KR102049978B1

KR102049978B1 - Nkx3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102049978B1
Application number: KR1020170148509A
Authority: KR
Inventors: 김대원
Original assignee: 아이씨엠 주식회사
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2019-11-28
Anticipated expiration: 2037-11-09
Also published as: CN110036023B; ES3009014T3; EP3539978A2; KR20180052103A; CA3042186A1; CA3042186C; EP3835311B1; AU2020207879B2; ES2987020T3; AU2017358282C1; KR20200129068A; KR20190126753A; WO2018088813A3; AU2017358282B2; CN110036023A; JP2019535310A; JP7055455B2; US20190351015A1; KR102342171B1; JP6991593B2

Abstract

본 발명은 Nkx3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 Nkx3.2 단편은 전장의 Nkx3.2와 유사한 수준의 NF-κB 활성화 기능을 가지며, Siah1에 의한 단백질 분해에 저항성을 가진다. 또한, 상기 Nkx3.2 단편은 동물모델 기반 in vivo 효능 평가에서 Nkx3.2에 비해 최소 10배 이상 향상된 퇴행성 관절염 치료효과를 나타내었다. 따라서, 상기 Nkx3.2 단편은 관절염 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

Nkx3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ARTHRITIS COMPRISING NKX3.2 FRAGMENT AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 Nkx3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

발생율이 가장 높은 관절염 중 하나인 퇴행성 관절염은, 퇴행성 변화로 관절을 보호하는 연골조직이 손상되거나, 관절을 이루는 뼈와 인대 등이 손상되어 염증과 통증이 생기는 질환이다. 기존의 퇴행성 관절염의 치료는 주로 염증 제어를 통해 이루어져 왔으나, 이는 근본적인 치료 기술이 될 수 없음이 입증되고 있다.

따라서, 퇴행성 관절염의 근본적인 치료를 위해서는 연골세포의 생성, 분화, 사멸 및 석회화 등의 과정을 조절하는 표적을 확보하고, 상기 표적을 제어하는 기술의 개발이 요구되고 있다.

한편, 퇴행성 관절염에 의한 연골조직의 소실이 과발현된 Nkx3.2(NK3 homeobox 2)에 의해 억제됨으로써, 상기 단백질이 퇴행성 관절염의 치료에 사용될 수 있음이 확인된 바 있다. 이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1150900호는 Nkx3.2 단백질을 이용한 관절염 치료용 조성물, 관절염 진단 키트 또는 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 개시하고 있다.

또한, 연골세포 비대화/석회화 과정에서 활성화되는 인디안 헤지호그 신호전달로 인해 Nkx3.2 단백질 분해가 촉진되고, 이러한 현상이 단백질 분해 효소 Siah1에 의해 매개됨이 보고된 바 있다. 이와 더불어, 연골세포 석회화를 동반하는 퇴행성 관절염의 발병과 함께 인디안 헤지호그(Indian Hedgehog, Ihh) 신호전달이 증가하며, 이를 제어함으로써 동물모델에서의 퇴행성 관절염 진행이 억제될 수 있음이 알려져 있다.

대한민국 등록특허 제1150990호

본 발명자들은 Nkx3.2를 기반으로 하는 퇴행성 관절염 치료에 있어, 퇴행성 관절염의 병리 환경 하에서 효과적으로 작용할 수 있는 Nkx3.2 변이체를 개발하기 위해 연구한 결과, Siah1에 의해 유도되는 단백질 분해에 저항성을 가지는 Nkx3.2 단편들을 제조하였다. 또한, 상기 Nkx3.2 단편들이 전장의 Nkx3.2와 유사한 수준의 NF-κB 활성화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 상기 Nkx3.2 단편들이 전장의 Nkx3.2에 비해 현저히 향상된 퇴행성 관절염 치료효능을 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Nkx3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 Nkx3.2 단편은 전장의 Nkx3.2와 유사한 수준의 NF-κB 활성화 기능을 가지며, Siah1에 의한 단백질 분해에 저항성을 가진다. 또한, 상기 Nkx3.2 단편은 동물모델 기반 in vivo 효능 평가에서 Nkx3.2에 비해 최소 10배 이상 향상된 퇴행성 관절염 치료효과를 나타내었다. 따라서, 상기 Nkx3.2 단편은 관절염 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 Nkx3.2 단편들의 Siah1에 의한 단백질 분해 저항성을 확인한 도면이다.
도 2는 Nkx3.2 단편과 IκBα의 결합 유무를 확인한 도면이다.
도 3은 Nkx3.2 단편이 IκBα의 분해를 유도하는지 확인한 도면이다.
도 4는 Nkx3.2 단편이 NF-κB의 전사기능을 활성화 시키는지 확인한 그래프이다.
도 5는 Nkx3.2에 의해 유도되는 NF-κB 활성화 과정의 분자적 기전을 보여주는 모식도이다.
도 6은 Nkx3.2 단편의 치료효과를 검증하기 위한 퇴행성 관절염 유발 동물모델을 이용한 동물실험 과정을 도식화한 도면이다.
도 7은 Nkx3.2 또는 Nkx3.2 단편의 환부 내 발현에 의한 퇴행성 관절염 치료 효능을 조직병리학적으로 확인한 사진이다.
도 8은 조직학적인 분석을 통해 얻어진 모든 데이터를 정량적으로 평가하여 퇴행성 관절염 중증도를 최소 0점에서 최대 5점으로 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Nkx3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 Nkx3.2 단편은 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다:

N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (I)

상기 식 (I)에서,

코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;

N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;

C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.

상기 코어 도메인은 전장의 Nkx3.2 단백질의 166번부터 309번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 112번부터 165번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개, 41개, 44개, 47개, 50개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

상기 C-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 310번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

상기 아미노산 잔기의 결실은, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인 중 어느 하나 또는 양쪽 도메인 전부에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다. 상기 단편은 서열번호 13의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한, 상기 단편은 서열번호 13의 320번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개, 41개, 44개, 47개, 50개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 또한, 서열번호 13의 320번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

또한, 상기 Nkx3.2 단편은 하기 식 (II)로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다:

N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (II)

상기 식 (II)에서,

코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;

N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 41개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;

C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.

