KR102098289B1 - 발네물린을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발네물린(Valnemulin)을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발네물린 HCl이 파골세포의 분화를 억제하고 골 재흡수를 감소시키는 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 발네물린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 파골세포에 의한 골 흡수 과다에 의해 발병되는 골다공증과 같은 골 질환 치료용 조성물로 제공될 수 있다.

Description

발네물린을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating bone disorders comprising valnemulin}

본 발명은 발네물린을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

정상적인 뼈의 재형성과정은 뼈 형성과 뼈 흡수의 균형으로 이루어지며, 이러한 뼈 형성과 뼈 흡수는 크게 두 가지 세포, 조골세포(osteoblast) 및 파골세포(osteoclast)의 상호작용에 의해 이루어진다. 특히, 조골세포의 증식과 분화는 뼈의 석회화와 밀접한 관계가 있으며 조골세포에서 중요한 전사인자인 RUNX2에 변이가 생기거나 발현량이 감소하면 뼈의 석회화가 일어나지 않는다.

RANKL(receptor activator of NF-kB ligand)은 조골세포의 분화과정 동안에 발현되어 파골세포 분화를 조절하는 것으로 알려져 있고 OPG(Osteoprotegrin) 역시 조골세포에서 발현되어 RANKL의 역할을 억제함으로써 파골세포의 분화를 억제하는 인자로 알려져 있다. 또한, RANKL은 파골세포 분화의 핵심 유발인자로, 세포 표면의 수용체 RANK와 결합하여 파골세포 분화에 관여하는 다양한 분자(예를 들어, nuclear factor of activated T cells 1)의 발현을 조절하여 파골세포 분화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

한편, 파골세포의 분화, 형성 및 활성의 과도한 증가는 골다공증 및 치주염에 의한 골소실, 몇몇 암의 골전이에 의한 고칼슘혈증 및 골소실, 또는 류마티즘 관절염에 의한 골 손실 등을 증가시키는 것으로 알려짐에 따라, 이들을 치료하기 위한 타겟 세포로 파골세포가 지목되고 있다. 즉, 파골세포의 분화를 억제 시킨다면 뼈 흡수 역시 억제 시킬 수 있고 골다공증, 치주염 및 골전이 암과 같은 골 질환 역시 치료할 수 있을 것이라는 가정하에 파골세포에 대한 많은 약물들과 치료법들에 대한 연구가 진행 중이다.　

현재 파골세포에 의한 골다공증과 같은 골 손상 치료에 포사맥스(Fosamax, 성분명:aledronate)와 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 치료제가 널리 이용되고 있다. 이들 비스포스포네이트 제제들은 대부분 뼈를 파괴하는 파골세포의 기능을 약화하고 세포사멸을 유도해 뼈의 손실을 느리게 하거나 멈추게 하는 작용을 한다. 그러나 이들 약제들은 새로운 골 형성을 촉진시키는 기능은 가지고 있지 않으며, 최근 비스포스포네이트를 복용하는 환자들에게서 턱뼈 괴사(osteonecrosis), 중증 심방세동, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 해마다 증가되고 있다(Coleman RE., Br J Cancer, 98:1736-1740(2008)). 특히, 유방암, 전립선암 환자에서 뼈로 전이된 암세포에 의해 파골세포 형성이 촉진되어 심각한 골 질환이 발생하는데 이를 치료하기 위한 약물이 개발되어 있지 않다. 현재 비스포스포네이트 제제를 고용량으로 투여하는데 이로 인해 턱뼈괴사 환자들이 현저히 증가하는 추세이다.

따라서, 비스포스포네이트의 단점을 보완하고 독성이 없으며 파골세포에 의한 골 흡수에 효과적인 물질을 발견하는 것이 아주 중요한 과제이다.

