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KR102038695B1 - 프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 알코올성 장손상 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 알코올성 장손상 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR102038695B1
KR102038695B1 KR1020180131208A KR20180131208A KR102038695B1 KR 102038695 B1 KR102038695 B1 KR 102038695B1 KR 1020180131208 A KR1020180131208 A KR 1020180131208A KR 20180131208 A KR20180131208 A KR 20180131208A KR 102038695 B1 KR102038695 B1 KR 102038695B1
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KR
South Korea
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lactobacillus
ckdb001
lactic acid
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acid bacteria
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Active
Application number
KR1020180131208A
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English (en)
Inventor
박나현
김우리
이인옥
김병국
최인석
Original Assignee
주식회사 종근당바이오
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Publication date
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Abstract

본 발명은 프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 알코올성 장손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 신규 분리 유산균주인 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13669B), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13670BP), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CKDB008 (수탁번호: KCTC13673BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호 KCTC13114BP), 또는 이들의 혼합 균주를 포함하며, 알코올 자극으로 인한 장내 세포의 염증 감소 효과가 우수하므로 알코올성 장손상을 예방, 개선하기 위한 식품 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 알코올성 장손상 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Alcoholic Intestinal Damage Comprising Probiotics as Effective Ingredients}
본 발명은 프로바이오틱스를 포함하는 알코올성 장손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
알코올(alcohol)은 스트레스 해소나 사교 등을 목적으로 오랫동안 소비되어온 기호품이다. 소량 섭취하면 혈액순환에 도움이 되어 건강에 유익할 수 있으나 과량을 만성적으로 섭취하면 지방간염, 간경변과 같은 간질환이 발생할 수 있다. 그러나 과다한 알코올 섭취로 인해 영향을 받는 장기로는 간 뿐만이 아니다. 섭취된 알코올의 80% 이상은 소장을 통하여 체내로 흡수되기 때문에 알코올이 소장에 미치는 영향은 결코 간과할 수 없다.
장은 크게 소장과 대장으로 나뉘며 소장은 다시 십이지장, 공장, 회장으로 분류할 수 있다. 알코올이 미치는 영향은 장의 부위마다 다르게 나타난다. 십이지장에서는 장 점막의 손상으로 인한 출혈 및 염증 반응이 가장 두드러지게 나타나고, 공장에서는 영양소의 흡수 장애가 나타나며, 회장에서는 융모의 수축이 증가하여 설사가 나타난다.
위와 같은 알코올 섭취로 인한 장의 손상을 예방하기 위해서는 금주하는 것이 가장 이상적인 방법이기는 하나 장 손상을 예방하는 식품을 섭취하는 것도 좋은 대안이 될 수 있다. 그러나 시장에서 판매중인 대부분 제품들은 간 손상을 예방하는 제품이고 장 손상을 예방할 수 있는 제품은 판매되고 있지 않다. 또한, 알코올성 위장관 질환의 예방 또는 치료를 위한 특허(KR10-1782848, KR10-1772810, KR10-2013-0036939, 및 KR10-1819026)들이 있지만, 모두 천연추출물을 유효성분으로 하는 발명이고, 프로바이오틱스를 유효성분으로 하는 발명은 아직 개발된 바 없는 실정이다. 따라서 본 발명자들은 식품 및 의약품으로 응용이 가능한 알코올성 장손상을 예방 또는 치료할 수 있는 기능성 프로바이오틱스 균주를 발굴하고자 하였다.
대한민국 등록특허 제10-1782848호(2017.09.22. 등록) 대한민국 등록특허 제10-1772810호(2017.08.23. 등록) 대한민국 공개특허 제10-2013-0036939호(2013.04.15. 공개) 대한민국 등록특허 제10-1819026호(2018.01.10. 등록)
본 발명자들은 식품 및 의약품으로 응용이 가능한 알코올성 장손상을 예방 또는 치료할 수 있는 기능성 프로바이오틱스 균주를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 총 530종의 유산균으로부터 안전성, 안정성 및 산업화 가능성을 확인한 균주 17종을 1차 선발하고, 이후 우수한 장 부착능을 보유한 12종의 유산균을 선발하였으며, 이 중 알코올로 인한 세포생존율 저하를 개선시킬 수 있는 균주 7종을 2차 선발하였다. 마지막으로 알코올로 인해 증가되는 염증성 사이토카인 발현을 효과적으로 낮추는 균주 4종을 최종 선발하였으며, 선발된 4종의 혼합균주가 각 단일 균주 보다 알코올로 인한 장세포의 염증을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 상기 4종의 균주는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13669B), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13670BP), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CKDB008 (수탁번호: KCTC13673BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호 KCTC13114BP) 이다.
본 발명자들은 상기 선발된 4종의 각 균주가 알코올성 장손상에 대한 예방 또는 치료 효과가 우수하다는 것을 확인하였으며, 특히 이들의 혼합 균주는 각 단일 균주 보다 알코올로 인한 장세포의 염증을 효과적으로 예방할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 선발된 각 단일 균주 또는 이들의 혼합 균주를 포함하는 유산균 조성물을 제공하는 것이다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 적당한 양을 섭취했을 때 건강에 이로움을 주는 미생물로 각종 병원균 및 외부 물질로부터 장 점막 표면을 보호하는 작용을 한다. 최근 프로바이오틱스가 만성 염증성 장질환에서 장 점막 방어 및 장 투과성을 조절하는 효과를 보임에 따라, 장 세포 보호에 관여할 것이라는 가설을 바탕으로 한 다양한 연구들이 시행되고 있다.
본 발명자들은 소장의 기관 별 상피 세포주를 대상으로 알코올 보호 효과가 있는 프로바이오틱스를 선별하였고, 각 소장 부위별 손상을 모두 아우를 수 있는 프로바이오틱스의 혼합균주를 개발하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 유산균, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 유산균 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13669B), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13670BP), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CKDB008 (수탁번호: KCTC13673BP), 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 비피도박테리움 속 유산균은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 비피도박테리움 속 유산균은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호 KCTC13114BP)이다.
본 발명의 가장 구체적인 구현예에서, 상기 유산균은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13669BP), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13670BP), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CKDB008 (수탁번호: KCTC13673BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호 KCTC13114BP), 또는 이들의 혼합 균주를 포함한다.
