[go: up one dir, main page]

KR102034203B1 - 새로운 C5a 결합 핵산 - Google Patents

새로운 C5a 결합 핵산 Download PDF

Info

Publication number
KR102034203B1
KR102034203B1 KR1020147022321A KR20147022321A KR102034203B1 KR 102034203 B1 KR102034203 B1 KR 102034203B1 KR 1020147022321 A KR1020147022321 A KR 1020147022321A KR 20147022321 A KR20147022321 A KR 20147022321A KR 102034203 B1 KR102034203 B1 KR 102034203B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
absent
seq
acid molecule
nucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020147022321A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140111703A (ko
Inventor
카이 호흘릭
악셀 바테르
클라우스 부쉬네르
크리스티안 마쉬
스벤 클루스만
Original Assignee
아프타리온 바이오테크 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2012/000089 external-priority patent/WO2012095303A1/en
Application filed by 아프타리온 바이오테크 아게 filed Critical 아프타리온 바이오테크 아게
Publication of KR20140111703A publication Critical patent/KR20140111703A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102034203B1 publication Critical patent/KR102034203B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 C5a에 결합할 수 있는 핵산 분자에 관한 것으로 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드의 중앙 스트레치를 포함하고, 상기 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
5'　AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 61]의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU이고, alc
G, A, U, C, H, K 및 R는 리보뉴클레오티드이고, 및
dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.

Description

새로운 C5a 결합 핵산{New C5a binding nucleic acids}
본 발명은 C5a 및/C5에 결합할 수 있는 핵산 분자, 약제, 진단 시약 및 검출 시약 각각의 제조를 위한 이의 용도, 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물, 상기 핵산 분자를 포함하는 복합체, 상기 핵산 분자를 사용하여 C5a 및/C5에 의해 매개되는 활성의 길항제의 스크리닝 방법 및 상기 핵산 분자의 검출을 위한 방법에 관한 것이다.
인간의 아나필라톡신(anaphylatoxin) C5a(보체 인자5a; SwissProt 등재P01031)의 기본 구조는 1978년에 확인되었다(Fernandez & Hugli 1978). 이는 74 개의 아미노산으로 구성된 8,200 Da의 분자량을 갖는 반면, 탄수화물 부분은 대략 3,000 Da를 차지한다. C5a의 탄수화물 부분은 64번 위치의 아스파라긴에 부착된 단일 복합 올리고당 단위로 존재한다. 세 개의 디설파이드 결합은 안정적이고 단단한 구조를 분자에 부여한다.
다양한 포유동물 종으로부터의 C5a 형태의 3차원 구조는 일반적으로 유지되지만, 아미노산 서열은 진화하는 동안 특히 잘 유지되지 않는다. 서열 정렬은 인간 및 생쥐 C5a의 64% 전제 서열 동일성을 보여준다. 인간의 C5a는 다음의 C5a와 동일한 아미노산의 다음과 같은 비율을 공유한다.
- 마카카 물라타(붉은털 원숭이) 85 %
- 필리핀 원숭이(시노몰구스 원숭이) 85 %
- 보스 타우루스(소) 69 %
- 수스 스크로파(돼지) 68 %
- 무스 무스쿨루스(생쥐) 64 %
- 라투스 노르베기쿠스(쥐) 61 %
제한된 서열 상동성 외에도, 글리코실화는 불균일하다. 인간의 C5a는 아스파라긴 64 상에서 글리코실화되지만, 쥣과 동족체(murine homologue)는 아직 글리코실화되지 않았다. 더욱 먼 친척인 인간 단백질인 C3a 및 C4a는 각각 C5a와35 및 40%의 동일성만을 공유한다.
보체계(complement system)는 세포와 세균의 항혈청 매개 용해를 "보완"하는 감열 혈청 분획(heat sensitive serum fraction)으로서 지난 세기 초에 발견되었다. 자연적인 불특정(선천성) 면역 반응의 체액 성분이기 때문에, 이는 감염원에 대한 숙주 방어에서 그리고 염증 과정에서 중요한 역할을 한다. 보체는, (i) 항체 그 자체가 세포 표면 또는 세균에 부착된 이후(고전적 경로(classical pathway)라 함), (ii) 세균 또는 바이러스의 당지질에 의해 직접적으로(대체 경로(alternative pathway)라 함), 또는 (iii) 세균 상의 탄수화물에 의한(렉틴 경로(lectin pathway)라 함) 세 가지 별개의 경로를 통해 활성화될 수 있다. 이들 모든 활성화 경로는 공통 말단 경로(common terminal pathway)가 시작하는 보체 성분 C3 및 C5의 활성화 지점에서 만나며, 막 공격 복합체(membrane attack complex, MAC)의 조립에서 끝난다. 보체계는 단백질 분해 효소 또는 결합 단백질의 역할을 하며 척추동물의 혈청의 총 글로불린의 대략 10%를 구성하는 20 개 이상의 가용성 단백질로 구성된다. 보체계는 또한, 보체 단백질의 단백질 가수분해 단편에 대해 특이성을 보이고 염증 세포 및 적응 면역 반응을 조절하는 세포에 의해 발현되는 다수의 별개의 세포 표면 수용체를 포함한다. 보체 활성화를 억제하고 따라서 돌발적인 보체 공격으로부터 숙주 세포를 보호하는 여러 가지 조절 단백질이 있다. 보체계는 적응 면역 반응과 독립적으로 또는 함께 활성화될 수 있다
보체의 기능은 옵소닌화(opsonization)(즉, 세균을 식균작용에 더욱 민감하게 함), 세균과 이질적인 세포의 막에 기공을 삽입함으로써 이들의 용해(막 공격 복합체이라 함), 화학주성 활성 물질의 생성, 혈관 투과성의 증가, 평활근 수축의 환기(evocation) 및 비만 세포 탈과립(degranulation)의 촉진을 들 수 있다. 응고 캐스케이드(coagulation cascade)와 유사하게, 보체 활성화의 과정은 효소 캐스케이드라고도 알려진 순차적 효소 단계에서 체계화된다(Sim and Laich, 2000). 이러한 상호작용의 상세한 순서는 이하에서 설명된다.
고전적 경로. 이 항체 의존성 활성화 경로는 특이 항체 반응을 보완한다. 이는 대체 경로와 같이 정교하게 제어되지만, 항체 의존성 인식 작용과 피드백 증폭 메커니즘과 같은 자발적인 개시 능력이 부족하다. 고전적 경로의 활성제 중에는 항원-항체 복합체, β-아밀로이드, DNA, 폴리이노신산, 헤파린/프로타민과 같은 다가음이온-다가양이온 복합체, 일부 외피보유 바이러스(enveloped virus), 요산 일나트륨 결정(monosodium urate crystal), 세균 세포벽의 지질 A, 플리카틱산(plicatic acid), 개미 독 다당류(ant venom polysaccharide), 세포내 막(예, 미토콘드리아)뿐만 아니라 플라스민(plasmin), 칼리크레인(kallikrein), 활성 하게만 인자(activated Hageman factor), 엘라스타아제(elastase) 또는 카텝신(cathepsin)과 같은 세포 및 혈장 유래 효소가 있다. 항체 유도 고전적 경로는, 세포 표면 항원에 유착되는 항체(IgM > IgG3 > IgG1 >> IgG2)의 Fc-단편에 결찰하는 C1과 함께 출발한다. C1은 3 개의 하위 단위인 C1q, C1r, C1s 내에서 22 개의 폴리펩타이드 체인으로 구성된 인식 복합체이다. C1q는, 한 묶음의 튤립처럼 보이는 콜라겐 유사 도메인(하이드록시프롤린 및 하이드록시리신 잔기를 보임)을 포함하는 당단백질인 실제 인식 부위이다. C1q를 통해 결합하면, C1r은 활성화되어 C1s를 a 형태로 분열시키는 단백질 분해효소가 되며, 이 a 형태는 C2a/b 및 C4a/b에 대해 C2 및 C4 모두를 (분열에 의해) 활성화시킨다. C2a 및 C4b는 결합하여 C3 전환효소(C3 활성화 효소)인 C4b2a를 생성한다. C4a는 약한 아나필라톡신 활성만 갖지만, 화학주성은 아니다. C3는 세 가지 모든 활성화 경로에 중심이 된다. 고전적 경로에서, C4b2a 전환효소는 C3을 C3a/b로 분열시킨다. C3a는 아나필라톡신이다. C3b는 C4b2a와 결합하여 C4b2a3b 복합체(C5 전환효소)를 생성한다. C3b는 또한 세균을 식균작용에 민감하게 하는 세포에 직접 결합할 수 있다(옵소닌화).
대체 경로 . 이 경로는 활성화를 위한 항체를 필요로 하지 않으며, 고전적 경로와는 다르게, 세균/바이러스 당지질 또는 내독소(endotoxin)와 같은 침입 미생물의 표면 구조에 의해 직접 활성화되기 때문에 세균 및 바이러스 감염에 대한 숙주 방어에 매우 중요하다. 다른 활성제는 이눌린(inulin), 토끼 적혈구, 탈시알릴화(desialylated) 인간 적혈구, 코브라 독 인자, 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(phosphorothioate oligonucleotide)이다. 여섯 개의 단백질, 즉, C3, B, D, H, I 인자 및 프로퍼딘(properdin)은 경로의 개시, 인식 및 활성화 기능을 함께 수행하여 활성제-결합 C3/C5 전환효소를 형성한다. 캐스케이드는 C3로 시작한다. C3의 자발적인 분열("C3-공전(tickover)")의 결과로 소량의 C3b가 항상 발견되지만, 농도는 일반적으로 후속적인 분해에 의해 매우 낮게 유지된다. 그러나, C3b가 세포 표면에서 당과 결합할 때, 대체 경로의 활성화를 위한 핵의 역할을 할 수 있다. 이후 B 인자는 C3b와 결합한다. D 인자가 존재할 경우, 결합 인자 B는 Ba와 Bb로 분열되며; Bb는 C3 전환효소에 대한 활성 부위를 포함한다. 이후, 프로퍼딘은 C3bBb에 결합하여 세포 표면 상의 C3bBb 전환효소를 안정화시킴으로써 추가의 C3 분자의 분열로 이어진다. 마지막으로, 대체 C5 전환효소 C3bBb3b가 형성되어 C5를 C5a/b로 분열시킨다. 일단 존재하면, C5b는 상기한 바와 같은 막 공격 복합체의 조립을 개시한다. 일반적으로, 그람 음성 세포만이 항체와 보체에 의해 직접 용해될 수 있으며, 그람 양성 세포는 대부분 저항성이다. 그러나, 식균작용은 C3b와의 옵소닌화에 의해 크게 향상되며(식세포는 이들의 표면에서 C3b 수용체를 가짐), 항체는 항상 필요하지 않다. 또한, 보체는 숙주 세포의 직접적인 용해에 의해 또는 숙주 세포의 바이러스 침투를 방지함으로써 바이러스 입자를 중화시킬 수 있다.
렉틴 경로. 가장 최근에 발견된 렉틴 또는 만난-결합 렉틴(mannan-binding lectin, MBL) 경로는 이물질(즉, 세포 표면)의 선천성 인식에 의존한다. 이 경로는 고전적 경로와 구조적 및 기능적 유사성을 갖는다. 렉틴 경로의 활성화는 급성기 단백질(acute phase protein) MBL 에 의해 개시되며, 이는 세균, IgA 및 손상된 내피세포에 의해 노출된 구조 상의 만노오스를 인식한다. MBL은 C1q와 상동이고 MBL 관련 세린 단백질 분해효소(MBL associated serine protease, MASP)를 촉발시키며, 이의 세 가지 형태 MASP1, MASP2 및 MASP3는 설명되었다. 추가의 렉틴 경로의 활성화는 고전적 경로와 사실상 유사하며, 동일한 C3 및 C5 전환효소를 형성한다. 또한, 일부 조건에서 MASP가 C3를 직접 활성화시킬 수 있는 몇 가지 증거가 있다.