발네물린 HCl(Valnemulin HCl)은 플류로무틸린(pleuromutilin) 항생제로 돼지의 설사병, 회장염, 장염 및 폐렴에 사용되는 약물이며, 소 마이코플라스마 감염에 의한 정신증상을 빠르게 억제시키고 송아지의 폐로부터 소 마이코플라스마를 제거하는 효과를 가지는 것으로 보고되어 있으나, 발네물린이 파골세포의 분화를 억제하여 파골세포 과다 활성에 의해 유발되는 골 질환을 예방하거나 치료하는 효과에 대해서는 아직까지 알려진 바 없다.

대한민국공개특허 제10-2005-0002109호(2005.01.07. 공개)

본 발명은 발네물린(Valnemulin)을 유효성분으로 함유하는 조성물을 파골세포 과다에 의해 유도되는 골 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약학조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 발네물린(Valnemulin)을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 발네물린을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 발네물린이 파골세포의 분화를 억제하고 골 재흡수를 감소시키는 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 발네물린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 파골세포에 의한 골 흡수 과다에 의해 발병되는 골다공증 및 치주염과 같은 골 질환을 예방하거나 치료하기 위한 조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 파골세포 분화에 미치는 발네물린 HCl 영향을 확인한 결과로, 도 1A는 골수 유래 대식세포(BMMs)를 다양한 농도의 발네물린 HCl이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 M-CSF(10 ng/mL) 및 RANKL(20 ng/mL)과 함께 배양하였으며, 4일 후 세포를 고정시켜 TRAP 염색한 결과이며(배율: 50×), 도 1B는 핵이 3개 이상인 TRAP 양성 다핵 세포 수를 확인한 결과이다(**p < 0.01 versus the vehicle-treated control).
도 2는 발네물린 HCl이 골수 유래 대식세포(BMMs)의 생존도에 미치는 영향을 확인한 결과로, 골수 유래 대식세포를 다양한 농도의 발네물린 HCl이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 M-CSF(10 ng/mL)와 3일 동안 인큐베이트하고 세포생존도를 확인한 MTT 분석 결과이다(*p < 0.05, **p < 0.01 vehicle-treated control).
도 3은 파골세포 분화기간 동안 RANKL에 의해 유도되는 mRNA 발현에 미치는 발네물린 HCl의 영향을 확인한 결과로, M-CSF(10 ng/mL) 및 RANKL(20 ng/mL)의 존재하에서 골수 유래 대식세포(BMMs)에 비이클 또는 발네물린 HCl (0.5 μM)을 처리하여 배양한 후 실시간 정량적 PCR을 수행하여 TRAP (Acp5), cathepsin K (Ctsk), DC-STAMP (Dcstamp) 및 NFATc1 (Nfatc1)의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 액틴 링 구조 및 NFATc1 전좌에 미치는 발네물린 HCl의 영향을 확인한 결과로, 골수 유래 대식세포를 비이클 또는 발네물린 HCl (0.5 μM)과 함께 파골세포분화 배지를 이용하여 유리 커버슬립에서 4일간 배양하고 항-NFATc1 항체로 세포를 표지한 후 팔로이딘 및 DAPI 염색을 수행한 결과이다.
도 5는 흡수와(resorption pits) 형성에 미치는 발네물린 HCl 영향을 확인한 결과로, 골수 유래 대식세포를 뼈 조각에 접종하고 M-CSF(10 ng/mL) 및 RANKL(20 ng/mL)과 함께 3일간 인큐베이션하여 파골세포 분화를 유도한 후 세포에 발네물린 HCl (0.5 μM)를 처리하거나 처리하지 않고 2일간 추가 배양한 후 흡수와를 헤마톡실린 염색하여 확인한 결과이다(**p < 0.01).
도 6은 결찰에 의해 유도되는 치주골 재흡수에 대한 발네물린 HCl의 영향을 확인한 결과로, 도 6A는 치주골 손실이 나타난 두 번째 어금니(제2대구치)의 MicroCT 이미지이며, 도 6B는 두 번째 어금니의 CEJ에서 ABC까지의 직선 거리를 분석한 결과로, 각 실험군은 n = 5이다 (*p < 0.05, **p < 0.01 versus the ligated-vehicle-treated group).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