본 발명의 상기 락토바실러스 불가리쿠스 CKDB001균주는 2018년 10월 23일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 13669BP를 부여받았다.
또한, 본 발명의 상기 락토바실러스 헬베티쿠스 CKDB001균주는 2018년 10월 23일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 13670BP를 부여받았다.
또한, 본 발명의 상기 락토바실러스 플란타럼 CKDB008 균주는 2018년 10월 23일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 13673BP를 부여받았다.
마지막으로, 본 발명의 상기 비피도박테리움 비피덤 CKDB001균주는 2016년 9월 23일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 기탁하였고, 기탁번호 KCTC13114BP 를 부여받았다.
상기 4종의 균주는 그람 양성, 간균으로 용혈성,포자형성능 및 카탈라아제(Catalase) 음성으로 확인되었다. 상기 균주의 당 이용성은 API 50 CHL 키트를 이용하여 분석하였으며(표 1), 균주동정을 위해 16s rDNA 염기서열을 분석하여 유전자 동정을 진행하였다(표 2).
Source L. bulgaricus
CKDB001		 L. helveticus
CKDB001		 L. plantarum
CKDB008		 B.bifidum
CKDB001
Temoin 0 + + + -
Glycerol 1 - - - -
Erythritol 2 - - - -
D-Arabinose 3 - - - -
L-Arabinose 4 - - + -
D-Ribose 5 - - + w
D-Xylose 6 - - - -
L-Xylose 7 - - - -
D-Adonitol 8 - - - -
Methyl-
Figure 112018107485334-pat00001
D-Xylopyranoside		 9 - - - -
D-Galactose 10 - + + +
D-Glucose 11 + + + +
D-Fructose 12 + + w +
D-Mannose 13 + + + -
L-Sorbose 14 - - - -
L-Rhamnose 15 - - + -
Dulcitol 16 - - - -
Inositol 17 - - - -
D-Mannitol 18 - - + -
D-Sorbitol 19 - - - -
Methyl-αD-Mannopyranoside 20 - - + -
Methyl-αD-Glucopyranoside 21 - - - -
N-Acetylglucosamine 22 + + + +
Amygdaline 23 - - + -
Arbutine 24 - - + -
Esculine, citrate de fer 25 - - - -
Salicine 26 - - + -
D-Cellobiose 27 - - + -
D-Maltose 28 w + + -
D-Lactose 29 + + + +
D-Melibiose 30 - - + -
D-Saccharose 31 + - + -
D-Trehalose 32 + + + -
Inuline 33 - - - -
D-Melezitose 34 - - + -
D-Raffinose 35 - - + -
Amidon 36 - - - -
Glycogene 37 - - - -
Xylitol 38 - - - -
Gentiobiose 39 - - + +
D-Turanose 40 - - + -
D-Lyxose 41 - - - -
D-Tagatose 42 - - - -
D-Fucose 43 - - - -
L-Fucose 44 - - - -
D-Arabitol 45 - - + -
L-Arabitol 46 - - - -
Potassium GlucoNaTe 47 - - + -
Potassium 2-CetoGluconate 48 - - - -
Potassium 5-CetoGluconate 49 - - - w
Strains sequence
L. bulgaricus CKDB001 GTTTGAATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCTGAATTCAAAGATCCCTTCGGGGTGATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAACAACATGAATCGCATGATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGCAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGTCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAATGATAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCATCGGAAACTGTCATTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGCGCTAGGTGTTGGGGACTTTCCGGTCCTCAGTGCCGCAGCAAACGCATTAAGCGCTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTGCGCTACACCTAGAGATAGGTGGTTCCCTTCGGGGACGCAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAACGAGAAGCGAACCCGCGAGGGTAAGCGGATCTCTTAAAGCTGCTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGTCGGTGAGATAACCTTTAT
L. helveticus CKDB001 GCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCAGAACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGACGCTGGGGACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATCCTAAGAGATTAGGAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGGAAGGAGCCGTCTAAGCAGGCAGATGACTGGGGTG
L. plantarum CKDB008 GCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTT
B. bifidum CKDB001 GCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCGGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATGCTCCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGTTCCACATGATCGCATGTGATTGTGGGAAAGATTCTATCGGCGTGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTGTTTGGGAGCAAGCCTTCGGGTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGCTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGACGCTGGATGTGGGGCACGTTCCACGTGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCGTCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGACGCCAGAGATGGCGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAGCGGGATGCGACATGGCGACATGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGGAGCCTGCAACCCGGCTCCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTCTAAG
본 발명의 조성물의 유효성분인 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13669BP), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13670BP), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CKDB008 (수탁번호: KCTC13673BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호 KCTC13114BP)는 총 17종의 프로바이오틱스 균주 중에서 알코올에 의한 장손상을 가장 효과적으로 예방하는 균주로 선택된 것이다.
본 발명의 조성물의 유효성분인 상기 유산균은 소장(회장) 및 대장 상피세포에 대한 부착능이 상용 균주인 락토바실러스 람노서스 GG 균주(Lactobacillus rhamnosus GG strain, LGG)보다 우수하여 장의 부위에 관계없이 매우 우수한 장 부착능을 가진다.
또한, 상기 유산균은 소장(십이지장 및 회장) 상피세포에 대한 에탄올 처리에도 불구하고 상용 균주인 LGG 균주 뿐만 아니라, 정상 세포와 유사할 정도로 매우 높은 세포생존율을 나타낸다.
또한, 상기 유산균은 소장(십이지장 및 회장) 상피세포에 대한 에탄올 처리에도 불구하고 상용 균주인 LGG와 비교하여 염증성 사이토카인(IL-1β 및 TNFα)의 발현을 크게 감소시킨다. 따라서 본 발명의 상기 유산균은 소장에 대해 매우 우수한 항염증 효과를 나타낸다.
특히, 본 발명의 최종 선발 및 기탁기관에 기탁된 4종 유산균은 각 균주의 장부착능, 세포생존율, 및 항염증 효과도 우수하지만, 이들을 혼합한 혼합 균주로 사용시 각 단일 균주의 항염증 효과보다 더 우수한 항염증 효과(시너지 효과)를 가진다는 점에서 특성이 있다. 따라서 본 발명의 유산균은 혼합 균주로 사용되는 경우에 더 유용하다.
