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KR102081267B1 - 헤파란 설페이트 - Google Patents

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KR102081267B1
KR102081267B1 KR1020157035715A KR20157035715A KR102081267B1 KR 102081267 B1 KR102081267 B1 KR 102081267B1 KR 1020157035715 A KR1020157035715 A KR 1020157035715A KR 20157035715 A KR20157035715 A KR 20157035715A KR 102081267 B1 KR102081267 B1 KR 102081267B1
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heparin
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빅터 누르콤베
시몬 쿨
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

구조적으로 및 기능적으로 연관된 분리된 헤파란 설페이트의 새로운 부류가 기재된다. 새로운 부류의 헤파란 설페이트는 FGF2에 결합하고 줄기 세포의 전분화능/다분화능을 유지시키면서 이들의 증식을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.

Description

헤파란 설페이트{Heparan sulphates}
본 발명은 헤파란 설페이트, 구체적으로, 비록 이에 제한되지는 않으나, FGF2에 결합하는 헤파란 설페이트에 관한 것이다.
세포 기반의 치료에서 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC) 사용의 주요 문제점은 치료 목적의 충분한 수의 세포를 얻기 어렵다는 데에 있다. 세포외 기질 (ECM)의 사용 및 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2) 사용을 포함하는 최근의 전략은 세포 계수를 높이지만 세포 집단에서 분화된 전구세포의 증가로 이어진다.
골수 단핵 세포의 0.01% 내지 0.0001% 만큼 적은 수의 hMSC는 그들의 광범위한 사용을 못하게 저해한다. 게다가, 최근의 생체외(ex vivo) 확장 전략은, 더 낮은 질 및 기능과 함께, 이식을 위한 충분한 세포에 있어서 다능성의 상실로 이어질 것이다.
브릭맨 등(Brickman et al., Glycobiology Vo. 8 No. 5 pp. 463-471, 998)은 FGF2와 상호작용할 수 있는 것으로 보고된 HS2로 불리는 헤파란 설페이트를 기재하고 있다. HS2는 브릭맨에 기재된 바와 같이 배아 10일차에 쥐의 세포의 헤파란 프로테오글리칸으로부터 수득 가능하다. HS2는 약 25 kDa의 분자량을 갖는 것으로 기재되어 있으며, 따라서 디사카라이드당 400 Da의 평균 분자 질량으로 추정되어, 약 60개의 디사카라이드로 구성되어 있다. HS2의 디사카라이드 조성물은 브릭맨 등(Glycobiology Vo. 8 No. 5 pp. 463-471, 998), WO2010/011185 에 기재되어 있으며, 이는 전체로서 참조로 본 발명에 포함된다. HS2의 아질산 및 헤파란 리아제 분해 프로파일은 도 29 및 30에 나타난다.
마카라나 등(Maccarana et al, Minimal Sequence in Heparin/Heparan Sulfate Required for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 268, No.32, Issue 15, pp23898-23905, 1993)은 인간 대동맥으로부터의 헤파린 또는 HS로부터 생성된 몇몇의 작은 올리고사카라이드에 의한 FGF-2의 결합을 조사하는 실험을 기재하고 있다. 하나의 옥타사카라이드 분획(B2)은 옥타사카라이드를 위한 구조를 구성하는 데에 사용되었고, 저자는 HS-8이라고 불렀다. 이것은 본 발명의 HS-8이 아님에 특히 주의할 것이며, 명명법은 전체적으로 일치한다.
돼지 장관 점막으로부터의 헤파린, 선택적으로 O-탈설페이트화된 헤파린의 2개의 샘플, 우선적으로 출발 물질의 N-탈설페이트화와 함께 6-O-탈설페이트화에 이어 재-N-설페이트화에 의해 생성된 하나의 샘플, 알칼리성 조건하에서 선택적인 2-O-탈설페이트화에 의해 수득된 다른 하나의 샘플, 인간 대동맥으로부터 분리된 낮은 설페이트화된 HS, 및 소의 신장으로부터의 HS는 짝수 또는 홀수의 적은 쇄 길이의 올리고사카라이드를 생성하는 데에 사용되었다.
짝수의 올리고사카라이드는 아질산과의 부분적인 탈아미노화 분열을 통한 탈중합화에 의해 헤파린으로부터 생성되었고, 생성된 2,4-안하이드로-D-만노스 잔기는 NAB3H4 로 감소되었다. 표지된 올리고사카라이드는 짝수 종의 4-14 사카라이드 및 20-24 사카라이드가 함유된 분획을 생성하기 위해 분리되었다. 선택적으로 6-O-탈설페이트화된 헤파린은 4- 내지 12-사카라이드를 얻기 위해 유사하게 처리되었다. 분리되고 탈염된 올리고사카라이드는 약한 산 처리를 하였다. 홀수의 헤파린 올리고사카라이드는 20-24 량체의 사카라이드에 헤파리나제 I을 추가로 처리하여 수득하였다.
4-14량체의 올리고사카라이드는 N-아세틸화 GlcN 유닛에 의해 채워진 위치에서의 절단을 포함한 상이한 전략에 의해 인간 대동맥 HS로부터 생성되었다. 샘플은 N-탈아세틸화되고 이어 아질산으로 탈아미노되었다. 이러한 처리는 비치환된 GlcN 유닛의 탈아미노화 및 글루코사미니딕 결합의 절단으로 이어지는 반면 N-설페이트화된 GlcN 유닛은 온전하게 남아 있다. 생성물은 GlcA-[1-3H]aManR 디사카라이드 ((-GlcNAc)-(GlcA-GlcNac)n-서열로부터 유래) 및 GlcA-GlcNS03-HexA)n-[1-3H]aManR 올리고사카라이드 ((-GlcNac)-GlcA-(GlcNS03-HexA)n-GlcNac-서열로부터 유래)를 포함한다.
이러한 처리에 의해 생성된 올리고사카라이드는 본 발명의 HS와는 구별되는 그들의 제조 과정에 의해 짧고 화학적으로 변형되었다.
발명의 개요
본 발명은 헤파란 설페이트 제제, 헤파란 설페이트 HS8에 관한 것이다. HS8은 FGF2에 결합하는 것으로 밝혀졌고, 그들의 전분화능/다분화능을 유지하는 동안 줄기세포의 증식을 향상시킨다. HS8은 구조적으로 및 기능적으로 관련된 분리된 헤파란 설페이트의 신규한 클래스를 지칭한다. 본 발명자들은 짧은 보존 서열(YCKNGGF)을 공유하는 FGF2로부터 유래된 헤파린 결합 도메인에 결합하는 공통적인 특징을 갖는 몇몇의 밀접하게 관련된 HS8 클래스의 구성원을 확인하였다. HS8 클래스의 구성원은 줄기세포의 증식을 자극하고, 콜로니 형성 단위(CFU)를 높일 수 있다.
본 발명의 하나의 양태로서, 헤파란 설페이트 HS8이 제공된다. HS8은 분리된 형태 또는 실질적으로 정제된 형태로 제공될 수 있다. 이는 헤파란 설페이트 성분이 적어도 80% HS8, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나 이상인 조성물을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, HS8은 YCKNGGF(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 펩타이드는 이 서열의 한쪽 또는 양쪽에 하나 또는 그 이상의 추가적인 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 이 서열의 한쪽 또는 양쪽에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 임의의 아미노산을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, HS8은 하기 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지거나 이로 이루어지는 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다:
ㆍ YCKNGGF (서열번호 2), 또는
ㆍ GHFKDPKRLYCKNGGF (서열번호 1).
다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 FGF2 단백질이다. 일부 실시형태에서 HS8은 100μM보다 낮은 KD로, 보다 바람직하게는 50μM, 40μM, 30μM, 20μM, 또는 10μM 중 하나보다 낮은 KD로, 서열번호 1, 2 또는 FGF2 단백질 중 임의의 아미노산 서열을 가지거나 이로 이루어지는 펩타이드에 결합한다.
HS8은 여기에 기재된 본 발명자들의 방법론에 따라 수득되거나, 확인되거나, 분리되거나, 또는 강화될 수 있으며, 이는 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:
(i) 지지체에 부착된 폴리펩타이드 분자를 갖는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 여기에서 상기 폴리펩타이드는 YCKNGGF의 아미노산 서열을 갖는 헤파린-결합 도메인을 포함하는 것인 단계;
(ii) 상기 폴리펩타이드 분자를 글리코사미노글리칸을 포함하는 혼합물과 접촉하여 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스를 형성시키는 단계;
(iii) 상기 혼합물의 나머지로부터 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스를 분할하는 단계;
(iv) 상기 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스로부터 글리코사미노글리칸을 해리시키는 단계;
(v) 상기 해리된 글리코사미노글리칸을 수집하는 단계.
일부 실시형태에서, 지지체에 부착된 폴리펩타이드는 하기에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
ㆍ YCKNGGF (서열번호 2), 또는
ㆍ GHFKDPKRLYCKNGGF (서열번호 1).
본 발명자들의 방법론에서, 혼합물은 상업적으로 이용가능한 원료로부터 수득된 글리코사미노클리칸을 포함할 수 있다. 하나의 적절한 원료는 헤파란 설페이트 분획, 예를 들어 상업적으로 이용가능한 헤파란 설페이트이다. 하나의 적절한 헤파란 설페이트 분획은 돼지 장관 점막으로부터 헤파린을 분리하는 동안 수득될 수 있다 (예를 들어, Celsus Laboratories Inc. 때때로 "Celsus HS"로 불림).
헤파란 설페이트의 다른 적절한 원료는 임의의 포유동물(인간 또는 비-인간), 구체적으로 신장, 폐 또는 장관 점막으로부터의 헤파란 설페이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 헤파란 설페이트는 돼지 또는 소 장관 점막, 신장 또는 폐로부터 유래된다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기의 양태 중 어느 하나에 따른 HS8 및 FGF2 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기에 기재된 양태에 따른 HS8을 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제가 제공된다. 약제학적 조성물 또는 약제는 추가로 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 또는 희석제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료 방법에 사용되고, 상기 방법은 조직, 예를 들어 골절의 회복 및/또는 재생을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 또는 약제는 추가로 FGF2 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 또는 약제는 추가로 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, HS8은 의학적 치료의 방법에의 사용에 제공된다. 의학적 치료의 방법은 생체 내(in vivo) 상처 치유, 조직의 회복 및/또는 재생, 결합조직의 회복 및/또는 재생, 골의 회복 및/또는 재생, 및/또는 포유동물 또는 인간에서 골의 회복 및/또는 재생의 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 관련된 양태에서, 의학적 치료의 방법에서 사용되는 약제의 제조에 있어 HS8의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 의학적 치료의 방법은 포유동물 또는 인간에서 골절의 회복 및/또는 재생을 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태에서, 생체물질 및 HS8을 포함하는 생체적합성 임플란트 또는 보철물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 임플란트 또는 보철물은 HS8로 코팅된다. 일부 실시형태에서 임플란트 또는 보철물은 HS8이 주입되어 있다. 임플란트 또는 보철물은 추가로 FGF2 단백질 및/또는 중간엽 줄기세포로 코팅되거나 이들이 주입되어 있을 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 생체적합성 임플란트 또는 보철물을 형성하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 생체물질을 HS8로 코팅하거나 또는 이를 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 생체물질을 FGF2 단백질 및 중간엽 줄기세포 중 하나 또는 둘 모두로 코팅하거나 이들을 주입하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 환자에서 골절을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HS8의 치료학적 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 골절 주변의 조직에 HS8을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 골절 주변의 조직에 HS8의 주입을 포함한다. 그러한 방법에서, HS8은 HS8 및 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제로서 제제화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 FGF2 단백질을 환자에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그러한 방법에서, HS8 및 FGF2 단백질은 HS8 및 FGF2 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 중간엽 줄기세포를 환자에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그러한 방법에서, HS8, FGF2 단백질 및 중간엽 줄기세포 중 적어도 둘이, HS8, FGF2 단백질 및 중간엽 줄기 세포 중 적어도 둘, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다.
바람직하게는, HS8, FGF2 단백질 및 중간엽 줄기세포는 각각 치료학적 유효량이 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 골절 치료 방법은 추가로 치료학적 유효량의 HS8, 및/또는 FGF2 단백질 및/또는 중간엽 줄기세포를, HS8, 및/또는 FGF2 단백질 및/또는 중간엽 줄기세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물로 제제화하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 약제학적 조성물은 환자에 투여된다.
본 발명의 다른 양태에서, 환자에서 골절을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 생체물질 및 HS8을 포함하는 생체적합성 임플란트 또는 보철물을 골절부위 또는 그 주변에서 환자의 조직내로 외과적으로 임플란트하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 임플란트 또는 보철물은 HS8로 코팅된다. 일부 실시형태에서, 임플란트 또는 보철물은 HS8가 주입된다. 일부 실시형태에서, 임플란트 또는 보철물은 추가로 FGF2 단백질 및 중간엽 줄기세포 중 하나 또는 둘 모두가 주입된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 배양 배지가 제공되고, 상기 배양 배지는 HS8를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 시험관내(in vitro) 세포 배양에서 HS8의 용도가 제공된다. 본 발명의 관련된 양태에서, 시험관내 결합조직의 성장에서 HS8의 용도가 제공된다. 본 발명의 다른 관련된 양태에서, 시험관내 결합조직의 성장 방법이 제공되고, 상기 방법은 외부에서 추가된 HS8과 접촉하는 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 치료가 필요한 인간 또는 동물 환자에서 조직의 회복, 교체 또는 재생 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 시험관내에서 중간엽 줄기세포가 조직을 형성하기 위한 충분한 기간 동안 HS8과 접촉하는 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계;
(ii) 상기 조직을 수집하는 단계;
(iii) 상기 조직을 손상 또는 질환이 있는 부위의 환자의 생체내로 임플란트하여 환자에서 조직을 회복, 교체 또는 재생하는 단계.
상기 조직은 결합조직, 예를 들어, 골, 연골, 힘줄, 또는 지방일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 중간엽 줄기세포를 외부의 FGF2 단백질을 갖는 배지에서 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, HS8의 존재 하에 중간엽 줄기세포의 시험관내 배양에 의해 수득된 조직이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 조직은 HS8 및 FGF2 단백질의 존재 하에 중간엽 줄기세포의 시험관내 배양에 의해 수득된 것이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 줄기세포, 예를 들어 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HS8과 접촉하는 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 시험관내에서 줄기세포를 배양하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 시험관내에서 헤파란 설페이트 HS8과 접촉하는 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다. HS8은 바람직하게는 외부의 것이고 분리된 것이며, 보충물, 예를 들어 배양 배지의 일부로 배양시 추가된다.
바람직한 실시형태에서, HS8과 접촉하면서 배양되는 줄기세포는 집단에서 확장되고(즉, 줄기세포의 수가 증가하고), 높은 비율의 배지내 세포는 모줄기세포의 다능성 또는 전능성 특성을 유지한다(예를 들어, 줄기세포의 타입의 특정 조직 타입으로 분화하기 위한 줄기세포의 능력). 예를 들어, 바람직하게는 적어도 배양시 줄기세포의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 는 모줄기세포의 다능성 또는 전능성 특성을 나타낸다. 바람직하게는, HS8는 배양시 다능성 또는 전능성인 세포의 비율(예를 들어, 퍼센트)을 증가시키는 작용을 한다. 이는 출발 배양에서 다능성 또는 전능성인 세포의 수와 비교하여 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다능성 또는 전능성 세포의 비율의 증가는 단지 외부의 HS8의 존재의 결핍만이 상이한 배양 조건에 해당하는 줄기세포의 대조군 배양에 대비하여 비교될 수 있다. 줄기세포 배양은 선택적으로 FGF2를 함유 또는 비함유할 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 콜로니 형성 단위(CFU), 즉 단일 세포 전구체로부터 유래된 줄기세포의 콜로니를 생산할 수 있는 단일 줄기세포의 수의 증가를 제공한다. 상기 증가는 배양시 CFU인 세포의 퍼센트의 수, 예를 들어 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 증가로서 측정될 수 있다. 상기 증가는 배양의 기간으로, 단일 계대로, 또는 선택된 수의 계대, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 계대로, 초기 배양시 CFU의 수와 비교한 증가의 결정으로 측정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 배양 방법은 줄기세포의 증식 및 줄기세포 수의 확장을 할 수 있게 하고, 전구 세포의 높은 비율이 다능성 또는 전능성이고/이거나 CFU이다. 따라서, 본 발명의 방법은 시험관내 배양에서 줄기세포 확장 동안 전능성 또는 다능성 줄기세포의 전능성 또는 다능성 상태의 상실을 예방 또는 감소시키는 것을 제공한다. 이는 전구 세포에서 줄기세포 특성이 상실되는 것이 일반적인 기존의 줄기세포 배양 방법보다 유리한 것이다. 그러므로, 본 발명의 방법은 의약, 진단 및 연구에 사용되는 많은 수의 줄기세포를 수득하는 수단을 제공하여 다능성/전능성 줄기세포 및/또는 CFU를 위한 줄기세포 배양을 강화시키는 수단을 제공한다.
따라서, 본 발명의 방법은 높은 비율(예를 들어, 퍼센트)의 전능성 또는 다능성 및/또는 CFU인 세포를 갖도록 배양을 향상시킴과 동시에 줄기세포 배양의 증식 및 확장을 할 수 있게 한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 중간엽 줄기세포(MSC)의 배양에서 콜로니 형성 단위(CFU-F)를 높이는 방법이 제공되고, 상기 방법은 시험내에서 헤파란 설페이트HS8과 접촉하는 MSC를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 배양시 중간엽 줄기세포 및/또는 콜로니 형성 단위(CFU-F)를 높이는 방법을 제공하고, 상기 방법은 시험관내에서 헤파란 설페이트 HS8과 접촉하는 MSC를 배양하여 배양된 세포를 증식시키고 MSC의 집단을 확장시키는 단계를 포함하며, 여기에서 확장된 MSC 집단이 하기와 같이 특징지어진다:
ㆍ MSC 집단의 2% 이하가 CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR 중 어느 하나를 발현하고;
ㆍ MSC 집단의 95% 이상이 CD105, CD73 및 CD90을 발현하고;
ㆍ MSC 집단의 40% 이상이 CD49a를 발현하고/하거나;
ㆍ MSC 집단의 50% 이상이 SSEA-4를 발현하고/하거나;
ㆍ MSC 집단의 20% 이상이 STRO-1을 발현한다.
본 발명의 다른 양태에서, 중간엽 줄기세포(MSC)의 배양시 중간엽 줄기세포 및/또는 콜로니 형성 단위(CFU-F)를 높이는 방법을 제공하고, 상기 방법은 시험관내에서 헤파란 설페이트 HS8과 접촉하는 MSC를 배양하는 단계, 및 MSC를 계대하는 단계를 포함하며, 여기에서 1 또는 그 이상의 계대 후 MSC 집단이 하기와 같이 특징지어진다:
ㆍ MSC 집단의 2% 이하가 CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR 중 어느 하나를 발현하고;
ㆍ MSC 집단의 95% 이상이 CD105, CD73 및 CD90을 발현하고;
ㆍ MSC 집단의 40% 이상이 CD49a를 발현하고/하거나;
ㆍ MSC 집단의 50% 이상이 SSEA-4를 발현하고/하거나;
ㆍ MSC 집단의 20% 이상이 STRO-1을 발현한다.
줄기세포 또는 MSC의 집단 또는 배양물은 본 발명에 기재된 방법에 의해 수득되거나 생산된다.
MSC의 집단 또는 배양물은 하기와 같이 특징지어진다:
ㆍ MSC 집단의 2% 이하가 CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR 중 어느 하나를 발현하고;
ㆍ MSC 집단의 95% 이상이 CD105, CD73 및 CD90을 발현하고;
ㆍ MSC 집단의 40% 이상이 CD49a를 발현하고/하거나;
ㆍ MSC 집단의 50% 이상이 SSEA-4를 발현하고/하거나;
ㆍ MSC 집단의 20% 이상이 STRO-1을 발현한다.
일부 실시형태에서, CD49a를 발현하는 MSC 집단의 퍼센트는 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 또는 70% 중 하나 또는 그 이상보다 크거나 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, SSEA-4를 발현하는 MSC 집단의 퍼센트는 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 80% 중 하나 또는 그 이상보다 크거나 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, STRO-1을 발현하는 MSC 집단의 퍼센트는 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% 또는 50% 중 하나 또는 그 이상보다 크거나 같을 수 있다.
일부 실시형태에서, 바람직한 계대 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 계대 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 기재된 줄기세포의 배양 방법은 시험관내에서 줄기세포를 분리하고/하거나 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 기재된 방법은 또한 하기 단계 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다:
ㆍ 동물 또는 인간으로부터 줄기세포, 예를 들어 기질세포, 또는 골수 기질세포를 수득하는 단계,
ㆍ 줄기세포를 분리하는 단계,
ㆍ STRO-1 발현 MSC를 분할하고/하거나 분리하는 단계, 예를 들어 유세포분석 또는 자기 또는 형광 활성 세포 분류에 의해,
ㆍ STRO-1+ bnght MSC를 분할하고/하거나 분리하는 단계, 예를 들어 유세포 분석 또는 자기 또는 형광 활성 세포 분류에 의해,
ㆍ STRO-1 bright/CD106+ MSC를 분할하고/하거나 분리하는 단계, 예를 들어 유세포 분석 세포 분류(FACS)에 의해,
ㆍ 줄기세포의 보관 단계, 예를 들어 동결보존에 의해. 이는 강화된/확장된 줄기세포의 시험관내 배양 또는 확장에 앞서 동물 또는 인간으로부터 수득된 세포의 보관을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 부품들의 키트를 제공하고, 상기 키트는 기결정된 양의 HS8 및 기결정된 양의 FGF2를 포함한다. 상기 키트는 기결정된 양의 HS8을 함유하는 제1용기 및 기결정된 양의 FGF2를 함유하는 제2용기를 포함할 수 있다. 상기 키트는 추가로 기결정된 양의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 상기 키트는 의학적 치료 방법의 사용에 제공될 수 있다. 의학적 치료 방법은 포유동물 또는 인간에서 생체내 상처 치유, 결합조직의 회복 및/또는 재생, 골의 회복 및/또는 재생 방법을 포함할 수 있다. 상기 키트는 의학적 치료를 제공하기 위하여 HS8, FGF2 단백질 및/또는 중간엽 줄기세포를 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여하기 위한 지시서와 함께 제공될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 제품을 제공하고, 상기 제품은 의학적 치료 방법에서 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위한, 치료학적 유효량의
(i) HS8; 및
(ii) FGF2 단백질;
(iii) 중간엽 줄기세포 중 하나 또는 둘 모두
를 함유한다. 상기 의학적 치료 방법은 포유동물 또는 인간에서 생체내 상처 치유, 결합조직의 회복 및/또는 재생, 골의 회복 및/또는 재생 방법을 포함할 수 있다. 상기 제품은 선택적으로 동시투여를 위한 조합된 제제로 제제화될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 다음과 같다.
본 발명의 하나의 양태에서, FGF2에 높은 결합 친화도를 갖는 GAG가 제공된다. 보다 바람직하게는 GAG는 헤파란 설페이트(HS)이다. 하나의 실시형태에서, HS는 YCKNGGF의 아미노산 서열을 함유하는 FGF2의 헤파린-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 고체 지지체에 부착되어 GAG-폴리펩타이드 컴플렉스가 형성된, 본 발명에 기재된 방법론에 따라, 돼지 장관 점막으로부터 수득된 GAG 혼합물로부터 분리된 것이다(Celsus Laboratories Inc, Cincinnatti, USA로부터 이용가능하며, 예를 들어 INW-08-045, Heparan Sulfate I, Celsus Lab Inc, HO-03102, HO-10595, 10 x 1OOmg). GAG-폴리펩타이드 컴플렉스로부터 GAG 성분의 해리는 본 발명에서 "HS8"라 불리는 고유한 HS의 분리로 이어졌다. 하나의 실시형태에서, HS8은 폴리펩타이드 GHFKDPKRLYCKNGGF(서열번호 1)가 고체 지지체에 부착되고, GAG-폴리펩타이드 컴플렉스가 형성되고, GAG-폴리펩타이드 컴플렉스로부터 GAG 성분을 해리시켜 분리된 HS이다.
본 발명자들은 HS8가 포유동물(인간 및 비-인간) 조직 및/또는 세포외 기질을 포함하는 다수의 원료로부터 수득된 HS 분획으로부터 수득될 수 있다고 확신한다.
그에 따라, 본 발명의 하나의 양태에서, HS8이 제공된다. HS8는 분리된 또는 정제된 형태로 제공될 수 있다. 다른 양태에서, HS8을 포함하는 배양 배지가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, HS8를 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제가 제공되고, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 또는 희석제와 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 또는 약제는 FGF2 단백질을 포함할 수 있다. HS8을 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제는 손상 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위하여 제공된다. 손상 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서 HS8의 용도 또한 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 치료가 필요한 환자에서 손상 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 환자에게 치료학적 유효량의 HS8을 투여하는 단계를 포함한다. 투여된 HS8은 적절한 약제학적 조성물 또는 약제로 제제화될 수 있으며, 추가로 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 또는 희석제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 약제학적 조성물 또는 약제는 또한 FGF2 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, HS8을 골 전구 세포 또는 골 줄기세포에 투여하는 단계를 포함하는, 골 형성(골 세포 및/또는 골 조직의 형성)을 촉진하거나 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, HS8을 연골 전구 세포 또는 연골 줄기세포에 투여하는 단계를 포함하는, 연골 조직의 형성(연골형성)을 촉진하거나 억제하는 방법이 제공된다.
골 형성 또는 연골 조직의 형성을 자극하거나 억제하는 방법은 골 또는 연골 전구 또는 줄기세포를 HS8와 접촉시키는 단계에 의해 시험관내에서 수행될 수 있으며, 선택적으로 외부에서 추가된 FGF2 단백질의 존재 하에서 수행될 수 있다. 전구세포 또는 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 조직 형성이 촉진되면, 형성된 조직은 인간 또는 동물 환자 내에 주입되기 위해 수집되고 사용될 수 있다.
그에 따라, 본 발명의 하나의 양태에서, HS8(즉, 외부의 HS8)의 존재 하에서, 및 선택적으로 FGF2(즉, 외부의 FGF2)의 존재 하에서 중간엽 줄기세포의 시험관내 배양에 의해 수득된 결합조직이 제공된다. 상기 결합조직은 골, 연골, 근육, 지방, 인대 또는 힘줄일 수 있다.
HS8을 이용한 질환의 예방 또는 치료는 조직, 구체적으로는 골, 연골, 근육, 지방, 인대 또는 힘줄과 같은 결합조직의 회복, 재생 또는 교체를 포함할 수 있다.
이 조직 중 하나의 악화를 갖는 환자에서, HS8의 악화된 부위로의 투여는 그 부위의 조직의 성장, 증식 및/또는 분화를 자극하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 투여된 부위 또는 그 근처에 존재하는 중간엽 줄기세포의 자극은, 바람직하게는 FGF2 또한 그 부위에 존재할 때, 중간엽 줄기세포의 적절한 결합조직 내로의 증식 및 분화로 이어질 수 있으며, 그에 의해, 손상된 조직의 교체/재생 및 손상의 치료를 제공한다.
대안적으로, HS8과 접촉하는 중간엽 줄기세포의 시험관내 배양으로부터 수득된 결합조직은 손상되거나 악화된 조직을 교체하기 위해 손상 또는 질환의 부위에서 수집되고 주입될 수 있다. 손상되거나 악화된 조직은 선택적으로 먼저 손상 또는 질환의 부위로부터 잘라내어질 수 있다.
다른 양태에서, 약제학적 조성물은 줄기세포, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 및 HS8을 함유하도록 제공될 수 있다. 조성물의 손상, 질환 또는 악화된 부위로의 투여, 예를 들어 주입은 그 부위에서 조직의 재생을 위해 제공된다.
그에 따라, 치료가 필요한 환자로의 HS8의 직접 적용, 선택적으로 FGF2 및/또는 줄기세포와의 조합에 의해, 조직 회복, 재생 및/또는 교체(예를 들어, 반흔 조직 또는 골절의 치유)를 포함하는 생체내 상처 치유를 가져와, HS8은 유용하다. HS8은 조직 회복, 재생 및/또는 교체가 필요한 환자 내로 주입하기에 알맞아 조직의 시험관내 재생에서도 또한 유용하다.
본 발명의 다른 양태에서, 줄기세포 시험관내 배양 방법이 제공되고, 상기 방법은 시험관내에서 HS8과 접촉하는 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다. HS8은 바람직하게는 배양된 세포와 접촉하는 외부의 HS8이다. 이는 배양 배지의 일부로서 또는 배양시 개별적으로 추가되어 제공될 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 줄기세포의 증식을 포함할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 다수의 집단 배가 또는 계대, 예를 들어 적어도 하나의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 집단 배가 또는 계대에도 줄기세포의 전능성 또는 다능성 상태를 유지하는 것을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 시험관내에서 줄기세포의 배양을 확장하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 단일 줄기세포를 1 x 103 보다 많은 줄기세포의 집단으로 확장시키는 것을 포함하며, 줄기세포 배양을 HS8과 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, cm2 당 약 2000 내지 5000 세포의 초기 배양 크기로부터 적어도 1x103 배 많은 줄기세포를 함유하는 확장된 배양 크기로, 시험관내에서 줄기세포의 배양을 확장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 줄기세포 배양을 HS8과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 초기 배양 크기와 확장된 배양 크기 사이에 확장된 배양 시간은 40일, 30일, 25일 중 하나보다 적다.
다른 실시형태에서, 줄기세포의 배양에서 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 증가시키는 시험관내 방법이 제공되고, 상기 방법은 HS8와 접촉하는 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, CFU는 CD49a, CD73, CD105, STRO-1 또는 CD90 중 하나 또는 그 이상을 발현한다.
다른 실시형태에서, 중간엽 줄기세포의 시험관내 배양에서 STRO-1 또는 STRO-1+bright 세포의 비율을 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 HS8과 접촉하는 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 시험관내 배양에서 줄기세포 확장 동안 다능성 줄기세포의 다능성 상태의 상실을 예방하거나 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 HS8과 접촉하는 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 10 집단 배가 동안 배양시 줄기세포를 유지하는 것을 포함한다.
본 발명에서 보는 바와 같이, HS8은 FGF2를 안정화시키는 특성을 갖고, 그에 의해 그 작용을 연장시킨다. HS8은 배양배지에서 분해로부터 FGF2를 예방한다(도 46). 이는 FGF2 제제의 보관 및 배양 배지를 함유하는 FGF2의 제조에 유용하게 적용될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 하나의 양태에서, 성장인자 및 분리된 HS8을 포함하는 조성물이 제공된다. 성장인자는 단백질 성장인자, 바람직하게는 FGF2일 수 있다. 상기 조성물은 분리된 FGF2 및 분리된 HS8을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 배양 배지일 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 FGF2를 함유하는 약제학적 조성물 또는 약제일 수 있다.
상기 조성물은 용기 내에 FGF2 및 분리된 HS8을 포함하는 FGF2 제제일 수 있다. 적절한 용기는 병, 유리병, 튜브 또는 주사기일 수 있다.
성장인자의 안정성을 증가시키는 방법 또한 제공되며, 상기 방법은 성장인자를 분리된 HS8과 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 성장인자의 안정성은 그의 반감기(즉 주어진 조성물에서 성장인자의 반이 분해되고/되거나 그 활성을 잃을 때까지 걸리는 시간의 양) 면에서 측정될 수 있다. 상기 성장인자는 바람직하게는 단백질 성장인자, 보다 바람직하게는 FGF2이다. HS8은 FGF2 반감기를 유지하고 연장시키는 작용을 한다. 상기 방법은 분리된 HS8을 시험관내에서 성장인자(예를 들어, FGF2)와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다(예를 들어, 성장인자(예를 들어, FGF2) 조성물, 그의 보관 또는 수송의 제제의 일부로서). 대안적으로, 상기 방법은 분리된 HS8을 생체내에서 성장인자(예를 들어, FGF2)와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다(예를 들어, 분리된 HS8을 성장인자(예를 들어, FGF2)가 조직 내에 자연적으로 존재하거나 외부에서 조직으로 추가되어 존재하는 조직에 투여함에 의해). 상기 방법은 또한 외부의 성장인자(예를 들어, FGF2)를 조직 내에 추가하는 단계를 포함할 수 있다.