말단 경로. 세 가지 모든 활성화 경로는 C5를 C5a/b로 분열시키는 C5 전환효소(고전적 및 렉틴 경로에서의 C4b2a3b, 대체 경로에서의 C3bBb3b)의 형성에서 만난다. C5a는 강력한 아나필라톡신 활성을 가지며 화학주성이다. 다른 C5 단편인 C5b는, 분해성 막 공격 복합체(MAC 또는 말단 보체 복합체(terminal complement complex, TCC)가 형성되는 표적 세포 표면 상의 앵커로서 소수성 결합 부위와 함께 기능한다. MAC는 C5b, C6, C7, C8및 C9의 다섯 개의 전구체 단백질로부터 조립된다. 마지막은 단계는, 막관통 채널로서 원형질 막으로 삽입되어 세포의 삼투성 용해를 유발하는 C9 올리고머의 형성이다. MAX 조립은 수용성 혈장 인자인 S 단백질(비트로넥틴(vitronectin)으로도 알려짐) 및 SP-40,40 (클러스테린(clusterin)으로도 알려짐)에 의해서, 그리고 숙주 세포막 상의 CD59 및 HRF(상동 제한 인자)에 의해서 제어된다. 많은 종류의 세포, 즉, 적혈구, 혈소판, 세균, 지질단백질 외피를 갖는 바이러스 및 림프구가 보체 매개 용해에 민감하다.
보체계는 염증을 개시하고 증폭하기 위한 강력한 메커니즘이다. 이는 보체 성분의 단편을 통해 매개된다. 아나필라톡신은 가장 잘 정의된 단편이며, C3a, C4a 및 C5a와 같은 보체계의 세린 단백질 분해효소의 단백질 분해 단편이다. 아나필라톡신은 보체 활성화 과정에서 생성될 뿐만 아니라, 직접 C3, C4 및 C5을 분열시킬 수 있는 다른 효소계(enzyme system)의 활성으로부터도 생성될 수 있다. 이러한 효소는 트롬빈(thrombin), 플라스민(plasmin), 칼리크레인(kallikrein), 조직 및 백혈구 리소좀 효소 및 세균성 단백질 분해효소를 들 수 있다. 아나필라톡신은 혈관벽에 강력한 영향을 미침으로써 평활근(예를 들어, 회장(ileal), 기관지, 자궁 및 혈관 근육)의 수축 및 혈관 투과성의 증가를 유발한다. 이러한 영향은 특정한 속성 내성(tachyphylaxis, 즉, 반복적인 자극이 감소하는 반응을 유도하는 것)을 보여주고 항히스타민제에 의해 차단될 수 있으며; 이는 아마도 비만 세포와 호염기성 세포(basophil)에서의 히스타민의 방출을 통해 간접적으로 매개된다. C5a는 C5 혈장단백질 α 사슬의 74-아미노산 N 말단 분열 생성물이다. 이는 호중구(neutrophil), 대식세포, 평활근 세포 및 내피 세포 등과 같은 많은 다양한 세포 유형에서 가장 현저하게 존재하는 분자인 수용체 C5aR(C5R1 또는 CD88로도 알려짐)에 의해 높은 친화도로 결합된다. C5a는 C3a보다 대략 100 배 이상, 그리고 C4a보다 1000 배 이상 더 효과적인 단연코 가장 강력한 아나필라톡신이다. 이 활성은 C5a > 히스타민 > 아세틸콜린 > C3a >> C4a 순으로 감소한다
C5a는 호중구의 화학주성, 부착, 호흡 폭발(respiratory burst)의 생성 및 탈과립을 촉진하는데 있어서 가장 강력하다. C5a는 또한 호중성 백혈구와 내피 세포가 더 많은 부착 분자를 생성하도록 촉진하며; 예를 들어, C5a의 정맥내 주사는 혈관벽에 호중구의 부착을 촉발함으로써 동물 실험에서 호중구 감소증(neutropenia)을 신속하게 유발한다. 호중구 C5a 수용체의 결찰(ligation)은, 호중구 및 단핵구에 대한 또 하나의 강력한 화학주성인자(chemoattractant)인, LTB4를 포함하는 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 류코트리엔(leukotriene)으로 대사되는 세포막 아라키돈산(arachidonic acid)의 동원이 따른다. 단핵구 C5a의 결찰 이후, IL-1이 방출된다. 따라서, 염증 부위에서의 C5a의 국소적 방출은 강력한 전염증성(pro-inflammatory) 자극을 유발한다. 사실상, C5a의 방출은 일반적으로 면역 복합체 관련 질환(Heller et al., 1999); 천식(Kohl, 2001); 패혈성 쇼크(Huber-Lang et al., 2001); 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS); 다기관 기능부전(multiorgan failure, MOF); 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS); 염증성 장 증후군 (inflammatory bowel syndrome, IBD)(Woodruff et al., 2003); 전염병; 중화상(Piccolo et al., 1999); 심장(van der Pals et al. 2010), 비장, 방광, 췌장, 위, 폐, 간, 신장, 사지, 뇌, 골격근 또는 창자(Riley et al., 2000)와 같은 장기의 재관류 손상(reperfusion injury); 심근염(myocarditis); 다발성 경화증(multiple sclerosis)(Muller-Ladner et al., 1996); 및 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA)(Woodruff et al., 2002)과 같은 다양한 급성 또는 만성 질환에 직접 또는 간접적으로 연관된다.
보체계와 질환의 관계에 대한 많은 개관이 공개되어 있다(Kirschfink, 1997; Kohl, 2001; Makrides, 1998; Walport, 2001a; Walport, 2001b).
보체에 의한 세포 손상은 세포의 표면에서 고전적 경로 또는 대체 경로의 활성화의 결과로 발생한다. MAC는 대략 20 개의 단백질 분자로 구성되고 대략 1천7백만 DA의 분자량을 나타내는 초분자(supramolecular) 구조를 구성한다. 완전히 조립된 MAC는 C5b, C6, C7 및 C8의 각각 하나의 분자와 C9의 여러 개의 분자를 포함한다. 이러한 모든 MAC 성분은 당단백질이다. C5가 C5 전환효소에 의해 분열되고 C5b가 생성되면, MAC의 자가 조립이 시작된다. C5b와 C6는 안정한 수용성 이분자 복합체(bimolecular complex)를 형성하는데, 이는 C7에 결합하고 C7이 준안정 부위(metastable site)를 발현하도록 유도함으로써, 초기의 삼분자 복합체(trimolecular complex, C5b-7)가 표적 지질 이중층(lipid bilayer) 상에서 또는 근접해서 발생할 때, 상기 준안정 부위를 통해 삼분자 복합체 그 자체가 세포막으로 삽입될 수 있다. 삽입은, C7이 C5b-6에 결합한 이후 나타나는, C5b-7 복합체 상의 소수성 영역에 의해 매개된다. 막-결합 C5b-7은 세포막 부위로 MAC 조립을 수용하며 C8에 대한 수용체를 형성한다. 각각의 C5b-7 복합체로의 하나의 C8 분자의 결합은, 표적 세균 및 적혈구 막을 교란시킬 수 있는 1 nm 기능 직경의 막관통 채널을 생기게 한다. 각각의 막-결합 C5b-8 복합체는 다수의 C9 분자에 대한 수용체의 역할을 하며 세포막의 탄화수소 중심으로의 C9의 삽입을 촉진하는 것으로 보인다. C9의 하나의 분자의 결합은 막 공격 부위에서의 C9 올리고머화(oligomerisation)의 과정을 개시한다. 적어도 12 개의 분자가 복합체에 혼입된 이후, 개별적인 채널 구조가 형성된다. 따라서, 최종 생성물은 사분자(tetramolecular) C5b-8 복합체(대략 550 kDa의 분자량을 가짐) 및 관형 폴리-C9(대략 1,100 kDa의 분자량을 가짐)으로 구성된다. MAC의 이러한 형태는, 일단 세포막으로 삽입되고 나면, 완벽한 막관통 채널을 형성하여 세포의 삼투성 용해로 이어진다. 형성된 막관통 채널은 채널 구조에 혼입된 C9 분자의 수에 따라 그 크기가 다양하다. 폴리-C9의 존재가 적혈구 또는 유핵 세포(nucleated cell)의 용해에 절대적으로 필수적인 것은 아니지만, 세균을 죽이기 위해선 필요하다.
보체계는 침입 미생물에 대한 신체의 방어에서 주로 유용하다. 보체 캐스케이드의 초기 성분은, 신체에서 제거된 이후 감염원의 옵소닌화를 위해 중요하다. 또한, 이들은 면역 복합체의 형성과 제거를 제어하거나 잔해, 괴사 조직 및 이물질의 청소하는 것과 같은 면역 체계의 정상적인 기능을 제공한다. 비자체(non-self) 구조의 확장 배열을 (건강한 신체에서) 생성하는 다양한 분자 패턴을 인식하는 세 가지 모든 활성화 경로는 침입자를 제어하는데 도움을 준다. MAC의 조립 내에서 끝나는 말단 보체 경로는 세균과 이질적인 세포를 용해함으로써 추가의 방어 라인을 나타낸다.
기능적인 보체계의 중요성은 보체 결핍의 영향을 고려하는 경우 명확해진다. 예를 들어, 대체 경로의 단백질 또는 최종 성분 중 하나를 손실한 개인은 화농성 유기체(pyogenic organism), 특히 나이세리아종(Neisseria species)의 심각한 감염을 얻는 경향이 있다. 고전적 경로 성분(C1, C2, C4)에서의 결핍은 또한, 강력하게 상승되지는 않지만, 상승된 감염의 위험과 관련된다. C1 및 MBL과 같은 보체 성분은 또한 숙주 세포막으로 바이러스의 상호작용을 방해함으로써 바이러스를 중화시켜 세포 내의 진입을 방지하는 능력을 가지고 있다.
물론, C5의 분열이 C5a 및 MAC로 이어지지만, C5 결핍의 임상적 특징은 다른 말단 성분의 결핍(예를 들어, C6, C7, C8, C9)의 임상적 특징과는 크게 다르지 않으며, 이는 C5a의 부재가 C5-결핍 환자의 임상상(clinical picture)에 크게 기여하지 않는다는 것을 시사한다. 따라서, C5a의 선택적 적대화(antagonisation)는 최적의 분열을 약속함으로써 보체의 정상적인 상류 및 하류의 질병 방지 기능을 온전하게 유지시킨다. 따라서, 전염증성 아나필라톡신의 유해한 과잉 생성이 방지된다.
C5aR 결핍 생쥐는, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 감염에 더욱 민감하기는 하지만, 다르게 정상적으로 나타나며, 이는 C5a 기능의 차단이 유해 효과를 가지지 않는다는 것을 시사한다.
C5a 또는 C5 또는 각각의 수용체를 표적으로 하는 몇 가지 화합물이 알려져 있으며 생체 내 모델에서 성공적으로 테스트되었다. 이들 중 일부는 임상 실험에서 추가로 테스트되었다. C5 특이 인간화 항체인 에쿨리주맙(eculizumab)은 발작성 야간 혈색뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH)에 대해 승인되었고, 이형 용혈성 요독 증후군(atypical haemolytic uraemic syndrome, aHUS), 급성 항체 매개성 신장 동종이식 거부(kidney allograft rejection) 및 한랭 응집 질환(cold agglutinin disease)을 치료하는데 효과를 보인다. 이는 C5의 분열을 방지하고 C5a 및 C5b 양자의 작용을 억제한다. 유사한 연구 단계의 C5 항체 및 항체 단편 외에도, C5a:C5aR (CD88) 상호작용을 선택적으로 방해하고, 영향을 받지 않은 C5 분열과 C5b-의존성 MAC-형성을 남기는 항체가 특별한 관심의 대상이다. 그 예로는 염증성 장애와 조직 손상의 잠재적인 4기 치료에 대한 I 단계 임상 개발 중인 인간화 항-C5a mAb MEDI-7814 및 2007년 이후 개발이 보고된 바가 없는 C5a antibody TNX-558을 들 수 있다. C5a 수용체에 대한 항체인 뉴트라주맙(neutrazumab)은 류마티스성 관절염 및 뇌졸중을 위해 개발 중이다 (Ricklin & Lambris 2007; Wagner & Frank 2010).