현재 골다공증과 같은 파골세포 과도 활성에 의해 유도되는 골 질환을 치료하기 위해 사용되는 치료제는 환자의 순응도가 낮고, 지속적인 복용이 잘 이루어지지 않는 문제점이 알려진 바, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 문제점을 최소화하고 우수한 약효를 갖는 새로운 골질환 치료제에 대한 연구를 진행하던 중 발레물린이 파골세포의 분화와 기능을 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 발네물린(Valnemulin)을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 발네물린은 파골세포로의 분화를 억제시키고 골 재흡수를 감소시키는 것일 수 있다.

상기 골 질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 골감소증, 칼슘조절이상, 전이성 암 또는 임플란트의 피로잔해에 의한 골용해, 염증성 골소실, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골손실(secondary bone loss), 파젯병(Paget disease), 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 및 치조골의 파괴가 동반되는 치주질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 약학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 및 캠퍼술폰산염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 약학조성물은 조성물 총 100 중량부에 대하여, 발네물린 0.001 내지 1 중량부를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 발네물린을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 발네물린을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 발네물린의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 발네물린을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.

상기 건강식품은 상기 발네물린 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 파골세포 형성( Osteoclastogenesis )

6주령 수컷 C57/B6L 생쥐로부터 골수 세포(Bone marrow cells; BMCs)를 수집하였다. 수집된 BMCs를 10% FBS 및 M-CSF (30 ng/mL)가 포함된 α-MEM 배지에서 3일간 배양하였다. 파골세포로 분화시키기 위해, 골수 유래 대식세포(bone marrow macrophages; BMMs)를 RANKL (20 ng/mL) 및 M-CSF (10 ng/mL)가 존재하는 96-웰 플레이트에 분주하고 0, 0.1, 0.5, 2.5 또는 10 μM 발네물린(valnemulin) HCl과 함께 배양하였다.

배양 4일 후 세포를 고정하고 제조사의 설명서에 따라 타타르산 내성 산성 인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase; TRAP) 염색 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 염색하고, 현미경을 이용하여 3개 이상의 핵을 갖는 TRAP-양성 다핵세포(MNCs)를 계수하였다.

< 실험예 2> 세포 생존도 분석

골수 유래 대식세포(BMMs)의 세포 생존도를 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma-Aldrich)분석으로 확인하였다.

먼저, M-CSF (10 ng/mL)존재하에서 다양한 농도의 발네물린 HCl과 함께 BMMs를 배양하였다. 배양 3일 후 각 웰에 MTT를 첨가하고 2시간 동안 인큐베이트하였다. 96-웰 microplate reader (BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

< 실험예 3> 정량적 실시간 PCR (Quantitative real-time PCR )

TRI-solution (Bioscience, Seoul, Korea)을 이용하여 세포로부터 전체 RNA를 분리하고, SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 mRNA를 역전사하였다.

OPreal qPCR 2× PreMIX with SYBR green (Enzynomics, Daejeon, Korea)을 이용하여 LightCycler 1.5 real-time PCR 시스템(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)으로 정량적 실시간 PCR을 수행하였다.

< 실험예 4> 면역형광 ( Immunofluorescence ) 분석

골수 유래 대식세포(BMMs)를 RANKL(20 ng/mL) 및 M-CSF(10 ng/mL)와 함께 발네물린 HCl (0.5 μM) 존재 또는 비존재 조건으로 유리 커버슬립에서 4일 동안 배양하였다.

세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시키고, 0.25% Triton X-100를 투과시킨 후 블로킹 버퍼(blocking buffer; 3% 소혈청알부민이 포함된 PBS)로 1시간 동안 블로킹하였다. 세포를 항-NFATc1 항체와 인큐베이션한 후 Alexa Fluor-488 결합된 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 인큐베이션하였다. F-액틴을 로다민(rhodamine)이 결합된 팔로이딘(phalloidin) (Cytoskeleton, Denver, CO, USA)으로 염색하였으며, DAPI(4′',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 핵을 염색하고, BX51 fluorescence microscope (Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 형광 이미지를 얻었다.

