KR102038450B1 - 멀티좀: 앤캡슐화된 액적 네트워크 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소수성 매체의 방울; 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및 상기 주변층 내에 수성 액적을 포함하며, 상기 수성 액적은: (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하는 앤캡슐화 액적을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 앤캡슐화 액적을 제조하는 공정을 제공한다. 상기 앤캡슐화 액적의 다양한 용도는 또한, 약물 전달 비히클, 합성 생물제제, 및 막 단백질의 연구에 이들의 용도를 포함하여, 기재된다.
Description
본 발명은 앤캡슐화 액적 (이하 "멀티좀 (multisomes)"이라 한다), 및 상기 앤캡슐화 액적 (droplet encapsulate)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 앤캡슐화 액적을 제조하는 공정을 제공한다. 합성 생물제제 (biology), 및 막 단백질의 연구에서, 약물 전달 비히클 (vehicles)로서 상기 앤캡슐화 액적의 사용을 포함하는, 이들의 다양한 용도는 또한 기재된다.
오일 내의 지질의 용액으로 제조된 수성 액적은 지질 단분자층 코팅을 획득하고, 두 개의 이러한 액적은, 소위 액적 계면 이중층 (droplet interface bilayer) (DIB)이라 불리는, 이들의 계면에서 지질 이중층을 형성하기 위해 접촉시킨다 (Funakoshi, K. et al. Anal. Chem. 78, 8169-8174 (2006); Holden, M. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007)). 유사하게, 평평한 하이드로겔 지지체 (flat hydrogel support)는 하이드로겔-상-액적 (droplet-on-hydrogel) 이중층 (DHB)을 형성하기 위해 상기 액적 중 하나를 대신하여 사용될 수 있다 (Heron, A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 16042-16047 (2007)). DIBs and DHBs는 단일 막 단백질에 대한 전기 또는 광학 측정을 위해 매우 안정한 플랫폼을 제공해왔다 (Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007); Heron, A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 16042-16047 (2007); Syeda, R. et al., J. Am. Chem. Soc.130, 15543-15548 (2008); Heron, A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 131, 1652-1653 (2009)). 생물물리학 측정에서 개개의 계면 이중층의 활용 외에, DIB에 연결된 액적의 기능적 네트워크는 광 센서, 건전지, 및 전기 장치로서 작용하기 위해 다양한 막 펌프, 채널, 및 기공을 활용하도록 구성될 수 있다 (Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007); Maglia, G. et al. Nat. Nanotechnol. 4, 437-440 (2009)). 액적 네트워크가 기능적 장치를 만들기 위한 수단을 제공하는 반면, 이들은 생리학적 및 다른 수성 환경에서 이들의 사용을 불가능하게 하는, 중요 제약으로부터 고통받아 왔는데, 즉, 상기 액적은 벌크 오일 상에 의해 반드시 감싸여 있어야 한다.
본 발명자들은 벌크 오일 상 (bulk oil phase)을 요구하지 않고, 수성 및 다른 친수성 (hydrophilic) 환경에서 안정한 앤캡슐화된 수성 액적 네트워크를 제공한다. 양쪽친화성 (amphiphilic) 분자에 의해 결합된, 수성 액적 및 액적 네트워크는 소수성 (hydrophobic) 매체의 작은 방울 내에 이들을 앤캡슐화시켜 안정화된다. 최종 앤캡슐화 액적 (본 명세서에 또한 "멀티좀"이라 한다)은 막 단백질을 통해 외부 환경과 소통할 수 있다. 부가하여, 막 단백질은 서로 소통하기 위해 동일한 멀티좀 내에 다중 액적을 허용한다. 이것은 이론적으로 이들의 환경을 감지하고, 정보를 처리하며, 및 경우에 따라 주변에 물질을 전달하도록 멀티좀을 허용한다. 동일한 앤캡슐화 액적 내에 다중 액적은 또한, 예를 들어, 약물의 조합적 전달을 위한 유용한 방법을 제공하는, pH의 감소 또는 온도의 증가 이후에, 동시에 환경으로 이들의 내용물을 방출할 수 있다. 멀티좀의 또 다른 적용는 "버텀-업 (bottom-up)" 합성 생물제제를 위한 다-구획 원세포의 섀시 (multi-compartment protocellular chassis)로 작용하는데, 막 단백질의 기초적 연구를 위한 새로운 플랫폼을 제공하는 단계에 이르기까지 다양하다.
따라서, 제1 관점에서, 본 발명은 하기를 포함하는 앤캡슐화 액적을 제공한다:
- 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 (amphipathic) 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적을 포함하며, 상기 수성 액적은: (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함한다.
상기 주변 및 외부층들은 상기 수성 액적 및 상기 주변층 사이 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 함께 형성할 수 있다.
제2 관점에 있어서, 본 발명은 앤캡슐화 액적의 제조공정을 제공하고, 상기 앤캡슐화 액적은:
- 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적을 포함하며, 상기 수성 액적은: (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며;
상기 공정은:
(a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하는 수성 액적을,
그것의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층을 갖는 소수성 매체의 방울로 이송시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 전술된 바와 같이 본 발명의 제2 관점의 공정에 의해 얻어질 수 있는 앤캡슐화 액적을 더욱 제공한다.
제3 관점에 있어서, 본 발명은 앤캡슐화 액적의 제조공정을 제공하고, 상기 앤캡슐화 액적은:
- 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적을 포함하며, 상기 수성 액적은: (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며;
상기 공정은:
(i) 비-중합체 양친매성 분자의 존재하에서, 친수성 담체로 소수성 매체의 방울을 도입시키는 단계로, 이에 의해 소수성 매체의 방울 및 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층을 제조하며;
(ii) 상기 비-중합체 양친매성 분자의 존재하에서, 소수성 매체로 수성 매체의 방울을 도입시키는 단계로, 이에 의해 상기 소수성 매체 내에 수성 액적을 제조하고, 상기 수성 액적은: (a) 상기 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며;
여기서 단계 (i) 및 (ii)는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있고; 그리고
(iii) 단계 (ii)에서 제조된 수성 액적을 단계 (i)에서 제조된 상기 소수성 매체의 방울로 이송시키는 단계를 포함하며, 이에 의해 상기 앤캡슐화 액적을 제조한다.
본 발명은 전술된 바와 같은 발명의 제3 관점의 공정에 의해 얻어질 수 있는 앤캡슐화 액적을 더욱 제공한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은, 예로서, 연속 전단 (consecutive shearing) 또는 유체집속 (flowfocusing) 미세유체 장치를 사용할 수 있는, 미세유체 (microfluidic) 기술을 사용하여 또한 제조될 수 있다.
따라서, 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 앤캡슐화 액적의 제조하는 공정을 제공하고, 상기 공정은:
(i) 미세유체 장치의 수성 매체를 함유하는 제1 채널로부터 상기 수성 매체의 액적을 상기 미세유체 장치의 소수성 매체를 함유하는 제2 채널로 도입시키는 단계,
여기서 상기 제1 채널에서 수성 매체, 또는 상기 제2 채널에서 소수성 매체, 또는 이들 모두는, 비-중합체 양친매성 분자를 더욱 포함하고,
(ii) 상기 제2 채널로부터의, 수성 액적을 포함하는 소수성 매체의 방울을 상기 미세유체 장치의 친수성 담체를 함유하는 제3 채널로 도입시키는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 제2 채널에서 소수성 매체, 또는 상기 제3 채널에서 친수성 담체 또는 이들 모두는, 비-중합체 양친매성 분자를 더욱 포함하고,
이에 의해 상기 제3 채널에서 상기 친수성 담체 내에 앤캡슐화 액적을 제조하며, 상기 앤캡슐화 액적은:
- 상기 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적을 포함한다.
본 발명은 전술된 바와 같은 본 발명의 또 다른 관점의 공정에 의해 얻어질 수 있는 앤캡슐화 액적을 더욱 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적, 및 친수성 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 발명의 복수의 앤캡슐화 액적 및 상기 친수성 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 하나 이상의 생물활성제 (bioactive agent), 예를 들어, 치료 및/또는 진단 시약을 포함할 수 있고, 전술된 바와 같이, 약물 전달 비히클로서 유용하다.
따라서, 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은, 요법에 의해 사람 또는 동물체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 치료제를 더욱 포함하는. 전술된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적을 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은, 사람 또는 동물체에 실행되는 진단 방법에서 사용하기 위한, 진단 시약을 더욱 포함하는, 전술된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적을 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 전술된 바와 같이 본 발명의 조성물을 제공하며, 여기서 상기 앤캡슐화 액적은 요법에 의해 사람 또는 동물체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 치료제를 더욱 포함한다.
또한 전술된 바와 같은 본 발명의 조성물은 제공되며, 여기서 상기 앤캡슐화 액적은 사람 또는 동물체에 실행된 진단 방법에 사용하기 위한, 진단 시약을 더욱 포함한다.
멀티좀의 또 다른 적용은 막 단백질의 기초적 연구를 위한 플랫폼을 제공하는 것을 포함한다. 하기에 더욱 설명될 바와 같이, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 포함할 수 있다. 특히, 상기 앤캡슐화에서 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하기 위해 주변층과 접촉할 수 있다. 부가적으로 또는 선택적으로, 하나 이상의 수성 액적은 상기 앤캡슐에 존재할 수 있고, 하나의 수성 액적의 외부층의 일부는 두개의 액적들 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하기 위해 또 다른 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉할 수 있다. 또한, 하나 이상의 수성 액적은 상기 주변층으로 이중층을 형성할 수 있다. 이러한 방식에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 비-중합체 양친매성 분자의 하나 이상의 이중층을 포함할 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 앤캡슐화 액적은 비-중합체 양친매성 분자의 다중 이중층을 포함한다. 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 상기 이중층 또는 각각의 이중층은 하나 이상의 막 단백질을 수용할 수 있고, 따라서 본 발명의 앤캡슐화 액적은, 예를 들어, 단백질 기공, 단백질 채널, 또는 단백질 펌프, 수용체, 및 세포 인식 또는 세포간 상호작용에 영향을 미치는 단백질을 포함하는, 막 단백질의 기초적 연구를 위한 유용한 플랫폼을 제공할 수 있다. 상기 앤캡슐에서 상기 이중층 또는 각각의 이중층들은 복수의 막 단백질, 예를 들어, 동일한 막 단백질의 다중 복제물 (multiple copies) 또는 둘 이상의 다른 부류의 막 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 막 단백질의 연구를 위한 조사 도구로서 전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
본 발명은 막 단백질을 조사 및/또는 검사하는 방법에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 더욱 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 막 단백질과 상호작용하는 검체 (analyte)를 조사 및/또는 검사하기 위한 방법에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 조사 및/또는 검사하는 방법에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 두 개의 이중층에 걸치는 막 단백질 복합체를 조사 및/또는 검사를 위한, 전술된 바와 같이 본 발명의 제1 앤캡슐화 액적 및 전술된 본 발명의 제2 앤캡슐화 액적의 용도를 제공하고, 여기서, 각각의 제1 및 제2 앤캡슐화 액적에서, 상기 수성 액적은 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하고, 및 여기서 상기 제1 및 제2 앤캡슐화 액적은 상기 제1 앤캡슐화 액적의 이중층 및 상기 제2 앤캡슐화 액적의 이중층이 나란히 놓이도록 배치되고, 여기서 막 당백질 복합체는 상기 두 개의 덧붙인 이중층에 걸친다.
막 단백질 및 다중 액적을 사용하여, 멀티좀은, 도 1a에서 예시된 바와 같이, 이들의 환경을 감지하고, 정보를 처리하며, 및 경우에 따라 주변으로의 물질을 전달할 수 있다.
따라서, 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 상기 앤캡슐 내의 액적들 사이에서 분자를 트레피킹 (trafficking)하기 위한 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 앤캡슐 내의 액적으로부터의 분자를 외부 환경으로 전달하기 위해 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 앤캡슐화된 액적 및 환경 사이에 물질을 교환하기 위한 전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 센서로서 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다. 예를 들어, 상기 앤캡슐화 액적은 표적 검체 (target analyte)의 존재에 대한 센서 또는 광센서로서 사용될 수 있다.
액적의 네트워크는 광센서, 건전지, 및 전자 장치로서 작용하는데 다양한 막 펌프, 채널, 및 기공을 이용하도록 멀티좀 내에 구성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 센서, 건전지, 또는 전자 장치로서 전술된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적을 포함하는, 센서, 건전지, 또는 전자 장치는 더욱 제공된다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 "버텀-업" 합성 생물제제를 위한 다-구획 원세포의 섀시로서 또한 작용할 수 있다.
따라서, 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 합성 생물제제에서 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 합성 생물제제에서 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 원세포를 제조하는데 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 원세포의 군집체를 제조하는데 전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 또한 제공한다. 원세포의 군집체는 또한 원조직 (prototissue)이라 한다.
원세포를 제조하는데 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도는 더욱 제공된다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 원세포의 군집체를 제조하는데 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 원세포의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은:
상기에서 정의된 바와 같은 앤캡슐화 액적을 제공하는 단계; 및
상기 수성 액적의 외부층을 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과의 접촉 상태를 허용하는 단계, 또는 상기 수성 액적의 외부층을 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 상기 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시킨다.
이중층 형성은 본 발명의 앤캡슐화 액적로부터 소수성 매체의 일부 또는 전부를 제거시켜 선택적으로 도움을 받을 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 원세포를 제조하기 위한 방법은: 비-중합체 양친매성 분자의 주변층이 상기 수성 액적의 외부층에 들러붙고, 이에 의해 상기 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하도록, 전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적로부터 상기 소수성 매체의 일부 또는 전부를 제거하는 단계를 포함한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 원세포를 제조하는데 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 원세포를 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적을 포함하는 원세포를 제공하고, 여기서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층은 상기 수성 액적의 외부층과 접촉하고, 이에 의해 상기 수성 액적의 일부 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 원조직을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 상기 원조직은 원세포의 군집체를 포함하며, 상기 방법은:
복수의 수성 액적을 포함하는 전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적을 제공하는 단계; 및
상기 수성 액적의 외부층을 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과의 접촉 상태를 허용하는 단계, 또는 상기 수성 액적의 외부층을 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 상기 복수의 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시킨다.
이중층 형성은 본 발명의 앤캡슐화 액적로부터 소수성 매체의 일부 또는 전부를 제거하여 선택적으로 도움받을 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 원조직을 제조하기 위한 방법은: 상기 비-중합체 양친매성의 주변층이 수성 액적의 외부층에 들러붙고, 이에 의해 복수의 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하도록, 복수의 수성 액적을 포함하는 전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적로부터 상기 소수성 매체의 일부 또는 전부를 제거하는 단계를 포함한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 원조직을 제조하기 위해 전술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 원조직을 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 앤캡슐화 액적이 복수의 수성 액적을 포함하는, 전술된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적을 포함하는 원조직을 제공하고, 여기서 상기 비-중합체 양친매성의 주변층이 상기 수성 액적의 외부층과 접촉하며, 이에 의해 복수의 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 복수의 원세포를 포함하는 원조직을 제공한다.
도 1a-e는 본 발명의 멀티좀의 개략적 설명을 함유하는 사진이다. 따라서, 도 1a는 오일 액적에서 앤캡슐화된 수성 액적을 나타내는 개략적인 예시이고; 상기 수성 액적은 막 단백질, 예를 들어, 단백질 기공, 채널 또는 펌프를 통해 네트워크 내에 소통을 허용하는, 지질 이중층에 의해 서로 분리되며; 이중층은 또한 상기 벌크 용액과 소통하는 네트워크를 가능하도록 상기 오일 액적으로부터 돌출되어 수성 액적의 표면에 존재한다. 도시된 멀티좀은 이의 환경을 감지, 정보를 처리, 및 그 다음 경우에 따라 상기 환경으로 물질을 전달할 수 있다. 감지 및 전달 능력은 본 명세세의 실시 예에서 입증된다.
도 1b는 본 발명의 멀티좀 내의 상기 지질 단분자층 및 이중층을 예시하는, 앤캡슐화된 두 개의 액적 네트워크의 개략적 예시이다.
도 1c, 1d 및 1e는 각각 하나, 둘, 및 세 개의 내부 액적을 함유하는 멀티좀의 사진이다. 상기 오일 액적은 확장된 연구를 허용하도록 와이어 루프 (wire loop) 상에 현탁된다. 상기 수성 액적은 25 μM 설포로다민 (sulforhodamine) 101 (적색) 또는 플루오레세인 (fluorescein) (초록색)으로 염색된다. 스케일 바 (Scale bar)는 400 ㎛을 나타낸다.
도 2a는 수평선에 대하여, 앤캡슐화된 액적에 대한 접촉각 θ1, θ2 및θ3의 정의를 나타내고, 이의 기하학은 실시 예 1에 기재한 바와 같이 컴퓨터로 계산된다.
도 2b는 실시 예 1에 제공된 파라미터 값에 대한 접촉각 θ2 및θ3의 함수에 따른 이중층 형성의 계산된 자유 에너지를 나타낸다. 화살표는 최대 경사 (steepest descent)의 방향을 나타낸다. 적색 원에 의해 표시된 지역 (landscape)의 아홉 점에서 앤캡슐화된 액적의 기하학은 각 점에 인접하게 예시된다. 별표에 의한 지역에 표시된, 계산에 의해 결정된 가장 안정한 상태는, 도 2a에 묘사된다.
도 3은 스타필로로컬 (staphylococcal) α-헤몰리신 (hemolysin) (αHL) 기공을 통한 이온 전류의 측정에 관련된다. 따라서, 도 3a는 상기 이중층에 삽입된 αHL 기공을 통해, 앤캡슐화된 액적 및 벌크 수성 용액 사이를 흐르는 이온 전류의 측정의 개략적인 예시이다.
도 3b는 상기 벌크 수성 용액으로부터 상기 앤캡슐화된 액적을 분리하는 이중층으로 야생형 (WT) αHL 기공의 연속적 삽입을 나타내는 전류의 계단식 증가를 나타낸다. (상기 전류 히스토그램에서 피크와 상응하는) 상기 전류 수준은 단일 αHL 기공에 대해 예상된 전류인, 18.6 ± 0.8 pA (평균 ±s.d., n = 16)로 분리된다. 오직 상기 데이터의 샘플은 도시된다. 측정은 500 mM KCl에서 +50 mV으로 수행된다.
도 3c는 벌크 용액에 ~10 μM γ-시클로덱스트린 (cyclodextrin) (γCD)을 첨가한 후 단일 WT αHL 기공의 전류 차단 (current blockade)을 나타낸다. 비어있는 기공의 전류 수준, γCD 결합을 갖는 기공, 및 0 전류 수준을 나타낸다. 상기 γCD 전류 차단은 이전 연구와 일치하는 63.7 ±2.0% (평균 ±s.d., n = 673)의 진폭 (amplitude), 및 4.0 ±0.6 s-1 (평균 ±s.d.)의 해리도 (dissociation rate)를 갖는다. 오직 상기 데이터의 샘플은 도시된다. 측정은 1 M KCl에서 -50 mV로 수행된다.
도 4는 αHL 기공을 통한 확산에 의한 소통에 관련된다. 따라서, 도 4a는 동일한 벌크 용액에서, 각각 단일 내부 액적을 갖는, 두 개의 멀티좀의 형광 측정의 결과를 나타낸다. 내부 액적들 모두는 덱스트란-접합 플로우 (fluo)-4를 함유하고, 하나는 αHL을 함유한다. 상기 오일 및 내부 액적의 윤곽을 나타내며, 이들은 사진에서 볼 수 없고, '오일' 및 '염료'로 각각 표지된다. 상기 외부 용액으로 Ca2 +를 첨가한 후에, 형광물질에서 증가는 αHL을 함유하는 액적에서 관찰되는 반면, 형광물질은 단백질이 없는 액적에 대해 무시할정도로 남는다. 스케일 바는 300 ㎛을 나타낸다.
도 4b는 앤캡슐화된 두 개의 액적 네트워크의 형광 측정의 결과를 나타내고, 여기서 하나의 액적은 Ca2 +를 함유하고, 다른 하나는 덱스트란-접합 플로우-4 및αHL를 함유하며; 이들 액적은 각각 'Ca2 +',및 '염료'로 표지된다. 형광물질의 증가는 염료-함유 액적에서만 관찰된다. 스케일 바는 300 ㎛를 나타낸다.
도 5는 pH-의존 전달에 관련된다. 따라서, 도 5a는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 올레산 (OA)의 혼합물로 제조된 앤캡슐화된 두 개의-액적 네트워크의 pH 민감도를 입증하는 실험의 개략적인 예시이다. 하나의 액적은 Ca2 +를 함유하고, 다른 하나는 덱스트란-접합 플로우-4를 함유한다. 8.0로부터 5.5로 상기 외부 수성 완충제의 pH를 낮춤에 따라, 액적들 모두는 형광 신호를 생산하기 위해 혼합되고, 상기 벌크 수성 용액으로 이들의 내용물을 방출하여, 파열된다.
도 5b는 도 5a에서 예시된 실험으로부터 형광 측정의 결과를 나타낸다. Ca2+ 또는 플로우-4를 함유하는, 오일 및 내부 액적은 윤곽을 나타내며, 각각 "오일','Ca2 +',및 '염료'로 표지된다. 상기 외부 용액의 pH를 낮춘 후, 액적들 모두는 동시에 파열된다. 이것은 먼저 상기 염료 액적의 내용물이 희석됨에 따라, 형광 강도 (intensity)에서 다소 감소를 유발하고, 그 다음 플로우-4 용액이 Ca2 + 용액과 혼합됨에 따라 강도에서 급속한 증가를 유발한다. 최종적으로, 상기 강도는 상기 혼합물이 벌크 수성 상으로 희석됨에 따라 감소한다. 스케일 바는 500 ㎛을 나타낸다.
도 6은 온도-의존 전달에 관련된다. 따라서, 도 6a는 온도 램프에 적용된 단일 내부 액적을 갖는 멀티좀의 파열 온도를 나타낸다 (상부: 온도가 ~1 ℃ min-1의 속도로 실온으로부터 증가된다; 하부: 파열하는 온도의 히스토그램). 상기 파열 온도는 35 ℃ 이하에서 파열하는 세 개의 멀티좀을 배제하고는, 43.6 ±3.5 ℃ (평균 ±s.d., n = 93)이다.
도 6b는 37.2 ±0.4 ℃의 일정한 온도로 유지된 단일 내부 액적을 갖는 멀티좀의 파열하는 횟수를 나타낸다. 상부 개략도는 온도 프로파일을 제공한다. 하부 그래프는 이러한 온도 (n = 46)에서 적어도 30분 동안 생존된 93%의 멀티좀을 나타내는, 37 ℃에 도달한 30분 내에서 파열하는 멀티좀의 비율을 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 멀티좀 내의 상기 지질 단분자층 및 이중층을 예시하는, 앤캡슐화된 두 개의 액적 네트워크의 개략적 예시이다.
도 1c, 1d 및 1e는 각각 하나, 둘, 및 세 개의 내부 액적을 함유하는 멀티좀의 사진이다. 상기 오일 액적은 확장된 연구를 허용하도록 와이어 루프 (wire loop) 상에 현탁된다. 상기 수성 액적은 25 μM 설포로다민 (sulforhodamine) 101 (적색) 또는 플루오레세인 (fluorescein) (초록색)으로 염색된다. 스케일 바 (Scale bar)는 400 ㎛을 나타낸다.
도 2a는 수평선에 대하여, 앤캡슐화된 액적에 대한 접촉각 θ1, θ2 및θ3의 정의를 나타내고, 이의 기하학은 실시 예 1에 기재한 바와 같이 컴퓨터로 계산된다.
도 2b는 실시 예 1에 제공된 파라미터 값에 대한 접촉각 θ2 및θ3의 함수에 따른 이중층 형성의 계산된 자유 에너지를 나타낸다. 화살표는 최대 경사 (steepest descent)의 방향을 나타낸다. 적색 원에 의해 표시된 지역 (landscape)의 아홉 점에서 앤캡슐화된 액적의 기하학은 각 점에 인접하게 예시된다. 별표에 의한 지역에 표시된, 계산에 의해 결정된 가장 안정한 상태는, 도 2a에 묘사된다.
도 3은 스타필로로컬 (staphylococcal) α-헤몰리신 (hemolysin) (αHL) 기공을 통한 이온 전류의 측정에 관련된다. 따라서, 도 3a는 상기 이중층에 삽입된 αHL 기공을 통해, 앤캡슐화된 액적 및 벌크 수성 용액 사이를 흐르는 이온 전류의 측정의 개략적인 예시이다.
도 3b는 상기 벌크 수성 용액으로부터 상기 앤캡슐화된 액적을 분리하는 이중층으로 야생형 (WT) αHL 기공의 연속적 삽입을 나타내는 전류의 계단식 증가를 나타낸다. (상기 전류 히스토그램에서 피크와 상응하는) 상기 전류 수준은 단일 αHL 기공에 대해 예상된 전류인, 18.6 ± 0.8 pA (평균 ±s.d., n = 16)로 분리된다. 오직 상기 데이터의 샘플은 도시된다. 측정은 500 mM KCl에서 +50 mV으로 수행된다.
도 3c는 벌크 용액에 ~10 μM γ-시클로덱스트린 (cyclodextrin) (γCD)을 첨가한 후 단일 WT αHL 기공의 전류 차단 (current blockade)을 나타낸다. 비어있는 기공의 전류 수준, γCD 결합을 갖는 기공, 및 0 전류 수준을 나타낸다. 상기 γCD 전류 차단은 이전 연구와 일치하는 63.7 ±2.0% (평균 ±s.d., n = 673)의 진폭 (amplitude), 및 4.0 ±0.6 s-1 (평균 ±s.d.)의 해리도 (dissociation rate)를 갖는다. 오직 상기 데이터의 샘플은 도시된다. 측정은 1 M KCl에서 -50 mV로 수행된다.
도 4는 αHL 기공을 통한 확산에 의한 소통에 관련된다. 따라서, 도 4a는 동일한 벌크 용액에서, 각각 단일 내부 액적을 갖는, 두 개의 멀티좀의 형광 측정의 결과를 나타낸다. 내부 액적들 모두는 덱스트란-접합 플로우 (fluo)-4를 함유하고, 하나는 αHL을 함유한다. 상기 오일 및 내부 액적의 윤곽을 나타내며, 이들은 사진에서 볼 수 없고, '오일' 및 '염료'로 각각 표지된다. 상기 외부 용액으로 Ca2 +를 첨가한 후에, 형광물질에서 증가는 αHL을 함유하는 액적에서 관찰되는 반면, 형광물질은 단백질이 없는 액적에 대해 무시할정도로 남는다. 스케일 바는 300 ㎛을 나타낸다.
도 4b는 앤캡슐화된 두 개의 액적 네트워크의 형광 측정의 결과를 나타내고, 여기서 하나의 액적은 Ca2 +를 함유하고, 다른 하나는 덱스트란-접합 플로우-4 및αHL를 함유하며; 이들 액적은 각각 'Ca2 +',및 '염료'로 표지된다. 형광물질의 증가는 염료-함유 액적에서만 관찰된다. 스케일 바는 300 ㎛를 나타낸다.