본 발명의 조성물들의 유효성분인 상기 균주, 또는 이의 배양물은 상기 균주를 단리 및/또는 정제한 균체 외에 균체를 포함하는 배양물, 균체의 추출물, 배양물 상층액, 이들의 농축액, 농축물, 건조물, 또한 필요에 따라서 희석액, 희석물 등이며, 배양액, 배양물을 처리하여 얻어지는 모든 상태의 것을 포함한다.
상기 균체의 배양법, 추출법, 분리법, 농축법, 건조법, 희석법 등은 특별히 한정되지 않는다.
균체를 배양하기 위한 배지로는 통상적으로 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 효모 엑기스 등을 포함하고 있으며, 배양 방법으로는 일반적인 각종 호기적 또는 혐기적인 방법을 적당히 사용할 수 있다.
배양 온도로는 예를 들어 35~45℃를 설정하고, 배양 중에는 수산화나트륨 등의 알칼리를 사용하여 배지의 pH를 중성으로부터 산성, 예를 들어 pH가 5~6정도가 되도록 유지하는 중화배양법을 사용할 수도 있다. 이와 같은 중화배양법 외에 회분배양법 등의 임의의 배양 방법을 사용할 수 있으며, 배양한 후에는 필요에 따라서 배양물이나 그 상층액을 농축, 건조, 희석 등을 할 수도 있다.
또한 원심분리법이나 막분리법을 사용하여 배양물의 상층액과 균체를 분리하여 균체를 농축한 상태로 회수할 수도 있다. 그리고 균체에 초음파 처리나 효소 처리 등을 행하여 균체 내의 성분을 추출하거나, 배양물이나 그 상층액, 균체나 그 추출물 등을 건조할 수도 있다. 이들은 본 발명의 상기 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 유효성분인 유산균은 상술한 알코올의 장 상피세포 독성에 대하여 우수한 세포생존율 및 항염증 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 알코올성 장손상 예방, 개선 또는 치료용도를 가진다.
본 발명의 구체적인 구현예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 유산균은 소장의 여러 부위(십이지장, 회장) 및 대장에 대해서 상술한 유리한 효과를 나타낸다. 따라서, 상기 장손상의 "장"은 소장 및/또는 대장을 의미하고, 보다 구체적으로 상기 "소장"은 십이지장, 공장, 및/또는 회장을 의미한다. 가장 구체적으로는 상기 소장은 십이지장 및/또는 회장을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 유산균은 장에서의 염증성 사이토카인의 발현을 현저하게 감소시킨다. 따라서 본 발명의 조성물은 장염, 또는 염증성 장질환의 예방, 개선 또는 치료용도를 가진다.
본 발명에서 상기 장염은 세균성 장염, 바이러스성 장염, 및 알코올성 장염을 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 염증성 장질환은 크론병, 베체트병, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 유산균 조성물은 상술한 용도를 가지는 식품조성물, 또는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 유산균 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가성분은 예컨대 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 상기 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 유산균 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 요거트, 발효유, 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량(약제학적 유효량)을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미하고, "예방"은 질환상태의 악화를 억제하여 질환상태가 발현하지 않도록 하는 것을 의미하며, 상기 치료를 포함한다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제. 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스. 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.
상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 알코올성 장손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 신규 분리 유산균주인 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13669B), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13670BP), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CKDB008 (수탁번호: KCTC13673BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호 KCTC13114BP), 또는 이들의 혼합 균주를 포함한다.
(b) 본 발명은 알코올 자극으로 인한 장내 세포의 염증 감소 효과가 우수하므로 알코올성 장손상을 예방, 개선하기 위한 식품 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 프로바이오틱스 균주의 장 상피세포 부착능을 나타낸 도이다.
도 2a는 본 발명의 프로바이오틱스 균주의 십이지장 세포주(HUTU-80)에 대한 알코올성 세포 손상 보호효과를 나타내는 도이다.
도 2b는 본 발명의 프로바이오틱스 균주의 회장 세포주(IEC-18)에 대한 알코올성 세포 손상 보호효과를 나타내는 도이다.
도 3a는 본 발명의 프로바이오틱스 균주의 십이지장 세포주(HUTU-80)에서 염증성 사이토카인인 IL-1β의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3b는 본 발명의 프로바이오틱스 균주의 십이지장 세포주(HUTU-80)에서 염증성 사이토카인인 TNFα의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 4a는 본 발명의 프로바이오틱스 균주의 회장 세포주(IEC-18)에서 염증성 사이토카인인 IL-1β의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 4b는 본 발명의 프로바이오틱스 균주의 회장 세포주(IEC-18)에서 염증성 사이토카인인 TNFα의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5a는 본 발명의 혼합균주의 회장 세포주(IEC-18)에서 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5b는 본 발명의 혼합균주의 십이지장 세포주(HUTU-80)에서 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
1. 실험재료
1.1 프로바이오틱스 균주의 분리 및 선별
1.1.1. 신규 미생물 분리
본 실험에 사용된 프로바이오틱스는 ㈜종근당바이오 (CKDBiO, Korea)에서 분리한 균주로 영유아 분변과 원유 및 기타 발효식품에서 분리하였다. 수집한 시료는 멸균 혐기수에 현탁하고 십진 희석 후 MRS(ManRogosaSharpe) 고체배지, BL(Blood-liver) 고체배지에 도말하였다. 37℃에서 48시간 동안 5% CO2, 10% H2, 85% N2 대기 조성으로 유지되는 혐기 챔버 내에서 배양한 후, 형태가 상이한 콜로니(colony)를 선택하여 순수 분리하였다. 실험 결과 총 530 주의 유산균이 분리되었다. 이어서, 상기 분리한 530 주의 유산균에 대하여 용혈현상 검사, 젤라티나아제(gelatinase) 생성 여부, 우레아제(urease) 생성 여부, 바이오 아민 생성 여부를 확인 반응 실험을 한 결과, 음성반응을 보이는 균주 총 428주를 선별하였다.
1.1.2 소화액 (산성 pH 및 담즙산염) 내성 비교 평가
상기 1.1.1 에서 선별된 유산균들 각각의 strain별로 pH 내성 및 담즙산염에 대한 내성을 비교 분석하였다.