< 실험예 5> 흡수와 분석(Resorption pit assay)

생쥐 대식세포를 뼈 조각(IDS Nordic, Herlev, Denmark)에 접종하고 M-CSF (10 ng/mL) 및 RANKL (20 ng/mL)와 함께 3일 동안 배양하여 파골세포 분화를 유도하였으며, 세포를 발네물린 HCl (0.5 μM)이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 2일간 추가 배양하였다.

뼈 조각으로부터 모든 세포가 사라지면 메이어스 헤마톡실린(Mayer’s hematoxylin) 염색을 통하여 흡수와를 시각화하고, i-Solution image analysis software (IMT i-Solution, Daejeon, Korea)을 이용하여 흡수와 부위를 확인하였다.

< 실험예 6> 리가루타(Ligature)로 유도된 치조골 소실 모델 및 조직계측학적 분석

모든 동물 실험은 경북대학교 동물 보호 및 사용 위원회에 승인을 받았으며, 실험 동물 관리 및 사용에 대한 가이드라인에 따라 수행되었다.

생체 내에서 발네물린 HCl의 효능을 확인하기 위해, 7주령 수컷 C57B6/L 생쥐를 각 그룹당 5 마리씩 5 그룹으로 나누었다. 각각의 그룹은 비결찰(nonligation) 및 비이클(vehicle) 그룹(NL + V), 비결찰과 발네물린 HCl 그룹(NL + valnemulin HCl), 결찰과 비이클 그룹(L + V), 결찰과 발네물린 HCl 1 mg/kg 그룹(L + valnemulin HCl 1 mg/kg) 및 결찰과 발네물린 HCl 5 mg/kg (L + valnemulin HCl 5 mg/kg)이다.

이전에 보고된 방법에 따라, 치조골 재흡수는 상악 좌측 제2대구치 주변의 5-0 실크의 결찰을 통해 유도되었다.

생쥐에게 비이클 또는 발네물린 HCl (1 또는 5 mg/kg)을 7일 동안 복강 내 주사하고, 시작한 날을 1일로 하였다. 8일째에 이산화탄소로 모든 생쥐를 안락사시키고, 턱을 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다.

고정된 턱을 70kV 전원 전압, 142㎄의 전류 및 6㎛ 해상도로 SkyScan 1272 high-resolution micro-computed tomography (μCT) 시스템 (Bruker, Kontich, Belgium)을 이용하여 스캔하였다.

3차원 이미지는 CTvox software를 이용하여 얻었으며, 치주골 소실을 평가하기 위해, 상악 좌측 제2대구치의 CEJ에서 ABC까지 직선 거리를 측정하였다.

< 실시예 1> 발네물린 HCl의 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제효과 확인

RANKL로 유도된 파골세포 분화에 있어서, 발네물린 HCl의 효과를 확인하기 위해, 골수 유래 대식세포를 발네물린 HCl (0, 0.1, 0.5, 2.5 또는 10 μM) 존재 또는 비존재하에서 M-CSF (10 ng/mL) 및 RANKL (20 ng/mL)와 함께 배양하였다.

배양 4일 후 도 1A 및 도 1B와 같이 M-CSF 및 RANKL에 의해 TRAP-양성 MNCs가 생성되었다. 그러나 발네물린 HCl이 처리에 의해 파골세포 형성이 감소되었으며, 0.5 μM 농도의 발네물린 HCl이 처리된 실험군에서는 TRAP-양성 MNCs의 형성이 현저하게 억제(약 98% 억제)된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 발네물린 HCl의 억제 효과가 세포독성에 의한 것인지를 확인하기 위해, MTT 분석을 수행하여 파골세포 전구체의 생존도를 확인하였다.

그 결과, 도 2와 같이 발네물린 HCl(2.5 μM 까지)은 골수 유래 세포에서 세포독성을 나타내지 않았다.