도 5는 pH-의존 전달에 관련된다. 따라서, 도 5a는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 올레산 (OA)의 혼합물로 제조된 앤캡슐화된 두 개의-액적 네트워크의 pH 민감도를 입증하는 실험의 개략적인 예시이다. 하나의 액적은 Ca2 +를 함유하고, 다른 하나는 덱스트란-접합 플로우-4를 함유한다. 8.0로부터 5.5로 상기 외부 수성 완충제의 pH를 낮춤에 따라, 액적들 모두는 형광 신호를 생산하기 위해 혼합되고, 상기 벌크 수성 용액으로 이들의 내용물을 방출하여, 파열된다.
도 5b는 도 5a에서 예시된 실험으로부터 형광 측정의 결과를 나타낸다. Ca2+ 또는 플로우-4를 함유하는, 오일 및 내부 액적은 윤곽을 나타내며, 각각 "오일','Ca2 +',및 '염료'로 표지된다. 상기 외부 용액의 pH를 낮춘 후, 액적들 모두는 동시에 파열된다. 이것은 먼저 상기 염료 액적의 내용물이 희석됨에 따라, 형광 강도 (intensity)에서 다소 감소를 유발하고, 그 다음 플로우-4 용액이 Ca2 + 용액과 혼합됨에 따라 강도에서 급속한 증가를 유발한다. 최종적으로, 상기 강도는 상기 혼합물이 벌크 수성 상으로 희석됨에 따라 감소한다. 스케일 바는 500 ㎛을 나타낸다.
도 6은 온도-의존 전달에 관련된다. 따라서, 도 6a는 온도 램프에 적용된 단일 내부 액적을 갖는 멀티좀의 파열 온도를 나타낸다 (상부: 온도가 ~1 ℃ min-1의 속도로 실온으로부터 증가된다; 하부: 파열하는 온도의 히스토그램). 상기 파열 온도는 35 ℃ 이하에서 파열하는 세 개의 멀티좀을 배제하고는, 43.6 ±3.5 ℃ (평균 ±s.d., n = 93)이다.
도 6b는 37.2 ±0.4 ℃의 일정한 온도로 유지된 단일 내부 액적을 갖는 멀티좀의 파열하는 횟수를 나타낸다. 상부 개략도는 온도 프로파일을 제공한다. 하부 그래프는 이러한 온도 (n = 46)에서 적어도 30분 동안 생존된 93%의 멀티좀을 나타내는, 37 ℃에 도달한 30분 내에서 파열하는 멀티좀의 비율을 나타낸다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 또한 본 명세서에서 하나 또는 복수의 수성 액적이 주변층 내에 앤캡슐화되는 것과 상과 없은 "멀티좀"이라 한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "앤캡슐화 액적" 및 "멀티좀"은 모두 하나 이상의 앤캡슐화된 액적을 함유하는 합성 구조에 관련된다. 본 발명에 있어서, 하나 이상의 수성 액적은 층이 소수성 방울의 표면 주위에 위치된, 비-중합체 양친매성 분자의 주변층 내에 앤캡슐화된다. 상기 수성 액적 또는 각각의 수성 액적은 (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함한다. 하나 이상의 수성 액적들은 또한 전체적으로 또는 부분적으로 소수성 방울 자체 내에 있다. 따라서, 수성 액적은 상기 소수성 매체에 의해 완벽하게 감싸여져, 완전히 소수성 방울 내에 있다. 선택적으로, 상기 외부 및 주변층이 도 1b 내지 1e에 도시된 바와 같이 이중층을 형성하기 위해 부착되도록, 주변층과 접촉하여, 상기 방울의 가장자리에 또는 근처에 있을 수 있다. 상기 외부층이 주변층과 이중층을 형성하도록 상기 수성 액적이 상기 방울의 가장자리에 또는 근처에 있는 후자의 배열은, 열역학적으로 좀더 안정할 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 합성된다. 따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 합성 앤캡슐화 액적이라 할 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 소수성 매체의 방울; 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및 상기 주변층 내에 수성 액적을 포함한다. 상기 수성 액적은 수성 매체 및 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함한다.
상기 비-중합체 양친매성 분자는 통상적으로 단분자층에서 소수성 방울의 표면 주위에 배열되고, 상기 멀티좀 내의 상기 수성 액적 또는 각각 수성 액적의 외부층은 통상적으로 상기 비-중합체 양친매성 분자의 단분자층을 포함한다. 그러나, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층은 상기 수성 액적 또는 각각 수성 액적이 소수성 방울의 표면에 부착될 경우, 및 수성 액적이 서로 부착될 경우 (도 1c-e 참조) 계면에 형성될 수 있다.
따라서, 상기 주변층은 통상적으로 비-중합체 양친매성 분자의 단분자층을 포함한다.
상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 단분자층을 포함한다.
통상적으로, 상기 주변층은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 단분자층을 포함하고, 상기 외부층은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 단분자층을 포함한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적의 몇몇 구현 예에 있어서, 특히 상기 앤캡슐이 먼저 합성되고, 상기 수성 액적이 열역학적으로 좀더 안정한 구조를 형성하기 위해 주변층에 부착하기 위해 시간을 갖지 못한 경우, 상기 수성 액적은 소수성 방울 내에 완전히 위치될 것이고; 상기 비-중합체 양친매성 분자의 외부층은 상기 주변층과 접촉되는 경우에 있지 않을 것이지만, 일반적으로 소수성 매체와 접촉될 것이다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 수성 액적은 상기 방울 내부에 위치되고, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 외부층은 상기 주변층과 접촉하지 않는다. 일반적으로, 이러한 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 외부층은 소수성 매체와 접촉한다.
그러나, 통상적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 비-중합체 양친매성 분자의 적어도 하나의 이중층을 포함한다. 일반적으로, 예를 들어, 상기 앤캡슐화 액적의 주변층 및 상기 수성 액적의 외부층은 상기 수성 액적 및 상기 주변층 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 함께 형성할 수 있다. 부가적으로 또는 선택적으로, 상기 수성 액적의 외부층은 상기 앤캡슐화 액적에서 또 다른 수성 액적의 외부층과 이중층을 형성할 수 있다.
따라서, 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 수성 액적은 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 주변층과 접촉하고, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다. 통상적으로, 이러한 구현 예에 있어서, 상기 외부층의 다른 부분은 상기 소수성 매체와 접촉한다. 이러한 배열의 예의 사진은 도 1c에 도시된다. 이러한 배열은 또한 두 개의 수성 액적이 존재하는 경우에 있어서, 도 1b에서 개략적으로 예시된다. 이러한 배열은 동력학적으로 안정한 것으로 확인된다.
상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 이중층은 막 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 막 단백질은 어떤 유형일 수 있다. 통합 막 단백질의 사용은 입증되어왔지만, 주변 막 단백질이 사용될 수 있는 것으로 동등하게 예상된다. 상기 막 단백질은 상기 액적 및 외부 용액 사이에서, 전자의 소통, 및 물질의 교환에 대한 정밀한 조절을 허용하기 위해, 예를 들어, 막 펌프, 채널 및/또는 기공일 수 있다. 상기 막 단백질은, 예를 들어, αHL 기공일 수 있다. 그러나, 어떤 적절한 막 단백질은 β-배럴 (barrel) 또는 α-나선형 다발 (helical bundle)인 두 개의 주요 부류를 포함하여 사용될 수 있다. 중요한 적용은 기공 또는 채널인 막 단백질이다. 단백질 기공 또는 채널 이외에, 더욱 가능한 막 단백질은, 세포 인식 또는 세포간 상호작용에 영향을 주는 단백질, 수용체, 또는 수송체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 이중층, 및 실제로 상기 앤캡슐화 액적에서 어떤 다른 이중층은 하나 이상의 막 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특히 이중층은 동일한 막 단백질의 다중 복제물, 또는 둘 이상의 다른 부류의 막 단백질를 함유할 수 있다. 하나 이상의 부류가 존재하는 경우, 상기 이중층은 각각의 다른 부류의 다중 복제물을 함유할 수 있다.
물질의 교환 및 전기적 소통을 허용하는 적절한 막 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있고, 쉽게 이용가능하며; 다수의 이러한 단백질은 상업적으로 이용가능하거나 또는 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, WT αHL 단량체는 생체외에서 전사/번역 (transcription-translation) (IVTT)에 의해 제조될 수 있고, 토끼의 적혈구 막으로 배양하여 헵타머화될 수 있다 (heptamerised). 상기 헵타머는 통상적으로 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 정제된다 (Maglia, G. et al. Method. Enzymol. 475, 591-623, 2010). 또한, Bayley, H. et al. Droplet interface bilayers. Mol. BioSyst. 4, 1191-1208 (2008)은 벌크 오일에서 제조된 액적 계면 이중층으로 삽입하기 위해 시험되는 여러가지 단백질을 열거하고 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 주변층 내에 복수의 수성 액적을 포함할 수 있다. 각각의 수성 액적은 (a) 상기 수성 매체, 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함한다. 각각 수성 액적의 외부층은 통상적으로 비-중합체 양친매성 분자의 단분자층을 포함한다. 그러나, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층은 상기 수성 액적 또는 각각의 수성 액적이 소수성 방울 주위에 주변층의 내부에 부착된 경우, 또는 수성 액적이 서로 부착된 경우 계면에 형성될 수 있다.
복수의 액적을 포함하는 상기 앤캡슐화 액적에서 상기 수성 액적의 수는 n으로 나타낼 수 있고, 여기서 n은 2 이상이다. n이 2인 구현 예는 도 1b에서 개략적으로 예시되고, 이러한 구현 예의 사진은 도 1d에 나타낸다. 몇몇 구현 예에 있어서, n은 3 이상의 정수이다. n이 3인 구현 예의 사진은 도 1e에 나타내고, n이 6인 구현 예는 도 1a에 개략적으로 예시된다.
정수 n은 이론적으로, 예를 들어, 대략 수백만으로 매우 높을 수 있다. 이것은 상기 수성 액적이 매우 작을 수 있고, 상기 소수성 방울의 크기에 상한 제한이 없기 때문이다. 또한, 하기에 설명된 바와 같이, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 수성 액적의 큰 네트워크를 포함할 수 있다. 수백만의 액적을 이론적으로 포함할 수 있는, 이러한 네트워크는 원조직 (prototissue) (즉, 원세포의 군집체)를 제조하는데 유용하다. 따라서, 몇몇 구현 예에 있어서, 정수 n은, 예를 들어, 약 10,000,000까지, 또는 예를 들어, 약 5,000,000까지, 수백만 만큼 클 수 있다.
다른 구현 예에 있어서, n은 예를 들어, 약 500까지, 또는 예를 들어, 약 400까지, 수백일 수 있다. 실제로, 본 발명의 실시 예에 사용된 수동 피펫 방법에 의해 제조된 멀티좀은 통상적으로 약 ~1 mm의 외부 직경을 갖고, 수성 액적은 ~100-㎛ 직경까지 수동으로 낮추어 쉽게 제조될 수 있다. 따라서, 약 500의 이러한 수성 액적은 1 mm 구형에 적합할 수 있거나, 또는 아마도 (비록 이것이 상기 액적의 조성물에 의존할 지라도) 패킹 제한 (packing constraints)에 기인하여 이보다 ~25% 미만까지 적합할 수 있다. 따라서, 몇몇 구현 예에 있어서, 정수 n은 약 500까지, 또는 예를 들어, 약 400까지 일 수 있다.
정수 n은, 예를 들어, 2 내지 500, 또는 3 내지 500의 정수일 수 있다. n은 2 내지 400의 정수일 수 있다. 다른 구현 예에 있어서, n은 2 내지 300의 정수, 또는 3 내지 200의 정수일 수 있다. 좀더 통상적으로 n은 2 내지 200 이다. 그러나, 다른 구현 예에 있어서, n은 2 내지 50의 정수, 또는 3 내지 50의 정수 이다. n은 예를 들어, 2 내지 20, 또는 2 내지 10일 수 있다.
통상적으로, 상기 앤캡슐화 액적은 복수의 수성 액적을 포함하는 경우, 제1 수성 액적의 외부층 일부는 제2 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하고, 이에 의해 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다.
따라서, 좀더 일반적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 통상적으로 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 포함하고, 여기서 이중층은 상기 수성 액적 및 주변층 사이, 또는 상기 수성 액적 및 제2 수성 액적 사이의 계면에서 형성된다.
상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 이중층은 하나 이상의 막 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 앤캡슐화된 액적은 상기 액적들 사이의 이중층에 혼입된 막 단백질을 통해 서로 화학적 종을 교환할 수 있다. 적절한 막 단백질은 펌프, 채널 및/또는 기공, 예를 들어, αHL 기공을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일반적으로, 제1 및 제2 액적 중 적어도 하나는 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층 일부는 주변층과 접촉하고, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다.
상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 이중층은 하나 이상의 막 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 막 단백질은 예를 들어, 펌프, 채널, 및/또는 기공, 예를 들어, αHL 기공을 포함하는, 어떤 유형일 수 있다. 앤캡슐화된 액적은 상기 액적 및 이러한 단백질을 통한 외부 용액 사이에 물질을 교환할 수 있다. 또한, 전술된 바와 같이, 상기 멀티좀 내에 앤캡슐화된 액적은 또한 액적들 사이의 이중층에서 막 단백질을 통해, 서로들 사이에서 물질을 교환할 수 있다. 따라서, 액적의 사슬 또는 네트워크를 갖는 앤캡슐화 액적은 외부 환경에서 및 외부 환경으로부터 뿐만 아니라, 액적으로부터 액적으로, 사슬 또는 네트워크를 통해 화학 화합물과 같은 물질을 트래피킹 (trafficking)할 수 있다. 복합 수송 시스템은 이러한 방식으로 구축될 수 있고, 이러한 시스템의 예는 도 1a에 개략적으로 도시된다.
복수의 액적을 포함하는 전술된 앤캡슐화 액적에서 제1 미 제2 액적은 상기 방울의 가장자리에 모두 위치될 수 있고, 여기서, 상기 제1 수성 액적의 외부층의 일부는 주변층과 접촉하고, 이에 의해 제1 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 제1 이중층을 형성하고, 및 제2 수성 액적의 외부층 일부는 주변층과 접촉하고, 이에 의해 제2 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 제2 이중층을 형성한다. 이러한 구현 예는 도 1b에서 개략적으로 예시되고, 이러한 구현 예의 사진은 도 1d에 나타낸다. 상기 제1 또는 제2 이중층은 막 단백질을 더욱 포함할 수 있거나, 또는 상기 제1 및 제2 이중층 모두는 막 단백질을 포함할 수 있다. 어떤 적절한 막 단백질 또는 단백질들은 사용될 수 있다. 상기 막 단백질 또는 단백질들은, 예를 들어, 펌프, 채널, 및/또는 기공으로부터 선택될 수 있고, 예를 들어, α-헤몰리신 (hemolysin) (αHL) 기공일 수 있다. 또 다른 가능한 막 단백질은 세포 인식 또는 세포간 상호작용에 영향을 주는 단백질, 수용체, 또는 수송체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 막 단백질을 통해, 상기 제1 및 제2 액적 모두는 서로 사이 뿐만 아니라, 외부 환경과 물질 교환 또는 전기적 소통을 가능하게 할 수 있다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 바람직하게는 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 포함한다.
따라서, 바람직한 구현 예에 있어서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적은 상기 주변층 내에, 수성 액적, 또는 복수의 수성 액적을 포함하고, 여기서 상기 수성 액적 또는 각각 수성 액적은: (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하고, 상기 앤캡슐화 액적은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 더욱 포함하며, 여기서
(i) 상기 수성 액적은 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하거나; 또는
(ii) 상기 제1 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 제2 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하며, 이에 의해 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적의 하나의 구현 예에 있어서, n은 3 이상이고, 상기 제1 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 제2 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하며, 이에 의해 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하고, 및 여기서, 상기 제2 액적의 외부층의 일부는 상기 제3 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하며, 이에 의해 상기 제2 및 제3 액적 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다. 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 이중층은 막 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 제2 및 제3 액적 사이의 계면에서 이중층은 막 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 하나의 구현 예에 있어서, 상기 제 1 및 제2 액적 사이의 계면에서 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하고, 상기 제2 및 제3 액적 사이의 계면에서 이중층은 막 단백질을 더욱 포함한다. 상기 세 개의 액적은 그 다음 서로 소통하는 액적의 사슬을 형성한다.
통상적으로, 상기 제1, 제2 및 제3 액적 중 적어도 하나는 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 적어도 하나의 수성 액적의 외부층 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다.
상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 이중층은 펌프, 채널, 또는 기공과 같은, 막 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 액적은 그 다음 외부 환경과 또한 소통할 수 있다.
통상적으로, 상기 세개의 제1, 제2, 및 제3 액적 모두는 상기 방울의 가장자리에 위치되며, 여기서 상기 제1, 제2 및 제3 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하고, 이에 의해 상기 제1, 제2 및 제3 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다. 이러한 구현 예의 실시 예의 사진은 도 1e에 나타낸다.
상기 제1, 제2 및 제3 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 중 적어도 하나는 막 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 어떤 적절한 막 단백질 또는 단백질들은 사용될 수 있다. 상기 막 단백질 또는 단백질들은 펌프, 채널, 및/또는 기공으로부터 선택될 수 있고, 예를 들어, αHL 기공일 수 있다. 또 다른 가능한 막 단백질은 세포 인식 또는 세포간 상호작용에 영향을 주는 단백질, 수용체, 또는 수송체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 상기 소수성 방울 내에 수성 액적의 사슬 또는 네트워크를 포함할 수 있다. 사슬 또는 네트워크에서 수성 액적은 비-중합체 양친매성 분자의 이중층, 통상적으로 지질 이중층들에 의해 서로 분리되며, 선택적으로 단백질 기공이 상기 이중층들에 존재하는 경우, 단백질 기공을 통해 사슬 또는 네트워크 내에서 소통을 허용한다. 만약 액적의 "사슬"은 "일-차원" 구조라 한다면, 여기서 각 액적은 액적의 라인을 형성하기 위해 최대 두 개의 다른 액적과 접촉하고, 그 다음 네트워크는 적어도 하나의 액적이 둘 이상의 다른 액적과 접촉하는, 이- 또는 삼- 차원 구조라 할 수 있다. 일반적으로, 네트워크에서, 상기 네트워크 내의 하나 이상의 액적은 둘 이상의 다른 액적과 접촉하고 있다. 몇몇 네트워크에 있어서, 상기 네트워크 내의 각각 및 모든 액적은 둘 이상의 다른 액적과 접촉하고 있다. 상기 네트워크는, 예를 들어, "이-차원" 단분자층의 액적 또는 "삼-차원" 덩어리의 액적일 수 있다. 이중층은 또한 존재하는 막 단백질을 통해 벌크 용액과 소통하도록 사슬 또는 네트워크를 가능하게 하는, 상기 소수성 방울의 주변층과 접촉하는, 상기 수성 액적의 표면에 존재할 수 있다. 따라서, 멀티좀은 이들의 환경을 감지, 정보를 처리, 및 그 다음 경우에 따라 환경에 물질을 전달, 또는 환경으로부터 물질을 수용할 수 있도록 제조될 수 있다. 상기 감지 및 전달 능력은 본 발명의 실시 예들에서 입증된다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 상기 주변층 내에 복수의 수성 액적을 포함할 수 있고, 여기서 복수의 수성 액적은 사슬 또는 네트워크에서 서로 접촉하는, 둘 이상의 수성 액적을 포함하며, 여기서 상기 사슬 또는 네트워크에서 각 액적의 외부층의 일부는 상기 사슬 또는 네트워크에서 또 다른 액적의 외부층의 일부와 접촉하고, 이에 의해 상기 사슬 또는 네트워크에서 상기 액적들 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다.
몇몇 구현 예에 있어서, 상기 사슬 또는 네트워크에서 액적들 사이의 계면에서 각각의 이중층은 막 단백질을 더욱 포함한다. 상기 막 단백질 또는 단백질들은 펌프, 채널, 및 기공, 예를 들어, αHL으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 이론적으로, 어떤 막 단백질도 사용될 수 있다. 전술된 바와 같이, 또 다른 가능한 막 단백질은 세포 인식 또는 세포간 상호작용에 영향을 주는 단백질, 수용체, 또는 수송체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사슬 또는 네트워크에서 수성 액적의 수는 m으로 나타낼 수 있고, 여기서 m은 3 이상인 정수이다. 몇몇 구현 예에 있어서, m은 4 이상이다. 정수 m은 예를 들어, 적어도 5, 또는 적어도 6일 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, m은 8 이상이다.
정수 m은, 예를 들어, 대략 수백만으로, 이론적으로 매우 높을 수 있다. 전술된 바와 같이, 상기 수성 액적은 매우 작을 수 있고, 상기 수성 액적의 모두는 동일한 네트워크에 존재할 수 있다. 따라서, 상기 정수 m은 수백만 만큼 클 수 있다. 이러한 커다란 액적의 네트워크는 원조직을 제조하는데 유용하다. 따라서, 몇몇 구현 예에 있어서, m은 약 10,000,000까지, 또는 예를 들어, 약 5,000,000까지의 정수이다.
다른 구현 예에 있어서, m은 400 또는 500 만큼일 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, m은 500까지, 또는 예를 들어, 400까지의 정수이다. 예를 들어, m은 3 내지 500, 또는 3 내지 400의 정수일 수 있다. 다른 구현 예에 있어서, m은 4 내지 500의 정수, 또는 4 내지 400의 정수일 수 있다. 따라서, 예를 들어, m은 6 내지 500의 정수, 또는 10 내지 400의 정수일 수 있다. 좀더 통상적으로, m은 3 내지 300, 또는 3 내지 200의 정수이다. 따라서, m은 5 내지 200일 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, n은 3 내지 50의 정수, 또는 4 내지 50의 정수일 수 있다. n은, 예를 들어, 3 내지 20, 또는 3 내지 10일 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, m은 4 내지 10이다.
통상적으로, 상기 사슬 또는 네트워크에서 수성 액적들 중 적어도 하나는 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 방울의 가장자리에 위치된 수성 액적의 외부층의 일부는 주변층과 접촉되며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다. 이러한 이중층은 액적의 사슬 또는 네트워크 및 외부 환경 사이에서 소통을 허용하도록, 하나 이상의 막 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 상기 막 단백질 또는 단백질들은 어떤 적절한 막 단백질, 예를 들어, 펌프, 채널, 또는 기공일 수 있다. 상기 막 단백질은 예를 들어, αHL일 수 있다. 상기 이중층은 동일한 막 단백질의 다중 복제물 또는 막 단백질의 둘 이상의 다른 부류를 함유할 수 있다. 하나 이상의 부류가 존재하는 경우, 상기 이중층은 각 다른 부류의 다중 복제물을 함유할 수 있다. 상기 이중층은, 예를 들어, 다른 종류의 이온 채널 막 단백질, 예를 들어, 적어도 하나의 나트륨 채널 단백질 및 적어도 하나의 칼륨 채널 단백질을 포함할 수 있다. 더욱 가능한 막 단백질은 세포 인식 또는 세포간 상호작용에 영향을 주는 단백질, 수용체, 또는 수송체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
통상적으로, 상기 사슬 또는 네트워크에서 수성 액적들 중 적어도 하나는 상기 주변층과 접촉하지 않는다. 따라서, 상기 사슬 또는 네트워크 내의 수성 액적들 중 적어도 하나는 상기 사슬 또는 네트워크의 중간에 있을 수 있고, 따라서 상기 멀티좀의 가장자리로부터 떨어진 위치에 유지될 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 사슬 또는 네트워크에서 수성 액적들 중 적어도 둘은 상기 주변층과 접촉하지 않는다. 상기 사슬 또는 네트워크에서 상기 수성 액적들의 둘이 상기 주변층과 접촉하지 않는 구현 예는 도 1a에서 개략적으로 예시되며, 여기서, 처리 모듈로서 작용하는 상기 두개의 수성 액적들은 상기 주변층으로부터 떨어진, 네트워크의 중간에 존재한다.
상기 사슬 또는 네트워크를 포함하는 본 발명의 앤캡슐화 액적의 하나이 구현 에에 있어서, 상기 사슬 또는 네트워크의 한쪽 말단에서, 제1 수성 액적은, 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 제1 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층의 제1 부분과 접촉하며, 이에 의해 상기 제1 수성 액적 및 상기 주변층의 제1 부분 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하고; 및 상기 사슬 또는 네트워크의 또 다른 말단에, 제2 수성 액적은 또한 (통상적으로 상기 방울의 반대 말단에) 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 제2 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층의 제2 부분과 접촉하며, 이에 의해 상기 제2 수성 액적 및 상기 주변층의 제2 부분 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하고; 및 상기 사슬 또는 네트워크는 상기 제1 및 제2 수성 액적 사이에 위치된, 적어도 하나의 다른 수성 액적을 더욱 포함한다. 이러한 적어도 하나의 다른 수성 액적은 상기 주변층과 일반적으로 접촉하지 않는다.
일반적으로, 이러한 구현 예에 있어서, 상기 사슬 또는 네트워크는 제1 및 제2 수성 액적들 사이에 위치된, 적어도 두 개의 다른 수성 액적을 더욱 포함한다. 통상적으로, 상기 적어도 두 개의 다른 수성 액적은 상기 주변층과 접촉하지 않는다.
이러한 구현 예는 도 1a에서 개략적으로 예시된다. 도 1a의 구현 예에 있어서, 한쪽 말단에 위치된, 두 개의 제1 수성 액적은 감지 모듈로서 작용하고, 상기 네트워크의 또 다른 말단에 위치된, 두 개의 제2 수성 액적은 전달 모듈로서 작용하며, 처리 모듈로서 작용하는 두 개의 또 다른 수성 액적은 상기 제1 (감지) 및 제2 (전달) 액적 사이에 위치된다.
통상적으로, 상기 제1 수성 액적 및 상기 주변층의 제1 부분 사이의 계면에서 이중층은 (전술된 바와 같이) 펌프, 채널, 또는 기공과 같은, 막 단백질을 더욱 포함한다. 상기 멀티좀에서 액적의 사슬 또는 네트워크는 그 다음 상기 제1 수성 액적 및 상기 막 단백질을 통해 외부 환경과 소통할 수 있다. 상기 네트워크에서 제1 액적은, 예를 들어, 외부 환경에서 특정한 화학물질의 존재를 감지할 수 있는, 또는 예를 들어, 광을 감시할 수 있는 감지 모듈로서 작용할 수 있다. 따라서, 상기 제1 액적은, 몇몇 구현 예에 있어서, 감지 분자를 포함한다. 상기 감지 분자는 상기 액적의 수성 매체에 또는 이중층에 존재할 수 있다. 상기 감지 분자는 특정한 화학물질 (예를 들어, 표적 검체)의 존재에 민감한 분자일 수 있고, 또는 광-민감성 분자일 수 있다.