PEG화 항-C5 앱타머(ARC-1905)는 AMD를 위한 전임상 개발 중에 있다. CCX168는 현재 항호중구 세포질 자가항체-연관 혈관염을 위해 II 단계 임상 개발 중에 있는 저분자 C5aR 억제제이다(ChemoCentryx Press Release Oct 17, 2011). 임상 개발 중인 또 하나의 C5aR 길항제는 류마티스성 관절염의 치료용 MP-435이다.
현재 저분자/펩티도미메틱(peptidomimetic) C5a 수용체 길항제인 JPE-1375, JSM-7717에 대해 개발이 보고된 바가 없다(Ricklin & Lambris 2007). C5a 수용체 CD88의 또 하나의 억제제인 고리형 헥사펩타이드 PMX53은 염증성 동물 모델에서 효과적이지만, 류마티스성 관절염 환자에서의 위약 대조 이중 맹검 임상 연구에서 종료점을 만나지 못했다. AMD를 위한 임상 개발은 또한 중단되었다(Wagner & Frank 2010). PMX53의 연구 단계 변형물인 PMX205는 알츠하이머성 치매의 쥣과 모델에서 활성인 것으로 공개되었다(Fonseca et al. 2009). 추가의 임상 단계 화합물은 C5a 수용체(C5aR) 길항제인CCX-168이다. 염증성 및 자가 면역 질환에 대한 I 단계 실험이 2010년 1월에 시작되었다.
상기한 바와 같은 C5a의 효과 외에도, 새로운 데이터는 종양 미세환경에서의 C5a의 생성이 항종양 CD8+ T-세포 매개 반응의 억제에 의해 종양 성장을 향상시킨다는 것을 추정할 수 있게 하며, 상기 억제는 골수 유래 억제 세포의 종양 내 동원 및 T-세포 유도 억제 기능의 증가와 관련되는 것으로 보인다. Markiewski 등은 펩타이드 C5a 수용체 길항제에 의한 C5a 수용체의 차단은 생쥐 모델에서 지연된 종양 성장을 유발하는 것을 보여주었다(Markiewski et al., 2008).
대부분의 펩타이드 화합물은 펩티다아제에 의해 분해 및 변형되기 쉽고 신체, 바람직하게는 인체로부터의 빠른 제거율을 보여준다. 따라서, 이러한 펩타이드 화합물은 일반적으로 제공될 약물의 개발을 위해 전제조건인 약물 유사 분자로 고려될 수 없다.
다른 종의 C5a로는 결합하지 않으나 인간 C5a에만 특이적으로 결합하는 몇 가지 스피에겔머(Spiegelmer)가 과거에 개발되었다(WO2009/040113 및 WO2010/108657 참조).
전임상 및 임상 개발을 위해 동물 모델이 필수적이므로, 본 발명의 기본적인 과제는 생쥐 C5a와 상호작용을 하는 화합물을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명의 기본적인 과제는 생쥐 C5a 및 인간 C5a 모두와 상호작용을 하는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 기본적인 또 다른 과제는 인간 및/또는 비인간의 질병을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 화합물을 제공하는 것이며, 상기 질병은 이러한 질병의 발생 기전에 직접 또는 간접적으로 관여하는 C5a에 의해 특징지어진다.
본 발명의 또 다른 기본적인 과제 질병의 치료를 위한 진단 시약의 제조를 위한 화합물을 제공하는 것이며, 상기 질병은 이러한 질병의 발생 기전에 직접 또는 간접적으로 관여하는 C5a에 의해 특징지어진다.
본 발명의 이들 및 다른 기본적인 과제들은 첨부된 독립항들의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 실시형태들이 종속항들로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 기본적인 과제는 제 1 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 1 양태에서 인간 C5a에 결합할 수 있는 핵산 분자에 의해 해결되며, 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드의 중앙 스트레치를 포함하고, 상기 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
5' AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 61]의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU이고, 및
G, A, U, C, H, K 및 R는 리보뉴클레오티드이고, 및
dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 1 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 2 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
a ) 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 62],
b) 5' AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 63],
c) 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 64],
d) 5' AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 65],
e) 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 66],
f) 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 67], 및
e) 5' AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 68]로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU이고, 및
G, A, U 및 C는 리보뉴클레오티드이고, 및
dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 2 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 3 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
5' AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 65]의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU이고, 및
G, A, U 및 C는 리보뉴클레오티드이고, 및
dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 3 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 4 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
a) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA　3' [서열 번호 73],
b) 5' AUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA　3' [서열 번호 74],
c) 5' AUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA　3' [서열 번호 75],
d) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA　3' [서열 번호 76],
e) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 77],
f) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA　3' [서열 번호 78],
g) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 79],
h) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 80],
i) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 81],
j) 5' AUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 82],
k) 5' AUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 83],
l) 5' AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 84]로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
바람직하게 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA　3' [서열 번호 78] 또는
5' AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 84]이다.
제 1 양태의 제 2 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 5 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
5’ AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3’ [서열 번호 66]의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU이고, 및
G, A, U 및 C는 리보뉴클레오티드이고, 및
dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 2 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 6 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 67]의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU 이고, 및
G, A, U 및 C는 리보뉴클레오티드이고, 및
dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 2 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 7 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 64]의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU이고, 및
G, A, U 및 C는 리보뉴클레오티드이고, 및
dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6 및 제 7 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 8 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 리보뉴클레오티드 및 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 구성된다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 5, 제 6 및 제 7 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 9 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 리보뉴클레오티드로 구성된다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4 제 5, 제 6, 제 7, 제 8 및 제 9 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 10 실시형태에서, 핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치를 5' → 3' 방향으로 포함하고,
뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 1개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하고,
뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 1개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하고,
바람직하게, 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 3개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하며,
뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 3개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하고,
더욱 바람직하게, 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 3 개의 뉴클레오티드를 포함하며, 및
뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 3 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
제 1 양태의 제 10 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 11 실시형태에서, 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' Z1Z2Z3Z4G　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5'　Z5Z6Z7Z8Z9　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서 Z1은 G 또는 존재하지 않거나, Z2는 S 또는 존재하지 않거나, Z3은 S 또는 존재하지 않거나, Z4는 B 또는 존재하지 않거나, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V 또는 존재하지 않거나, Z7은 S 또는 존재하지 않거나, Z8은 S 또는 존재하지 않거나, Z9는 C 또는 존재하지 않고, 및
G, S, B, C, V는 리보뉴클레오티드이고, 및
dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이고,
바람직하게,
a) Z1은 G, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 rV, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
b) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 존재하지 않거나, 또는
c) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
d) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않거나, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
e) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
f) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
g) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
h) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 존재하지 않거나, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
i) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 존재하지 않거나, 또는
j) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 존재하지 않거나, 또는
k) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 존재하지 않거나, Z5는 C 또는 dC, Z6는 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 존재하지 않거나, 또는
l) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
m) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않거나, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
n) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 존재하지 않거나, Z5는 C, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
o) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
p) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않거나, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
q) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 존재하지 않거나, Z7은 존재하지 않거나, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않는다.
제 1 양태의 제 10 및 제 11 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 12 실시형태에서, 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCCUG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' CAGGC　3' 또는 of 5' dCAGGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서 C, A, G 및 U는 리보뉴클레오티드이고, 및
dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 12 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 13 실시형태에서, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAGGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 양태의 제 12 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 14 실시형태에서, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' CAGGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 양태의 제 10 및 제 11 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 15 실시형태에서,
뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' CCUG　3' 또는 5' CUG　3' 또는 5' UG　3' 또는 5' G　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및
뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAGGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서 C, A, G 및 U는 리보뉴클레오티드이고, 및
dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 15 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 16 실시형태에서,
뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' CCUG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 양태의 제 15 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 17 실시형태에서,
뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' CUG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 양태의 제 10 및 제 11 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 18 실시형태에서,
a) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCUG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
b) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCCG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
c) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GGCG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGCC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서 C, A, G 및 U는 리보뉴클레오티드이고, 및
dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 18 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 19 실시형태에서,
뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GGCG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGCC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 양태의 제 10 및 제 11 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 20 실시형태에서,
뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' CUG　3' 또는 5' UG　3' 또는 5' CG　3' 또는 5' G　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및
뉴클레오티드의 제 2말단 스트레치는 5' dCAGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서 C, A, G 및 U는 리보뉴클레오티드이고, 및
dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 10 및 제 11 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 21 실시형태에서,
뉴클레오티드의 제 1말단 스트레치는 5' GCUG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
뉴클레오티드의 제 2말단 스트레치는 5' dCAC　3' 또는 5' dCC　3' 또는 5' dCA　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서 C, A, G 및 U는 리보뉴클레오티드이고, 및
dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 10 및 제 11 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 22 실시형태에서,
a) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GUG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
b) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' UG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCA　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
c) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
d) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' CG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
e) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' G　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
f) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
g) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
h) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 또는
i) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' CGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서 C, A, G 및 U는 리보뉴클레오티드이고, 및
dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 22 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 23 실시형태에서, 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 뉴클레오티드의 제 2말단 스트레치는 5' dCGC　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 5, 제 6, 제 7, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12 및 제 14 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 24 실시형태에서,
핵산 분자는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 90으로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 90으로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 핵산 분자에 대해 적어도 85%의 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 90으로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 상동인 핵산 분자를 포함하며, 상기 상동성은 적어도 85%이다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 8, 제 10, 제 11, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22 및 제 23 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 25실시형태에서,
핵산 분자는 서열 번호 14, 서열 번호 21, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 37, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 91 및 서열 번호 92로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는, 서열 번호14, 서열 번호 21, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 37, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 91 및 서열 번호 92로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 핵산 분자에 대해 적어도 85%의 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는, 서열 번호14, 서열 번호 21, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 37, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 91 및 서열 번호 92로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 상동인 핵산 분자를 포함하며, 상기 상동성은 적어도 85%이다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24 및 제 25 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 26실시형태에서, 핵산 분자는 인간 C5a 및 생쥐 C5a에 결합할 수 있다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25 및 제 26 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 26실시형태에서, 핵산 분자는 인간 C5a 및 생쥐 C5a를 결합시킬 수 있는 적어도 하나의 결합 모이어티를 포함하며, 이러한 결합 모이어티는 L-뉴클레오티드로 구성된다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26 및 제 27 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 28실시형태에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 형성하는 뉴클레오티드는 L-뉴클레오티드이다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27 및 제 28 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 29실시형태에서, 핵산 분자는 L-핵산 분자이다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28 및 제 29 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 30실시형태에서, 핵산은 인간 및/또는 생쥐 C5a에 의해 매개되는 활성의 길항제이다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29 및 제 30 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 31실시형태에서, 핵산 분자는 변형기를 포함하며, 유기체로부터의 변형기를 포함하는 핵산 분자의 배설율(excretion rate)은 변형기를 포함하지 않는 핵산에 비해 감소된다.
제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29 및 제 30 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 32실시형태에서, 핵산 분자는 변형기를 포함하며, 변형기를 포함하는 핵산 분자는 변형기를 포함하지 않는 핵산에 비해 유기체에서의 체류 시간이 증가된다.
제 1 양태의 제31 및 제 32 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 33 실시형태에서, 변형기는 생분해성 및 비-생분해성 변형으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게, 변형기는 폴리에틸렌 글리콜, 선형 폴리에틸렌 글리콜, 분기된 폴리에틸렌 글리콜, 히드록시에틸 전분, 펩타이드, 단백질, 다당류, 스테롤, 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시아미데이트 및 폴리(2-히드록시에틸)-L-글루타민으로 이루어진 군에서 선택된다.
제 1 양태의 제 33 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 34 실시형태에서, 변형기는 바람직하게 선형 폴리에틸렌 글리콜 또는 분기된 폴리에틸렌 글리콜로 이루어지는 폴리에틸렌 글리콜이며, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 바람직하게 약 20,000 내지 약 120,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 약 80,000 Da, 그리고 가장 바람직하게는 약 40,000 Da이다.