< 실시예 2> 발네물린 HCl이 파골세포 특이적 마커 발현에 미치는 영향 확인

파골세포 형성에 있어 발네물린 HCl의 역할을 확인하기 위해, 실시간 PCR(qPCR)을 수행하여 파골세포 특이적 마커의 발현을 확인하였다.

M-CSF 및 RANKL로 자극시킨 골수 유래 대식세포(BMMs)에 발네물린 HCl (0.5 μM)을 처리하였다.

그 결과, 도 3과 같이 RANKL은 TRAP(Acp5), cathepsin K(Ctsk), DC-STAMP(Dcstamp) 및 NFATc1(Nfatc1) 발현을 급격하게 증가시켰다. 상기 RANKL 처리 대조군과 비교하여 발네물린 HCl이 첨가된 실험군에서는 상기 유전자의 발현이 유의적으로 감소되었다.

골수 유래 대식세포가 파골세포로 분화하는 것을 조절하는 주요 전사 인자인 NFATc1의 핵 전좌를 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4와 같이 핵 내 NFATc1 양성 세포의 수가 발네물린 HCl 처리에 의해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 도 3의 Dcstamp 감소 수준을 참고하면, 다핵거대세포의 형성이 발네물린 HCl의 첨가에 의해 억제된 것임을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 발네물린 HCl은 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 및 형성과 관련된 유전자의 발현의 억제하는 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

< 실시예 3> 발네물린 HCl의 골 재흡수 활성 감소 효과 확인

성숙하고 활성화된 파골세포는 재흡수 단계 동안 세포와 골기질 사이에 밀봉된 구역을 만드는 액틴 링 구조를 포함한다.

본 발명의 발명자들은 발네물린 HCl 파골세포 활성 조절 여부를 흡수와 분석을 통하여 확인하였다.

파골세포를 유도시키는 배지를 이용하여 골수 유래 대식세포(BMMs)를 뼈 조각 상에서 3일 동안 인큐베이트하여 파골세포 유사 단핵세포(MNCs)를 발생시키고, 발네물린 HCl과 비이클을 처리하여 2일간 추가 인큐베이트하였다.

그 결과, 도 5와 같이 양성 대조군과 비교하여 발네물린 HCl은 흡수와 형성을 억제(17.6% 억제)시키는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 발네물린 HCl은 파골세포의 골 재흡수 활성을 효과적으로 억제시키는 것이 확인되었다.

< 실시예 4> 결찰에 의해 유도된 치조골 손실에 미치는 발네물린 HCl의 효과 확인

치주염에 대한 발네물린 HCl의 생체 내 영향을 확인하기 위해, 결찰에 의해 유도된 치조골 손실을 생쥐에서 평가하였다. 비결찰 및 결찰 생쥐군에 비이클 또는 발네물린 HCl(1 mg/kg 또는 5 mg/kg)을 처리하고 μCT 이미지를 확인하였다.

그 결과, 도 6A와 같이 결찰 군에서는 상악 좌측 제2대구치의 심각한 치조골 손실이 확인되었다. 그러나 발네물린 HCl은 결찰에 의해 유도된 뼈 재흡수가 상당히 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6B를 참고하면 구강 측면에서 어금니의 CEJ에서 ABC까지의 거리는 5 mg/kg 발네물린 HCl이 처리된 군에서 21.8% 감소된 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 발네물린(Valnemulin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 발네물린은 파골세포로의 분화를 억제시키고 골 재흡수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 골감소증, 칼슘조절이상, 전이성 암 또는 임플란트의 피로잔해에 의한 골용해, 염증성 골소실, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골손실(secondary bone loss), 파젯병(Paget disease), 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 및 치조골의 파괴가 동반되는 치주질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 및 캠퍼술폰산염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 조성물 총 100 중량부에 대하여, 발네물린 0.001 내지 1 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
6. 발네물린(Valnemulin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 개선용 건강식품.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 및 캠퍼술폰산염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 개선용 건강식품.

Images