일반적으로, 상기 제2 수성 액적 및 상기 주변층의 제2 부분 사이의 계면에서 이중층은 막 단백질을 더욱 포함한다. 상기 멀티좀에서 액적의 사슬 또는 네트워크는 그 다음 상기 제2 수성 액적 및 상기 막 단백질을 통해 외부 환경과 또한 소통할 수 있다. 상기 네트워크에서 상기 제2 액적은, 예를 들어, 상기 외부 환경으로 특정한 화학물질을 전달할 수 있는, 전달 모듈로서 작용할 수 있다. 이러한 전달은, 예를 들어, 화학물질의 존재 또는 부재 또는, 예를 들어, 광의 존재 또는 부재를 감지하는 제1 액적에 의존할 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 수성 액적은 따라서 감지 모듈로서 사용될 수 있고, 궁극적으로, 하나의 구현 예에 있어서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 상기 수성 액적, 또는 수성 액적들 중 적어도 하나는 감지 분자를 더욱 포함할 수 있다. 상기 감지 분자는 상기 수성 액적 및 상기 주변층 사이 또는 상기 수성 액적 및 또 다른 수성 액적 사이의 계면에 형성된 이중층에 또는 상기 액적의 수성 매체에서 존재할 수 있다. 어떤 적절한 감지 분자는 사용될 수 있다. 상기 감지 분자는 특정 화학물질, 예를 들어, 표적 검체, 또는 예를 들어, 광-민감 분자의 존재에 대해 민감성인 분자일 수 있다. 적절한 광-민감 감지 분자의 예는 박테리오로돕신 (bacteriorhodopsin)이다. 박테리오로돕신은 광 에너지를 포획하고, 이를 상기 막을 가로지르는 광자를 이동하도록 사용하는 막 단백질이다. 감지 분자의 다른 적절한 예는 게이트 이온 채널 (gated ion channels) 및 수용체 단백질을 포함한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 상기 수성 액적, 또는 수성 액적들 중 적어도 하나는 전달하기 위한 분자를 더욱 포함할 수 있다. 상기 앤캡슐화 액적으로부터 외부 환경으로 분자의 전달은, 예를 들어, 상기 앤캡슐에서 또 다른 액적 또는 상기 액적에서 감지 분자 활성에 의존할 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 소수성 매체는 광범위의 물질로부터 선택될 수 있다. 상기 소수성 매체는 단일 소수성 화합물을 포함할 수 있다. 선택적으로, 이것은 둘 이상의 다른 소수성 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 매체는 멀티좀에서 상기 수성 액적 또는 액적들이 소수성 매체와 혼합하기 보다는, 액적 형태로 앤캡슐화되어 남도록 소수성이지만, 상기 소수성 매체는 자유롭게 선택될 수 있다. 상기 소수성 매체는 멀티좀에서 상기 수성 액적 또는 액적의 부력 (buoyancy) 및 상기 멀티좀을 제조하는 경우, 상기 수성 액적 또는 액적들 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층의 형성의 속도에 영향을 미치도록 선택될 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 소수성 매체는 통상적으로 오일이다. 상기 오일은 단일, 순수, 화합물일 수 있고, 또는 상기 오일은 둘 이상의 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 어떤 유형의 오일도, 상기 수성 액적의 친수성 매체와 이의 계면 장력 (interfacial tension)이 있는 한, 적합하고, 상기 외부 벌크 상은, 형성된 이중층을 불안정하게 하지 않는 한, 상기 오일 및 수성 액적의 자발 붕괴 (spontaneous disintegration)를 방지하는데 매우 충분하다.
상기 오일은, 예를 들어, 실리콘 오일 (예를 들어, 폴리 페닐 메틸 실록산)을 포함할 수 있다. 상기 오일은 단일 실리콘 오일, 예를 들어, 폴리 페닐 메틸 실록산으로 이루어질 수 있다. 선택적으로, 상기 오일은 둘 이상의 다른 실리콘 오일을 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 선택적으로, 상기 오일은 탄화수소를 포함할 수 있다. 상기 오일이 탄화수소를 포함하는 경우, 이것은 단일 탄화수소 화합물 또는 둘 이상의 탄화수소의 혼합물을 포함할 수 있다.
몇몇 구현 예에 있어서, 상기 오일은 (a) 하나 이상의 탄화수소, 및 (b) 하나 이상의 실리콘 오일을 포함하는 혼합물이다.
상기 오일이 탄화수소를 포함하는 경우, 상기 탄화수소는 (비록 더 저분자량의 탄화수소가 증발의 조절을 요구할 지라도) 분지형 또는 비분지형, 예를 들어, 5 내지 30 탄소 원자, 또는 5 내지 20 탄소 원자를 갖는 탄화수소일 수 있다. 바람직하게는, 상기 탄화수소는 본 발명의 앤캡슐화 액적의 작동 온도에서 액체이다. 적절한 예는 헥사데칸, 데칸, 펜탄 또는 스쿠알렌과 같은 알켄 또는 알칸을 포함한다. 일반적으로, 상기 오일은 탄화수소를 포함한다.
통상적으로, 상기 탄화수소는 비치환된 C10-C20 알칸, 예를 들어, 헥사데칸이다. 비록 저밀도의 순수한 헥사데칸이 본 실시 예에서 기재된 방법에 의한 멀티좀의 어셈블리를 만드는 것이 어렵다는 것을 확인하였을지라도, 그렇기는 하지만, 헥사데칸 및 더 짧은 알칸은, 예를 들어, 본 실시 예에서 제조된 것 보다 더 작은 "소형화된" 멀티좀을 포함하는, 부력 효과가 덜 중요하고, 이의 단분자층이 더욱 빠르게 형성될 수 있는 다른 멀티좀에 적절할 수 있다.
몇몇 구현 예에 있어서, 상기 탄화수소는 비치환된 C17-C20 알칸과 같은, 장-쇄 탄화수소이다.
오일의 다른 유형은 가능하다. 예를 들어, 상기 오일은 플루오르화 탄소 (fluorocarbon)일 수 있다. 이것은, 예를 들어, 특정 막 단백질 또는 액적으로부터 검체의 손실을 최소화하기 위해 또는 산소와 같은 가스 함량을 조절하기 위해, 몇몇 시스템의 연구에 위해 유용할 수 있다. 플루오르화 탄소가 소수성 및 소유성 (lipophobic) 모두 일 수 있기 때문에, 플루오르화 탄소를 포함하는 오일 상은 표면에 멀티좀의 부착을 유용하게 방지할 수 있다.
또 다른 구현 예에 있어서, 상기 탄화수소는 브로모-치환된 C10-C30 알칸, 또는 예를 들어, 브로모-치환된 C10-C20 알칸, 예를 들어, 보로모도데칸이다. 비록 브로모도데칸이 단분자층 형성에 대한 긴 배양 시간을 요구하는 것으로 확인되었지만, 이러한 오일은 다른 멀티좀의 단분자층이, 예를 들어, 본 실시 예에서 제조된 것 보다 더 작은, "소형화된" 멀티좀을 좀더 빠르게 배양할 수 있게 하는데 더욱 적절할 수 있다.
통상적으로, 상기 오일은 실리콘 오일 또는 탄화수소를 포함한다. 어떤 적절한 실리콘 오일은 사용될 수 있다.
실리콘 오일은, 상기 앤캡슐화 액적이 물에서 대략적으로 중립 부력인 것을 보장하는, 물의 밀도에 가까운 이의 밀도 때문에 장점이 있다. 상기 실리콘 오일은 약 1 g.cm-3의 밀도를 갖는, 예를 들어, 폴리 페닐 메틸 실록산일 수 있다.
상기 탄화수소는 통상적으로 5 내지 20 탄소 원자 (C5-C20 탄화수소), 좀더 통상적으로는 10 내지 20 탄소 원자 (C10-C20 탄화수소)를 갖는다. 통상적으로, 이것은 알칸 또는 알켄이다. 따라서, 상기 탄화수소는 C5-C20 알칸, 또는 C10-C20 알칸일 수 있다. 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 탄화수소는 C5-C20 알켄, 또는 C10-C20 알켄일 수 있다. 상기 탄화수소는 통상적으로 비치환된다. 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 탄화수소는 비치환된 C5-C20알칸, 바람직하게는 비치환된 C10-C20 알칸이다. 상기 탄화수소는, 예를 들어, 스쿠알렌, 헥사데칸, 또는 데칸일 수 있다. 하나의 구현 예에 있어서, 이것은 스쿠알렌이다. 그러나, 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 탄화수소는 할로겐 원자, 예를 들어, 브롬으로 치환될 수 있다.
몇몇 구현 예에 있어서, 상기 소수성 매체는 실리콘 오일 및 탄화수소의 혼합물을 포함한다. 이러한 혼합물은 형성될 적절한 멀티좀에 대한 낮은 배양 시간을 유리하게 제공하는 것을 확인하였다. 상기 혼합물에서 실리콘 오일 및 탄화수소는 상기에서 더욱 정의된 바와 같을 수 있다. 통상적으로, 상기 탄화수소는 비치환된 C10-C20 알칸, 바람직하게는 헥사데칸이다. 상기 실리콘 오일은 상기 멀티좀이 수성 매체에서 대략적으로 중립 부력을 갖는 것을 보장하기 위해, 통상적으로 물의 밀도와 가깝고; 이것은 예를 들어 폴리 페닐 메틸 실록산일 수 있다. 일반적으로, 실리콘 오일 대 탄화수소의 부피비는 5:1 이상이다. 상기 실리콘 오일 대 탄화수소의 부피비는 예를 들어, 5:1 내지 15:1, 예를 들어, 약 9:1 또는 약 10:1일 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적에 사용된 상기 소수성 매체는 본 발명의 앤캡슐화 액적이 물에서 대략적으로 중립 부력이도록, 물의 밀도와 가까운 밀도, 예를 들어, 약 1 g.cm-3의 밀도를 갖는다.
하나의 구현 예에 있어서, 상기 소수성 매체는 실리콘 오일 및 헥사데칸 모두를 포함한다. 통상적으로 상기 실리콘 오일은 폴리 페닐 메틸 실록산이다. 상기 실리콘 오일 대 헥사데칸의 부피비는 통상적으로 5:1 이상, 예를 들어, 5:1 내지 15:1이다. 이것은 예를 들어, 약 9:1, 또는 약 10:1일 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 상기 수성 액적 또는 액적 내에 수성 매체는 순수한 물일 수 있다. 선택적으로, 상기 수성 매체는 수성 용액, 예를 들어, 수성 완충제 용액일 수 있다. 상기 수성 용액은 상기 멀티좀의 목적 또는 사용을 위해, 또는 상기 멀티좀을 사용하여 수행될 실험을 위하여 자유롭게 선택될 수 있다. 상기 앤캡슐화 액적에서 각 액적의 수성 용액은 같거나 또는 다를 수 있다. 하나의 중요한 특성은 pH이고, 이것은 광범위한 범위에 걸쳐 변화될 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 예를 들어, 상기 수성 액적 또는 액적들 내에 수성 매체의 pH는 비록 더 높고 더 낮은 pH가 또한 가능할지라도, 5 내지 9 (또는 예를 들어, 6 내지 8의 범위)의 범위에 있을 수 있다. 상기 수성 매체는 따라서 수성 완충제 용액일 수 있다. 어떤 적절한 완충제는 원하는 pH에 의존하여, 사용될 수 있다. 상기 완충제 용액은, 예를 들어, KCl를 갖는 Tris HCl, 및 EDTA를 포함할 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 수성 완충제 용액의 pH는 5 내지 9, 또는 예를 들어, 6 내지 8이다. 상기 용질의 본질 및 농도는 상기 용액의 특성을 변화하기 위해 변화될 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 중합체가 아니고, 중합체를 포함하지 않는 양친매성 분자를 포함한다. 상기 앤캡슐화 액적의 주변층 모두에, 및 상기 수성 액적 또는 각 수성 액적의 외부층에 존재하는, 이러한 양친매성 분자는 본 명세서에서 "비-중합체 양친매성 분자"라도고 한다.
일반적으로, 상기 비-중합체 양친매성 분자는 상기 멀티좀에서 소수성 매체 내에 이중층을 형성할 수 있는 어떤 유형일 수 있다. 이것은 상기 액적의 수성 매체 및 소수성 매체의 본질에 의존하지만, 광범위의 비-중합체 양친매성 분자는 가능하다. 양친매성 분자는 소수성 및 친수성 그룹 모두를 갖는 분자이다. 전술된 바와 같이, 상기 수성 액적 주위에 형성된 외부층은 일반적으로 상기 분자가 상기 수성 매체의 내부 쪽을 향하는 친수성기, 및 상기 소수성 매체의 외부쪽을 향하는 소수성기로 상기 액적의 표면에 나란히 되도록 상기 수성 매체와 소수성 및 친수성기의 상호작용에 의해 천연적으로 형성되고 유지되는 비-중합체 양친매성 분자의 단분자층을 포함한다. 유사하게, 상기 소수성 방울 주위에 형성된 주변층은 일반적으로 (a) 상기 방울의 소수성 매체 및, 상기 앤캡슐화 액적이 수성 매체 또는 이온 액체와 같은 친수성 담체 내에 현탁되는 경우, (b) 친수성 담체와, 소수성 및 친수성기의 상호작용에 의해 천연적으로 형성 및 유지되는, 비-중합체 양친매성 분자의 단분자층을 포함한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 사용될 수 있는 비-중합체 양친매성 분자의 중요한 부류는 지질 분자이다. 상기 지질 분자는 인지질, 지방산, 지방 아실, 글리세로지질, 글리세로인지질, 스핑고지질 (sphingolipid), 스테롤 지질 (sterol lipid), 프레놀 지질 (prenol lipids), 사카로지질 (saccharolipid) 및 폴리케타이드 (polyketide)를 포함하는, 어떤 주요 부류의 지질일 수 있다. 몇몇 중요한 예는 인지질 및 지방산을 포함한다. 상기 지질 분자는 천연적으로 발생하거나 또는 합성일 수 있다. 지질 분자로부터 이중층의 형성이 입증된 반면, 상기 방법은 이중층을 형성할 수 있는 어떤 비-중합 양친매성 분자를 위해 적절할 것으로 예상된다.
비-중합체 양친매성 분자에 존재할 수 있는 소수성기의 일반 부류는, 예를 들어, 대부분 지질에서, 탄화수소 그룹이다. 그러나, 또 다른 적절한 종류의 사용될 수 있는 소수성기는 플루오르화 탄소 그룹이다. 따라서, 비-중합체 양친매성 분자의 추가 중요한 부류는 적어도 하나의 플루오르화 탄소 그룹을 포함하는 비-중합체 양친매성 분자이다. 이러한 분자의 예는 소수성 플루오르화 탄소 꼬리 및 친수성 머리 그룹을 포함하는 지질-유사 분자 일 수 있다. 플루오로양친매성 (Fluoroamphiphile)은 상기 플루오로양친매성의 군집체에서 단백질을 격리시켜, 가능한 지질 이중층으로 막 단백질의 삽입을 방지하는데 사용될 수 있다 (Raychaudhuri et al. Biochemistry 50, 1599-1606 (2011)).
상기 앤캡슐화 액적에서 상기 비-중합체 양친매성 분자는 모두 동일한 유형일 필요는 없다. 오히려, 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자는 비-중합체 양친매성 분자의 둘 이상의 다른 종류의 혼합물일 수 있다. 또 다른 중요한 예는 상기 멀티좀에서 다른 수성 액적의 각각의 외부층에서 상기 비-중합체 양친매성 분자가 다른 수성 액적들 사이에 형성된 이중층(들)이 비대칭일 수 있도록 다른 유형일 수 있는 것이다.
따라서, 통상적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자는 지질 분자를 포함한다. 상기 지질 분자는 모두 동일한 유형일 필요는 없다. 따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자는 지질의 단일 유형 또는 둘 이상의 다른 지질 분자의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 앤캡슐화 액적의 주변층의 지질 조성물은 상기 수성 액적의 외부층의 지질 조성물과 같거나 또는 다를 수 있다. 하나 이상의 수성 액적이 상기 앤캡슐화에 존재하는 경우, 상기 수성 액적의 외부층의 지질 조성물은 서로 같거나 또는 다를 수 있고, 상기 주변층의 지질 조성물과 같거나 또는 다를 수 있다. 지질 분자는 지질 이중층, 또는 좀더 일반적으로 비-중합체 양친매성 분자의 이중층이 세포막의 모델이기 때문에 특히 유리하고, 따라서 본 발명의 앤캡슐화 액적은, 예를 들어, 막 단백질의 기초적 연구를 위한 새로운 플랫폼, 또는 "버텀-업" 합성 생물제제를 위한 다-구획 원세포의 섀시를 포함하는, 다양한 실험적 연구를 위한 우수한 플랫폼으로서 제공된다.
인지질은 전술된 이유 때문에 특히 바람직하고, 또한 이들은 모든 세포막의 주요 성분이기 때문에, 약물 전달뿐만 아니라, 합성 생물제제 적용을 위해 특히 적절한 인지질을 포함하는 앤캡슐화 액적을 제조한다.
따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자는 통상적으로 인지질 분자를 포함한다. 상기 인지질 분자는 같거나 또는 다를 수 있는데, 즉, 상기 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자는 단일 종류의 인지질, 또는 둘 이상의 다른 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있고, 다수는 Avanti Polar Lipid과 같은 공급업자로부터 상업적으로 이용가능하다. 상기 인지질 분자는 글리세로인지질 (glycerophospholipids) 또는 인스핑고지질 (phosphosphingolipids) 또는 둘의 혼합물일 수 있다. 상기 인지질 분자는 음이온성 인지질, 1차 아민을 포함하는 인지질, 콜린-함유 인지질 및/또는 글리코스핑고지질 (glycosphingoplipid)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 비-중합체 양친매성 분자는 하나 이상의 글리세로인지질을 포함한다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 글리세로인지질은 하기 화학식 1에 정의된 바와 같은 구조를 갖는 글리세로인지질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며:
여기서:
R1 및 R2는 같거나 또는 다르게, C10-C25 알킬기 및 C10-C25 알킬렌기로부터 선택되고;
R3가 부재면 OR3는 O-이고, 또는 R3는 존재하면, H, CH2CH2N(R4)3 +, 당 그룹, 또는 아미노기이고; 및
각각의 R4는 같거나 또는 다르게, H 및 비치환된 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
통상적으로, R3가 CH2CH2N(R4)3 +인 경우, 각각의 R4는 같거나 또는 다르게, H 및 메틸로부터 선택된다. 기술분야의 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 각각 및 모든 R4가 메틸인 경우, R3 기는 콜린기이고, 각각 및 모든 R4가 H인 경우, 상기 R3 기는 에탄올아민기이다.
R3가 아미노산기인 경우, 이것은, 예를 들어, 세린기, 즉, -CH2CH(NH2)(COOH)일 수 있다. R3가 당 그룹인 경우, 이것은, 예를 들어, 글리세롤, 즉, -CH2CHOHCH2OH, 또는 예를 들어, 이노시톨, 즉, -CH(CHOH)5일 수 있다.
R1 및 R2 기의 통상적인 예는, 예를 들어, CH3(CH2)10-, CH3(CH2)12-, CH3(CH2)14-, CH3(CH2)16-, CH3(CH2)18-, CH3(CH2)22-과 같은 직쇄형 C10-C25 알킬기, 및 예를 들어, -CH2-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)2과 같은 분지형 C10-C25 알킬기를 포함하는, C10-C25 알킬기이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
R1 및 R2 기의 또 다른 통상적인 예는 CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3CH=CH(CH2)3-, 및 CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-을 포함하는, 비치환된 C10-C25 알킬렌기이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, OR3기에 인접한 인산염 기에서 O- 기는, 몇몇 구현 예에 있어서, 적절한 양이온, 예를 들어, Na+와 같은 금속 양이온과 연관되거나 또는 양성자화될 수 있다.
따라서, 상기 비-중합체 양친매성 분자는 상기에서 정의된 바와 같이 화학식 1의 구조를 갖는 하나 이상의 글리세로인지질을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 비-중합체 양친매성 분자는 어떤 하나 이상의 다음의 글리세로인지질을 포함할 수 있고: 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 양쪽 친화성 분자로서 사용될 수 있는 1,2-디피타노일 (diphytanoyl)-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (DPPG) 또는 이의 하나 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 글리세로인지질 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)은 또한 사용될 수 있고, 통상적으로 pH-민감성 지질, 예를 들어, 지방산 (하기를 참조)와 조합하여 사용된다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자는 하나 이상의 지방산, 예를 들어, 올레산을 포함할 수 있다. 지방산은 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있고, 광범위의 이들은 상업적으로 이용가능하다.
상기 비-중합체 양친매성 분자는, 예를 들어, (a) 하나 이상의 인지질, 및 (b) 하나 이상의 지방산을 포함하는 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 비-중합체 양친매성 분자에 부가하여, 본 발명의 앤캡슐화 액적의 주변층은 페길화 (PEGylated) 지질을 더욱 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "페길화 지질"은 폴리(에틸렌글리콜)로 유도된 지질을 의미한다.
상기 멀티좀의 주변층에 하나 이상의 페길화 지질의 내포는 생체 내에서 멀티좀을 안정화시키는 유용한 효과를 갖고, 특히 상기 멀티좀의 플라즈마 반감기를 연장한다. 이것은, 상기 멀티좀이 하나 이상의 치료 또는 진단 시약을 함유한 경우, 상기 주변층에 하나 이상의 페길화 지질의 내포가 또한 상기 멀티좀 내에 시약의 플라즈마 반감기를 연장하는 유용한 효과를 갖는다는 것을 의미한다. 이러한 효과는 페길화 지질이 리포좀 약물 제형에 사용된 경우, 이미 관찰되었다. 페길화 지질은 기술분야에서 알려져 있고, NOF Corporation, Japan와 같은 공급업자로부터 상업적으로 이용가능하다 (http://www.phospholipid.jp/phospholipid_2-3.html참조). 어떤 적절한 페길화 지질은 PEG-인지질, 디아실글리세롤-PEG, 콜레스테롤-PEG 유도체, 및 이의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 본 발명에서 사용될 수 있다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적의 주변층은 페길화 지질을 더욱 포함한다. 상기 주변층은 비-중합체 양친매성 분자에 부가하여, 하나 이상의 페길화 지질, 예를 들어, 동일한 페길화 지질의 다중 복제물, 또는 페길화 지질의 둘 이상의 다른 부류의 혼합물을 포함할 수 있다. 적절한 페길화 지질은 PEG-인지질, 디아실글리세롤-PEG, 콜레스테롤-PEG 유도체 및 이의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 페길화 지질의 폴리(에틸렌글리콜) (PEG) 성분은 몇 가지 다른 기하학 중 어떤 하나를 가질 수 있다. 따라서, 실질적으로 선형 PEG 또는 분지형 PEG일 수 있다. 상기 분지형 PEG는, 예를 들어, 중심 코어 기에서 나오는 3 내지 10개의 PEG 사슬을 가질 수 있다. 선택적으로, 상기 분지형 PEG는 중심 코어 기에서 나오는 10 내지 100 PEG를 갖는, 별 PEG일 수 있다. 선택적으로, 상기 PEG는 중합체 골격에 이식된 다중 PEG 사슬을 갖는 빗 PEG (comb PEG)일 수 있다.
상기 주변층에 사용된 하나 이상의 페길화 지질은 다음의 화학식 2의 PEG-인지질을 포함할 수 있고,
여기서 R1 및 R2는 화학식 1의 글리세롤인지질에 대해 정의된 바와 같고, R5는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 기이다.
폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 기은 예를 들어 화학식 -CH2CH2NHC(O)-X, 또는 예를 들어, -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-X을 가질 수 있고, 여기서 X는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 상기 기 X는, 예를 들어, 실질적으로 선형 PEG, 또는 예를 들어, 중심 코어기에서 나오는 3 내지 10 PEG 사슬을 갖는, 분지형 PEG를 포함할 수 있다. 선택적으로, 이것은 중심 코어 기에서 나오는 10 내지 100 PEG를 갖는 별 PEG일 수 있다. 또는, 예를 들어, 중합체 골격에 이식된 다중 PEG 사슬을 갖는, 빗 PEG일 수 있다.
따라서, R5는, 예를 들어, -CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3, -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3, -CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH, 또는 -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH일 수 있고, 여기서 q는 양의 정수이다. 정수 q는 예를 들어, 5 내지 10,000, 또는 예를 들어, 10 내지 1,000일 수 있다.
선택적으로, R5는 -(CH2CH2O)qCH3 또는 -(CH2CH2O)qH일 수 있고, 여기서 q는 양의 정수이다. 정수 q는 5 내지 10,000, 또는 예를 들어, 10 내지 1,000일 수 있다.
부가적으로 또는 선택적으로, 하나 이상의 페길화 지질은 화학식 3의 디아실글리세롤-PEG를 포함할 수 있고,
여기서, R1 및 R2는 화학식 1의 글리세로인지질에 대해 정의된 바와 같고, R6는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 기이다.
상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 실질적으로 선형 PEG, 또는 예를 들어, 중심 코어 기에서 나오는 3 내지 10 PEG 사슬을 갖는, 분지형 PEG를 포함할 수 있다. 선택적으로, 이것은 중심 코어 기에서 나오는 10 내지 100 PEG를 갖는, 별 PEG일 수 있다. 또는, 예를 들어, 중합체 골격에 이식된 다중 PEG 사슬을 갖는, 빗 PEG일 수 있다.
R6는, 예를 들어, -(CH2CH2O)qCH3, -(CH2CH2O)qH, -CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3, -CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH, -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3 또는 -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH일 수 있고, 여기서 q는 양의 정수이다. 상기 정수 q는 5 내지 10,000, 또는 10 내지 1,000 일 수 있다.
부가적으로 또는 선택적으로, 하나 이상의 페길화 지질은 화학식 4의 콜레스테롤-PEG 유도체를 포함할 수 있고,
여기서 R7은 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 기이다.
다시, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 실질적으로 선형 PEG, 또는 예를 들어, 중심 코어 기로부터 나오는 3 내지 10 PEG 사슬을 갖는, 분지형 PEG를 포함할 수 있다. 선택적으로, 이것은 중심 코어 기에서 나오는 10 내지 100 PEG를 갖는, 별 PEG일 수 있다. 또는 예를 들어, 중합체 골격에 이식된 다중 PEG 사슬을 갖는, 빗 PEG일 수 있다.
R7은, 예를 들어, -(OCH2CH2)qOH 또는 -(OCH2CH2)qOCH3일 수 있고, 여기서 q는 양의 정수이다. 상기 정수 q는 예를 들어, 5 내지 10,000, 또는 10 내지 1,000 일 수 있다.
폴리글리세린은 폴리(에틸렌 글리콜)을 대신하여 사용될 수 있고, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적의 주변층은 폴리글리세린 모이어티 (moiety)를 포함하는 지질을 더욱 포함할 수 있다.
500 ㎛ 내지 2000 ㎛의 범위, 통상적으로 약 800 ㎛의 직경을 갖는 본 발명의 앤캡슐화 액적은 실험적으로 생산된다. 그러나, 더 큰 앤캡슐화 액적 및 더 작은 직경의 앤캡슐화 액적은 제조될 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 2 mm 이하, 바람직하게는 1 mm 이하인 직경을 갖는다.
본 발명의 앤캡슐화 액적의 부피는 0.2 μL 내지 2 μL의 통상적 범위로 실험적으로 제조되지만, 다시 이것은 더 큰 앤캡슐화 액적 및 더 작은 부피의 앤캡슐화 액적이 제조될 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 4 μL 이하, 바람직하게는 2 μL 이하의 부피를 갖는다. 상기 앤캡슐화 액적은, 예를 들어, 0.2 μL 내지 2 μL 범위의 부피를 갖는다.
