KR102110966B1

KR102110966B1 - 데옥시포도필로톡신의 대량생산 방법

Info

Publication number: KR102110966B1
Application number: KR1020180051133A
Authority: KR
Inventors: 안순철; 김영욱; 유선녕; 남효원; 안현희; 최현덕; 김광연; 박슬기; 김상헌
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2020-05-14
Anticipated expiration: 2038-05-03
Also published as: KR20180124733A

Abstract

본원 발명은 데옥시포도필로톡신을 포함하는 추출 대상물로부터 알코올 용매를 이용 및 칼럼을 이용하여 대량으로 고순도의 데옥시포도필로톡신을 추출하는 방법에 관한 것이다. 기존의 정제 방법은 복잡한 단계를 요하고, 최종적으로 수득되는 데옥시포도필로톡신의 수율이 낮은 단점이 있다. 그러나 본원 발명은 전호의 알코올 추출 후 농축하는 과정이 없고, 용매가 단일하여 분리과정을 요하지 않는다. 그러므로 본원 발명은 항암제 등에 포함되는 데옥시포도필로톡신을 간단하고 대량으로 추출하는 것에 적합하다.

Description

데옥시포도필로톡신의 대량생산 방법{Process for Producing Deoxypodophilotoxin in Quantity}

본 발명은 추출 대상물로부터 데옥시포도필로톡신을 대량으로 추출 및 생산하는 방법에 관한 것이다.

데옥시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin)은 전호를 비롯한 백두옹(할미꽃[Pulsatilla koreana]의 뿌리), 향나무(Juniperus chinensis L.), 나한백(Thujopsis dolabrata), 토밀수(Bridelia tulasneana) 등에서 분리한다. 데옥시포도필로톡신은 자궁경부암 HeLa 세포, 폐암 A549 세포, 대장암 HCT116 세포, 피부암 B16F10 세포 등의 여러 가지 암세포에서 세포주기를 정지하거나, 세포의 증식 단백질의 발현을 조절하여 세포자멸사(apoptosis)를 유발하거나, 암세포의 혈관 생성을 저해하여 항암 작용을 일으킨다. 또한 oriental armyworm 등의 해충에 대한 살충효과 뿐만 아니라 진통, 항염증 효과, UV에 의한 피부색소 침착을 억제하는 미백 효과, herpes simplex virus에 대한 항바이러스 효과 등이 보고되었다. 특히 데옥시포도필로톡신은 항종양 활성이 우수하여 국내 최초의 천연물 항암제 SB 주사의 주성분으로 보고되었다. 이러한 데옥시포도필로톡신의 함암 효과, 살충효과, 미백효과, 항염증효과 등으로 인해 이는 약물, 화장품, 살충제, 가축사료 등에 널리 사용될 수 있다는 장점을 가진다.

데옥시포도필로톡신은 백두옹, 전호, 측백나무 등으로부터 메탄올 또는 에탄올 추출 후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 등의 복잡한 분리를 통해 정제되고 있나 고순도로 대량으로 분리, 정제된 보고는 없다.

이에 본 발명의 목적은 유용한 물질인 데옥시포도필로톡신을 대량 및 고순도로 추출할 수 있으면서도, 간단한 데옥시포도필로톡신의 추출 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 발명자는 간단하면서도 데옥시포도필로톡신을 대량 및 고순도로 추출할 수 있는 추출 방법을 발명하였으며, 본 발명의 과제 해결 수단은 다음과 같다:

1. 추출 대상물을 100% 알코올로 추출하고, 증류수를 더하여 알코올 80%의 추출액을 제조하는 단계;

상기 추출액을 칼럼에 통과시키는 단계;

80% 알코올을 칼럼에 통과시켜 흡착되지 않은 물질을 제거하는 단계;

100% 알코올을 칼럼에 통과시켜 흡착되어 있던 데옥시포도필로톡신을 용출하는 단계;를 포함하는 데옥시포도필로톡신의 추출 방법.

2. 1에 있어서, 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 데옥시포도필로톡신의 추출 방법.