분리된 HS8을 함유하는(또는 분리된 HS8이 추가되어) 주어진 조성물 또는 조직에서 FGF2의 안정성은 HS8이 함유되지 않은(또는 분리된 HS8이 추가되지 않은) 비슷한 조성물과 비교할 수 있다.
여기에 기술된 것과 같이, 상기에서 기술한 조성물 및 방법에서 HS8은 정제될 수 있다. FGF2는 분리되거나 및/또는 정제되거나, 비-분리되거나 또는 부분적으로 분리되거나, 예를 들어, 세포외 매트릭스 물질의 일부, 또는 세포의 조성 내에 존재하는 것일 수 있다. 분리된 또는 정제된 FGF2는 재조합 FGF2일 수 있다. 재조합 FGF2는 Peprotech; 머크 밀리포어 엠에이(Merck Millipore, MA); 라이프 테크놀로지스 코오포레이션(Life Technologies Corporation); 깁코(Gibco); 및 인비트로젠(Invitrogen)과 같은 많은 제조업자로부터 상업적으로 이용가능하다.
선택적으로, 본 발명의 양태 및 실시형태는 Brickman 등 (WO2010/011185 내의 Glycobiology Vo.8, No.5, pp.463-471, 1998)에서 기술된 HS1 또는 HS2를 포함하지 않는다. 일부 실시형태로, 본 발명에 따른 헤파란 설페이트는 HS2, 및/또는 도 29에 따른 질산 디사카라이드 분해 프로파일을 가지는 헤파란 설페이트, 및/또는 도 30에 따른 질산 디사카라이드 분해 프로파일을 갖는 헤파란 설페이트를 포함하지 않는다.
바람직한 실시형태의 기술
본 발명자는 HS8이라 불리는 새로운 부류의 헤파란 설페이트 분자를 규명하였다. 이들은 HS8이 다음과 같은 유리한 특성을 가짐을 보였다:
ㆍ HS8은 STRO1을 발현하는 중간엽 줄기 세포(MSC)를 강화시킨다 (도 12, 도 14);
ㆍ HS8은 STRO-1+ve 친화적인 분리된 MSC 및 플라스틱에의 부착에 의해 분리된 MSC의 성장을 증가시키는 결과를 발생시킨다(도 17, 18, 19, 20)
ㆍ HS8이 결핍된(HS8-ve 분획물) 헤파란 설페이트와는 달리, HS8은 국제적으로 인지되고 있는 인간 MSC의 정의와 일치하는 표면 마커 발현 패턴을 갖는 인간 MSC의 집단을 강화시킨다 (도 22).
ㆍ HS8과의 hMSC의 배양은 CD49a, SSEA-4 및 STRO-1의 높은 발현수준을 갖는 인간 MSC 집단을 제공한다(도 22). 반면, 배양 보충물(supplement)로서 FGF-2의 hMSC에의 첨가는 STRO-1을 발현하는 hMSC의 부분에 부정적으로 영향을 미치고, hMSC의 다능성(multipotentiality)의 손실이라는 결과를 발생시킨다(도 22, 23 및 25).
ㆍ HS8은 CFU-F 형성을 증가시킨다;
ㆍ HS8은 FGF-2 매개의 MSC 성장을 향상시킨다 (도 26);
ㆍ HS8은 ERK 경로의 FGF2 매개의 신호전달(signalling)을 유지시킨다.
ㆍ HS8은 중간엽 줄기세포의 증식을 촉진시킨다 (도 42 및 43).
HS8
본 발명은 HS8로 불리는 헤파란 설페이트 분자의 부류에 관한 것이다. HS8 분자는 FGF2의 헤파린-결합 도메인에 상응하는 폴리펩타이드에 결합하는 하나 또는 그 이상의 GAG를 포함하는 화합물의 혼합물을 강화시키는 방법에 의해 수득될 수 있다. 특히, HS8 분자는 FGF2의 헤파란 결합 도메인에 결합하는 헤파란 설페이트를 강화시킴으로써 수득될 수 있으며, 상기 도메인은 YCKNGGF의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이루어진 것일 수 있다. 강화 프로세스는 HS8을 분리하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 HS8로 강화된 화합물의 혼합물, 및 이러한 혼합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
여기에 기재된 방법론에 의해 수득될 수 있을 뿐만 아니라, HS8은 기능적으로 및 구조적으로 정의될 수 있다.
기능적으로, HS8은 YCKNGGF (서열번호 2)의 아미노산 서열을 가지는, 또는 이루어진 펩타이드에 결합할 수 있다. 펩타이드는 펩타이드의 한 쪽 또는 양 말단에 하나 또는 그 이상의 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예로써, 펩타이드는 GHFKDPKRLYCKNGGF (서열번호 1)일 수 있다.
바람직하게는, HS8은 100μM 미만, 보다 바람직하게는 50μM, 40μM, 30μM, 20μM, 또는 10μM 중 하나의 미만의 KD 값으로 펩타이드와 결합한다.
바람직하게는, HS8은 100μM 미만, 보다 바람직하게는 50μM, 40μM, 30μM, 20μM, 또는 10μM 중 하나의 미만의 KD 값으로 FGF2 단백질과 결합한다. HS8과 FGF2 단백질 간의 결합은 하기 어세이 방법에 의해 결정될 수 있다.
FGF2는 3μg/ml의 농도로 차단 용액(SAB 내 0.2% 젤라틴)에서 용해되고, 차단 용액에서 0-3μg/ml로부터 연속적으로 희석하는 것으로 계획하였다. FGF2의 각 희석액 200 μl를, 헤파린이 미리 코팅된 헤파린/GAG 결합 플레이트의 웰에 3배로(triplicate) 디스펜싱하였고; 37℃에서 2시간 동안 배양하였고, SAB로 조심스럽게 3번 세척하고 250 ng/ml의 바이오틴화된 항-FGF2 200μl를 차단 용액에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, SAB로 조심스럽게 3번 세척하고, 220 ng/ml의 ExtrAvidin-AP 200 μl를 차단 용액에 첨가하였고, 37℃에서 30분 동안 배양한 후, SAB로 조심스럽게 3번 세척하고, 잔류 액을 제거하기 위하여 태핑(tap)하고, 200μl의 개발 시약(Development Reagent, SigmaFAST p-나이트로페닐 포스페이트)을 첨가하였다. 실온에서 40 분간 배양하고, 1시간 이내에 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이 어세이에서 결합은 흡광도를 측정함으로써 결정될 수 있으며, 첨가된 헤파란 설페이트의 부재하에서 FGF2 단백질과 같은 대조군, 또는 헤파란 설페이트가 첨가되었으나 FGF2 단백질과 결합하지 않은 FGF2 단백질과 비교하여 결정될 수 있다.
HS8은 서열번호 1과 같은 YCKNGGF를 포함하는 펩타이드, 또는 FGF2 단백질과 높은 친화성의 결합 상호작용을 나타내는 헤파란 설페이트의 선발을 포함한 방법에 의해 다른 헤파란 설페이트 및/또는 GAG로부터 선별될 수 있다는 맥락에서, HS8의 결합은 비특이적 결합과는 달리, 바람직하게는 특이적이다.
본 발명에 따른 HS8은 바람직하게는 줄기세포의 증식을 증가시키는 반면, 그들의 전분화능 또는 다분화능을 유지시킨다.
헤파린 리아제 I, II 및 III로 완전히 분해시킴으로써 발생한 디사카라이드 단편을 모세관 전기영동 분석한 결과, HS8의 디사카라이드 조성은 도 44 및 45에 나타내었다.
헤파린 리아제 I, II 및 III로의 완전한 분해 이후, 발생한 디사카라이드 단편을 모세관 전기영동 분석하여 결정된 본 발명에 따른 HS8은, HS8 보유종(retained species)에 대한 도 45에서의, 또는 HS8 보유종에 대한 도 44에서의 각 디사카라이드에 대하여 보인 표준화된 백분율 값의 ±10% 이내 (보다 바람직하게는, ±9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 중에 하나)의 디사카라이드 조성을 갖는 헤파란 설페이트를 포함한다.
헤파린 리아제 I, II 및 III로의 완전한 분해 이후 발생한 디사카라이드 단편을 모세관 전기영동 분석하여 결정된 디사카라이드의 조성은 하기 중의 어느 하나에 따른 디사카라이드 조성을 가질 수 있다:
Figure 112015123615334-pct00001
또는
Figure 112015123615334-pct00002
또는
Figure 112015123615334-pct00003
또는
Figure 112015123615334-pct00004
또는
Figure 112019060090425-pct00005
또는
Figure 112015123615334-pct00006
바람직한 실시형태로서, 상기 기재된 8개의 디사카라이드의 총 중량 퍼센트는 100%이다(임의로 ±3.0% 이하, 또는 ±2.0% 이하, ±1.0% 이하, ±0.5% 이하).
성장 인자 BMP2에 대하여 높은 친화도를 갖는, HS3으로 불리는, 분리된 HS (WO2010-030244에 기재됨)와 HS8의 비교를 비교를 통해, HS3에 비해 HS8의 구조적 차이는 하기의 디사카라이드의 함량을 특징으로 한다: △UA-GlcNS,6S 및 △UA-GlcNS. 특히 HS8은 HS3보다 더 높은 퍼센트의 △UA-GlcNS,6S의 조성을 가지고, HS3보다 더 낮은 퍼센트의 △UA-GlcNS의 조성을 가진다.
따라서, HS8은 15.5±4.0 이하, 또는 ±3.5 이하, 또는 ±3.0 이하, 또는 ±2.5 이하, 또는 ±2.0 이하, ±1.5 이하, 또는 ±1.0 이하, 또는 ±0.5 이하, 또는 ±0.25 이하, 또는 ±0.1 이하의 △UA-GlcNS,6S의 백분율 조성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. HS8은 추가적으로 또는 선택적으로 15.7±4.0 이하, 또는 ±3.5 이하, 또는 ±3.0 이하, 또는 ±2.5 이하, 또는 ±2.0 이하, 또는 ±1.5 이하, 또는 ±1.0 이하, 또는 ±0.5 이하, 또는 ±0.25 이하, 또는 ±0.1 이하의 △UA-GlcNS의백분율 조성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
HS8은 또한 12.7±1.5 이하, ±1.0 이하, 또는 ±0.5 이하, 또는 ±0.25 이하, 또는 ±0.1 이하의 △UA,2S-GlcNS,6S의 백분율 조성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
HS8은 또한 7.2 또는 ±2.0 이하, ±1.5 이하, ±1.0 이하, 또는 ±0.5 이하, 또는 ±0.25 이하, 또는 ±0.1 이하의 △UA,2S-GlcNS의 백분율 조성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
HS8은 또한 6.5±1.5 이하, ±1.0 이하, 또는 ±0.5 이하, 또는 ±0.25 이하, 또는 ±0.1 이하의 △UA,2S-GlcNAc,6S의 백분율 조성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
HS8은 또한 8.9±0.5 이하, 또는 ±0.25 이하, 또는 ±0.1 이하의 △UA-GlcNAc,6S의 백분율 조성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
이러한 실시형태에서, 나머지 디사카라이드 성분의 백분율 조성은 상기에서 기재한 것이거나 또는 도 44 또는 도 45에서 보여주는 것에 대하여, ±10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 중에 하나일 수 있다 .
헤파린 리아제 I, II 및 III로의 HS8의 분해 및/또는 디사카라이드의 모세관 전기영동 분석 HS8의 분해는 바람직하게는 실시예 18에 따라 수행될 수 있다.
HS 제제(preparation)의 헤파린 리아제 효소로의 분해는 하기와 같이 수행될 수 있다: HS 제제(1 mg)들을 500 μL의 소듐 아세테이트 완충액 (10 mM의 칼슘 아세테이트를 포함하는 100 mM, pH 7.0)에 각각 용해시킨 후, 2.5 mU의 세 가지 효소를 각각 첨가한다; 시험관을 부드럽게 돌리면서(9 rpm) 시료를 37℃에서 밤샘(24h) 배양하고; 시험관을 부드럽게 돌리면서(9 rpm) 시료를 37℃에서 48시간 동안 추가로 배양한 시료에 2.5 mU의 세 가지 효소를 각각 추가로 첨가한다; 가열을 통해 분해를 중지시키고 (100℃, 5분), 그리고 나서 동결건조시킨다; 분해물은 500 μL의 물에 재현탁시키고, 분석을 위하여 분취(50μL)한다.
HS 제제들의 분해로부터 발생한 디사카라이드의 모세관 전기영동(capillary elecrtophoresis, CE)은 하기와 같이 수행될 수 있다: 20 mM H3PO4의 수용액을 20 mM Na2HPO4·12H2O에 첨가하여 pH 3.5의 모세관 전기영동 작동 완충액(operating buffer)을 제조한다; 컬럼 세척액은 (50% w/w NaOH로부터 희석된) 100 mM NaOH이다; 작동 완충액과 컬럼 세척액 모두 0.2 μm 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 필터로 피팅된 필터 단위를 사용하여 여과한다; 디사카라이드를 물(1 mg/mL)에 용해시켜 디사카라이드 Is (예컨대, 12)의 스톡 용액을 준비한다; 10 μg/100 μL의 각 디사카라이드를 포함하는 모든 표준을 포함하는 혼합물을 제조하여 표준에 대한 검량선을 결정하고, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 μg/100 μL 를 포함하는 연속 희석액을 제조한다; 2.5 μg/ml 내부 표준(△UA,2S-GlcNCOEt,6S)을 포함시킨다. HS의 분해물은 물로 희석시키고(50 μL/mL), 동일한 내부 표준(2.5 μg)을 각 시료에 첨가한다. 용액을 동결건조시키고, 물(1 mL)에 재현탁시킨다. 시료를 PTFE 친수성 일회용 시린지 여과단위(PTFE hydrophilic disposable syringe filer units)를 사용하여 여과시킨다.
30 kV의 모세관 전압으로 25℃에서 20 mM의 작용 완충액(operating buffer)을 사용하여 코팅되지 않은 융합된 실리카 모세관(uncoated fused silica capillary) 상에서 모세관 전기영동 기기를 사용하여 분석이 수행된다. 음극(역극성) 말단에서 유체역학 주입법을 사용하여 시료는 모세관에 주입된다. 각각 수행하기 전에 모세관을 100 mM NaOH(2 분), 물(2분) 및 프리-컨디션드 작용 완충액(5분)으로 씻어 낸다. 완충액 보충 시스템은 일정한 부피, pH 및 이온강도가 유지되도록 하기 위하여 주입구 및 배출구 튜브에서 완충액을 교체한다. 물은 오직 블랭크(blank)로서 시료 순서의 초반, 중반 및 말단부 모두에서 작동한다. 흡광도는 232 nm에서 관측된다. 모든 데이터는 데이터베이스에 저장하고 이후 검색되며, 재가동(re-processed)된다. 이중의 또는 삼중의 분해/분석이 수행될 수 있으며, HS 분해물 내의 디사카라이드의 표준화된 백분율은 분석 결과치의 중간 평균치로 계산된다.
일부 실시형태에서, HS8은 18 내지 27 kDa의 범위의 평균(중간) 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서 이는 20 내지 25 kDa, 21 내지 25 kDa, 21 내지 24 kDa, 21 내지 23 kDa, 20 내지 24 kDa, 20 내지 23 kDa, 또는 20 내지 22 kDa 중 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, HS8 쇄는 적어도 25 디사카라이드 단위를 포함한다. 일부 실시형태에서 이는 적어도 26 디사카라이드, 적어도 27 디사카라이드, 적어도 28 디사카라이드, 적어도 29 디사카라이드, 적어도 30 디사카라이드, 적어도 31 디사카라이드, 적어도 32 디사카라이드, 적어도 33 디사카라이드, 적어도 34 디사카라이드, 적어도 35 디사카라이드, 적어도 36 디사카라이드, 적어도 37 디사카라이드, 적어도 38 디사카라이드, 적어도 39 디사카라이드, 적어도 40 디사카라이드, 적어도 41 디사카라이드, 적어도 42 디사카라이드, 적어도 43 디사카라이드, 또는 적어도 44 디사카라이드 중에 하나일 수 있다.
HS8을 규명하기 위하여, 본 발명자들은 헤파린-결합 도메인을 갖는 특정 폴리펩타이드에 대한 결합력을 보이는 글리코사미노글리칸 분자를 강화시키는 방법을 사용하였다. 이후 분리된 GAG 혼합물 및/또는 분자들을 규명할 수 있었으며, 이들의 헤파린-결합 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는 세포 및 조직의 성장 및 분화를 조절하는 능력을 평가하였다. 이는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)모두에서 세포와 조직의 성장 및 분화에 대한 특정 GAG 사카라이드 서열의 효과의 조절된 분석을 가능케 하였다. 이 방법론은 PCT/GB2009/000469 (WO2010/030244)에 기술되어 있으며, 이는 본원의 참고문헌으로도 포함되어 있다. 본 발명자들은 FGF2에 높은 결합성을 갖는 GAG를 분리하고 이를 특정하기 위하여, 상기 방법론을 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2)에 적용시켰다.
따라서, HS8을 규명하기 위하여 본 발명자들은 헤파린/헤파란-결합 도메인을 갖는 단백질에 결합할 수 있는 글리코사미노글리칸을 분리하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 지지체에 부착된, 헤파린-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 분자를 가진 고체 지지체를 제공하는 단계;
(ⅱ) 상기 폴리펩타이드 분자를 글리코사미노글리칸을 포함하는 혼합물과 접촉시켜 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스를 형성하도록 하는 단계;
(ⅲ) 상기 혼합물의 잔류물로부터 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스를 분획하는 단계;
(ⅳ) 상기 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스로부터 글리코사미노글리칸을 분리시키는 단계;
(ⅴ) 분리된 글리코사미노글리칸을 수집하는 단계.
본 발명자들은 또한 세포 또는 조직의 성장 또는 분화를 조절하는 능력에 의해 규명된 분리된 글리코사미노글리칸을 제공하였다. 이를 위하여 그들은 세포 및/또는 조직의 성장 및/또는 분화를 자극 또는 억제할 수 있는 글리코사미노글리칸을 규명하는 방법을 제공하였으며, 그 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 지지체에 부착된, 헤파린-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 분자를 가진 고체 지지체를 제공하는 단계;
(ⅱ) 상기 폴리펩타이드 분자를 글리코사미노글리칸을 포함하는 혼합물과 접촉시켜 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스를 형성하도록 하는 단계;
(ⅲ) 상기 혼합물의 잔류물로부터 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스를 분획하는 단계;
(ⅳ) 상기 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스로부터 글리코사미노글리칸을 분리시키는 단계;
(ⅴ) 분리된 글리코사미노글리칸을 수집하는 단계;
(ⅵ) 수집된 글리코사미노글리칸을, 헤파린-결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 존재하는 세포 또는 조직에 첨가하는 단계;
(ⅶ) 세포의 증식, 세포의 분화, 및 하나 이상의 단백질 마커의 발현 중에서 하나 이상을 측정하는 단계.
본 발명자들은 (HS8이라 불리는) FGF2에 결합할 수 있는 GAG를 규명하기 위하여 이러한 방법을 사용하였으며, 본 발명자들의 방법론에서 사용한 폴리펩타이드는 GHFKDPKRLYCKNGGF (서열번호 1)의 헤파린-결합 도메인을 포함하였다.
본 발명자들의 방법론에서, GAG를 포함하는 혼합물은 합성 글리코사미노글리칸을 포함할 수 있다. 그러나 세포 또는 조직으로부터 수득된 GAG가 바람직하다. 예를 들어, 혼합물은 세포외 매트릭스(extracellular matrix)를 포함할 수 있는데, 여기에서 세포외 매트릭스 물질은 인사이투(in situ)로 살아있는 조직을 긁어 냄으로써(즉, 수득된 인간 또는 동물의 신체 내에 있는 조직으로부터 직접적으로), 또는 인간 또는 동물의 신체로부터 추출된 (살아있거나 죽은) 조직을 긁어냄으로써 수득될 수 있다. 아니면, 세포외 매트릭스 물질은 배양물 내에서 자란 세포로부터 수득될 수도 있다. 세포외 매트릭스 물질은 결합조직 또는 결합조직 세포, 예를 들어, 뼈, 연골, 근육, 지방, 인대 또는 힘줄로부터 수득될 수 있다. 일 실시형태로 돼지 점막(porcine mucosa) 유래의 상업적으로 이용가능한 헤파란 설페이트(Celsus HS)를 사용하였다.
GAG 성분은 당업계에 잘 알려진 일련의 통상적인 분리 단계(예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피)에 의해 조직이나 세포 시료 또는 추출물로부터 추출될 수 있다.
GAG 혼합물은 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 헤파란 설페이트를 포함한, 서로 다른 종류의 글리코사미노글리칸의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 고체 지지체와 접촉된 GAG 혼합물은 헤파란 설페이트가 강화되어 있다. 헤파란 설페이트-강화된 GAG 분획물은 GAG 혼합물 상에서 강한 고성능액체크로마토그래피(SAX-HPLC) 뿐만 아니라, 컬럼 크로마토그래피, 예를 들어 약한, 중간의 또는 강한 음이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 적절한 분획물의 분리와 함께 수득될 수 있다.
GAG를 규명하기 위하여 수집된 GAG는 추가적인 분석, 예를 들어 GAG 조성 또는 서열 결정, 또는 GAG의 구조적 특징의 결정이 필요하다. GAG 구조는 전형적으로 고도로 복잡하기 때문에, 현재 사용가능한 분석기술을 고려한다면 GAG 서열 구조의 정확한 결정은 불가능한 경우가 대부분이다.
그러나, 수집된 GAG 분자는, GAG의 특이적이면서도 동시에 진단적인 사카라이드 단편을 생산하기 위하여, 부분적 또는 완전한 사카라이드 분해 (예를 들어, 질산에 의해 화학적으로, 또는 헤파리나제 Ⅲ와 같은 리아제에 의한 효소적으로)의 대상이 될 수 있다. 특히, 디사카라이드(또는 테트라사카라이드)를 생산하기 위한 분해는 수득된 각 디사카라이드의 퍼센트를 측정하기 위하여 사용될 수 있으며, 이는 GAG의 특이적인 디사카라이드 "핑거프린트"를 제공할 것이다.
GAG의 설페이트화(sulphation) 패턴 또한 결정될 수 있으며, GAG 구조를 결정하기 위하여도 사용될 수 있다. 예를 들어, 헤파란 설페이트에 대하여 아미노당 위치에서 및 C2, C3 및 C6 위치에서 설페이트화의 패턴은 헤파란 설페이트를 특징짓는데 사용될 수 있다.
디사카라이드 분석, 테트라사카라이드 분석 및 설페이트화의 분석은, GAG에 대하여 유일한 스펙트럼을 각각 제공할 수 있는 HPLC, 질량 분석법 및 NMR과 같은 다른 분석적 기법과 함께 사용될 수 있다. 이와 함께 이들 기법은 GAG의 결정적인 구조적 특징을 제공할 수 있다.
예를 들면, HS8의 1H NMR 스펙트럼을 (HS8이 유래되었던) Celsus HS 및 HS3 (BMP2 결합 HS)와 비교하여 도 31 및 32에 나타내었다. 본 발명에 따른 HS8은 도 31 또는 32의 HS8 스펙트럽과 상응되는 1H NMR 스펙트럼을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 HS8은 4.0-3.5 ppm에서의 1H NMR 스펙트럼이 도 32에서의 HS8 (3.8-3.7 ppm 사이의 윗선)과 상응하는 1H NMR 스펙트럼을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 HS8은 약 3.8 ppm 및/또는 약 3.7 ppm에서 피크를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, HS8은, 예를 들어 도 32에서 보여진 것과 같이, 그것의 유일한 메틴(methine) 및/또는 메틸렌 1H NMR 스펙트럼에 의해서 다른 HS8과 구별될 수 있다.
GAG와 헤파린-결합 도메인간의 높은 친화성 결합 상호작용은 GAG가 높은 친화성 결합 상호작용을 기여하는 특정 사카라이드 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 추가적인 단계는 결합 상호작용에 관여하는 GAG의 완전한 또는 부분적인 사카라이드 서열, 또는 GAG의 핵심 부분의 결정을 포함할 수 있다.
GAG-폴리펩타이드 컴플렉스는 글리코사미노글리칸 쇄를 용해시키는 제제, 예를 들어, 리아제(lyase)로 처리될 수 있다. 리아제 처리는 폴리펩타이드와의 결합 상호작용에 관여하지 않는 GAG 부분을 절단할 수 있다. 폴리펩타이드와의 결합 상호작용에 관여하는 GAG 부분은 리아제 작용으로부터 보호될 수 있다. 리아제의 제거 후, 예를 들어, 세척 단계 이후에, 폴리펩타이드에 결합된 채로 남아있는 GAG는 폴리펩타이드의 특정한 결합 파트너("GAG 리간드")를 나타낸다. 짧은 GAG 분자는 덜 복잡하기 때문에 뒤이은 GAG 리간드의 분리 및 수집에 따라 GAG 리간드의 구조적 특징은 높은 수준으로 예측될 수 있다. 예를 들어, 어떤 사카라이드 서열의 조합(즉, GAG 리간드 내에 포함된 모노사카라이드의 일차(선형)서열), 설페이트화 패턴, 디사카라이드 및/또는 테트라사카라이드 분해 분석, NMR 스펙트럼, 질량분석 스펙트럼 및 HPLC 스펙트럼은 GAG 리간드의 구조적 특징을 높은 수준으로 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "강화시키는(enriching)", "강화(enrichment)", "강화된(enriched)" 등은 혼합물의 상대적 조성이 하나 이상의 다른 개체에 주어진 혼합물의 분획물이 감소하는 것에 반해, 하나 이상의 이들 개체에 의해 주어진 혼합물의 분학물이 증가하는 방식으로 바뀌는 과정(또는 상태)를 말한다. 강화에 의해 분리된 GAG는 순수할 수 있고, 예를 들어, 실질적으로 오직 한 종류의 GAG만을 포함할 수 있고, 또는 다른 종류의 GAG의 혼합물로 계속 진행될 수 도 있고, 특정 GAG를 높은 비중으로 갖는 혼합물은 시작 혼합물에 비하여 헤파린-결합 도메인에 결합한다.
규명된 GAG는 바람직하게는, 헤파린-결합 도메인을 포함하는 단백질이 발현되거나 또는 포함된 세포 또는 조직과 접촉되었을 때 기능적 효과를 나타낸다. 기능적 효과는 조절하거나(modulating) 또는 강화하는(potentiating) 효과일 수 있다.
기능적 효과는 특정 종류의 세포의 증식을 조절(자극)하거나 억제하는 것일 우 있고, 어떤 세포 종류를 또 다른 종류로 분화시키는 것일 수도 있고, 또는 하나 이상의 단백질 마커의 발현일 수 있다. 예를 들어, GAG는 세포 증식을 촉진할 수 있고, 즉 세포 수의 증가, 또는 줄기 세포의 특화된 세포 종류로의 분화(예를 들어, 결합 조직 내의 중간엽 줄기세포)를 촉진할 수도 있으며, 세포의 다분화능 또는 분화상태에 대하여 지시적인 단백질 마커(예를 들어, 알칼리 포스파타제 활성(alkaline phosphatase activity), RUNX2의 검출, 오스테릭스(osterix), 콜라겐 I, II, IV, VII, X, 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(Osteocalcin), BSPII, SOX9, 아그레칸(Aggrecan), ALBP, CCAAT/증폭제결합단백질-a(C/EBPa), 지방세포지질결합단백질(adiocyte lipid binding protein, ALBP), 알칼리 포스파타제(ALP), 골 시알로 단백질 2(bone sialo protein 2, BSPII), 콜라겐2a1(Coll2a) 및 SOX9와 같은 마커)의 발현을 촉진하거나 또는 억제할 수 있다.
본 발명에서 용어 '조절 효과'는 첫번째 개체(entity)가 두번째 개체에 대하여 갖는 효과로서, 두번째 개체의 일반적인 기능이 또다른 과정 또는 과정들에서 첫번째 개체의 존재에 의하여 변형되는 효과를 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 조절 효과는 효능적(agonistic) 또는 길항적(antagonistic)일 수 있다.
상기 조절 효과는 강화하는 효과일 수 있다. 용어 '강화하는 효과'는 역가(효능, potency)를 증가시키는 효과를 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태로서, 용어 '강화하는 효과'는 첫번째 개체가 두번째 개체에 대하여 갖는 효과로서, 또다른 과정 또는 과정들에서 두번째 개체의 역가를 증가시키는 효과를 의미한다. 본 발명의 보다 바람직한 실시형태로서, 강화하는 효과는 분리된 GAG의 헤파린-결합 인자에 대한 효과로서, 상기 효과는 헤파린-결합 인자의 역가를 증가시키는 효과를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명에서 '접촉'하는 과정은 2 이상의 별개의 개체들의 가까운 물리적 근접성을 연결하는데 관여한다. '접촉'하는 과정은 2 이상의 별개의 개체들의 부분이분자 수준에서의 상호작용을 허용하게 하는 충분한 시간동안, 및 조건 하에서 2 이상의 별개의 개체들의 가까운 물리적 근접성을 연결하는데 관여한다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 '접촉'하는 과정은 하나 이상의 GAG를 포함한 화합물의 혼합물과, 헤파린-결합 인자의 헤파린-결합 도메인에 상응하는 폴리펩타이드의 가까운 근접성을 연결하는데 관여한다. '접촉' 과정의 예로는 혼합, 용해, 팽윤, 세척을 포함한다. 바람직한 실시형태로, GAG 혼합물과 폴리펩타이드의 '접촉'은 서로 간에 높은 친화성을 보이는 GAG와 폴리펩타이드 간에, 공유적으로도 형성될 수 있지만 바람직하게는 비공유적으로 형성되는 컴플렉스라면 충분하다.
폴리펩타이드는 헤파린-결합 도메인을 가진 선택된 단백질의 전체 길이(full length) 또는 전체 길이에 가까운 일차 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 긴 폴리펩타이드에서 발생할 수 있는 접힘 현상 때문에, GAG 혼합물로부터 헤파린-결합 도메인의 차폐(masking)가 일어날 수 있으므로 폴리펩타이드는 짧은 것이 바람직하다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 헤파린-결합 도메인을 포함하는 아미노산 서열과, 임의적으로 펩타이드의 하나 또는 각 N- 및 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이들 추가적인 아미노산은, 폴리펩타이드가 고체 지지체에 결합하기 위하여 필요로 하는 링커 또는 결합 분자(attachment molecules)의 폴리펩타이드에의 추가를 가능하게 한다.
본 발명자들의 방법론의 바람직한 실시형태로, 폴리펩타이드는 헤파린-결합 도메인 내의 아미노산의 수에 추가로, 1-20, 보다 바람직하게는 1-10, 여전히 보다 바람직하게는 1-5의 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태로 헤파린-결합 도메인의 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 아미노산의 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 여전히 보다 바람직하게는 적어도 95%를 차지한다. 폴리펩타이드를 고체 지지체의 표면에 접착시키기 위하여, 폴리펩타이드는 바람직하게는 분자 태그(molecular tag)를 포함하도록 변형될 수 있고, 즉, 분자 태그는 프로브와 결합 쌍을 형성하므로, 고체 지지체의 표면은 분자 태그에 대하여 높은 친화성을 갖고 이에 상응하는 분자 프로브를 포함하도록 변형될 수 있다. 태그 및/또는 프로브는 다음 중에서 어느 하나로 선택될 수 있다: 항체, 세포 수용체, 리간드, 바이오틴, 이들 구조의 임의의 단편(fragment) 또는 유도체(derivative), 앞서 기재한 것의 임의의 조합, 또는 결합하거나 아니면 특이성을 가지고 어울리도록 프로브가 디자인되거나 설정될 수 있도록 하는 임의의 다른 구조. 태그 및 프로브로서 사용하기에 적절한 바람직한 결합 쌍은 바이오틴 및 아비딘(avidin)이다.
폴리펩타이드는 관심있는 단백질로부터 유래된 것이며, 본 발명의 경우 FGF2이다. 폴리펩타이드가 관심있는 단백질 내에 존재하는 헤파린-결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하고 있기 때문에, "~로부터 유래된"이란 폴리펩티드는 선택되거나, 선발되거나 또는 제조될 수 있음을 의미한다. 헤파린-결합 도메인의 아미노산 서열은, 예를 들어, GAG 결합에 대한 헤파린-결합 도메인 서열 내의 변화의 영향을 연구하기 위하여, 관심있는 단백질에서 나타나는 것으로부터 변형된 것일 수도 있다.