통상적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적 내에 상기 수성 액적 또는 각각 수성 액적은 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 300 ㎛ 이하의 직경을 갖는다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 상기 수성 액적 또는 각각 수성 액적의 부피는 일반적으로 80 nL 이하, 예를 들어, 20 nL 이하이다. 하나의 구현 예에 있어서, 상기 수성 액적 또는 각각 수성 액적은 0.5 nL 내지 70 nL의 부피를 갖는다.
전술된 바와 같이, 더 작은 부피 및 직경의 앤캡슐화 액적은 제조될 수 있다. 더 작은 앤캡슐화 액적은 특히, 생체 내에 투여하는데, 예를 들어, 약물 전달 적용에 바람직하다. 실제로, 상기 앤캡슐화 액적이 몇 마이크론보다 더 크지 않은, 이상적으로 <200 nm인 것이 살아있는 세포와 상호작용하는 멀티좀을 요구하는 적용에서 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 앤캡술화 액적은, 몇몇 구현 예에 있어서, 10 ㎛ 이하, 또는, 예를 들어, 200 nm 이하인 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은, 몇몇 구현 예에 있어서, 0.5 picolitres 이하, 또는 예를 들어, 5 attolitres 이하의 부피를 가질 수 있다.
상기 단분자층 및 이중층 상에 증가된 곡률의 효과는 이러한 크기의 앤캡슐에서 중요하다. 따라서, 상 전이 (phase transitions)와 같은, 단분자층 및 이중층의 곡률-의존 특성을 맞추기 위하여, 이러한 앤캡슐화 액적에서 높은 고유 곡률 (high intrinsic curvature)을 갖는 지질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 높은 고유 곡률을 갖는 지질은 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. Zimmerberg, J. & Kozlov, M.M. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 7, 9-19 (2006)는 이중층 곡률을 생산하기 위한 몇 가지 전략을 제공하고, 상기 논문에서 표 1은 (음의 곡률 (negative curvature)을 갖는) DOPE 및 (양의 곡률을 갖는) 다양한 라이소지질 (lysolipids)과 같은, 높은 고유 곡률을 갖는 몇몇 지질을 열거한다. 따라서, 높은 고유 곡률을 갖는 지질의 예로는 다음의 라이소인지질을 포함하고, 이것의 모두는 양의 곡률을 갖는다: L-라이소 포스파티딜콜린 (L-라이소 PC), O-라이소 포스파티딜콜린 (O-라이소 PC), P-라이소 포스파티딜콜린 (P-라이소 PC), 라이소포스파티드산 (LPA), L-라이소 포스파티딜에탄올아민 (L-라이소 PE), O-라이소 포스파티딜에탄올아민 (O-라이소 PE) 및 S-라이소 포스파티딜에탄올아민 (S-라이소 PE). 디올레오일포스파티딜세린 (DOPS)은 또한 양의 곡률을 갖는다. 높은 고유 곡률을 갖는 지질의 또 다른 예는 다음을 포함하고, 이것은 음의 곡률을 갖는다: 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 포스파티드산 (PA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 콜레스테롤, 디카프릴글리세롤 (DCG) 및 디아실글리세롤 (DAG) (Zimmerberg, J. & Kozlov, M.M. Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 7, 9-19 (2006)).
따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자는, 몇몇 구현 예에 있어서, L-라이소 PC, O-라이소 PC, P-라이소 PC, LPA, L-라이소 PE, O-라이소 PE, S-라이소 PE, DOPS, DOPC, PA, DOPE, 콜레스테롤, DCG 및 DAG로부터 선택될 수 있다.
상기 앤캡슐화 수성 액적, 및 각각 반대 곡률의 지질을 갖는, 소수성 매체의 방울을 코팅하기 위하여 10 ㎛ 미만의 앤캡슐화 액적이 바람직할 수 있다. 이것은 음의 곡률을 갖는 지질을 함유하는 오일에서 상기 수성 액적을 배양하여 달성될 수 있고, 그 다음 상기 액적을 양의 곡률을 갖는 단분자층의 지질로 코팅된 오일 액적으로 이동시킨다.
따라서, 통상적으로 상기 주변층에서 비-중합체 양친매성 분자는 제1 곡률을 갖는 지질을 포함하고, 상기 수성 액적 또는 각각 수성 액적의 외부층에서 비-중합체 양친매성 분자는 제2 곡률을 갖는 지질을 포함하며, 여기서 상기 제1 곡률은 양성이고, 상기 제2 곡률은 음성이거나, 또는 상기 제2 곡률은 양성이고 상기 제2 곡률은 음성이다.
음의 곡률을 갖는 지질의 예는 DOPC, PA, DOPE, 콜레스테롤, DCG 및 DAG을 포함한다. 양의 곡률을 갖는 지질의 예는 라이소인지질 (예를 들어, L-라이소 PC, O-라이소 PC, P-라이소 PC, LPA, L-라이소 PE, O-라이소 PE 및 S-라이소 PE) 및 DOPS를 포함한다.
전술된 바와 같이, 상기 주변층은 혈류 (bloodstream)에서 멀티좀의 수명을 증가시키기 위해 하나 이상의 (하나 이상이 존재하는 경우 같거나 또는 다를 수 있는) 페길화 지질을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 약물 전달 비히클, 예를 들어, 생체 내에서 치료제, 진단 시약, 조영제 (contrast agents)를 전달하기 위한, 또는 요구된 바와 같은 생체 내에서 어떤 다른 유형의 화합물 또는 조성물을 전달하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 치료제를 더욱 포함한다.
상기 치료제는 전구 약물 (prodrug)일 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 전구 약물을 더욱 포함한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 선택적으로 진단 시약, 또는 예를 들어, 조형제를 포함할 수 있다.
상기 치료제, 전구 약물, 진단 시약, 또는 조영제는 본 발명의 앤캡슐화 액적 내에 수성 액적의 친수성 매체에 존재할 수 있다. 선택적으로, 이것은 상기 방울의 소수성 매체에 존재할 수 있다. 통상적으로, 이것은 상기 앤캡슐화에서 상기 수성 액적 또는 수성 액적의 친수성 매체에 존재한다.
동일한 앤캡슐화 액적 내에 다중 액적은, 예를 들어, pH 또는 온도에서 변화와 같은 외부 자극에 노출시켜, 동시에 또는 다른 시간에 환경으로 이들의 내용물을 방출할 수 있는데; 이것은 약물의 조합적 전달을 위한 유용한 방법을 제공한다. 실제로, 종래의 리포좀에서 앤캡슐화에 의해 세포로 다중 약물학적 종들을 전달하는 것은 이들 사이에 잠재적으로 원하지 않는 반응을 허용하거나, 또는 개별적으로, 각 종들의 좋지 못하게 조절된 비율을 수용하는 각 세포의 경우에 있어서, 이들 종들이 같이 앤캡슐화되는 것을 요구한다. 반대로, (소수성 상을 포함하는) 단일 멀티좀의 다른 구획에서 앤캡슐화된 몇 가지 약물의 전달은 복용량 비율에 따라 정밀하게 조절되는 것을 허용한다. 이것은 활성의 독립적 메커니즘을 갖는 약물의 전달에 유리할 수 있고; 고정된 비율로 세포에 의한 이들의 흡수는 이들의 전체 효율을 증가시키고, 상기 약물 중 어떤 하나에 대한 내성 성장의 가능성을 감소시키는 것으로 기대될 수 있다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 제1 시약 및 제2 시약을 더욱 포함한다. 통상적으로, 이들은 상기 앤캡슐의 별개의 부분에 존재한다. 본 명세서에 언급된 앤캡슐화의 일부는 상기 방울의 소수성 매체, 및 어떤 상기 수성 액적의 수성 매체를 포함한다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 제1 시약은 상기 앤캡슐에서 상기 수성 액적, 또는 상기 수성 액적들 중 적어도 하나에 있고, 상기 제2 시약은 소수성 매체 내에 있다.
또 다른 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 복수의 수성 액적을 포함하는 앤캡슐화 액적이고, 상기 제1 시약 및 제2 시약은 상기 앤캡슐의 다른 수성 액적 내에 있다.
통상적으로, 상기 제1 및 제2 시약은 치료제, 진단 시약, 병용 요법에서 서로 사용하기 위한 약물, 전구 약물 및 이들의 상응하는 활성제 (activators), 약물 및 이들의 상응하는 불활성화제 화합물, 및 약물의 생분포 (biodistribution)를 감지하기 위한 조영제로부터 선택된다.
선택적으로, 상기 제1 및 제2 시약은 화학 반응에서 서로 반응하기 위한 반응제 화합물일 수 있다.
통상적으로, 상기 제1 및 제2 시약은 미리결정된 비율로, 예를 들어 미리결정된 복용량 비율, 또는 예를 들어, 상기 시약 사이에 발생하는 특정 화학 반응에 적절한 화학양론적 비율로 앤캡슐화 액적에 존재한다.
작용의 독립적 메커니즘을 갖는 다중 약물의 전달은 개별적으로 각각 약물의 효과의 합보다 더욱 효과적일 수 있다. 약물 조합의 일반적 사용은 광범위한 질병에서 약물 내성의 발생을 방지하는 데 있다. 만약 다양한 약물이 용액에 전달된다면, 특정한 세포에 의해 흡수된 각 약물의 비율은 좋지 못하게 조절된다. 반대로, 본 발명의 앤캡슐화 액적과 같은, 단일 담체에서 이들 약물의 앤캡슐화는 복용량 비율에 따라 정밀하게 조절가능하다. 각 멀티좀의 별개의 구획에서 다중 약물의 앤캡슐화는 상기 약물 사이에 어떤 원하지 않는 상호작용을 방지하고, 그 구획에서 상기 약물에 대해 최적화되는 각 수성 구획에서의 조건을 허용한다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 전술된 상기 제1 및 제2 시약은 두 개의 다른 약물이다. 통상적으로, 상기 제1 및 제2 시약은 병용 요법에 서로 사용하기에 적절한 약물이다. 상기 약물은 미리결정된 복용량 비율로 앤캡슐화 액적에 존재할 수 있다. 병용요법에서 서로 사용하기에 적절하고, 따라서 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 서로 사용하기에 적절한 다수의 약물 조합은 기술분야에서 알려져 있다.
예를 들어, 동일한 내성 메커니즘을 공유하지 않는 항말라리아의 조합의 사용은 약물 내성의 기회를 감소시킬 수 있다 (White, N. "Antimalarial drug resistance and combination chemotherapy."Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 354, 739-49 (1999)). 따라서, 상기 제1 및 제2 시약은 다른 약물 내성 메커니즘을 갖는 두 개의 다른 항말라리아 약물일 수 있다. 특히, 상기 제1 및 제2 항말라리아 약물은 설파독신 (sulphadoxine) 또는 설팔렌 (sulphalene)과 조합한 피리메타민 (pyrimethamine)일 수 있고, 이의 조합은 항-클로로퀸 (chloroquine) P. falciparum에 의해 유발된 말라리아를 치료하기 위해 사용된다. 상기 두 개의 화합물은 폴레이트 (folate) 생합성에서 순차적 단계를 억제한다. 동일한 메커니즘은 클로르프로구아닐(chlorproguanil) 및 답손 (dapsone)의 조합에 의해 사용된다. 작용의 다른 메커니즘을 갖는 다른 항물질 약물 조합은: 아토바퀴온 (atovaquone) 및 프로구아닐 (proguanil), 아르테마이신 (artemisin) 및 메플로퀸 (mefloquine), 아르테메테르 (artemether) 및 루메판트림 (lumefantrine), 아토바쿠온 (atovaquone) 및 프로구아닐 (proguanil)과 아르테스네이트 (artesunate), 퀴닌 (quinine) 및 테트라시클린 (tetracycline), 및 퀴닌 (quinine) 및 클린다마이신 (clindamycin)을 포함한다. 따라서, 상기 제1 및 제2 시약은 전술된 조합 중 하나일 수 있다.
또 다른 예로는 다수의 병용 화학 요법 (regimens)이 존재하는, 암이다 (예를 들어, http://www.macmillan.org.uk, 참조). 몇몇 예는 호지킨스 림프종 (Hodgkin's lymphoma)에 대한 ABVD (독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 빈블라스틴 (vinblastine) 및 다카르바진 (dacarbazine)), 비-호지킨스 림프종에 대한 CHOP (시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 독소루비신 (doxorubicin), 빈크리스틴 (vincristine) 및 프레드니손 (prednisone), 및 유방암에 대한 CMF (시클로포스파미드, 메토트렉세이트 (methotrexate) 및 5-플루오로우라실 (fluorouracil))이다. 따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 전술된 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 다른 약물은 상기 앤캡슐의 같거나 다른 구획 내에 함유될 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적 내에 포함될 수 있는 약물의 또 다른 예로는 바이러스 감염을 치료하기 위해 사용된 약물 조합이다 (Clavel, F. & Hance, A.J. HIV drug resistance. N. Engl. J. Med. 350, 1023-1035 (2004), 참조). 통상적인 조합은 (바이러스 게놈의 역 전사를 억제하는) 뉴클레오시드 역-전사효소 억제제 (nucleoside reverse-transcriptase inhibitors) 및 (다른 메커니즘에 의해 바이러스 게놈의 역 전사를 억제하는) 비-뉴클레오시드 역-전사효소 억제제 또는 (바이러스 입자 어셈블리를 억제하는) 프로테아제 억제제 (protease inhibitor)를 포함한다. 몇몇 현재 추천된 요법 (regimens)은 (http://aidsinfo.nih.gov 참조): 엠트리시타빈 (emtricitabine), 테노포비어 (tenofovir) 및 에파비렌즈 (efavirenz); 엠트리시타빈, 테노포비어, 타자나비어 (tazanavir) 및 리토나비어 (ritonavir); 엠트리시타빈, 테노포비어, 다루나비르 (darunavir) 및 리토나비어; 및 엠트리시타빈, 테노포비어, 및 랄테그라비어 (raltegravir)이다. 본 발명의 앤캡슐화 액적은 따라서 전술된 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 다른 약물은 상기 앤캡슐의 다른 구획 내에 함유될 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 또한 독립적으로 효과가 거의 없거나 또는 없으나, 및 다른 화합물과 조합에서 오직 효과가 있는, 화합물의 전달을 허용한다. 이러한 상승 조합은 박테리아 감염에 대한 몇몇 치료, 및 전구 약물 (활성 약물의 불활성 전구체)의 전달에 사용된다. 몇몇 경우에 있어서, 하기에 논의되는 박테리아 감염의 치료에서와 같이, 다양한 화합물은 함께 앤캡슐화될 수 있고, 이러한 경우에 있어서, 멀티좀의 장점은 상기에서 논의된 바와 같다. 하기에 논의되는 바와 같은 전구 약물의 전달 및 활성과 같은, 다른 경우에 있어서, 상기 성분들은 함께 도입하는 경우 반응한다. 따라서, 멀티좀이 이의 내용물을 방출하기 위해 작동된 경우, 활성 종들은 이의 모 화합물에 대한 다른 비율로 인시튜 생성될 수 있다. 몇몇 예는 다음과 같다:
박테리아 감염 [Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406, 775-81 (20은 00)]: 암목시실린 (Amoxicillin)은 클라블라네이트 (clavulanate)와 조합하여 사용되고, 이것은 특정한 계통 (strain)이 암목시실린을 불활성화시킬 효소를 불활성시킨다. 앰피실린 (ampicillin) 및 설박탐 (sulbactam)의 조합은 유사한 이론을 사용하고, 여기서 설박탐은 효소 불활성화제이다. 또 다른 상승 조합은 퀴누프리스틴 (quinupristin) 및 달포프리스틴 (dalfopristin)의 조합이다.
따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 상기 제1 및 제2 약물은 각각 암목시실린 및 클라블라네이트, 각각 앰피실린 및 설박탐, 또는 퀴누프리스틴 및 달포프리스틴일 수 있다.
또 다른 가능성은 효소-전구 약물 치료이다 [Xu, G. & McLeod, H.L. Clin. Cancer Res. 7, 3314-3324 (2001)]: 항-암 약물 독소루비신의 유도체의 불활성인, HMR 1826은 사람의 베타-글루코니다제 (beta-glucuronidase)에 의해 독소루비신으로 전환된다. 이러한 조합을 사용한 연구에 있어서, 사람 베타-글루코니다제 유전자는 종양 세포로 먼저 형질감염 (transfect)되고, 그 다음 상기 효소를 생성하며, 이를 분비한다. 상기 전구 약물 HMR 1826은 세포외 종에 첨가되고, 여기서 이것은 활성 약물 독소루비신으로 전환된다. HMR 1826이 세로막을 투과하지 못하는 반면, 독소루비신은 시토졸 (cytosol)에 진입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 상기 제1 및 제2 시약은 HMR 1826 및 사람 베타-글루코니다제일 수 있다.
또 다른 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 전구 약물 및 이의 활성제의 동시 전달을 위한 비히클로서 사용된다. 이러한 적용에 있어서, 멀티좀의 하나의 내부 액적은 전구 약물을 함유하고, 동일한 멀티좀의 또 다른 내부 액적은 이의 상응하는 활성제를 함유한다. 몇몇 외부 자극에 따라 상기 내용물을 공동으로 방출하는 것은 상기 전구 약물 및 활성제의 조합을 허용하여, 인시튜 활성 종을 생산한다. 이것은, 예를 들어, 너무 불안정하거나 또는 불용성이어서 활성 상태에서 전달할 수 없는 약물의 투여를 허용할 것이다. 이러한 접근법은 또한 멀티좀 이중층으로 불투과 전구 약물을 앤캡슐하는데 사용될 수 있고, 이것은 세포막으로 투과하는 활성 약물로 전환된다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 제1 시약은 활성제에 의해 활성될 수 있는 약물의 불활성 형태이고, 상기 제2 시약은 상기 활성제이다. 상기 활성제는 예를 들어, 효소일 수 있다. 상기 약물의 불활성 형태는 전구 약물로 언급될 수 있다.
통상적으로, 상기 전구 약물은 너무 불안정하거나 또는 불용성이어서 활성상태에서 전달할 수 없는 약물이다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 전구 약물은 미프록시펜 포스페이트이고, 상기 활성제는 알카린 포스페타아제이다. 미프록시펜 포스페이트는 항암제 미프록시펜의 불활성 포스페이트 에스테르이고, 미프로시펜보다 ~1,000-배 큰 수성 용해도를 갖는다. 이것은 알칼린 포스페타아제에 의해 활성 종으로 전환된다.
특히 멀티좀에 전달하기 적합한 전구 약물은 내생적으로 확인되지 않는 활성제이다. 몇몇 전구 약물 전략은 전구 약물의 시스템적, 표적화된 전달 후에 외인성 활성제의 전달에 의존한다. Xu, G. & McLeod, H.L. "Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy" Clin. Cancer Res. 7, 3314-3324 (2001)는 이러한 전략에 사용된 전구 약물/활성제 조합의 예들을 나타내며, 이것은 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 상기 제1 및 제2 시약으로서 사용될 수 있다. 상기 전구 약물은, 예를 들어, HMR 1826일 수 있고, 이러한 경우에 있어서, 상기 활성제는 사람 베타-글루코니다제이다.
역으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 또 다른 종에 의해 불활성화되는 활성 약물을 전달하기 위해 사용될 수 있어, 상기 활성 약물의 수명에 대한 정밀한 제어를 제공한다. Bodor, N. & Buchwald, P. "Soft drug design: general principles and recent applications" Med. Res. Rev. 20, 58-101 (2000)는 내생적 종에 의해 통상적으로 불활성화되는, 연성 약물 (soft drugs)의 몇 가지 예들을 나타낸다. 멀티좀은 몸체에서 발견될 수 있는 것보다 더 높은 내생적 불활성화제의 농도, 또는 외인성 탄활성화제의 사용을 허용할 수 있다.
따라서, 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 제1 시약은 불활성화제 화합물에 의해 불활성화될 수 있는 약물이고, 상기 제2 시약은 상기 불활성화제 화합물이다. 예를 들어, 상기 제1 시약은 약물 염화 미바큐리움 (mivacurium chloride)일 수 있고, 상기 제2 시약은 상응하는 효소 불활성화제 사람 플라즈마 콜린에스터라아제 (cholinesterase)일 수 있다.
약물에 부가하여, 멀티좀은 또한 몇몇 의학 화상 기법 (modality)를 위한 조영제를 운반하는데 사용될 수 있다. 이것은 상기 멀티좀에 제약된 약물의 분포의 정밀한 결정을 허용하는 반면, 전달의 순간까지 약물과 별개의 마커 (marker)를 유지한다. 다양한 의학 화상 기법을 위한 조영제를 앤캡슐하는 것이 가능하고, 어떻게 약물-운반 멀티좀이 몸체 내에 분포되는지의 가시화를 허용한다. 상기 약물 및 트레이서에 대한 별개의 구획의 사용은 둘 사이의 어떤 화학적 반응을 방지할 것이다. 조영제는 방사선 (radiography) (예를 들어, 디아트리조에이트 (diatrizoate), 이오파미돌 (iopamidol), 아이오디사놀 (iodixanol)), MRI (예를 들어, 가도디아미드 (gadodiamide), 가도펜테틴산 (gadopentetic acid)), 초음파 (예를 들어, 기포 발생)에 대해 포함될 수 있고, 또는 방사성핵종 (radionuclides)은 양전자방출 단층촬영 (positron emission tomography) (예를 들어, 플루데옥시글루코오즈 (fludeoxyglucose) (18F)), 섬광조영술 (scintigraphy) (예를 들어, 아이오벤구안 (iobenguane)) 또는 단일광자방출 전산화 단층촬영 (single-photon emission computed tomography) (예를 들어, Na123I)에 대해 앤캡슐될 수 있다.
따라서, 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 제1 시약은 약물이고, 상기 제2 시약은 약물의 생분포를 감시하기 위한 적절한 조영제이다. 상기 조영제는, 예를 들어, 방사선 (예를 들어, 디아트리조에이트, 이오파미돌, 아이오디사놀), 자기 공명 영상 (magnetic resonance imaging) (MRI) (예를 들어, 가도디아미드, 가도펜테틴산), 또는 초음파 (예를 들어, 기포 발생)에 대한 조영제일 수 있고, 또는 방사성핵종은 양전자방출 단층촬영 (예를 들어, 플루데옥시글루코오즈 (18F)), 섬광조영술 (예를 들어, 아이오벤구안) 또는 단일광자방출 전산화 단층촬영 (예를 들어, Na123I)에 대해 앤캡슐될 수 있다.
멀티좀은 비-약물 화합물 및 (오일 상을 포함하는) 별개의 구획에 약물을 함유하도록 제조될 수 있다. 상기 비-약물 화합물에 대한 하나의 가능성은, 전술된 바와 같은, 약물의 생분포를 감시하기 위해 적절한 조영제이다. 다른 가능성은 하기와 같다:
표적화제 (Targeting agent) [Pouponneau, P., Leroux, J.C., Soulez, G., Gaboury, L. & Martel, S. Co-encapsulation of magnetic nanoparticles and doxorubicin into biodegradable microcarriers for deep tissue targeting by vascular MRI navigation. Biomaterials 32, 3481-3486 (2011)]: 최근 연구는 폴리(락트-코-글리콜산) 마이크로스피어 (microspheres)에서 독소루비신 및 마그네틱 나노입자 (FeCo)를 앤캡슐화하고, 동시에 화상에 대해 변형된 MRI 스캐너를 사용하며, 생체 내에서 혈관을 통해 미세입자를 조정한다. 유사한 원리는 본 발명의 앤캡슐화 액적에 적용될 수 있고, 이러한 경우에 있어서, 자기 입자 및 약물은 별개의 구획에서 앤캡슐화될 수 있다.
트리거 (Trigger): 약물에 앤캡슐화에 부가하여, 멀티좀은 상기 약물의 방출을 유도하기 위한 방식으로 외부의 트리거에 대해 반응하는 물질을 함유할 수 있다. 이러한 물질은, 예를 들어, 강자성체 (ferromagnetic) 입자일 수 있고, 이것은 MRI에 대해 사용된 바와 같은 외부 인가된 교류 자기장에 의해 가열될 수 있다.
세포: 특정 거동을 트리거하기 위해, 같은 멀티좀들에 개별적으로 앤캡슐화된 화합물과 함께, 멀티좀에서 살아있는 세포를 앤캡슐화하고, 이들을 환경으로 방출하는 것이 가능할 수 있다.
따라서, 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 제1 시약은 약물이고, 상기 제2 시약은 표적화제, 트리거 또는 살아있는 세포이다. 상기 표적화제 또는 트리거는 전술된 목록 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 상기 앤캡슐화의 다른 부분에서, 셋 이상의 다른 시약을 함유할 수 있다.
따라서, 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 앤캡슐화 액적은 상기 주변층 내에 복수의 수성 액적을 포함하고, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에서 상기 제1 시약, 제2 시약 및 제3 시약을 더욱 포함하는 전술된 바와 같은 앤캡슐화 액적이다. 본 명세서에 언급된 앤캡슐화의 부분은 상기 방울의 소수성 매체, 및 다른 수성 액적들을 포함한다.
예를 들어, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 제1 시약은 상기 앤캡슐화에서 상기 수성 액적들 중 하나에 존재하고, 상기 제2 시약은 소수성 매체 내에 존재하며, 상기 제3 시약은 또 다른 상기 수성 액적에 존재한다. 또 다른 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 둘 이상의 수성 액적을 포함하고, 상기 제1, 제2 및 제3 시약은 상기 앤캡슐의 다른 수성 액적 내에 있는 앤캡슐화 액적이다.
상기 제3 시약은 치료제, 진단 시약, 상기 제1 또는 제2 시약과 병용 요법에서 함께 사용하기 위한 약물, 전구 약물, 전구 약물에 대한 활성제 화합물, 활성 약물에 대한 불활성화제 화합물, 또는 상기 제1 또는 제2 시약의 생분포를 감시하기 위한 조영제일 수 있다. 선택적으로, 상기 제1, 제2 및 제3 시약은 화학반응에서 함께 반응하기 위한 반응제 화합물일 수 있다.
통상적으로 상기 제1, 제2 및 제3 시약은 미리결정된 비율로 상기 앤캡슐화 액적에서 존재한다. 전술된 바와 같이, (소수성 상에 포함하는) 단일 멀티좀의 다른 구획에 앤캡슐화된 여러 약물의 전달은 복용량 비율에 따라 정밀한 조절을 허용할 수 있다. 이것은 작용의 독립된 메커니즘을 갖는 약물의 전달에 대해 유리할 수 있다. 또한, 고정된 비율로 세포에 의한 흡수는 그들 전체 효율을 증가시키고, 상기 약물 중 어느 하나에 대한 내성 성장의 가능성을 감소시키는 것으로 기대될 수 있다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에 사용될 수 있는 셋 이상의 약물 (예를 들어, 개별 구획에서 각 약물)의 조합의 비-제한 예로는 다음의 암 치료법을 포함한다: 호지킨스 림프종에 대한 ABVD (독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), 비-호지킨스 림프종에 대한 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손), 및 유방암에 대한 CMF (시클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실).