선별된 유산균의 산성 pH에 대한 내성을 확인하기 위하여, 염산을 이용하여 pH 2.5로 조절한 MRS 또는 BL 액체배지를 제조하였다. 각각의 균주들을 상기 배지에 1%씩 접종한 후 초기균수를 측정하기 위하여 혐기 희석액(pH 6.2)으로 십진 희석한 후 1 ml 분주하고 동일 고체배지를 이용하여 도말한 후 37℃에서 48시간 배양하였다. 균주를 접종한 pH 2.5인 MRS 액체배지와 BL 액체배지를 37℃ 배양기에서 2시간 동안 배양 한 후 위와 동일한 방법으로 동일한 고체배지에 배양하였다. 배양 후에 나타난 집락(colony)을 계수하여 pH에 대한 내성을 측정하였다.
선별된 유산균의 담즙 내성을 확인하기 위하여, Gilliland와 Walker(1990)의 방법을 이용하여 MRS 또는 BL 액체배지에 0.3% 옥스갈(Sigma, USA)을 첨가하여 2차 계대배양이 끝난 유산균을 1% 접종하였다. 대조군으로는 0.3% 옥스갈을 첨가하지 않은 MRS 또는 BL 액체배지에 유산균을 동량 접종하였다. 모든 시료들은 37℃ 배양기에서 배양하여 2시간 후에, 각각의 유산균 생장 고체배지에서 배양하여 통상적인 내성 측정 방법(식 1)에 따라 미생물 수를 계측하였다.
식 1
Survival rate (%) = [(CFU/ml120min)/(CFU/ml0min)]x100
실험 결과, 각 species 별로 내산성과 내담즙성이 높은 균주 상위 30%를 선별하여 총 128주를 선별하였다.
1.1.3 유산균 원말의 제조
상기 선별된 128 주의 유산균의 고농도 분말제조를 위해 각각의 균주에 최적화된 증균배지와 배양조건을 설정하여 배양하였으며, 이후 균체 회수 및 동결건조 공정부분은 통상적인 방법(원심분리 후 60℃ 냉동고에서 급속 동결한 다음 0℃에서 45℃ 사이의 조작 조건에서 동결건조 수행)을 적용하였다. 균체 회수 후 농축액 대비 말토덱스트린 5-50(부피/중량)% 또는 트레할로스 5-50(부피/중량)% 또는 셀룰로오스 5-50(부피/중량)% 첨가하고, 동결건조 후 분쇄하여 유산균 원말을 제조하였다. 그 결과 species별로 가장 높은 원말 생존율을 나타내며, 장기 보관 안정성이 높아 산업화 가능성이 가장 높은 균주 총 17종(표 3)을 최종 선발하였다. 실험 시 분말화한 균주는 동물세포 배양 배지에 현탁하여 사용하였다.
연구에 사용된 프로바이오틱스 균주 목록
연번 균주명 원말 생존율
(%)		 약어
1 Lactobacillus helveticus CKDB001 60 LH
2 Lactobacillus gasseri CKDB026 50 LG
3 Lactobacillus reuteri CKDB016 67 LU
4 Lactobacillus plantarum CKDB008 82 LP
5 Lactobacillus acidophilus CKDB007 29 LA
6 Lactobacillus bulgaricus CKDB001 72 LB
7 Lactobacillus casei CKDB007 75 LC
8 Lactobacillus fermentum CKDB004 74 LF
9 Lactobacillus rhamnosus CKDB 80 LR
10 Lactobacillus salivarius CKDB001 75 LS
11 Lactobacillus paracasei CKDB005 68 LPARA
12 Lactococcus lactis CKDB007 81 LCL
13 Streptococcus thermophilus CKDB021 70 ST
14 Bifidobacterium lactis CKDB005 35 BL
15 Bifidobacterium longum CKDB004 40 BO
16 Bifidobacterium bifidum CKDB001 27 BF
17 Bifidobacterium breve CKDB002 38 BB
1.2 세포배양
HUTU-80(십이지장 상피 세포주, Human), IEC-18(회장 상피 세포주, Rat), HT-29(대장 상피 세포주, Human)는 세포는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, HUTU-80과 IEC-18은 Dulbeco’s Modified Eagle’s Media (DMEM) 배지를 이용하였고, HT-29는 Rowell Park Memorial Institue (RPMI) 1640 배지를 이용하였으며, 각 배지에 Penicillin/ Streptomycin(P/S) 1 %와 Fetal Bovine Serum (FBS) 10%를 각각 첨가한 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
1.3 통계처리
실험 결과에 대한 유의차 검정은 Prism software에서 평균값을 분산분석(Anova: analysis of variance)한 후 p<0.05 수준에서 다중검증법에 따라 분석하였다.
2. 본 발명의 프로바이오틱스의 장 상피세포 부착능 측정
장관에는 수많은 장내세균이 서로 경쟁 및 상호작용을 하며 서식하고 있다. 이러한 장내에서 프로바이오틱스가 유해균 억제, 장벽 기능 강화, 면역기능 조절 등과 같은 기능성을 발휘하기 위해서는 장 부착능력이 필수적으로 요구된다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 프로바이오틱스 균주들의 장 부착능을 확인하기 위하여 회장 상피세포(IEC-18)와 대장 상피세포(HT-29)에 대한 부착능을 측정하였다.
2.1 회장 상피세포주 (IEC-18)에 대한 프로바이오틱스 균주의 부착능 측정
IEC-18을 12 웰 세포배양 디쉬에 1Х105 cell/mL 농도로 분주하여 단일층이 될 때까지 세포배양기 (약 2일간 37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 프로바이오틱스 균주는 항생제 무첨가 세포배지 DMEM에 1Х109 CFU/mL 로 희석하였다. IEC-18이 컨플루언시를 이루면 각 균액을 세포에 1 mL씩 분주하고 90분간 세포배양기에서 배양한다. 그 후 PBS로 두 번 세척하고, Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내었다. 떼어진 세포를 단계 희석하고 MRS 아가 플레이트(MRS agar plate)에 접종하여 37℃에서 18시간 배양 후 생균수를 측정한다. 비교군은 상용균주인 Lactobacillus rhamnosus GG를 사용하였으며, 장 부착율은 하기 식 2와 같이 계산하였다.