상기 코어 도메인은 전장의 Nkx3.2 단백질의 154번부터 317번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 112번부터 153번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개 또는 41개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개 또는 41개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

상기 C-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 318번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

구체적으로, C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 15번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 3개, 6개, 9개, 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

상기 화학식 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드는 Nkx3.2 단백질의 단편으로서, 생체 내에서는 존재하지 않는다. 그러나, 상기 폴리펩타이드는 전장의 Nkx3.2 단백질과 동일한 활성을 가지면서도, 생체 내에서 쉽게 분해되지 않아 전장의 Nkx3.2 단백질에 비해 체내에서 오랫동안 존재함으로써, 더 우수한 활성을 나타낼 수 있다.

상기 Nkx3.2 단편은 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 통해 수득할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 코어 도메인, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인을 코딩하는 것으로서, 각각은 서열번호 2 또는 38, 서열번호 36 또는 40 및 서열번호 6 또는 42의 염기서열을 가질 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같은 N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인에서 아미노산 잔기가 결실된 단편을 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 35 또는 서열번호 5의 폴리펩타이드를 발현시키는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같은 N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인에서 아미노산 잔기가 결실된 단편을 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 41의 폴리펩타이드를 발현시키는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다.

상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 발현벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드가 발현 및 분비될 수 있도록 통상의 기술자에 의해 제작될 수 있다.

상기 숙주세포는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드가 포함된 발현벡터가 형질전환된 세포로서, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 구체적으로, 포유동물세포일 수 있다. 상기 형질전환은 통상의 기술분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 한편, 상기 원핵세포의 일 예는 E. coli일 수 있으며, 진핵세포의 일 예는 효모(Yeast)일 수 있다. 또한, 상기 포유동물세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다.

상기 관절염은 골 관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍 관절염, 소아 관절염, 노인성 관절염, 반응성 관절염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 0.1 내지 99 중량%, 1 내지 90 중량%, 10 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.

상기 Nkx 3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 폴리펩타이드의 투여량은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏일 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명은 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 재조합 바이러스에 적재되는 폴리뉴클레오타이드는 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 것일 수 있다:

N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (I)

상기 식 (I)에서,

또한, 구체적으로, 상기 재조합 바이러스에 적재되는 폴리뉴클레오타이드는 하기 식 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 것일 수 있다:

N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (II)

상기 식 (II)에서,

상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

구체적으로, C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.

상기 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스는 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질감염시킨 숙주세포를 통해 수득할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다.

상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노-부속 바이러스(AAV)일 수 있다. 상기 아데노 부속 바이러스는 특정 혈청형 (serotype)에 한정되지 않으며, 바람직하게는 AAV1 내지 AAV9 중 어느 하나일 수 있다.

상기 아데노-부속 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미를 동시 형질전환시켜 제조될 수 있다.

상기 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 재조합 바이러스의 성인 기준 1일 1.0x10⁵내지 1.0x10¹⁵ 바이러스 유전체(viral genome)의 양으로 투여할 수 있다. 구체적으로, 본 발며의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준 1일 1.0x10⁵ 내지 1.0x10¹⁵, 1.0x10⁷ 내지 1.0x10¹³, 1.0x10⁸ 내지 1.0x10¹² 또는 1.0x10⁹ 내지 1.0x10¹⁰의 양으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 Nkx 3.2 단편 또는 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로 상기 약학 조성물은 관절강 내 투여할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 "관절강"이란, 관절에서 뼈와 뼈의 틈새로서, 관절포에 의하여 싸여있는 내강을 의미한다. 관절강 내에 투여하는 방법은 다양하다. 예를 들면, 환자가 천장을 쳐다보는 자세로 누운 상태에서 한쪽 무릎을 90도로 굽히도록 하고 관절강 내에 주삿바늘을 찌르는 방법이 있다. 상기 자세에서 안쪽과 바깥쪽의 관절 경계선을 비교적 쉽게 손으로 구분할 수 있다. 안쪽과 바깥쪽, 양쪽 모두에 주사할 수 있으나, 주로 안쪽 방향으로 주사한다. 또한, 무릎을 편 상태에서 주사하는 방법도 있다. 상기 두 자세 모두 예정된 주사 위치에 정확하게 주삿바늘을 꽂았다면, 별다른 저항감 없이 주사액을 주입할 수 있다. 그러나, 주사기를 누를 때 약물이 잘 들어가지 않고 저항감이 느껴지거나 환자가 심한 통증을 호소한다면 바늘의 위치를 조정해야 한다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명자들은 Nkx3.2의 단편을 제작하여, 상기 단편이 Siah1에 의해 분해되지 않으면서도(도 1) IκBα와의 결합을 통해 IκBα의 분해를 유도하고(도 2 및 3), NF-κB에 의한 전사 활성화를 유도함을 확인하였다(도 4). 또한, Nkx3.2의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 아데노 부속 바이러스를 퇴행성 관절염 유발 마우스에 관절강 투여하여 손상된 연골조직이 회복되는 것을 확인하였다(도 7 및 8). 따라서, 본 발명의 Nkx3.2의 단편 또는 Nkx3.2의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스는 관절염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. Nkx3.2의 단편을 발현하는 벡터의 제작

Siah1에 의한 단백질 분해에 저항성을 가지는 변이체를 확보하기 위하여 다음과 같은 방법으로 Nkx3.2의 단편을 발현하는 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 가지는 Nkx3.2 유전자를 주형으로 Lamp Pfu DNA 중합효소(Cat.# LP116-250, BioFACT, 한국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소인 EcoRI(Cat.# FD0274, ThermoFisher, 미국)과 XhoI(Cat.# FD0694, ThermoFisher, 미국) 또는 XbaI(Cat.# FD0684, ThermoFisher, 미국)으로 절단하고, T4 리가아제(Cat.# EL0011, ThermoFisher, 미국)를 사용하여 pCS 발현벡터(Addgene Cat # 17095)에 각각 삽입하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 20종의 Nkx3.2의 단편을 발현하는 발현벡터를 제작하였다.