또한 조합으로 전달되지 않는 물질을 앤캡슐화하는데 사용될 수 있는 멀티좀을 기대하는 것은 합리적이다. 화합물의 이상적 조합은 개별적으로 안정한 모 화합물로 이루어질 수 있고, 그 다음 활성의, 불안정한 화합물을 형성하기 위해 반응하는 멀티좀으로부터 방출을 트리거된다. 상기 활성 화합물의 불안정성은 트리거된 영역으로부터 먼 지역이 영향받지 않는 것을 보장할 것이다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 하나 이상의 이중층의 안정도는, 몇몇 구현 예에 있어서, 문제의 이중층이 이러한 자극에 노출된 경우 이의 내용물이 주변 환경에 방출될 수 있도록, 자극, 예를 들어, 외부 자극에 대해 민감할 수 있다. 상기 자극에 대해 민감한 이중층은 수성 액적 및 주변층 사이에 계면에 형성된 이중층, 즉, "외부 이중층" 일 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 문제의 자극에 대해 앤캡슐화 액적을 노출시키는 것은 외부 이중층의 누출 또는 파열을 일으킬 수 있고, 상기 수성 액적의 내용물은 상기 앤캡슐화 액적으로부터 방출될 수 있다. 선택적으로, 상기 자극에 대해 민감한 이중층은 앤캡슐화에서 둘의 수성 액적들 사이의 계면에 형성된 이중층, 즉 "내부 이중층"일 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 상기 자극에 대해 이중층을 노출하는 것은 상기 내부 이중층의 누출 또는 파열을 유발할 수 있어, 두 개의 수성 액적의 내용물의 조합을 허용한다.
동일한 앤캡슐화 액적 내에 둘 이상의 액적의 외부 이중층은 예를 들어 동일한 자극에 대해 민감할 수 있고, 상기 액적은 따라서 상기 자극에 노출시 동시에 그들의 내용물을 방출할 수 있다. 다른 구현 예에 있어서, 상기 동일한 앤캡슐화 액적 내에 둘 이상의 액적의 외부 이중층은 다른 안정도를 가질 수 있고, 상기 액적은 따라서 다른 시간에서, 다른 자극에 반응하여, 또는 예를 들어, 동일한 자극의 다른 수준 또는 정도에 반응하여, 상기 환경으로 이들의 내용물이 방출할 수 있다. 예를 들어, 상기 앤캡슐화 액적에서 제1 액적은 pH 변화에 반응하여 이의 내용물을 방출할 수 있는 반면, 상기 앤캡슐화에서 제2 액적은 온도 변화에 반응하여 이의 내용물을 방출할 수 있다. 선택적으로, 상기 동일한 앤캡슐화 액적 내에 둘 이상의 액적은 동일한 자극의 다른 수준에 반응하여 이들의 내용물을 방출할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제1 액적은 pH 또는 온도의 상대적으로 작은 변화에 반응하여 이의 내용물을 방출할 수 있는 반면, 제2 액적은 pH 또는 온도에서 더 큰 변화에 반응하여 이의 내용물을 오직 방출할 수 있다. 부가적으로 또는 선택적으로, 상기 앤캡슐에 하나 이상의 내부 이중층은 상기 앤캡슐 내에 둘 이상의 수성 액적의 내용물이 조합될 수 있도록 자극에 대해 민감할 수 있다.
따라서, 몇몇 구현 예에 있어서, 동일한 앤캡슐화 액적 내에 다중 액적은, 예를 들어, pH 또는 온도 변화와 같은 외부 자극에 노출시 동시에 환경으로 이들의 내용물을 방출할 수 있다. 본 명세서에 언급된 내용물은 상기 앤캡슐화 액적 내로부터 전달하기 위한 어떤 다른 화합물 또는 조성물, 또는 상기에서 정의된 바와 같은 제1, 제2 및/또는 제3 시약일 수 있다.
따라서, 상기 앤캡슐화 액적이 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 포함하는, 본 명세서에 기재된 본 발명의 앤캡슐화 액적의 구현 예에 있어서, 상기 이중층의 안정도는 자극에 대해 민감할 수 있다. 상기 자극은 통상적으로 외부 자극이다.
또한, 상기 앤캡슐화 액적이 상기 비-중합체 양친매성 분자의 복수의 이중층을 포함하는, 본 명세서에 기재된 본 발명의 앤캡슐화 액적의 구현 예에 있어서, 상기 이중층들 중 하나 이상의 안정도는 자극에 대해 민감할 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 이중층 중 적어도 하나의 안정도는 자극에 대해 민감하다. 상기 자극은 통상적으로 외부 자극이다. 다른 구현 예에 있어서, 상기 이중층 중 하나 이상의 안정도는 자극에 대해 민감하다. 다른 구현 예에 있어서, 각각 및 모든 이중층의 안정도는 자극에 대해 민감하다. 상기 자극에 민감한 상기 이중층은 같거나 또는 다를 수 있다.
상기 수성 액적의 외부층의 일부가 주변층을 접촉하고, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 (즉, "외부 이중층") 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하는, 본 명세서에 기재된 본 발명의 앤캡슐화 액적의 구현 예에 있어서, 상기 이중층의 안정도는 자극에 대해 민감할 수 있다. 상기 자극은 통상적으로 외부 자극이다.
또한, 상기 앤캡슐화 액적이 주변층 내에 복수의 수성 액적이 포함하는, 본 명세서에 기재된 본 발명의 앤캡슐화 액적의 구현 예에 있어서, 여기서 하나 이상의 수성 액적의 외부층은 복수의 외부 이중층을 형성하기 위해 주변층과 접촉하고, 하나 이상의 이중층의 안정도는 자극에 대해 민감할 수 있다. 상기 자극은 통상적으로 외부 자극이다. 몇몇 구현 예에 있어서, 이중층 중 적어도 하나의 안정도는 자극에 대해 민감하다. 다른 구현 예에 있어서, 하나 이상의 이중층의 안정도는 자극에 대해 민감하다. 다른 구현 예에 있어서, 각각 및 모든 이중층들의 안정도는 자극에 대해 민감하다. 자극에 민감한 외부 이중층은 같거나 또는 다를 수 있다.
상기 앤캡슐화 액적이 상기 주변층 내에 복수의 수성 액적을 포함하는, 본 명세서에 기재된 본 발명의 앤캡슐화 액적의 구현 예에 있어서, 여기서 제1 수성 액적의 외부층 일부는 제2 수성 액적의 외부층 일부와 접촉하고, 이에 의해 상기 제1 및 제2 수성 액적 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 ("내부 이중층")을 형성하며, 상기 이중층의 안정도는 자극에 대해 민감할 수도 또는 민감하지 않을 수도 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 내부 이중층의 안정도는 외부 자극에 민감하다.
더군다나, 상기 앤캡슐화 액적이 비-중합체 양친매성 분자의 복수의 내부 이중층을 포함하는, 본 명세서에 기재된 본 발명의 앤캡슐화 액적의 구현 예에 있어서, 하나 이상의 상기 이중층들의 안정도는 자극에 대해 민감할 수 있다. 상기 자극은 외부 자극일 수 있다. 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 내부 이중층의 적어도 하나의 안정도는 자극에 대해 민감하다. 다른 구현 예에 있어서, 각각 및 모든 상기 내부 이중층들의 안정도는 자극에 대해 민감하다. 자극에 만감한 상기 내부 이중층은 같거나 또는 다를 수 있다.
통상적으로, 이들 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 전술된 바와 같이, 치료제, 전구 약물, 진단 시약, 또는 조영제와 같은, 전달하기 위한 시약을 더욱 포함하는 것 중 하나이다. 선택적으로, 이것은 전달을 위해 둘 이상의 이러한 시약을 포함하는 것 중 하나 일 수 있다. 상기 둘 이상의 시약들은, 전술된 바와 같이, 상기 앤캡슐의 별개의 부분, 또는 동일한 부분에 있을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 앤캡슐화 액적은, 전술된 바와 같이, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에서 제1 시약 및 제2 시약을 포함하는 것 중 하나이거나, 또는 정의된 바와 같은, 앤캡슐의 별개의 부분에서 제1, 제2 및 제3 시약을 포함하는 것 중 하나일 수 있다.
전술된 바와 같이, 상기 자극은 (pH를 증가 또는 감소와 같은) pH의 변화, (가열 또는 냉각과 같은) 온도의 변화일 수 있지만, 어떤 다른 적절한 자극은 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 적절한 자극은 초음파; 기계적 자극; 전단 흐름 (shear flow); 종들의 임계 농도 (예를 들어, 이가 양이온의 임계 농도); 자기장; 전계; 및 적외선, UV, X-선 및 감마선을 포함하지만 제한되지는 않는, 전자기 방사선 (electromagnetic radiation) (광)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 부가적으로 또는 선택적으로, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층의 안정도는 표적 세포 상에 표면 종들을 인지하는, 지질 또는 단백질과 같은, 하나 이상의 이중층에서 분자를 포함하여 조절될 수 있다. 상기 표면 종들은 단백질 그 자체일 수 있다. 이러한 인지에 대한 반응은 이중층의 즉각적인 불안정일 수 있거나, 또는 간접적일 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 이중층 또는 이중층들의 비-중합체 양친매성 분자는 표적 세포 상에 표면 종을 인지하는 분자를 포함하고, 여기서 상기 인지에 대한 반응은 상기 이중층 또는 이중층들의 불안정화를 포함한다. 상기 반응은 상기 이중층의 즉각적인 불안정화를 포함할 수 있거나, 또는 이것은 상기 이중층의 간접적 불안정화를 포함할 수 있다. 상기 분자는, 예를 들어, 지질 또는 단백질일 수 있다.
그러나, 일반적으로, 상기 외부 자극은 pH 또는 온도에서 변화이다.
하나의 구현 예에 있어서, 외부 자극은 pH의 변화이다. 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들이 민감한 pH의 변화는 7.5 이상으로부터 7.5 이하로 감소, 또는 예를 들어, pH가 7.0 이상으로부터 7.0 이하로 감소, 또는 예를 들어, pH가 7.0 이상으로부터 6.5 이하로 감소일 수 있다, 좀더 통상적으로, 상기 pH의 변화는 pH가 7.0 이상으로부터 6.0 이하로 감소, 또는 예를 들어, pH가 7.0 이상으로부터 5.5 이하로 감소이다. 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 pH의 변화는 pH가 7.5 이상으로부터 7.0 이하로 감소, 또는 예를 들어, pH가 7.5 이상으로부터 6.5 이하로 감소, 또는 예를 들어, pH가 7.5 이상으로부터 7.0 이하에서 감소, 또는 예를 들어, pH가 7.5 이상으로부터 5.5 이하로 감소이다. 따라서, 몇몇 구현 예에 있어서, 상기 이중층 또는 이중층들의 비-중합체 양친매성 분자는 상기 이중층 또는 이중층들이 pH의 변화시 파열 또는 누출되도록 선택된다. 본 명세서에 "파열"은 상기 앤캡슐화 액적의 전체 내용물이 환경으로 방출되기 위한 가역적인 파열을 의미한다. 이러한 상황에 있어서 상기 용어 "누출"은 상기 내용물의 몇몇이, 예를 들어, 상기 앤캡슐화 액적의 상기 이중층 또는 이중층들의 구조가 덜 안정한 경우, 상기 앤캡슐화 액적으로부터 방출되고, 따라서, 이들의 내용물을 누출하지만, 상기 앤캡슐화 액적의 전체 구조는 거의 온전하게 남는다.
본 발명의 앤캡슐화 액적의 하나의 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 7.5 미만의 pH에 노출시 파열 또는 누출될 수 있다. 본 발명의 앤캡슐화 액적의 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 산성 pH, 즉, 7.0 미만의 pH에 노출하여 파열 또는 누출될 수 있다. 통상적으로, 이러한 구현 예에 있어서, 상기 산성 pH는 6.5 이하의 pH이다. 좀더 통상적으로, 상기 산성 pH는 6.0 이하의 pH, 또는 예를 들어, 5.5 이하의 pH이다.
이것은 문제의 상기 이중층 또는 이중층들에서 pH-민감성 지질을 사용하여 달성될 수 있다. 상기 pH-민감성 지질은 예를 들어 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들이 불안정하게 되는 것이 바람직한 pH에서 또는 pH 주변에서 이중층에 혼입된 경우의 pKa을 갖는 지방산일 수 있다. 상기 지방산의 pKa를 초과하는 pH의 것에서, 상기 지방산은 비양성자화될 것이고, 따라서, 강한 양친매성일 것이며, 따라서, 멀티좀의 내부 또는 외부 이중층을 안정화시키는데 적절할 것이다. 반면, 상기 pKa보다 낮은 pH의 것에서, 상기 지방산은 양성자화될 것이고, 덜 양친매성일 것이며, 이에 의해 이것이 존재하는, 어떤 이중층을 불안정화시킨다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 상기 이중층에 지방산의 pKa은 수성 용액에서 자유 지방산의 pKa와 비교하여 이동된다 (shifted). 따라서, 본 명세서에 언급된 각각의 pKa는 상기 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층이 존재된 경우의 지방산의 pKa이다. 당업자는 기술분야에서 알려진 방법, 예를 들어, 알려진 분광기를 이용한 방법에 의해, 특히 NMR 분광법 (spectroscopy)을 사용한 공지의 방법을 사용하여 이중층에서 지방산의 pKa을 쉽게 측정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적의 하나의 구현 에에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 pH-민감성 지질을 포함한다.
통상적으로, 상기 pH-민감성 지질은 지방산이다. 하나의 구현 예에 있어서, 상기 pH-민감성 지질은 약 8.5 이상인 pKa를 갖는 지방산이다.
또 다른 구현 예에 있어서, 상기 pH-민감성 지질은 약 8.0 이하의 pKa를 갖는 지방산이다. 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 pH-민감성 지질은 약 7.5 이하의 pKa를 갖는 지방산이다.
상기 pH-민감성 지질은, 예를 들어, 6 내지 8의 pKa를 갖는 지방산, 예를 들어, 약 7.5의 pKa를 갖는 지방산일 수 있다. 적절한 지방산은 올레산을 포함하고, 이것 자체는 이중층이 존재하는 경우, 약 7.5의 pKa를 갖는다.
본 발명의 앤캡슐화 액적의 하나의 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 상기에서 정의된 바와 같은, pH-민감성 지질 및, pH에 민감하지 않는 또 다른 지질을 포함한다. 통상적으로, pH에 민감하지 않는 또 다른 지질은 비-이중층 상태를 선호하는 지질이지만, 중성 pH에서 pH-민감성 지질과 조합하여 안정한 이중층을 형성한다. 통상적으로, pH에 민감하지 않는 지질은 인지질이다. 좀더 통상적으로, 이것은 글리세로인지질이다. 이러한 상황에 사용하기 위한 적절한 글리세로인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)일 것이다.
따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적의 하나의 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 상기에서 정의된 바와 같은, pH-민감성 지질, 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자는 DOPE 및 올레산의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 앤캡슐화 액적의 하나의 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 1:1 내지 3:1의 몰비로, 바람직하게는 약 2:1의 몰비로 DOPE 및 올레산을 포함한다.
또 다른 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 온도-민감성이다. 따라서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 몇몇 구현 예에 있어서 감소된 온도에 노출시 또는 상승된 온도에 노출시 파열 또는 누출할 수 있다. 하나의 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 상승된 온도에 노출시 파열 또는 누출할 수 있다. 생체 내에서 약물 전달을 유용하게 하기 위하여, 상승된 온도는 통상적으로 체온, 즉 약 37 ℃ 주변 또는 이상이다. 따라서, 본 발명의 앤캡슐화 액적의 하나의 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 약 37 ℃ 이상의 온도에 노출시 파열 또는 누출할 수 있다. 또 다른 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 약 40 ℃ 이상, 또는 예를 들어, 약 42 ℃ 이상의 온도에 노출시 파열 또는 누출될 수 있다. 이러한 구현 예는 생체 내에서 멀티좀으로부터 약물 방출의 상응하는 국소적 향상을 생산하는, 42 ℃까지의 국소적 온화한 발열요법 (hyperthermia)과 연결하여 유용하다.
통상적으로, 이들 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 온도-민감성 지질을 포함한다. 선택적으로, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 온도-민감성 지질 및 또 다른 지질을 포함할 수 있다. 통상적으로, 상기 온도-민감성 지질은 인지질, 좀더 통상적으로 글리세로인지질이다. 또 다른 지질은 일반적으로 인지질이다.
통상적으로, 상기 온도-민감성 지질은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 층들이 불안정하게 될 수 있는 것이 요구되는, 관심의 온도 주위 또는 온도에서 용융 전이 온도 Tm을 갖는 지질이다. 이러한 지질로 제조된 리포좀은 상기 리포좀 이중층의 고체 및 유체 상 사이의 경계에 기인하여, Tm 주변의 국지적 최대 투과성 (permeability)을 갖는 것으로 알려져 있다.
그렇긴 하지만, 상기 앤캡슐화 액적의 파열 온도는 상기 온도-민감성 지질의 전이 온도보다 일반적으로 더 낮아, 상기 전이 온도와 상당히 다를 수 있다. 이것은, 또 다른 지질이 존재가 온도-민감성 지질의 용융 전이를 넓히고, 및/또는 상기 온도-민감성 지질의 피크 전이 온도를 감소시키는 효과를 가질 수 있음에 따라, 또 다른 지질이 존재한다면, 일반적인 경우이다. 둘째, 온도-민감성 리포좀으로부터 내용물의 방출 정도는 이들의 크기에 따라 증가하는 것으로 나타나고, 제공된 온도-민감성 지질에 대하여, 본 발명의 앤캡슐화 액적의 파열 온도는 상기 앤캡슐화 액적의 크기가 증가함에 따라 감소할 수 있다.
따라서, 통상적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적의 이중층 또는 이중층들에 사용된 온도-민감성 지질은, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 층들이 불안정화될 수 있는 것이 요구되는 관심의 온도 이상인, 용융 전이 온도, Tm을 갖는 지질이다.
따라서, 약 37 ℃ 이상인, 온도-민감성 지질은 용융 전이 온도, Tm을 갖는 지질일 수 있다. 좀더 통상적으로, 약 40 ℃ 이상인, 용융 전이 온도, Tm을 갖는 지질이다. 따라서, 37 ℃ 내지 90 ℃, 또는 예를 들어, 40 ℃ 내지 70 ℃인, 용융 전이 온도, Tm를 갖는 지질일 수 있다. 하나의 구현 예에 있어서, 온도-민감성 지질은 40 ℃ 내지 60 ℃인, 용융 전이 온도, Tm을 갖는 지질이다.
통상적으로, 온도-민감성 지질은 글리세로인지질이다. 이것은, 예를 들어, 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)일 수 있다. 만약 또 다른 지질이 온도-민감성 지질과 조합하여 존재한다면, 이것은 통상적으로 글리세로인지질, 예를 들어, 본 명세서에 정의된 화학식 1의 글리세로인지질이다. 또 다른 지질은, 예를 들어, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)일 수 있다.
따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층 또는 이중층들은 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)을 포함한다. 통상적으로, 이러한 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자는 1:1 내지 5:1, 바람직하게는 약 3;1의 몰비에서 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)을 포함한다.
또 다른 구현 예에 있어서, 상기 비-중합체 양친매성 분자는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC) 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)을 포함한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 수성 및 다른 친수성 환경에서 안정하다.
따라서, 본 발명은 (a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적, 및 (b) 친수성 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
통상적으로, 상기 조성물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 복수의 앤캡슐화 액적 및 상기 친수성 담체를 포함한다.
상기 친수성 담체는 어떤 적절한 친수성 매체일 수 있다. 통상적으로, 이것은 수성이다. 따라서, 상기 친수성 담체는 통상적으로 물을 포함한다. 상기 친수성 담체는, 예를 들어, 순수한 물, 또는 수성 용액일 수 있다. 통상적으로, 이것은 수성 완충제 용액이다. 물 외에 친수성 물질은, 예를 들어, 친수성 이온성 액체를 사용할 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 친수성 담체는 이온성 액체를 포함한다. 특정한 적용을 위하여, 상기 친수성 담체는 바람직하게는 약학적으로 허용가능하다.
따라서, 본 발명은 (a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적, 및 (b) 약학적으로 허용가능한 친수성 담체를 포함하는 약학적 조성물을 더욱 제공한다. 통상적으로, 본 발명의 이러한 관점에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 전술된 바와 같이, 치료제, 전구 약물, 진단 시약, 또는 조영제와 같은, 생체 내에서 전달하기 위한 시약을 더욱 포함하는 것 중 하나이다. 선택적으로, 상기에서 정의된 바와 같이, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에 둘 이상의 시약을 포함하는 것 중 하나일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 상기에서 정의된 바와 같이, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에 제1 시약 및 제2 시약을 포함하는 것 중 하나, 또는 상기에서 정의된 바와 같이, 상기 앤캡슐화의 개별의 부분에서 제1, 제2, 및 제3 시약을 포함하는 것 중 하나일 수 있다.
본 발명은 요법에 의해 사람 또는 동물체의 치료를 위한 방법에 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물을 더욱 제공한다. 통상적으로, 이러한 관점에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적, 또는 상기 조성물에서 앤캡슐화 상기 액적 또는 각각의 액적은, 치료제 또는 전구 약물을 더욱 포함하는 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적이다. 이것은, 예를 들어, 상기에서 정의된 바와 같이, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에서 둘 이상의 시약을 포함하는 것 중 하나일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 상기에서 정의된 바와 같이, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에서 제1 시약 및 제2 시약을 포함하는 것 중 하나, 또는 상기에서 정의된 바와 같이, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에서 제1, 제2, 및 제3 시약을 포함하는 것 중 하나일 수 있다.
본 발명은 사람 또는 동물체에서 시행된 진단 방법에서 사용하기 위한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 앤캡슐화 액적 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물을 더욱 제공한다. 통상적으로, 이러한 관점에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적, 또는 상기 조성물에서 상기 앤캡슐화 액적 또는 각각의 앤캡슐화 액적은 진단 시약 또는 조영제를 더욱 포함하는 상기에서 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적이다. 예를 들어, 상기에서 정의된 바와 같은, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에 둘 이상의 시약을 포함하는 것 중 하나일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 상기에서 정의된 바와 같은, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에 제1 시약 및 제2 시약을 포함하는 것 중 하나, 또는 상기에서 정의된 바와 같은, 상기 앤캡슐의 별개의 부분에 제1, 제2 및 제3 시약을 포함하는 것 중 하나일 수 있다.
멀티좀의 또 다른 적용은 "버텀-업" 합성 생물제제에 대한 다-구획 원세포의 섀시로서 작용하는, 막 단백질의 기초적 연구를 위한 새로운 플랫폼을 제공하는 범위이다. 특히, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 원세포 또는 원세포 (원조직)의 군집체를 제조하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도 또는 합성 생물제제에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적, 또는 원세포를 제조하기 위한 방법에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도는 더욱 제공된다.
본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적, 또는 원조직을 제조하기 위한 방법에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도는 더욱 제공된다.
원세포는 본 발명의 앤캡슐화 액적, 예를 들어, 상기 주변층 내에 오직 하나의 수성 액적을 함유하는 앤캡슐화 액적으로부터 소수성 매체의 양을 제거 또는 감소시켜 제조될 수 있다. 상기 소수성 매체는 그것의 증발을 허용하여 및/또는 기계적으로, 예를 들어, 미세피펫으로 이를 제거시켜 상기 수성 액적 주변으로부터 제거될 수 있다. 점점 더 많은 상기 소수성 매체가 제거됨에 따라, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층은 수성 액적의 외부층으로 더 근접하게 이동하고, 상기 수성 액적의 외부층의 비-중합체 양친매성 분자와 궁극적으로 이중층을 형성한다. 오일 제거는 이중층의 형성하기 위해 부착하는데 두 개의 단분자층이 요구되지 않는다. 그러나, 오일 제거는 이중층으로 단분자층의 또 다른 부착을 결과할 것이다. 따라서, 소수성 매체의 양을 제거 또는 감소시키는 것은 원세포로서 그 자체로 사용될 수 있거나 또는 원세포를 생산하기 위해 사용될 수 있는 세포-유사 구조를 생산하기 위해, 상기 수성 액적의 표면 주위에 형성되도록 이중층을 유발할 수 있다. 오일 전부의 제거는 상기 수성 액적의 표면 주위에 완벽하게 형성되는 이중층을 유발할 것이다. 상기 이중층은, 특정 양의 개입한 소수성 매체의 부재하에서, 상기 이중층이 두 개의 단분자층보다 더 낮은 자유 에너지를 갖고, 따라서 형성의 음의 자유 에너지를 갖기 때문에, 소수성 매체의 양을 제거 또는 감소한 후 빠르게 형성되고; 따라서 이것은 자발적인 사건이다. 상기 이중층은 또한 상기 소수성 매체의 양을 제거 또는 감소 없이 형성될 수 있고; 전술된 바와 같이, 이중층 형성은 서로 접촉하는 두 개의 단분자층-코팅된 표면을 단순히 요구하는데, 이것은 만약 상기 수성 액적이 오일 방울에서 중립 부력이 아닌 경우 자발적으로 발생할 수 있으며; 그러나 오일의 제거는 단분자층들을 또 다른 이중층으로 부착하도록 유발할 수 있다.
원조직은 상기 수성 액적의 사슬 또는 네트워크를 포함하는 본 발명의 앤캡슐화 액적으로 시작하는 유사 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 상기 수성 액적은 이미 이들 사이에 형성된 이중층들을 가지며; 그러나, 상기 사슬 또는 네트워크의 외부층 일부는 멀티좀에서 소수성 매체에 노출된, 단분자층 형태에 있을 것이다. 상기 사슬 또는 네트워크 주위로부터 소수성 매체를 감소 또는 제거하는 것은 상기 사슬 또는 네트워크에서 수성 액적의 외부 단분자층 표면에 더욱 근접하게 이동하도록 상기 주변 단분자층을 유발할 수 있고, 궁극적으로, 상기 주변 단분자층은 이중층을 형성하기 위해 수성 액적의 외부 단분자층과 조합할 것이다. 따라서, 소수성 매체의 양을 제거 또는 감소시키는 것은, 원조직을 생산하기 위한 기초로서 사용될 수 있는 세포-유사 구조의 네트워크를 생산하기 위해, 상기 사슬 또는 네트워크의 표면 주위에 형성되는 이중층을 유발할 수 있다. 상기 오일의 전부를 제거하는 것은 상기 사슬 또는 네트워크의 표면 주위에 완벽하게 형성되는 이중층을 유발할 것이다. 전술된 바와 같이, 상기 이중층은 또한 소수성 매체의 양을 제거 또는 감소 없이 형성될 수 있지만, 오일의 제거는 단분자층을 또 다른 이중층으로 부착하도록 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명은 원세포를 제조하기 위한 방법을 더욱 제공하고, 상기 방법은 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적을 제공하는 단계, 및 상기 수성 액적의 외부층을 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과의 접촉 상태를 허용하는 단계, 또는 상기 수성 액적의 외부층을 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 상기 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시킨다.
전술된 바와 같이, 이중층 형성은 본 발명의 앤캡슐화 액적으로부터 소수성 매체의 전부 또는 일부를 제거하여 도울 수 있다. 따라서, 몇몇 구현 예에 있어서, 원세포를 제조하기 위한 방법은: 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층이 상기 수성 액적의 외부층에 들러붙도록, 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적으로부터 소수성 매체의 모두 또는 일부를 제거하는 단계를 포함하고, 이에 의해 상기 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시킨다.
통상적으로, 원세포를 제조하기 위한 본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 오직 하나의 수성 액적을 함유하는 것 중 하나이다.