본 발명의 데옥시포도필로톡신의 대량 추출방법은 기존의 추출방법인 메탄올 또는 에탄올 추출 후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 등의 복잡한 분리를 통해 정제하는 방법과 비교하여 정제 단계가 간단하며, 고순도 및 대량으로 추출이 가능하다. 또한 수용액 상태에서 추출물을 흡착시키지 않기 때문에 소요되는 수지의 양이 적다.

도 1은 본 발명의 실시예 1-2에 따라 Diaion HP-20 수지 및 메탄올 용액을 이용하여 전호로부터 대량으로 데옥시포도필로톡신을 추출하는 방법을 간략화한 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1-2에 따라 추출된 메탄올 추출물, Diaion HP-20 수지 통과액 및 100% 메탄올 용출액과 데옥시포도필로톡신 표준물질의 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 그래프를 비교한 것을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1-2에 따라 Diaion HP-20 수지의 100% 메탄올 용출액에서는 머무름 9분에 나타나는 물질을 ¹H-NMR으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1-2에 따라 분리, 정제된 데옥시포도필로톡신의 항암효과를 MTT 실험방법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에 따라 Diaion HP-20 수지 및 에탄올 용액을 이용하여 전호로부터 대량으로 데옥시포도필로톡신을 추출하는 방법을 간략화한 도이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따라 추출된 에탄올 추출물, Diaion HP-20 수지 통과액 및 100% 에탄올 용출액과 데옥시포도필로톡신 표준물질의 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 그래프를 비교한 것을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2에 따라 Diaion HP-20 수지의 100% 에탄올 용출액에서는 머무름 9분에 나타나는 물질을 ¹H-NMR으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 추출 대상물의 80% 알코올 추출액을 크로마토그래피 칼럼에 통과시켜 데옥시포도필로톡신을 칼럼에 흡착시키는 단계;

80% 알코올을 상기 칼럼에 통과시켜 흡착되지 않은 물질을 용출시키는 단계;

100% 알코올을 상기 칼럼에 통과시켜 흡착되어 있던 데옥시포도필로톡신을 용출시키는 단계;를 포함하는 데옥시포도필로톡신의 추출 방법을 제공한다.

추출 대상물의 80% 알코올 추출액을 크로마토그래피 칼럼에 통과시키는 단계에서 데옥시포도필로톡신은 칼럼에 흡착하게 되고, 이를 제외한 다른 성분은 칼럼을 통과하여 분리된다. 그 후 남아있는 흡착되지 않은 물질을 제거하기 위해 80% 알코올을 칼럼에 통과시켜 이를 제거한다. 마지막으로 100% 알코올을 칼럼에 통과시켜 흡착되어 있던 데옥시포도필로톡신을 용출하고, 그 결과 데옥시포도필로톡신이 고순도로 용해되어 있는 알코올 용액을 수득하게 된다.

수득된 알코올 용액에서 알코올을 증발시키거나 분리시켜 데옥시포도필로톡신을 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 알코올은 하나 이상의 -OH기를 갖는 모든 화합물을 지칭하며, 바람직하게는 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올이다.

본 발명에 있어서, 추출 대상물은 데옥시포도필로톡신을 함유하고 있는 어떠한 것이어도 무방하다. 예컨대, 본 발명의 추출대상물은 전호, 백두옹, 향나무, 측백나무, 나한백 및 토밀수로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 칼럼은 80% 알코올보다는 데옥시포도필로톡신과의 인력이 크면서, 100% 알코올보다는 데옥시포도필로톡신과의 인력이 작은 것을 사용하여야 한다. 그 예로는 활성탄, Diaion HP-20 수지 및 Amberlite XAD-20 수지 등이 있으나, 상기 조건을 만족하는 것이라면 활성탄, Diaion HP-20 수지 및 Amberlite XAD-20 수지 이외에도 다른 것을 사용할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 비교예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 비교예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 메탄올을 이용한 데옥시포도필로톡신의 추출

실시예 1-1. 추출 용매의 선택

추출에 사용되는 용매를 선택하기 위해, 열수 추출, 50% 메탄올 추출 및 100% 메탄올 추출을 수행하고 그 결과를 비교하였다. 구체적으로는 전호 10 g을 사용하여 100℃에서 10분간 열수 추출하거나 50% 메탄올과 100% 메탄올을 사용하여 24시간 동안 상온에서 메탄올로 추출한 후, 감압원심증발기(SpeedVac)를 이용하여 추출물의 고형분 함량을 측정하였으며 부탄올(butanol)로 용매추출한 추출물에 포함되어 있는 데옥시포도필로톡신의 함량은 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 측정하였다. 열수 추출 방법과 메탄올의 함량에 따른 메탄올 추출 방법을 통해 전호로부터 추출된 추출물의 고형분 함량이 달라지고 그 속에 포함되어 있는 데옥시포도필로톡신의 함량에도 차이가 있었으며, 그 결과를 하기 표 1로 정리하였다.