제 1 양태의 제 33 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 35 실시형태에서, 변형기는 히드록시에틸 전분이며, 히드록시에틸 전분의 분자량은 바람직하게 약 50 내지 약 1,000 kDa, 보다 바람직하게 약 100 내지 약 700 kDa, 그리고 가장 바람직하게는 200 내지 500 kDa이다.
제 1 양태의 제 31, 제 32, 제 33, 제 34 및 제 35 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 36 실시형태에서, 변형기는 링커를 통해 핵산 분자에 결합되며, 바람직하게 상기 링커는 생분해성 링커이다.
제 1 양태의 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35 및 제 36 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 37 실시형태에서, 변형기는 핵산 분자의 5'-말단 뉴클레오티드 및/또는 3'-말단 뉴클레오티드에 및/또는 핵산 분자의 5'-말단 뉴클레오티드와 핵산 분자의 3'-말단 뉴클레오티드 사이의 핵산 분자의 뉴클레오티드에 결합된다.
제 1 양태의 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36 및 제 37 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 1 양태의 제 38 실시형태에서, 유기체는 동물 또는 인체, 바람직하게는 인체이다.
본 발명의 기본적인 과제는, 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한, 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 핵산 분자에 의해, 제 2 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 2 양태에서 해결된다.
제 2 양태의 제 1 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 2 양태의 제 2 실시형태에서, 질환은 보체 활성화 및 C5a 매개 발명 기전과 관련되고, 및/또는 자가 면역 질환, 염증성 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 안 질환, 국소빈혈/재관류 손상, 지연 이식 기능, 이식 거부, 심혈관계 질환, 호흡기 질환, 급성 반응, 전염병, 신경 질환, 신경퇴행성 질환, 섬유증 질환, 혈액 질환, 대사 질환, 종양 및 생체재료에 의한 보체 활성화와 관련된 임상 합병증으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게, 전신성 염증 반응 증후군은 패혈증 및 정신적 외상 또는 중화상의 이차 손상으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 기본적인 과제는, 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자 및 선택적으로 추가 성분을 포함하는 약학적 조성물에 의해, 제 3 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 3 양태에서 해결되며, 상기 추가 성분은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 약학적으로 허용 가능한 운반체 및 약학적 활성제로 이루어진 군에서 선택된다.
제 3 양태의 제 1 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 3 양태의 제 2 실시형태에서, 약학적 조성물은 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제10, 제 11, 제 12, 제13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 양태에 따른 핵산 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 기본적인 과제는, 약제의 제조를 위한 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제10, 제 11, 제 12, 제13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 양태에 따른 핵산 분자의 사용에 의해, 제 4 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 4 양태에서 해결된다.
제 4 양태의 제 1 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 4 양태의 제 2 실시형태에서, 약제는 인간 의학에서의 사용 또는 수의학에서의 사용을 위한 것이다.
제 4 양태의 제 1 및 제 2 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 4 양태의 제 3 실시형태에서, 약제는 자가 면역 질환, 염증성 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 안 질환, 국소빈혈/재관류 손상, 지연 이식 기능, 이식 거부, 심혈관계 질환, 호흡기 질환, 급성 반응, 전염병, 신경 질환, 신경퇴행성 질환, 섬유증 질환, 혈액 질환, 대사 질환, 종양 및 생체 재료에 의한 보체 활성화와 관련된 임상 합병증의 치료 및/또는 예방을 위한 것이며, 바람직하게, 전신성 염증 반응 증후군은 패혈증 및 정신적 외상 또는 중화상의 이차 손상으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 기본적인 과제는, 진단 수단의 제조를 위한, 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자의 사용에 의해, 제 5 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 5 양태에서 해결된다.
본 발명의 기본적인 과제는, 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자 및 C5a를 포함하는 복합체에 의해, 제 6 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 6 양태에서 해결된다.
본 발명의 기본적인 과제는, C5a의 검출을 위한, 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자의 사용에 의해, 제 7 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 7 양태에서 해결된다.
본 발명의 기본적인 과제는,
- C5a에 의해 매개되는 활성의 후보 길항제를 제공하는 단계,
- 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자를 제공하는 단계,
- C5a에 의해 매개되는 활성의 길항제의 존재 하에 신호를 제공하는 테스트 시스템을 제공하는 단계, 및
- C5a에 의해 매개되는 활성의 후보 길항제가 C5a에 의해 매개되는 활성의 길항제인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 C5a에 의해 매개되는 활성의 길항제의 스크리닝을 위한 방법에 의해, 제 8 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 8 양태에서 해결된다.
본 발명의 기본적인 과제는, 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자 및 적어도 지시 리플릿 또는 반응 용기를 포함하는 C5a의 검출을 위한 키트에 의해, 제 9 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 9 양태에서 해결된다.
본 발명의 기본적인 과제는, 샘플에서 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산의 검출을 위한 방법에 의해, 제 10 양태의 제 1 실시형태이기도 한 제 10 양태에서 해결되며, 상기 방법은
a) 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자의 제 1 부분에 적어도 부분적으로 상보적인 캡처 프로브 및 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자의 제 2 부분에 적어도 부분적으로 상보적인 검출 프로브, 또는 대안적으로, 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자의 제 2 부분에 적어도 부분적으로 상보적인 캡처 프로브 및 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자의 제 1 부분에 적어도 부분적으로 상보적인 검출 프로브를 제공하는 단계;
b) 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자를 포함하는 또는 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자를 포함하는 것으로 추정되는 샘플에 캡처 프로브 및 검출 프로브를 별도로 또는 함께 추가하는 단계;
c) 상기 캡처 프로브 및 검출 프로브가 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자 또는 이의 일부와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 반응하도록 하는 단계;
d) 상기 캡처 프로브가 단계 (a)에서 제공되는 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자에 혼성화되는지 여부를 선택적으로 검출하는 단계; 및
e) 제 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자, 캡처 프로브 및 검출 프로브로 이루어지는, 단계 (c)에서 형성되는 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
제 10 양태의 제 1 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 10 양태의 제 2 실시형태에서, 상기 검출 프로브는 검출 수단을 포함하고 및/또는 상기 캡처 프로브는 지지체, 바람직하게는 고체 지지체에 고정화된다.
제 10 양태의 제 1 및 제 2 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 10 양태의 제 3 실시형태에서, 단계 (c)에서 형성되는 복합체의 일부가 아닌 검출 프로브는, 단계 (e)에서 상기 복합체의 일부인 검출 프로브만 검출되도록, 반응에서 제거된다.
제 10 양태의 제 1, 제 2 및 제 3 실시형태의 일 실시형태이기도 한 제 10 양태의 제 4 실시형태에서, 단계 (e)는 1 양태의 제 1, 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10, 제 11, 제 12, 제 13, 제 14, 제 15, 제 16, 제 17, 제 18, 제 19, 제 20, 제 21, 제 22, 제 23, 제 24, 제 25, 제 26, 제 27, 제 28, 제 29, 제 30, 제 31, 제 32, 제 33, 제 34, 제 35, 제 36, 제 37 및 제 38 실시형태에 따른 그리고 제 2 양태의 제 1 실시형태에 따른 핵산 분자 또는 이의 일부의 존재 하에 및 상기 핵산 분자 또는 이의 일부의 부재 하에 캡처 프로브 및 검출 프로브가 혼성화될 때 상기 검출 수단에 의해 생성되는 신호를 비교하는 단계를 포함한다.
어떠한 이론에 의해 제한되기를 원하는 것은 아니나, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 핵산 분자가 생쥐 C5a 및 인간 C5a 모두에 특이적으로 그리고 매우 높은 친화도를 가지고 결합함으로써, C5a가 C5a 수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있으나, 상동 부분에서 생쥐 C5a 및 인간 C5a의 서열 상동성이 단지 64%이며 생쥐 C5a는 3 개의 추가적인 N- 말단 아미노산을 갖는다는 것을 알아냈다. 또한, 인간 C5a와는 대조적으로, 생쥐 C5a는 글리코실화되지 않는다. 인간 C5a에서 글리코실화 부위인 아스파라긴64는 생쥐의 글루타메이트로 돌연변이된다. 특히, 피코몰 범위에서 여러 개의 개별적인 C5a 결합 핵산의 나타난 친화도는 예상할 수 없다.
또한, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 핵산 분자가 C5a와 C5a 수용체의 상호작용을 차단하기에 적합하다는 것을 알아냈다. 이러한 점에 있어서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 각각 C5a 수용체의 길항제로 그리고 C5a의 효과의 길항제로, 특히 이의 수용체에 대한 C5a의 효과의 길항제로 볼 수 있다. C5a에 대한 길항제는 본 발명에 따른 핵산 분자와 같이 C5a에 결합하고, 실시예에서 설명한 바와 같이, 바람직하게 체외 분석에서 또는 체내 모델에서 C5a의 기능을 억제하는 분자이다.
본 발명에 따른 핵산이 핵산 분자라는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 점에 있어서, 핵산 및 핵산 분자라는 용어는, 달리 지시하지 않으면, 본원에서 동의어로 사용된다. 또한, 이러한 핵산(들)은, 바람직하게, 본 발명에 따른 핵산 분자(들), 본 발명에 따른 핵산(들), 본 발명의 핵산(들), 또는 본 발명의 핵산 분자(들)로서 본원에서 또한 언급된다.
본원에서 기재되는 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산의 특징들은 단독으로 또는 조합으로 핵산이 사용되는 본 발명의 모든 양태에서 실현될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자 및 조성물, 바람직하게는 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있는 다양한 질환, 질병 및 장애에 관해서, 이러한 질환, 질병 및 장애는 특히 본 출원의 도입부에 기재되고 제시된 것들을 포함하여, 본원에 기재되어 있는 것들이라는 것을 인정해야 한다. 이러한 점에 있어서, 명세서 및 명세서의 도입부의 각 구절은 상기 질환, 질병 및 장애에 대해 각각 예방 및 치료를 위한 본 발명의 핵산 분자의 적합성을 알려주는 본 발명의 주요 부분을 형성한다. 또한, C5a-C5a 수용체 축의 생리학적 영향이 C5a의 높은 혈장 농도와 관련된다면, 본 발명에 따른 핵산 분자가 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, C5a라는 용어는 포유류의 C5a를 포함하여 모든 C5a를 의미하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게, 상기 포유류의 C5a는 인간, 쥐, 생쥐, 원숭이의 C5a로 이루어진 군에서 선택된다(도 11의 C5a 종 정렬 참조). 더욱 바람직하게, 상기 C5a는 인간의 C5a이다. 인간 C5a는 서열 번호 50에 따른 아미노산 서열을 갖는 염기성 단백질이다. 생쥐 C5a는 서열 번호 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 염기성 단백질이다.
청구범위와 실시예 1에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 인간 및 생쥐 C5a 모두에 결합할 수 있는 다수의 다양한 결합 핵산 분자를 확인할 수 있었다.
본원에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 인간 및 생쥐 C5a 모두에 결합할 수 있는 다수의 다양한 C5a 결합 핵산 분자를 확인했으며, 상기 핵산 분자는 개시된 바와 같이 본원에서 또한 언급되는 뉴클레오티드의 스트레치 측면에서 특징지어질 수 있다(실시예 1 참조). 실시예 8 및 실시예 9에 실험적으로 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 핵산 분자가 패혈증의 치료에 적합한 여러 개의 시스템을 입증할 수 있었다.
C5a에 결합하는 본 발명의 다양한 유형의C5a 결합 핵산 분자 각각은 세 개의 상이한 뉴클레오티드의 다양한 스트레치, 즉 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 C5a 결합 핵산 분자는 5'-말단 및 3'-말단에 뉴클레오티드의 말단 스트레치, 즉 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치(뉴클레오티드의 5'-말단 스트레치 및 뉴클레오티드의 3'-말단 스트레치라고도 함) 중 각각 하나씩을 포함한다. 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 원칙적으로 이의 염기 상보성으로 인해 서로 혼성화할 수 있으며, 혼성화 시에 이중 가닥 구조가 형성된다. 그러나, 이러한 혼성화가 생리학적 및/또는 비-생리학적 조건 하의 분자에서 반드시 실현되는 것은 아니다. 본 발명의 C5a 결합 핵산 분자의 뉴클레오티드의 세 가지 스트레치, 즉 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' → 3' 방향, 즉 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치-뉴클레오티드의 중앙 스트레치-뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 순으로 서로 정렬된다. 대안적으로, 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치가 5' → 3' 방향으로 서로 정렬된다.