본 발명은 원세포를 제조하기 위해 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 원세포를 더욱 제공한다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적을 포함하는 원세포는 더욱 제공되고, 여기서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층은 상기 수성 액적의 외부층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적의 일부 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성한다. 통상적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 오직 하나의 수성 액적을 함유하는 것 중 하나이다.
본 발명의 앤캡슐화 액적에서 수성 액적은, 전단 흐름이 오일 방울 및 개별의 거대한 단일박막의 소포 (unilamellar vesicle)을 생산하기 위해, 외부적 (예를 들어, 외부 수성 상에) 적용된 경우, 상기 오일 방울으로부터 분리될 수 있다. 상기 소포는, 예를 들어, 원세포로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 소포를 제조하기 위한 방법을 더욱 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 앤캡슐화 액적에 전단 흐름을 적용하는 단계를 포함한다.
원세포를 제조하기 위한 방법은 더욱 제공되고, 이러한 방법은 본 발명의 앤캡슐화 액적에 전단 흐름을 적용하는 단계를 포함한다.
본 발명은 원세포를 제조하기 위해 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 원세포를 더욱 제공한다.
본 발명은 원조직을 제조하기 위한 방법을 더욱 제공하고, 이러한 방법은 복수의 수성 액적을 포함하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적을 제공하는 단계, 및 상기 수성 액적의 외부층을 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과의 접촉 상태를 허용하는 단계, 또는 상기 수성 액적의 외부층을 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 상기 복수의 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시킨다.
전술된 바와 같이, 이중층 형성은 본 발명의 앤캡슐화 액적으로부터 소수성 매체의 일부 또는 전부를 제거하여 도울 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 원조직을 제조하기 위한 방법은: 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층이 상기 수성 액적의 외부층에 들러붙도록, 복수의 수성 액적을 포함하는 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적으로부터 소수성 매체의 일부 또는 전부를 제거하는 단계를 포함하고, 이에 의해 복수의 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시킨다.
통상적으로, 원조직을 제조하기 위한 본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 앤캡슐화 액적은, 사슬 또는 네트워크에서 서로 접촉하는, 둘 이상의 수성 액적들, 또는 예를 들어, 둘을 초과하는 수성 액적을 포함하는 것 중 하나이고, 여기서 상기 사슬 또는 네트워크에서 각 액적의 외부층의 일부는 상기 사슬 또는 네트워트에서 또 다른 액적의 외부층의 일부와 접촉하며, 이에 의해 상기 사슬 또는 네트워크에서 상기 액적들 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시킨다.
원조직을 제조하기 위해 상기에서 정의된 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 원조직은 더욱 제공된다.
본 발명은 또한, 앤캡슐화 액적이 복수의 수성 액적을 포함하는, 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적을 포함하는 원조직을 제공하고, 여기서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층은 상기 수성 액적의 외부층과 접촉하며, 이에 의해 복수의 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시킨다.
본 발명은 또한 정의된 바와 같이 본 발명의 복수의 원세포를 포함하는 원조직을 제공한다.
이중층에 의해 연결된 다중 액적 및 막 단백질을 사용하여, 멀티좀은 이들의 환경을 감지, 정보 처리, 및 도 1a에 예시된 바와 같은, 주변으로 물질을 의존적으로 전달할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 앤캡슐에서 액적들 사이의 분자를 트래피킹하기 위하여 및/또는 외부 환경으로 상기 앤캡슐에서 액적으로부터 분자를 전달하기 위하여 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 더욱 제공한다. 좀더 일반적으로, 본 발명은 앤캡슐화된 액적 및 환경 사이의 물질을 교환하기 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 사용을 더욱 제공한다.
멀티좀은 또한 막 단백질의 기초적 연구에 대한 플랫폼으로서 사용될 수 있고; 본 발명의 앤캡슐화 액적은 상기 이중층 곡률을 조절하기 위한 다양한 방식으로, 굽은 지질 이중층을 만들기 위한 간단한 방식을 나타낸다. 또한, 이들은, 사실상 마이크로- 및 나노-조작의 어떤 수단을 통해, 두 개의 지질 이중층들을 바싹 붙여서 놓이도록 허용하여, 광범위한 실험을 가능하게 한다. 이러한 실험들은 막 단백질의 조사 및/또는 검사, 막 단백질과 상호작용하는 검체의 조사 및/또는 검사, 및 상기 앤캡슐화 액적에서 곡면의 이중층의 조사 및/또는 검사를 포함한다. 실제로, 본 발명의 앤캡슐화 액적은, 통상적으로 상기 이중층에서 또는 통하여 일어나는 공정을 포함하는, 일반적인 어떤 이중층 현상을 연구하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 막 단백질을 조사 및/또는 검사하는 방법에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 더욱 제공한다. 본 발명의 앤캡슐화 액적은 하기에 더욱 설명되고 있는 바와 같이, 두 개의 근접하게-나란히 놓인 이중층들을 걸치는 막 단백질 연구하는데 특히 유용하다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 막 단백질은 두 개의 이중층을 걸치는 것 중 하나이다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 막 단백질과 상호작용하는 검체를 조사 및/또는 검사하는 방법에서 본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 조사 및/또는 검사하는 방법에서 본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적의 용도를 제공한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 또한 그 내부의 이중층으로 삽입된 막 단백질의 특성을 연구하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 막 단백질의 특성의 전압 의존성은 결정될 수 있다. 지질 이중층에서 막 단백질을 연구하기 위한 기술은 기술분야에서 잘 알려져 있다. 채널 또는 기공의 기능은, 예를 들어, 막 단백질을 통해 지질 이중층을 가로질러 흐르는 이온성 전류를 측정하여 결정될 수 있다. 수송자 (transporter)의 기능은 상기 지질 이중층을 가로질러 전위된 분자의 양을 측정하여, 예를 들어, 질량 분광기 또는 ELISA 또는 형광물질 또는 방사선물질로 표지된 물질을 사용하여 측정하여 결정될 수 있다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 두 개의 이중층들을 걸치는 막 단백질을 연구하는데 특별히 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 이들의 이중층이 나란히 놓이도록 단일 내부 액적과 두 개의 멀티좀을 배치시켜 단일-분자 수준에서, 갭 접합 (gap junctions) 및 핵 기공과 같은, 두 개의 지질 이중층들을 걸치는 기공-형성 단백질 복합체를 연구하는데 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은, 상기 비-중합체 양친매성 분자의 두 개의 이중층을 걸치는 막 단백질 복합체를 조사 및/또는 검사하기 위하여, 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 제1 앤캡슐화 액적 및 상기에서 정의된 바와 같이 본 발명의 제2 앤캡슐화 액적의 용도를 제공하고, 여기서, 상기 제1 및 제2 앤캡슐화 액적의 각각에서, 상기 수성 액적은 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하고, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하며, 여기서, 상기 제1 및 제2 앤캡슐화 액적은 상기 제1 앤캡슐화 액적의 이중층 및 상기 제2 앤캡슐화 액적의 이중층이 나란히 놓이도록 배치되고, 여기서 막 단백질은 두 개의 나란한 이중층들에 걸친다.
액적 계면 이중층에 의해 연결된 수성 액적의 네트워크는 광센서, 건전지, 및 전자 장치로 작용하는 다양한 막 펌프, 채널 및 기공을 이용하도록 구성될 수 있다. 이것은 Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007), and Maglia, G. et al. Nat. Nanotechnol. 4, 437-440 (2009)에 기재되었고, 이것은 벌크 오일 상에서 이러한 액적 네트워크의 구성에 관련한다. 이러한 액적 네트워크는 또한 센서, 건전지, 또는 전자 장치로 기능을 하는 본 발명의 앤캡슐화 액적을 제공하기 위하여, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 멀티좀 내에 구성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 센서, 건전지, 또는 전자 장치로서 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 사용을 더욱 제공한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명의 앤캡슐화 액적을 포함하는, 센서, 건전지, 또는 전자 장치는 더욱 제공된다.
상기 멀티좀을 함유하는 벌크 친수성 (통상적으로 수성) 상을 통해 서로 소통하는 멀티좀은 또한 조사되고, 여기서 제1 멀티좀은 외부 이중층에 기공을 통한 확산에 의해, 또는 pH- 또는 온도-유도된 파열에 의해, 벌크 용액으로 종들을 방출시켜 신호를 "전송하고", 그 다음 제2 멀티좀은 상기 신호를 "수신한다". 상기 제2 멀티좀은 상기 외부 이중층에 기공을 통한 상기 제2 멀티좀의 수성 액적으로 종들의 확산, 또는 신호에 민감한 상기 제2 멀티좀의 외부 지질 단분자층에 또 다른 종들의 사용에 의해 신호를 수신할 수 있다.
외부 화학적 및 생물학적 물질과 소통하는 멀티좀은, 예를 들어, 생물학적 세포, 조직 또는 기관과 소통하는 멀티좀을 포함하여, 또한 조사된다. 하나의 구현 예에 있어서, 예를 들어, 본 발명의 앤캡슐화 액적은 신경 말단이 검출할 수 있는 신경전달물질 (neurotransmitter)을 방출하여, 신경 말단과 소통할 수 있다. 상기 신경전달물질은 상기 멀티좀의 외부 이중층에 기공을 통해 확산, 또는 pH- 또는 온도-유도 파열에 의해 방출될 수 있다. 상기 멀티좀에 의해 방출시, 상기 신경전달물질은 그 다음 신경 말단에 의해 검출되고, 이에 의해 신호는 상기 멀티좀으로부터 신경으로 전송된다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 앤캡슐화 액적을 생산하기 위한 본 발명의 공정에 의해 생산될 수 있고, 앤캡슐화 액적은:
- 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적을 포함하고, 상기 수성 액적은 (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며;
이러한 공정은:
수성 액적을 소수성 매체의 방울로 전달하는 단계를 포함하고, 상기 수성 액적은 (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며, 여기서 상기 소수성 매체의 방울은 이의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층을 갖는다.
일반적으로, 본 발명의 공정은 하기 단계를 포함한다:
(i) 비-중합체 양친매성 분자의 존재하에서, 친수성 담체로 소수성 매체의 방울을 도입하는 단계로, 이에 의해 소수성 매체 및 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층을 생산하고;
(ii) 비-중합체 양친매성 분자의 존재하에서 소수성 매체로 수성 매체의 액적을 도입하는 단계로, 이에 의해 상기 소수성 매체 내에 수성 액적을 생산하고, 상기 수성 액적은 (a) 상기 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며;
여기서 단계 (i) 및 (ii)는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있고; 및
(iii) 단계 (i)에서 생산된 소수성 매체의 방울로 단계 (ii)에서 생산된 수성 액적을 이동시키는 단계로, 이에 의해 앤캡슐화 액적을 생산한다.
단계 (i)에서 사용된 친수성 담체는 어떤 적절한 친수성 매체일 수 있다. 통상적으로 이것은 수성이다. 따라서, 상기 친수성 담체는 통상적으로 물을 포함한다. 상기 친수성 담체는, 예를 들어, 순수한 물, 또는 수성 용액일 수 있다. 통상적으로, 이것은 수성 완충제 용액이다. 그러나, 물 외에 친수성 물질은, 예를 들어, 친수성 이온성 액체가 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구현 예에 있어서, 상기 친수성 담체는 이온성 액체를 포함한다. 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 친수성 담체는, 수성 매체, 예를 들어, 물 또는 수성 완충제 용액이다.
단계 (i)에서 사용된 소수성 매체는 본 발명의 앤캡슐화 액적에 대해 상기에서 정의된 바와 같을 수 있다. 상기 소수성 매체의 방울은 비-중합체 양친매성 분자의 존재하에서 친수성 담체로 도입된다. 상기 소수성 매체의 방울은 통상적으로 피펫을 사용하여 친수성 담체에 도입된다. 통상적으로, 상기 비-중합체 양친매성 분자는 상기 소수성 매체 자체에 존재하는데, 즉, 이들은 상기 소수성 방울에 존재한다. 선택적으로, 이들은 친수성 담체에 제공될 수 있고, 예를 들어, 이들은 상기 친수성 담체에서, 지질 소낭 (lipid vesicle)으로 용해, 또는 현탁될 수 있다. 상기 비-중합체 양친매성 분자는 본 발명의 앤캡슐화 액적에 대해 정의된 바와 같을 수 있다. 바람직하게는, 만약 상기 비-중합체 양친매성 분자가 상기 소수성 매체에 존재하지 않는다면, 그 다음 이들은 단계 (i)에서 사용된 친수성 담체에 및 상기 액적의 수성 매체 모두에서 존재한다. 이것은 멀티좀의 안정도를 개선한다.
상기 소수성 방울의 직경은 유사한 직경을 갖는 루프 (loop) 상에 방울을 형성하여 조절될 수 있다. 통상적으로, 상기 소수성 방울은 친수성 담체 내에 루프 상에 형성된다. 따라서, 상기 빈 루프는 친수성 담체에 먼저 침지되고, 상기 소수성 매체의 방울은 상기 친수성 담체로, 그 다음 상기 루프 상에 도입된다. 일반적으로, 상기 소수성 매체의 방울은 친수성 담체 및 상기 루프 상에 피펫된다.
선택적으로, 만약 더 작은 소수성 방울은 원한다면, 상기 소수성 방울의 직경은 미세피펫을 사용하여, 즉, 미세 피펫으로부터 친수성 담체로 소수성 매체의 방울을 도입하여 조절될 수 있다.
상기 소수성 방울의 직경은 통상적으로 500 ㎛ 내지 2000 ㎛, 좀더 통상적으로 500 ㎛ 내지 1500 ㎛, 예를 들어, 약 800 ㎛이다. 그러나, 더 큰 방울 및 더 작은 방울의 직경은 사용될 수 있다. 따라서, 상기 소수성 방울의 직경은 약 2 mm 이하, 또는 예를 들어, 1 mm 이하일 수 있다.
상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층의 형성은 복잡하지 않다. 전술된 바와 같이, 상기 친수성 담체 또는 상기 방울의 소수성 매체에 비-중합체 양친매성 분자를 제공하여 단순히 달성되고, 그 결과 만약 상기 방울이 충분한 시간 동안 친수성 담체에 남는다면, 상기 층은 자연적으로 형성할 수 있다. 상기 비-중합체 양친매성 분자는 친수성 담체 및 소수성 방울 사이의 계면에, 층, 통상적으로 단분자층을 자발적으로 형성되고, 이것은 본 발명의 앤캡슐화 액적의 주변층이 된다.
단계 (i)에서 사용된 소수성 매체는 어떤 치료제, 약물, 전구 약물, 진단 시약 또는 최종 앤캡슐화 액적의 소수성 매체에 포함하는 것이 요구된 다른 것과 같은 어떤 또 다른 시약을 포함할 수 있다.
단계 (ii)는 상기 멀티좀으로 포함되는 수성 액적의 제조에 관한 것으로, 단계 (ii)에서, 수성 매체의 액적은 비-중합체 양친매성 분자의 존재하에서 소수성 매체로 도입된다. 물론, 만약 하나 이상의 수성 액적이 멀티좀으로 포함된다면, 하나 이상의 액적은 단계 (ii)에 따라 이 단계에서 제조될 수 있고, 그 다음 상기 멀티좀에 대한 각각의 최종 액적은 단계 (iii)에 따라 소수성 방울로 이동될 수 있다.
단계 (ii)에서 사용된 소수성 매체는 통상적으로 단계 (i)의 소수성 방울을 생산하는데 사용된 동일한 소수성 매체이고, 본 발명의 앤캡슐화 액적에 대한 상기에서 정의된 바와 같은 어떤 소수성 매체일 수 있다. 상기 비-중합체 양친매성 분자는 일반적으로 소수성 매체에 존재한다. 그러나, 선택적으로, 예를 들어, 지질 소낭으로 현탁 또는 상기 수성 매체에 용해되어, 상기 액적의 수성 매체에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 만약 상기 비-중합체 양친매성 분자가 소수성 매체에 존재하지 않는다면, 이들은 단계 (i)에서 사용된 친수성 담체 및 상기 액적의 수성 매체 모두에 존재한다. 이것은 멀티좀의 안정도를 개선한다. 단계 (ii)에서 사용된 상기 비-중합체 양친매성 분자는 본 발명의 앤캡슐화 액적에 대해 상기에서 논의된 어떤 것 중 하나일 수 있다.
단계 (ii)에서 사용된 수성 매체는 순수한 물일 수 있다. 선택적으로, 이것은 수성 용액일 수 있다. 상기 수성 용액은 멀티좀 내에 문제의 액적의 사용 또는 목적을 위해 선택될 수 있다. 하나의 중요한 특성은 pH이고, 이것은 광범위한 범위에 걸쳐 변화될 수 있다. 상기 수성 매체는, 따라서, 수성 완충제 용액일 수 있다. 어떤 적절한 완충제는 원하는 pH에 의존하여, 사용될 수 있다. 상기 완충제 용액은 예를 들어, KCl를 갖는, Tris HCl 및 EDTA를 포함할 수 있다. 만약 상기 수성 액적이 치료제, 약물, 전구 약물, 진단 시약, 활성제, 불활성제, 또는 센서 분자와 같은, 시약을 함유한다면, 상기 시약은 통상적으로 이 단계에서 액적을 형성하는데 사용된 수성 매체에 존재한다. 유사하게, 만약 상기 수성 액적이 상기 멀티좀에서 다른 액적과, 또는 외부 환경과 소통한다면, 그 다음 적절한 막 단백질은 이 단계의 수성 매체에 통상적으로 존재할 것이다. 상기 단백질은 본 발명의 앤캡슐화 액적에 대해 상기 논의된 어떤 막 단백질일 수 있다.
상기 수성 매체의 액적은 미세페펫, 예를 들어, 전기영동 겔-로딩 팁을 갖는 피펫을 사용하여 단계 (ii)의 소수성 매체로 도입될 수 있다. 상기 미세페펫의 팁은 통상적으로 상기 수성 매체로 채워지고, 그 다음 소수성 매체에 침지된다. 상기 충분한 수성 매체는 작은 펜던트 액적을 노출시키기 위해 방출될 수 있고, 상기 액적은 그 다음 어떤 편리한 방법, 예를 들어, 소수성 매체를 함유하는 용기 벽 (vessel wall)에 대하여 팁을 압박하여, 팁으로부터 분리될 수 있다. 상기 수성 액적의 부피는 일반적으로 80 nL 이하이지만, 예를 들어, 20 nL 이하일 수 있다.
상기 수성 매체의 표면 주위에 상기 비-중합체 양친매성 분자의 외부층의 형성은 간단하다. 전술된 바와 같이, 상기 액적의 수성 매체에서 또는 상기 소수성 매체에 비-중합체 양친매성 분자를 제공하여 간단히 달성되고, 그 결과 만약 상기 액적이 충분한 시간 동안 소수성 매체에 남겨진다면, 상기 외부층은 자연적으로 형성할 수 있다. 상기 비-중합체 양친매성 분자는 상기 액적 및 소수성 매체 사이의 계면에서, 층, 통상적으로 단분자층을 자발적으로 형성한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적을 생산하기 위해, 소수성 매체의 방울에 수성 액적을 이동시키는 단계는, 어떤 적절한 방법에 의해 수행될 수 있고; 상기 액적은 확신 있고 쉽게 조작된다. 상기 단계는 일반적으로 페펫을 사용하여 수행된다. 그러나, 이러한 단계는 또한 자동화된 절차의 일부로서, 미세유체 장치에서 수행될 수 있다 (하기 참조).
만약 상기 앤캡슐화 액적이 하나 이상의 수성 액적을 함유한다면, 하나 이상의 액적은 상기 소수성 방울로 복수의 수성 액적, 사슬 또는 온전한 DIB 네트워크를 이동시키거나, 또는 나중에 인시튜 이중층을 형성할 수 있는, 연결되지 않은 액적을 이동시켜, 이러한 방식에서 소수성 방울으로 이동될 수 있다. 전술된 바와 같이, 상기 액적은 확신 있고 쉽게 조작된다.
통상적으로 단계 (iii)는 시간이 (a) 수성 매체의 액적 또는 액적들의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층의 형성 및 (b) 소수성 매체의 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층의 형성을 허용하기에 충분히 지날 때까지 수행되지 않는다. 안정한 단분자층을 형성하기에 필요한 이러한 시간은 배양 시간으로 언급될 수 있다. 상기 배양 시간은 사용된 소수성 매체 및 상기 비-중합체 양친매성 분자의 농도에 의존하여 변한다.
하나의 구현 예에 있어서, 단계 (iii)은 단계 (i) 및 (ii)의 완성 후 적어도 5분까지 수행되지 않는다. 다른 구현 예에 있어서, 단계 (iii)은 단계 (i) 및 (ii)의 완성 후 적어도 10분까지, 또는 예를 들어, 단계 (i) 및 (ii)의 완성 후 적어도 25분까지 수행되지 않는다. 오직 DPhPC를 사용한 실험에 있어서, 대기 시간은 ~10 분이고; DOPE/OA 혼합물을 사용하면, ~25분; DSPC/DPhPC 혼합물을 사용하면, ~10이다.
본 발명의 앤캡슐화 액적을 생산하기 위한 본 발명의 공정은 친수성 담체로부터 상기 앤캡슐화 액적을 회수하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 앤캡슐화 액적은 상기 친수성 담체로부터 앤캡슐화 액적을 제거하기 위한, 어떤 적절한 기술을 사용하여, 예를 들어, 피펫을 사용하여 회수될 수 있다.
상기 공정은 또 다른 친수성 담체로 회수된 앤캡슐화 액적을 재-도입하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 또 다른 친수성 담체는 예를 들어 약학적으로 허용가능한 조성물, 물 또는 수성 용액, 이온성 액체, 또는 예를 들어, 점성 또는 단단한 친수성 담체 물질일 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적을 생산하기 위한 본 발명의 공정은 상기 친수성 담체와 또 다른 친수성 담체를 교환하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 친수성 담체가 수성 용액인 경우, 상기 공정은 새로운 수성 상으로 계열 희석에 의해 상기 수성 용액을 교환하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 앤캡슐화 액적을 생산하기 위해 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 공정에 의해 얻어질 수 있는 앤캡슐화 액적을 더욱 제공한다.
본 발명의 앤캡슐화 액적은 또한 예를 들어, 연속 쉐어링 (consecutive shearing) 또는 흐름-집중 (flow-focusing) 미세유체 장치를 사용할 수 있는 미세유체 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 기술은 작은 부피 및 직경 (예를 들어, 약 100 ㎛의 직경)을 갖는 앤캡슐화 액적을 생산하는데 특히 적절하다. 미세유체 기술은, 예를 들어, 약물 전달 적용에서, 생체 내에 투여를 위한 앤캡슐화 액적을 생산하는데 적절하다.
따라서, 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 앤캡슐화 액적을 생산하기 위한 공정을 제공하고, 이러한 공정은:
(i) 미세유체 장치의 수성 매체를 함유하는 제1 채널로부터 상기 수성 매체의 액적을 상기 미세유체 장치의 소수성 매체를 함유하는 제2 채널로 도입시키는 단계,
여기서 상기 제1 채널에서 수성 매체, 또는 상기 제2 채널에서 소수성 매체, 또는 이들 모두는, 비-중합체 양친매성 분자를 더욱 포함하고,
이에 의해 상기 제2 채널에서 상기 소수성 매체 내에 수성 액적을 제조하며, 상기 수성 액적은: (a) 상기 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하고; 그리고
(ii) 상기 제2 채널로부터의, 수성 액적을 포함하는 소수성 매체의 방울을 상기 미세유체 장치의 친수성 담체를 함유하는 제3 채널로 도입시키는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 제2 채널에서 소수성 매체, 또는 상기 제3 채널에서 친수성 담체 또는 이들 모두는, 비-중합체 양친매성 분자를 더욱 포함하고,
이에 의해 상기 제3 채널에서 상기 친수성 담체 내에 앤캡슐화 액적을 제조하며, 상기 앤캡슐화 액적은:
- 상기 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적을 포함한다.
상기 공정은, 예를 들어, 연속 쉐어링 공정 (Okushima, S. et al., Langmuir 20, 9905-9908 (2004)) 또는 흐름-집중 공정 (Chu, L. Y. et al., Angew. Chem. Int. Edit. 46, 8970-8974 (2007); Seo, M. et al., Soft Matter 3, 986-992 (2007))일 수 있다.
하나의 구현 예에 있어서, 상기 공정은 연속 쉐어링 공정이다. 통상적으로, 이러한 구현 예에 있어서, 상기 제1 채널은 상기 제2 채널과 실질적으로 T-자 접합을 형성하고, 상기 제2 채널은 상기 제3 채널과 실질적으로 T-자 접합을 형성한다. 이러한 배열은 상기 제2 채널 말단에 상기 소수성 매체의 방울의 생산뿐만 아니라, 제1 및 제2 채널 사이의 접합에서 수성 액적의 생산을 돕는다. 통상적으로, 상기 제1 및 제2 채널은 소수성 물질로 제조된다. 이것은 액적을 형성하도록 및 액적 형태로 유지하도록 이러한 채널들에서 수성 매체를 돕는다. 통상적으로, 상기 제3 채널은 친수성 물질로 제조된다. 이것은 상기 제3 채널에 방울의 형태로 유지하도록 소수성 매체 (그 자체가 상기 수성 액적 또는 액적들을 함유함)의 방울을 돕는다.
또 다른 구현 예에 있어서, 상기 공정은 흐름 집중 공정이다. 통상적으로, 이러한 구현 예에 있어서, 상기 수성 매체의 액적이 생산되는 제1 채널의 말단은 상기 제2 채널로 돌출되고, 상기 소수성 매체의 방울이 생산되는 제2 채널의 말단은 상기 제3 채널로 돌출된다. 일반적으로, 상기 수성 매체는, 연속 공정에서, 상기 제1 채널을 통해 흐르고, 상기 소수성 매체는 상기 제2 채널을 통해 흐르며, 상기 담체 매체는 상기 제3 채널을 통해 흐른다.
상기 공정은 상기 미세유체 장치로부터 상기 친수성 담체 내에 앤캡슐화 액적의 회수를 더욱 포함할 수 있다.
상기 공정은 상기 친수성 담체로부터 앤캡슐화 액적을 회수하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 앤캡슐화 액적은 어떤 적절한 기술을 사용하여, 예를 들어, 상기 친수성 담체로부터 앤캡슐화 액적을 제거하기 위해 페펫을 사용하거나, 또는 미세유체 장치에서 자동화된 절차를 사용하여 회수될 수 있다. 미세유체 장치는 예를 들어 멀티좀을 위한 하나 이상의 트랩으로 장착될 수 있어, 제자리에서 멀티좀을 유지하는 동안 외부 수성 상이 교환되는 것을 허용한다. 선택적으로, 미세유체 장치는 멀티좀의 생산에서 하나의 외부 수성 상을 사용할 수 있고, 그 다음 다른 외부 수성 상으로 상기 멀티좀을 생산한다.
상기 공정은 또 다른 친수성 담체로 회수된 앤캡슐화 액적을 재-도입하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 또 다른 친수성 담체는 약학적으로 허용가능한 조성물, 물 또는 수성 용액, 이온성 액체, 또는 예를 들어, 점성 또는 단단한 친수성 담체 물질일 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 앤캡슐화 액적을 생산하기 위한 본 발명의 공정은 또 다른 친수성 담체와 상기 친수성 담체를 교환하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 친수성 담체가 수성 용액인 경우, 상기 공정은 새로운 수성 상으로 계열 희석에 의해, 또는 미세유체 장치에서 자동화된 절차를 사용하여 상기 수성 용액을 교환하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 앤캡슐화 액적을 생산에 대한 전술된 바와 같은 본 발명의 공정에 의해 얻어질 수 있는 앤캡슐화 액적을 더욱 제공한다.