명칭	특징	서열번호
Nkx3.2 (1-333)	전장의 Nkx3.2	서열번호 7
Nkx3.2 (1-320)	1 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 9
Nkx3.2 (1-307)	1 내지 307번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 10
Nkx3.2 (42-333)	42 내지 333번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 11
Nkx3.2 (99-333)	99 내지 333번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 12
Nkx3.2 (112-333)	112 내지 333번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 13
Nkx3.2 (123-333)	123 내지 333번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 14
Nkx3.2 (99-330)	99 내지 330번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 15
Nkx3.2 (99-327)	99 내지 327번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 16
Nkx3.2 (99-320)	99 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 17
Nkx3.2 (105-327)	105 내지 327번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 18
Nkx3.2 (110-324)	110 내지 324번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 19
Nkx3.2 (112-320)	112 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 20
Nkx3.2 (123-320)	123 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 21
Nkx3.2 (130-320)	130 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 22
Nkx3.2 (150-320)	150 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 23
Nkx3.2 (153-318)	153 내지 318번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 24
Nkx3.2 (156-316)	156 내지 316번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 25
Nkx3.2 (159-314)	159 내지 314번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 26
Nkx3.2 (162-312)	162 내지 312번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 27
Nkx3.2 (165-310)	165 내지 310번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편	서열번호 28

실시예 2. Siah1에 의한 단백질 분해에 저항성을 가지는 Nkx3.2 단편 선별

실시예 1.에서 제작된 Nkx3.2 단편을 발현하는 발현벡터를 이용하여, Siah1에 의해 분해되지 않는 Nkx3.2의 단편을 다음과 같은 방법으로 선별하였다.

먼저, Siah1(서열번호 29; GenBank Accession No. AAH35562.1)을 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 통해 증폭시키고, 증폭된 PCR 산물을 EcoRI 및 NcoI을 사용하여 절단하였다. 이를 동일한 제한효소로 절단된, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)의 아미노산 서열(서열번호 33; YPYDVPDYA)이 3번 반복된 표지를 포함하는 pCS 3HA 발현벡터(Addgene plasmid #17095 pCS2P+의 EcoRI과 ClaI site 사이에 3 HA epitope tag을 삽입한 형태의 벡터)에 삽입하여, Siah1을 발현하는 발현벡터를 제작하였다.

한편, 293T 신장세포주(Cat.# CRL-3216, ATCC, 미국)는 10%(v/v) 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 준비된 세포를 60x15 ㎜ 세포 배양 플레이트에 세포수가 5x10⁵개가 되도록 분주하고, Nkx3.2를 발현하는 발현벡터 2 ㎍, 및 Nkx3.2 단편을 발현하는 발현벡터들을 4 ㎍씩 사용하여, 이들 각각을 2 ㎍의 Siah1를 발현하는 발현벡터와 함께 일시적 형질전환(transient transfection)시켰다. 형질전환은 VivaMagic(Cat.# VM001, 비바젠, 한국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.

형질전환된 세포들로부터 전체 단백질을 분리하고, 이를 Bio-Rad Laboratories protein kit(Cat.# 500-0116, Bio-Rad, 미국)를 이용하여 정량한 뒤, Nkx3.2, Siah1 및 β-actin 각각에 대한 웨스턴 블롯팅을 통상적인 방법으로 수행하였다. 이때, 항-Nkx3.2 항체(Cat.# Ab83288, Abcam, 영국)는 1:1000, 항-HA 항체(Cat.# 11583816001, Roche, 스위스)는 1:5000, 항-Myc 항체(Cat.# 11667149001, Roche, 스위스)는 1:5000 및 항-β-actin 항체(Cat.# LF-PA0207, AbFrontier, 한국)는 1:5,000으로 3%(v/v)의 소혈청알부민(BSA)을 포함하는 TBST 완충액에 희석하여 사용하였다. 그 결과, 웨스턴 블롯팅 밴드를 촬영한 사진을 도 1에 나타내었고, 이를 하기 표 2에 정리하였다.

명칭	서열번호	Siah1에 의한 분해 여부
Nkx3.2(1-333)	서열번호 7	+++	○
Nkx3.2(1-320)	서열번호 9	+	X
Nkx3.2(1-307)	서열번호 10	-	X
Nkx3.2(42-333)	서열번호 11	+++	○
Nkx3.2(99-333)	서열번호 12	++	X
Nkx3.2(112-333)	서열번호 13	++	X
Nkx3.2(123-333)	서열번호 14	-	X
Nkx3.2(99-330)	서열번호 15	+++	○
Nkx3.2(99-327)	서열번호 16	+++	○
Nkx3.2(99-320)	서열번호 17	+	X
Nkx3.2(105-327)	서열번호 18	++	○
Nkx3.2(110-324)	서열번호 19	+++	○
Nkx3.2(112-320)	서열번호 20	-	X
Nkx3.2(123-320)	서열번호 21	-	X
Nkx3.2(130-320)	서열번호 22	-	X
Nkx3.2(150-320)	서열번호 23	-	X
Nkx3.2(153-318)	서열번호 24	-	X
Nkx3.2(156-316)	서열번호 25	++	X
Nkx3.2(159-314)	서열번호 26	++	X
Nkx3.2(162-312)	서열번호 27	++	X
Nkx3.2(165-310)	서열번호 28	++	X

도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, Siah1에 의한 Nkx3.2 단백질의 분해 현상이 전장의 Nkx3.2(1-333)와는 달리, Nkx3.2(1-320), Nkx3.2(1-307), Nkx3.2(123-333), Nkx3.2(99-320), Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들에서는 일어나지 않았다.

실시예 3. Nkx3.2 단편과 IκBα의 결합 유무 확인

Nkx3.2는 IκBα와의 결합을 통해 NF-κB의 활성화를 유도한다. 따라서, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들이 IκBα와의 결합 유무를 면역침강법을 이용하여 확인하였다.

먼저, IκBα(서열번호 31; GenBank Accession No. CAB65556)를 실시예 1.과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 통해 증폭시키고, 증폭된 PCR 산물을 EcoRI 및 XbaI을 사용하여 절단하였다. 이를 동일한 제한효소로 절단된, Myc 아미노산 서열(서열번호 34: EQKLISEEDL)이 6번 반복된 표지를 포함하는 pCS 6Myc 발현벡터(Addgene plasmid #17095 pCS2P+의 EcoRI과 ClaI site 사이에 6 Myc epitope tag을 삽입한 형태의 벡터)에 삽입하여 IκBα를 발현하는 발현벡터를 제작하였다.