본 명세서에서 단백질은 FGF2이다. 바람직한 헤파린-결합 도메인의 아미노산 서열은 헤파린-결합 도메인의 아미노산 서열은 GHFKDPKRLYCKNGGF (서열번호 1)[인간 FGF2의 157-172번 아미노산 서열에서 발견된다], 또는 서열 YCKNGGF (서열번호 2)을 갖는 서열이다.
특정한 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서의 작은 변이는 해당 부분의 내재적 기능을 유지시킬 수 있음은 당업자에게 자명하다. 펩타이드 내의 특정 아미노산 잔기의 등입체적(isosteric) 및/또는 등전기적(isoelectric)인 다른 아미노산 잔기로의 치환은, 비치환된 펩타이드의 어떠한 특성을 유지시키거나 또는 향상시킬 수 있음 또한 당업자에게 자명하다. 이들 변이들 또한 본 발명의 범주 안에 모두 포함된다. 예를 들어, 아미노산 알라닌은 펩타이드의 하나 이상의 특성을 유지하면서 종종 아미노산 글리신 (및 역으로)으로 치환될 수 있다. 용어 '등입체적'은 두 개체간의 공간적 유사성을 의미한다. 적절히 상승된 온도에서 등입체적인 모이어티의 두 가지 예로 이소-프로필과 3급-부틸 그룹을 들 수 있다. 용어 '등전기적'은 두 개체간의 전기적 유사성을 의미하며, 두 개체가 동일하거나 유사한 pKa의 기능성을 가지는 경우를 예로 들 수 있다.
헤파린-결합 도메인에 상응하는 폴리펩타이드는 합성 또는 재조합에 의한 것일 수 있다.
고체 지지체는 분자가 직접적 또는 간접적으로, 공유적 또는 비공유적 결합을 통해서 부착될 수 있는 표면을 가진 임의의 기재일 수 있다. 고체 지지체는 표면에 부착되는 프로브에 대하여 물리적 지지력을 제공할 수 있는 임의의 기재 소재를 포함할 수 있다. 그것은 매트릭스 지지체일 수 있다. 소재는 일반적으로 어세이를 수행하는 동안 접하게 되는 프로브의 표면에의 부착 및 임의의 뒤따르는 처리, 핸들링, 또는 공정(processing)과 관련된 조건을 견디게 할 수 있다. 소재는 천연적으로 발생한 것이거나, 합성한 것이거나 또는 천연적으로 발생한 물질의 변형품일 수도 있다. 고체 지지체는 플라스틱 소재 (예를 들어, 폴리(비닐 클로라이드), 사이클로-올레핀 공중합체, 폴리아크릴아마이드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈라레이트), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE 또는 Teflon®), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트) 등과 같은 폴리머를 포함) 등일 수 있고, 이들 소재 자체가 사용되거나 또는 다른 소재와 함께 사용될 수 있다. 실리카와 예를 들어, 생체유리(Bioglass)로 사용할 수 있는 유리를 추가적으로 포함하는 유리와 같은 추가적인 강성 소재(rigid material)도 고려될 수 있다. 예를 들어 조절된 기공 유리 비드(controlled pore glass beads)와 같이 기공 소재를 포함하여 다른 소재 역시 채택될 수 있다. 예를 들어, 그것의 표면 상에 포함된 임의의 아미노, 카복실, 티올, 또는 히드록실 작용기와 같이, 하나 이상의 작용기를 갖도록 하는 당업계에 알려진 다른 어떤 소재 역시 고려될 수 있다.
바람직한 고체 지지체는 컬럼의 표면상에 고정된 폴리펩타이드를 갖는 컬럼을 포함한다. 표면은 컬럼의 벽일 수 있고, 및/또는 컬럼의 중심부 내에 채워진 비드에 의해 제공된 것일 수 있다.
폴리펩타이드는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 고정시키는 방법의 예로는 흡착, 공유적 결합, 포착(entrapment) 및 막 격리(membrane confinement)를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태로는 폴리펩타이드와 매트릭스 간의 상호작용이 실질적으로 영구적인 것이다. 본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태로는 펩타이드와 매트릭스 간의 상호작용이 적절하게 이온-교환 크로마토그래피에 불활성(inert)인 것이다. 바람직한 배치로는 폴리펩타이드가 고체 지지체의 표면 상에 부착된 것이다. 당업자가 두 개체를 서로 화학적으로 및/또는 물리적으로 결합시키기 위하여 선택할 수 있는 옵션이 매우 많다는 것은 자명하다. 이러한 옵션은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 바람직한 배치로는, 폴리펩타이드가 바이오틴과 스트렙타비딘과의 상호작용을 통해 고체 지지체에 흡착되는 것이다. 이와 같은 배치의 대표적인 예로는, 바이오틴 분자가 폴리펩타이드에 공유적으로 결합되고, 그 결과 바이오틴-폴리펩타이드 결합체가 스트렙타비딘과 결합하며, 이것이 결국 고체 지지체에 공유적으로 결합한 것이다. 또다른 배치로는, 바이오틴 분자를 폴리펩타이드 및/또는 스트렙타비딘과 매트릭스를 연결시키기 위하여, 스페이서 또는 링커 모이어티가 사용될 수 있다.
GAG 혼합물을 고체 지지체에 접촉시킴으로써 GAG-폴리펩타이드 컴플렉스가 형성될 수 있다. 이들은 고체 지지체로부터 남은 혼합물을 제거함으로써, 예를 들어, 비-결합 물질을 용출시키기 위하여 고체 지지체를 세척함으로써 남은 혼합물부터 분리된다. 컬럼이 고체 지지체로 사용되는 경우, 컬럼에 결합된 GAG-폴리펩타이드를 남겨둔 채로 GAG 혼합물의 비-결합 성분을 컬럼으로부터 용출될 수 있다.
특정한 올리고사카라이드가 비특이적 방식으로 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있음은 이해된다. 특정한 실시형태로, 비특이적 방식으로 폴리펩타이드와 상호작용하는 올리고사카라이드는, 헤파린-결합 인자의 효과를 조절하는 하나 이상의 GAG로 강화된 화합물의 혼합물에 포함되거나 또는 이로부터 배제될 수 있다. 비특이적인 상호작용의 예로는 적절한 크기의 및/또는 형태의 분자의 포켓 내로의 일시적 격리를 들 수 있다. 또한 이들 올리고사카라이드는 펩타이드와 전혀 상호작용을 보이지 않는 올리고사카라이드에 비해 더욱 천천히 용출될 수 있음은 자명하다. 게다가 비특이적으로 결합하는 화합물은 특이적 방식(예를 들어, 이온 상호작용을 통해)으로 결합하는 이들 화합물을 용출시키기 위하여 동일한 외부 자극의 입력을 필요로 하지 않을 수 있다. 본 발명자들의 방법론은 올리고사카라이드의 혼합물을 다음과 같은 구성성분으로 분리시킬 수 있다: 폴리펩타이드에 특이적 방식으로 결합하는 것들; 폴리펩타이드에 비특이적 방식으로 결합하는 것들; 및 폴리펩타이드에 결합하지 않는 것들. 이러한 목적은 각 GAG-펩타이드 쌍에 대하여 작동가능하도록 정의된다.
GAG와 폴리펩타이드의 결합이 일어나는 고체 지지체의 표면에 존재하는 조건(예를 들어, 염 농도)을 다양화함으로써 헤파린-결합 도메인에 대하여 가장 높은 친화도 및/또는 특이성을 가진 GAG가 선발될 수 있다. GAG는 이에 따라 관심있는 단백질 및/또는 관심있는 단백질의 헤파린-결합 도메인에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 GAG를 수득할 수 있다. 결합 친화도(Kd)는 다음 중에서 선택될 수 있다: 10 μM 미만, 1 μM 미만, 100 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 100 pM 미만.
기술된 방법에 의해 수득된 GAG는 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)의 적용 범위에서 유용할 수 있다. GAG는 시험관 내(in vitro)의 세포 또는 조직 배양물, 또는 생체 내(in vivo)의 세포 또는 조직에서, 세포 또는 조직의 성장 및/또는 증식 및/또는 분화를 자극하거나 또는 억제하는 용도로 제공될 수 있다.
GAG는 이와 같은 목적으로 제형(formulation)으로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 기술된 방법에 의해 수득된 GAG를 포함하는, 즉 HS8을 포함하는 배양 배지가 제공될 수 있다.
HS8의 존재 하에서 시험관 내(in vitro)의 세포 또는 조직 배양물로부터 수득된 세포 또는 조직은 수집되어 치료를 필요로 하는 인간 또는 동물에게 임플란트 될 수도 있다. 따라서 세포 및/또는 조직의 임플란트 방법이 제공될 수 있으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) HS8과 접촉하여 시험관 내(in vitro)에서 세포 및/또는 조직을 배양하는 단계;
(b) 세포 및/또는 조직을 수집하는 단계;
(c) 세포 및/또는 조직을 치료를 필요로 하는 인간 또는 동물 개체에게 임플란트하는 단계.
(a) 부분에서 배양된 세포는 세포 또는 조직의 성장, 증식 또는 분화가 허용될 수 있는 충분한 시간동안 HS8과 접촉하여 배양될 수 있다. 예를 들어, 시간은 다음 중에서 선택될 수 있다: 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일 또는 적어도 40일.
또 다른 실시형태로, HS8은 장해 또는 질환의 예방 또는 치료를 포함하는, 의학적 치료방법에서의 사용을 위하여 제형화될 수 있다. HS8 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물 또는 의약이 제공될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물 또는 의약은 장해 또는 질환의 예방 또는 치료를 위하여 제공될 수 있다. 장해 또는 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어 HS8의 용도 또한 제공된다. 선택적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및 의약은 GAG과 결합하는 헤파린-결합 도메인을 갖는 관심있는 단백질(즉, FGF2) 또한 포함할 수 있다. 추가적인 실시형태로, 약제학적 조성물 및 의약은 줄기세포, 예를 들어 중간엽 줄기세포를 추가적으로 포함할 수 있다.
장해 또는 질환의 치료는 결합조직(예를 들어, 뼈, 연골, 근육, 지방, 힘줄 또는 인대)과 같은 세포 또는 조직의 회복, 재생 또는 교체를 포함한다. 조직의 회복을 위해, HS8을 포함하는 약제학적 조성물 또는 의약이, 장해의 회복 또는 질환 상태의 치료 또는 완화(예를 들어, 증상의 완화를 제공)에 영향을 미치는 새로운 조직의 성장, 증식 및/또는 분화를 자극하기 위하여, 장해 또는 질환의 위치에 직접적으로 투여될 수 있다. 조직의 치유 또는 재생은 약제학적 조성물 또는 약제 중에서 줄기 세포를 배합함으로써 개선될 수 있다.
조직의 교체를 위해, 환자의 장해 또는 질환의 위치에 임플란트하기 위한 세포 및/또는 조직을 생산하기 위하여, HS8이 세포 및/또는 조직의 시험관 내(in vitro) 배양 동안 세포 및/또는 조직과 접촉될 수 있다. 세포 또는 조직의 임플란트는 다친 또는 질병에 걸린 조직의 교체에 의해 환자 내의 다친 또는 질병에 걸린 조직의 회복에 영향을 미치는 데에 사용될 수 있다. 이는 다친/질병에 걸린 조직의 절단 및 HS8과 접촉한 세포 및/또는 조직의 배양에 의해 제조된 새로운 조직의 임플란트를 포함할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및 의약은 다음 중 하나를 포함할 수 있다:
(a) HS8;
(b) 줄기세포와 조합한 HS8;
(c) HS8에 의해 결합된 헤파린-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 1)을 포함하는 단백질과 조합한 HS8;
(d) 줄기세포 및 HS8에 의해 결합된 헤파린-결합 도메인(예를 들어, 서열번호 1)을 포함하는 단백질과 조합한 HS8;
(e) HS8과 접촉한 세포 또는 조직의 배양물로부터 수득한 조직 또는 세포.
HS8은 신체 조직의 회복 또는 재생, 특히 뼈 재생, 신경 재생, 골격 조직 구성, 심혈관계 장해의 회복, 및 배아 및 성체 줄기세포의 확장(expansion) 및 자가재생(self-renewal)에서 사용될 수 있다. 따라서, HS8은 골관절염, 연골 교체, 모든 종류의 골절(예를 들어, 척추 디스크 융합 치료(spinal disc fusion treatment), 장골 파괴(lone bone break), 두개골 결함(cranial defect)), 중증(critical) 또는 위관절(non-union) 골 결함 재생(bone defect regeneration)을 포함하여 넓은 범주의 질병 및 장해를 예방 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
조직의 회복, 재생 또는 교체에 있어서 HS8의 용도는 상처 치유, 예를 들어 상처 치유의 가속화, 흉터 또는 골조직 및 이식 조직의 치유에서의 용도에 관여할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 HS8을 포함하는 생물학적 스캐폴드를 제공한다. 일부 실시형태로, 본 발명의 생물학적 스캐폴드는 정형외과, 혈관, 보철, 피부 및 각막의 적용에 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 생물학적 스캐폴드는 서방성 약물 전달 장치, 조직판막, 조직판막 리플렛(leaflet), 약물-방출 스텐트, 상처 치유 또는 피부 이식편 및 뼈, 인대, 힘줄, 연골 및 근육과 같은 정형외과적 보철을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태로, 생물학적 스캐폴드는 내부(및/또는 외부) 표면이 카테터에 부착된 하나 이상의 (HS8을 포함한) GAG 화합물을 포함하는 카테터(catheter)이다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 보강제 용도로 개시된 방법에 의해 분리된 하나 이상의 GAGs(HS8 포함)를 제공한다. 상기 보강제는 면역 보강제일 수 있다.
또 다른 일 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 GAGs를 포함하는 화합물의 혼합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 제제를 제공하며, 상기 혼합물은 HS8를 풍부하게 갖는다. 또 다른 일 측면에서, 본 발명은 분리, 동시 또는 연속 투여용으로,
i) 하나 이상의 GAGs를 포함하는 화합물의 혼합물로서, HS8를 풍부하게 갖는 혼합물; 및
ii) FGF2
를 포함하는 약제학적으로 허용되는 제제를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 제제는 하나 이상의 GAGs를 포함하는 화합물의 혼합물을 포함하며, 상기 혼합물은 주변 혼합물에서 HS8 및 FGF2가 풍부하며, 치료가 필요한 환자에게 동시에 투여된다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서, 키트는 회복, 또는 조직의 재생 용도로 제공되며, 상기 키트는 (i) 소정 양의 HS8, 및 (ii) 소정 양의 FGF2를 포함한다.
본 발명의 강화된(enriched) 혼합물의 화합물은 그의 약제학적으로 허용되는 염으로서 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 강화된 혼합물의 화합물은의 기본 염은 이에 제한되지는 않지만, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 및 알킬암모늄과 같이 약제학적으로 허용되는 양이온으로 형성된 것이다. 본 발명은 양이온 염의 범위 안에서 예를 들어, 나트륨 또는 칼륨 염을 포함한다. 카르복실산 기를 포함하는 본 발명의 강화된 혼합물의 화합물은 투여가능한 프로드러그의 형태로 전달될 수 있으며, 여기서 산 부분은 (-CO2R' 형태를 갖는 것으로)에스테르화되는 것으로 여겨질 수 있다. 용어 "프로드러그(pro-drug)"는 구체적으로 생체 내에서, -OR' 기의 -OH 기, 또는 그의 카르복실레이트 음이온으로의 전환과 관계된다. 따라서, 본 발명의 프로드러그는 약물 흡수 및/또는 세포로의 약물 전달을 강화하는데 작용할 수 있다. 프로드러그의 생체 내에서의 전환은 리파아제 및 에스테라제와 같은 세포 효소에 의해, 또는 생체 내 에스테르 가수분해와 같은 화학적 분해에 의해 용이하게 될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 약제 및 약제학적 조성물은 이에 제한되지는 않지만,질병 또는 상처 부위에 주사하는 등 다양한 경로에 의해 투여용으로 제조될 수 있다. 약제 및 약제학적 조성물은 유체(fluid) 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 유체 제제는 인간 또는 동물 몸의 선택된 부분에 주사에 의한 투여용으로 제조될 수 있다.
투여는 "치료학적 유효량"이 바람직하며, 이는 개인에게 효과를 나타내기에 충분하다. 투여되는 실제양, 및 투여 비율과 시간 경로는 상처의 성질 및 심각성, 또는 치료되는 질병에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 복용량과 같은 치료의 처방은 일반의 및 다른 의사(medical doctors)의 책임 하에 있으며, 치료되어야 하는 장애, 환자 개개인의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 요소들이 통상적으로 고려된다. 상기에서 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 레밍톤 파머티컬 사이언스(Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins)에서 발견될 수 있다.
줄기 세포
HS8과 접촉한 세포는 줄기 세포를 포함한다.
HS8은 줄기 세포의 확산 및/또는 분화, 및/또는 줄기 세포의 계통 결정(lineage-commitment)에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 소개되고 설명된 줄기 세포는 임의의 종류의 줄기 세포일 수 있다. 상기 줄기 세포는 전분화능 또는 다분화능(다능성)일 수 있다. 줄기 세포는 임의의 조직으로부터의 초기 또는 성체 줄기 세포일 수 있으며, 조혈 줄기 세포, 인간 신경 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 바람직하게는 줄기 세포는 성체 줄기 세포이다.
본 명세서에서, 줄기 세포는 분리할 능력(즉, 자기 재생)을 가지며, 전분화능 또는 다분화능(다능성)이며, 특정 세포를 생기게 하는 임의의 세포 유형을 의미한다.
본 명세서에 소개된 줄기 세포는 혈액, 골수, 피부, 상피 또는 탯줄을 포함하여, 임의의 성체, 초기 또는 태아 조직(통상적으로 폐기되는 조직)으로부터 직접, 또는 현존 배양 조직으로부터 유래하거나 얻을 수 있다.
줄기 세포의 다분화능은 적절한 분석의 사용에 의해 결정될 수 있다. 상기 분석은 하나 이상의 전분화능 마커(marker) 예를 들어, 알칼리 포스파타아제 활동도, RUNX2 검사, 오스테릭스, 콜라겐 I, II, IV, VII, X, 오스테오폰틴, 오스테오칼신, BSPII, SOX9, 저산소증(Aggrecan), ALBP, CCAAT/강화 결합 단백질-α(C/EBPα), 지방세포 지질 결합 단백질(ALBP), 알칼리 포스파타아제(ALP), 골 시알로프로테인 2, (BSPII), 콜라겐 2a1 (Coll2a)및 SOX9를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 줄기 세포는 예를 들어, 연골세포, 골아세포, 근육세포 및 지방세포와 같은 골 세포 및/또는 결합조직로 분화할 수 있는 중간엽 줄기 세포(MSC)이다.
중간엽 줄기 세포는 최소 침습 기술에 의해 골수로부터 쉽게 얻어질 수 있으며, 배양 조직으로 확장될 수 있고, 원하는 계통으로 분화될 수 있다. 분화는 특정 성장 인자의 적용에 의해 유도될 수 있다. 뼈 형성 단백질(BMPs)과 같은 형질 전환 성장 인자 베타(TGF-beta) 상과(superfamily) 멤버 단백질은 중간엽 줄기 세포의 골분화 및 연골세포 분화에 중요한 인자이다.
중간엽 줄기 세포는 골수 증식 가능성을 보여주는 CD34+ 부분으로부터, STRO-I과 같은 선택된 마커를 사용하여 검출되고 분리될 수 있다. 상기 세포 표면 마커들은 단지 중간엽 줄기 세포의 세포 표면에서 발견되며, 세포 전분화능의 지표이다.
적합한 중간엽 줄기 세포는 골수 흡입액(예컨대, Wexler et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal of Haematology 121(2):368-374, April 2003.) 또는 탯줄의 와튼젤리(Wharton’s Jelly) (예컨대, Ta et al. Long-term Expansion and Pluripotent Marker Array Analysis of Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev . 2009 July 20 (Epub))로부터 수집된 골수 단핵 세포(BMMNCs)로부터 유래되거나 얻을 수 있다.
중간엽 줄기 세포는 당해 기술분야에 잘 알려진 적절한 분화 요소의 적용에 의해, 유도 다능성 줄기 세포 또는 인간 배아 줄기 세포와 같은 다능성 줄기 세포의 분화에 의해 얻어질 수 있다.
중간엽 줄기 세포는 연골, 뼈, 근육, 힘줄, 인대, 및 지방의 성분을 생성시키는 능력을 가진 다능성(다분화능) 간세포이다. 상기 근본적 프로제니터는 출생 후에 존재하며, 줄기 세포 특징 즉, 낮은 발생빈도 및 광범위한 재생 가능성을 나타낸다. 발전적 성형성과 함께 상기 특성들은 그들의 잠재적인 사용에 엄청난 이익을 발생시켜서, 손상된 조직을 교체한다. 본질적으로 상기 줄기 세포들은 배양되어서, 그들의 수가 확대되어 그 다음 손상된 부위에 이식되거나 스캐폴드 위/안에 시딩된 후에 알맞은 조직 구조를 발생시킬 수 있다.
따라서, 뼈대, 근육, 힘줄, 인대 및 혈액 복구/재생에 대한 대안적인 접근은 특정 조직 성장 인자의 신중한 선택과 함께 재생을 보호하고 유지하기 위해서, 전도성 또는 유도성 스캐폴드와 함께 뼈의 경우에 있어서, 골전구 세포(osteoprogenitor cell)와 같은 알맞은 간세포(예컨대, 중간엽 줄기 세포, 연골 세포, 골아 세포, 근아 세포, 골 줄기 세포 또는 골 전구 세포(bone precursor cells))의 선택, 확장 및 조절에 관한 것이다.
줄기 세포는 임의의 동물 또는 인간 예를 들어, 인간이 아닌 동물 예컨대, 토끼, 기니피그, 쥐, 마우스, 또는 다른 설치류(설치목(order Rodentia)에서 임의의 동물로부터 유래된 세포 포함), 고양이, 강아지, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 영장류, 또는 다른 인간이 아닌 척추 생물; 및/또는 인간이 아닌 포유류 동물; 및/또는 인간으로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는 줄기 세포는 인간으로부터 유래된다. 선택적으로는 줄기 세포는 비-인간으로부터 유래된다. 선택적으로는 비-배아 줄기 세포이다. 선택적으로는 전분화능이 아니다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 발생된 다른 세포 또는 줄기 세포, 또는 그들의 일부 또는 생성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 의학 치료 방법에 유용할 수 있다. 적합한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서, 본 발명의 임의의 방법에 의해 발생된 다른 세포 또는 줄기 세포는 의학 치료의 방법에 유용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명은 상기 의약 또는 약제학적 조성물의 치료학적 유효양을 치료가 필요한 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 의학 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 배양 방법 및 기술을 통하여 얻어진 다른 세포 또는 줄기 세포는 의학 치료 방법적 용도를 위해 다른 세포 유형의 분화에 사용될 수 있다. 따라서, 분화된 세포 유형은 분리될 수 있으며, 연속적으로 분화가 허용되는 상기 기술 및 배양 방법에 의해 얻어진 줄기 세포의 생성물로 여겨질 수 있다. 약제학적 조성물은 상기 분화된 세포, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 희석제를 포함하여 제공될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 의학 치료 방법에 유용할 수 있다.
중간엽 줄기 세포
중간엽 줄기 세포(MSC)는 기본적으로 골수로부터 분리되며, 104-105 총 골수 단핵세포(BMMNC) 중에서 단지 1개 존재한다(Friedenstein et al. 1966). 상기 세포들은 CFU-F(콜로니 형성 단위 섬유아세포) 수를 더빙한(dubbed), 단일 세포 전구체로부터 유래된 콜로니(colonies)를 생성할 수 있다. MSC는 현재 지방 조직(Gimble and Guilak 2003; Zuk et al. 2001), 제대혈(Bieback et al. 2004; Erices et al. 2000; Goodwin et al. 2001; Kogler et al. 2004; Wagner et al. 2005) 및 근육Jiang et al. 2002)을 포함하여 많은 다른 조직에서 확인되고 있다.
다분화능 인간 중간엽 줄기 세포(MSC)에 대한 최소 기준은 국제세포치료학회(Internation Society for Cellular Therapy)(Dominici et al Cytotherapy (2006) Vol.8, No.4, 315-317)에 개시되어 있다. 국제세포치료학회는 인간 MSC를 정의하는데 세 가지 기준 즉, 플라스틱 부착, 특정 표면 항원 발현 및 다분화능 분화 가능성을 제시한다. 특히, "첫째, 조직 배양 플라스크를 사용하여 표준 배양 조건을 유지하는 경우, MSC는 플라스틱-부착성(plastic-adherent)이어야 하며, 둘째, MSC 수의 95% 이상은 유동세포 분석법으로 측정했을 때, CD105, CD73 및 CD90를 나타내야 한다. 또한, 상기 세포들은 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79α 또는 CD19 및 HLA 클래스 II (HLA-DR)의 표시가 없어야(2% 이하) 한다. 셋째, 상기 세포들은 생체 내 표준 분화 조건에서, 골아 세포, 지방 세포 및 조연골 세포를 분화시킬 수 있어야 한다."고 제시하고 있다.
또한, Dominici 등은, 특히 유일하게 MSC를 인식하는 생물학적 특성은 표준 생체 조직 배양-분화 조건을 사용하여, 골아 세포, 지방 세포 및 조연골 세포로 세가지 계통 중간엽성 분화를 할 수 있는 능력을 의미한다고 개시한다. 또한, Dominici 등은, 골아 세포로의 분화는 알리자린 레드 또는 본 코사 스테이닝(von Kossa staining)과 함께 얼룩에 의해 증명될 수 있으며, 지방 세포 분화는 오일 레드 오(O)와 함께 얼룩에 의해 가장 쉽게 증명될 수 있으며, 조연골 세포는 콜라겐 유형 II에 대해 면역 조직화학적 착색 또는 알시안 블루즈(Alcian bluse)와 함께 얼룩에 의해 증명될 수 있다고 개시한다. Dominici 등은, 상기 분석을 위한 키트는 상업적으로 이용가능하며, 분화 증명은 모든 조사자에게 적합해야 한다고 개시한다.
또한, Dominici 등은, 신규한 표면 마커가 미래에 인식될 수 있으며, 또한 인간 MSC를 정의하는데 사용될 수 있다고 개시한다. 세 가지 상기 마커들은 현재 CD49a, SSEA-4 및 STRO-1로 알려져 있다.
Rider 등은 다음과 같이 개시한다: CD49a+ 클론은 미분류된 세포와 비교하여 CD90 및 CD105의 강화된 표시를 가지며, 중간엽 줄기 세포의 강화를 위한 알파-1 인테그린(CD49a) 선택의 사용을 지지하면서, CD49a+ 클론은 미분류된 세포와 비교하여 지방, 뼈 및 연골으로의 다중 계통 분화를 쉽게 경험하며, 골수 단핵 줄기 세포의 이질성 풀(heterogenous pool)로부터 최고의 다능성 세포를 선택하기 위한 전략을 제공한다(Rider et al. J.Mol. Hist (2007) 38:449-458). Rider 등은 또한, CFU-F 세포가 CD49a의 표현과 관련이 있으며, CD49a 표현 CFU-F 세포는 또한 동시에 STRO-1를 표현하며, CD49a는 인간과 함께 쥐 및 마우스로부터 MSC를 분리하는데 사용될 수 있으며, 이는 축재를 위한 마커로 보존될 수 있음을 개시한다.
Gang 등은 다음과 같이 개시한다: 미분화된 다분화능 인간 배아 줄기 세포 및 낭포 단계 배아로의 분열을 위한 마커로서 통상 사용되는 단계 특정 태아 항원 SSEA-4는 또한 성체 인간 중간엽 줄기 세포 수를 인식하며, MSC를 구별하는데 시용될 수 있다(Gang et al., Blood 2007; 109:1743-1751). Gang et al은 (CFU-F)-소위 STRO-1+bright라 불리는 증식성 간질 세포의 축재에서 표면 마커 STRO-1를 연결하는 단일 클론 항체의 사용을 개시한다.
글리코사미노글리칸
본 명세서에서 개시하였듯이, 용어 '글리코사미노글리칸' 및 'GAG'은 교대해서 사용되며 올리고당을 포함하는 분자들의 큰 집합체를 언급하는 것으로 이해되며, 여기서 상기 하나 이상의 결합된 단당류는 아미노 치환기, 또는 그의 유도체를 보유한다. GAGs의 예는 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 헤파린, 데르마탄 설페이트, 히알루로네이트, 및 헤파란 설페이트이다.
본 명세서에서 개시하였듯이, 용어 'GAG'는 또한 GAG 콘쥬게이션된 상기 분자들을 포함하는 것으로 기대된다. GAG 콘주게이트의 예는 프로테오글리코사미노글리칸(PGAG, 프로테오글리칸)이며, 여기서 펩타이드 구성은 올리고당 성분과 공유 결합된다.
헤파란 설페이트 (HS)
헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG; Heparan Sulfate Proteoglycan)는 프로테오글리칸의 고도로 다양한 하위 집단을 대표하고 단백질 백본(backbone)에 공유 결합으로 부착된 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸 측쇄로 구성된다. 코어(core) 단백질은 3개의 주요 형태로 존재한다: 퍼레칸(perlecan)으로 공지된 분비되는 형태, 글리피칸으로 공지된 플라즈마 막에 고착된 형태, 및 신데칸으로 공지된 경막적(transmembrane) 형태. 이들은 포유류의 세포 표면 및 대부분의 세포외 기질의 편재하는 구성 성분이다. 아그린(agrin), 또는 HS 쇄가 일반적으로 적게 발견되는 코어들에 부착될 수 있는 아밀로이드 전구체 단백질과 같은 다른 단백질들도 있다.
"헤파란 설페이트" ("Heparan sulfate" 또는 "HS") D-글루쿠론산 (GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코스아민 (GlcNAc)의 연쇄 반복(tandem repeats)으로 이루어진 다당류로서 골지체에서 시초에 합성된다. 발생기의 다당류는 일련의 단계들을 거쳐 후속적으로 변형될 수 있다: GlcNAc의 N-아세틸 이탈 반응/N-설페이트화, GlcA의 이두론산(IdoA)으로의 C5 에피머화, IdoA 및 GlcA의 C2에서의 O-황산염화, N-설포글루코스아민(GlcNS)의 C6에서의 O-황산염화 및 가끔 일어나는 GlcNS의 C3에서의 O-황산염화. N-아세틸 이탈 반응/N-황산염화, HS의 2-0-, 6-0- 및 3-O-황산염화는 N-데아세틸라아제/N-설포트랜스퍼라제(HSNDST), HS 2-0-설포트랜스퍼라제(HS2ST), HS 6-O-설포트랜스퍼라제(HS6ST) 및 HS 3-0-설포트랜스퍼라제, 각각의 특정한 작용에 의해 중개된다. 각 변형 단계에서, 잠재적인 기질의 단지 소량만이 변형되고, 이는 상당한 서열 다양성을 초래한다. HS의 이러한 구조적인 복잡성은 그것의 서열을 결정하고 HS 구조 및 기능 사이의 관계를 이해하는 것을 어렵게 만들어 왔다.
헤파란 설페이트 측쇄는 (1-> 4) 글리코시드 결합을 통해서 연결된 교대로 배열된 D-글루쿠론산 또는 L-이두론산 및 D-글루코스아민으로 구성된다. 글루코스아민은 종종 N-아세틸화되거나 N-설페이트화되며 우론산 및 글루코스아민은 둘 모두 부가적으로 O-설페이트화될 수 있다. 특정한 결합 상대에 대한 특정한 HSPG의 특이성은 글루코스아민 및 우론산에 부착된 카르복시기, 아세틸 및 설페이트기의 특정한 패턴에 의해 생성된다. 헤파린과는 대조적으로, 헤파란 설페이트는 N- 및 O-sulfate기를 더 적게 함유하고 N-아세틸기를 더 많이 함유한다. 헤파란 설페이트 측쇄는 테트라사카라이드 결합(-글루쿠로노실-β-(1→3)-갈락토실-β-(1→3)-갈락토실-β-(1→4)-크실로실-β-1-O-(세린))영역을 통해 코어 단백질의 세린 잔기와 연결된다.