본 발명은 하기의 실시 예에서 더욱 설명된다:
실시 예
일반적 방법
지질 및 오일
모든 지질은 Avanti Polar Lipid로부터 분말로 구매하고, 10 mg ml-1로 펜탄 (DPhPC, DOPE) 또는 클로로폼 (DSPC)에 용해된다. 이러한 모액 (stock solution)의 일부는 진공하에서 적어도 30분을 수반하여 질소 스트림을 사용하여 증발된다. 상기 잔류물은 다양한 오일 혼합물에서 다양한 농도로 재-용해된다. 오직 DPhPC을 사용하는 실험에 대하여, 상기 지질 농도는 0.1-0.2 mg ml-1이고, 상기 오일은 실리콘 오일 (Silicone Oil AR 20) 및 헥사데칸 (Sigma-Aldrich사에서)의 9:1 (v/v) 혼합물이다. 상기 pH 민감도 실험은 실리콘 오일 및 헥사데칸의 19:1 (v/v) 혼합물에서, 10 mg ml-1 총 농도에서 DOPE 및 OA (Sigma-Aldrich)의 2:1 (mol/mol) 혼합물이 사용된다. 상기 온도 민감도 실험은 실리콘 오일 및 헥사데칸의 9:1 (v/v) 혼합물에서, 1 mg ml- 1총 농도에서 DSPC 및 DPhPC의 3:1 (mol/mol) 혼합물이 사용된다.
αHL 기공
야생형 (WT) 포도상구균 (staphylococcal)α-헤몰리신 (αHL) 단량체는 생체 외에서 전사/번역 (IVTT)에 의해 제조되고, 토끼 적혈구 세포막으로 배양에 의해 헵타머화된다. 상기 헵타머는 그 다음 ~1 ng μL-1의 최종 농도로 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 정제된다 (Maglia, G. et al. Method. Enzymol. 475, 591-623, 2010). 상기 단백질은 전기적 기록 실험을 위해 10- 내지 100-배 희석된다. 형광 실험에서 사용된 αHL을 제조하는데 사용된 절차는 기재되었다 (Maglia, G. et al. Nano Lett. 9, 3831-3836, 2009). 간단하게, 배양은 황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus)의 Wood 46 균주의 단일 클론으로부터 성장된다. αHL의 자발적으로 올리고머화된 헵타머는 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 전기영동에 의해 정제되고, pH 8.0에서 150 mM NaCl 및 0.3% (w/v) SDS을 갖는 20 mM 인산 나트륨 완충제에 ~2 mg ml-1로 저장된다. 이러한 단백질 용액은 50-배 희석하여 수성 액적에 첨가된다.
완충제 (Buffers)
상기 사용된 완충제는, pH 민감도 실험을 제외하고는, 본문에 제공된 바와 같은 지질 농도, KCl 및 EDTA로, 25 mM Tris HCl, pH 8.0이고, 상기 pH 민감도 실험에서 상기 완충제는 pH 8.0 또는 pH 3.0에서 10 mM Tris HCl, 10 mM 숙신산, 50 mM KCl, 50 ㎛ EDTA이다.
실시 예 1: 앤캡슐화 (앤캡슐화)
멀티좀은 3 단계로 제조된다. 먼저, 직경 ~300 ㎛의 완충제의 액적은 용해된 지질을 함유하는 오일에 피펫으로 옮겨지고; 통상적으로 상기 오일은 실리콘 오일 및 헥사데칸의 9:1 (vol/vol) 혼합물이며, 상기 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)이다. 둘째, 직경 ~800 ㎛의 동일한 오일 용액의 액적은 벌크 완충제에 놓인다. 마지막으로, ~5 분 후에, 다수의 상기 수성 액적은 상기 오일 액적으로 피펫으로 이동된다. 앤캘슐화의 ~1 분 내에, 상기 내부 액적은 서로, 및 상기 오일 액적의 표면에 들러붙는다 (도 1c-e). 이러한 구조는 적어도 24 h 동안 안정하다. 단순성을 위하여, 상기 용어 "멀티좀"은 앤캘슐화된 액적의 수와 상관없이 본 명세서에 사용된다.
앤캡슐화 전에 몇 분 (배양 시간)을 기다리는 것이 바람직하다. 만약 너무 빨리 이동된다면, 상기 수성 액적은 서로 및 외부 수성 상과 융합하는 경향이 있다. 상기 배양 시간은 상기 수성 및 오일 액적 주위에 잘-팩킹된 지질 단분자층을 형성하기 위해 요구될 수 있다. 이러한 단분자층 그 다음 두 개의 앤캡슐화된 액적들 (내부 이중층) 사이, 또는 내부 액적 및 외부 수성 용액 (외부 이중층) 사이에서, 지질 이중층을 형성하기 위해 들러붙을 수 있다.
대부분의 예견된 적용에 있어서, 멀티좀은 물에서 거의 중립 부력 (neutrally buoyant)이어야 하고, 따라서 사용된 실리콘 오일은 이의 밀도가 1.01 g.cm-3인 것에서 선택된다. 그러나, 동등하게 중용한 것은 제공된 오일로 안정한 멀티좀을 형성하기 위해 요구된 최소 배양 시간인데: 이것은 0.2 mg ml-1 DPhPC을 함유하는 상기 실리콘 오일 및 헥사데칸 혼합물에 대해 <5 분인 반면, 1-브로모도데칸으로 제조된 멀티좀 (밀도 1.04 g cm-3)은 긴 배양 시간 이후 및 높은 지질 농도에서도 안정하지 않다.
앤캡슐화 - 방법
장기적인 기간동안 멀티좀을 연구하기 위하여, 구조를 파괴할 수 있는 용기의 벽과 어떤 상호작용을 피하면서 그들의 위치를 고정하는 것이 필요하다. 예를 들어, 만약 멀티좀의 오일 방울이, 지질 단분자층으로 전체적으로 코팅되기 전에, 공기-벌크 수성 계면과 접촉하다면, 상기 방울은 그 계면에서 퍼질 것이다. 유사하게, 만약 상기 멀티좀이 단분자층 형성 전에 용기 벽과 접촉한다면, 상기 오일 방울은 그 표면에 들러붙을 수 있고, 이는 외부 이중층의 형성을 방해할 수 있다. 이것은, 상기 벌크 수성 완충제에 침지된, 직경 ~0.8-1.5 mm의 은 와이어 또는 플라스틱의 작은 루프로부터 각 멀티좀을 현탁시켜 (suspending) 달성된다. 은 루프는 실린더형 형판 주위를 100 ㎛ 직경의 은 와이어로 감싸 제조된다. 플라스틱 루프는 핏펫 팁으로부터 절단된 단면으로 이루어진다. 각 루프는 그 다음 상기 용기 벽에 고정된 은 와이어에 부착된다. 멀티좀은 기계적 방해에 의해 은 루프에서 제거될 수 있는 반면, 플라스틱 루프는 매우 확실히 멀티좀을 보유하는데 이는 상기 오일 액적에 그들의 강한 부착 때문이다.
오일에서 지질의 용액은 완충제에서 현탁된 ~0.5-2 μL 부피의 오일 액적을 만들기 위해 루프상에서 조제된다. 미세기계화 아크릴 웰은 동일한 오일 용액으로 채워지고, 부피 ~0.5-70 nl의 수성 액적은 전기영동 겔-로딩 팁으로 2 μL 피펫을 사용하여 이들 웰에 만들어진다. 상기 팁은 상기 수성 용액의 ~200 nl로 채우고, 그 다음 오일 용액에 침지된다. 상기 충분한 용액이 충분히 작은 펜던트 방울에 노출하도록 방출되고, 이러한 방울은 상기 웰의 버텀에 대하여 피펫 팁을 압축시켜 팁으로부터 분리된다. 대기 시간 후, 피펫은 벌크 수성 용액에서 오일 액적으로 하나 이상의 수성 액적의 전달을 위해 사용된다. 오직 DPhPC를 사용하는 실험에 있어서, 상기 대기 시간은 ~10분이고; DOPE/OA 혼합물을 사용하는 경우, ~ 25분이며; DSPC/DPhPC 혼합물을 사용하는 경우, ~10 분이다. 몇 가지 내부 액적을 갖는 멀티좀은, 고유의 DIB 네트워크를 이동하거나, 또는 연결되지 않는 액적을 이동시켜 형성될 수 있고, 그 다음 인시튜 이중층을 형성한다.
자유 에너지 지역 (Free energy landscape)
이중층 형성 전이지만 앤캡슐화 후에, 멀티좀에서 오일 및 내부 액적이 구형 기하학 구조를 적용하여 이들의 표면 에너지를 최소화한다. 이중층 형성 후, 멀티좀은 도 2b-d에 나타낸 기하학 구조를 갖는다. 이들 기하학 구조는 이중층을 형성하기 위해 나란히 놓인 단분자층의 유리한 부착, 및 큰 단분자층 또는 이중층 표면적을 노출시키는 불리한 뒤틀림 (unfavourable distortion) 사이를 포함하는 준안정성을 나타낸다. 이러한 상태는 벌크 수성 상을 갖는 내부 액적의 융합이 상기 시스템의 자유 에너지를 더욱 감소시키기 때문에, 오직 열역학적으로 안정하다. 단분자층 및 이중층의 표면 장력 (surface tension), 각각 γm 및 γb은 각 종류의 계면의 단위 면적 (unit area)을 생성하는 에너지적 비용의 측정이다. 멀티좀의 가능한 기하학 구조의 범위를 고려하고, 및 이중층 형성 전 상태와 비교하여 각 기하학 구조의 에너지 비용 또는 이점을 계산하여, 가장 유리한 기하학 구조를 예견할 수 있다. 본 명세서에는 단일 내부 액적을 갖는 멀티좀에 대한 이러한 계산의 개요를 나타낸다.
먼저, 모든 가능한 기하학 구조에 노출하기 위해, 멀티좀의 구조를 파라미터화하는 것이 필요하다. 두 개의 단분자층들 및 이중층의 각각이 그들 자신의 표면적을 최소화한다고 가정한다면, 이것은 상기 멀티좀의 기하학 구조가 구형 캡으로 구성되는 것으로 결과한다. 상기 멀티좀의 기하학 구조는 그 다음 도 2a에 예시된 세 개의 접촉 각에 의해 정의될 수 있다. 상기 오일 및 내부 액적에 대한 부피 전환을 도입하여, 이들 각 중 하나는 제약되고, 다른 두 개는 자유 가변성으로 남는다. 제약되는 이러한 각의 선택은 임의적이다.
특정 기하학 구조를 갖는 멀티좀의 형성의 자유 에너지는 각 계면의 표면 장력에 의해 측량된, 구형 상태와 비교하여 단분자층 및 이중층 표면적에서 변화에 의해 간단히 제공된다. 접촉각 (θ1, θ2, θ3)을 갖는 멀티좀의 형성의 자유 에너지는:
여기서, R1 및 R2는 이중층 형성 전에, 오일 및 내부 액적 각각의 반지름이고; ri은 접촉각 θi에 상응하는 세 개의 구형 캡의 곡률의 반지름이며, θi, R1 및 R2으로부터 평가될 수 있다.
자유 가변성으로 θ2 및 θ3을 선택하여, 다음의 파라미터 값: R1 = 400 ㎛, R2 = 200 ㎛, γm = 5 mN m-1 (Yue, B. Y. et al., J. Chem. Soc. Farad. T. 1 72, 2685-2693 (1976); Morisaku, T., et al. Anal. Sci. 20, 1605-1608 (2004)) 및 γb/γm = 0.68을 사용하여, 자유 에너지 지역 (도 2b)를 생산하기 위해 θ2 및 θ3의 각각의 가능한 조합에서 △F을 평가할 수 있다. 상기 γb/γm의 값은 DIB 접촉 각의 측정으로부터 얻어진다. 상기 지역 (landscape)의 최소는 도 2a에 예시된 국소적 평형 기하학 구조를 나타낸다. 상기 지역에 계산하는데 사용된 조건에 대하여, 평형 접촉 각은: (θ1, θ2, θ3) = (33°, 173°, 77°)이다.
γm 또는 γb의 절대값은 절대 자유 에너지의 형성을 계산하는데 오직 요구된다. 상기 멀티좀의 평형 기하학 구조는 제공된 액적 부피의 비 및 비 γb/γm로 계산될 수 있다. 정반대로, 멀티좀에 대한 특정의 원하는 평형 기하학 구조를 제공하여, 본 명세서에 나타낸 것과 유사한 분석은 상대적 액적 부피 및 표면 장력에 대해 설계 제약을 부과할 수 있다.
실시 예 2: 전기적 측정
벌크 오일에서 DIBs의 시스템 (Holden, M. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007))에서 유추하여, 멀티좀의 이중층으로 막 펌프, 채널 및 기공의 혼입은 다양한 내부 액적 및 외부 용액 사이에서, 전기적 소통 및 물질의 교환에 대한 정밀한 조절을 허용할 것이다. 멀티좀의 외부 이중층이 막 단백질의 삽입을 지지할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 전기적 소통은 단일 내부 액적을 갖는 멀티좀의 외부 이중층을 가로질러 수행된다. 이것을 달성하기 위하여, 유리-절연 Ag/AgCl 전극은 이의 팁에서 오직 전기적으로 노출되는 것으로 제조된다 (하기 방법을 참조). 수성 액적이 오일 액적에 이동된 후 즉시, 상기 전극 팁은 내부 액적으로 삽입된다. 상기 전극의 미세조작 (micromanipulation)을 통해, 상기 내부 액적은 그 다음 이중층 형성을 허용하기 위해 오일 액적의 표면으로 이끌어진다 (도 3a).
야생형 (WT) 포도상구균 α-헤몰리신 (αHL)이 내부 액적에서 포함된 경우, 이온성 전류의 단계적 증가는 외부 수성 용액에서 삽입 전극 및 보통의 Ag/AgCl 전극으로 기록된 것으로서, 이중층 형성의 1분 이내로 관측된다. 이러한 전류 트레이스 (current trace)의 샘플은 도 3b에서 나타낸다. 상기 단계의 진폭은 제공된 조건 (+50 mV, 500mM KCl) 하에서 αHL 기공에 대해 ~18.6 pA의 예상된 전류와 일치하는, 18.6 ±0.8 pA (평균 ±s.d., n = 16)이다 (Stoddart, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 7702-7707 (2009)). 따라서, 전류 단계는 외부 이중층으로 αHL 기공의 연속적 삽입에 상응한다.
삽입한 기공이 αHL인 것을 확인하기 위하여, 상기 실험은 다중 삽입의 가능성을 감소시키기 위해 더 낮은 농도의 단백질로 반복된다. 몇 분 후, 상기 전류가 상기 외부 이중층으로 단일αHL 기공의 삽입에 상응하는, 0으로부터 정상 수준으로 단계적이다. 나중에 즉시, γ-시클로덱트린 (γCD, ~10 ㎛)은 상기 외부 수성 용액에 첨가되고, 이것은 1 M KCl에서 -50 mV로 63.7 ±2.0% (평균 ±s.d., n = 673)의 차단 진폭 (blocking amplitude)으로 기공 (도 3c)를 통해 전류를 가역적으로 차단을 유발한다. 체류시간 (dwell times)의 10 대수 히스토그램에 대한 최소 제곱법 선형 적합도 (least-squares linear fit)는 4.0 ± 0.6 s-1 (평균 ±s.d.)의 해리 속도를 제공한다. DIBs를 사용한 이전 연구는 pH 7.0 완충제에서 2.0 s-1의 해리 속도 및 ~60%의 차단 진폭을 확인하였다 (Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007).). pH 8.0 완충제에서 본 명세서에서 알 수 있는 더 높은 해리 속도는 αHL로부터 β-사이클로덱스트린의 해리 속도가 pH로 증가하는 연구결과와 일치한다 (Gu, L. Q. et al., Biophys. J. 79, 1967-1975 (2000)).
본 명세서에 개발된 플랫폼의 전기적 기록은 이들의 이중층이 나란히 놓이도록 단일 내부 액적을 갖는 두 개의 멀티좀을 위치시켜 단일-분자 수준에서, 갭 접합 (Nakagawa, S. et al., Curr. Opin. Struc. Biol. 20, 423-430 (2010)) 및 핵 기공 (Strambio-De-Castillia, C. et al., Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 11, 490-501 (2010))과 같은, 두 개의 지질 이중층을 걸치는 기공-형성 복합체를 연구하는데 사용될 수 있다.
전기적 측정 - 방법
순수 실리콘 오일로 제조된 DIBs 및 멀티좀을 가로질러 측정된 전류는 누설 전류의 종종 파열을 나타내고, 이것은 작은 비율의 헥사데칸과 오일을 혼합하여 압축된다.
전류는 패치-클램프 증폭제 (Axopatch 200B, Axon Instruments) 및 16-비트 디지타이저 (1322A, Molecular Devices)를 갖는 Ag/AgCl 전극을 사용하여 측정된다. 데이터는 2 kHz의 저주파-통과 바셀 필터 (low-pass Bessel filter)로 10 kHz에서 획득되고, 분석을 위하여 400 Hz의 저주파-통과 바셀 필터로 더욱 여과된다.
Ag/AgCl 전극은 적어도 30분 동안 25% 차아염소산나트륨 용액으로 25 또는 100 ㎛ 직경 은 와이어를 처리하여 제조된다 (각각, Scientific Wire Company 및 Sigma Aldrich).
유리-칼집 전극 (Glass-sheathed electrode)은 142 ㎛ 및 559 ㎛의 내부 및 외부 직경을 각각 갖는 유리 모세관을 통해 25 ㎛-직경 은 와이어로 스레딩 (threading)하여 제조된다 (Drummond). 상기 모세관은 그 다음 이것이 두 개의 조각으로 분리되도록, 그 내부로 와이어로 당긴다 (PC-10, Narishige). 이들 조각 중 와이어 내부 하나는 상기 모세관의 더 큰 입구에서 전극 핀으로 납땜된다. 트위져 (Tweezer)는 모세관의 말단을 당겨 ~50 ㎛의 유리를 다듬는데 사용되며, 상기 와이어의 말단을 노출시킨다. 이러한 말단은 그 다음 전술된 바와 같은 차아염소산나트륨 용액으로 처리된다. 상기 모세관의 당겨진 말단 근처의 영역은 내부 액적 및 외부 수성 용액 사이의 전류 누설을 방지하기 위해 실리콘 고무 (3140 RTV Coating, Dow Corning)로 코팅된다 (도 3a).
실시 예 3: 확산에 의한 소통
αHL 기공이 멀티좀 외부 이중층들로 삽입될 수 있도록 만들기 위하여, 본 발명자들은 멀티좀의 내부 액적이 서로 및 외부 수성 용액과 수동적으로 소통하기 위해, 즉, 외부적으로 적용된 전압으로 이온 유체를 구동하지 않고, 이들 기공을 사용할 수 있는지의 여부를 분석하였다.
먼저 본 발명자들은 앤캡슐화 액적이 외부 수성 용액과 소통할 수 있는지 여부를 시험하였다. 멀티좀은 10,000 MW 덱스트린에 접합된 αHL 기공 및 플로우-4 (Ca2 +-민감성 염료)를 함유하는 단일 내부 액적을 제조되고, 형광 분광법에 의해 감시된다. 상기 외부 용액에 Ca2 +의 첨가는 초기에 검정의 내부 액적이 ~1.5 h에 걸쳐 형광을 나타내는 반면, αHL을 갖지 않는 멀티좀은 형광 증가가 없는 것을 보여준다 (n=6). 본 발명자들은 αHL 함유 멀티좀에서 형광 증가가 상기 외부 이중층에서 αHL 기공을 통해, 내부 액적으로 외부 수성 용액으로부터 Ca2 + 이온의 확산에 의해 유발된 것으로 결론을 내렸다. 멀티좀에 사용된 것과 같은 동일한 농도의 αHL로 DIB를 가로지르는 전기 측정으로부터, 상기 멀티좀 이중층에 삽입된 αHL 기공의 수는 수천인 것으로 예상된다.
본 발명자들은 그 다음 멀티좀에서 두 개의 내부 액적이 덱스트란-접합 플로우-4 및 하나의 액적에 αHL 및 다른 액적에 Ca2 +를 포함하는 것에 의해, 유사한 방식에서 서로 소통될 수 있는지의 여부를 시험한다. 플로우-4를 함유하는 액적은 ~1 h에 걸쳐 형광이 증가하여, 내부 이중층에서 αHL 기공을 통해 내부 액적들 사이의 Ca2 + 이온의 확산을 나타낸다 (도 4b). 종합하면, 이러한 결과는 멀티좀 및 외부 용액 사이, 및 멀티좀의 내부 액적 내에 수동적 확산에 의한 소통을 입증한다.
상기 형광 측정은 Ca2 + 플럭스의 출발 및 형광 증가 사이의 시간 차이를 나타낸다. 이것은 배경 형광을 생산할 수 있는, 완충제 염에 존재하는 소량의 오염원 Ca2 +를 킬레이트하기 위해 내부 액적에 포함된, EDTA에 의한 Ca2 +의 경쟁적 결합에 기인한다. Ca2 +는 유사한 속도로 (kon ~107-108 M-1 s-1) 플로우-4 및 EDTA에 결합되지만, 각각 koff ~400 s-1 및 <1 s-1로, EDTA보다 더 쉽게 플로우-4로부터 해리된다 (Naraghi, M., Cell Calcium 22, 255-268 (1997); Johnson, J. D. et al., Biophys. J. 76, 1514-1522 (1999)). 따라서, 분 단위의 시간척도에 따라, 상기 EDTA는 상기 액적에서 거의 모든 Ca2 +에 대해 씽크 (sink)로 작용하고, 오직 상기 EDTA가 포화된 경우가 상기 플루우-4 분자 결합 Ca2 + 이온의 중요한 비율일 수 있다.
방법 - 형광 측정
10,000 MW 덱스트린 (Invitrogen)에 접합된 플로우-4의 칼륨염은 순수한 물에 용해되고, 25 ㎛의 최종 염료 농도로 액적에 첨가된다. 염료-함유 액적은 또한 50 ㎛ EDTA 디소듐염을 함유한다. Ca2 +-함유 액적은 100 mM CaCl2을 함유한다.
형광 분광법은 조명을 위한 수은 아크형 램프 및 적절한 필터 큐브를 사용하여, Nikon CFI DL 10X 대물렌즈를 갖는 Nikon Eclipse TE2000-S 도립 현미경 (inverted microscope)으로 수행된다. 사진은 400 ms의 노출 및 179의 게인 (gain)으로, Hamamatsu C9100 EMCCD 카메라로 찍는다. 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정된다 (Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J. & Ram, S. J. Image processing with ImageJ. 11, 36-42 (2004)).
실시 예 4: 약물 전달을 위한 멀티좀
개별적 구획에서 몇 가지 화학 종들을 유지, 및 조절된 방식으로 이들의 조합을 허용하는, 단일 멀티좀의 능력은 약물 전달의 새로운 수단을 가능하게 한다. 종래의 리포좀을 사용하여 세포로 하나를 초과하는 약학적 종들의 전달은 이러한 종들이 서로 앤캡슐화되는 것을 요구하여, 이들 사이에 잠재적으로 바람직하게 않는 반응을 허용하거나; 또는 개별적으로, 이러한 경우에 있어서, 세포는 각각 종들의 좋지 못한 조절 비율을 수용할 것이다. 반대로, (오일 상에 포함하는) 단일 멀티좀의 다른 구획에서 앤캡슐화된 몇 가지 약물의 전달은 복용량 비율에 따라 정밀한 조절을 허용할 것이다. 이것은 작용의 독립적 메커니즘을 갖는 약물 전달에 대해 유리할 수 있고; 고정된 비율에서 세포에 의한 그들의 섭취는 그들의 전체적인 효율을 증가시키고, 상기 약물 중 어느 하나에 대한 내성 성장의 가능성을 감소시킬 것으로 기대될 수 있다.
독립적 약물의 동시에 전달을 넘어, 멀티좀 전달은 다른 종들에 의해 활성화될 수 있는 약물의 불활성 형태인, 전구 약물에 특별하게 적합할 것이다 (Rautio, J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 255-270 (2008)). 이러한 경우에 있어서, 각 멀티좀은 하나의 내부 액적에서 전구 약물, 및 또 다른 내부 액적에서 활성제를 함유할 것이다. (pH 또는 온도에서 변화와 같은) 몇몇 외부 자극시 액적 내용물을 함께 방출하는 것은 상기 전구 약물 및 활성제의 조합을 허용하여, 상기 활성 종들을 인시튜 생산한다. 이것은, 예를 들어, 너무 불안정하거나 또는 불용성이어서 활성 상태에서 전달할 수 없는 약물의 투여를 허용한다. 미프록시펜 포스페이트를 예를 들면, 항암제 미프록시펜의 불활성 포스페이트 에스테르는, 미프록시펜보다 ~1,000-배 더 큰 수성 용해도를 갖고, 알칼리 포스페타아제에 의해 활성 종으로 전환된다 (Rautio, J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 255-270 (2008)). 반대로, 멀티좀은 "소프트 약물" (또 다른 종에 의해 불활성화된 활성 약물; Bodor, N. et al., Med. Res. Rev. 20, 58-101 (2000))을 전달하는데 사용될 수 있다. 상기 동일한 멀티좀의 개별 액적에서 상기 활성 약물 및 이의 불활성제의 포함은 상기 활성 약물의 수명에 걸쳐 정밀한 조절을 제공할 수 있다.
전구 약물의 전달에 대한 두 개의 광범위한 접근이 있다. 하나는 생체 내에 이미 존재하는 활성제의 사용을 만들고 (Rautio, J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 255-270 (2008)), 따라서, 활성제의 제한된 선택을 갖는다. 다른 접근법에 있어서, 항체-, 유전자- 및 바이러스-직접 효소 전구 약물 요법 (ADEPT, GDEPT 및 VDEPT, 각각)에서와 같이, 외인성 활성제는 전구 약물의 계통적 투여 전에 표적 세포에 공급된다 (Niculescu-Duvaz, I. I. et al., Adv. Drug Deliver. Rev. 26, 151-172 (1997)). 비록 이들 접근법들은 넓은 범위의 활성제의 이용을 만들지라도, 이들은 고려해야할 장애와 직면한다. ADEPT에 있어서, 상기 활성제는 특정 세포 형의 표면으로 표적화된 항체에 연결된다. 이러한 연결된 항체는 면역성 합병증을 도입하고 진전시켜 비용이 들 수 있고 (Xu, G. et al., Clin. Cancer Res. 7, 3314-3324 (2001)); 더욱이, 상기 활성 약물은 반드시 세포외 종으로부터 시토졸로 침투할 수 있어야 한다. 비록 GDEPT 및 VDEPT이 표적 세포로 전구 약물-활성 효소에 대한 유전 물질을 전달하여 이들 문제점을 피할지라도, 이들 접근법은 높은 수준으로 발현될 수 있는 단백질 활성제에 제한된다 (Xu, G. et al., Clin. Cancer Res. 7, 3314-3324 (2001)).