그 후, 실시예 1.에서 제조된 Nkx3.2(1-333)과 상기 단편들을 각각 발현하는 발현벡터들을 8 ㎍씩 사용하여, 이들 각각을 동량의 IκBα를 발현하는 발현벡터와 함께 실시예 2.와 동일한 조건 및 방법으로 293T 신장 세포주에 형질전환하였다. 이때, Nkx3.2 단백질에 의해 IκBα 단백질이 분해되는 것을 억제하기 위해 프로테오좀 분해 억제제인 MG132(Cat.# 474790, Merck Millipore, 독일) 20 μM의 농도로 첨가하였다. 6시간 후, 세포로부터 전체 단백질을 분리하고, IκBα에 표지된 Myc을 인식하는 항-Myc 항체를 이용하여 통상적인 방법으로 면역침강을 수행한 뒤, 상기 기재된 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과 사진을 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들에서 전장의 Nkx3.2(1-333)와 유사하게 밴드가 형성되었다. 따라서, 상기 Nkx3.2 단편들이 NF-κB의 활성화를 위해 필수적으로 요구되는 IκBα와의 결합체 형성 기능을 보유하고 있음을 확인하였다.

실시예 4. Nkx3.2 단편에 의한 IκBα단백질 분해 여부 확인

Nkx3.2는 IκBα와의 결합을 통해 IκBα의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 촉진시킨다. 이에, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들이 이와 같은 활성을 유지하는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

한편, ATDC5 연골 세포주(Cat.# RCB0565, Riken, 일본)는 10%(v/v) 우태아혈청이 포함된 DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle's medium: Nutrient Mixture F-12) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 준비된 세포를 90x20 ㎜ 세포 배양 플레이트에 세포수가 5x10⁵개가 되도록 분주하고, 여기에 Nkx3.2(1-333)를 발현하는 발현벡터 4 ㎍, 및 Nkx3.2 단편을 발현하는 발현벡터들을 8 ㎍씩 사용하여, 이들 각각을 1 ㎍의 IκBα를 발현하는 발현벡터와 함께 일시적 형질전환을 수행하였다. 형질전환은 VivaMagic(Cat.# VM001, 비바젠, 한국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.

이후의 과정은 실시예 2.와 동일한 조건 및 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과를 확인한 사진을 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들에서 전장의 Nkx3.2(1-333)와 유사한 강도의 밴드가 형성되었다. 이로부터, 상기 Nkx3.2 단편들이 전장의 Nkx3.2와 동일한 수준으로 IκBα의 단백질 분해를 유도할 수 있음을 검증하였다.

실시예 5. Nkx3.2 단편에 의한 NF-κB 전사기능 활성화 여부 확인

Nkx3.2는 NF-κB의 활성화를 유도함으로써, 연골세포의 세포사멸을 억제한다. 따라서, Nkx3.2 단편에 의한 NF-κB의 활성화를 측정하기 위하여, NF-κB에 특이적인 DNA 결합 사이트(서열번호 35: GGGAATTTCC)가 4번 반복된 폴리뉴클레오티드 서열을 MluI 및 XhoI을 이용하여 pGL3-Basic 벡터(Cat.# E1751, Promega, 미국)에 삽입하여 4x-κB-Luc 발현벡터를 제작하였다. 또한, 상기 발현벡터를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 Nkx3.2에 의한 NF-κB의 전사기능 활성화를 확인하였다.

먼저, 전장의 Nkx3.2(1-333) 및 Nkx3.2 단편을 발현하는 발현벡터 200 ng, 4x-κB-Luc 발현벡터 100 ng, pRL-TK 발현벡터 (Cat.# E2241, Promega, 미국) 20 ng을 각각 사용하여 293T 신장 세포주로 일시적 형질전환시켰다.

형질전환은 VivaMagic을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 24시간 후, Dual-Luciferase Reporter Assay System (Cat.# E1910, Promega, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 어세이를 수행하였다.

구체적으로, 형질전환된 293T 신장 세포주의 배양액을 제거하고, 1xPBS로 세척하였다. 여기에 150 ㎕의 1x Passive Lysis Buffer(PLB)를 첨가하여 15분 동안 상온에서 세포를 용해시키고, 10 ㎕의 세포 용해물에 50 ㎕의 LAR II를 첨가하여 반응시킨 뒤, 파이어플라이 루시퍼라제(FireFly luciferase) 활성을 측정하였다. 여기에 50 ㎕의 Stop&Glo를 첨가하여 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 활성을 측정하였다. 실험 결과는 각각의 샘플에 대한 레닐라 루시퍼라제 활성을 파이어플라이 루시퍼라제 활성으로 정규화시키고(normalized), 이에 대한 백분율의 평균을 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 음성 대조군으로서 pCS2 벡터만을 형질전환한 세포에서의 루시퍼라제 활성을 1로 하였을 때, 전장의 Nkx3.2(1-333)뿐만 아니라, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들에서 모두 유의하게 증가된 루시퍼라제 활성을 나타내었다. 따라서, 상기 Nkx3.2 단편들이 전장의 Nkx3.2와 유사한 수준의 NF-κB 전사기능 활성화 기능을 보유하고 있음을 확인하였다.

실시예 6. Nkx3.2 단편의 향상된 퇴행성 관절염 치료 효능 확인

상기의 in vitro 실험들을 통해 전장의 Nkx3.2에 비하여 Nkx3.2 단편들이 나타내는 기능적 우수성을 확인할 수 있었다. 이에, Nkx3.2 단편에 대한 in vivo 측면에서의 향상된 기능을 검증하기 위하여 Nkx3.2 단편(123-320)과 전장의 Nkx3.2(1-333)의 퇴행성 관절염 치료 효능을 비교 분석하였다. 이를 위해 DMM(Destabilization of Medial Meniscus)이라 명명되는 외과적 시술을 통해 퇴행성 관절염을 유도하는 마우스 모델을 선택하였다. 해당 실험과정을 도 6에 도식화하였다.