식 2
장 부착율(%) = ( 90분 배양 후 생균수 / 초기 생균수 ) x 100
실험 결과 CKDBiO의 균주 17종 중 IEC-18에서 L. GG(0.02%) 보다 장 부착능이 우수한 균주는 B. bifidum CKDB001(0.18%), L. plantarum CKDB008(0.11%), S. thermophilus CKDB021(0.08%), L. salivarius CKDB001(0.05%), L. bulgaricus CKDB001(0.04%), L. helveticus CKDB001(0.02%), 및 L. fermentum CKDB004(0.02%) 7종이 확인되었다(도 1a).
2.2 대장 상피세포주 (HT-29)에 대한 프로바이오틱스 균주의 부착능 측정
HT-29를 12 웰 세포배양 디쉬에 1Х105 cell/mL 농도로 분주하여 단일층(monolayer)이 될 때까지 세포배양기(약 5일간 37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 각 프로바이오틱스 균주는 항생제 무첨가 세포배지 RPMI 1640에 1Х109 CFU/mL 로 희석하였다. HT-29가 컨플루언시를 이루면 각 균액을 세포에 1 mL씩 분주하고 90분간 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 PBS로 두 번 세척하고, Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내었다. 떼어낸 세포를 단계 희석하고 MRS 아가 플레이트(MRS agar plate)에 접종하여 37℃에서 18시간 배양 후 생균수를 측정하였다. 비교군으로는 상용균주인 Lactobacillus rhamnosus GG를 사용하였으며, 장 부착율은 상기 2.1과 동일하게 식 2와 같이 계산하였다.
식 2
장 부착율(%) = ( 90분 배양 후 생균수 / 초기 생균수 ) x 100
HT-29에서 LGG(2.23%) 보다 장 부착능이 우수한 균주는 L. helveticus CKDB001(8.17%), L. reuteri CKDB016(4.88%), L. plantarum CKDB008(4.41%), L. acidophilus CKDB007(3.43%), L. bulgaricus CKDB001(3.39%), L. casei CKDB007(3.32%), B. lactis CKD005 (3.22%), B. longum CKD004(3.11%), L. fermentum CKD004 (2.37%) 9종이 확인되었다(도 1b).
2.3. 소결
상기 두 세포주 모두에 장 부착능이 우수한 균주를 감안하면 17종 중 총 12종이 선발되었다. 이 중 BBF와 LH는 종래 장 부착능력이 우수한 균주로 잘 알려져 있는 LGG에 비해 장 부착능력이 현저히 우수한 것으로 확인되었다.
3. 본 발명의 프로바이오틱스의 알코올성 장 세포 손상 보호효과 - 세포 생존율 측정 ( MTT assay)
장 상피세포에 대한 알코올의 독성과 이에 대한 프로바이오틱스의 예방 효과를 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. MTT assay는 앞선 장 부착능 실험에서 LGG보다 효과가 뛰어났던 12종 균주로 진행했다.
3.1 실험 방법
먼저 HUTU-80과 IEC-18을 96 웰 세포배양 디쉬에 1Х105 cell/mL 농도로 분주하여 단일층이 될 때까지 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 프로바이오틱스 균주는 항생제 무첨가 세포배지 MEM에 1Х106 CFU/mL 로 희석하였다. 세포가 컨플루언시를 이루면 각 균액을 세포에 200 μL씩 분주하고 90분간 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 PBS로 두 번 세척하고, 에탄올을 포함한 세포배지를 분주하여 90분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 배지를 제거한 뒤 MTT solution 을 넣고 세포배양기에서 3시간 동안 배양한 후 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 넣어 반응을 종결시켰다. DMSO는 10분간 반응시켰으며 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 계산하였다. 대조군은 에탄올만 처리했으며, 비교군은 상용균주인 Lactobacillus rhamnosus GG를 사용하였다. 세포생존률은 하기 식 3과 같이 계산하였다.
식 3
세포생존률(%) = ( 실험군 흡광도 값 / 대조군 흡광도 값 ) x 100
3.2 십이지장 상피 세포주(HUTU-80)에 대한 보호효과
십이지장 상피 세포주(HUTU-80)의 경우, 에탄올만 반응시킨 대조군에서 정상군 대비 세포생존율이 33%로 감소했다. 비교균인 LGG를 전처리했을 경우에는 82%로 세포생존율이 증가했다. LGG보다 높은 세포생존율을 보인 균주는 12종 중 2종이었다. 즉, L. plantarum CKDB008이 95%, L. salivarius CKDB001이 88% 세포생존율을 보이며 대조군과 유의적 차이를 나타내었을 뿐만 아니라 정상세포와 유사한 세포생존율을 보였다(도 2a)
3.3 회장 상피 세포주(IEC-18)에 대한 보호효과
회장 상피 세포주(IEC-18)의 경우, 에탄올만 반응시킨 대조군에서 정상군 대비 세포생존율이 59%로 감소했다. 비교균인 LGG를 전처리 했을 경우 77%로 세포생존율이 증가했다. LGG보다 높은 세포생존율을 보인 균주는 12종 중 5종이었다. 즉, B. bifidum CKDB001, L. bulgaricus CKDB001, L. fermentum CKDB004, L. helveticus CKDB001, 및 L. acidophilus CKDB007이 80% 이상의 세포생존율을 보이며 대조군과 유의적 차이를 나타내었다(도 2b)
4. 본 발명의 프로바이오틱스의 장내 염증성 사이토카인의 발현 억제 효과
본 발명의 프로바이오틱스 균주가 알코올에 의해 유도되는 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다. 염증성 사이토카인 mRNA 발형량 확인은 앞선 장 부착능 실험과 MTT assay에서 LGG보다 효과가 뛰어났던 7종 균주로 진행하였다.