추출 방법	추출물의 고형분 함량	부탄올 추출물의 고형분 함량	부탄올 추출물의 데옥시포도필로톡신 함량	수율 (%) (DPT/고형분)
열수 추출	2.95 g	0.12 g	15.95 mg	0.54
50% 메탄올 추출	2.67 g	0.14 g	67.20 mg	2.52
100% 메탄올 추출	1.57 g	0.15 g	66.79 mg	4.25

즉, 열수 추출 방법으로 추출되는 고형분의 함량은 가장 많았지만 데옥시포도필로톡신의 함량이 가장 낮았다. 50% 메탄올 추출 방법은 추출되는 고형분의 함량이 많을 뿐만 아니라 데옥시포도필로톡신의 함량도 높았다. 100% 메탄올 추출 방법은 추출되는 고형분의 함량은 적었지만, 추출물 속에 포함되어 있는 데옥시포도필로톡신의 함량은 50% 메탄올 추출 방법과 비슷한 수준을 나타내어 사용한 세 가지 추출방법 중 가장 높은 4.25%의 수율(데옥시포도필로톡신의 함량/고형분의 함량)을 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 가장 효율적으로 데옥시포도필로톡신을 추출하기 위한 용매로 100% 메탄올을 선택하였다.

실시예 1-2. 전호로부터 데옥시포도필로톡신의 대량 추출

건조 전호 10 ㎏을 대용량 믹서기로 잘게 분쇄한 후, 분쇄한 전호에 100% 메탄올 45ℓ를 넣어 2일 동안 상온에서 추출하였다. 1차 추출물을 회수한 후 100% 메탄올 45ℓ를 다시 넣어 동일한 조건에서 2차 및 3차 추출을 실시하였다. 3차 추출까지 완료한 후 100% 메탄올 추출액의 침전물을 여과지로 제거하고 증류수를 가하여 메탄올의 농도가 80%가 되도록 맞추었다. 미리 80% 메탄올에 평형화 시킨 약 4.5ℓ 부피의 Diaion HP-20 칼럼에 최종 농도가 80% 메탄올로 희석한 전호의 메탄올 추출물을 통과시켜 데옥시포도필로톡신을 포함한 지용성 물질을 흡착시켰다. 추출액을 모두 통과시킨 후, 80% 메탄올 20ℓ를 사용하여 Diaion HP-20에 흡착되지 않은 물질을 씻어냈다. 그 후 100% 메탄올을 사용하여 Diaion HP-20에 흡착되어 있던 데옥시포도필로톡신을 용출시켰다. 데옥시포도필로톡신이 포함된 100% 메탄올 용출액을 진공회전농축기(evaporator)로 메탄올 제거하고 고성능액체크로마토그래피로 분석하여 순도 80%의 데옥시포도필로톡신 분획 29.7 g을 얻었다. 본 실시예의 추출 과정을 도 1로 간략화하여 나타내었다.

비교예 1. 기존의 추출방법인 메탄올 추출 후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 등의 복잡한 분리를 통해 정제한 결과