헤파란 설페이트 쇄 및 코어 단백질 둘 모두는 그들의 생물학적 작용에 궁극적으로 영향을 줄수 있는 일련의 변형을 거칠 수 있다. HS의 복잡성은 핵산의 것을 능가하는 것으로 여겨져왔다(Lindahl 등, 1998, J. Biol. Chem. 273, 24979; Sugahara 및 Kitagawa, 2000, Curr. Opin. Struct. Biol. 0, 518). HS 종들의 이형은 비-랜덤의 합성, N-아세틸화된 글루코스아민을 함유하는 디사카라이드의 설페이트화되지 않은 영역에 의해 분리된 고도로 설페이트화된 당 잔기 서열에서 발생한다. N-아세틸글루코스아민의 N-설포글루코스아민으로의 초기 전환은 다른 변형으로의 초점을 생성하며, 이는 글루쿠론산의 이두론산으로의 에피머화 및 글루코스아민 또는 이두론산에서의 O-설페이션의 복합 패턴을 포함한다. 추가로, 비-변형되고, 저 설페이트화되며, N-아세틸화된 서열 내에서는, 고도로 설페이트화된 N-설페이트화된 영역에서는, C-5 에피머 이두로네이트(iduronate)가 지배적이인 반면 헥스우로네이트(hexuronate) 잔기는 글루쿠로네이트(glucuronate)로 남아있다. 이는 임의의 소정의 쇄 잠재적으로 가능한 디사카라이드 변종의 수를 제한하지만 각각의 풍부함은 제한하지 않는다. 대부분의 변형은 N-설페이트화된 도메인에서 일어나거나, 그에 직접적으로 인접한 영역에서 일어나, 발달한 쇄에 저 설페이션의 도메인에 의해 분리된 고 설페이션 영역이 있다(Brickman et al. (1998), J. Biol. Chem. 273(8), 4350-4359, 전체가 본원에서 참고로 삽입됨).
고도로 변이성의 헤파란 설페이트 쇄는 많은 수의 세포외 리간드의 작용의 조절에서 중요한 역할을 하는데, 이는 성장 및 세포에의 접착 인자의 통제 및 제공, 오토크린(autocrine), 적스타크린(juxtacrine) 및 파라크린(paracrine) 피드백 루프(feedback loop)의 복잡한 배합을 통해, 그렇게 세포내 시그널링(signaling)을 제어하고 그럼으로써 줄기 세포를 분화시키는 것을 포함하는 것으로 가정된다. 예를 들어, 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸은 유전적으로 기재될 수 있음에도 (Alberts 등 (1989) Garland Publishing, Inc, 새로운 York & London, pp. 804 및 805), 단일 근원으로부터 분리된 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸 종들은 생물학적 작용에서 다를 수 있다. Brickman 등(Brickman et al, 1998, Glycobiology 8, 463)이 보인 바와 같이 신경상피세포로부터 수득된 2개의 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸의 개별적인 풀(pool)은, 유사 분열(mitogenic) 상태에 따라서 FGF-1 또는 FGF-2 둘 중 하나를 한정하여 활성화시킬 수 있다. 유사하게, 헤파란 설페이트(HS)가 FGF-1 또는 FGF-2 둘 중 하나와 상호 작용하는 능력이 WO 96/23003호에 기재되어있다. 이러한 특허 출원에 따라서, 각각의 FGF-1와 상호 작용할 수 있는 HS는 약 11 내지 약 13 배아 일의 뮤린(murine) 세포로부터 수득 가능하고, 반면에 FGF-2와 상호 작용할 수 있는 HS는 약 8 내지 약 10 배아 일의 것으로부터 수득 가능하다.
위에서 언급된 바와 같이 HS 구조는 고도로 복합적이고 HS 간에 변이 가능하다. 사실, HS 구조에서 이형은 세포 성장을 촉진하고 세포 분화를 지시하는 일에서의 각각의 HS의 상이한 작용에 기여하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 구조적인 복잡성은 핵산의 것을 능가하는 것으로 여겨지고 비록 HS 구조가 특정하고 독특한 설페이트화 패턴을 갖는 반복되는 디사카라이드 단위의 서열을 특징으로 할 수 있지만 핵산 시퀀싱에 이용 가능한 것과 동등한 HS 서열 구조를 결정하는 데 이용 가능한 표준의 시퀀싱(sequencing) 기술은 현재 없다. 확정적인 HS 서열 구조를 결정하는 간단한 방법이 없는 가운데 HS 분자는 당업자들에 의해 많은 분석 기술들로 분명하게 동정되고 구조적으로 특징화된다. 이는 디사카라이드 분석, 테트라사카라이드 분석, HPLC 및 분자량의 결정 중 하나 또는 그것들의 조합을 포함한다. 이러한 분석 기술들은 당업자들에게 잘 공지되어 있고 사용된다.
HS로부터 디- 및 테트라-사카라이드를 생성하는 2가지 기술은 아질산 분해 및 리아제 분해를 포함한다. 이러한 분해 기술을 수행하는 하나의 방법에 대한 설명이 아래에 제공되며, 순수하게 예시로서, 이러한 설명은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
아질산 분해
헤파란 설페이트의 아질산 기초 탈중합화는 탄수화물 쇄의 최종적인 분해로 이어지며, 완료되면 그것의 개별적인 디사카라이드 컴포넌트가 된다.
예를 들어, 아질산은 0.5 M H2S04 및 0.5 M Ba(N02)2 250 μl를 얼음 위에서 분리하여 15 분간 냉각시킴으로 제조될 수 있다. 냉각 후에, Ba(N02)2 는 H2S04 와 결합되며 원심 분리되기 전에 와동되고 바륨 설페이트 침전물이 제거된다. HN02 125 μl는 H20 20 μl에 재현탁된(resuspended) GAG 샘플에 첨가되며, 인큐베이션되기 전에 25℃에서 15 분간 와동되고 가끔 믹싱이 일어난다. 인큐베이션 된 후에, 1 M Na2C03 가 샘플에 첨가되어 pH 6이 된다. 다음으로, 0.1 M NaOH 내의 0.25 M NaBH4 100 μl가 샘플에 첨가되고 혼합물은 50℃로 20 분간 가열된다. 혼합물은 그후에 25℃로 냉각되고 산성화된 차가운 아세트산 첨가되어 샘플이 pH 3이 되도록 한다. 혼합물은 그후에 10 M NaOH로 중화되며 용적은 동결 건조로 감소된다. 최종 샘플은 Bio-Gel P-2 컬럼을 통과하여 디- 및 테트라사카라이드로 분리되고 분해의 정도를 확인한다.
리아제 분해
헤파리나제 III는 당 쇄의 글루쿠론 결합을 쪼갠다. 헤파리나제 효소들 (I, II 및 III)은 각각 특정한 설페이션 인식 부위의 특정한 헤파란 설페이트 서열을 탈중합화함으로 상대적으로 특정한 작용을 드러낸다. 헤파리나제 I은 HS 쇄를 따라 NS 영역으로 HS 쇄를 쪼갠다. 이는 설페이트화된 도메인의 분열로 이어진다. 헤파리나제 III는 NA 도메인으로 HS를 탈중합화하여, 탄수화물 쇄가 개별적으로 설페이트화된 도메인으로 분리되는 것을 초래한다. 헤파리나제 II는 주로 HS 쇄의 NA/NS "숄더(shoulder)" 도메인을 쪼개며, 여기서 다양한 설페이션 패턴이 발견된다. 주: 반복되는 헤파란 중합체의 디사카라이드 백본은 아미노 당 글루코스아민에 연결된 우론산이다. "NS"는 아미노 당이 아미노 기의 설페이트를 운반하여 C2, C6 및 C3에서 다른 기의 설페이션을 가능하게 하는 것을 의미한다. "NA"는 아미노 기가 설페이트화되지 않고 아세틸화된 상태로 남아있음을 나타낸다.
예를 들어, 헤파리나제 III를 사용하여 NA 영역에서 탈중합화하기 위해 효소 및 동결 건조된 HS 샘플 모두가 pH 7.5에서 20 mM Tris-HCL, 0.1 mg/ml BSA 및 4 mM CaCI2를 함유하는 완충액에서 제조되었다. 순수하게 예시로서, 헤파리나제 III는 HS 5 mU per 1μg에 첨가되고 70℃로 5 분동안 가열되어 반응을 멈추기 전에 37℃에서 16 시간동안 인큐베이션될 수 있다.
디- 및 테트라사카라이드는 컬럼 크로마토그래피로 추출될 수 있다.
골절
일부 양태에서 본 발명은 골절을 치료하기 위한 HS8의 치료적인 용도 (인간 및/또는 동물)와 관계가 있다.
골절은 의학적인 조건이다. 본 출원에서 "골절"은 뼈에 금이 가거나, 부러지거나 또는 흠이 간 뼈에 대한 피해 또는 손상을 포함한다. 브레이크(break)는 뼈의 불연속성을 나타낸다. 골절은 물리적 충격, 또는 기계적인 스트레스(stress) 또는 골다공증 또는 골관절염과 같은 의학적인 조건에 의해서 초래될 수 있다.
골절의 정형외과적인 분류는 폐쇄 또는 개방 및 단순 또는 다중-파편 골절을 포함한다. 폐쇄 골절에서는 피부가 온전하게 남아있는 반면, 개방 골절에서는 뼈가 상처 부위를 통해 노출될 수 있고, 이는 더 높은 감염의 위험을 초래한다. 단순 골절은 단일 선상에서 일어나며, 뼈를 둘로 나누는 경향이 있다. 다중-파편 골절은 뼈를 다수의 조각들로 나눈다.
다른 골절 타입은, 압박골절, 다진(compacted) 골절, 나선골절, 완전 및 불완전골절, 횡, 선형 및 사골절 및 분쇄골절을 포함한다.
대부분의 대상체에서 뼈 치유(골절 결합[union])는 자연스럽게 일어나며 손상 후에 개시된다. 출혈은 일반적으로 응고 및 백혈구 및 섬유아세포의 결집으로 이어지며, 콜라겐 섬유질의 생성이 뒤따른다. 이는 콜라겐 기질을 뼈로 변형하는 뼈 기질 (칼슘 하이드록시아파타이트) 퇴적 (무기물화)으로 이어진다. 미성숙한 재-생성된 뼈는 전형적으로 발달한 뼈보다 약하며 시간이 흐르면서 미성숙한 뼈는 발달한 "라멜라(lamellar)" 뼈를 생성하기 위해 리모델링 과정을 거친다. 완전한 뼈의 치유 과정은 전형적으로 수 개월의 상당한 시간이 걸린다.
골절이 일어나고 HS8을 사용한 치료로부터 유익을 얻을 수 있는 뼈는 모든 뼈 타입을 포함하고, 특히 모든 포유류의 뼈는, 긴 뼈 (예를 들어 대퇴골, 상완골, 지골), 짧은 뼈 (예를 들어 수근골, 부골), 납작한 뼈 (예를 들어 두개골, 늑골, 견갑골, 흉골, 요대), 고르지 못한 뼈 (예를 들어 척추골), 종자골 뼈 (예를 들어 슬개골)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
골절이 일어나고 HS8을 사용한 치료로부터 유익을 얻을 수 있는 뼈는 골격의 뼈 (즉 골격의 임의의 뼈), 안면의 영역의 뼈, 축 골격의 뼈 (예를 들어 척추골, 늑골), 부속지의 뼈 (예를 들어 수족의), 골반의 골격의 뼈 (예를 들어 골반뼈)를 포함한다.
골절이 일어나고 HS8을 사용한 치료로부터 유익을 얻을 수 있는 뼈는 또한 턱, 코 및 볼과 같은 안면의 것을 포함하는 두부 (두개골) 및 목의 것을 포함한다. HS8는 치과의 또는 안면의 또는 두개골의 수술동안 뼈의 수복 또는 재생을 돕는데 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 턱뼈를 포함하는 안면 및/또는 구강의 뼈(치아와는 다르게)의 재건을 포함할 수 있다.
골절은 또한 골다공증 대상체에서 나타나는 것과 같은 병적 다공성을 포함한다.
본 발명을 제한하지는 않지만, HS8의 주요 작용은 세포 내의, 세포와 인접한, 또는 상처 부위로 이동된 세포에서 일어나며 중간엽 줄기 세포, 뼈 줄기 세포, 전조골세포 또는 골아 세포, 또는 보조적인 또는 맥관형성(vasculogenic) 세포 발견되는 또는 이동된 상처 바닥(bed)내의 임의의 세포에서 일어날 수 있다.
HS8 및 약제학적 조성물 및 HS8을 포함하는 약제는 포유류의 대상체에서 골절의 치료의 방법에의 용도로서 제공된다. 치료는 뼈의 상처 치유를 포함할 수 있다. 치료는 뼈의 수복, 재생 및 성장을 포함할 수 있다. HS8는 새로운 뼈 성장을 용이하게 함으로 골절 수복을 용이하게 한다. HS8은 뼈 치유가 일어나게 하는 골절 수복 속도를 더 빠르게 향상시키기 위해 작용하고, 이는 손상으로부터 회복 시간을 향상시킨다. 치료는 향상된 뼈 강도로 이어질 수 있다.
치료는 또한 골다공증 또는 골관절염의 치료를 포함할 수 있다.
HS8의 투여는 바람직하게는 골절 주위의 조직에 이루어진다. 이는 골절이 일어난 골 조직에 직접적으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 투여는 뼈 또는 골절 주위의 연결 조직 또는 뼈에 인접하고 뼈를 공급하는 맥관 구조 (예를 들어 혈관)에 이루어질 수 있다. 손상 부위에 직접적으로 투여할 수 있으며 상처의 초기 치유에 의해 형성되는 굳은살(callus)에 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약제 및 약제학적 조성물은 수많은 경로에 의한 투여를 위하여 제형화 될 수 있다. 가장 바람직하게는 HS8은 주입을 위한 유체 또는 액체 형태로 제형화된다.
일부 실시형태에서 HS8은 조절된 방출 제형, 예를 들어, 상처 부위에 임플란트(implantation)하기 위한 약 캡슐로서 제형화 된다. HS8는 담체 물질(예를 들어, 생체물질), 예를 들어, 나노섬유 또는 생물분해성 종이 또는 텍스타일(textile) 내로 스며들거나 침습되어 부착될 수 있다.
HS8을 포함하는 약제학적 조성물, 약제, 임플란트 및 보철물은 또한 FGF2를 포함할 수 있다. FGF2와 결합하는 HS8의 능력 때문에, HS8는 FGF2의 담체로서 작용할 수 있다.
투여는 바람직하게는 "치료학적 유효량"으로 이루어지며, 이는 상응하는 미치료된 골절과 비교하여 골절의 치유를 향상하기에 충분한 정도이다. 실제 투여되는 양, 속도 및 투여의 시간-경로(time-course)는, 골절의 특성 및 중증도에 좌우된다. 치료의 처방, 예를 들어 투여량 결정 등은 가정의 및 다른 전문의의 책임 안에 있으며, 골절의 특성, 개별적인 환자의 상태, 전달의 부위, 투여 방법 및 시술자에게 공지된 다른 인자를 전형적으로 고려하여 정해진다. HS8의 투여량의 단일 또는 다중 투여는 처방한 의학적인 시술자의 지도에 따라 투여될 수 있다. 순수하게 예시로서, HS8은 적어도 1 ng/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 5ng/ml 및 선택적으로 10 ng/ml 또는 그 이상의 투여량으로 전달될 수 있다. 개별적인 HS8 투여량은 1 mg 보다는 낮고 1 μg보다는 큰 차수로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 약 5μg, 약 10μg, 약 25μg, 약 30μg, 약 50μg, 약 100μg, 약 0.5mg, 또는 약 1 mg중 하나가 될 수 있다. 위에 언급된 기술 및 관례(protocols)의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins에서 발견될 수 있다.
HS8은 예를 들어, 고통 완화제 또는 소염제의 투여, 예를 들어, 부상당한 팔다리를 석고 모형으로 고정시키는 뼈의 고정화 및 세팅, 예를 들어, 이탈, 만곡(angulation) 또는 탈구를 교정하기 위하여 뼈를 다시 맞추거나 뼈를 옮기는 수술적 개입같은 다른 치료와 함께 뼈 골절을 치료하는 데 사용된다. 만약 수술이 요구되는 경우, HS8은 수술과정 동안 골절로 직접(예를 들어, 도포함) 투여될 수 있다.
생체물질
본 발명의 약제학적 조성물 및 약제 (medicament)는 HS8이 코팅 및/또는 주입된 (impregnated) 생체물질의 형태일 수 있다. 상기 생체물질로부터 임플란트 또는 보철물이 형성될 수 있다. 상기 임플란트 또는 보철물은 세포 이식, 골 성장, 조직 재생, 조직 재구축 (restructuring) 및/또는 조직 리모델링(re-modelling)에 보조용으로 외과적으로 이식될 수 있다.
HS8은 원하는 위치에 새로운 조직 형성을 촉진하기 위해 임플란트 또는 보철물로 적용될 수 있다. 단백질과는 달리, 헤파란 설페이트는 특히 강건하며 (robust), 합성 바이오스캐폴드 (bioscaffold)의 제조, 및 임플란트 및 보철물에 적용에 요구되는 용매를 견디는 더 나은 능력을 가지는 것이 인정될 것이다.
상기 생체물질은 HS8로 코팅 또는 함침 (impregnated) 될 수 있다. 함침은 예를 들어 폴리머화 과정에서 상기 생체물질의 구성 성분과 HS8을 혼합하여, 또는 HS8을 생체물질로 흡수시켜 생체물질을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 코팅은 상기 생체물질의 표면에 HS8을 흡수시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 생체물질은 대상체 (subject)에 투여 또는 이식되었을 때 생체물질로 부터 코팅 또는 주입된 HS8을 방출하게 할 수 있다. 생체물질 방출 동력학 (release kinetics)는 그 구조, 예를 들어 생체물질의 다공성 (다공성)을 변화시켜 변할 수 있다.
생체물질을 HS8로 코팅 또는 주입하는 것에 더하여, 하나 이상의 생물학적 활성 분자가 생체물질에 주입 또는 코팅될 수 있다. 예를 들어, BMP-2, BMP-4, OP-1, FGF-1, FGF-2, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3; VEGF; 콜라겐; 라미닌; 피브로넥틴; 비트로넥틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 생활성 분자에 더하거나 또는 이를 대체하여, 하나 이상의 비스포스포네이트가 HS8과 함께 생체물질에 주입 또는 코팅될 수 있다. 유용한 비스포스포네이트의 예는 에티드로네이트 (etidronate); 클로드로네이트 (clodronate); 알렌드로네이트 (alendronate); 파미드로네이트 (pamidronate); 리세드로네이트 (risedronate); 졸레드로네이트 (zoledronate)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다.
HS8이 코팅 또는 주입된 생체물질은 의학적 및 수의학적 목적에 모두 유용할 수 있다. 본 발명은 환자의 삶의 질을 향상시키거나, 예를 들어 육종에 사용하기 위한 가치 있는 경주마와 같은 동물의 삶을 잠재적으로 연장시키는 것으로 인정될 수 있다.
상기 생체물질은 스캐폴드 (scaffold) 또는 매트릭스 지지체 (matrix support)를 제공한다. 상기 생체물질은 조직에 이식하기 적합할 수 있고, 또는 투여에 적합할 수 있다 (예를 들어, 용액 내 마이크로캡슐 형태로).
상기 임플란트 또는 보철물은 생체적합성, 예를 들어 비독성 및 저면역원성 (가장 바람직하게는 비면역원성)이 있어야 한다. 상기 생체물질은 상처가 치유되면서 생체물질이 분해되고, 궁극적으로 대상체 내에서 그 자리에 재생된 뼈만 남게 되는 생분해성일 수 있다. 대안적으로 비생분해성 생체물질이 사용될 수 있는데, 예를 들어 크게 단절된 (over a large discontinuity) 골 재생을 안내하기 위해 및/또는 골 치유 과정에서 구조적 지지체로서 역할을 하기 위해, 성공적으로 상처가 회복된 후 선택적 요구로 상기 생체물질을 외과적으로 제거하여 사용될 수 있다.
생체물질은 부드럽고 및/또는 유연할 수 있고, 예를 들어 하이드로겔 (hydrogel), 피브린 웹 (fibrin web) 또는 메쉬 (mesh), 또는 콜라겐 스폰지일 수 있다. "하이드로겔"은 물 분자 또는 겔을 형성하기 위한 기타 용액을 가두는 삼차원 열린-격자 (open-lattice) 구조를 생성하기 위해 천연 또는 합성일 수 있는 유기 중합체가 굳어지거나 (set) 고형화될 때 형성되는 물질이다. 고형화는 응집 (aggregation), 응고 (coagulation), 소수성 상호작용 또는 가교 (cross-linking)에 의해 발생할 수 있다.
대안적으로 생체물질은 상대적으로 단단한 구조일 수 있는데, 예를 들어 플라스틱, 또는 티타늄과 같은 생물학적으로 비활성 금속과 같은 고체 물질로 부터 형성되는 것일 수 있다.
상기 생체물질은 가교 중합체에 의해 제공될 수 있는 다공성 매트릭스 구조를 가질 수 있다. 상기 생체물질은 가교 중합체에 의해 제공될 수 있는 다공성 매트릭스 구조를 가질 수 있다.
매트릭스 구조는 예를 들어 피브린 또는 콜라겐 등의 가교 섬유에 의해 형성되거나, 또는 소듐 알지네이트, 키토산 또는 예를 들어 칼슘염, 폴리아크릴산, 헤파린 등 적절한 가교제를 가지는 기타 폴리사카라이드의 액체 필름에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, 스캐폴드는 당업자에게 공지된 잘 확립된 방법을 사용하여 가교결합된 콜라겐 또는 알기네이트에 의해 제작되는 젤로써 형성될 수 있다.
매트릭스 형성을 위한 적합한 중합체 물질은, 이에 제한하지 않고, 아가로스, 콜라겐, 피브린, 키토산, 폴리카프로락톤, 폴리(DL-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드, 폴리하이드록시알카노에이트, 이의 공중합체의 그룹 중에서 선택될 수 있는 생물분해성/생물흡수성(biodegradable/bioresorbable) 중합체, 또는 셀룰로오스 아세테이트; 셀룰로오스 부티레이트, 알기네이트, 폴리술폰, 폴리우레탄, 폴리아크릴로니트릴, 술폰화 폴리술폰, 폴리아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메틸메타크릴레이트, 이의 공중합체의 그룹 중에서 선택될 수 있는 비생물분해성(non-biodegradable) 중합체를 포함한다.
콜라겐은 그의 생체적합성 및 세포 부착 및 기능을 지지하는 유리한 특성으로 인해 매트릭스 구조(construction)를 위한 유망한 물질이다(U.S. Pat. No. 5,019,087; Tanaka, S.; Takigawa, T.; Ichihara, S. & Nakamura, T. Mechanical properties of the bioabsorbable polyglycolic acid-collagen nerve guide tube Polymer Engineering & Science 2006, 46, 1461 -1467). 임상적으로 허용가능한 콜라겐 스폰지는 매트릭스의 한 예이며 종래기술에 잘 공지되어 있다(예를 들어 Integra Life Sciences에서).
피브린 스캐폴드(예를 들어, 피브린 접착제)는 대안적인 매트릭스 물질을 제공한다. 피브린 접착제는 상처 밀봉제(sealant), 성장 인자를 전달하는 저장 기관으로써 및 생물학적 임플란트의 배치와 안전의 보조물로써의 광범위한 임상적 용도를 가진다.(Rajesh Vasita, Dhirendra S Katti. 조직 공학을 위한 성장 인자 전달 시스템: 물질 전망. 의료기기에서의 전문가 리뷰. 2006; 3(1): 29-47; Wong C, Inman E, Spaethe R, Helgerson S. Thromb . Haemost . 2003 89(3): 573-582; Pandit AS, Wilson DJ, Feldman DS. 산성 성장 인자 (FGF-1)의 전달을 위한 효과적인 비히클로서의 피브린 스캐폴드. J. Biomaterials Applications. 2000; 14(3); 229-242; DeBlois Cote MF. Doillon CJ. 헤파린-섬유아세포 성장 인자 피브린 복합체: 콜라겐 기반 물질에 대한 시험관내 및 생체내 용도. 생체물질. 1994; 15(9): 665-672.)
본 명세서에 참조로서 포함되는 문헌인 루옹-반 등(Luong-Van et al, In vitro biocompatibility and bioactivity of microencapsulated heparan sulphate Biomaterials 28 (2007) 2127-2136)은, 폴리카프로락톤 마이크로캡슐로부터의 HS의 지연된 국소 전달을 개시하고 있다.
생체물질의 또 다른 예는 하이드록시아파타이트 또는 히알루론산을 포함하는 폴리머이다.
HS8와 결합하여 사용하기에 적합한 생체물질의 일례로는 JAX™ 골 결손 충진재(bone void filler)(스미스 앤 네퓨)이다. Jax 과립은 고순도 칼슘 설페이트로 이루어지고 이들의 형태를 유지하여 제어된, 과립간 다공성 및 과립 이동 안정성을 갖는 스캐폴드를 제공한다. 작스 과립은 생체내에서 안전하고 완전하게 용해된다.
다른 적합한 생체물질은 세라믹 또는 금속(예를 들어, 티타늄), 하이드록시아파타이트, 트리칼슘 포스페이트, 탈미네랄화 골 매트릭스(DBM), 자가이식편(즉, 환자의 조직으로부터 유래된 이식편), 또는 동종이식편(환자가 아닌 동물의 조직으로부터 유래된 이식편)을 포함한다. 생체물질은 합성물(예를 들어, 금속, 섬유, 세라믹) 또는 생물(예를 들어, 동물 조직, 예컨대 비인간 포유동물(예를 들어, 소, 돼지), 또는 인간으로부터 생성된 담체 물질)일 수 있다.
생체물질은 추가적인 세포로 보충될 수 있다. 예를 들어, 미분화 골 전구체 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포, 더욱 바람직하기로 인간 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포와 함께 생체물질을 "시드(seed)"(또는 이를 함께 합성(co-synthesise))할 수 있다.
처치되는 대상은 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 대상은 바람직하기로 포유동물, 더욱 바람직하기로 인간이다. 대상은 비인간 포유동물(예를 들어, 토끼, 기니 피크, 래트, 마우스 또는 다른 설치동물(설치 목의 임의의 동물 유래 세포 포함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소(암소(cow), 예를 들어 젖소, 또는 보스(Bos) 속의 임의의 동물 포함), 말(말과(Equidae)의 임의의 동물 포함), 당나귀, 및 비인간 영장류)일 수 있다. 비인간 포유동물은 가정의 애완동물, 또는 상업적 목적을 위해 보유하는 동물, 예를 들어 경주마, 또는 돼지, 양 또는 소와 같은 농업용 가축일 수 있다. 대상은 수컷 또는 암컷일 수 있다. 대상은 환자일 수 있다.
본 발명에 따른 방법은, 나타낸 바와 같이, 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 용어 "시험관내"는 배양물 내 세포를 사용하는 과정을 포함하는 것으로 의도되는 반면, 용어 "생체내"는 무손상 다세포 생물을 사용하는 과정을 포함하는 것으로 의도된다.
세포의 계대 (passage)
본원에 개시된 방법은 배양 중 세포의 계대, 또는 분할(splitting)를 포함할 수 있다. 상기 방법은 연속적인(continuous) 또는 계속적인(continual) 계대를 수반할 수 있다.
용어 "계대(passage)"는 일반적으로 세포 배양물의 하나의 분취물(aliquot)을 취하고, 상기 세포를 완전히 또는 부분적으로 해리시킨 다음, 희석시키고 배지(medium)에 접종시키는 과정을 나타낼 수 있다. 계대는 1회 또는 그 이상의 횟수로 반복될 수 있다. 상기 분취물은 세포 배양물의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 상기 분취물의 세포는 완전히 또는 부분적으로 합류하거나 또는 합류하지 않을 수 있다. 계대는 하기 순서의 단계들 중 적어도 일부를 포함할 수 있다: 흡인, 헹구기, 트립신 처리, 인큐베이션, 흡출, 퀀칭, 재-시딩(re-seeding) 및 분취하기(aliquoting). 유씨 샌 디에이고(UC San Diego)의 헤드릭 랩(Hedrick Lab)에서 발표한 프로토콜을 사용할 수 있다(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html).
배양물 중 세포는 기체(substrate) 또는 플라스크로부터 해리되고, 조직 배양 배지로 희석시키고 재평판배양(replating) 함으로써 "분할(split)"되고, 계대배양되거나(subcultured) 계대된다(passaged).
계대의 과정은 적어도 1회, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회 등(하기에 기술된 바와 같이)이 반복될 수 있다. 몇몇의 경우에, 이는 임의의 횟수, 예를 들어 무한으로 반복될 수 있다. 가장 바람직하기로, 상기 과정은 3회 또는 그 이상의 횟수, 예를 들어 5회 또는 그 이상의 횟수, 6회 또는 그 이상의 횟수, 7회 또는 그 이상의 횟수, 8회 또는 그 이상의 횟수, 9회 또는 그 이상의 횟수, 10회 또는 그 이상의 횟수, 11회 또는 그 이상의 횟수, 12회 또는 그 이상의 횟수, 13회 또는 그 이상의 횟수, 14회 또는 그 이상의 횟수, 15회 또는 그 이상의 횟수, 16회 또는 그 이상의 횟수, 17회 또는 그 이상의 횟수, 18회 또는 그 이상의 횟수, 19회 또는 그 이상의 횟수, 20회 또는 그 이상의 횟수, 21회 또는 그 이상의 횟수, 22회 또는 그 이상의 횟수, 23회 또는 그 이상의 횟수, 24회 또는 그 이상의 횟수, 25회 또는 그 이상의 횟수로 반복될 수 있다.
세포는 임의의 적합한 수단, 예컨대 당업계에 알려진 기계적 또는 효소적 수단으로 해리시킬 수 있다. 세포는 기계적 해리, 예를 들어 세포 스크래퍼 또는 피펫을 사용하여 깰 수 있다. 세포는 적합한 분자체, 예컨대 100 마이크론 또는 500 마이크론 체를 통해 체질함으로써 해리시킬 수 있다. 세포는 효소적 해리, 예를 들어 콜라게나제 처리 또는 trypLE 수확으로 분할시킬 수 있다. 상기 해리는 완전하거나 또는 부분적일 수 있다.
희석은 임의의 적합한 희석일 수 있다. 세포 배양물 내 세포는 임의의 적합한 비율로 분할될 수 있다. 예를 들어, 세포는 1:2 또는 그 이상, 1:3 또는 그 이상, 1:4 또는 그 이상, 또는 1:5 또는 그 이상의 비율로 분할될 수 있다. 세포는 1:6 또는 그 이상, 1:7 또는 그 이상, 1:8 또는 그 이상, 1:9 또는 그 이상, 또는 1:10 또는 그 이상의 비율로 분할될 수 있다. 분할 비율은 1:10 또는 그 이상일 수 있다. 이는 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20 또는 그 이상일 수 있다. 분할 비율은 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25 또는 1:26 또는 그 이상일 수 있다.
따라서, 줄기 세포는 1 계대 또는 그 이상으로 계대될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 계대 또는 그 이상으로 계대될 수 있다. 줄기 세포는 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 그 이상의 계대로 계대될 수 있다. 줄기 세포는 배양물 중에서 무한으로 증식될 수 있다.
계대는 세포 성장의 세대로서 표현될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 줄기 세포가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 세대 또는 그 이상으로 증식되는 것을 허용하기에 적합하다. 줄기 세포는 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 그 이상의 세대로 성장될 수 있다.
계대는 또한 세포 배가(doubling)의 수로서 표현될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 줄기 세포가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 세포 배가 또는 그 이상으로 증식되는 것을 허용하기에 적합하다. 줄기 세포는 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 그 이상의 세포 배가로 성장될 수 있다.
줄기 세포는 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상 또는 800 이상의 계대, 세대 또는 세포 배가로 배양될 수 있다. 줄기 세포는 100, 200, 500 또는 그 이상의 계대, 세대 또는 세포 배가로 유지될 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 각각의 계대에서 세포는 HS8과 접촉된다. 다른 실시형태에서, HS8은 계대 배양물 중 선택된 수, 예를 들어 계대 배양물의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95% 중 하나로만 배양 배지 중에 존재할 수 있다.
증식된 줄기 세포는 배양물을 시딩하기 위해 사용된 초기 줄기 세포(들)의 적어도 하나의 특징을 유지할 수 있다. 줄기 세포는 하나 또는 그 이상의 계대 이후 상기 특징을 유지할 수 있다. 이들은 다수의 계대 이후에도 그러할 수 있다. 이들은 상기에 기재된 바와 같은 언급된 계대 수 이후에도 그러할 수 있다.