4.1 실험 방법
먼저 십이지장 상피세포주(HUTU-80)와 회장 상피세포주(IEC-18)를 6 웰 세포배양 디쉬에 1Х105 cell/mL 농도로 분주하여 단일층이 될 때까지 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 프로바이오틱스는 항생제 무첨가 세포배지 DMEM에 1Х109 CFU/mL 로 희석하였다. 세포가 컨플루언시를 이루면 각 균액을 3 mL씩 세포에 분주하고 90분간 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 PBS로 두 번 세척하고, 에탄올을 포함한 세포배지를 분주하여 90분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내었다. 그 후 각 세포주로부터 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. 그리고 RT-PCR을 통해 염증성 사이토카인의 mRNA 발현량을 확인하였다. PCR분석에 사용한 유전체 염기 서열은 표 4에 기술하였다.
PCR분석에 사용한 유전체 염기 서열
세포주 유전체 Forward Reverse
HUTU-80
(Human)		 GAPDH ACCCACTCCTCCACCTTTGA CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT
IL-1β CCGACCACCACTACAGCAAG GGGCAGGGAACCAGCATCTT
TNFα CTGGGCAGGTCTACTTTGGG CTGGAGGCCCCAGTTTGAAT
IEC-18
(Rat)		 GAPDH AGTGCCAGCCTCGTCTCATA GATGGTGATGGGTTTCCCGT
IL-1β CACCTCTCAAGCAGAGCACAG GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC
TNFα GGCTTTCGGAACTCACTGGA CCCGTAGGGCGATTACAGTC
4.2 십이지장 상피 세포주(HUTU-80)에서 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 감소 효과
십이지장 상피 세포주의 경우 에탄올만 반응시킨 대조군에서 정상 대비 IL-1β mRNA 발현양이 385%, TNFα 발현양이 357% 증가했다. 비교균인 LGG를 전처리 했을 경우 IL-1β는 235%, TNFα는 257%로 감소했다. LGG보다 IL-1β 발현량을 낮춘 균주는 B. bifidum CKDB001 1종으로 155%로 감소시켰다. LGG보다 TNFα 발현량을 낮춘 균주는 B. bifidum CKDB001, L. plantarum CKDB008 2종으로 각각 130%, 142%로 감소시켰다. 따라서 7종 후보균주들 중 2종은 알코올로 인한 십이지장세포의 염증반응을 비교군인 LGG보다 더 효과적으로 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다(도 3a 및 도 3b).
4.3 회장 상피 세포주(IEC-18)에서 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 감소 효과
십이지장 상피 세포주의 경우 에탄올만 반응시킨 대조군의 경우, 정상 대비 IL-1β mRNA 발현양이 320%, TNFα 발현양이 289% 증가했다. 비교균인 LGG를 전처리 했을 경우 IL-1β는 201%, TNFα는 223%로 감소했다. LGG보다 IL-1β 발현량을 낮춘 균주는 L. bulgaricus CKDB001, L. helveticus CKDB001, L. plantarum CKDB008 3종으로 각 145%, 166%, 182%로 감소시켰다. LGG보다 TNFα 발현량을 낮춘 균주는 L. helveticus CKDB001 1종으로 191%로 감소시켰다. 따라서 7종 후보균주들 중 3종은 알코올로 인한 회장 상피세포의 염증반응을 비교군인 LGG보다 더 효과적으로 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다(도 4a 및 4b).
4.4 소결
B. bifidum CKDB001 경우 십이지장 세포주에서는 염증성 사이토카인 발현을 효과적으로 감소시킬 수 있는 것으로 나타났지만, 회장 세포주에서는 효과가 상대적으로 미비한 것으로 나타났다. L. helveticus CKDB001는 이와 반대 경향을 보였다. 따라서 이 균주들을 혼합할 경우, 서로 상호보완하여 모든 소장부위를 아우러서 항염증 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
5. 본 발명의 혼합 균주의 장내 염증성 사이토카인의 발현 억제 효과 검증
본 발명자들은 상기 4에서 선별한 각 소장 부위별 손상에 효능이 있는 균주 혼합물이 단일 균주 대비 더 효과적인지 확인하기 위하여, 본 발명의 혼합균주 (염증성 사이토카인 mRNA 발현량 억제 우수 균주 4종 : B. bifidum CKDB001, L. helveticus CKDB001, L. plantarum CKDB008, L. bulgaricus CKDB001)의 장내 염증성 사이토카인의 발현 억제 효능을 검증하였다. 실험방법은 상기 4종 혼합균주를 실험군으로 설정한 것을 제외하고는 상기 4와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
5.1 혼합 균주의 회장 상피 세포주(IEC-18)에서 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 감소 효과
회장 세포주에서 5% 에탄올만 반응시킨 대조군의 경우, 정상 대비 IL-1β mRNA 발현량이 481%로 증가했으며, 비교균인 LGG를 전처리 하였을 때 220%로 감소하는 결과를 보였다. L. helveticus CKDB001, L. plantarum CKDB008, L. bulgaricus CKDB001은 IL-1β mRNA 발현량을 각각 110%, 202%, 132%로 낮추어 LGG보다 더 효과적인 것으로 나타났으며, 4가지 균을 혼합하여 전처리한 경우 IL-1β mRNA 발현량이 103%로 현저히 낮아져 Normal과 유사한 정도를 보였다.
TNFα의 경우 5% 에탄올 처리시 정상 대비 발현량이 343%로 증가했으며, 비교균인 LGG를 전처리 하였을때 150%로 감소하는 결과를 보였다. L. helveticus CKDB001가 TNFα mRNA 발현량을 104%로 낮추어 LGG보다 더 효과적인 것으로 나타났는데, 4가지 균을 혼합하여 전처리한 경우에는 105%로 낮아져 TNFα mRNA 발현을 억제하는 효과가 매우 뛰어난 것으로 나타났다(도 5a).
5.2 혼합 균주의 십이지장 상피 세포주(HUTU-80)에서 염증성 사이토카인 mRNA 발현량 감소 효과
십이지장 세포주에서 2.5% 에탄올만 반응시킨 대조군의 경우 정상 대비 IL-1β mRNA 발현량이 427%로 증가했으며, 비교군인 LGG를 전처리 하였을 때 217%로 감소하는 결과를 보였다. B. bifidum CKDB001, L. plantarum CKDB008은 IL-1β mRNA 발현량을 각각 168%, 212%로 낮추어 LGG보다 더 효과적인 것으로 나타났으며, 4가지 균을 혼합하여 전처리한 경우 IL-1β mRNA 발현량이 150%로 현저히 낮아서 시너지 효과가 있는 것으로 나타났다.