먼저 전호 500 g을 메탄올로 추출한 후 회전증발기로 메탄올을 증발시키고 고형성분만 남게 하였다. 남은 고형 성분에 물과 에틸아세테이트(ethylacetate)를 동량으로 가한 후 에틸아세테이트 층만 취하였다. 에틸아세테이트 층에 실리카겔을 넣고 회전증발기로 에틸아세테이트를 제거하여 고형성분을 실리카겔에 흡착 시킨 후, 미리 충진된 실리카겔 칼럼에 가하여 헥세인(hexane)과 에틸아세테이트를 3대 1로 혼합한 용액을 전개용매로 용출하여 데옥시포도필로톡신이 포함된 분획을 얻었다. 용리된 데옥시포도필로톡신을 포함하는 분획을 앞과 같은 방법으로 C₁₈-역상 실리카겔에 흡착하고 충진된 칼럼을 이용하여 60% 메탄올을 전개용매로 하여 데옥시포도필로톡신을 용리시켰다. 데옥시포도필로톡신을 포함하는 분획을 회전증발기로 농축시키고 Sepadex LH-20 칼럼에 가하고 100% 메탄올을 전개용매로 하여 용리하였다. 용리된 데옥시포도필로톡신을 포함하는 분획을 고성능액체크로마토그래피(HPLC, high performance liquid chromatography)를 이용하여 C₁₈ 칼럼, 60% 메탄올을 전개용매 조건으로 분리 및 분획하여 순수한 데옥시포도필로톡신 50 mg을 얻었다.

이를 본원발명의 실시예 1-2과 비교한 결과를 하기 표 2로 정리하였다.

정제법	초기 전호의 양	추출물의 고형분 함량	최종 추출물의 고형분 함량	최종 추출물의 DPT 함량	순도 (%) (DPT/고형분)
비교예 1	500 g	79 g	52 mg	50 mg	>95 순수분리)
실시예 1-2	10 kg	1,065g	37 g	29.7 g	80

최종 정제 후 데옥시포도필로톡신의 순도의 경우 비교예의 정제방법은 95% 이상의 순수분리를 보여주었으며 본 발명에 따른 실시예의 정제방법은 대량의 전호를 간단한 방법으로 정제하였음에도 불구하고 80%의 높은 순도를 나타내었다. 특히 전호추출물로부터의 수율(최종 추출물의 데옥시포도필로톡신 함량/추출물의 고형분 함량)을 고려하면 비교예의 정제법은 0.06%이었으나 본 발명에 따른 실시예의 정제법에 의해서는 2.8%의 고효율로 데옥시포도필로톡신을 정제할 수 있었다.

실험예 1-1. 실시예 1-2의 방법으로 추출 및 정제한 데옥시포도필로톡신의 HPLC 분석

Diaion HP-20 칼럼에 흘려주어 통과한 분획과 Diaion HP-20에 흡착되어 100% 메탄올에 용출된 분획을 표준물질 데옥시포도필로톡신과 비교하여 고성능액체크로마토그래피 분석을 실시하였다. 데옥시포도필로톡신의 표준물질, 전호의 메탄올 추출물, Diaion HP-20 수지 통과액, Diaion HP-20 수지에서 100% 메탄올 용출액 등의 분석 조건은 다음과 같다. 영인과학의 YL9100 HPLC에서 칼럼은 Waters Spherisorb ODS2 (Ø 4.6x150 mm, 5 μm)를 사용하였으며 전개용매로는 60% 메탄올을 유속 0.8 mL/min 유지하여 용출하여 UV 240 nm에서 검출하였다. 분석 결과는 도 2로 도시하였다. 전호 메탄올 추출물에서는 머무름 시간 9분에서 데옥시포도필로톡신의 피크가 관찰되었으나 Diaion HP-20 수지 통과액에서는 데옥시포도필로톡신이 관찰되지 않았다. 한편 Diaion HP-20 수지의 100% 메탄올 용출액에서는 머무름 9분에서 데옥시포도필로톡신의 피크가 관찰되어 Diaion HP-20 수지에 의해서 데옥시포도필로톡신이 순수하게 분리되는 것을 알 수 있었다. 고성능액체크로마토그래피 분석에서 머무름 9분에 나타나는 물질을 동정하기 위하여 양성자 핵자기공명 분광기(¹H-NMR)로 분석하였으며, 그 결과를 도 3으로 도시하였다. 상기 물질의 스펙트럼은 표준물질 데옥시포도필로톡신의 스펙트럼과 동일하여 Diaion HP-20 수지의 100% 메탄올 용출액의 주성분이 데옥시포도필로톡신임을 확인 할 수 있었다.