상기 특징은 형태학적인 특징, 면역조직화학적 특징, 분자생물학적 특징 등을 포함할 수 있다. 상기 특징은 생물학적 활성을 포함할 수 있다. 특히, 줄기 세포는 특정 분자 마커, 예컨대 세포 표면 마커의 발현, 또는 발현의 유지를 특징으로 할 수 있다.
마커의 검출은 당업계에 알려진 임의의 수단, 예를 들어 면역학적으로 달성될 수 있다. 조직화학 염색, 유세포분석(FACS), 웨스턴 블럿, 효소-결합 면역분석법(ELISA) 등이 사용될 수 있다.
생물학적 활성은 언급된 계대의 수 이후의 세포 생존력을 포함할 수 있다. 세포 생존력은 다양한 방식, 예를 들어 트리판 블루 배제로 분석될 수 있다. 생체염색을 위한 프로토콜은 하기와 같다. 적절한 튜브 내에 적합한 부피의 세포 현탁액(20-200 μL)을 넣고 동일 부피의 0.4% 트리판 블루를 첨가하고 부드럽게 혼합한 후, 상온에서 5분 동안 방치한다. 혈구계에 10 μl의 염색된 세포를 넣고 생존(비염색) 및 사멸(염색) 세포의 수를 계수한다. 각각의 사분면(quadrant)의 비염색 세포의 평균 개수를 계산하고, 2 x 104으로 곱하여 세포/ml을 구한다. 생존 세포의 퍼센트는 사멸 및 생존 세포의 개수로 나눈 생존 세포의 개수이다.
세포의 생존력은 50% 또는 그 이상, 60% 또는 그 이상, 70% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 93% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 97% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다.
증식된 줄기 세포는 줄기 세포 타입의 특징이 되는 계통(lineage)으로 분화하는 능력을 유지할 수 있다. 특정 계통으로 분화하는 줄기 세포의 유도 방법은 당업계에 알려져 있으며 증식된 줄기 세포의 가능성(capability)을 분석하는데 사용될 수 있다. 증식된 세포의 모두 또는 상당한 부분이 이러한 능력을 유지할 수 있다. 이는 증식된 줄기 세포의 50% 또는 그 이상, 60% 또는 그 이상, 70% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 93% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 97% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다.
증식된 줄기 세포는 증식 도중 또는 이후에 정상 핵형을 유지할 수 있다. "정상(normal)" 핵형은 줄기 세포가 유래된 모 줄기 세포, 또는 이로부터 달라졌으나 임의의 실질적인 방식으로는 달라지지 않은 줄기 세포의 핵형과 동일, 유사 또는 실질적으로 유사한 핵형이다. 예를 들어, 임의의 심한 이상(gross anomaly), 예컨대 전위, 염색체의 결손, 결실 등이 아니어야 한다.
핵형은 다수의 방법, 예를 들어 광학 현미경 하에 시각적으로 평가될 수 있다. 핵형은 McWhir et al. (2006), Hewitt et al. (2007), 및 Gallimore and Richardson (1973)에 개시된 바와 같이 준비되고 분석될 수 있다. 세포는 또한 표준 G-밴딩(G-banding) 기술을 사용하여 핵형이 결정될 수 있고(일반적인 핵형 결정 서비스를 제공하는 많은 임상 진단실, 예를 들어 오클랜드 캘리포니아의 사이토제네틱스 랩(Cytogenetics Lab)에서 이용가능) 발표된 줄기 세포 핵형과 비교될 수 있다.
증식된 세포의 모두 또는 상당한 부분이 정상 핵형을 유지할 수 있다. 이러한 비율은 50% 또는 그 이상, 60% 또는 그 이상, 70% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 93% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 97% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상, 또는 실질적으로 100%일 수 있다.
배양 배지
HS8 (바람직하기로 분리된 HS8)를 포함하는 배양 배지는 임의의 종류일 수 있으나 바람직하기로 액체 또는 겔이고 다른 영양소 및 성장 인자(예를 들어, FGF-2)를 함유할 수 있다. 배양 배지는 액체 또는 겔로 재구성하기 위한, 건조된 형태, 예를 들어 분말화 형태로 준비될 수 있다. HS8은 바람직하기로 비-미량(non-trace amounts)으로 존재할 것이다. 예를 들어, 배양 배지 내 HS8의 농도는 약 1 ng/ml 배양 배지 내지 약 1000 ng/ml 배양 배지의 범위일 수 있다. 바람직하기로, 배양 배지 내 HS8의 농도는 약 500 ng/ml 또는 그 미만, 더욱 바람직하기로 250 ng/ml 또는 그 미만, 100 ng/ml 또는 그 미만, 90 ng/ml 또는 그 미만, 80 ng/ml 또는 그 미만, 70 ng/ml 또는 그 미만, 60 ng/ml 또는 그 미만, 50 ng/ml 또는 그 미만, 40 ng/ml 또는 그 미만, 30 ng/ml 또는 그 미만, 20 ng/ml 또는 그 미만, 10 ng/ml 또는 그 미만, 또는 5 ng/ml 또는 그 미만이다.
헤파란 설페이트의 용량(dosage)
시험관내 및 생체내 사용 모두에서, HS8은 약 500 ng/ml 또는 그 미만, 더욱 바람직하기로 250 ng/ml 또는 그 미만, 100 ng/ml 또는 그 미만, 90 ng/ml 또는 그 미만, 80 ng/ml 또는 그 미만, 70 ng/ml 또는 그 미만, 60 ng/ml 또는 그 미만, 50 ng/ml 또는 그 미만, 40 ng/ml 또는 그 미만, 30 ng/ml 또는 그 미만, 20 ng/ml 또는 그 미만, 10 ng/ml 또는 그 미만, 5 ng/ml 또는 그 미만 중의 하나; 또는 약 100 mg 또는 그 미만, 50 mg 또는 그 미만, 40 mg 또는 그 미만, 30 mg 또는 그 미만, 20 mg 또는 그 미만, 10 mg 또는 그 미만, 5 mg 또는 그 미만, 4 mg 또는 그 미만, 3 mg 또는 그 미만, 2 mg 또는 그 미만, 또는 1 mg 또는 그 미만; 또는 약 0.3-5㎍/ml 사이, 0.3-4, 0.3-3, 0.3-2.5, 0.3-2, 0.3-1.5, 0.3-1.0, 0.3-0.9, 0.3-0.8, 0.3-0.7, 0.3-0.6, 0.3-0.5, 0.3-0.4, 1-2, 1-1.75, 1-1.5, 1-1.25, 1.25-2, 1.5-2, 또는 1.75-2 μg/ml의 농도 또는 용량으로 사용될 수 있다.
FGF2
본 명세서에서, FGF2는 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원인 섬유아세포 성장 인자 2(또한 기본적인 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 또는 FGF-β로 알려짐)를 언급한다.
FGF2는 많은 조직의 기저막에 존재하고 신호 자극의 부재시 막에 구속된채로 머무르는 것으로 여겨진다. FGF2는 상처 치유, 종양 발달 및 혈관신생에 연관되어 왔다.
FGF2의 이의 티로신 키나제 수용체에 대한 결합은 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MEK)의 활성화 및 세포외 신호-관련 키나제(ERK)의 인산화를 수반하는 신호 케스케이드(signal cascade)를 자극한다(예를 들어, Ok-Jin Park et al., The Journal of Biological Chemistry, 285, (2010) 3568-3574 참고).
호모 사피엔스 유래 FGF2의 아미노산 서열을 도 28에 도시한다(헤파린 결합 도메인 서열번호 1은 밑줄쳐짐). 이러한 서열은 유전자은행 등록번호(Accession no.) NP_001997.5 하에 이용가능하다(Gl: 153285461).
본 명세서에서, "FGF2"는 도 28에 도시된 FGF2의 아미노산 서열과 적어도 70%, 더욱 바람직하기로 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상동성 중 하나를 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
FGF2 단백질 또는 폴리펩타이드는 또한 바람직하기로 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 하나의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 헤파린 결합 도메인을 포함한다.
FGF2 단백질 또는 폴리펩타이드는 전장(full length) FGF2 단백질 또는 폴리펩타이드의 단편 또는 결절(truncate)일 수 있다.
FGF2 단백질은 임의의 동물 또는 인간, 예를 들어 비인간 동물, 예컨대 토끼, 기니 피크, 래트, 마우스 또는 다른 설치동물(설치 목의 임의의 동물 포함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소(암소(cow), 예를 들어 젖소, 또는 보스(Bos) 속의 임의의 동물 포함), 말(말과(Equidae)의 임의의 동물 포함), 당나귀, 및 비인간 영장류 또는 다른 비인간 척추동물 생체; 및/또는 비인간 포유동물; 및/또는 인간으로부터, 또는 이로부터 유래된 것일 수 있다.
FGF2의 용량
시험관내 및 생체내 사용 모두에서, FGF2는 HS8와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇의 세포 배양 방법에서, 외인성 HS2가 배양물에 첨가된다. FGF2의 적합한 농도 또는 용량은 약 500 ng/ml 또는 그 미만, 더욱 바람직하기로 250 ng/ml 또는 그 미만, 100 ng/ml 또는 그 미만, 90 ng/ml 또는 그 미만, 80 ng/ml 또는 그 미만, 70 ng/ml 또는 그 미만, 60 ng/ml 또는 그 미만, 50 ng/ml 또는 그 미만, 40 ng/ml 또는 그 미만, 30 ng/ml 또는 그 미만, 20 ng/ml 또는 그 미만, 10 ng/ml 또는 그 미만, 5 ng/ml 또는 그 미만 중의 하나; 또는 약 100 mg 또는 그 미만, 50 mg 또는 그 미만, 40 mg 또는 그 미만, 30 mg 또는 그 미만, 20 mg 또는 그 미만, 10 mg 또는 그 미만, 5 mg 또는 그 미만, 4 mg 또는 그 미만, 3 mg 또는 그 미만, 2 mg 또는 그 미만, 또는 1 mg 또는 그 미만; 또는 약 0.1-5 ng/ml의 범위, 0.1-0.2, 0.1-0.3, 0.1-0.4, 0.1-0.5, 0.1-0.6, 0.1-0.7, 0.1-0.8, 0.1-0.9, 0.1 -1.0, 0.1-1.5, 0.1-0.2.0, 0.1-2.5, 0.1-3.0, 0.1-3.5, 0.1-4.0, 0.1-4.5, 0.1-5.0 ng/ml을 포함한다.
몇몇의 실시형태에서, HS8의 시험관내 및 생체내 사용은 외인성 FGF2의 첨가를 배제한다. 예를 들어, 본 발명의 몇몇의 세포 배양 방법에서 외인성 FGF2는 배양물에 첨가되지 않는다.
본 발명은 기재된 양태들 및 바람직한 특징들의 조합을, 이러한 조합이 명백히 허용할 수 없거나 또는 분명히 회피되는 경우를 제외하고 포함한다.
본원에 사용된 항목 머릿글은 단지 조직화 목적을 위한 것이며 기재된 주제로 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
본 발명의 양태 및 실시형태는 이하에서 첨부되는 도면을 참조하여 예시로서 설명될 것이다. 추가적인 양태 및 실시형태가 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에서 언급되는 모든 문헌들은 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명의 원리를 설명하는 실시형태 및 실험이 이하에서 첨부되는 도면을 참조하여 논의될 것이다.
도 1. 0, 25, 50 및 100 ng/ml의 FGF2의 농도에서 FGF2에 대한 HS8의 우선적인 결합을 보여주는 그래프. 그래프의 상단으로부터 하단으로의 데이터 라인: HS8+ (5㎍/ml) (삼각형), 헤파린 (5㎍/ml) (사각형), Celsus HS (5㎍/ml), HS8- (5㎍/ml), 무 GAG (다이아몬드).
도 2. FGF2에 대한 HS8 (5㎍/ml)의 특이성을 보여주는 그래프. 그래프의 상단으로부터 하단으로의 데이터 라인: HS8+/FGF2 (다이아몬드), HS8+/FGF1, HS8-/FGF2, HS8+/FGF7, HS8+/BMP2, HS8+/VEGF, SAB/FGF2, HS8+/PDGFBB.
도 3. HS8 처리에 대한 반응으로 6일째 STR01 인간 중간엽 줄기 세포의 개수에 있어서의 투여량(dose) 의존적인 증가를 보여주는 그래프. 좌측으로부터 우측으로의 바는 다음을 나타낸다: 대조군, HS8+ 50ng/ml, HS8+ 100ng/ml, HS8+ 500ng/ml, HS8+ 1OOOng/ml, HS8+ 5000ng/ml, HS8+ 10000ng/ml.
도 4. HS8+ 5000ng/ml (사각형) 및 대조군 (다이아몬드)에 대한 반응으로 6일에 걸친 STR01 인간 중간엽 줄기 세포의 증식을 보여주는 그래프.
도 5. FGF2 헤파린 결합 도메인 펩타이드를 보여주는 표.
도 6. (A) 상이한 양의 펩타이드에 대한 방사능 분당 계산(counts per minutes, CPM) (B) 친화 크로마토그래피에 의한 HS8 풀 다운(pull down)
도 7. GAG 결합 친화 분석의 배열을 도시하는 다이아그램.
도 8. FGF2에 결합하는 다양한 GAG 농도의 최적화
도 9. FGF2에 대한 다양한 GAG 결합을 보여주는 그래프
도 10. 다양한 단백질에 결합하는 (A) HS8 (HS8+) 및 (B) HS8 (-)를 보여주는 그래프.
도 11. 헤파린 비드 분석 (A) FGF2 최적화, (B) 외인성 헤파린과의 헤파린 비드 경쟁 및 (C) 다양한 GAG와의 경쟁의 백분율을 보여주는 그래프.
도 12. (A) 각각의 날(day)의 STR01 생존 세포수 및 (B) 누적 세포 성장을 보여주는 그래프.
도 13. (A) 각각의 날(day)의 HM21 생존 세포수 및 (B) 누적 세포 성장을 보여주는 그래프.
도 14. (A) 각각의 날(day)의 STRO 1 HM21 생존 세포수 및 (B) 누적 세포 성장을 보여주는 그래프.
도 15. GAG-결합 플레이트(인듀론(Iduron))로 평가된, FGF2에 대한 다양한 GAG의 결합 능력을 보여주는 그래프. HS8 (HS8+) 부분은 대부분의 FGF2뿐만 아니라 헤파린을 결합하고, 미처리 출발물질(raw starting) 셀수스(Celsus) HS 및 HS8-관류(flow through)보다 더욱 잘 결합한다.
도 16. GAG-결합 플레이트(인듀론)로 평가된, 헤파린-결합 성장 인자(HBGFs) BMP-2, FGF1, FGF2, FGF7, PDGF-BB 및 VEGF에 대한 다양한 GAG의 결합 능력을 보여주는 그래프. (A) Celsus HS, (B) HS8, (C) HS8-부분, (D) 헤파린. HS8 (HS8+) 부분은 모든 다른 HBGF에 걸쳐 FGF2를 우선적으로 결합하고 헤파린을 더욱 잘 결합한다. HS8- 및 미처리 출발물질 Celsus HS는 임의의 HBGF에 대해 거의 우선성을 보이지 않는다.
도 17. 36 시간에 걸쳐 BrdU 인코포레이션에 의해 모니터된, HS8 (HS8+)에 대한 인간 중간엽 줄기 세포의 투여량-반응을 보여주는 그래프. FGF2는 투여하는 양성 대조군으로서 사용된다. HS8+ 부분은 다른 테스트되는 GAG보다 유의적으로 더욱 많은 자극을 제공한다.
도 18. 기재된 시간(날로서)에 걸친 구아바 비아카운트(Guava ViaCount) (FACS-기초) 방법에 의해 모니터된, HS8 (HS8+) (상단) 및 FGF2 (하단)에 대한 인간 중간엽 줄기 세포의 투여량-반응을 보여주는 그래프. FGF2는 투여하는 양성 대조군(하단 그래프)으로서 사용된다. HS8은 유의적인 자극을 제공한다.
도 19. 기재된 시간(날로서)에 걸친 구아바 비아카운트(FACS-기초) 방법에 의해 모니터된, 다양한 GAG의 증가하는 농도에 대한 인간 중간엽 줄기 세포의 투여량-반응을 보여주는 그래프. HS8 (HS8+)은 더욱 높은 세포 개수로의 경향을 띠고 있다.
도 20. 7 계대까지 구아바 비아카운트(FACS-기초) 세포 계수 방법으로 모니터된, 다양한 GAG의 증가하는 농도에 대한 인간 중간엽 줄기 세포의 투여량-반응을 보여주는 그래프. FGF2 단독이 가장 높은 자극을 준다; 두 농도에서 HS8 (HS8+)은 헤파린과 같이 더욱 높은 세포 개수로의 경향을 띠고 있다.
도 21. 하기 마커에 기초한, hMSC (론자(Lonza)) 줄기 세포의 대표적인 FACS 면역표현의 결과의 도시: (A) 음성 마커: CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR, 및 (B) 양성 마커: CD73, CD90, CD105, STRO-1, SSEA-4, CD49a.
도 22. 비보충된(대조군), HS8 (HS8+), HS8-, 미처리 Celsus HS (CHS), 또는 FGF2 단독에서 7 계대 동안 성장된, FACS 면역표현된 hMSC 줄기 세포의 정량 표. 표는 다음의 관련 세포 표면 마커를 발현하는 세포의 퍼센트를 보여준다: CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR, CD73, CD90, CD105, CD49a, SSEA-4, STRO-1.
도 23. 비보충된(대조군), HS8 (HS8+), HS8-, 미처리 Celsus HS, 또는 FGF2 (2.5 ng/ml) 단독에서 4 내지 7 계대로 성장된, FACS 면역표현된 hMSC 줄기 세포의 그래프적인 표현. (A) CD49a, (B) SSEA-4, (C) STRO-1.
도 24. 비보충된(대조군), 헤파린, Celsus HS, HS8-, 및 HS8 (HS8+)을 함유하는 배양 배지 내에서 4 내지 7 계대 (P4, P7)로 성장된 hMSC의 배양 이후 hMSC CFU 분석의 (A) 그래프적인 표현 및 (B) 배양 접시의 현미경 사진.
도 25. 비보충된(대조군), HS8 (HS8+), HS8-, Celsus HS, 헤파린 및 FGF2를 함유하는 배양 배지 내에서 4 내지 7 계대 (P4, P7)로 성장된 hMSC의 배양 이후 골(상단, 알리자린 레드) 및 지방(하단, 오일 레드 오) 세포로 분화하는 hMSC의 능력을 보여주는 현미경 사진.
도 26. HS8은 FGF-2 매개 MSC 성장을 강화한다. 정상 유지(대조군) 배지, 또는 변화하는 투여량의 HS8 (㎍/ml) 및 고정된 투여량의 FGF-2 (0.156ng/ml)를 함유하는 배지 내에서 배양 이후 hMSC의 세포 개수를 보여주는 그래프.
도 27. HS8은 FGF-2 시그널링을 지속시킨다. HS8 및/또는 FGF-2로 자극 후 30분 및 24시간째 ERK1/2 인산화 및 FRS2a 인산화를 보여주는 웨스턴 블럿.
도 28. 인간 FGF2의 아미노산 서열. 서열번호 1이 밑줄로 표시된다.
도 29. E10 신경상피 (HS2) 유래 헤파란 설페이트의 아질산-유래 디사카라이드 조성. 방사성 표지된 HS는 낮은 pH HN02에 의한 탈아민성 분할(deaminitive cleavage)에 의해 탈중합되었다. 디사카라이드는 GAG의 HN02 처리 이후 분리되었으며 샘플은 그다음 1 × 120 cm Bio-Gel P-2 컬럼에 가해졌다. 결과적인 디사카라이드를 SAX-HPLC로 분획하였다. 피크 아래의 면적을 적분하여 디사카라이드 조성을 얻고 이어서 각각의 샘플 내 퍼센트 조성을 얻었다.
도 30. 헤파린 리아제 처리 후 E10 신경상피 (HS2) 유래 헤파란 설페이트의 디사카라이드 조성. 헤파란 설페이트는 헤파란 리아제의 혼합물로 완전히 탈중합되었다. 결과적인 불포화 디사카라이드는 P-2 컬럼 상에서 분리되었고 강한 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 분획되었다. 각각의 결과적인 커브 아래 면적을 적분하여 각각의 샘플 내 각각의 디사카라이드의 퍼센트를 계산하였다. 수는 2회 실행(초기 GAG 샘플에 대하여) 및 3회 실행(2.3D 유래 샘플에 대하여)의 평균을 나타낸다. 97% 이상의 디사카라이드가 각각의 샘플로부터 회수되었다.
도 31. Celsus HS, HS8 및 HS3의 1H NMR (D20 용액).
도 32. Celsus HS, HS8 및 HS3의 1H NMR의 클로즈-업.
도 33. 50 mM 암모늄 아세테이트로 용리된, 2×슈퍼덱스(Superdex) 펩타이드 컬럼 상에서 분리된 Celsus HS #10697 및 HS8의 HPLC-SEC-RI 크로마토그램.
도 34. 헤파란 설페이트의 HPLC-SEC-RI 크로마토그램: Celsus HS #10697; BMP2는 유지되지 않음(848/HS3/001); BMP2는 유지됨(HS3) (848/HS3/001); 초기 실행(HS3-001-01); 최종 실행(HS3-001-02). HS3 제제는 약 15ml에서 높은 피크(0.06-0.08)를 보인다.
도 35. Celsus로부터의 HS 제제인 HS #10697 및 HS #10595의 헤파린 리아제 I, II 및 III 분해의 HPLC-SEC-RI. 헤파린 리아제 분해는 2회 반복으로 수행되었다. 수직선은 2보다 더욱 큰 중합도(dp)를 갖는 디사카라이드 및 올리고사카라이드의 용리에 대한 컷 오프를 나타낸다.
도 36. 50 mM 암모늄 아세테이트로 용리된, 2×슈퍼덱스 펩타이드 컬럼 상에서의 HS8 (18-20ml에서의 넓은 피크), HS3-001-01 (9-20ml에서의 피크)의 HPLC-SEC-RI 크로마토그램.
도 37. 헤파린 결합 서열번호 1을 보여주는 그래프.
도 38. 고정된 헤파린을 결합시키는 HS8의 능력을 보여주는 그래프.
도 39. 친화 크로마토그래피(서열번호 1로 유도체화된 컬럼)에 의해 정제된 HS8을 결합하는 FGF-2의 능력을 보여주는 그래프. 이는 미처리 출발물질 HS (HS-PM 돼지 점막), 또는 무당(no sugar) 대조군과의 결합과 비교하였다.
도 40. HS8 존재 하에 6일에 걸친 플라스틱 부착 중간엽 줄기 세포의 증식을 보여주는 그래프.
도 41. 미처리 Celsus 출발물질 HS (HS-PM), 또는 비-결합 HS 관류(HS8-)와 비교하여, 분리된 HS8의 존재 하에 36시간에 걸쳐 STRO-1-분리된 중간엽 줄기 세포의 BrDU에 의해 측정된 증식을 보여주는 그래프.
도 42. Celsus HS에 대한 표준화된(normalized) 디사카라이드 조성을 보여주는 그래프.
도 43. HS3에 대한 표준화된 디사카라이드 조성을 보여주는 그래프.
도 44. Celsus HS, HS8 및 HS3의 디사카라이드 조성을 보여주는 그래프.
도 45. Celsus HS, HS3 및 HS8의 퍼센트 디사카라이드 조성을 보여주는 표.
도 46. HS 무존재, 헤파린, HS8, Celsus HS (HSPM) 또는 HS8-의 존재 하에 FGF-2의 안정성을 보여주는 그래프. FGF-2는 HS8의 존재 하에 안정화된다.
도 47. SU5402 (FGFR1 억제제)가 HS8로 자극된 hMSC의 증식을 억제함을 보여주는 그래프.
도 48. IMB-R1 (FGFR1 중화 항체)가 HS8로 자극된 hMSC의 증식을 억제함을 보여주는 그래프.
도 49. IMB-R1 (FGFR1 중화 항체)가 HS8로 자극된 hMSC의 증식을 억제함을 보여주는 그래프.
도 50. FGF2 중화 항체가 HS8로 자극된 hMSC의 증식을 억제함을 보여주는 그래프.
도 51. HS8이 보충된 배지에서 증식된 인간 MSCs가 더 클론제닉(clonegenic)함을 보여주는 그래프.
도 52. 쥐를 이용한 임계-크기 두개관(critical-sized calvaria) 손 모델에서 HS8이 뼈 치료를 증가시킴을 보여주는 그래프 및 마이크로 CT 분석 결과.
본 발명을 수행하기 위한 하나의 예로서, 본 발명자들에 의해 고안된 최적의 방식에 대한 구체적인 설명을 포함하는 하기 실시예를 통하여, 본 발명의 하나 이상의 실시형태를 설명한다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 하기 구체적인 실시예에 의해 한정되지 않고 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1
상업적으로 이용가능한, 돼지 켈수스(Celsus) 헤파란 설페이트 원천으로부터 새로운 FGF2 결합 HS를 정제하는 것이, 치료에 사용될 수 있는 헤파란 설페이트 (HS)의 생산 규모 확대에 적합한 것인지 확인하였다.
FGF2로부터 헤파린 결합 도메인 (HBD)의 펩타이드 서열 GHFKDPKRLYCKNGGF (서열번호 1)을 선택하여(The structure of glycosaminoglycans and interactions with proteins; Gandhi NS and Mancera RL, Chem Biol Drug Des. 2008 Dec; 72(6):455-82), FGF2에 결합하는 구체적인 HS 종을 정제하는 데에 사용하였다.
펩타이드를 합성에 투여량에 따라 니트로셀룰로스 막에 담긴 펩타이드에 대한 3H 헤파린의 특이적 결합을 3H 헤파린의 총 수와 비교하는, 3H 헤파린 어세이를 수행하였다. FGF2-HBD 펩타이드에 대한 3H 헤파린의 특이적 결합으로 인해 상기 펩타이드는, 돼지 켈수스 HS로부터 FGF2에 결합하는 특정 HS를 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 풀 다운(pull down)하는 데에 사용되었다. 상기 새로운 HS 종을 HS8로 명명하였다(변이체 이름은 HS8G로 명명하였다).
글리코사미노글리칸 (GAG)이 결합된 플레이트를 사용하여, FGF2에 대한 HS8의 특이적 결합을 헤파린, 돼지 켈수스 HS 및 HS8 음성 분획과 비교 측정을 통해 HS8의 FGF2와의 결합 특성을 분석하였다.
GAG 결합 플레이트(5μg/ml)에 GAGs를 밤새 놓은 후, 재조합 인간 FGF2 (0-100ng/ml)와 함께 배양하였다. 그 후 ELISA 방법을 사용하여 FGF2에 대한 GAGs의 결합 특성을 확인하였다.
그 결과, HS8는 다른 GAG 종에 비해 FGF2에 더 잘 결합함을 확인하였다(도 1). FGF2에 결합하는 HS8의 능력을 다른 성장 인자 (VEGF, BMP2, PDGFBB, FGF1, 및 FGF7)에 대하여 비교한 결과, HS8은 FGF2에 특이적임을 확인하였다(도 2).
HS8의 생리활성을 측정하기 위해, STR01 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)를 이용하는, 시험관내 세포 증식 어세이를 수행하였다. 대조군과 비교하여, hMSC의 단기간 성장에 있어서, 다양한 농도(50 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 ng/ml, 5000 ng/ml and 10000 ng/ml)로 보충된 독립형 배지에 HS8를 사용하였다. 다른 외인성 성장 인자의 첨가 없이, HS8 농도 의존적인 hMSC의 성장을 확인하였다(도 3 및 4).
실시예 2
중간엽 줄기 세포 ( MSC )
MSC는 골원성(osteogenic), 연골원성(chondrogenic), 지방 생성(adipogenic), 근원성(myogenic), 및 다른 계통으로 시험관내에서 분화할 수 있는, 플라스틱 점착성 세포로서 넓게 정의된다. 또한, 최근, International Society for Cytotherapy(Zulma et al, 2011)는 "다능성 중간엽 스트로마 세포(multipotent mesenchymal stromal cells)"를 MSC로 분류하였다. MSC는 골수, 지방 조직, 피부 조직, 추간판, 양수, 다양한 치아 조직, 인간 태반 및 제대혈에서 발견된다(Si et al, 2011 and Zulma et al, 2011). MSC의 치료 가능성이 사람들에게 인식되었고, 골 조직 재생 및 무골격 조직 재생과 같은 많은 치료에 적용되었다. 최근 몇 년간 MSC의 면역억제 및 항염증 효과가 보고되었다. 이는 MSC가 세포 표면에 있는, 주요 조직 적합 유전자 복합체-l (major histocompatibility complex-l, MHC-1)를 낮은 수준으로 발현시킴으로써, 면역원성을 약하게 만들고, T 및 B 림프구의 활성 및 증식을 억제하는 능력을 가지며, 손상 조직을 보호하는 동안 손상 조직의 미세환경을 변하기 때문이다 (Si et al, 201 1 and Zulma et al, 2011). 이러한 GVHD를 치료하는데 사용될 수 있는, MSC-매개 면역억제는 메카니즘에서 종 변이를 가진다 (Ren et al, 2009 and Shi et al, 2010). 사이토카인을 먹인(cytokine-primed) 마우스 유래 MSC는 산화 질소 (NO)에 의해 영향을 받고, 사이토카인을 먹인 인간 유래 MSC는 인돌아민 2, 3-디옥시게나제(indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO)에 의해 수행된다.
헤파린 및 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸 ( HSGAG )
헤파린이 비만 세포에서 생산 및 저장되는 것과 달리, HSGAGs는 모든 동물 조직에서 발견되고, 프로테오글리칸으로써 작용할 수 있으며, HS 체인은 세포 표면 또는 ECM 단백질에 결합한다. HS는 물질대사, 수송, 정보 전이, 세포 부착, 세포 성장 및 분화, 및 모든 기관계의 지지에 영향을 준다. (Bishop et al, 2007 및 Gandhi et al, 2008). 헤파린 및 HS는 우론산-(1->4)-D-글루코사민 디사카라이드 단위체가 반복되는, 선형의 폴리사카라이드이다. 우론산은 D-글루쿠론산 또는 L-이두로산일 수 있다. 또한, 특정 위치의 변이는 다른 N-설페이트화, O-설페이트화, 및 N-아세틸화된, 복합체 서열이 생기게 한다(Ori et al 2008). 헤파린에서 가장 많은 디사카라이드는 ldoA(2S)-(1->4)-GlcNS(6S)로서, 이는 체인 길이 도처에 높은 음전하를 만들어, 단백질과의 결합에 있어서, 헤파린의 선택성을 약하게 또는 사라지게 만든다. 반면, HS에서는 설페이트화되지 않은 GlcA-(1->4)-GlcNA 디사카라이드가 가장 흔한 형태이고, 이로 인해 설페이트화되지 않은 NA 도메인의 블럭과 고도로 설페이트화된, 헤파린-유사 ldoA-(1->4)-GlcNS 디사카라이드(NS 도메인)의 블럭을 분리할 수 있다. NA 및 NS 도메인은 NA/NS 전이 도메인으로 분리된다. 이러한 HS 구조의 다양성은 광범위한 생물학적 기능에 책임이 있다.
섬유아세포 성장 인자 ( FGF ) 단백질 및 헤파린 결합 도메인
섬유아세포 성장 인자 (FGFs)는 인간에서 22 종을 포함하는, 폴리펩타이드 성장 인자의 큰 패밀리이다. 섬유아세포 성장 인자는, FGF receptors (FGFR)로서 알려진, FGF 세포 표면 수용체 타이로신 키나제의 서브패밀리에 결합하고 이를 활성화시킴으로써, 발달, 분화, 세포 증식, 혈관형성 및 상처 치료에 중요한 역할을 한다(Ornitz et al 1996). 게다가, FGFs는 가장 많이 연구된, 헤파린-결합 단백질 중에 하나이고, HSGAGs는 FGFRs와 직접적인 분자 연결을 통해 FGF 시그날링을 조절한다(Pellegrini, 2001). 또한, FGFR1을 통한 FGF2 시그날링은 MSC 확장에 중요한 역활을 한다(Gronthos et al, 1999).