TNFα 경우 2.5% 에탄올 처리시 정상 대비 발현량이 411%로 증가했으며, 비교군인 LGG를 전처리 하였을 때 266%로 감소하는 결과를 보였다. B. bifidum CKDB001, L. plantarum CKDB008은 mRNA 발현량을 각각 143%, 150%로 낮추어 LGG보다 더 효과적인 것으로 나타났으며, 4가지 균을 혼합하여 전처리한 경우 TNFα mRNA 발현량이 138%로 현저히 낮아서 가장 효과있는 것으로 나타났다(도 5b).
5.3 소결
본 발명자들은 상기 결과로부터 본 발명의 혼합균주가 회장 세포주, 십이지장 세포주 모두에서 단일 균주 대비 염증성 사이토카인 발현 억제에 더 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
6. 결론
알코올로 인한 장손상을 효과적으로 예방하는 프로바이오틱스 혼합물을 개발하기 위하여, 각 장을 세분화하여 부위별로 균주의 효능을 검증하였다. 총 530 종의 유산균으로부터 안전성, 안정성 및 산업화 가능성을 확인한 균주 17종을 1차 선발 하였다. 이후 우수한 장 부착능을 보유한 12종을 선발하였고, 이 중 알코올로 인한 세포생존율 저하를 개선시킬 수 있는 균주 7종을 2차 선발하였다.
마지막으로 알코올로 인해 증가되는 염증성 사이토카인 발현을 효과적으로 낮추는 균주 4종을 최종 선발하였으며, 선발된 4종의 혼합균주가 각 단일 균주 보다 알코올로 인한 장세포의 염증을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 확인하였다. 이 혼합균주는 종래 장부착능, 항염증에 효능이 있다고 검증된 LGG 균보다 탁월한 효과를 나타낸다는 점에서 발굴이라고 할 수 있다.
또한 기존 대다수 연구들이 알코올로 의한 간 손상을 예방 및 치료하는 연구이며, 혈중 알코올 농도 측정, 간 내 염증반응 및 조직학적 결과를 확인하는 루틴한 방식을 활용한 반면, 이번 연구에서는 장관의 각 부위별에서 손상정도, 염증반응 완화을 확인함으로써 장관부위 모두를 아울러 알코올성 장손상을 예방할 수 있는 연구를 진행했다는 점에서 의의가 있다.
한국생명공학연구원 KCTC13669BP 20181023 한국생명공학연구원 KCTC13670BP 20181023 한국생명공학연구원 KCTC13673BP 20181023 한국생명공학연구원 KCTC13114BP 20160923
<110> CKD Bio Corp <120> Composition for Preventing or Treating Alcoholic Intestinal Damage Comprising Probiotics as Effective Ingredients <130> PN180323 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1465 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA of L. bulgaricus CKDB001(KCTC13669BP) <400> 1 gtttgaatca tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga 60 gctgaattca aagatccctt cggggtgatt tgttggacgc tagcggcgga tgggtgagta 120 acacgtgggc aatctgccct aaagactggg ataccacttg gaaacaggtg ctaataccgg 180 ataacaacat gaatcgcatg attcaagttt gaaaggcggc gcaagctgtc actttaggat 240 gagcccgcgg cgcattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcaa tgatgcgtag 300 ccgagttgag agactgatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga 360 ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt 420 gaagaaggtc ttcggatcgt aaagctctgt tgttggtgaa gaaggataga ggcagtaact 480 ggtctttatt tgacggtaat caaccagaaa gtcacggcta actacgtgcc agcagccgcg 540 gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcgga 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CKDB008(KCTC13673BP) <400> 3 gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgaacgaac tctggtattg 60 attggtgctt gcatcatgat ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg 120 gaaacctgcc cagaagcggg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac 180 ttggaccgca tggtccgagc ttgaaagatg gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc 240 ggcgtattag ctagatggtg gggtaacggc tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg 300 agagggtaat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag 360 tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg 420 gtttcggctc gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt 480 attgacggta tttaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540 taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag 600 tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt 660 gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac 720 accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agtatgggta 780 gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct 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120 ccggaatagc tcctggaaac gggtggtaat gccggatgtt ccacatgatc gcatgtgatt 180 gtgggaaaga ttctatcggc gtgggatggg gtcgcgtcct atcagcttgt tggtgaggta 240 acggctcacc aaggcttcga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acattgggac 300 tgagatacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca 360 agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat ggaggccttc gggttgtaaa cctcttttgt 420 ttgggagcaa gccttcgggt gagtgtacct ttcgaataag cgccggctaa ctacgtgcca 480 gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttatccggat ttattgggcg taaagggctc 540 gtaggcggct cgtcgcgtcc ggtgtgaaag tccatcgctt aacggtggat ctgcgccggg 600 tacgggcggg ctggagtgcg gtaggggaga ctggaattcc cggtgtaacg gtggaatgtg 660 tagatatcgg gaagaacacc gatggcgaag gcaggtctct gggccgtcac tgacgctgag 720 gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt 780 ggacgctgga tgtggggcac gttccacgtg ttccgtgtcg gagctaacgc gttaagcgtc 840 ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagaa attgacgggg gcccgcacaa 900 gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg gcttgacatg 960 ttcccgacga cgccagagat ggcgtttccc ttcggggcgg gttcacaggt ggtgcatggt 1020 cgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgcc 1080 ccgtgttgcc agcacgttat ggtgggaact cacgggggac cgccggggtt aactcggagg 1140 aaggtgggga tgacgtcaga tcatcatgcc ccttacgtcc agggcttcac gcatgctaca 1200 atggccggta cagcgggatg cgacatggcg acatggagcg gatccctgaa aaccggtctc 1260 agttcggatc ggagcctgca acccggctcc gtgaaggcgg agtcgctagt aatcgcggat 1320 cagcaacgcc gcggtgaatg cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc aagtcatgaa 1380 agtgggcagc acccgaagcc ggtggcctaa ccccttgtgg gatggagccg tctaag 1436 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human GAPDH <400> 5 acccactcct ccacctttga 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human GAPDH <400> 6 ctgttgctgt agccaaattc gt 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human IL-1 beta <400> 7 ccgaccacca ctacagcaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human IL-1 beta <400> 8 gggcagggaa ccagcatctt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of human TNF alpha <400> 9 ctgggcaggt ctactttggg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of human TNF alpha <400> 10 ctggaggccc cagtttgaat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of rat GAPDH <400> 11 agtgccagcc tcgtctcata 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of rat GAPDH <400> 12 gatggtgatg ggtttcccgt 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of rat IL-1 beta <400> 13 cacctctcaa gcagagcaca g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of rat IL-1 beta <400> 14 gggttccatg gtgaagtcaa c 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of rat TNF alpha <400> 15 ggctttcgga actcactgga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of rat TNF alpha <400> 16 cccgtagggc gattacagtc 20

Claims (10)

  1. 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 유산균, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 알코올성 장손상, 장염, 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 유산균 조성물에 있어서,
    상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13669B), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13670BP), 또는 이들의 조합이고; 및
    상기 비피도박테리움 속 유산균은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호 KCTC13114BP)인, 유산균 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CKDB008 (수탁번호: KCTC13673BP)을 추가적으로 포함하는 것인, 유산균 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13669B), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CKDB001 (수탁번호: KCTC13670BP), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CKDB008 (수탁번호: KCTC13673BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호 KCTC13114BP), 또는 이들의 혼합 균주를 포함하는 것인, 유산균 조성물.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 장은 소장인, 유산균 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 크론병, 베체트병, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유산균 조성물.