본 발명에 따른 핵산의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 길이는 바람직하게 34이다.
본 발명에 따른 핵산의 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치의 길이는 1 개 및 5 개의 뉴클레오티드 사이, 바람직하게는 3 개와 5개의 뉴클레오티드 사이, 더욱 바람직하게는 3 개의 뉴클레오티드이다.
본 발명에 따른 핵산의 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 길이는 1 개 및 5 개의 뉴클레오티드 사이, 바람직하게는 3 개와 5개의 뉴클레오티드 사이, 더욱 바람직하게는 3 개의 뉴클레오티드이다.
달리 지시하지 않으면, "스트레치" 및 "뉴클레오티드의 스트레치"라는 용어는 본원에서 동의어로 사용된다.
상이한 C5a 결합 핵산 분자 간의 정의된 또는 스트레치의 서열에서의 차이는 C5a에 대한 결합 친화도에 영향을 미친다. 본 발명의 상이한 C5a 결합 핵산 분자의 결합 분석에 따르면, 중앙 스트레치 및 이를 형성하는 뉴클레오티드는 개별적이며, 보다 바람직하게는 전체가 C5a에 대한 C5a 결합 핵산 분자의 결합에 필수적이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산은 단일 핵산 분자이다. 다른 실시형태에서, 상기 단일 핵산 분자는 다수의 단일 핵산 분자 또는 다수의 단일 핵산 분자 종으로서 존재한다.
본 발명에 따른 핵산 분자는, 바람직하게 인산디에스테르 결합을 통해, 바람직하게 서로 공유 결합되는 뉴클레오티드로 구성된다는 것을 본 기술분야의 숙련자는 인정할 것이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는, 원칙적으로, 서로 혼성화할 수 있는 2 개 이상의 스트레치 또는 이들의 부분(들)을 포함한다는 것이 본 발명 내에 있다. 이러한 혼성화 시, 이중 가닥 구조가 형성된다. 이러한 혼성화는, 특히 체외 및/또는 생체 내 조건에서 발생하거나 발생하지 않을 수 있다는 것을 본 기술분야의 숙련자는 인정할 것이다. 또한, 이러한 혼성화의 경우에서, 혼성화는 적어도 염기쌍의 규칙에 따라, 두 개의 스트레치의 전체 길이에 걸쳐 발생하며, 따라서, 이러한 혼성화 및 이중 가닥 구조의 형성은, 원칙적으로, 발생할 수 있다. 본원에서 바람직하게 사용된 바와 같이, 이중 가닥 구조는 핵산 분자의 일부, 또는 두 개 이상의 개별 가닥 또는 핵산 분자의 단일 가닥의 두 개의 공간적으로 분리된 스트레치에 의해 형성된 구조이며, 바람직하게 왓슨-크릭 염기쌍 규칙(Watson-Crick base pairing rule)에 따르는 염기쌍인 적어도 하나, 바람직하게는 두 개 이상의 염기쌍이 존재한다. 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍과 같은 다른 염기쌍이 이러한 이중 가닥 구조에 존재하거나 이러한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다는 것을 본 기술분야의 숙련자는 또한 알 것이다. 두 개의 스트레치가 혼성화하는 특징이 이러한 혼성화가 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 실제로 발생하는지 여부에 관계없이, 이러한 혼성화가 두 개의 스트레치의 염기 상보성으로 인해 발생하는 것이 가정된다는 것을 바람직하게 나타낸다는 것이 또한 인정될 것이다. 본 발명과 관련하여, 이러한 스트레치는 상기에 정의된 바와 같이, 실시형태에서, 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치이다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 사용되는 바와 같은 배열이라는 용어는 본원에 개시된 본 발명의 핵산 분자와 관련해서 본원에 기재되는 구조적 또는 기능적 특징 또는 요소의 순서 또는 서열을 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 C5a 및 C5 모두에 결합할 수 있다는 것을 본 기술분야의 숙련자는 인정할 것이다. 어떠한 이론에 의해 제한되기를 원하는 것은 아니나, 이러한 결합 특성은, 핵산의 확인을 위해, C5a 및 C5 모두에 존재하는 C5a의 모이어티가 사용된다는 사실로 인한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산은 C5a 또는 C5 또는 이들 모두의 검출에 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 C5 및 C5a에 대한 길항제임을 본 기술분야의 숙련자는 인정할 것이다. 이로 인해, 본 발명에 따른 핵산은 C5a 또는 C5 또는 이들 모두와 관련되거나 이들에 의해 야기되는 질환의 치료 및 예방에 적합하다. 과학적 근거는 C5a 및 C5가 각각 다양한 질환 및 질병에 각각 관여되거나 관련된다는 것을 확립하는 종래 기술로부터 선택될 수 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
본원에 개시된 본 발명의 C5a 결합 핵산 분자는 C5의 맥락에서 C5a를 인식하는 것으로 나타났다(실시예 1 참조). 따라서, 막 공격 복합체(MAC)의 일부인 아나필라톡신 C5a 및 C5b로의 C5 분열이 C5a 결합 핵산에 의해 억제되는지를 확인하였다. MAC는, C5b-9로 구성된 기공인, 보체 캐스케이드의 최종 생성물이다. MAC는 병원균의 세포질 막에 삽입되어 세포질 막 누출의 도입으로 이들을 죽이는 것으로 여겨진다. C5 분열에 대한 분석은 보체 의존성 양 적혈구 용혈 테스트를 이용하여 이루어졌다. 본 발명의 C5a 결합 분자는 용혈을 억제하지 않았다(실시예 6 참조). 본 발명의 C5a 결합 핵산 분자는 C5 분열 및 MAC 형성을 간섭하지 않으며 따라서 C5a 만의 선택적인 길항제이다. 약제로 사용되는 경우, 병원균 방어에 유리한 MAC의 형성이 이들의 존재로 위태롭지 않기 때문에 많은 질병에서 유리하다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 본원에 개시된 특정 서열과 본질적으로 상동인 핵산을 포함할 수 있다. 실질적으로 상동이란 용어는 상동성이 적어도 75%, 바람직하게 85%, 더욱 바람직하게 90%, 그리고 가장 바람직하게 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99% 이상인 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 핵산 분자에 존재하는 상동 뉴클레오티드의 실제 비율은 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 총수에 따라 달라질 것이다. 비율 변경은 핵산 분자에 존재하는 뉴클레오티드의 총수에 근거할 수 있다.
두 개의 핵산 분자 간의 상동성은 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 바와 같이 결정될 수 있다. 보다 구체적으로, 설계된 프로그램 매개변수를 근거로, 참조 서열에 대하여 테스트 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 상동성을 계산하기 위해 서열 비교 알고리즘이 사용될 수 있다. 테스트 서열은 바람직하게, 상동이라고 말하는 또는 상이한 핵산 분자와 상동인지, 상동이라면, 어느 정도까지 상동인지 여부를 테스트하는 핵산 분자 또는 서열이며, 이러한 상이한 핵산 분자는 참조 서열로서 또한 언급된다. 일 실시형태에서, 참조 서열은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자이며, 바람직하게는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 90, 서열 번호 14, 서열 번호 21, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 37, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 91 and 서열 번호 92 중 어느 하나에 따른 서열을 갖는 핵산 분자이다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, Smith & Waterman의 로컬 상동성 알고리즘(Smith & Waterman, 1981), Needleman & Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(Needleman & Wunsch, 1970), Pearson & Lipman의 유사성 방법에 대한 검색(Pearson & Lipman, 1988), 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(GAP, BESTFIT, FAST, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 일 예는 기본 로컬 정렬 검색 도구(local alignment search tool, "BLAST")에서 사용되는 알고리즘이다, 예를 들어, Altschul et al(Altschul et al. 1990 and Altschul et al, 1997) 참조. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, "NCBI")를 통해 공적으로 사용 가능하다. NCBI로부터 이용 가능한 소프트웨어, 예를 들어(뉴클레오티드 서열에 대한) BLASTN 및 (아미노산 서열에 대한) BLASTP를 사용하여 서열 동일성을 결정하는 과정에서 사용되는 디폴트 매개변수는 McGinnis et al(McGinnis et al., 2004)에서 기술된다.
본 발명에 따른 핵산은 본원에 개시된 및 이의 뉴클레오티드 서열에 의해 정의된 본 발명의 핵산에 대하여 어느 정도의 동일성을 갖는 핵산을 또한 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 본 발명은 이의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부에 의해 정의되는 본 발명의 핵산 분자에 대하여 적어도 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 그리고 가장 바람직하게는 95%, 96 %, 97 %, 98 % 또는99% 이상의 동일성을 갖는 이들 핵산 분자를 또한 포함한다.
본 발명의 핵산 또는 본 발명에 따른 핵산 분자라는 용어는, 바람직하게 어느 정도까지는 핵산 분자 또는 상기 일부가 인간 C5a에 대한 결합에 관여하는 것과 같은, 본원에 개시된 핵산 서열 또는 이의 일부를 포함하는 핵산 분자를 또한 포함할 수 있다. 이러한 핵산은, 일 실시형태에서, 본원에 개시된 핵산 분자 중 하나 또는 이들의 유도체 및/또는 대사 산물이며, 이러한 유도체 및/또는 대사 산물은 바람직하게 본원에 개시된 핵산 분자에 비해 절단된 핵산이다. 절단은 본원에 개시된 바와 같은 핵산의 말단 중 하나 또는 모두에 관련될 수 있다. 또한, 절단은 핵산의 뉴클레오티드의 내부 서열과 관련될 수 있다, 즉, 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드(들)과 관련될 수 있다. 또한, 절단은 본원에 개시된 본 발명의 핵산의 서열로부터 단일 뉴클레오티드와 같은 작은 삭제를 포함할 수 있다. 또한, 절단은 본 발명의 핵산(들)의 하나 이상의 스트레치와 관련될 수 있으며, 상기 스트레치는 하나의 뉴클레오티드 길이만큼 작을 수 있다. 본 발명에 따른 핵산의 결합은 일상적인 실험을 사용하여 본 기술분야의 숙련자에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같은, 바람직하게는 실시예 부분에서 본원에 개시된 바와 같은 방법을 사용하거나 채택하여 결정될 수 있다.
본 발명에 다른 핵산 분자는 D-핵산 분자 또는 L-핵산 분자일 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 다른 핵산 분자는 L-핵산 분자이다. 보다 바람직하게, 본 발명에 다른 핵산 분자는 스피에겔머이다.
일 실시형태에서, 핵산 서열(들)에 관하여 그들의 전체에서 본원에 기재된 각각의 및 모든 핵산 분자는 특정 표시된 뉴클레오티드 서열(들)에 제한된다. 즉, "포함하는(comprising)" 또는 "포함하다(comprise)"라는 용어는 포함하는 또는 구성하는 이라는 의미로 이러한 실시형태에서 해석될 것이다.
본 발명에 따른 핵산은 보다 긴 핵산의 일부이며, 보다 긴 핵산은 여러 개의 부분을 포함하며, 적어도 하나의 이러한 부분은 본 발명에 따른, 핵산 또는 이의 일부인 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 긴 핵산의 다른 부분(들)은 하나 또는 여러 개의 D-핵산(들) 또는 하나 또는 여러 개의 L-핵산(들)일 수 있다. 임의의 조합이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 단독으로 또는 함께, 또는 이들의 전체로 또는 특정 조합으로 선택되는 이러한 긴 핵산의 다른 부분(들)은 결합과는 상이한, 바람직하게는 C5a에 대한 결합과는 상이한 기능을 나타낼 수 있다. 하나의 가능한 기능은 다른 분자와의 상호작용을 허용하는 것이며, 이러한 다른 분자는 바람직하게 예를 들어, 고정화, 가교, 검출 또는 증폭 등을 위해, C5a와 상이하다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산은 본 발명의 핵산 중 몇 개를, 각각 또는 결합된 부분들로서, 포함한다. 본 발명의 핵산 몇 개를 포함하는 이러한 핵산은 보다 긴 핵산이라는 용어에 의해 또한 포함된다.