현재의 전구 약물 전달 시스템에 적용되는 제약은, 개별적 구획에 전구 약물 및 활성제를 함유하는, 멀티좀으로 전달하여 피할 수 있다. 모든 약물 전달 비히클에 대한 가장 중요한 문제점은 적절한 부위에 포획된 약물의 방출을 촉발시키는 것이다. 본 명세서에서 본 발명자들은 1차로 pH에서 감소에 기초하고, 2차로 온도에서 상승에 기초하여, 촉발된 방출의 두 개의 확립된 메커니즘의 멀티좀에 대한 적용을 입증하였다.
pH 민감도
리포좀은 특이 표적 분자의 사용 및 사용 없이 세포에 의해 흡수될 수 있다 (Torchilin, V. P. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 145-160 (2005)). 시토졸로 리포좀 내용물의 방출은, 엔도좀이 라이소좀으로 전파하기 전에 이들이 엔도좀 막과 융합하도록, 산성 pH에서 불안정하도록 리포좀을 설계하여 달성될 수 있고, 여기서 상기 내용물은 격리되거나 또는 망가질 수 있다 (Chu, C. J. et al., Pharm. Res. 7, 824-834 (1990)). 세포 내로 흡수되고, 산성 pH에 불안정화된 소형화된 멀티좀은 또한 상기 엔도좀 내에 전구 약물 및 활성제를 동시에 방출하여, 세포 내의 약물 전달을 달성할 수 있다. 상기 활성 약물을 상기 시토졸에 진입시키기 위하여, 이것은 엔도좀의 막에 대한 투과성이 있어야 하고; 반대로, 상기 전구 약물 및 활성제는 정상보다 이른 전구 약물 누출을 방지하기 위하여 멀티좀 막에 대해 불투과성이어야 한다. 특정 실시 예는 하기를 포함한다:
● 개별적으로-앤캡슐화된 HMR 1826 및 사람 베타-글루코니다제. 후자는 전자를 독소루비신으로 전환시킨다. HMR 1826은 세포막으로 스며들지 못하는 반면, 독소루비신은 스며든다.
● 개별적으로-앤캡슐화된 미프록시펜 포스페이트 및 알칼린 포스페타아제 활성제. 후자는 전자를 미프록시펜으로 전환시킨다. 미프록시펜은 미프록시펜 포스페이트보다 ~1,000 배 덜 수용성이고, 따라서 더 높은 막-투과도를 갖는다.
선택적으로, 상기 활성 약물은 유출량, 예를 들어, 재순환 경로를 통해 엔도좀 또는 라이소좀으로부터 시토졸로 가로질러 얻을 수 있다.
pH-민감성 리포좀을 제조하기 위한 하나의 전략은 두 지질의 혼합물을 사용하는 것이다 (Drummond, D. C. et al., Prog. Lipid Res. 39, 409-460 (2000)). 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)과 같은, 어떤 것은 비-이중층 상태를 선호하고; 올레산 (OA)과 같은, 또 다른 것은, 이의 pKa 이상의 pH 값에서 이중층 상태를 안정화시키지만 (~7.5 when incorporated in a bilayer (Hamilton, J. A. & Cistola, D. P. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 82-86 (1986)), (Small, D. M., Cabral, D. J., Cistola, D. P., Parks, J. S. & Hamilton, J. A. Hepatology 4, 77S-79S (1984))), OA의 중요한 비율이 양성자화인 경우, 더 낮은 pH 값에서는 아니다. 본 명세서에서는 멀티좀에 대한 pH 민감도를 제공하기 위한 이러한 전략을 적용한다.
DOPE 및 OA의 혼합물로 제조된 멀티좀은 pH 8.0 (n = 7)의 외부 수성 용액에서 적어도 하루 동안 안정화하는 것으로 확인된다. pH 3.0의 동일한 완충제로 대략 반정도를 대체하여 8.0로부터 ~5.5로 이 용액의 pH를 감소시켜, 상기 외부 이중층이 갑자기 파열되어, 상기 내부 액적의 내용물이 서로 및 외부 용액과 혼합하는 것을 허용한다 (도 5a). 상기 액적은 항상 서로의 <2 min 이내, 및 일반적으로 <1 min (n = 8) 이내로 파열한다. 만약 pH 8.0 완충제가 동일한 pH의 완충제와 교환된다면, 멀티좀은 파열되지 않아, 상기 파열이 기계적 분포에 기인한 것이 아닌 것을 나타낸다.
상기 액적의 내용물이 외부 용액으로 멀리 확산되기 전에 서로 혼합되는지의 여부를 시험하기 위하여, 두 개의 내부 액적을 갖는 멀티좀은 하나의 내부 액적이 덱스트란-접합 플로우-4를 함유하고, 다른 하나는 Ca2 +를 함유하도록 제조된다. 이들 멀티좀은 형광 분광법으로 감시된다. 상기 외부 용액의 pH가 낮추어진 후 곧바로, 내부 액적들 모두는 동시에 파열되어, 외부 용액으로 Ca2 + 및 플로우-4를 방출하고; 형광 강도는 상기 플로우-4가 희석됨에 따라 상응하게 감소한다 (도 5b). 몇 초 내에, 상기 외부 용액에서 플로우-4 및 Ca2 +의 구름 (clouds)은 혼합되기 시작하고, 이들의 교차하는 부피는 형광 강도에서 가파른 증가를 나타낸다. 최종적으로, 이러한 밝은 색 혼합물은 희석되고, 다시 한번 형광 강도는 감소된다.
pH 민감도 - 방법
염료-함유 액적은 25 ㎛ 덱스트란-접합 플로우-4 및 50 ㎛ EDTA을 함유한다. Ca2+-함유 액적은 10 mM CaCl2을 함유한다. 앤캡슐화된 액적은 형성 후 ~15분 동안 평형을 허용하고, 그 다음 상기 외부 수성 용액의 부피의 절반은 동일한 pH 8.0 완충제의 동일한 부피로 대체된다. 이것은 그 다음 pH 3.0 완충제의 동일한 부피로, 반복된다.
온도 민감도
본 발명자들은 또한 멀티좀으로부터 온도-트리거 방출을 위한 메커니즘을 시행하였다. 용융 전이 온도 Tm를 갖는 지질로 제조된 리포솜은 리포좀 이중층의 고체 및 유체 상 사이의 경계에 기여가능한, 국소적 최대 투과성 Tm을 갖는다 (Mills, J. K. et al., BBA-Biomembranes 1716, 77-96 (2005)). 이러한 현상을 이용한 전달 메커니즘은 42 ℃까지의 국소적 온화한 발열요법과 연합하여 사용하기 위해 개발되었고, 약물 방출에서 상응하는 국소적 향상을 생산한다 (Needham, D. et al. Adv. Drug Deliver. Rev. 53, 285-305 (2001)).
온도-민감성 리포좀에 대해 대중적으로 사용된, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC) (Tm = 41 ℃)으로 멀티좀을 형성하기 위한 시도는, 지질 농도 및 배양 시간의 범위에 걸쳐 수행된 경우 안정한 이중층을 산출하지 못한다. 거대한 DPPC 리포좀의 불안정성은 어디서나 볼 수 있다 (Akashi, K. et al., Biophys. J. 71, 3242-3250 (1996); Korlach, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8461-8466 (1999)). 그러나, DPPC 및 DPhPC의 1:1 (mol/mol) 혼합물로 제조된 멀티좀은 적어도 12시간 (n=8) 동안 ~90% 생존으로, 안정하다. 온도 구배에 적용된 경우, 단일 내부 액적을 갖는 이러한 지질 혼합물로 제조된 멀티좀의 외부 이중층은 32.6 ±1.6 ℃ (n = 11)에서 갑자기 파열하여, 상기 외부 수성 용액으로 상기 내부 액적의 내용물을 방출한다. 상기 파열 온도는 DPhPC의 몰 비율이 ~15-5%로 변화되고, DPhPC의 상당히 낮은 비율은 상기 이중층을 안정화하는 것에 실패했기 때문에 중요한 경향을 나타내지 않는다.
상기 파열 온도는 DPPC의 전이 온도가 유사하게 두 개의 요인에 기인하는 것보다 상당히 더 낮다. 첫째, DPPC에 DPhPC의 첨가는 용융 전이를 상당히 넓히고, 피크 전이 온도를 감소하는 것으로 알려져 있다 (Lindsey, H. et al., Biochim. Biophys. Acta 555, 147-167 (1979)). 둘째, 온도-민감성 리포좀으로부터 내용물의 방출의 정도는 이들의 크기에 따라 증가하는 것으로 나타내었다 (Ueno, M. et al., B. Chem. Soc. Jpn 64, 1588-1593 (1991)). 따라서, 리포좀과 비교하여 본 모델 멀티좀에서 이중층의 큰 면적은 강조된 온도 민감도를 발생할 것이다. DPhPC의 첨가에 의해 유발된 용융 전이의 초기 시작과 함께, 이러한 증가된 민감도는 순수 DPPC의 Tm 이하에서 잘 관찰되는 이중층의 극적인 붕괴를 설명할 수 있다.
DPPC과 유사한 지질이 DPhPC의 혼합시 유사 광폭의 용융 전이로 시달리는 가설을 따라, DPPC는, 임상적 온화한 발열요법에 대한 적절한 범위 이내로 멀티좀의 파열 온도를 상승시키기 위해, 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) (Tm ~55 ℃)으로 대체된다. 단일 내부 액적을 갖는 DPhPC 및 DSPC의 3:1 (mol/mol) 혼합물로 제조된 멀티좀은 적어도 하루 동안 (n = 11) 실온에서 안정하다는 것을 확인하였다.
이러한 지질 혼합물로 제조된 멀티좀은 ~1 ℃ min-1의 온도 램프에 적용되고, 상기 온도에서 각각의 멀티좀 파열이 주목된다 (도 6a). ~30 ℃에서 파열되는 ~3%의 멀티좀을 배제하고, 상기 파열온도는 43.6 ±3.5 ℃이다 (평균 ±s.d., n = 93). 두 개의 내부 액적을 갖는 멀티좀이 동일한 방식으로 가열된 경우, 각 경우의 70%에서, 각 멀티좀의 두 개의 내부 액적은, 42.9 ±3.5 ℃ (평균 ±s.d., n = 10)에서 서로 0.1 ℃ 내에서 파열한다.
상기 멀티좀은 발열요법 (hyperthermia)에 적용되기 전 체온에서 이들의 내용물을 유지할 수 있고; 단일 내부 액적을 갖는 멀티좀이 37.2 ±0.4 ℃에서 유지된 경우, 적어도 30분 (n = 46)동안 93% 생존한다 (도 6b).
온도 민감도- 방법
플라스틱 루프 상에 12 개의 멀티좀이 유지되도록 만든 용기는 가열 블럭 상에 놓이고, 상기 벌트 수성 용액의 온도는 열전대 온도계 (thermocouple thermometer)로 측정된다. 상기 벌크 용액은 온도를 균일하게 보장하기 위하여 모터로 연속적으로 교반된다. 상기 가열 블럭 온도조절장치는 본문에 기재된 램프 및 인정한 온도 레짐 (temperature regimes)을 달성하기 위하여 온도 측정으로부터 실시간 피드백을 이용하여 조절된다.
결론
멀티좀은 수성 용액에서 안정하다는 것을 본 실시 예에서 알 수 있다. 앤캡슐화된 액적은 이중층에 혼입된 막 단백질을 통해 서로 및 환경과 화학적 종들을 교환할 수 있다. 더욱이, 멀티좀은 상기 앤캡슐화된 액적의 내용물을 공-방출하여 pH 및 온도와 같은 외부 자극에 반응할 수 있다. 이러한 기능성은, 예를 들어, 조합 약물 전단을 위한 비히클로서, 액적 네트워크 장치의 적용성을 상당히 확장시킨다.
본 명세서에서 연구된 상기 멀티좀은 ~800 ㎛의 직경을 갖는다 (도 1c-e). 이러한 스케일은 초기 조작 및 단일 멀티좀의 연구에 편리하다. 그러나, 살아있는 세포와 상호작용하는 멀티좀을 요구하는 몇몇 적용은 약물 전달에서 사용하기 위해서, 몇 마이크론보다 크지 않는, 이상적으로 <200 nm로 이들을 요구할 수 있다 (Devine, D. V., Biochim. Biophys. Acta 1191, 43-51 (1994)). 상기 멀티좀 단분자층 및 이중층 상에 증가된 곡률의 효과는 ~1 ㎛의 직경보다 더 작은 멀티좀에 대해 중요한 것 같다 (Lichtenberg, D. et al. Biochemistry (Mosc.) 20, 3462-3467 (1981)).
소형화된 멀티좀의 고-처리량 제조는, 벌크 수성 용액에서, ~100 ㎛ 직경 오일 액적에 수성 액적을 앤캡슐화하기 위해, 연속 쉐어링을 사용하는 현존하는 미세유체 기술 (Okushima, S. et al., Langmuir 20, 9905-9908 (2004)) 또는 흐름-집중 (Chu, L. Y. et al., Angew. Chem. Int. Edit. 46, 8970-8974 (2007); Seo, M. et al., Soft Matter 3, 986-992 (2007))을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 구조는 통상적으로 계면활성제 또는 블럭 공중합체에 의해 안정화된다. 최근 연구 (Shum, H. C. et al., Angew. Chem. Int. Edit. 50, 1648-1651 (2011))는 블럭 공중합체의 이중층에 의해 연결된 수성 액적의 군을 생성하기 위해 흐름-집중 미세유체를 사용한다.
Claims (118)
- 앤캡슐화 액적으로서,
- 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적 또는 복수의 수성 액적을 포함하며, 상기 수성 액적 또는 각각의 수성 액적은: (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며,
여기서 상기 앤캡슐화 액적은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 포함하고, 여기서 상기 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하며, 여기서:
(i) 수성 액적은 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하거나; 또는
(ii) 제1 수성 액적의 외부층의 일부는 제2 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하고, 이에 의해 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하는 앤캡슐화 액적. - 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 막 단백질은 기공, 채널 또는 펌프인 앤캡슐화 액적. - 청구항 1에 있어서,
상기 주변층 내에 복수의 상기 수성 액적을 더욱 포함하며, 각각의 수성 액적은: (a) 상기 수성 매체, 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 상기 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 4에 있어서,
제1 수성 액적의 외부층의 일부는 제2 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하고, 이에 의해 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 5에 있어서,
제1 및 제2 액적 사이의 계면에서의 상기 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 4에 있어서,
상기 수성 액적 중 적어도 하나는 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 7에 있어서,
상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서의 상기 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 4에 있어서,
상기 복수의 수성 액적은 사슬 또는 네트워크에서 서로 접촉하는 둘 이상의 수성 액적을 포함하고, 여기서 상기 사슬 또는 네트워크에서 각각의 외부층의 일부는 상기 사슬 또는 네트워크에서 다른 외부층의 일부와 접촉하며, 이에 의해 상기 사슬 또는 네트워크에서 상기 액적들 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 9에 있어서,
상기 사슬 또는 네트워크에서 상기 액적들 사이의 계면에서 각각의 상기 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 9에 있어서,
상기 사슬 또는 네트워크에서 상기 액적들 중 적어도 하나는 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 방울의 가장자리에 위치된 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 11에 있어서,
상기 사슬 또는 네트워크에서 상기 액적들 사이의 계면에서 각각의 상기 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하며, 여기서 상기 방울의 가장자리에 위치된 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서의 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 1에 있어서,
상기 수성 액적, 또는 적어도 하나 상기 수성 액적은, 감지 분자를 더욱 포함하며, 여기서, 상기 감지 분자는 표적 검체 또는 광-민감 분자의 존재에 민감한 분자이거나; 또는
상기 앤캡슐화 액적은 치료제, 전구 약물 또는 진단 시약을 더욱 포함하며, 상기 치료제, 진단 시약 또는 전구 약물은 수성 액적의 친수성 매체, 또는 상기 소수성 매체에 존재하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 1에 있어서,
상기 앤캡슐화 액적은 상기 앤캡슐의 분리 부분에 제1 시약 및 제2 시약을 더욱 포함하고, 여기서 상기 제1 시약은 상기 수성 액적 또는 상기 수성 액적들 중 적어도 하나 내에 있으며, 제2 시약은 상기 소수성 매체 내에 있거나, 또는 상기 제1 시약 및 제2 시약은 상기 앤캡슐의 다른 수성 액적 내에 있으며, 여기서:
(i) 상기 제1 및 제2 시약은 치료제, 진단 시약, 병용 요법에 함께 사용하기 위한 약물, 전구 약물 및 이들의 상응 활성제, 활성 약물 및 상응 불활성화제 화합물, 및 약물의 생분포를 관찰하기 위한 조영제로부터 선택되며;
(ii) 상기 제1 및 제2 시약은 병용 요법에 함께 사용하는데 적절한 약물이거나, 또는
상기 제1 시약은 활성제에 의해 활성화될 수 있는 불활성 형태의 약물이고, 상기 제2 시약은 상기 활성제이거나, 또는
상기 제1 시약은 불활성화제 화합물에 의해 불활성화될 수 있는 약물이고, 상기 제2 시약은 상기 불활성화제 화합물이거나, 또는
상기 제1 시약은 약물이고 상기 제2 시약은 약물의 생분포를 관찰하는데 적절한 조영제이며;
(iii) 상기 앤캡슐화 액적은 제3 시약을 더욱 포함하고, 상기 제3 시약은 상기 제1 및 제2 시약으로부터의 앤캡슐의 다른 부분 또는 부분들, 다른 수성 액적 또는 액적들, 또는 상기 소수성 매체에 있으며, 여기서 상기 제3 시약은 치료제, 진단 시약, 상기 제1 또는 제2 시약과 병용 요법에 함께 사용하기 위한 약물, 전구 약물, 전구 약물용 활성제, 활성 약물용 불활성화제 화합물, 또는 약물의 생분포를 관찰하기 위한 조영제로부터 선택되며;
(iv) 상기 활성제는 미리결정된 복용량 비율로 상기 앤캡슐화 액적에 존재하며; 또는
(v) 상기 제1 및 제2 시약 및, 존재하는 경우, 상기 제3 시약은 화학 반응에서 함께 반응하는 반응제 화합물인 앤캡슐화 액적. - 청구항 1에 있어서,
상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층, 또는 상기 비-중합체 양친매성 분자의 하나 이상의 이중층의 안정도는 자극에 민감성이며,
여기서:
(a) 상기 자극은 pH의 변화, 온도의 변화, 초음파, 기계적 자극, 전단 흐름, 종의 임계 농도, 자기장, 전계, 및 전자기 방사선로부터 선택되며;
(b) 상기 자극은 pH의 변화이며, 여기서 상기 이중층 또는 이중층들은 7.5 이하의 pH에 노출시 파열 또는 누출할 수 있으며;
(c) 상기 이중층 또는 이중층들의 비-중합체 양친매성 분자는 pH-민감성 지질, 및 pH에 민감하지 않은 추가 지질을 포함하고, 여기서 상기 추가 지질은 인지질이며, 상기 pH-민감성 지질은 8 이하의 pKa를 가지며;
(d) 상기 이중층 또는 이중층들의 비-중합체 양친매성 분자는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 올레산을 포함하며;
(e) 상기 이중층 또는 이중층들은 온도-민감성이며, 여기서 상기 이중층 또는 이중층들은 40 ℃ 이상의 온도에 노출시 파열 또는 누출할 수 있으며;
(f) 상기 이중층 또는 이중층들의 비-중합체 양친매성 분자는 온도-민감성 지질 및 인지질인 추가 지질을 포함하며, 여기서 상기 온도-민감성 지질은 40 ℃ 내지 70 ℃의 용융 전이 온도, Tm,을 가지며;
(g) 상기 이중층 또는 이중층들의 비-중합체 양친매성 분자는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)의 혼합물, 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC) 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)의 혼합물을 포함하며;
(h) 상기 이중층 또는 이중층들의 비-중합체 양친매성 분자는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)을 1:1 내지 5:1의 몰비로 포함하며; 또는
(i) 상기 이중층 또는 이중층들의 비-중합체 양친매성 분자는 표적 세포상에 표면 종을 인식하는 분자를 포함하고, 여기서 상기 인식에 대한 반응은 상기 이중층 또는 이중층들의 불안정성을 포함하는 앤캡슐화 액적. - 청구항 1, 또는 3 내지 15 중 어느 한 항에 정의된 앤캡슐화 액적, 또는 복수의 상기 앤캡슐화 액적, 및 친수성 담체를 포함하는 조성물.
- (a) 청구항 1, 또는 3 내지 15 중 어느 한 항에 정의된 앤캡슐화 액적, (b) 약학적으로 허용가능한 친수성 담체, 및 (c) 활성제로서, 치료제, 전구 약물, 진단 시약 또는 조영제를 포함하는 약학적 조성물.
- 합성 생물제제에서, 청구항 1, 또는 3 내지 15 중 어느 한 항에 정의된 앤캡슐화 액적, 또는 청구항 1, 또는 3 내지 15 중 어느 한 항에 정의된 앤캡슐화 액적 및 친수성 담체를 포함하는 조성물을 이용하는 방법.
- 청구항 1, 또는 3 내지 15 중 어느 한 항에 정의된 앤캡슐화 액적을 제공하는 단계; 및
수성 액적 또는 액적들의 외부층 또는 층들을 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과의 접촉 상태를 허용하는 단계, 또는 상기 수성 액적 또는 액적들의 외부층 또는 층들을 상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 상기 수성 액적 또는 복수의 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성시키며;
상기 비-중합체 양친매성 분자의 주변층이 상기 수성 액적 또는 액적들의 외부층 또는 층들에 달라붙고, 이에 의해 상기 수성 액적 또는 복수의 수성 액적의 적어도 일부의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 이중층이 형성되도록, 상기 앤캡슐화 액적으로부터 상기 소수성 매체의 일부 또는 전부를 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는 원세포 또는 원조직의 제조방법. - 앤캡슐에서 액적들 사이에 분자를 트레피킹 (trafficking) 및/또는 앤캡슐에서 액적으로부터 외부 환경으로 분자를 전달하기 위한, 또는
막 단백질 또는 막 단백질과 상호작용하는 검체를 조사 및/또는 검사하기 위한, 또는
비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 조사 및/또는 검사하기 위한,
청구항 1, 또는 3 내지 12 중 어느 한 항에 정의된, 막 단백질을 포함하는 앤캡슐화 액적의 이용방법. - 청구항 1, 또는 3 내지 15 중 어느 한 항에 정의된 앤캡슐화 액적을 포함하는 센서.
- 앤캡슐화 액적의 제조공정에 있어서,
상기 앤캡슐화 액적은:
- 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적 또는 복수의 수성 액적을 포함하며, 상기 수성 액적 또는 각각의 수성 액적은: (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며;
여기서 상기 앤캡슐화 액적은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 포함하고, 여기서 상기 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하며, 여기서:
(i) 수성 액적은 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하거나; 또는
(ii) 제1 수성 액적의 외부층의 일부는 제2 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하고, 이에 의해 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하며;
상기 공정은:
(a) 막 단백질을 포함하는 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하는 수성 액적을,
그것의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층을 갖는 소수성 매체의 방울로 이송시키는 단계를 포함하는 앤캡슐화 액적의 제조공정. - 앤캡슐화 액적의 제조공정에 있어서,
상기 앤캡슐화 액적은:
- 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적 또는 복수의 수성 액적을 포함하며, 상기 수성 액적 또는 각각의 수성 액적은: (a) 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며;
여기서 상기 앤캡슐화 액적은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 포함하고, 여기서 상기 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하며, 여기서:
(i) 수성 액적은 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하거나; 또는
(ii) 제1 수성 액적의 외부층의 일부는 제2 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하고, 이에 의해 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하며;
상기 공정은:
(i) 비-중합체 양친매성 분자의 존재하에서, 친수성 담체로 소수성 매체의 방울을 도입시키는 단계로, 이에 의해 소수성 매체의 방울 및 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층을 제조하며;
(ii) 상기 비-중합체 양친매성 분자의 존재하에서, 소수성 매체로 막 단백질을 포함하는 수성 매체의 방울을 도입시키는 단계로, 이에 의해 상기 소수성 매체 내에 수성 액적을 제조하고, 상기 수성 액적은: (a) 막 단백질을 포함하는 상기 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하며;
여기서 단계 (i) 및 (ii)는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있고; 그리고
(iii) 단계 (ii)에서 제조된 수성 액적을 단계 (i)에서 제조된 상기 소수성 매체의 방울로 이송시키는 단계를 포함하며, 이에 의해 상기 앤캡슐화 액적을 제조하는 앤캡슐화 액적의 제조공정. - (i) 미세유체 장치의 수성 매체를 함유하는 제1 채널로부터 막 단백질을 포함하는 수성 매체의 액적을 상기 미세유체 장치의 소수성 매체를 함유하는 제2 채널로 도입시키는 단계,
여기서 상기 제1 채널에서 수성 매체, 또는 상기 제2 채널에서 소수성 매체, 또는 이들 모두는, 비-중합체 양친매성 분자를 더욱 포함하고,
이에 의해 상기 제2 채널에서 상기 소수성 매체 내에 수성 액적을 제조하며, 상기 수성 액적은: (a) 막 단백질을 포함하는 상기 수성 매체 및 (b) 상기 수성 매체의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 외부층을 포함하고; 그리고
(ii) 상기 제2 채널로부터의, 수성 액적 또는 복수의 수성 액적을 포함하는 소수성 매체의 방울을 상기 미세유체 장치의 친수성 담체를 함유하는 제3 채널로 도입시키는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 제2 채널에서 소수성 매체, 또는 상기 제3 채널에서 친수성 담체 또는 이들 모두는, 비-중합체 양친매성 분자를 더욱 포함하고,
이에 의해 상기 제3 채널에서 상기 친수성 담체 내에 앤캡슐화 액적을 제조하며, 상기 앤캡슐화 액적은:
- 상기 소수성 매체의 방울;
- 상기 방울의 표면 주위에 비-중합체 양친매성 분자의 주변층; 및
- 상기 주변층 내에 수성 액적 또는 복수의 수성 액적을 포함하며;
여기서 상기 앤캡슐화 액적은 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 포함하고, 여기서 상기 이중층은 막 단백질을 더욱 포함하며, 여기서:
(i) 수성 액적은 상기 방울의 가장자리에 위치되고, 여기서 상기 수성 액적의 외부층의 일부는 상기 주변층과 접촉하며, 이에 의해 상기 수성 액적 및 주변층 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하거나; 또는
(ii) 제1 수성 액적의 외부층의 일부는 제2 수성 액적의 외부층의 일부와 접촉하고, 이에 의해 상기 제1 및 제2 액적 사이의 계면에서 상기 비-중합체 양친매성 분자의 이중층을 형성하는 앤캡슐화 액적의 제조공정. - 청구항 23 또는 24에 있어서,
상기 친수성 담체로부터 상기 앤캡슐화 액적을 회수하는 단계를 더욱 포함하는 앤캡슐화 액적의 제조공정. - 청구항 1, 또는 3 내지 15 중 어느 한 항에 정의된 앤캡슐화 액적을 포함하는 건전지.
- 청구항 1, 또는 3 내지 15 중 어느 한 항에 정의된 앤캡슐화 액적을 포함하는 전자 장치.
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