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021172900A1 (ko) * 2020-02-26 2021-09-02 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2022169337A1 (ko) 2021-02-08 2022-08-11 주식회사 리스큐어바이오사이언시스 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20220114490A (ko) 2021-02-08 2022-08-17 주식회사 리스큐어바이오사이언시스 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20230153702A (ko) * 2022-04-29 2023-11-07 한림대학교 산학협력단 락토바실러스 헬베티커스 ckdb001 균주를 포함하는 알코올성 간질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111603490B (zh) * 2020-06-30 2022-06-10 江南大学 一种用于预防和/或治疗酒精性肠道损伤的药品

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040110270A1 (en) * 2002-12-05 2004-06-10 Veronique Dennin Bacterial composition and its use
JP2004250338A (ja) * 2003-02-18 2004-09-09 Sunstar Inc 有用生菌製剤
KR20130036939A (ko) 2011-10-05 2013-04-15 이정민 꾸지뽕나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 알콜성 위장관질환의 예방 및 치료용 조성물
KR101772810B1 (ko) 2016-03-28 2017-08-29 영남대학교 산학협력단 시금장 메주 추출물을 유효성분으로 함유하는 알콜성 위장질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101782848B1 (ko) 2016-12-16 2017-09-29 한국 한의학 연구원 백편두 추출물을 유효성분으로 함유하는 숙취해소 및 알코올성 위장질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101819026B1 (ko) 2016-08-12 2018-01-18 농업회사법인 제주바이오팜 주식회사 제주도 자생식물 발효물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 위 손상 억제, 알코올 흡수 억제 또는 숙취 해소용 조성물

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2787544C (en) * 2010-01-28 2019-07-09 Ab-Biotics S.A. Probiotic composition for use in the treatment of bowel inflammation
US8853269B2 (en) * 2010-02-04 2014-10-07 Copperhead Chemical Company Inc. Composition and method for treating infections and promoting intestinal health

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040110270A1 (en) * 2002-12-05 2004-06-10 Veronique Dennin Bacterial composition and its use
JP2004250338A (ja) * 2003-02-18 2004-09-09 Sunstar Inc 有用生菌製剤
KR20130036939A (ko) 2011-10-05 2013-04-15 이정민 꾸지뽕나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 알콜성 위장관질환의 예방 및 치료용 조성물
KR101772810B1 (ko) 2016-03-28 2017-08-29 영남대학교 산학협력단 시금장 메주 추출물을 유효성분으로 함유하는 알콜성 위장질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101819026B1 (ko) 2016-08-12 2018-01-18 농업회사법인 제주바이오팜 주식회사 제주도 자생식물 발효물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 위 손상 억제, 알코올 흡수 억제 또는 숙취 해소용 조성물
KR101782848B1 (ko) 2016-12-16 2017-09-29 한국 한의학 연구원 백편두 추출물을 유효성분으로 함유하는 숙취해소 및 알코올성 위장질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Won-Gyeong Kim 외 4명. Food Funct. pp.4255~4265. (2018.9)* *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021172900A1 (ko) * 2020-02-26 2021-09-02 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20210108900A (ko) * 2020-02-26 2021-09-03 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
JP2023516268A (ja) * 2020-02-26 2023-04-19 ジーアイ バイオーム ラクトバチルス・ヘルベティカス株及びそれを含む炎症性疾患を予防又は処置するための組成物
KR102544149B1 (ko) * 2020-02-26 2023-06-16 주식회사 지아이바이옴 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 및 이를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
TWI842979B (zh) * 2020-02-26 2024-05-21 南韓商Ｇｉ生物群系公司 瑞士乳酸桿菌菌株及含有其之用於預防或治療發炎性疾病的組成物
AU2021229110B2 (en) * 2020-02-26 2024-05-23 Gi Biome Lactobacillus Helveticus strain and composition containing same for prevention or treatment of inflammatory diseases
JP7685510B2 (ja) 2020-02-26 2025-05-29 ジーアイ バイオーム ラクトバチルス・ヘルベティカス株及びそれを含む炎症性疾患を予防又は処置するための組成物
WO2022169337A1 (ko) 2021-02-08 2022-08-11 주식회사 리스큐어바이오사이언시스 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20220114490A (ko) 2021-02-08 2022-08-17 주식회사 리스큐어바이오사이언시스 류코노스톡 시트래움 균주를 유효성분으로 포함하는 장 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20230153702A (ko) * 2022-04-29 2023-11-07 한림대학교 산학협력단 락토바실러스 헬베티커스 ckdb001 균주를 포함하는 알코올성 간질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물
KR102626672B1 (ko) 2022-04-29 2024-01-18 한림대학교 산학협력단 락토바실러스 헬베티커스 ckdb001 균주를 포함하는 알코올성 간질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물

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