본원에서 사용되는 L-핵산은 L-뉴클레오티드로 이루어진, 바람직하게는 완전히 L-뉴클레오티드로 이루어진 핵산 또는 핵산 분자이다.
본원에서 사용되는 D-핵산은 D-뉴클레오티드로 이루어진, 바람직하게는 완전히 D-뉴클레오티드로 이루어진 핵산 또는 핵산 분자이다.
핵산 및 핵산 분자라는 용어는, 명시적으로 달리 지시하지 않으면, 본원에서 동일한 의미로 사용된다.
또한, 달리 지시하지 않으면, 모든 뉴클레오티드 서열은 5' → 3' 방향으로 본원에 명시된다.
바람직하게 본원에서 사용된 바와 같이, 모든 뉴클레오티드의 위치는 서열, 스트레치 또는 이러한 뉴클레오티드를 포함하는 서브스트레치의 5' 말단에 대해 결정되거나 언급된다. 따라서, 제 2 뉴클레오티드는 서열, 스트레치 및 서브스트레치 각각의 5' 말단으로부터 카운트되는 제 2 뉴클레오티드이다. 또한, 이에 따라서, 끝에서 두 번째의 뉴클레오티드는 서열, 스트레치 및 서브스트레치 각각의 3' 말단으로부터 카운트되는 제 2 뉴클레오티드이다.
본 발명의 핵산 분자가 D-핵산, L-핵산, 또는 예를 들어, 랜덤 조합 또는 적어도 하나의 L-뉴클레오티드 및 적어도 하나의 D-핵산으로 이루어지는 스트레치의 정의된 서열인 조합을 갖는 둘의 조합으로 이루어지는지 여부와 관계없이, 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드(들), 리보뉴클레오티드(들) 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
또한, 핵산 분자는 리보뉴클레오티드와 2'데옥시리보뉴클레오티드 양자로 구성된다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 2'데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드는 도 22 및 도 23에 도시된다. 본 발명에 따른 핵산 분자의 서열에서 리보뉴클레오티드와 2'데옥시리보뉴클레오티드를 구별하기 위해, 다음의 참조 코드가 본원에서 사용된다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 2'데옥시리보뉴클레오티드로 이루어지며,
여기서 dG는 2'데옥시-구아노신-5'-일인산염이고,
dC는 2'데옥시-시티딘-5'-일인산염이고,
dA는 2'데옥시-아데노신-5'-일인산염이며,
dU는 2'데옥시-우리딘-5'-인산염이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 리보뉴클레오티드로 구성되며,
여기서 G는 구아노신-5'-일인산염이고,
C는 시티딘-5'-일인산염이고,
A는 아데노신-5'-일인산염이며,
U는 우리딘-5'-일인산염이다.
리보뉴클레오티드 서열 모티프(motif)의 정의를 위해, 모호한 뉴클레오티드에 대해 IUPAC 약어들이 사용된다:
S 강함 G 또는 C;
W 약함 A 또는 U;
R 푸린 G 또는 A;
Y 피리미딘 C 또는 U;
K 케토 G 또는 U;
M 이미노 A 또는 C;
B A 아님 C 또는 U 또는 G;
D C 아님 A 또는 G 또는 U;
H G 아님 A 또는 C 또는 U;
V U 아님 A 또는 C 또는 G;
N 모두 A 또는 G 또는 C 또는 U.
L-핵산 분자로서 본 발명의 핵산 분자를 설계하는 것이 여러 가지 이유로 유리하다. L-핵산 분자는 자연적으로 발생하는 핵산의 거울상 이성질체이다. 그러나, D-핵산 분자는 뉴클레아제의 광범위한 존재로 인해 수용액 및 특히 생물학적 시스템 또는 생물학적 샘플에서 매우 안정하지 않다. 자연적으로 발생하는 뉴클레아제, 특히 동물 세포로부터의 뉴클레아제는 L-핵산을 분해할 수 없다. 이 때문에, L-핵산 분자의 생물학적 반감기는 동물 및 인체를 포함하여, 이러한 시스템에서 상당히 증가된다. L-핵산 분자의 분해성 부족으로 인해, 뉴클레아제 분해 생성물이 생성되지 않고, 따라서 이로부터 일어나는 부작용이 동물 및 인체를 포함하여, 이러한 시스템에서 관찰되지 않는다. 이러한 양태는 사실상 L-핵산 분자를, C5의 존재를 포함하는 질환 및 장애의 치료에 사용되는 모든 다른 화합물과 구별한다. 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍과 다른 메커니즘을 통해 표적 분자에 특이적으로 결합하는 L-핵산 분자, 또는 일부 또는 전부가 L-뉴클레오티드로 구성되는 앱타머, 특히 이 앱타머의 일부가 표적 분자에 대한 앱타머의 결합에 관여하는 앱타머는 스피에겔머라고도 불린다. 이와 같은 앱타머 및 스피에겔머는 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있으며 및 그 중에서도, "앱타머 핸드북"(eds. Klussmann, 2006)에 개시되어 있다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는, D-핵산, L-핵산 또는 D,L-핵산으로 존재하는지, 또는 DNA인지 RNA인지 여부와 관계없이, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 분자로 존재할 수 있다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 일반적으로, 핵산 분자는, 일차 서열로 인해 정의된 이차 구조를 나타내는 단일 가닥 핵산 분자이며, 따라서 삼차 구조를 또한 형성할 수 있다. 그러나, 핵산 분자는 서로 상보적 또는 부분적으로 상보적인 두 개의 가닥이 서로 혼성화된다는 의미에서 또한 이중 가닥일 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 변형될 수 있다. 이러한 변형은 핵산 분자의 단일 뉴클레오티드와 관련될 수 있으며, 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 이러한 변형에 대한 예들은, 그 중에서도, Venkatesan et al.(Venkatesan, Kim et al. 2003) 및 Kusser(Kusser 2000)에 의해 설명된다. 이러한 변형은 핵산 분자가 구성되어 있는 각각의 뉴클레오티드 모두 중 하나, 몇 개의 2' 위치에서의 H 원자, F 원자 또는 O-CH3 작용기 또는 NH2-작용기일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 LNA 뉴클레오티드로 구성된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 분절(multipartite) 핵산 분자일 수 있다. 본원에서 사용된 분절 핵산 분자는 적어도 두 개의 분리된 핵산 가닥으로 구성되는 핵산 분자이다. 이들 적어도 두 개의 핵산 가닥은 기능 단위(functional unit)를 형성하며, 기능 단위는 표적 분자에 대한 리간드이며, 바람직하게는, C5a의 경우에서, 표적 분자에 대한 길항제이다. 상기 적어도 두 개의 핵산 가닥은 적어도 두 개의 가닥을 생성하기 위해 본 발명의 핵산 분자를 분열시키거나, 본 발명의 전장 핵산 분자의 제 1 부분에 대응하는 하나의 핵산 분자 및 본 발명의 전장 핵산 분자의 다른 일부에 대응하는 다른 핵산 분자를 합성함으로써 본 발명의 핵산 분자 중 어느 하나로부터 유도될 수 있다. 전장 핵산 분자를 형성하는 부분의 개수에 따라, 필요한 뉴클레오티드 서열을 갖는 부분의 해당 개수가 합성될 것이다. 분열 방법 및 합성 방법 모두는, 위에 예시된 바와 같이 두 개 이상의 가닥이 있는 분절 핵산 분자를 생성하기 위해 적용될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 즉, 상기 적어도 두 개의 분리된 핵산 가닥은 일반적으로 상보적이고 서로 혼성화하는 두 개의 가닥과 다르지만, 상기 적어도 두 개의 분리된 핵산 가닥 사이에 어느 정도의 상보성이 존재할 수 있으며, 이러한 상보성은 상기 분리된 가닥의 혼성화를 야기할 수 있다.
마지막으로, 본 발명에 따른 핵산 분자에 대해 완전히 닫힌, 즉 원형 구조가 실현되며, 즉 본 발명에 따른 핵산 분자가 일 실시형태에서, 바람직하게 공유 결합을 통해 닫혀 있으며, 보다 바람직하게는 이러한 공유 결합은 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자의 핵산 서열 또는 이들의 유도체의 5' 말단 및 3' 말단 사이에서 이루어진다는 것이 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 결합 상수를 결정하는 가능성은 본원의 실시예 3 및 실시예 4에서 설명되는 방법의 사용이며, 이는 본 발명에 따른 핵산이 유리한 KD 값 범위를 나타낸다는 상기 결과를 확인한다. 각각의 핵산 분자 및 본 경우에서는 C5a인 타켓 사이의 결합의 세기를 표현하기 위한 적절한 단위는 소위 KD 값이며, 이의 결정을 위한 방법 또한 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 핵산에 의해 도시된 KD 값은 1 μm 이하이다. 약 1 μm의 KD 값은 표적에 대한 핵산의 비-특이적 결합에 대한 특성이라고. 본 기술분야의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 분자와 같은 일군의 화합물의 KD 값은 특정 범위 내에 있다. 전술한 약 1 μm의 KD는 KD 값에 대한 바람직한 상한(upper limit)이다. 표적 결합 핵산의 KD에 대한 하한은 약 10 피코몰 정도일 수 있으며, 더 높을 수 있다. C5a에 결합하는 각각의 핵산 분자의 KD 값은 바람직하게 이 범위 내에 있다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직한 범위는 이 범위 내의 제 1 숫자 및 이 범위 내의 제 2 숫자를 선택함으로써 정의될 수 있다. 바람직한 KD 상한값은 250 nM 및 100 nM이며, 바람직한 KD 하한값은 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 10 pM이다. 더욱 바람직한 KD 상한값은 10 nM이며, 더욱 바람직한 KD 하한값은 100 pM이다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자의 결합 특성 외에도, 본 발명에 따른 핵산 분자는 본 경우에서는 C5a 각 표적 분자의 기능을 억제한다. C5a의 기능 억제(예를 들어, 전술한 바와 같은 각 수용체의 자극)는 C5a에 대한 본 발명에 따른 핵산 분자의 결합에 의해 및 C5a와 본 발명에 따른 핵산 분자의 복합체 형성에 의해 달성된다. C5a와 핵산 분자의 이러한 복합체는, 정상적으로 C5a, 즉, 본 발명의 핵산 분자를 갖는 복합체에는 존재하지 않는 C5a에 의해 자극되는 수용체를 자극할 수 없다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 분자에 의한 수용체 기능의 억제는, C5a에 의해 자극될 수는 있지만 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 C5a에 의한 수용체의 자극을 방지하는 것으로 인해 초래되는 각각의 수용체로부터 독립적이다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 억제 상수를 결정하는 가능성은, 본 발명에 따른 핵산 분자가 치료 요법에서 상기 핵산 분자의 사용을 허용하는 유리한 억제 상수를 나타낸다는 상기 결과를 확인하는 실시예 5에서 설명된 바와 같은 방법의 사용이다. 본 경우에서는 CGRP인 표적과 각각의 수용체와의 상호작용에 대한 각각의 핵산 분자의 억제 효과의 세기를 표현하기 위한 적절한 단위는 소위 반 최고치 억제 농도(IC50)이며, 이의 결정을 위한 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 핵산에 의해 도시된 IC50 값은 1 μm 이하이다. 약 1 μm 의 IC50 값은 표적 기능의 비 특이적 억제, 바람직하게 본 발명의 핵산 분자에 의해, 표적의 의한 표적 수용체의 활성의 억제에 대한 특성이라고 한다. 본 기술분야의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 분자의 다양한 실시형태와 같은 일군의 화합물의 IC50 값은 특정 범위 내에 있다. 전술한 약 1 μm 의 IC50은 IC50 값에 대한 바람직한 상한이다. 표적 결합 핵산 분자의 IC50에 대한 하한은 약 10 피코몰 정도일 수 있으며, 더 높을 수 있다. CGRP에 결합하는 각각의 핵산 분자의 IC50 값은 바람직하게 이 범위 내에 있다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직한 범위는 이 범위 내의 제 1 숫자 및 이 범위 내의 제 2 숫자를 선택함으로써 정의될 수 있다. 바람직한 IC50 상한값은 250 nM 및 100 nM이며, 바람직한 IC50 하한값은 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 10 pM이다. 더욱 바람직한 IC50 상한값은 5 nM이며, 더욱 바람직한 IC50 하한값은 100 pM이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 표적 분자에 여전히 결합될 수 있는 한 임의의 길이를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 핵산의 바람직한 길이가 있다는 것을 본 기술분야의 숙련자는 인식할 것이다. 일반적으로, 길이는 15와 120 뉴클레오티드 사이이다. 15와 120 사이의 임의의 정수는 본 발명에 따른 핵산에 대한 가능한 길이이다. 본 발명에 따른 핵산의 길이에 대한 더욱 바람직한 범위는 약 20 내지 100 뉴클레오티드, 약 20 내지 80 뉴클레오티드, 약 20 내지 60 뉴클레오티드, 약 38 내지 44 뉴클레오티드 및 약 40 뉴클레오티드의 길이이다.