헤파린/HS와 FGF2의 상호작용
단백질의 헤파린/HS 결합 부위에서 공통되는 구조적 특징에 대해 많은 연구들이 보고되었다(Gandhi et al, 2008; Hileman et al, 1998 and Ori et al, 2008). Cardin 및 Weintraub는 1989년에 최초로 21개의 헤파린-결합 단백질을 분석하여 헤파린 결합 도메인 (HBD)을 결정하려는 시도를 하였고, 헤파린-결합 부위의 일반적인 서열로서 XBBXBX 또는 XBBBXXBX를 제안하였다. 여기서, B는 양전화를 가진 아미노산 (아르기닌, 라이신 및 드물게 히스티딘)이고, X는 하이드로패틱(hydropathic) 잔기이다. Hileman 등은 몇몇 단백질의 X-레이 및 NMR을 비교하여, 다음 컨센서스 서열 TXXBXXTBXXXTBB을 1998년에 보고하였다. 상기 서열에서 T는 하나의 턴을 의미하고, B는 염기성 아미노산 (아르기닌 또는 라이신)을 의미하며, X는 하이드로패틱 잔기를 의미한다.
GAGs 사이에는 강한 이온 결합이 예상되고, 양전하를 띈 염기성 아미노산을 가진 단백질과 헤파린 체인의 음전하를 가진 설페이트 또는 카르복실기는 이온 결합을 형성한다. 이온 결합은 헤파린 및 HS 유사 NS 도메인 내 고도로 설페이트화된 부분과의 결합에 있어서, 결정 요인이 된다(Fromm et al, 1997, Ori et al, 2008). 또한, 다른 종류의 결합, 즉 반 데르 발스 힘, 수소결합 및 소수성 결합이 있다. 상기 결합은 다른 이종의 HS와 결합하는 데에 관여하는데, 여기에는 중성 아미노산이 필요하다(Fromm et al, 1997 and Ori et al, 2008). FGF2를 고려할 때, 글루타민 및 아스파라긴 아미노산은 이온결합과 함께 당의 하이드록시기와 수소결합을 형성함으로써, HS와 결합하는 데에 중요한 역활을 한다(Thompson et al, 1994).
수많은 연구에 따르면, FGF2의 헤파린 결합 도메인으로서 다른 펩타이드 서열이 존재하는데, 이들을 표 1에 나타내었다. 본 발명에서 아미노산은 전체 FGF2 서열 (288aa)에 따라 번호가 부여되었다.
이식편대숙주병 (Graft versus Host disease, GVHD )
조혈 세포 이식(Haemopoietic-cell transplantation, HCT)은 혈액학적 악성 질환을 치료하는 데에 사용되는 집중 치료법이며, 동종이계의 HCT 방법은 매년 증가하고 있다(Ferrara et al, 2009). HCT의 주요한 합병증은 주로 위장관, 간, 피부 및 폐에 영향을 미치는 면역계 질환인 GVHD이다. Billingham(1966-67)에 따르면, GVHD가 발생하려면, 3개의 요건이 필요하다. 즉, 1) 이식편(graft)은 면역학적으로 수용성 세포(competent cell)인 T 림프구를 포함해야 하고, 2) 수용자는 이식 기증자에서 존재하지 않는, 조직 항원을 발현해야 하며, 3) 환자는 이식된 세포를 폐하는, 효과적인 응답을 증가시키는 것이 불가능해야 한다. 골수 소멸성 조건화 요법(myeloablative conditioning regime)이 호스트에서 결함이 있는 골수를 제거하는 데에 사용될 때, GVHD 병리생리학이 시작된다. 손상 조직에 의해 생산되는 사이토카인 (TNFα, IL1, LPS) 때문에, 호스트의 항원 제시 세포가 활성화된다. 동종이계의 HCT가 이 단계에서 수행될 때, 도너 T 세포는 활성화되어 세포의 감염 반응을 야기시키는 사이토카인을 생산하여, GVHD를 발병시킨다. 비 조혈 줄기 세포; MSC는 강력한 면역억제제 로 인해 동종이계의 T 세포 반응을 감소시킬 수 있으며, GVHD를 개선시킬 수 있다(Le Blanc et al, 2008; Meuleman et al, 2009 및 Toubai et al, 2009).
치료를 위한 hMSC의 스케일 업 필요성
이미 hMSC가 치료에 이용되고 있을지라도, hMSC를 이용한 세포 치료에 있어서, 중대한 문제점은 충분한 세포 수를 확보하는 것이 어렵다는 것이다. 적은 수의 hMSC는 0.01% 내지 0.0001%의 골수 단핵 세포보다 더 적을 수 있으며, 이로 인해 hMSC의 이용을 보편화시키지 못하고 있다. Caplan(2009)에 따르면, 다른 나이의 기증자로부터 골수를 얻어, 분산시키고, 컬쳐 플라스크에 넣은 후, CFU-Fs의 수를 세고, 유핵의 골수 세포당 MSC 대비 10년의 나이(decade of age)에 의해 나타내었다. 유핵의 골수 세포당 MSC에서 두드러진 감소, 즉, 출생부터 10대까지의 10배 감소 및 10대부터 노인까지의 10배 감소가 관찰되었다. 나이에 따라 골수에서 MSC 수가 명확하게 감소하였다. 또한, Caplan은 이러한 감소는 어린이와 성인의 골절 치료 속도와 유사한 결과라고 지적하였다. 104 유핵 골수 세포 당 약 하나인, 골수에서 조혈 줄기 세포의 역가는 개인의 나이 동안에 일정하게 유지된다.
hMSC의 현행 확장 방법
hMSC을 배양할 때, 골수의 미세환경을 모방할 수 있다면, 치료에 유용한 수의 hMSC를 얻을 수 있을 것이라고 연구자들은 생각하였다. 기초적으로 상기 모방은 2가지의 방법, 즉 ECM으로 hMSC를 배양하거나, 외인성 성장 인자를 보충하여 hMSC를 배양하는 방법을 통해 수행될 수 있다. ECM 기체를 사용할 때, hMSC의 부착 및 누적 세포의 수가 증가하는 것이 관찰되었다(Griinert et al, 2007 및 Matsubara et al, 2004) 그러나, 확장된 세포는 분화능(stemness)이 부족하였다(Cool et al, 2005). 또한, FGF2를 외인성 성장 인자 보충제로서, 공통적으로 사용한 결과, 표준 컬쳐 배지를 사용한 대조군보다 세포 수가 매우 높게 증폭됨을 알 수 있었다(Ling et al, 2006 및 Sotiropoulou et al, 2006) ECM 기체에서 자란 세포 라인에서, FGF2에서 자란 세포도 또한 대조군의 다능성 hMSC와 비교하여, 분화된 전구 세포의 수가 증가하였다(Gronthos et al, 1999 및 Walsh et al, 2000). 따라서, hMSC의 증식을 촉진하여, 분화능에 부정적인 영향없이 치료에 필요한 수의 hMSC를 얻을 수 있는, 분자의 동정은 뼈 재생 및 GVHD를 개선한 골수 이식을 위한 hMSC의 임상적 활용에 커다란 가능성을 보여준다.
HS GAG는 세포의 분화능에 영향 없이 hMSC의 성장을 개선한다.
Nurcombe 등 (1993)은 뮤린(murine) 유래 신경 전구 세포에서 HS GAG 및 이의 결합에 의해 조절되는 FGF의 활성이 수용체에 대한 FGF2의 결합에 필요하다는 것을 보고하였다. 또한, FGF에 대한 HSGAG의 결합에 상당한 차이가 있었는데, 9일째에 우선적으로 FGF2에 결합된 세포에 의해 HSGAG가 생산되었고, 11일까지 HSGAG 결합은 FGF1로 이동하였다. 또한, 독특한 헤파란 설페이트는 신경 전구 세포에 있는 세포 표면 수용체와의 결합을 통해 특정 수용체에 대한 FGF2의 결합을 매개한다(Brickman et al, 1995). Brickman et al(1998)은 추가적으로 상기 발견을 불멸성 배아 10일 차의 마우스 신경상피의 2.3D 세포로부터 2개의 분리된 HS 풀(pool)을 동정하고, 특성 분석하여 재확인하였다. 지수 증식기의 세포로부터 유래한 하나의 풀은 FGF-2의 활성을 증가시켰으며, 접촉 저해 및 분화를 경험한 세포로부터 유래한 다른 풀은 FGF1에 대한 선호도를 가지고 있었다. 우리 실험실에서 전에 보고한 바와 같이, HS2라고 명명한, 배아 유래 HSGAG는 다능성의 손실 없이 hMSC의 성장을 증가시켰고, 생체내에서 이식되었을 때, 마우스의 뼈 형성을 증가시켰다. 이러한 증거는 ECM 성분 HSGAGs가 다능성에 부정적인 영향 없이 hMSC의 성장을 개선함을 시사하는 것이다. 따라서, HS2와 비교하여, FGF2에 대한 높은 결합 친화력을 가지며, 임상적 셋팅에 용이하게 사용될 수 있는, 세포 성장에 대한 활성을 증가시키는 HS 변이체가 필요하다.
결과
컬럼 크로마토그래피를 통한 FGF - 2에 대한 높은 결합 친화력을 가진 헤파란 설페이트(HS8)의 분리
FGF2 결합 HS2를 정제하는 전략에 따라, 병원에서 쉽게 사용될 수 있는, HS 제조를 스케일 업하기 위해, 상업적으로 이용 가능한 돼지 켈수스 헤파란 설페이트 원천 (Celsus Laboratories, USA)으로부터 FGF2 결합 HS를 정제할 수 있는 가능성을 탐색하였다. 표 1에 기재한 펩타이드 서열 이외에도, FGF2-Gandhi-HBD로 명명한, 157GHFKDPKRLYCKNGGF172 (Gandhi et al, 2008)을 사용하였다.
[ 3 H] 헤파린 어세이
펩타이드를 합성하여 3H 헤파린 어세이를 통해 헤파린에 결합하는 FGF2-HBD-펩타이드의 능력을 평가하였다. 공지된 양의 펩타이드 또는 포화된 양의 펨타이드를 동일한 니트로셀룰로르 막 위에서 처음은 건조 공기로 건조시킨 후, 80℃ 진공 오븐에서 45분 동안 추가적으로 건조시켰다. 그 후 막을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 후, 4% (w/v) 소혈청알부민(BSA)/PBS에서 0.1μCi [3H] 헤파린 (Perkin Elmer, Boston, USA)과 함께 18시간 동안 바이알에서 배양하였다. 그 후 막을 세척하고, Perkin Elmer Tri-Carb 2800 TCR Liquid Scintillation Analyzer를 사용하여 방사능을 측정하였다.
공지된 양의 펩타이드 (서열번호 1)를 사용한 결과, 투여량 의존적으로 CPM을 증가시킴을 확인하였고, 이때 BMP2-HBD을 양성 대조군으로 사용하였다(도 6(A)). 그러나, 니트로셀룰로스 막을 500 μg/ml 펩타이드 용액에서 포화시켰을 때, 최고의 수를 확인하였다. 소 [3H] 헤파린에 대한 CPM의 퍼센트를 500 μg/ml 펩타이드 용액 수준에서 각 펩타이드 별로 계산하였다. BMP2-HBD (7.2%)는 가장 높았고, 다음으로 FGF2-Gandhi-HBD (4.97%)이었다. [3H] 헤파린 어세이로부터 얻은 결과에 따라, 친화 그로마토그래피를 이용하여 돼지 켈수스 HS로 부터 FGF2에 대한 더 높은 결합 친화력을 가진 HS (HS8)를 풀 다운하는 데에 FGF2-Gandhi-HBD를 사용하였다.
HS8의 특성 분석
GAG 결합 친화력 어세이
FGF2 및 다른 단백질 (R&D Systems)과의 결합에 있어서, HS8의 친화력을 96 웰 GAG 결합 플레이트 (Iduron, UK)를 이용하여, 헤파린 (Sigma), 돼지 켈수스 HS (Celsus Laboratories, USA) 및 HS8 negative 분획과 비교하여, FGF2에 대한 HS8+의 특이적 결합을 통해 측정하였다. AGS를 GAG 결합 플레이트 (2.5-10μg/ml)에 밤새 놓은 후, 표준 어세이 완충액 (standard assay buffer, SAB)에서 37℃에서 1시간 동안 0.2% 생선 젤라틴 (Sigma)로 블럭하였다.
그 후, 0-100ng/ml 재조합 인간 FGF2의 200μl/웰과 함께 37℃에서 2시간 동안 배양하였고, 250ng/ml의 1차 바이오티닐레이트 항체 (R&D Systems) 200μl/웰과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음 단계로, 플레이트를 220ng/ml의 ExtrAvidin-AP (Sigma) 200μl/웰과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 밤새 배양부터 상기 단계까지 각 단계 사이에 플레이트를 SAB로 3회 세척하였다. 마지막으로, SigmaFAST p-Nitrophenyl phosphate (Sigma) 200μl/웰과 함께 37℃에서 40분 동안 배양하였고, Victor3 1420 multi-label counter, PerkinElmer를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
3종류의 농도(2.5, 5 및 10 μg/ml)에서 GAGs의 FGF2에 대한 결합이 FGF2의 증가에 따라 유사하게 증가하였고, 10Ong/ml FGF2에서 포화에 도달하였다(도 8). 다른 GAGs를 사용하여 FGF2의 결합을 측정하였을 때, HS8+은 다른 GAG 종보다 FGF2에 대해 가장 높은 결합 친화도를 가짐을 명확히 확인하였다(도 9). 100ng/ml FGF2에서 켈수스 HS: HS8+의 폴드 차이를 비교한 결과, 상기 비율은 1:1.51이었다.
그 다음으로, HS8 + 및 HS8 (-) 분획의 다른 단백질에 결합하는 능력을 분석하였다(도 10). HS8+은 VEGF, BMP2, PDGFBB, FGF1, 및 FGF7와 비교하여, FGF2에 대한 결합에서 더 높은 친화도를 가진다(도 10(A)). 이와 달리, HS8 (-) 분획은 다른 단백질과 비교하여 FGF1에 대한 결합에서 가장 높은 친화도를 가진다(도 10(B)).
헤파린과 경쟁하는, 다른 GAGs의 능력을 FGF2를 이용하여 Ono et al(1999) 방법의 변형을 통해 측정하였다. 공지 농도의 FGF2 (R&D Systems)를 GAGs의 농도별로 마이크로튜브를 이용하여 30분 동안 실온에서 혼합하였다.
40 μl의 비드 용액 [20 μl of 헤파린-아가로스 비드 (Type I, Sigma) 및 폴리아크릴아미아드 겔 (Bio-Gel P-30, Bio-Rad)]을 실온에서 30분 동안 혼합하였다. 헤파린 비드를 BSA-PBS(1% BSA in PBS)를 사용하여 원심분리(2000rpm, 1 분)로 3번 세척하였고, PBST (0.02% Tween을 함유한 PBS)로 3번 세척한 후, 각 튜브에 100 μl의 1:500 바이오티닐화된 항-FGF2 (R&D Systems)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 세척 후, 100 μl의 1:10 TMB 기질 (R&D Systems)을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 혼합하였다. 정지액(50 μl의 2N H2S04)을 첨가하고, 원심분리하여 상층액 100 μl을 96웰 플레이트로 옮겼다. Victor3 1420 multi label counter, Perkin Elmer를 사용하여, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
먼저, 첨가되는 헤파란 비드와 결합하는데 필요한 FGF2의 양을 FGF2 최적화로 측정하였고, 다음 실험을 위해 FGF2의 양을 20ng/ml로 선택하였다(도 11(A)).
그 후, 경쟁적 어세이에서 사용하기 위한 GAG의 범위를 결정하기 위해, 다양한 양의 헤파린을 사용하였다. 첨가된 헤파린 50㎍은 비드에 부착된 내부 헤파린과 경쟁하기에 충분하였다(도 11(B)). 따라서, 경쟁 어세이에 0-50㎍ 범위의 GAGS를 사용하였다(도 11(C)). 50㎍를 첨가하였을 때, 경쟁의 퍼센트를 고려하면, 헤파린이 약 13%로 가장 경쟁력이 있었고, 다음은 HS8+ 43%, 켈수스 HS 50% 및 HS8(-) 63% 순서였다.
증식 어세이
21살의 히스페닉 남성 기증자로부터 얻은 두 종류의 hMSC 변이체를 사용하였으며, 상기 hMSC 변이체는 자기 활성화 세포 분리(magnetic activated cell sorting)로 분리된 STR01 양성 세포 (계대 5-7) 및 종래의 플라스틱 부착에 의해 분리된 HM21 세포(계대 5)이었다. 세포를 3000 cells/cm2 씨딩 밀도로 씨딩하였고, 24시간 동안 플레이트에 부착하였다. 그 후 다양한 농도의 HS 8+을 50-10000ng/ml 범위로 독립 배지 보충제로서 사용하였고, 양성 대조군으로 2.5ng/ml 인간 재조합 FGF2 (R&D Systems)를 배지에 첨가하였다. 2 또는 3일 마다 배지를 교체하였다. 2일 마다 배지를 교체한 STRO 1 세포에서, HS8+의 농도가 증가할수록 대조군과 비교하여 6일까지 생존 세포 수가 증가하였고, 5000ng/ml에서 가장 높은 세포 수를 확인하였다(도 12). 또한, 3일 마다 배지를 교체한 HM21 세포에서는, 6일까지 대조군과 비교하여, 10000ng/ml에서 약간 더 높은 세포 수를 나타내었다(도 13).
생존 세포 수에 있어서, 상기 2 종류 세포의 유의미한 차이로 인해, 계대 5의 STR01 및 HM213 세포를 이용하여 증식 어세이를 6일 동안 수행하여 대조군과 비교하였고, 3일 마다 배지를 교체하였다. STRO 1은 HM21 세포보다 약간 더 높은 증식을 보였으나, 상기 두 세포 모두에서 대조군과 HS8+ 처리 세포는 거의 동일한 세포 수를 보였다(도 14(A)). 그 다음 배지 교체 간격을 변화시켜, 전의 실험에서 얻은 데이터에 따라 6일째에 STR01 세포의 세포수/cm2를 측정하였다(도 14(B)). 흥미롭게도, 배지를 3일 마다 교체하는 것보다 2일 마다 교체한 경우, 대조군 및 HS8+ 처리 세포에서 모두 세포 수를 더 증가시켰다. 또한, 배지를 2일 마다 교체한 경우, HS8+ 처리 세포 수는 처리하지 않은 대조군보다 더 높았다.
요약
본 발명자들은 돼지 켈수스(Porcine Celsus) HS으로부터 친화성 크로마토그래피에 의해 FGF2에 보다 높은 친화 결합(affinity binding) HS(HS8)를 준비하기 위해 서열 157GHFKDPKRLYCKNGGF172 을 사용하였다.
글리코사미노글리칸 (GAG) 결합 어세이 결과에 따르면, 다른 GAG 종에 비해 HS8+이 FGF2에 가장 높은 결합의 친화도를 나타내었다. 100ng/ml FGF2 지점에서 Celsus HS: HS8+의 배율 차이(fold difference)에 더해, 비율은 1:1.51였다. 완성 퍼센티지를 고려한 헤파린 비드 완성 어세이에서, 헤파린은 50 μg의 첨가로 13%에 도달하여 가장 경쟁적이었으며, HS8+이 43%, 켈수스 HS가 50%, HS8(-) 63%으로 그 뒤를 이었다. 자성 활성 세포 분리에 의해 분리된 STR01 + hMSC 및 전통적인 플라스틱 부착에 의해 분리된 HM21 hMSC이 세포 증식 어세이에 사용되었으며, HS8+이 5μg/ml의 농도로 단독으로 배지 보충물로 사용되고 2일 마다 배지 교체가 이루어졌을 때 많은 세포 수가 얻어졌다. 결론적으로, 본 발명자들은 FGF2에 높은 결합 친화성을 가지며 hMSC의 증식능을 향상시킬 수 있는 상업적으로 이용가능한 헤파란 설페이트 자원의 풀에서 FGF2에 높은 결합 친화성 헤파란 설페이트(HS8)를 성공적으로 분리하였다.
결론적으로, 본 발명자들은 상업적으로 이용가능한 헤파란 설페이트 자원의 풀에서 FGF2에 보다 높은 결합 친화성 헤파란 설페이트(HS8)를 성공적으로 분리하였고 헤파린을 포함한 다른 GAGs에 비해 더 높은 결합 친화성을 가짐을 보였다. 또한, 단독 배지 보충물로서 사용된 HS8+이 2일마다 배지를 교환할 때 세포 증식을 증가시켰다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명자들이 상기 세포들을 FGF2에 높은 친화성을 갖도록 조작된 헤파란 설페이트(HS8)에서 배양함으로써 높은 품질의 생체외 확장된(expanded) MSC의 필요성에 대해 다루고 있다고 믿는다.
추가적인 연구
FGF2에 대한 특이적 HS (HS8)의 분리
비록 본 발명자들이 FGF2에 대해 더 높은 결합 친화성 HS인 HS8을 분리하는 것에 성공하였으나, 본 발명자들은 Lee et al, 2007에 따라, [3H] 헤파린 어세이, GAG 결합 어세이 및 세포 접착 어세이의 방식으로 추가적으로 다른 FGF2 HBD 펩타이드 서열(표 1)을 시험하였다.
결합 친화성 어세이
HS8의 결합 친화성은 GAG 결합 플레이트에 의해 이미 확인되었고 도트 블롯 어세이 및 BIAcore T100와 함께 동력학 결합(kinetic binding)에 의해 추가적으로 검증할 것이다(Cain et al, 2005).
경쟁 어세이
ELISA 방법에 따른 결과는 웨스턴 블롯 방법에 의해 추가적으로 확인될 것이다.
증식 어세이
증식 어세이의 결과는 더 많은 hMSC 라인 및 또한 낮은 세포 계대를 이용하여 추가적으로 검증될 것이다. 추가적으로, 단기간 증식 어세이가 BRDU(Roche) 및 WST-1 (Roche) 시약을 이용하여 수행될 것이다.
디사카라이드 분석
HS8의 디사카라이드 분석은 Murali et al, 2009에 따라 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 수행될 것이고 HS8의 구성은 밝혀질 수 있을 것이다.
FGF2의 안정성
안정성 어세이(Stability assays)는 SYPRO 어세이 및 FGF2 quantikine 어세이로 사행될 것이다. SYPRO 어세이에서, 특정 Sypro Orange dye (Uniewicz et al, 2010)에 의해 FGF2 단백질의 GAG와의 상호 작용이 단백질의 변성 온도로 측정될 것이다. FGF2 quantikine 어세이는 세포 배양물 내 FGF2 농도를 측정하기 위해 제조사의 추천(R&D Systems Quantikine® ELISA Cat No.DFB50)에 따라 수행될 것이다. 결과는 도 46에 나타내었다.
시험관 내 HS8과 함께 성장된 hMSC의 생물학적 활성 체크
플라스틱 부착(plastic adherence), 골형성 분화(differentiating to osteogenic), 지방생성(adipogenic) 및 크론도게닉(chrondogenic) 조직을 위한 다중분화능(multipotentiality) 및 표면 마커를 위한 FACS가 시험될 것이다(Dominici et al, 2006). CFU-F 어세이는 골수 흡인액(bone marrow aspirates) 및 HS8을 포함하거나 포함하지 않는 확장된 hMSC(expanded hMSC)으로부터 수행될 것이다 (Cawthon, 2002 and Guillot et al, 2007). hMSC의 면역조절 활성(immunomodulatory activity)은 혼합된 T 림프구 어세이(T lymphocyte assays)에 의해 평가될 것이다.
생체내 HS8과 함께 성장한 hMSC의 생물학적 활성 체크
HS8의 존재 하에서 분리되고 성장한 세포는 마우스의 뼈 재생 모델에서 사용될 것이고 (Zannettino et al, 2010) 또한 GVHD의 이종 인간 NOD-SCID 마우스 모델 (Tiasto et al, 2007 and Toubai et al, 2009)에서도 사용될 것이다.
실시예 3
FGF2에 대한 다른 GAG의 결합 능력은 GAG-결합 플레이트(Iduron)를 이용하여 평가하였다. 헤파린-결합 성장 인자(HBGFs) BMP-2, FGF1, FGF2, FGF7, PDGF-BB 및 VEGF에 대한 다른 GAG의 결합 능력 역시 GAG-결합 플레이트(Iduron)를 이용하여 평가하였다. 재료 및 방법은 하기에서 설명하는 바와 같다.
HS8은 FGF-2에 헤파린만큼 결합하는 것이 발견되었으며, 가공되지 않은 출발(raw starting) 켈수스(Celsus) HS 및 분획을 통과한 HS8-플로우(도 15) 보다 결합을 잘하였다.
시험한 다른 모든 HBGF에 비해, HS8 (HS8+)은 우선적으로 FGF2에 결합하였고 FGF2에 헤파린 보다 높은 결합 능력을 가졌다. 즉, HS8이 FGF2에 특이적 결합을 나타내었다. HS8- 및 가공되지 않은 출발(raw starting) 켈수스 HS는 시험한 HBGF 어느 것에 대해서도 낮은 선호(preference)를 보였다(도 16).
재료
1. 표준 어세이 완충액 (SAB) - 10OmM NaCl, 50mM 소듐 아세테이트, 0.2% v/v 트윈(tween) 20, pH 7.2
2. 차단 완충액 - 0.4% 피쉬 젤라틴(Fish gelatin, Sigma Cat No. 67041) + SAB
3. GAG 결합 플레이트 (Iduron, UK)
4. R& D Systems의 단백질: BMP2 - Cat No. 355 BM, FGF 1 - Cat No. 231
BC, FGF 2 - 233 FB, FGF7 - Cat No, 251 KG, PDGF BB - Cat No. 220 BB, VEGF - Cat No. 293 VE
5. R & D Systems의 항체: BMP2 - Cat No. BAM 3552, FGF 1 - Cat No. BAF232, FGF 2 - BAM233, FGF7 - Cat No. BAF251, PDGF BB - Cat No. BAF220, VEGF - Cat No. BAF 293
6. ExtraAvidin-AP(Sigma Cat No. E2636)
7. 시그마 FAST p-니트로페닐 포스페이트(Sigma FAST p-Nitrophenyl phosphate, Sigma, N2770)
방법
1. SAB에 GAG를 용해시켰다 (5μg/ml)
2. GAG 용액/웰 200μl을 GAG 결합 플레이트에 가하고 RT에서 빛으로부터 보호하여 밤새 배양하였다
3. 플레이트를 250μl/웰의 SAB로 조심스럽게 3x 세척하였다
4. 250μl/웰의 차단 완충액으로 플레이트를 1시간 동안 빛으로부터 보호하여 37℃에서 배양하였다
5. 플레이트를 250μl/웰의 SAB로 조심스럽게 3x 세척하였다
6. 단백질을 차단 완충액으로 용해시키고 연속 희석을 수행하였다: 0, 0.781, 1.56, 3.125nM
7. 희석된 단백질을 200μl/웰으로 GAG 코팅된 플레이트에 나누고 2 시간 동안 37℃ 에서 배양하였다
8. 플레이트를 250μl/웰의 SAB로 조심스럽게 3x 세척하였다
9. 200μl/웰으로 차단 용액 내 250ng/ml의 바이오틴화 일차 항체(primary antibody)를 첨가하고 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다
10. 플레이트를 250μl/웰의 SAB로 조심스럽게 3x 세척하였다
11. 200μl/웰으로 차단 용액 내 220ng/ml의 ExtraAvidin-AP를 첨가하고 30동안 37℃에서 배양하였다
12. 플레이트를 250μl/웰의 SAB로 조심스럽게 3x 세척하였다
13. 200μl/웰으로 개발 시약(Development reagent)으로 첨가하였다: Sigma FAST p-Nitrophenyl phosphate in DI 물(DI water) 그리고 40분 동안 RT에서 배양하였다
14. 405nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다.
실시예 4
BrdU사 증식 어세이(BrdU incorporation proliferation assay)를 hMSC 증식에서 HS8의 효과를 입증하고자 수행하였다(프로토콜은 하기에 설명하였다).
인간 중간엽 줄기 세포(human mesenchymal stem cells)의 HS8 (HS8+)에 대한 복용량-반응(dose-response)은 BrdU 사에 의해 36 시간 이상 관찰되었다. FGF2는 복용 양성 대조군으로 사용되었다. HS8이 hMSC 증식을 강화하고 중요한 자극을 생성하는 것을 확인하였다(도 17).
프로토콜 (세포 증식 ELISA, BrdU ( Colorimetric ) Roche )
1. 세포 시딩(seeding) - 190μl의 배지/웰 내 5000 세포 (96 웰 플레이트)
2. 배지 - 1000mg/L + 10% 태아 송아지 혈청(Fetal calf Serum, FCS) + 1% 2mM L- 글루타민 + 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM
3. 37℃ 및 5% C02에서 6시간 동안 배양하였다
4. 6시간의 배양 후에 레이아웃(layout)에 지정된 웰에 10μl의 배지 내 다른 용량의 처리(different doses of treatments)를 첨가하였다
5. FGF2 (ng/ml) 및 GAGs (μg/ml) - 10,5,2.5,1.25,0.625, 0.3125
6. 37℃ 및 5% C02에서 처리(treatment)와 함께 36시간 배양하였다
7. BrdU를 각 웰에 첨가하였다
8. 세포를 BrdU으로 2시간 동안 37℃ 및 5% C02에서 표지하였다(20μl의 BrdU 표지 용액/웰 첨가하였다)
9. 표지 배지를 플레이트에서 떼어내서(tapping off) 제거하였다
10. 200μl/웰 FixDenat을 세포에 첨가하였고 30 분 동안 15-25℃에서 배양하였다
11. FixDenat 용액을 플리킹(flicking) 및 태핑(tapping)으로 온전히 제거하였다
12. 100μl/웰 항-BrdU-POD 작업(working) 용액을 첨가하였고 90분 동안 15-25℃에서 배양하였다
13. 항체 결합체를 플리킹(flicking off)에 의해 제거하였고 250μl/웰 세척 용액(1x PBS)으로 웰을 세차례 세척(rinse)하였다
14. 태핑(tapping)에 의해 세척 용액을 제거하였다
15. 100μl/웰 기질 용액을 첨가하고 15-25℃에서 30분간 배양하였다
16. 370nm에서 흡광도를 측정하였다 (참조 파장: 492nm)
실시예 5
FACS 기반 세포 증식 어세이(FACS based cell proliferation assay)는 HS8의 hMSC 증식에 대한 효과를 입증하기 위해 수행되었다(프로토콜은 하기에 설명하였다).
HS8 (HS8+)에 대한 인간 중간엽 줄기 세포의 복용량-반응(dose-responses)은 구아바 비아카운트(Guava ViaCount(FACS-based)) 방법에 의해 6일간 관찰하였다. FGF2는 복용 양성 대조군으로 사용하였다. HS8이 hMSC 증식을 강화하고 중요한 자극을 생성하는 것을 확인하였다.
세포 증식 프로토콜
재료
1. HM20 hMSC - 20세의 히스패닉계 남성 공여자(Lonza에서 구입)
2. FGF 2 (R & D 시스템. Cat No. 233-FB-025)
3. 유지 배지(Maintenance media): DMEM (10mg/l 글루코스), 10% FCS, 1% Pen/Strp, 2mM L-글루타민
4. HS8(+) Batch 2, HS8(-) Batch 2, 돼지 점막 헤파란 설페이트 (Celsus
laboratories, USA), 헤파린 (Sigma Cat No. H3149)
5. 구아바 플렉스 시약(Guava Flex reagent) (Millipore)
방법
1. HM20 세포는 500μl/웰 배지에서 3000세포/cm2 으로 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다(0일차)
2. 1일차 - 새로운 배지 500μl 내 FGF2(ng/ml) 및 GAGs(μg/ml)이 10,5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156의 증가하는 농도로 포함된 새로운 배지로 교환하였다
3. 배지는 2일마다 교환하였다
4. 트립신 100μl으로 세포를 정해진 시점(2일차, 4일차 및 6일차)에 회수하였고 100μl의 배지(2일차) 또는 300μl의 배지(4일차 및 6일차)로 중화하였다.
5. 세포를 구아바 기계(Guava machine)에서 계수(count)하였다 (구아바 플렉스 시약: 세포 현탁액의 비율은 1:200)
실시예 6 - 인간 중간엽 줄기 세포 분리
인간 골수(BM) 단핵 세포의 준비
밀도 구배 분리에 의한 인간 골수 (BM)의 수집 및 BM 단핵 세포의 준비
1. 사전에 고지된 동의에 따라, 약 40 ml의 인간 골수(BM)를 후면 장골릉(posterior iliac crest (hip bone))에서 흡인하여, 건강한 젊은 자원자(18-40세)로부터 수집하였다. BM은 즉시 무방부제(preservative-free), 소듐 헤파린-함유 50 mL 튜브에 두었다 (10,000 units/tube).