구체적으로, 무릎조직 내 내측반월상연골 인대를 절단하여, 내측반월상연골의 구조적인 불안정화를 유도하고 이를 통해 대퇴골연골과 경골연골이 서로 마주 부딪히게 하여 연골손상을 유도함으로써 퇴행성 관절염을 유도하였다. 대조군(Control)은 모의수술을 통하여 무릎 외피와 내피를 절개하였다가 봉합한 동물군을 사용하였다. 퇴행성 관절염을 유도한 동물군과 모의수술 대조군을 8주간 사육하고, 이 시점에서 Nkx3.2 단편(123-320) 또는 전장의 Nkx3.2(1-333)를 발현하는 AAV(Adeno-Associated Virus) 또는 공벡터 AAV를 해당 무릎 관절강에 주사하여, 4 주간 사육한 뒤 퇴행성 관절염의 진행 정도를 조직 병리 분석을 통해 분석하였다.

조직병리학적 분석은 양이온 화합물로써 연골의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfateproteoglycan)이 띄는 음이온기에 효과적으로 부착되어 붉은색의 색깔을 띄는 염색 시료인 Safranin-O 염색 방법을 채택하였다. 붉은색으로 진하게 염색된 부위는 건강성이 유지된 연골 조직으로 평가되며, 반대로 Safranin-O 염색이 약하거나 없으며 조직이 손상된 부분은 퇴행성 관절염 병증이 진행된 병변으로 해석된다.

도 7에 나타난 바와 같이, 공벡터 AAV가 관절강으로 주사된 대조군의 경우, 투여된 바이러스 입자의 양에 상관없이 매우 심한 연골 손상 및 퇴행 현상이 관찰되었다.

전장의 Nkx3.2(1-333)를 발현하는 AAV가 관절강으로 주사된 비교군의 경우, 1x10¹⁰ AAV 투여군에서만 유의한 퇴행성 관절염 치료 효능이 관찰되었다.

반면, Nkx3.2 단편(123-320)을 발현하는 AAV가 관절강으로 주사된 실험군의 경우, 가장 낮은 용량인 1.25x10⁹ AAV 투여군에서부터 월등한 퇴행성 관절염 치료효과를 나타내었다. 즉, Nkx3.2 단편(123-320) 단편의 경우, 퇴행성 관절염 치료 효능이 전장의 Nkx3.2(1-333) 대비 최소 10배 이상 향상되었음을 확인할 수 있었다.

상기 조직병리학적 분석을 통해 얻어진 모든 데이터를 정량적으로 평가하고, 그 결과를 그래프화하여 도 8에 나타내었다. 각 실험군 별로 분석된 동물의 수는 3마리이며, 퇴행성 관절염 중증도를 최소 0점에서 최대 5점으로 평가하여 막대 그래프를 작성하였다. 평균의 표준오차(mean with SEM)가 오차막대로 표기되었으며, 바이러스 입자의 투여 용량 A, B, C, D는 각각 1.25x10⁹, 2.5x10⁹, 5x10⁹, 1x10¹⁰ 순서로 증가 되었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 공벡터 AAV가 관절강으로 주사된 대조군의 경우, 투여된 바이러스 입자의 양에 상관없이 4.5 내지 5점의 높은 점수가 평가되었다. 또한, 전장의 Nkx3.2(1-333)을 발현하는 AAV가 관절강으로 주사된 비교군의 경우, 1x10¹⁰ AAV 투여군에서만 1.5점의 낮은 점수가 평가되었다. 반면, Nkx3.2 단편(123-320)의 을 발현하는 AAV가 관절강으로 주사된 실험군의 경우, 가장 낮은 용량인 1.25x10⁹ AAV 투여군에서부터 1점 이하의 매우 낮은 점수가 평가되었다. 즉, Nkx3.2 단편(123-320) 단편이 전장의 Nkx3.2(1-333)보다 퇴행성 관절염 치료 효능이 우수하다는 것을 확인하였다.