핵산 분자는, 바람직하게 고분자량 모이어티(moiety) 및/또는 바람직하게, 그 중에서도, 동물의 몸, 바람직하게 인체에서의 체류 시간에 관해서 핵산 분자의 특성을 변형할 수 있도록 하는 모이어티를 포함한다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 변형의 특히 바람직한 실시형태는 본 발명에 따른 핵산 분자의 PEG화(PEGylation) 및 HES화(HESylation)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, PEG는 폴리(에틸렌글리콜) 및 HES는 히드록시에틸 전분을 의미한다. 본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, PEG화는 본 발명에 따른 핵산의 변형이며, 이러한 변형은 본 발명에 따른 핵산에 부착되는 PEG 모이어티로 구성된다. 본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, HES화는 본 발명에 따른 핵산의 변형이며, 이러한 변형은 본 발명에 따른 핵산에 부착되는 PEG 모이어티로 구성된다. 이들 변형뿐만 아니라 이러한 변형을 사용하여 핵산을 변형시키는 과정은 유럽 특허 출원 제 EP 1,306,382호에 개시되어 있으며, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
PEG가 이러한 고분자량의 모이어티인 경우, 분자량은 바람직하게는 약 20,000 내지 120,000 Da, 더욱 바람직하게는 약 30,000 내지 80,000 Da, 그리고 가장 바람직하게는 약 40,000 Da이다. HES가 이러한 고분자량의 모이어티인 경우, 분자량은 바람직하게는 약 50 내지 1,000 kDa, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 700 Da, 그리고 가장 바람직하게는 200 내지 500 kDa이다. HES는 0.1 내지 1.5, 더욱 바람직하게는 1 내지 1.5의 몰 치환을 나타내며, 대략 0.1 내지 1.5, 바람직하게는 대략 3 내지 10의 C2/C6 비로서 표현되는 치환 등급(substitution grade)을 나타낸다. HES 변형의 과정은 예를 들어, 독일 특허 출원 제 DE 1 2004 006 249.8호에 개시되어 있으며, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
변형은, 원칙적으로, 본 발명의 핵산 분자의 모든 위치에서 이루어질 수 있다. 바람직하게, 이러한 변형은 5'-말단 뉴클레오티드, 3'-말단 뉴클레오티드 및/또는 핵산 분자의 5' 뉴클레오티드와 3' 뉴클레오티드 사이의 모든 뉴클레오티드에 이루어진다.
변형 및 바람직하게는 PEG 및/또는 HES 모이어티는 직접 또는 간접적으로, 바람직하게는 링커를 통해 간접적으로 본 발명의 핵산 분자에 부착될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 하나 이상의 변형, 바람직하게는 하나 이상의 PEG 및/또는 HES 모이어티를 포함한다는 것이 또한 본 발명의 범주에 있다. 일 실시형태에서, 개개의 링커 분자는 본 발명에 따른 핵산 분자에 하나 이상의 PEG 모이어티 또는 HES 모이어티를 부착시킨다. 본 발명과 관련하여 사용된 링커는 그 자체가 선형 또는 분기일 수 있다. 이러한 종류의 링커는 본 기술분야의 숙련자에게 주지되어 있으며, 또한 특허 출원 제 WO2005/074993호 및 제 WO2003/035665호에 개시되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 링커는 생분해성 링커이다. 생분해성 링커는 본 발명에 따른 핵산으로부터의 변형의 방출로 인해, 그 중에서도, 동물의 몸, 바람직하게 인체에서의 체류 시간에 관해서 본 발명에 따른 핵산의 특성을 변형할 수 있도록 한다. 생분해성 링커의 사용은 본 발명에 따른 핵산의 체류 시간의 보다 나은 제어를 허용할 수 있다. 이러한 생분해성 링커의 바람직한 실시형태는 국제 특허 출원 제 WO2006/052790호, 제 WO2008/034122호, 제 WO2004/092191호 및 제 WO2005/099768호에 기재된 바와 같은 생분해성 링커이지만, 이에 제한되지는 않는다.
변형 또는 변형기는 생분해성 변형이며, 상기 생분해성 변형은 직접적 또는 간접적으로, 바람직하게는 링커를 통해 본 발명의 핵산 분자에 부착될 수 있다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 생분해성 변형은 본 발명에 따른 핵산 분자로부터의 변형의 방출 또는 분해로 인해, 그 중에서도, 동물의 몸, 바람직하게 인체에서의 체류 시간에 관해서 본 발명에 따른 핵산 분자의 특성을 변형할 수 있도록 한다. 생분해성 변형의 사용은 본 발명에 따른 핵산 분자의 체류 시간의 보다 나은 제어를 허용할 수 있다. 이러한 생분해성 변형의 바람직한 실시형태는 국제 특허 출원 제 WO2002/065963호, 제 WO2003/070823호, 제 WO2004/113394 호 및 제 WO2000/41647호, 바람직하게는 제 WO2000/41647호의 18페이지, 4 내지 24 라인에 기재된 바와 같은 생분해성이지만, 이에 제한되지는 않는다.
전술한 바와 같은 변형 이외에, 다른 변형이 본 발명에 따른 핵산 분자의 특성을 변형하기 위해 사용될 수 있으며, 이러한 다른 변형은 콜레스테롤과 같은 단백질, 지질 및 아밀라아제, 덱스트란 등과 같은 당 사슬로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
어떠한 이론에 의해 제한되기를 원하는 것은 아니나, 고분자 및 더욱 바람직하게는 본원에 기재된 하나 이상의 고분자와 같은, 바람직하게는 생리학적으로 허용 가능한, 고분자량의 모이어티를 사용하여 본 발명에 따른 핵산 분자를 변형함으로써, 본 발명의 변형된 핵산 분자가 투여되는 동물 또는 인간의 몸으로부터 본 발명의 변형된 핵산 분자의 배설 운동(excretion kinetic)이 변화된다. 보다 구체적으로, 본 발명의 이와 같이 변형된 핵산 분자의 증가된 분자량으로 인해 및 L 형태, 즉 L-핵산 분자일 때 특히 신진 대사에 적용되지 않는 본 발명의 핵산 분자로 인해, 동물의 몸으로부터, 바람직하게는 포유류의 몸, 그리고 더욱 바람직하게는 인체로부터의 배설이 감소한다. 일반적으로, 배설은 신장을 통해 발생하기 때문에, 본 발명자들은 이와 같이 변형된 핵산 분자의 사구체 여과 속도는, 동물의 몸에서의 변형된 핵산 분자의 체류 시간의 증가시키는 이러한 종류의 고분자량 변형을 갖지 않는 핵산 분자에 비해 상당히 감소된다고 가정한다. 이와 관련하여, 이러한 고분자량 변형에도 불구하고, 본 발명에 따른 핵산 분자의 특이성은 해로운 방식으로 영향 받지 않는다. 이러한 점에 있어서, 본 발명에 따른 핵산 분자는, 그 중에서도, 정상적으로는 약학적으로 활성인 화합물로부터 기대될 수 없는, 지속적 방출(sustained release)을 제공하는 약학적 제형이 본 발명에 따른 핵산 분자의 지속적 방출을 제공하기 위해 반드시 필요하지는 않다는 놀라운 특성을 갖는다. 오히려, 지속적 방출 제형으로부터 이미 방출된 것처럼, 그 변형으로 인해, 고분자량의 모이어티를 포함하는 그 변형된 형태에서 본 발명에 따른 핵산 분자는 그것이 작용할 때의 지속적 방출 제형처럼 사용될 수 있다. 이러한 점에 있어서, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 핵산 분자의 변형(들) 및 이와 같이 변형된 본 발명에 따른 핵산 분자 및 그를 포함하는 임의의 조성은 별개의, 바람직하게는 제어된 약물 동력학 및 이의 생물학적 분배를 제공할 수 있다. 또한, 이는 동물 및 인간의 몸의 순환에서의 체류 시간 및 이러한 동물 및 인간의 조직에 대한 분포를 포함한다. 이러한 변형은 또한 특허 출원 제 WO2003/035665호에 개시되어 있다.
그러나, 본 발명에 따른 핵산 분자는 임의의 변형 및 특히 PEG화 또는 HES화와 같은 고분자량 변형을 포함하지 않는다는 것이 본 발명의 범주에 있다. 이러한 실시형태는, 본 발명에 따른 핵산이 몸에 있는 모든 표적 기관 또는 조직에 대해 우선 분배를 보여주는 경우, 또는 몸에 대한 투여 후 몸으로부터 본 발명에 따른 핵산의 빠른 제거가 요구되는 경우에 특히 바람직하다. 몸에 있는 모든 표적 기관 또는 표적 조직에 대한 우선적 분배 프로필을 갖는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 핵산 분자는 핵산 분자의 전신에 영향을 주는 농도를 낮게 유지하면서 표적 조직에서의 효과적인 국부 농도의 확립을 허용할 것이다. 이는 경제적인 관점으로부터의 이익뿐만 아니라 핵산 분자에 대한 다른 조직의 불필요한 노출을 감소시킴으로써 부작용의 잠재적 위험을 감소시키는 낮은 투여량의 사용을 허용할 것이다. 특히, 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 그를 포함하는 약제를 사용하는 생체 내 이미징 또는 특정 치료 투약 요구 사항의 경우에, 투여 후 몸으로부터 본 발명에 따른 핵산 분자의 빠른 제거가 요구될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자 및/또는 본 발명에 따른 길항제는 약제의 생성 또는 제조에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 약제 또는 약학적 조성물은 적어도 하나의 본 발명의 핵산 분자와 함께 추가적 약학적 활성 화합물을 선택적으로 포함하며, 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게 약학적 활성 화합물 자체로서의 역할을 한다. 이러한 약제는 바람직한 실시형태에서 적어도 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이러한 담체는 예를 들어, 물, 완충액, PBS, 포도당 용액, 바람직하게는 5% 포도당, 염분 평형액, 전분, 당, 젤라틴 또는 다른 허용 가능한 담체 물질일 수 있다. 이러한 담체는 일반적으로 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 본 발명의 약제의 또는 본 발명의 약제와 관련된 모든 실시형태, 용도, 양태는 또한 본 발명의 약학적 조성에 적용 가능하며, 그 반대의 경우도 마찬가지라는 것을 본 기술분야의 숙련자는 인식할 것이다.
본 발명의 또는 본 발명에 따라 제조된 핵산, 약학적 조성물 및 약제에 의한 징후, 질환 및 질병에 대한 치료 및/또는 예방은 각각의 발병 기전에서의 C5a의 직접적 또는 간접적 관여에서 기인한다.