2. 10-μL 앨리쿼트(aliquot)을 제거하였고 White Cell Fluid(WCF)로 희석(1:20)하였고 유핵 세포 함량을 혈구 계산기(hemocytometer)로 열거(enumerate)하였다.
3. BM 흡인액에 동일한 부피의 차단 완충액을 첨가하고, 잘 섞은 뒤, 70-μm 팔콘 셀 스트레이너(Falcon cell strainer)를 통해 스트레인(strain)하여 작은 응혈 및 뼈 단편들을 제거하였다.
4. 그 후 3 mL의 Ficoll-Hypaque (Lymphoprep) 용액을 약 12 라운드 바텀(round bottom) 14-mL 폴리스티렌 Falcon 튜브의 바닥에 나누고(dispense), 희석된 BM 7.5 mL을 조심스럽게 더하였다(overlay).
5. 튜브를 400 g 으로 30 분간 실온에서 원심분리하였다.
6. 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫(disposable plastic Pasteur pipette)을 이용하여, 모든 튜브에서 백혈구 밴드를 회수하였고 4X 14 mL 폴리프로필렌 튜브에 풀하였다(pool).
7. 세포는 HHF 세척 완충액으로 희석하였고 BMMNC는 샘플을 400 g 에서 10분간 4℃에서 원심분리하여 펠릿(pellet)하였다.
8. 완충액을 흡인하고 세포는 하나의 튜브에 풀하였다(pool).
부착에 의한 MSC의 분리
1. BMNC 분획을 15 cm 디쉬(dish) 유지 배지(DMEM, 1 g/l 글루코스, 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린 및 50 U/ml 스트렙토마이신)에 시드(seed)하고 첫 배지 교환 전 3일간 세포가 점착하도록 하였다.
2. 세포는 유지 배지에서 3-4일 마다 배지 교환하면서 배양하였고 일상적으로 0.125% 트립신을 이용하여 85% 합류(confluence)까지 계대하였다. 리플레이팅(re-plating)에 있어서, 세포를 3,000/cm2으로 시드하였다. 모든 배양물은 37℃에서 5% CO2 로 가습 배양기(humidified incubator)에서 유지되었다.
3. 세포는 비항체 세포 분리 용액(non-enzymatic cell dissociation solution (CellStripper, Mediatech, USA))을 이용하여 배양물에서 제거되었고, 계수 전에 PBS에서 한 차례 세척하였다. 1 x 105 세포는 96-웰 플레이트에 앨리쿼트(aliquotted)하고 상기 세포는 450 x g 으로 5분간 펠릿(pellet)하였다. 2% FCS/PBS 내 전-희석된(pre-diluted) 면역타이핑(immunotyping) 항체 용액을 차례로 가하였고 세포를 20 분간 얼음 상에서(on ice) 배양하였다. 이후, 세포를 2% FCS/PBS에서 재현탁하기 전에 2% FCS/PBS에서 두 차례 세척하였고 구아바 PCA-96 벤치-탑 유세포 분석기(GUAVA PCA-96 bench-top flow cytometer (Guava Technologies Inc., USA)) 상에서 분석하였다. 모든 샘플은 세 차례 측정하였다.
STRO -1 양성 BMSSC의 자기 활성 세포 분리(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS)
MACS의 사용은 BMSSC 집단의 부분 정제 및 많은 수의 BMMNC의 처리를 전체 줄기 세포 생산에 큰 손실 없이 가능하게 한다. 이어지는 밀도 구배 원심에서, (density gradient centrifugation) 40 mL의 BM 흡인액에서 약 1-2 x 108 단핵 세포가 회수되었다. 면역 표시 전, BMMNC는 0.5 mL의 차단 완충액에서 재현탁하였고 Fc 수용체-매개의 항체 결합의 가능성을 줄이기 위해 약 30분간 얼음 상에서(on ice) 배양하였다.
자기 활성 세포 분리(MACS)를 이용한 STRO -1 + BMSSC의 분리
1. BMMNC는 400 g 에서 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 펠릿하였고 각 5 x 107 BMMNC 마다 500 ㎕의 STRO-1 상층액에서 재현탁하였다. 얼음 상에서 60분간 때때로 부드럽게 혼합하면서 배양하였다.
2. BMMNC는 HHF 세척 완충액에서 두 차례 세척하였고 1/50 희석 0.5 mL의 HHF 함유 바이오틴화 고트 항-마우스 IgM(μ-쇄 특이적)에서 재현탁하여 4℃에서 45 분간 배양하였다.
3. BMMNC는 MACS 완충액에서 세 차례 세척하였고 50 μL의 스트렙타비딘 마이크로비드(90μL MACS 완충액 내 10 μL의 마이크로비드/107 세포)가 첨가된 450μL의 MACS 완충액에서 재현탁하였다. 혼합물은 15분간 얼음 상에서 배양하였다.
4. ice-cold MACS 완충액에서 한 차례 세척한 후, 세포의 적은 분액(small aliquot)은 유세포 분석을 위해 제거하였다(전 샘플, pre sample). 남아있는 세포는 미니 MACS 칼럼(108 세포의 칼럼 용량, Miltenyi Biotec, MS 칼럼)에 위치시켰다. STRO-1-세포(음성 분획)은 유출을 향한 중력 하에서, 칼럼 내에서 유지되지 않고 통과하여 새로운 2 mL 폴리프로필렌 튜브에 도달한 반면, STRO-1+ 세포는 자화 매트릭스(magnetised matrix)에 흡착된 상태로 남아있었다.
5. 새로운 2 mL 폴리프로필렌 튜브에 수집되는 비특이적으로 결합한 STRO-1 -세포를 제거하기 위해 칼럼을 3 차례 0.5 mL MACs 완충액로 세척하였다.
6. 자기장에서 칼럼을 회수한 후, STRO-1 + 세포 (양성 분획)는 상기 칼럼을 MACS 완충액와 함께 새로운 2-mL 폴리프로필렌 튜브로 플러싱하여 수집하였다. 이후 STRO-1 + 세포를 계수하였고 2색 FACS를 위한 처리를 하였다.
7. 각 전-MACS(pre-MACS), STRO-1 -, 및 STRO-1 + 분획으로부터 작은 샘플(0.5-1.0 x 105 세포)을 0.2 mL의 스트렙타비딘-FITC 결합체(conjugate)(1/50)를 함유하는 별도의 2 mL 폴리프로필렌 튜브에 제거하였다. 상기 세포 샘플은 강화 절차의 평가를 가능하게 하고자 추가적으로 5분간 얼음 상에서 배양하였다. (1.0 x105 세포) 비표지된 전-MACS 세포(unlabeled pre-MACS cells)의 샘플은 음성 대조군으로 사용하였다.
8. 상기 샘플은 HHF에서 두 차례 세척하였고, FACS 고정 용액(Fix solution)에서 고정하였으며, 이어서 순도(purity) 및 회복(recovery)을 평가하기 위해 유세포 분석으로 분석하였다.
9. 이 시점에서, 부분적으로 정제된 STRO-1 + BMSSC를 배양 확장(culture expand)하거나 2-색(two-color) FACS에 의해 추가로 정제할 수 있다.
콜로니 효율 어세이 (Colony-Efficiency Assay)에 의한 골수 품질의 평가
인간 골수 흡인액(bone marrow aspirates) 내 CFU-F 콜로니의 기대되는 형성 정도(expected incidence)는 플레이팅 된 105 세포 당 약 5-10 CFU-F이었다.
1. BMMNC는 20% (v/v) FBS, 2 m/W l-글루타민, 100 μM l-아스코보레이트-2-포스페이트, 50 U/mL 페니실린, 50 mg/mL 스트렙토마이신, 및 β-메르캅토에탄올 (5 x 10"5 M)으로 보충된 α-MEM 내 6-웰 배양 플레이트에 웰 당 0.3, 1.0, 및 3.0 x 105 세포를 시드하였다. 배양은 세차례 수행하였고 37℃, 5% C02 및 >90% 습도에서 12 일 간 배양하였다.
2. 12일 차 배양물은 PBS로 두 차례 세척하였고 이후 20분간 1%(w/v) PBS 내 파라포름알데하이드로 고정하였다.
3. 고정된 배양물은 0.1% (w/v) 톨루이딘블루(toluidine blue) (1% 파라포름알데히드 용액 내)로 1시간 동안 염색하고 수돗물로 세척(rinse)한 다음 건조시켰다. 50 세포 이상의 응집물(aggregates)을 CFU-F로 점수화(score)하였다.
고도로 정제된 BMSSC의 형광 활성 세포 분리(Fluorescence Activated Cell Sorting)
모든 측정가능한 CFU-F는 STRO-1 +BMMNC 분획 내에 포함된 반면, BMSSC는 전체 STRO-1 + 집단의 2% 이하만 나타났다. 대부분의 STRO-1 + 세포는 글리코포린-A+(glycophorin-A+) 유핵적혈구(nucleated red cells) 및 일부 CD19+ B-세포였다. 따라서, STRO-1 발현에 기초한 BMSSC의 선택 만으로는 CFU-F의 부분적인 강화(약 10배)만을 유도하게 된다. 클론형성(clonogenic) BMSSC는 모두 STRO-1 bright 세포 분획에 포함되었고 이는 유핵 적혈구 및 림프구 상에서 존재하지 않는 마커, 특히 CD106 및 CD146의 발현에 기초한 2색(dual-color) FACS에 의해 추가적으로 구별될 수 있다. 하기에는 전체 STRO-1 + 세포 분획의 소수의 부분집단이고, 플레이팅된 2-3 세포마다 CFU-F를 형성할 수 있는 능력을 가진, STRO-1 brigh/CD106+ BMMSC (1.4% ± 0.3; n = 20)을 분리(isolation) 가능하게 하는 방법을 설명하였다. 강화의 수준은 분획되지 않은 BMMNC에서 관찰되는 CFU-F의 평균 형성율에 비해 약 5,000배 높았다(플레이팅된 10,000 세포당 1 CFU-F).
유세포 분석 세포 분리(FACS)을 이용한 STRO -1 bright/CD 106+ BMSSC의 분리
1. 면역 표지 전, MACS-분리된 STRO-1+ 세포 BMMNC(통상적으로 1 x 108 BMMNC에서 2-5 x 106 세포)를 0.5 mL HHF에서 재현탁하여 2색 면역형광(immunofluorescence) 및 FACS를 준비하였다.
2. 3 개의 적절하게 표시된 튜브에 대략 3-5 x 105 개의 MACS로 분리된 STRO-1+ 세포를 나누어 담고, 다음을 추가하였다:
(i) 일차 항체를 불포함하는 표본 (이중 음성 대조군)을 얼음 위에 유지시켰다.
(ii) 스트렙타비딘-FITC 결합체 (HFF에 1/100 희석)를 얼음 위에서 30 분 동안 인큐베이션하였다 (FITC 대조군). 그 다음 세포를 HHF에서 2 회 세척하였다.
(iii) 0.5 mL 뮤린 (murine) IgG 항-인간 CD106 (VCAM-1)을 HFF에 20 ㎍/mL로 희석하였다. STRO-1+ 세포를 얼음 위에서 30 분 동안 인큐베이션하고, HHF에서 2 회 세척하고 PE가 결합된 염소 항-마우스 IgG (γ-쇄 특이적) 0.2 mL로 재현탁하였다 (PE 대조군). 상기 표본을 인큐베이션하고 세척한 다음 HFF에 재현탁시켰다.
(iv) 남은 1-2 x 106 개의 MACS로 분리된 STRO-1+ 세포를 0.5 mL 뮤린 (murine) IgG 항-인간 CD106 (VCAM-1)에 재현탁시키고 상기와 같이 인큐베이션하고 HHF에서 2 회 세척한 다음, PE가 결합된 염소 항-마우스 IgG (γ-쇄 특이적) 및 스트렙타비딘-FITC 결합체 (HHF에 1/100 희석) 0.2 mL에 재현탁시킨고, 얼음 위에서 30 분 동안 인큐베이션하였다 (분리 표본). 그 다음 HFF로 세포를 세척하고 재현탁시켰다.
3. 표본을 HHF에 mL 당 1 x 107 세포의 농도로 재현탁시킨 뒤, FITC 및 PE를 계속적으로 검출할 수 있는 488 nm 파장에서 250 MW 아르곤 레이저 방출광 (emitting light)을 갖춘 분리기로 분리하였다. 표본 (i-iii)은 FITC 및 PE 모두에 대한 보상 (compensation)을 확립하기 위해 사용되었다. 5. 표본 (iv)로부터 분리된 STRO-1bright/VCAM-1+ 세포를 적절한 성장 배지를 함유하는 튜브에 모으고 이를 혼합하였다. 6. 세포 수 측정은 상기 기술한 바와 같이 수행하였다. 그 다음 분리된 세포를 배양하였다.
인간 BMSSC의 생체외 배양
혈청이 충분한 배지
1. 20 % FBS, 100 μM l-아스코베이트-2-포스페이트 (l-ascorbate-2-phosphate), 2 mM l-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신을 함유하는 α-MEM (α-modification of Eagle's Medium)을 포함하는 조직 배양 플라스크 또는 접시에서 37 ℃, 4 % CO2, > 90 % 상대 습도 조건에서 2 주 동안 STRO-1bright/CD 106+ 분리된 BMSSC 집단 (1-3 x 104/cm2)을 배양하였다. 세포가 80-90 % 가득 찼을 때 초대 BMSSC 집단을 계대하였다.
2. 부착된 세포를 무혈청 HBSS로 1 회 세척하고, T75 플라스크 당 0.5 % 트립신/EDTA 용액을 2 ml 첨가하여 37 ℃에서 5-10 분 동안 효소 분해 반응에 의해 세포를 탈착시켰다 (liberated).
3. 세포 생존율은 0.4 % 트리판 블루 (trypan blue)/PBS에서 1:5로 희석된 단일 세포 현탁액을 제조하여 평가하였고, 살아있는 세포의 수는 헤모사이토미터 (haemocytometer)를 이용해 확인하였다.
4. BMMSC 단일 세포 현탁액을 모으고 10 % FBS, 100μM l-아스코베이트-2-포스페이트 (l-ascorbate-2-phosphate), 2 mM l-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신을 함유하는 α-MEM 성장 배지에서 0.5-1.0 x 104/cm2으로 재접종한 다음, 37 ℃, 5 % CO2, > 90 % 상대 습도 조건에서 배양하였다. 일주일에 두 번씩 배지를 흡입하고 37 ℃로 따듯하게 준비된 새로운 배지를 동량으로 교체하여 t세포를 배양하였다.
혈청 결핍 배지
본 방법은 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cell)의 성장을 위해 최초로 개발된 SDM (serum deprived medium)을 변형한 것이다.
1. 실온에서 90 분 동안 5 ㎍/cm2 피브로넥틴 (fibronectin) 용액으로 미리 코팅하여 피브로넥틴 코팅 접시 또는 플라스크를 제조하였다. 그 다음, 피브로넥틴 용액을 흡입하여 제거하고 배양 용기를 멸균 PBS로 1 회 세척한 다음 세포를 접종하였다.
2. 2 % (w/v) 송아지 혈청 알부민 (bovine serum albumin, Cohn fraction V), 10 ㎍/mL 재조합 인간 인슐린, 인간 저밀도 리포단백질 (low density lipoprotein), 200 ㎍/mL 철분 포화 인간 트랜스페린 (transferrin), 2 mM l-글루타민, 덱사메타손 소듐 포스페이트 (dexamethasone sodium phosphate, 10-8 M), 100 μM l-아스코빅산-2-포스페이트 (l-ascorbic acid-2-phosphate), β-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, 5 x 10-5 M), 10 ng/mL PDGF-BB (platelet derived growth factor-BB), 50 U/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신을 함유하는 a-MEM이 포함된 배지로 피브로넥틴 코팅 조직 배양 플라스크 또는 접시에서 STRO-1bright/CD106+ 분리된 BMSSC 집단 (1-3 x 104/cm2)을 배양하였다.
3. 그 다음 37 ℃, 4 % CO2, > 90 % 상대습도 조건에서 상기 세포를 2 주 동안 인큐베이션하였다. 세포가 80-90 % 가득 찼을 때, 초대 BMSSC 집단을 계대하였다.
생체외 증식시킨 MSC의 동결 보존
1. 통상적으로, 상기 기술한 바와 같이 트립신/EDTA 효소 분해에 의해 증식된 MPC의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음 세포를 차가운 HFF로 희석하고 세척하였다.
2. 세포 펠렛을 FBS에 1 x 107 세포/mL 농도로 재현탁시키고 얼음 위에서 유지하였다. 그 다음 세포를 조심스럽게 혼합하면서 10 % DMSO/FBS에 최종 농도가 5 x 106 세포/mL이 되도록 동량의 동결 혼합액 (차가운 FBS에 20 % DMSO)을 점차적으로 첨가하였다. 그 다음 얼음 위에서 미리 차갑게 한 1.8 mL 동결바이얼 (cryovial)에 1 mL씩 분주액을 담은 뒤, 속도 조절 냉동고 (rate control freezer)를 이용하여 -1 ℃/min의 속도로 동결시켰다.
3. 그 다음 동결시킨 바이얼을 장기간 보관을 위해 액체 질소로 옮겼다. 동결시킨 스탁 (stock)의 회복은 37 ℃ 항온 수조에 세포를 빠르게 해동시켜 수행하였다. 그 다음 세포를 차가운 HFF에 재현탁시키고 280 g에서 10 분 동안 원심분리하였다.
4. 세포의 생존율을 평가하기 위해, 0.4 % 트리판 블루/PBS에 1:5 희석액을 제조하고, 헤모사이토미터 (haemocytometer)를 이용하여 세포의 수를 확인하였다. 일반적으로 상기 과정은 80-90 % 생존율을 보인다.
실시예 7 - CFU -F (Colony-forming units-fibroblastic) 어세이
hMSC의 CFU-F 특성은 하기 기술한 방법을 사용하여 평가하였다. hMSC를 보충 없는 대조군 배지에서 4 계대 동안 배양하고, 그 다음 보충 없는 대조군 배지, 또는 대조군 배지에 헤파린 (1.25 ㎍/mL), Celsus HS (1.25 ㎍/mL), HS8- (1.25 ㎍/mL), HS8 (HS8+) (1.25 ㎍/mL) 또는 HS8 (HS8+) (2.5 ㎍/mL) 중 하나를 첨가한 배지에서 배양하였다. 결과는 도 24A 및 24B에 나타내었다.
재료
1. hMSC - (Lonza에서 구입).
2. 유지 배지: DMEM (1000 mg/L glucose), 10 % FCS, 1 % Pen/Strep, 2 mM L-글루타민.
3. 100 % 메탄올에 0.5 % 크리스탈 바이올렛 (Crystal Violet).
방법
1. 100 x 15 mm 페트리디쉬 (petri dish)에 접시 당 10 ml 유지 배지를 첨가하고 150 세포/cm2 농도로 세 번씩 MSC를 접종하였다.
2. 7 일째에 배지를 교체하면서 14 일 동안 세포를 배양하였다.
3. 14 일 째에 배양 접시를 크리스탈 바이올렛 (100 % 메탄올에 0.5 %)으로 하기와 같이 염색하였다:
a. 배지를 제거하고 PBS로 2 회 세척
b. 접시 당 10 ml의 크리스탈 바이올렛을 첨가하고 30 분 인큐베이션
c. PBS로 1 회 세척하고 H2O로 1 회 세척한 다음 건조
d. 다른 콜로니와 접촉하지 않은 세포 수 50 개 이상을 가지는 콜로니의 수 측정
실시예 8 - MSC의 다능성 특성 ( multipotent characteristic)
MSC의 다능성 특성 유지는 하기 기술한 방법에 따라 골형성 (osteogenesis) 및 지방생성 (adipogenesis)으로 분화하는 MSC의 능력을 분석하여 시험하였다. 결과는 도 25에 나타내었다.
세포
4 계대 세포 (P4) - 일반 유지 배지에서 배양한 hMSC
7 계대 세포 (P7) - 다음 중 하나의 처리를 포함하는 일반 유지 배지에서 P4 내지 P7까지 배양한 hMSC:
ㆍ HS8 (HS8(+)) 2.5 ug/mL
ㆍ HS8(-) 1.25 ug/mL
ㆍ Celsus HS 1.25 ug/mL
ㆍ 헤파린 1.25 ug/mL
ㆍ FGF2 1.25 ug/mL
골형성 분화 ( Osteogenic Differentiation)
재료
1. hMSC - (Lonza에서 구입)
2. 유지 배지: DMEM (1000mg/L 글루코스), 10% FCS, 1% Pen/Strep, 2mM L-글루타민
3. 처리 유지 배지: DMEM (1000mg/L 글루코스), 10% FCS, 1% Pen/Strep, 2mM L-글루타민, 10nM 덱사메타손 (dexamethazone), 10mM β-글리세롤-포스페이트 (β-glycerol-phosphate) 및 25 ㎍/mL L-아스코베이트-2-포스페이트 (L-ascorbate-2-phosphate)
4. PBS에 4 % 파라포름알데하이드 (Paraformaldehyde)
5. 알리자린 레드 용액 (Alizarin Red Solution): 100mL H2O에 1.37g; pH 4.1 - 4.3
방법
1. 세포를 6-웰 접시에 접종하고 (3,000 세포/cm2) 24 시간 동안 배양하였다.
2. 대조 웰은 유지 배지로 교체하였다.
3. 처리 웰은 10nM 덱사메타손 (dexamethazone), 10mM β-글리세롤-포스페이트 (β-glycerol-phosphate) 및 25㎍/ml L-아스코베이트-2-포스페이트 (L-ascorbate-2-phosphate)를 함유하는 유지 배지로 교체하였다.
4. 그 다음 모든 세포를 3 일 마다 배지를 교체하면서 28 일 동안 배양하였다.
5. 그 다음 세포를 알리자린 레드로 염색하였다:
a. PBS로 3 회 세척
b. 4 % 파라포름알데하이드로 10 분 동안 세포를 고정
c. ddH20로 3 회 세척
d. 알리자린 레드 용액을 세포에 첨가하고 천천히 흔들면서 30 분 동안 인큐베이션
e. ddH20으로 3 회 세척
f. 염색된 세포를 공기 중 건조
지방생성 분화 ( Adipogenic Differentiation)
재료
1. hMSC - (Lonza로부터 구입)
2. 지방세포 유지 배지: DMEM (4500mg/L 글루코스), 10% FCS, 1% Pen/Strep, 2mM L-글루타민
3. 지방세포 처리 배지: DMEM (4500mg/L 글루코스), 10% FCS, 1% Pen/Strep, 2mM L-글루타민, 1 μM 덱사메타손 (dexamethazone), 10μM 인슐린, 20μM 인도메타진 (indomethazine) 및 115㎍/mL 3-이소뷰틸-1-메틸잔틴 (3-isobutyl-1-methylxanthine)
4. PBS에 4 % 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)
5. 오일 레드 O (Oil Red O) 용액: 60% 아이소프로판올 (isopropanol)에 0.36%
방법
1. 세포를 6-웰 접시에 세 번씩 접종하였다 (18,000/cm2)
2. 세포를 가득 찰 때까지 배양하였다.
3. 대조군 웰은 지방세포 유지 배지로 배지를 교체하였다 (4500mg/L 글루코스).
4. 처리 웰은 1 μM 덱사메타손 (dexamethazone), 10μM 인슐린, 20μM 인도메타진 (indomethazine) 및 115㎍/mL 3-아이소뷰틸-1-메틸잔틴 (3-isobutyl-1-methylxanthine)을 함유하는 지방세포 처리 배지로 배지를 교체하였다.
5. 그 다음, 3 일 마다 배지를 교체하면서 28일 동안 배양하였다.
6. 그 다음 오일 레드 O (Oil-Red O)로 세포를 염색하였다:
a. PBS로 3 회 세척
b. 60분 동안 4 % 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 세포를 고정
c. ddH20로 1 회 세척
d. 오일 레드 O (Oil Red O) 용액을 세포에 첨가하고 천천히 흔들면서 1 시간 동안 인큐베이션
e. 60% 아이소프로판올 (isopropanol)로 2 회 세척
f. ddH20로 3 내지 5 회 세척
g. 접시에서 ddH2O를 제거하거나 염색된 세포를 공기 중 건조
실시예 9
FGF-2 매개 hMSC 성장에 대한 HS8의 효과는 하기 기술한 방법을 사용하여 조사하였다. HS8은 FGF-2 매개 MSC 성장을 향상시키는 것을 확인하였다 (도 26).
세포
4 계대 세포 - 다음 처리를 하거나 하지 않은 일반 유지 배지에서 hMSC를 배양하였다:
ㆍ FGF2 0.156ng/mL만 처리
ㆍ FGF2 0.156ng/mL와 함께 다양한 용량의 HS8(+)를 처리
세포 증식 프로토콜
재료
1. hMSC - (Lonza로부터 구입).
2. FGF 2 (R & D systems. Cat No. 233-FB-025).
3. 유지 배지: DMEM (1000mg/l 글루코스), 10% FCS, 1% Pen/Strep, 2mM L-글루타민.
4. HS8 (HS8(+)), HS8(-), 돼지 점막 헤파란 설페이트 (Ce!sus laboratories, USA), 헤파린 (Sigma Cat No. H3149).
5. Guava Flex 시약 (Millipore).
방법
1. 24-웰 접시에 500μl/웰 배지 (Day 0)를 첨가하고 3000세포/cm2 농도로 세포를 접종하였다.
2. 1 일 - FGF2 (0.156ng/mL) 단독 또는 FGF2 (0.156ng/mL) 및 다양한 농도의 HS8(+)를 첨가한 유지 배지로 배지를 교체하였다: 500μl의 새로운 배지에 10, 5, 2. 5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156 (㎍/ml).
3. 2 일 마다 배지를 교체하였다.
4. 4 일째에 100㎕ 트립신으로 세포를 회수하고 300㎕ 배지로 중화시켰다.
5. GUAVA machine (Guava flex 시약: 세포를 1:200으로 현탁)으로 세포 수를 세었다.
실시예 10
ERK 경로를 통한 FGF-2 신호전달에 있어서 HS8의 효과는 하기 기술한 방법을 사용하여 조사하였다. ERK1/2 및 FRS2a의 인산화를 측정한 결과, HS8은 ERK 경로의 신호전달로 매개되어 FGF2를 향상/유지시키는 것을 확인하였다 (도 27).
세포
P4 - hMSC는 다음의 처리를 하거나 하지 않은 일반 유지 배지에서 배양하였다:
ㆍ FGF2 0.312ng/mL만 처리
ㆍ HS8 (HS8(+)) 2.5㎍/mL
웨스턴 블롯
재료
1. hMSC -(Lonza로부터 구입)
2. FGF2 (R & D systems. Cat No. 233-FB-025)
3. 유지 배지: DMEM (1000mg/L 글루코스), 10% FCS, 1% Pen/Strep, 2mM L-글루타민
4. 무혈청 배지: DMEM (1000mg/L 글루코스), 0.2% FCS, 1% Pen/Strep, 2mM L-글루타민
5. 5% BSA를 함유한 TBST에 1:1000으로 희석한 인산화-FRS2a (Cell Signaling. Cat No. 3861)에 대한 항체
6. 5% BSA를 함유한 TBST에 1:2000으로 희석한 인산화-ERK1/2 (Cell Signaling. Cat No. 9106L)에 대한 항체
7. 5% BSA를 함유한 TBST에 1:1000으로 희석한 총 ERK1/2 (Cell Signaling. Cat No. 9102L)에 대한 항체
8. 5% BSA를 함유한 TBST에 1:8000으로 희석한 액틴 (actin) (Millipore Chemicon. Cat No. MAB1501 R)에 대한 항체
방법
1. 6-웰 접시에 유지 배지에서 10,000/cm2 농도로 세포를 접종하였다.
2. 1 일: 2mL/웰로 무혈청 배지로 교체하였다.
3. 3 일: 웰에 처리를 첨가하였다. 요구되는 양의 HS8(+) 및/또는 FGF2를 무혈청 배지에 첨가하고 10μL/웰로 첨가하였다.
4. 다른 시점 (30 분 및 24 시간)에 1.5X 라엠리 (laemmli) 완충액 100 μL/웰로 세포를 회수하였다.
5. 세포 용해물을 95 ℃에서 5 분 동안 열을 가하고 -20 ℃에서 보관하였다.
6. 표본은 단 한번만 동결-용해하였다.
7. 표본 20㎕/웰을 Novex 4-12% Bis-Tris SDS PAGE 겔의 각 레인 (lane)에 주입하였다, 10웰 (Invitrogen. Cat No. NP0335BOX).
8. 1 X MOPS 완충액으로 180V에서 50 분 동안 겔을 전기영동하였다.
9. 그 다음 1 X 이동 완충액으로 100V에서 1 시간 30 분 동안 분리된 단백질 밴드를 니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane)으로 옮겼다.
10. 니트로셀룰로스막을 Ponceau S 용액으로 염색하고 관심있는 단백질의 크기에 따라 긴 조각 (strip)으로 잘랐다.
11. 그 다음 5% BSA 또는 5% 탈지우유 함유 TBST로 상온에서 30 분 내지 1 시간 동안 천천히 흔들면서 막을 차단 (blocking)하였다.
12. 그 다음 추천되는 희석 수준으로 희석한 일차 항체로 4 ℃에서 천천히 흔들면서 밤새 인큐베이션하였다.
13. 그 다음 블롯(blot)을 TBST로 각각 5 분 동안 3 회 세척하였다.
14. 그 다음 추천되는 희석 수준으로 희석한 이차 항체로 상온에서 천천히 흔들면서 1 내지 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
15. 블롯을 TBST로 각각 5 분 동안 3 회 세척하였다.
16. 화학발광 (chemiluminescence) 시약으로 블롯을 인큐베이트시키고 밴드 시각화를 위해 암실에서 x-레이 필름을 현상하였다.
실시예 11 - HS8의 NMR 분석
분석에 앞서 HS8 표본은 -20℃에서 보관하였다. 화학적 이동 (chemical shift)의 비교 및 정량에 사용되는 내부 표준 (internal standard) tBuOH (200㎕, δ1.24 ppm)을 포함하는 D2O(600uL)에 표본을 용해시켜 NMR 분석을 완료하였다. Celsus HS는 ~1, 4 및 7mg의 양으로 정확하게 계량하고, 작동 (working) D2O / tBuOH 용액을 만든 다음 HS8과 동일하게 분석하였다. 표준 용액의 기준선은 아세틸 메틸 영역, δ3.15-3.25 ppm 영역 및 가장 낮은 필드 (field) 부분의 δ 5.15-5.65 ppm 아노머 (anomeric) 영역의 통합 (integration)에 대하여 내부 표준과 비교하여 0.995 또는 그 이상의 회귀값을 주었다.
잡음 (noise)으로 나타나는 낮은 신호가 잡히는 작은 표본 크기 때문에, 오직 아세틸 영역 데이터만을 0.7mg값을 전달하는 HS8의 양을 계산하기 위해 사용하였다. 이차 실험은 아세틸 피크의 잡음에 대한 신호와 비교하여 완료하였고 0.5mg 값을 기록하였다. 상기 값은 내부 표준과 관계 없는 절대값이다. tBuOH를 제거하기 위해 3 회 동결건조 단계를 거친 후, 더 분석하여 기록된 질량은 1.2mg이었다. 중요한 것은 SEC HPLC 데이터가 대략적인 순도 값을 주기 위해 통합될 수 있고, 또한 이것은 58%로 기록되었다는 것으로, 이는 0.7mg의 HS-GAG가 물질에 존재하는 것을 시사한다. 이러한 질량 차이가 작은 GAG 표본에서 새로운 현상은 아니므로, 다양한 습도 및 염분 비율이 기록된 질량에 영향을 미쳤을 것으로 추정된다.
HS8, Celsus HS 및 HS3*의 1H NMR 스펙트럼은 Error! Reference source not found.31.로 나타났다. 보여지는 플롯 (plot)에서 다른 신호 (Celsus HS는 4.8-4.9에서 가장 높은 피크, HS3는 중간 높이 피크로 나타났다.)에 비해 HS8의 강도 차이 (4.8-4.6 ppm에서 가장 낮은 피크)는 아세틸 메틸 공명의 높이에 대해 모든 스펙트럼을 표준화하였기 때문이다: 상기 HS8 표본의 경우, 아세틸 공명을 약간 날카롭고 높아지게 하는 좁은 넓이의 선을 가지는 약간 향상된 시밍 (shimming)이 관찰되었다.