<110> ICM Co., Ltd <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ARTHRITIS COMPRISING NKX3.2 FRAGMENT AS ACTIVE INGREDIENT <130> FPD/201710-0020 <150> KR 2016/0149090 <151> 2016-11-09 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 166-309 aa fragment of Nkx3.2 <400> 1 Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu 20 25 30 Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe 35 40 45 Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg 50 55 60 Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu 65 70 75 80 Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr 85 90 95 Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala 100 105 110 Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr 115 120 125 Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro 130 135 140 <210> 2 <211> 432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding 166-309 aa fragment of Nkx3.2 <400> 2 ggtgttggcc ccagaggtgc acacgtgtcc gcgctgtgca gcggggccgg cggcgggggc 60 ggcagcgggc cggcaggcgt cgcggaggag gaggaggagc cggcggcgcc caagccacgc 120 aagaagcgct cgcgggccgc tttctcccac gcgcaggtct tcgagctgga gcgccgcttt 180 aaccaccagc gctacctgtc cgggcccgag cgcgcagacc tggccgcgtc gctgaagctc 240 accgagacgc aggtgaaaat ctggttccag aaccgtcgct acaagacaaa gcgccggcag 300 atggcagccg acctgctggc ctcggcgccc gccgccaaga aggtggccgt aaaggtgctg 360 gtgcgcgacg accagagaca atacctgccc ggcgaagtgc tgcggccacc ctcgcttctg 420 ccactgcagc cc 432 <210> 3 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 123-165 aa fragment of Nkx3.2 <400> 3 Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val 20 25 30 Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp 35 40 <210> 4 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding 123-165 aa fragment of Nkx3.2 <400> 4 ttgagcctcg gccagccggt ctgtgagctg gccgcttcca aagacctaga ggaggaagcc 60 gcgggccgga gcgacagcga gatgtccgcc agcgtctcag gcgaccgcag cccaaggacc 120 gaggacgac 129 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 310-333 aa fragment encoding Nkx3.2 <400> 5 Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr 1 5 10 15 Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln 20 <210> 6 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding 310-333 aa fragment of Nkx3.2 <400> 6 tcctactatt acccgtacta ctgcctccca ggctgggcgc tctccacctg cgcagctgcc 60 gcaggcaccc ag 72 <210> 7 <211> 333 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala 1 5 10 15 Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly 20 25 30 Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala 35 40 45 Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly 50 55 60 Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala 65 70 75 80 Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala 85 90 95 Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly 100 105 110 Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro 115 120 125 Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly 130 135 140 Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro 145 150 155 160 Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala 165 170 175 Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val 180 185 190 Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg 195 200 205 Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg 210 215 220 Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala 225 230 235 240 Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn 245 250 255 Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala 260 265 270 Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp 275 280 285 Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu 290 295 300 Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly 305 310 315 320 Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln 325 330 <210> 8 <211> 1002 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atggctgtgc gcggcgccaa caccttgacg tccttctcca tccaggcgat cctcaacaag 60 aaagaggagc gcggcgggct ggccgcgcca gaggggcgcc cggcgcccgg gggcacagcg 120 gcatcggtgg ccgcggctcc cgctgtctgc tgttggcggc tctttgggga gagggacgcg 180 ggcgcgttgg ggggcgccga ggactctctg ctggcgtctc ctgccggtac cagaacagct 240 gcggggcgga ctgcggagag cccggaaggc tgggactcgg actccgcgct cagcgaggag 300 aacgagagca ggcggcgctg cgcggacgcg cggggggcca gcggggccgg ccttgcgggg 360 ggatccttga gcctcggcca gccggtctgt gagctggccg cttccaaaga cctagaggag 420 gaagccgcgg gccggagcga cagcgagatg tccgccagcg tctcaggcga ccgcagccca 480 aggaccgagg acgacggtgt tggccccaga ggtgcacacg tgtccgcgct gtgcagcggg 540 gccggcggcg ggggcggcag cgggccggca ggcgtcgcgg aggaggagga ggagccggcg 600 gcgcccaagc cacgcaagaa gcgctcgcgg gccgctttct cccacgcgca ggtcttcgag 660 ctggagcgcc gctttaacca ccagcgctac ctgtccgggc ccgagcgcgc agacctggcc 720 gcgtcgctga agctcaccga gacgcaggtg aaaatctggt tccagaaccg tcgctacaag 780 acaaagcgcc ggcagatggc agccgacctg ctggcctcgg cgcccgccgc caagaaggtg 840 gccgtaaagg tgctggtgcg cgacgaccag agacaatacc tgcccggcga agtgctgcgg 900 ccaccctcgc ttctgccact gcagccctcc tactattacc cgtactactg cctcccaggc 960 tgggcgctct ccacctgcgc agctgccgca ggcacccagt ga 1002 <210> 9 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-320 aa fragment of Nkx3.2 <400> 9 Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala 1 5 10 15 Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly 20 25 30 Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala 35 40 45 Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly 50 55 60 Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala 65 70 75 80 Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala 85 90 95 Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly 100 105 110 Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro 115 120 125 Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly 130 135 140 Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro 145 150 155 160 Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala 165 170 175 Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val 180 185 190 Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg 195 200 205 Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg 210 215 220 Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala 225 230 235 240 Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn 245 250 255 Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala 260 265 270 Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp 275 280 285 Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu 290 295 300 Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly 305 310 315 320 <210> 10 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-307 aa fragment of Nkx3.2 <400> 10 Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala 1 5 10 15 Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly 20 25 30 Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala 35 40 45 Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly 50 55 60 Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala 65 70 75 80 Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala 85 90 95 Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly 100 105 110 Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro 115 120 125 Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly 130 135 140 Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro 145 150 155 160 Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala 165 170 175 Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val 180 185 190 Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg 195 200 205 Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg 210 215 220 Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala 225 230 235 240 Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn 245 250 255 Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala 260 265 270 Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp 275 280 285 Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu 290 295 300 Leu Pro Leu 305 <210> 11 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 42-333 aa fragment of Nkx3.2 <400> 11 Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu 1 5 10 15 Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu 35 40 45 Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg 50 55 60 Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly 65 70 75 80 Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp 85 90 95 Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser 100 105 110 Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro 115 120 125 Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala 145 150 155 160 Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln 165 170 175 Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly 180 185 190 Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln 195 200 205 Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln 210 215 220 Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala 225 230 235 240 Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu 245 250 255 Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr 260 265 270 Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala 275 280 285 Ala Gly Thr Gln 290 <210> 12 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 99-333 aa fragment of Nkx3.2 <400> 12 Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys 20 25 30 Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser 35 40 45 Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr 50 55 60 Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys 65 70 75 80 Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg 100 105 110 Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn 115 120 125 His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser 130 135 140 Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala 165 170 175 Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln 180 185 190 Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro 195 200 205 Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala 210 215 220 Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln 225 230 235 <210> 13 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 112-333 aa fragment of Nkx3.2 <400> 13 Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala 20 25 30 Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser 35 40 45 Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser 50 55 60 Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly 65 70 75 80 Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys 85 90 95 Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg 100 105 110 Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu 115 120 125 Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln 130 135 140 Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu 145 150 155 160 Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg 165 170 175 Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser 180 185 190 Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro 195 200 205 Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln 210 215 220 <210> 14 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 123-333 aa fragment of Nkx3.2 <400> 14 Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val 20 25 30 Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg 35 40 45 Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val 85 90 95 Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro 100 105 110 Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val 115 120 125 Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met 130 135 140 Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val 145 150 155 160 Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val 165 170 175 Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro 180 185 190 Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala 195 200 205 Gly Thr Gln 210 <210> 15 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 99-330 aa fragment of Nkx3.2 <400> 15 Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys 20 25 30 Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser 35 40 45 Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr 50 55 60 Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys 65 70 75 80 Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg 100 105 110 Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn 115 120 125 His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser 130 135 140 Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala 165 170 175 Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln 180 185 190 Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro 195 200 205 Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala 210 215 220 Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 16 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 99-327 aa fragment of Nkx3.2 <400> 16 Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys 20 25 30 Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser 35 40 45 Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr 50 55 60 Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys 65 70 75 80 Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg 100 105 110 Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn 115 120 125 His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser 130 135 140 Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala 165 170 175 Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln 180 185 190 Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro 195 200 205 Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala 210 215 220 Leu Ser Thr Cys Ala 225 <210> 17 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 99-320 aa fragment of Nkx3.2 <400> 17 Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys 20 25 30 Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser 35 40 45 Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr 50 55 60 Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys 65 70 75 80 Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg 100 105 110 Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn 115 120 125 His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser 130 135 140 Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala 165 170 175 Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln 180 185 190 Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro 195 200 205 Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly 210 215 220 <210> 18 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 105-327 aa fragment of Nkx3.2 <400> 18 Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys 20 25 30 Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala 35 40 45 Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly 50 55 60 Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala 85 90 95 Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala 100 105 110 Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser 115 120 125 Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr 130 135 140 Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg 145 150 155 160 Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val 165 170 175 Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly 180 185 190 Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr 195 200 205 Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala 210 215 220 <210> 19 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 110-324 aa fragment of Nkx3.2 <400> 19 Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu 20 25 30 Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp 35 40 45 Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His 50 55 60 Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 65 70 75 80 Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg 85 90 95 Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu 100 105 110 Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala 115 120 125 Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp 130 135 140 Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp 145 150 155 160 Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu 165 170 175 Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro 180 185 190 Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser 210 215 <210> 20 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 112-320 aa fragment of Nkx3.2 <400> 20 Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala 20 25 30 Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser 35 40 45 Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser 50 55 60 Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly 65 70 75 80 Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys 85 90 95 Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg 100 105 110 Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu 115 120 125 Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln 130 135 140 Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu 145 150 155 160 Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg 165 170 175 Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser 180 185 190 Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro 195 200 205 Gly <210> 21 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 123-320 aa fragment of Nkx3.2 <400> 21 Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val 20 25 30 Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg 35 40 45 Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val 85 90 95 Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro 100 105 110 Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val 115 120 125 Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met 130 135 140 Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val 145 150 155 160 Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val 165 170 175 Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro 180 185 190 Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly 195 <210> 22 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 130-320 aa fragment of Nkx3.2 <400> 22 Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg 1 5 10 15 Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu 35 40 45 Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala 50 55 60 Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser 65 70 75 80 Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe 85 90 95 Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala 100 105 110 Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg 115 120 125 Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser 130 135 140 Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp 145 150 155 160 Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu 165 170 175 Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly 180 185 190 <210> 23 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 150-320 aa fragment of Nkx3.2 <400> 23 Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp 1 5 10 15 Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu 35 40 45 Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe 50 55 60 Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu 85 90 95 Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr 100 105 110 Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala 115 120 125 Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr 130 135 140 Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly 165 170 <210> 24 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 153-318 aa fragment of Nkx3.2 <400> 24 Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly 1 5 10 15 Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala 35 40 45 Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala 50 55 60 Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser 65 70 75 80 Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr 85 90 95 Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg 100 105 110 Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val 115 120 125 Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly 130 135 140 Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu 165 <210> 25 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 156-316 aa fragment of Nkx3.2 <400> 25 Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly 1 5 10 15 Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys 35 40 45 Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe 50 55 60 Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu 65 70 75 80 Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys 85 90 95 Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala 100 105 110 Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys 115 120 125 Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu 130 135 140 Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr 145 150 155 160 Tyr <210> 26 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 159-314 aa fragment of Nkx3.2 <400> 26 Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala 20 25 30 Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys 35 40 45 Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu 50 55 60 Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp 65 70 75 80 Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe 85 90 95 Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu 100 105 110 Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val 115 120 125 Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro 130 135 140 Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro 145 150 155 <210> 27 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 162-312 polypeptide fragment of Nkx3.2 <400> 27 Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu 1 5 10 15 Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala 20 25 30 Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser 35 40 45 Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe 50 55 60 Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg 85 90 95 Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser 100 105 110 Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp 115 120 125 Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr 145 150 <210> 28 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 165-310 polypeptide fragment of Nkx3.2 <400> 28 Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly 1 5 10 15 Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu 20 25 30 Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala 35 40 45 Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln 50 55 60 Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys 65 70 75 80 Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys 85 90 95 Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala 100 105 110 Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln 115 120 125 Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln 130 135 140 Pro Ser 145 <210> 29 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Ser Arg Gln Thr Ala Thr Ala Leu Pro Thr Gly Thr Ser Lys Cys 1 5 10 15 Pro Pro Ser Gln Arg Val Pro Ala Leu Thr Gly Thr Thr Ala Ser Asn 20 25 30 Asn Asp Leu Ala Ser Leu Phe Glu Cys Pro Val Cys Phe Asp Tyr Val 35 40 45 Leu Pro Pro Ile Leu Gln Cys Gln Ser Gly His Leu Val Cys Ser Asn 50 55 60 Cys Arg Pro Lys Leu Thr Cys Cys Pro Thr Cys Arg Gly Pro Leu Gly 65 70 75 80 Ser Ile Arg Asn Leu Ala Met Glu Lys Val Ala Asn Ser Val Leu Phe 85 90 95 Pro Cys Lys Tyr Ala Ser Ser Gly Cys Glu Ile Thr Leu Pro His Thr 100 105 110 Glu Lys Ala Asp His Glu Glu Leu Cys Glu Phe Arg Pro Tyr Ser Cys 115 120 125 Pro Cys Pro Gly Ala Ser Cys Lys Trp Gln Gly Ser Leu Asp Ala Val 130 135 140 Met Pro His Leu Met His Gln His Lys Ser Ile Thr Thr Leu Gln Gly 145 150 155 160 Glu Asp Ile Val Phe Leu Ala Thr Asp Ile Asn Leu Pro Gly Ala Val 165 170 175 Asp Trp Val Met Met Gln Ser Cys Phe Gly Phe His Phe Met Leu Val 180 185 190 Leu Glu Lys Gln Glu Lys Tyr Asp Gly His Gln Gln Phe Phe Ala Ile 195 200 205 Val Gln Leu Ile Gly Thr Arg Lys Gln Ala Glu Asn Phe Ala Tyr Arg 210 215 220 Leu Glu Leu Asn Gly His Arg Arg Arg Leu Thr Trp Glu Ala Thr Pro 225 230 235 240 Arg Ser Ile His Glu Gly Ile Ala Thr Ala Ile Met Asn Ser Asp Cys 245 250 255 Leu Val Phe Asp Thr Ser Ile Ala Gln Leu Phe Ala Glu Asn Gly Asn 260 265 270 Leu Gly Ile Asn Val Thr Ile Ser Met Cys 275 280 <210> 30 <211> 1540 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gtcccgtcgg tctcggcgcc gggaagaggc ggtggcgctg cccgcggtgg cgggggttgg 60 cgacggagcg cgttggtgcc aggaccgggg tccgaggcgc gctctccgcc cacagaaatg 120 agccgtcaga ctgctacagc attacctacc ggtacctcga agtgtccacc atcccagagg 180 gtgcctgccc tgactggcac aactgcatcc aacaatgact tggcgagtct ttttgagtgt 240 ccagtctgct ttgactatgt gttaccgccc attcttcaat gtcagagtgg ccatcttgtt 300 tgtagcaact gtcgcccaaa gctcacatgt tgtccaactt gccggggccc tttgggatcc 360 attcgcaact tggctatgga gaaagtggct aattcagtac ttttcccctg taaatatgcg 420 tcttctggat gtgaaataac tctgccacac acagaaaaag cagaccatga agagctctgt 480 gagtttaggc cttattcctg tccgtgccct ggtgcttcct gtaaatggca aggctctctg 540 gatgctgtaa tgccccatct gatgcatcag cataagtcca ttacaaccct acagggagag 600 gatatagttt ttcttgctac agacattaat cttcctggtg ctgttgactg ggtgatgatg 660 cagtcctgtt ttggctttca cttcatgtta gtcttagaga aacaggaaaa atacgatggt 720 caccagcagt tcttcgcaat cgtacagctg ataggaacac gcaagcaagc tgaaaatttt 780 gcttaccgac ttgagctaaa tggtcatagg cgacgattga cttgggaagc gactcctcga 840 tctattcatg aaggaattgc aacagccatt atgaatagcg actgtctagt ctttgacacc 900 agcattgcac agctttttgc agaaaatggc aatttaggca tcaatgtaac tatttccatg 960 tgttgaaatg gcaatcaaac attttctggc cagtgtttaa aacttcagtt tcacagaaaa 1020 taaggcaccc atctgtctgc caacctaaaa ctctttcggt aggtggaagc tagacacatg 1080 aaggtaaata aaaagaaagg ctgttaaata caggaaacag ttgcatgtag taacactaat 1140 atatttaaaa ataagtcaac agtaaaccac tgaaaaaata tatgtatata cacccaagat 1200 gggcatcttt tgtattaaga aaggaagcat tgtaaaataa ttctgagttt tgtgtttgtt 1260 gtagattgat tgtattgttg aaaaagtttg tttttgcgtg ggagtgtgtg cctgcgtggg 1320 tgtgtgcgtg tttgggtttt tttcctttaa ctgacaagcc atcttgagtg gtcatgggcc 1380 actgcttttc cctttgtgag tcaatacata gtgctgctgt gtgctttttt tgtgtgtatt 1440 tgctaatttt tattaatttt agtttttcat taaataaatt tgacttttct gtaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1540 <210> 31 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro 1 5 10 15 Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser 20 25 30 Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu 35 40 45 Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu 50 55 60 Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu 65 70 75 80 Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln 85 90 95 Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln 100 105 110 Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu 115 120 125 Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly 130 135 140 Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val 145 150 155 160 Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu 165 170 175 Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile 180 185 190 His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala 210 215 220 Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu 245 250 255 Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu 260 265 270 Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser 275 280 285 Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro 290 295 300 Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu 305 310 315 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Human influenza hemagglutinin <400> 32 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Myc <400> 33 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of NF-kappaB specific DNA binding site <400> 34 gggaatttcc 10 <210> 35 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 112-165 aa fragment of Nkx3.2 <400> 35 Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala 20 25 30 Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser 35 40 45 Pro Arg Thr Glu Asp Asp 50 <210> 36 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding 112-165 aa fragment of Nkx3.2 <400> 36 ggggccagcg gggccggcct tgcgggggga tccttgagcc tcggccagcc ggtctgtgag 60 ctggccgctt ccaaagacct agaggaggaa gccgcgggcc ggagcgacag cgagatgtcc 120 gccagcgtct caggcgaccg cagcccaagg accgaggacg ac 162 <210> 37 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 154-317 aa fragment of Nkx3.2 <400> 37 Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala 35 40 45 Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln 50 55 60 Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly 65 70 75 80 Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln 85 90 95 Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln 100 105 110 Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala 115 120 125 Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu 130 135 140 Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr 145 150 155 160 Pro Tyr Tyr Cys <210> 38 <211> 492 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding 154-317 aa fragment of Nkx3.2 <400> 38 gtctcaggcg accgcagccc aaggaccgag gacgacggtg ttggccccag aggtgcacac 66 gtgtccgcgc tgtgcagcgg ggccggcggc gggggcggca gcgggccggc aggcgtcgcg 126 gaggaggagg aggagccggc ggcgcccaag ccacgcaaga agcgctcgcg ggccgctttc 186 tcccacgcgc aggtcttcga gctggagcgc cgctttaacc accagcgcta cctgtccggg 246 cccgagcgcg cagacctggc cgcgtcgctg aagctcaccg agacgcaggt gaaaatctgg 306 ttccagaacc gtcgctacaa gacaaagcgc cggcagatgg cagccgacct gctggcctcg 366 gcgcccgccg ccaagaaggt ggccgtaaag gtgctggtgc gcgacgacca gagacaatac 426 ctgcccggcg aagtgctgcg gccaccctcg cttctgccac tgcagccctc ctactattac 486 ccgtactact gc 498 <210> 39 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 112-153 aa fragment of Nkx3.2 <400> 39 Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala 20 25 30 Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser 35 40 <210> 40 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding 112-153 aa fragment of Nkx3.2 <400> 40 ggggccagcg gggccggcct tgcgggggga tccttgagcc tcggccagcc ggtctgtgag 60 ctggccgctt ccaaagacct agaggaggaa gccgcgggcc ggagcgacag cgagatgtcc 120 gccagc 126 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 318-333 aa fragment of Nkx3.2 <400> 41 Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln 1 5 10 15 <210> 42 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding 318-333 aa fragment of Nkx3.2 <400> 42 ctcccaggct gggcgctctc cacctgcgca gctgccgcag gcacccag 48

Claims

삭제
Nkx3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 Nkx3.2 단편이 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인, 약학 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제 2항에 있어서,
상기 관절염이 골 관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍 관절염, 소아 관절염, 반응성 관절염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
삭제
Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 Nkx3.2 단편이 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인, 약학 조성물.
삭제
삭제
제 30항에 있어서,
상기 바이러스가 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것인, 약학 조성물.
제 30항에 있어서,
상기 관절염이 골 관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍 관절염, 소아 관절염, 반응성 관절염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
삭제
삭제