실험예 1-2. 실시예 1-2의 방법으로 추출 및 정제한 데옥시포도필로톡신의 항암효과 실험

데옥시포도필로톡신은 전립선암세포, 유방암세포, 폐암세포를 포함한 다양한 암세포에서 항암효과를 나타내는 것으로 알려졌다. 본 발명에 따른 정제방법으로 전호로부터 분리한 데옥시포도필로톡신이 이러한 효능을 가지는 지를 MTT 실험방법을 통하여 확인하였다. 인간전립선암 세포주인 PC-3 세포를 1×10⁴cells/well의 농도로 세포 배양용 48-well plate에 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후 2.75, 7.5, 15, 30 ng/ml 농도의 데옥시포도필로톡신을 처리하였다. 24시간 반응 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 0.5 mg/ml 농도로 각각 250 μl 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 상등액을 제거하고 생성된 formazan에 dimethylsulfoxide (DMSO) 250 μl를 각각 분주하여 96-well plate로 100 μl씩 옮긴 후, VERSA_MAX microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 능력(cell vaibility)을 측정하였다. 그 결과는 도 4로 도시하였으며, 기존에 알려진대로 본 발명에 따른 Diaion HP-20 수지를 이용한 정제방법을 사용하여 전호로부터 분리한 데옥시포도필로톡신이 인간전립선암 세포주에서 항암효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 2. 에탄올을 이용한 전호로부터 데옥시포도필로톡신의 대량 추출 방법

메탄올 대신 에탄올을 추출 용매로 사용하여 다음과 같은 방법으로 추출 절차를 수행하였다. 건조 전호 30 ㎏을 대용량 믹서기로 잘게 분쇄한 후, 분쇄한 전호에 100% 에탄올 80ℓ를 넣어 2일 동안 상온에서 추출하였다. 1차 추출물을 회수한 후 100% 에탄올 80ℓ를 다시 넣어 동일한 조건에서 2차 및 3차 추출을 실시하였다. 3차 추출까지 완료한 후 100% 에탄올 추출액의 침전물을 여과지로 제거하고 증류수를 가하여 에탄올의 농도가 80%가 되도록 맞추었다. 미리 80% 에탄올에 평형화 시킨 약 6.6ℓ 부피의 Diaion HP-20 칼럼에 최종 농도가 80% 에탄올로 희석한 전호의 에탄올 추출물을 통과시켜 데옥시포도필로톡신을 포함한 지용성 물질을 흡착시켰다. 추출액을 모두 통과시킨 후, 80% 에탄올 30ℓ를 사용하여 Diaion HP-20에 흡착되지 않은 물질을 씻어냈다. 그 후 100% 에탄올을 사용하여 Diaion HP-20에 흡착되어 있던 데옥시포도필로톡신을 용출시켰다. 데옥시포도필로톡신이 포함된 100% 에탄올 용출액을 진공회전농축기(evaporator)로 에탄올을 제거하고 고성능액체크로마토그래피로 분석하여 순도 80%의 데옥시포도필로톡신 분획 100.6 g을 얻었다. 본 실시예의 추출 과정을 도 5로 간략화하여 나타내었다.

비교예 2. 기존의 추출방법인 에탄올 추출 후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 등의 복잡한 분리를 통해 정제한 결과

먼저 전호 500 g을 에탄올로 추출한 후 회전증발기로 에탄올을 증발시키고 고형성분만 남게 하였다. 남은 고형 성분에 물과 에틸아세테이트(ethylacetate)를 동량으로 가한 후 에틸아세테이트 층만 취하였다. 에틸아세테이트 층에 실리카겔을 넣고 회전증발기로 에틸아세테이트를 제거하여 고형성분을 실리카겔에 흡착 시킨 후, 미리 충진된 실리카겔 칼럼에 가하여 헥세인(hexane)과 에틸아세테이트를 3대 1로 혼합한 용액을 전개용매로 용출하여 데옥시포도필로톡신이 포함된 분획을 얻었다. 용리된 데옥시포도필로톡신을 포함하는 분획을 앞과 같은 방법으로 C₁₈-역상 실리카겔에 흡착하고 충진된 칼럼을 이용하여 60% 에탄올을 전개용매로 하여 데옥시포도필로톡신을 용리시켰다. 데옥시포도필로톡신을 포함하는 분획을 회전증발기로 농축시키고 Sepadex LH-20 칼럼에 가하고 100% 에탄올을 전개용매로 하여 용리하였다. 용리된 데옥시포도필로톡신을 포함하는 분획을 고성능액체크로마토그래피(HPLC, high performance liquid chromatography)를 이용하여 C₁₈ 칼럼, 60% 에탄올을 전개용매 조건으로 분리 및 분획하여 순수한 데옥시포도필로톡신 50 mg을 얻었다.