Celsus HS 대비 HS8의 화학 구성 변화는 2-D NMR로 구별하였다.
HS8의 메틴 (methine) 및 메틸렌 (methylene) 영역의 자세한 조사로, 1H NMR에서는 Celsus HS 및 HS3 대비 차이가 나타났다 (Error! Reference source not found.32).
[*HS3는 BMP-2의 헤파란 결합 도메인에 대해 특이적이고 높은 결합 친화성을 가지는 분리된 헤파란 설페이트이다. HS3는 WO2010/030244에 기술되어 있다]
실시예 12 - HS8 및 다른 HS 제제의 HPLC -SEC-RI
헤파란 설페이트 (대략 1 mg, 정밀하게 측정)는 물에서 2 mg/mL까지 제조하였다. 상기 제조의 헤파린 리아제 (lyase) I, II 및 III 분해물은 물에서 2 mg/ml로 제조하였다. 상기 용액을 원심분리하고 (14,000 g, 2 분), 200 μL 분주액으로 분석을 수행하였다.
SEC-RI 시스템은 Waters 2690 Alliance 분리 모듈 (separations module) 및 Water 2410 굴절 지표 모니터 (refractive index monitor, 범위 64)로 구성된다. RI 크로마토그램 (chromatogram)으로부터 정량화를 위해 dn/dc은 0.129로 맞추었다 (ref). 표본을 주입하고 (50 ㎕), 연속적으로 두 SuperdexTM 펩타이드 10/300 GL 컬럼 (300 x 10 mm GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)에서 0.5 mL/분의 유속으로 50 mM 암모늄 아세테이트로 용출시켰다. ASTRA 소프트웨어 (버전 4.73.04, Wyatt Technology Corp)를 이용하여 데이터를 수집하고 분석하였다.
전체 HS8의 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography)는 구별되는 크기-배제 프로필로 나타났다. Celsus HS 출발 물질은 대략 23 mL의 용출물로 용출되는 다양한 크기의 추가적인 물질과 함께 15 mL에서 보이딩 신호 (voiding signal)를 보였다. Error! Reference source not found.33에서 보이는 바와 같이, HS8 물질 (FGF-2 친화성 컬럼에 의해 유지되는)은 SEC 컬럼을 비우는 물질에서 축적된 크기 프로필을 보였다.
이것은 HS3 제조의 크기 프로필과는 다시 구별되며, HS8 및 Celsus HS 프로필의 중간 크기 프로필을 보여준다 (Error! Reference source not found.34). HS8 크로마토그램 (chromatogram)은 이 표본이 물이 아닌 50 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 7)에서 제조되었기 때문에 대략 36 mL에서 큰 염분 신호를 보였다.
도 35는 Celsus로부터 HS의 두 가지 다른 배치 (batch)에 대한 SEC 크로마토그램을 보여준다배치 #10697은 HS3 및 HS8 모두의 제조를 위한 출발 물질로서 사용되었다. 배치 #10595가 모두 분해되지 않는 물질을 다량 가지고 컬럼을 비우는 것으로 나타난 것을 제외하고, 상기 효소와 함께 상기 두 배치의 분해는 유사하였다.
HS8의 헤파린 리아제 분해의 크기 프로필 (Error! Reference source not found.36)은 Celsus HS 출발 물질의 경우와 매우 달랐다. HS3에 대해 얻어진 크기 프로필은 이전에 분해되어 얻어진 것과 매우 유사하였다. HS3 분해에 대한 것과 같이, HS8 크로마토그램은 비우는 부피 (15 mL)에서 약한 신호 강도를 보였고, 이는 물질 대부분이 일정 규모로 분해된다는 것을 시사한다. 그러나, 두 HS3 분해물은 대략 19 mL에서 상당히 구별되는 신호 강도를 보였고, 반면에 HS8은 18 mL 주변에서 넓은 신호를 보였다.
실시예 13 - [3H] 헤파린 분석
FGF2 아미노산 서열로부터 유래된 서열번호 1의 헤파린 결합 능력은 하기 기술된 프로토콜을 이용하여 평가하였다. 결과는 도 37에 나타내었다.
재료
(1) 펩타이드:
Gandhi et al (HS8) - 난양기술대학교(Nanyang Technological University)에서 제조된 GHFKDPKRLYCKNGGF-Ahx-(K)Biotin
(2) 3H 헤파린 0.1 μCi (Perkin Elmer, Boston, USA)
(3) 니트로셀룰로오스 막 (Bio-Rad, USA)
(4) PBS에 포함된 소 혈청 알부민 4% (w/v)
(5) 진공 오븐 (Thermo Fisher Scientific, USA)
(6) Tri-Carb 2800 TCR 액체 신틸레이션(Scintillation) 분석기 (Perkin Elmer, Boston, USA)
방법
(1) FGF2-HBD-펩타이드를 PBS로 목적하는 농도(4.66x10-9, 9.32x10-9, 1.86x10-8, 3.73x10-8 몰)로 구성한다.
(2) 펩타이드의 알려진 농도(known concentrations)로 이중의 동일한 니트로셀룰로오스 막을 적신다.
(3) 상기 막을 1시간 동안 자연 건조한다.
(4) 45분 동안 800C의 진공 오븐에서 추가로 건조한다.
(5) PBS로 막을 3회 헹군다.
(6) 3H 헤파린 0.1 pCi을 상기 막에 첨가하고, 16시간 동안 신틸레이션 카운팅 바이알에서 배양한다(incubate).
(7) PBS로 막을 4회 헹군다.
(8) Tri-Carb 2800 TCR 액체 신틸레이션 분석기(Perkin Elmer, Boston, USA)로 방사능을 결정한다.
실시예 14
헤파린 결합 도메인 펩타이드 서열번호 1이 고정된(immobilized) 헤파린에 결합하는 능력은 아래에 설명된 프로토콜(protocol)을 사용하여 평가하였다. 결과는 도 38에 나타내었다.
재료
1. 표준 어세이 완충액 (SAB) - 100mM NaCl, 50mM 소듐 아세테이트(sodium acetate), 0.2% v/v 트윈(tween) 20, pH 7.2
2. 차단 완충액 - 0.4% 피쉬(Fish) 젤라틴 (Sigma Cat No. 67041) + SAB
3. GAG 결합 플레이트 (Iduron, UK)
4. 펩타이드:
Gandhi et al (HS8) - 난양기술대학교(Nanyang Technological University)에서 제조된 GHFKDPKRLYCKNGGF-Ahx-(K)Biotin
5. ExtraAvidin-AP(Sigma Cat No. E2636)
6. 시그마 FAST p-니트로페닐 포스페이트(Sigma FAST p-Nitrophenyl phosphate) (Sigma, N2770)
방법
1. SAB에 헤파린을 용해시킨다 (5μg/ml).
2. 200μl의 헤파린 용액/웰을 GAG 결합 플레이트에 첨가하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 하룻밤 동안(overnight) 배양한다.
3. 플레이트를 250μl/웰로 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
4. 플레이트를 250μl/웰 차단 완충액으로 빛으로부터 보호되는 370C에서 1시간 동안 배양한다.
5. 플레이트를 250μl/웰로 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
6. 펩타이드를 차단 완충액에 용해시키고, 단계 희석을 수행한다: 0, 50, 100, 200 nM.
7. 200μl/웰의 희석한 단백질을 GAG 코팅된 플레이트에 제공하고, 370C에서 2시간 동안 배양한다.
8. 플레이트를 250μl/웰로 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
9. 200μl/웰의 220ng/ml의 ExtrAvidin-AP를 차단 용액에 첨가하고, 370C에서 30분 동안 배양한다.
10. 플레이트를 250μl/웰로 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
11. 현상(Development) 시약: 200μl/웰의 시그마 FAST p-니트로페닐 포스페이트를 DI 물(DI water)에 첨가하고, 실온에서 40분 동안 배양한다.
12. 405nm에서 흡광도를 읽는다.
실시예 15
HS8에 결합하는 FGF-2의 특성을 평가하였다. 상기 특성을 원래의 시작(raw starting) HS (HS-PM 돼지 점막), 또는 당이 없는 것(no sugar)과의 결합과 비교하였다. 결과는 도 39에 나타내었다.
재료
1. 표준 어세이 완충액 (SAB) - 100mM NaCl, 50mM 소듐 아세테이트, 0.2% v/v 트윈 20, pH 7.2
2. 차단 완충액 - 0.4% 피쉬(Fish) 젤라틴 (Sigma Cat No. 67041) + SAB
3. GAG 결합 플레이트 (Iduron, UK)
4. R& D Systems으로부터의 단백질: FGF 2 - 233 FB
5. R & D Systems으로부터의 항체: FGF 2 - BAM233
6. ExtrAvidin-AP (Sigma Cat No. E2636)
7. 시그마 FAST p-니트로페닐 포스페이트 (Sigma, N2770)
방법
1. SAB에 GAG를 용해시킨다 (5μg/ml)
2. 200μl의 GAG 용액/웰을 GAG 결합 플레이트에 첨가하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 하룻밤 동안 배양한다.
3. 플레이트를 250μl/웰의 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
4. 플레이트를 250μl/웰 차단 완충액으로 빛으로부터 보호되는 370C에서 1시간 동안 배양한다.
5. 플레이트를 250μl/웰로 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
6. 단백질을 차단 완충액에 용해시키고, 단계 희석을 수행한다: 0, 0.781, 1.56, 3.125nM.
7. 200μl/웰의 희석한 단백질을 GAG 코팅된 플레이트에 제공하고, 370C에서 2시간 동안 배양한다.
8. 플레이트를 250μl/웰로 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
9. 200μl/웰의 250ng/ml의 바이오틴화된 일차 항체를 차단 용액에 첨가하고, 370C에서 1시간 동안 배양한다.
10. 플레이트를 250μl/웰의 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
11. 200μl/웰의 220ng/ml의 ExtrAvidin-AP를 차단 용액에 첨가하고, 370C에서 30분 동안 배양한다.
12. 플레이트를 250μl/웰로 SAB으로 3회 조심히 헹군다.
13. 현상(Development) 시약: 200μl/웰의 시그마 FAST p-니트로페닐 포스페이트를 DI 물(DI water)에 첨가하고, 실온에서 40분 동안 배양한다.
14. 405nm에서 흡광도를 읽는다.
실시예 16
플라스틱 접착 중간엽 줄기 세포의 증식을 6일 이상 HS8의 존재하에서 분석하였다. 결과는 도 40에 나타내었다.
세포 증식 프로토콜
재료
1. HM20 hMSC - 남성 히스패닉계 20세 기증자 (Lonza에서 구입)
2. FGF 2 (R & D systems. Cat No. 233-FB-025)
3. 유지 배지: DMEM (1000mg/l 글루코스), 10% FCS, 1% Pen/Strp, 2mM L-글루타민
4. HS8
5. 구아바 플렉스 시약(Guava Flex reagent) (Millipore)
방법
1. HM20 세포를 500μl/웰 배지에 포함된 3000세포/cm2로 24-웰 플레이트에 분주한다 (0 일).
2. 1 일 - 배지를 GAGs(μg/ml) - 2.5 및 0.5로 교체한다.
3. 이틀마다 배지를 교체한다.
4. 세포를 지정된 시간(6일)에 100μl의 트립신으로 수확하고, 300μl의 배지로 중화한다.
5. 세포를 구아바 기계에서 수를 센다 (구아바 플레스 시약: 세포 현탁액은 1:200)
실시예 17
STRO-1-분리된 중간엽 줄기 세포의 증식을 36시간 이상 분리된 HS8의 존재하에서 원래의 Celsus 시작(raw starting) HS (HS-PM), 또는 결합하지 않은 HS 관류 (HS8-)와 비교하여 아래에 설명된 BrDU 결합으로 측정하였다. 결과는 도 41에 나타내었다 (HS8G=HS8).
프로토콜 (세포 증식 ELISA, BrdU (색상계), Roche)
1. 세포 분주 - 190μl의 배지/웰에 5000 세포s (96 웰 플레이트)
2. 배지 - 알파 MEM + 10% 소 태아 혈청(FCS) + 1% L-글루타민(L-gluatamine) + 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 + 100nM L-글루타메이트.
3. 6시간 동안 370C 및 5% C02에서 배양한다.
4. 배지의 10μl에 포함된 다른 용량의 처리물을 배양의 6시간 이후에 레이아웃으로서 지정된 웰에 첨가한다.
5. GAGs (μg/ml) - 1.0, 5,2.5, 1.25, 0.625, 0.3125
6. 처리물을 36시간 동안 37℃ 및 5% C02에서 배양한다.
7. BrdU를 각 웰에 첨가한다.
8. 세포를 BrdU로 2시간 동안 37℃ 및 5% C02에서 표지한다 (20μl의 BrdU 표지 용액/웰)
9. 표지 배지를 태핑(tapping)하여 플레이트에서 제거한,
10. 200μl/웰 FixDenat을 세포에 첨가하고, 30분 동안 15-25℃에서 배양한다.
11. FixDenat 용액을 플리킹(flicking) 및 태핑(tapping)으로 완전히 제거한다.
12. 100μl/웰의 항-BrdU-POD 작용 용액(working solution)을 첨가하고, 90분 동안 15-25℃에서 배양한다.
13. 항체 접합체를 플리킹으로 제거하고, 250μl/웰 워싱 용액(1x PBS)으로 웰을 세 번 헹군다.
14. 태핑으로 워싱 용액을 제거한다.
15. 100μl/웰 기질 용액을 첨가하고, 30분 동안 15-250C에서 배양한다.
16. 370nm에서 흡광도를 측정한다 (기준 파장: 492nm)
실시예 18 - 디사카라이드의 모세관 전기영동 (CE) 분석
헤파란 설페이트 (HS)는 Celsus Laboratories Inc. (HO-03103, Lot #HO-10697)사의 것이다. 디사카라이드 표준(△UA,2S - GlcNS,6S; △UA,2S - GlcNS, △UA,2S -GlcNAc,6S, △UA - GlcNS,6S, △UA - GlcNS, UA - GlcNAc, △UA.2S - GlcNAc, △UA - GlcNAc,6S, △UA.2S - GlcN, △UA.2S - GlcN,6S, △UA - GlcN,6S, △UA - GlcN Cat No. HD001 to HD013, Iduron Ltd, Manchester, UK)은 높은-등급 돼지 헤파린의 세균성 헤파리나제(heparinases)에 의한 분해물로부터 유래한 것이고, Iduron Ltd, Manchester, UK에서 구입하였다. 자연적으로 발생하지 않은 디설페이트화된 디사카라이드 (△UA,2S-GlcNCOEt,6S)의 합성 유도체는 Iduron으로부터 구입하였고, 내부 표준으로 사용하였다. 헤파린 올리고사카라이드 (dp4, dp6, dp8, dp10, dp12 (Cat. No. HO04, HO06, HO08, HO10, H012)) 및 선택적으로 탈설페이트화된 헤파린 표준 (2-0, 6-0 및 N- 탈설페이트화된 헤파린) (Cat No. DSH001/2, DSH002/6, DSH003/N, Iduron Ltd, Manchester, UK) 또한 Iduron Ltd, Manchester, UK에서 구입하였다.
헤파린 리아제 I (헤파리티나제(Heparitinase), EC 4.2.2.8, 또한 헤파리티나제 I으로 알려져 있음), 헤파린 리아제 II (헤파리티나제 II, EC 숫자는 할당되지 않음) 및 헤파린 리아제 III (헤파리나제, EC 4.2.2.7, 또한 헤파리티나제 III)는 Seikagaku Corporation, Japan으로부터 획득하였다. 상기 효소들은 동결건조된 파우더(0.1 U/바이알)로 공급되었고, 0.1% BSA에 용해하여 0.5 mU/μL을 포함하는 용액을 제공하였다. 분취물(5 μL; 2.5 mU)을 필요할 때까지 동결(-80℃)하였다.
HS 제제를 헤파린 리아제 효소로 분해
HS 제제 (1 mg)를 각각 500μL의 소듐 아세테이트 완충액(칼슘 아세테이트를 포함하는 100 mM, pH 7.0)에 용해시켰고, 각각의 2.5 mU의 세 효소를 첨가하였다. 상기 샘플을 37℃에서 하룻밤(24시간) 동안 튜브를 천천히 인버전(inversion) (9 rpm)하면서 배양하였다. 추가의 각각 2.5 mU의 세 효소를 상기 샘플에 첨가하였고, 37℃에서 추가의 48시간 동안 튜브를 천천히 인버전 (9 rpm)하면서 배양하였다. 분해 과정을 열(100℃, 5 min)로 중지시켰고, 이후 동결건조하였다. 상기 분해물을 500μL 물에 재현탁하였고, 분취물(50μL)을 취해 CE로 분석하였다.
모세관 전기영동 (CE)
모세관 전기영동 작동 완충액은 20 mM H3PO4의 수용액을 20 mM Na2HP04.12H20의 수용액에 첨가하여 pH 3.5를 제공함으로써 제조하였다. 컬럼 세척(wash)은 100 mM NaOH (50% w/w NaOH로부터 희석됨)였다. 작동 완충액 및 컬럼 세척은 모두 0.2 μm 셀룰로오스 아세테이트 막 필터(47 mm Ø; Schleicher 및 Schuell, Dassel, Germany)가 적용된 밀리포어(Millipore) 필터 유닛을 사용하여 여과되었다.
12개 디사카라이드 표준의 스톡 용액은 디사카라이드를 물에 용해(1 mg/mL)하여 제조하였다. 표준의 보정 곡선을 결정하기 위하여, 12개 모든 표준이 포함된 혼합물을 제조하였다. 상기 12개 표준 혼합의 스톡 용액은 10 μg/100 μL의 각 디사카라이드를 포함하였고, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 μg/100 μL을 함유하는 단계 희석물은 2.5 μg의 내부 표준(△UA,2S-GlcNCOEt,6S)을 포함하도록 제조하였다. HS의 분해물을 물로 희석하였고(50 μL/mL), 같은 양의 내부 표준을(2.5 μg) 각 샘플에 첨가하였다. 상기 용액을 동결 건조하였고, 물(1 mL)에 재현탁하였다. 샘플을 PTFE 친수성 일회용 시린지 필터 유닛(0.2 μm; 13 mm Ø; Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)으로 여과하였다.
분석은 Agilent3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) 기기를 이용하였고, 코팅되지 않은 융합 실리카 모세관 튜브(75 pm ID, 64.5 cm 최종(total) 및 56 cm 유효 길이, Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, Part Number TSP075375)를 가지고 25℃에서 20 mM 작동 완충액을 이용하여 30 k V의 모세관 전압으로 수행하였다. 샘플을 유체역학 주입(50 mbar x 12 초)을 이용하여 음극(역 극성)에서 모세관 튜브에 도입하였다.
각 작동을 하기 전에, 모세관을 100 mM NaOH (2 분) 및 물 (2 분)로 씻어내었고, 작동 완충액 (5 min)으로 미리 조건을 맞추었다. 튜브의 입구 및 출구에서 완충액을 교체하는 완충액 보충 시스템을 부피, pH 및 이온 세기를 일정하게 맞추기 위해 유지하였다. 유일한 블랭크(blanks)인 물을 처음, 중간 및 샘플의 끝 순서로 작동하였다. 흡광도를 232nm에서 관찰하였다. 모든 결과를 ChemStore 데이터베이스에 저장하였고, 결과적으로 ChemStation 소프트웨어를 사용하여 검색 및 재처리하였다.
표준 혼합물에 포함된 12개 헤파린 디사카라이드 중에 11개는 위에 상세하게 기재된 조건을 사용하여 분리하였다. 12번째 디사카라이드인 △UA-GlcN는 본 실험에 사용된 조건하에서 이동하지 않았다. 그러나, 이 디사카라이드는 헤파란 설페이트에서 발생하지 않는 것으로 보고되고 있다. 표준 보정 곡선에서 R2 값은 0.9949부터 1.0까지의 범위에 있다.
HS 제조의 헤파린 리아제 I, II 및 III 분해는 두 번씩 이루어졌고, 각각의 이중물은 CE에 두 번 주입하였다. 그러므로, 디사카라이드의 표준화된 백분율은 HS 분해물에서 분석 결과의 평균치이다. 표준 혼합물에서 분리된 11개의 디사카라이드 중에서, 오직 8개만이 상기 HS 분해물에서 검출되었다. 다른 작은 신호가 분해물의 전기이동도의 베이스라인에서 관찰되었고, 이러한 결과는 올리고사카라이드>2 dp와 대응될 것이다. 위에서 언급한 것과 같이, 더 큰 올리고사카라이드는 디사카라이드와 비교하였을 때 더 작은 UV 흡광도를 가질 것이다.
이중 분석을 Celsus HS (Lot #10697)의 샘플에서 완료하였고, 동일한 샘플에 대한 분석의 이전 세트와 비교하였다: 이러한 결과는 도 42에 나타내었다. 분석의 두 세트 사이에서 우수한 연관성이 관찰되었다. Celsus HS 분해물에서 8개의 디사카라이드의 비율은 △UA-GlcNAc 및 △UA-GlcNS의 큰 구성요소 및 △UA-GlcNAc,6S, △UA-GlcNS,6S 및 △UA,2S-GlcNS,6S의 더 작은 부분을 갖는 다른 이전의 분석과 비슷하였다(도 42). 이것은 단일-의 큰 비율 및 디설페이트화된 디사카라이드의 설페이트화되지 않은 디사카라이드 더 적은 비율 및 트리설페이트화된 디사카라이드의 적은 비율과 상응하였고, HPLC-SEC 프로파일은 일관성을 보였다. 제한되지 않은 HS는 Celsus HS 시작 물질과 비교하였을 때 단일- 및 탈-설페이트화된 디사카라이드에서 더욱 풍부하다. 제한되지 않은 물질의 이러한 패턴은 또한 HPLC-SEC 크로마토그램에서 상당히 구분되게 관찰된다. HS8의 분석의 경우에 샘플 크기는 오직 단일 분석에만 가능하므로, 오류 결과는 이 제조에 의해 제공되지 않는다. HS8, HS3 및 Celsus HS의 비교는 도 44에 나타내었다.
HS8을 위한 디사카라이드 조성은 HS3(BMP2에서 헤파린 결합 도메인에 대한 친화성을 통해 Celsus HS로부터 분리된 HS, WO2010/030244에 개시됨)의 조성과 비교되며, 더 많은 설페이트화된(대전한) 분획이 일반적으로 Celsus HS로부터 제조된다. 그러나, HS3과 비교하였을 때 HS8에 대한 UA-GlcNS,6s의 더 큰 부분 및 US-GlcNS의 더 작은 부분에서 매우 큰 차이점이 존재한다.
HS8로부터 유래한 원래의 Celsus HS는 20-25 kDa의 평균 분자량을 가지며(헤파린에서 ~15 kDa임을 비교하였을 때), 친화성 크로마토그래피에 의한 HS8을 구분하기 위한 과정은 HS 체인의 관찰된 분쟈량에서 상당한 변화를 야기하지 않는다. 각 디사카라이드 유닛은 ~430에서 ~650 KDa의 범위에서 분자량을 가질 것으로 예상된다. 디사카라이드 당 500 달톤의 대략적인 평균(예로, 헤파린에서 평균 디사카라이드는 ~650 달톤임)을 사용하는 것은 평균 (22 kDa) HS8 당 44개 고리에 대한 HS8의 체인 길이를 의미한다.
실시예 19
HS8은 우선적으로 FGF2에 결합하여 hMSC의 성장 속도를 증가시키는 것으로 확인하였으므로, 본 발명자들은 HS8 활성의 메카니즘을 추가로 모색하였다.
FGF2 중화 항체 또는 FGFR1 저해제(키나제 저해제 및 중화 항체 모두)는 hMSC에서 HS8의 증식 효과를 감소시킬 수 있으며(도 47-50), hMSC에서 HS8의 분열 촉진 효과는 다른 분자들이 아닌 그들의 FGF2/FGFR과의 상호작용에 의한 것임을 확인하였다. HS8의 존재하에, FGF2의 빠른 분해가 지연되었으며(도 46), 이는 HS8은 FGF2와 상호작용하여 FGF2가 배양배지에서 분해되는 것을 막는다는 것을 증명한다.
본 발명자들은 HS8이 다분화능을 유지하면서 hMSC의 자가 증식을 향상시킴을 위에서 보여왔다. HS8 보충물이 hMSC 규칙적 배양에서 배양을 더욱 빠르게 확장시킬 수 있는지 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 각각 세 명의 기증자로부터 획득한 hMSC를 HS8이 보충된 배지에 각각 따로 배양하였다. HS8에 노출된 hMSC은 더 많은 콜로니들을 형성함을 확인하였고(도 51), 추가적인 세포 분열이 있음에도 불구하고 줄기세포-유사 표현형을 유지함을 3명의 기증자(예로, 도 22에 나타냄)에서 바이오마커 CD14, 19, 34, 45, HLA-DR, CD73, 90, 105, CD49a, SSEA-4 및 STRO-1에 대한 FACS를 통해 측정함으로써 확인하였다. "분화능(stemness)"을 의미하는 바이오마커는 hMSC가 HS8 보충 배지에서 확장되었을 때 유지되었다.
또한, 본 발명자들은 이러한 세포들은 모든 세 중간엽 줄기 세포 리니지(뼈를 포함, Alizarin red, Von Kossa, Oil-Red-0 및 Alcian Blue 염색으로 측정)로 쉽게 분화할 수 있고, 향상된 뼈형성을 가짐을 확인하였다. 이는, 이러한 전략은 정형외과 외상 치료에 효과적임을 암시한다. HS8은 MSC가 뼈로 분화하는 능력에 대하여 악영향을 미치지 않았다.
따라서, 본 발명자들은 HS8을 두개골 결손 래트 모델에 적용하였다(도 52). 향상된 뼈 치유는, HS8이 FGF2와 외상 부위에서 상호작용하여 내인성 줄기 및 골 전구세포의 활성을 FGF-2 의존 메커니즘을 통해 가속화한다는 것을 암시하고, 이에 두개관 뼈 결손을 치료하기 위한 이러한 접근 방법의 치료 가능성을 강조하는 증거였다.
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Claims (38)

  1. 아미노산 서열 YCKNGGF (서열번호 2) 또는 아미노산 서열 GHFKDPKRLYCKNGGF (서열번호 1)로 이루어진 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있고,
    헤파린 리아제 I, II 및 III로 분해한 후 생성된 디사카라이드 단편을 모세관 전기영동 분석하는 경우, 하기를 포함하는 디사카라이드 조성을 갖는,
    분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8:
    Figure 112019096043949-pct00007
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 헤파란 설페이트 HS8이, 헤파린 리아제 I, II 및 III로 분해한 후 생성된 디사카라이드 단편을 모세관 전기영동 분석하는 경우, 하기를 포함하는 디사카라이드 조성을 갖는, 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8:
    Figure 112019096043949-pct00008
    .
  3. 제1항에 있어서,
    하기를 포함하는 방법에 의해 수득되는, 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8:
    (i) 지지체에 부착되고 아미노산 서열 YCKNGGF를 갖는 헤파린-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 분자를 갖는 고체 지지체를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 폴리펩타이드 분자를 글리코사미노글리칸을 포함하는 혼합물과 접촉시켜 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스를 형성시키는 단계;
    (iii) 상기 혼합물의 나머지로부터 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스를 분할하는 단계;
    (iv) 상기 폴리펩타이드-글리코사미노글리칸 컴플렉스로부터 글리코사미노글리칸을 해리시키는 단계;
    (v) 상기 해리된 글리코사미노글리칸을 수집하는 단계.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 GHFKDPKRLYCKNGGF (서열번호 1)로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖거나 이로 이루어지는, 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8.
  5. 제3항에 있어서,
    글리코사미노글리칸을 포함하는 상기 혼합물이 돼지 장관 점막으로부터 수득되는 헤파란 설페이트 제제인, 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 헤파란 설페이트 HS8을 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    성장 인자를 추가로 포함하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 성장 인자가 FGF2인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 헤파란 설페이트 HS8을 포함하는, 중간엽 줄기 세포(MSC)와 조합하여 생체내에서의 상처 치유, 또는 조직이나 골 조직의 치유, 재생 또는 둘 모두를 위한, 약제학적 조성물 또는 약제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 또는 약제가 FGF2 단백질을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물 또는 약제.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물 또는 약제가 중간엽 줄기 세포를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물 또는 약제.
  12. 제9항에 있어서,
    의학적 치료 방법에 사용하기 위한, 약제학적 조성물 또는 약제.
  13. 의학적 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 의학적 치료 방법이 생체내에서의 상처 치유 방법을 포함하는, 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 의학적 치료 방법이 조직의 치유 또는 재생을 포함하는, 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 의학적 치료 방법이 골 조직의 치유 또는 재생을 포함하는, 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8.
  17. 생체물질 및 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8을 포함하는 생체적합성 임플란트 또는 보철물.
  18. 생체물질을 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8로 코팅하거나 함침시키는 단계를 포함하여, 생체적합성 임플란트 또는 보철물을 형성하는 방법.
  19. 줄기 세포를 시험관내에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8과 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하여, 줄기 세포를 시험관내에서 배양하는 방법.
  20. 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 시험관내에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8과 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하여, MSC의 배양물에서 콜로니 형성 단위 (CFU-F)를 높이는 (enrich) 방법.
  21. 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 배양물에서 콜로니 형성 단위 (CFU-F)를 높이는 방법으로서, 상기 방법은 MSC를 시험관내에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8과 접촉시켜 배양하여 배양된 세포를 증식시키고 MSC의 집단을 증대시키는 단계를 포함하고, 상기 증대된 MSC 집단이 하기로 특징지어지고:
    ㆍ MSC 집단의 2% 이하가 CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR 중 어느 하나를 발현하고;
    ㆍ MSC 집단의 95% 이상이 CD105, CD73 및 CD90을 발현하고;
    상기 증대된 MSC 집단이 하기 중 하나 이상으로 추가로 특징지어지는, 방법:
    ㆍ MSC 집단의 40% 이상이 CD49a를 발현하거나;
    ㆍ MSC 집단의 50% 이상이 SSEA-4를 발현하거나;
    ㆍ MSC 집단의 20% 이상이 STRO-1을 발현한다.
  22. 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 배양물에서 콜로니 형성 단위 (CFU-F)를 높이는 방법으로서, 상기 방법은 MSC를 시험관내에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8과 접촉시켜 배양하는 단계 및 MSC를 계대하는 단계를 포함하고, 1회 이상의 계대 후 상기 MSC 집단이 하기로 특징지어지고:
    ㆍ MSC 집단의 2% 이하가 CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR 중 어느 하나를 발현하고;
    ㆍ MSC 집단의 95% 이상이 CD105, CD73 및 CD90을 발현하고;
    상기 MSC 집단이 하기 중 하나 이상으로 추가로 특징지어지는, 방법:
    ㆍ MSC 집단의 40% 이상이 CD49a를 발현하거나;
    ㆍ MSC 집단의 50% 이상이 SSEA-4를 발현하거나;
    ㆍ MSC 집단의 20% 이상이 STRO-1을 발현한다.
  23. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8을 포함하는 배양 배지.
  24. 제23항에 있어서,
    FGF2를 추가로 포함하는, 배양 배지.
  25. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 기결정된 양의 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8 및 기결정된 양의 FGF2를 포함하는, 중간엽 줄기 세포와 조합하여 생체내에서의 상처 치유, 또는 조직이나 골 조직의 치유, 재생 또는 둘 모두를 위한, 부품들의 키트.
  26. 중간엽 줄기 세포와 조합하여 생체내에서의 상처 치유, 또는 조직이나 골 조직의 치유, 재생 또는 둘 모두의 의학적 치료 방법에서, 동시, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위한, 치료학적 유효량의
    (i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8; 및
    (ii) FGF2 단백질; 및
    (iii) 중간엽 줄기 세포 중 하나 또는 이 둘 모두를 포함하는 제품.
  27. 성장 인자를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 분리되거나 정제된 헤파란 설페이트 HS8과 접촉시키는 단계를 포함하여, 성장 인자의 안정성을 증가시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 성장 인자가 FGF2인 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
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  33. 삭제
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  35. 삭제
  36. 삭제
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