이를 본원발명의 실시예 1-2과 비교한 결과를 하기 표 3으로 정리하였다.

정제법	초기 전호의 양	추출물의 고형분 함량	최종 추출물의 고형분 함량	최종 추출물의 DPT 함량	순도 (%) (DPT/고형분)
비교예 2	500 g	79 g	52 mg	50 mg	>95 순수분리)
실시예 2	30 kg	3,197g	125.2 g	100.6 g	80

최종 정제 후 데옥시포도필로톡신의 순도의 경우 비교예의 정제방법은 95% 이상의 순수분리를 보여주었으며 본 발명에 따른 실시예의 정제방법은 대량의 전호를 간단한 방법으로 정제하였음에도 불구하고 80%의 높은 순도를 나타내었다. 특히 전호추출물로부터의 수율(최종 추출물의 데옥시포도필로톡신 함량/추출물의 고형분 함량)을 고려하면 비교예의 정제법은 0.06%이었으나 본 발명에 따른 실시예의 정제법에 의해서는 3.1%의 고효율로 데옥시포도필로톡신을 정제할 수 있었다.

실험예 2. 실시예 2의 방법으로 추출 및 정제한 데옥시포도필로톡신의 HPLC 분석

Diaion HP-20 칼럼에 흘려주어 통과한 분획과 Diaion HP-20에 흡착되어 100% 에탄올에 용출된 분획을 표준물질 데옥시포도필로톡신과 비교하여 고성능액체크로마토그래피 분석을 실시하였다. 데옥시포도필로톡신의 표준물질, 전호의 에탄올 추출물, Diaion HP-20 수지 통과액, Diaion HP-20 수지에서 100% 에탄올 용출액 등의 분석 조건은 다음과 같다. 영인과학의 YL9100 HPLC에서 칼럼은 Waters Spherisorb ODS2 (Ø 4.6x150 mm, 5 μm)를 사용하였으며 전개용매로는 60% 에탄올을 유속 0.8 mL/min 유지하여 용출하여 UV 240 nm에서 검출하였다. 분석 결과는 도 6으로 도시하였다. 전호 에탄올 추출물에서는 머무름 시간 9분에서 데옥시포도필로톡신의 피크가 관찰되었으나 Diaion HP-20 수지 통과액에서는 데옥시포도필로톡신이 관찰되지 않았다. 한편 Diaion HP-20 수지의 100% 에탄올 용출액에서는 머무름 9분에서 데옥시포도필로톡신의 피크가 관찰되어 Diaion HP-20 수지에 의해서 데옥시포도필로톡신이 순수하게 분리되는 것을 알 수 있었다. 고성능액체크로마토그래피 분석에서 머무름 9분에 나타나는 물질을 동정하기 위하여 양성자 핵자기공명 분광기(¹H-NMR)로 분석하였으며, 그 결과를 도 7으로 도시하였다. 상기 물질의 스펙트럼은 표준물질 데옥시포도필로톡신의 스펙트럼과 동일하여 Diaion HP-20 수지의 100% 에탄올 용출액의 주성분이 데옥시포도필로톡신임을 확인 할 수 있었다.

Claims

추출 대상물의 80 부피% 알코올 추출액을 활성탄, Diaion HP-20 수지 및 Amberlite XAD-20 수지로 이루어진 군에서 선택되는 충전제로 충전된 크로마토그래피 칼럼에 통과시켜 데옥시포도필로톡신을 칼럼에 흡착시키는 단계;
80 부피% 알코올을 상기 칼럼에 통과시켜 흡착되지 않은 물질을 용출시키는 단계;
100 부피% 알코올을 상기 칼럼에 통과시켜 흡착되어 있던 데옥시포도필로톡신을 용출시키는 단계;를 포함하며,
상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올이고,
상기 추출 대상물은 전호, 백두옹, 향나무, 측백나무, 나한백 및 토밀수로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것인,
데옥시포도필로톡신의 추출 방법.
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