염증 부위에서의 C5a의 국소 방출은 강력한 전염증성 자극을 유발한다. 따라서, C5a의 중화는 일반적으로 면역 복합체 관련 질환(Heller et al., 1999); 예를 들어, 알츠하이머병에서의 신경퇴화 및 염증(Bonifati & Kishore, 2007)과 같은 많은 급성 또는 만성 질환에서 유리할 수 있으며, 보체 C5a 수용체 길항제인 PMX205는 거동 매개변수를 향상시키며 섬유성 침전과 활성화 교질세포와 같은 생리학적 마커의 감소를 개선한다(Fonseca et al. 2009). C5a가 관련된 다른 염증성 질환은 전신 홍반성 낭창(Jacob et al. 2010a; Jacob et al. 2010b), 천식(Kohl, 2001); 정신적 외상의 이차 손상(Yao et al. 1998); 패혈성 쇼크(Huber-Lang et al., 2001); 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS); 다기관 기능부전(multiorgan failure, MOF); 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS); 염증성 장 증후군 (inflammatory bowel syndrome, IBD)(Woodruff et al., 2003); 예를 들어, 전신 홍반성 낭창의 합병증(Manderson et al, 2004)과 같은 면역-복합체-매개 신장 질환(Wang, 2006); 전염병 및 이의 영향(예를 들어, 혈관 누출 또는 치주염 이후의 뼈 손실과 같은 뼈 손실(Breivik et al. 2011)); 중화상(Piccolo et al., 1999); 그 중에서도, 예를 들어, 이차 손상으로 이어지는 삼장, 뇌 또는 폐의 경색 이후의 지연 이식 기능(Lewis et al, 2008) 또는 섬유증 및/또는 장기의 재형성을 유발할 수 있는 심장, 비장, 방광, 췌장, 위, 폐, 간, 신장, 사지, 뇌, 골격근 또는 창자(Riley et al., 2000)와 같은 장기의 재관류 손상(Gueler et al. 2008; Khan et al. 2011; van der Pals et al. 2010; Zheng et al. 2008); 건선(Bergh et al., 1993); 심근염(myocarditis); 다발성 경화증(multiple sclerosis)(Muller-Ladner et al., 1996); 발작성 야간 혈색뇨증(PNH), 용혈, 혈전 색전증(Hillmern et al. 2007) 및 류마티스성 관절염(RA)(Woodruff et al., 2002), 예를 들어, 골관절염 또는 지연 치유를 유발하는 신장세포 암종의 절제 및 뼈 파괴를 촉진하는 용골세포의 활성화를 들 수 있다. 보체 C5a는 연령 관련 황반 변성의 결정강(drusen)에서 증가된 양으로 발견되었으며 증가된 VEGF-발현으로 이어지고, 시력 장애 및 상실로 이어질 수 있는 맥락관 혈관신생을 촉진하는 것으로 나타났다(Nozaki et al, 2006).
보체계의 활성화는 또한 생쥐 모델에서 뇌 말라리아로 발병되는 민감성을 높이는 것으로 나타났다. 이러한 분자로 면역력을 갖는 생쥐의 혈청을 이용하는 C5a 또는 C5a 수용체의 차단은 뇌 말라리아에 대한 내성을 부여했다. 따라서, C5-C5a 축의 차단은 말라리아, 특히 인간에서의 뇌 말라리아의 발병을 예방하는데 유리할 수 있다(Patel et al. 2008).
보체 관련 자가면역 염증성 질환이 최근에 검토되었다(Chen et al. 2010). 가능한 그리고 이미 연구되고 있는 보체 표적 치료에 대한 전문가 검토가 2011년 Molecular Medicine에 공개되었다(Ehrnthaller et al. 2011).
물론, 본 발명에 따른 C5a 결합 핵산이 인간 C5a와 상호작용을 하고 결합되기 때문에, 본 발명에 따른 C5a 결합 핵산이 본원에 개시된 인간 및 동물의 모든 질병, 치료 및/또는 진단을 위해 쉽게 사용될 수 있다는 것을 본 기술분야의 숙련자는 일반적으로 이해할 것이다. 이와 관련해서, 본 발명에 따른 핵산 분자는, 이러한 질환, 장애 및 질병의 기초를 이루고 있는 작용의 모드에 관계없이, 본원에 기재된 모든 질환, 장애 또는 질병의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있다는 것을 인정할 것이다.
이하에서, 그리고 어떠한 이론에 의해 제한되기를 원하지 않고, 다양한 질환, 장애 및 질병과 관련해서 본 발명에 따른 핵산 분자의 사용을 위한 근가가 제공되며, 따라서 본 발명에 따른 핵산 분자의 청구된 치료, 예방 및 진단 이용 가능성을 타당하게 한다. 불필요한 반복을 피하기 위해, C5a-C5a 수용체 축의 관여로 인해, 이와 관련하여 기술된 바와 같이, 상기 축은 청구된 치료, 예방 및 진단 효과가 달성되도록 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 해결될 수 있다는 것을 인정해야 한다. 또한, 환자의 질환, 장애 및 질병의 특이성 및 이와 관련하여 기술된 치료 요법의 세부 사항은 본 발명의 바람직한 실시형태의 대상이 될 수 있다는 것을 인정해야 한다.
골수 유래 억제(Myeloid-derived suppressor, MDS) 세포를 암환자에게서 30 년 이상 전에 최초로 관찰하였으며, 항종양 면역의 스포일러로서의 이들의 역할은 현재 평가 중이다. 분화의 중간 단계에 있는 정상적인 골수성 세포의 이종 개체균인 MDS 세포는 거의 모든 암 환자의 혈액, 림프절 및 종양 부위에서 축적된다. 건강한 개인에서, 이들 세포는 대식세포, 수지상 세포 및 호중구로 분화하지만, 종양은 면역 전구 세포의 분해를 방해하는 다양한 인자를 분비한다(Ostrand-Rosenberg, 2008). 건강한 생쥐의 말초 혈액 및 비장에서 분리된 MDS 세포에 대해 나타났듯이, MDS 세포는 이들의 성숙한 대응부인 과립성 백혈구 및 단핵 백혈구와 유사한 정도로(풍부한 발현) 이들의 표면에서 C5a 수용체를 발현한다. 또한 종양을 갖는 생쥐에서 MDS 세포는 C5a 수용체를 발현하지만, 발현량은 말초 혈액 및 비장에서의 MDS 세포에서보다 종양 관련 MDS 세포의 표면에서 낮다. 그 이유는, Markiewski 등이 보여준 바와 같이 C5a 수용체가 종양 관련 세포에서 내부화되고, C5a 수용체 길항제가 MDS 세포의 표면에서 C5a 수용체의 기능을 차단할 수 있고 이는 손상된 종양 성장으로 이어지기 때문이다(Markiewski et al. 2008). C5a는 또한 자연 살해(natural killer, NK) 세포 기능의 억제제 역할을 함으로써, 특정 면역 질환을 갖는 환자에서 종양 감시 및 NK 기능 장애에 대한 보체의 부정적인 영향에 대한 설명을 제공한다(Li et al. 2012; Min et al. 2012).
따라서, 치료 및/또는 예방을 위해 본 발명에 따른 약제가 사용될 수 있는 질환 및/또는 장애 및/또는 질병은, 이에 제한되지 않으나, 종양 관련 질환 및/또는 장애 및/또는 질병을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 종양은 세포의 비정상적인 성장에 의해 형성되는(신생되는) 부종 또는 병변에 대한 이름이다. 종양은 양성, 악성 이전 또는 악성 종양일 수 있다. 또한, 종양은 고형 종양, 바람직하게는 암종, 육종, 골종, 섬유육종 및 연골종일 수 있다.
특히 본 발명에 따른 약제 또는 핵산 분자에 의해 치료될 수 있는 종양은 바람직하게 내분비계, 눈, 위장관, 생식계, 조혈계(혼합 및 초기 종양을 포함함), 유선, 신경계, 호흡기계, 골격, 피부, 연조직, 비뇨기계의 종양으로 이루어진 군에서 선택되는 종양이다.
바람직하게, 이들 종양은 유방암, 난소 암종, 전립선 암종, 골육종, 교아세포종, 흑색종, 폐소세포암종 및 직장 결장 암종으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 핵산을 각각 포함하는 약제 및 약학적 조성물은 어떠한 방식으로든지 치료를 위해 사용될 수 있다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다.
또 다른 실시형태에서, 약제는 종양의 치료를 위한 추가적인 약학적 활성제를 포함한다. 이러한 추가적인 약학적 활성 화합물은, 그 중에서도, 알킬화제, 항대사물질, 항혈관형성제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제, 세포내 신호전달, 호르몬, 항체, 면역 결합체 및 융합 단백질 억제제와 같은 항종양성 활성 물질로 알려진 것들이지만, 이에 제한되지 않는다.
그 밖의 약학적 활성 화합물은, 그 중에서도, 블레오마이신(Bleomycin) 랄티트렉시드(Raltitrexed) 및 페메트렉시드(Pemetrexed)와 같은 티미딜산 합성효소(thymidylate synthase)의 억제제, L-아스파라기나아제, 밀테포신(Miltefosine) 및 아나그렐리드(ANAgrelid)와 같은 효소, 볼테주입(Bortezomib)과 같은 프로테아좀 억제제로 알려진 것들이지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 약제는 만성 폐색성 폐질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 폐로부터의 공기흐름의 지속적인 차단에 의해 특징지어지는 폐질환이다. 이는 정상적인 호흡을 방해하는, 진단이 잘 되지 않고 생명을 위협하는 폐질환이며 완전히 회복되지 않는다. COPD는 몇 가지 폐질환을 포함한다: 가장 흔한 것은 만성 기관지염과 폐기종이다. COPD를 갖고 있는 많은 사람들은 이러한 질환 모두를 갖는다. 폐기종은 기도의 끝의 기낭(air sac)에서의 손상이며, 에서 몸이 필요로 하는 산소를 흡수하기 어렵게 한다. 만성 기관지염을 앓는 동안, 기도는 자극되고, 충혈되며, 너무 많은 끈적거리는 점액을 형성한다. 기도의 벽은 부어 오르고 공기가 통과하는 것을 부분적으로 막는다.
호중구는 C5a 구배를 향해 끌려가고, 초과산화 라디칼을 방출하여 병원균을 죽이며, 베타-글로쿠로니다아제를 방출하여 염증 부위에서 복잡한 글루쿠로니드 결합체를 가수분해한다. 그러나, 이러한 소중한 방어 기전은, 호중구가 무병균 감염 부위, 예를 들어, 뇌경색, 뇌졸중 또는 장기 이식 이후 또는 자가면역 질환, 알츠하이머병 및 아래에서 나열하는 다른 질환의 경우, 재관류된 부위로 동원될 때 신체에 손상을 입힐 수 있다.
결과적으로, 과도하게 높은 C5a 농도(특히 패혈증 동안 나타날 때 국소적으로만 상승하지 않는 경우)는 호중구의 전신적 활성화(이는 장기 손상으로 이어짐)로 이어지고, 이후 호중구 세포 표면 상에서 감소된 C5a 발현에 의해 고갈되고 비활성화된다. 이는 환자를 이의 몸에서 지속되는 병원균에 대해 더욱 취약하게 한다(Huber-Lang et al. 2002).
C5a-결합 핵산은 또한 이의 수용체(CD88)에 대한 C5a-매개 효과에 대해 억제적이며 따라서 C5a 신호전달의 상기한 결과를 차단하는 가능성을 가지고 있으며, 변형된 C5a 신호전달과 관련된 다수의 질환 및 질병에서 약제의 일부로서 유리함을 입증할 수 있다. 이러한 질병의 하나는 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis)이다. 패혈증에서 C5a 신호전달의 유해한 역할에 대한 증거를 수집한 많은 문헌이 있다(Ward 2010b). 본 발명에 따른 핵산은 맹장 결찰과 천자(cecal ligation and puncture, CLP) 연구에서 생쥐의 생존과 장기 기능 매개변수를 향상시키는 것으로 확인되었다. CLP는 다균성 패혈증에 대하 잘 확립된 설치류 모델이다. 최근에 맹장 결찰과 천자에 의해 유도된 패혈증에서 보체 C5의 역할을 야생형 및 C5 결핍 생쥐에서 알아보았다(Flierl et al. 2008). C5-/- 생쥐는 WT 생쥐에 비해 생존 이득을 갖지 못했으며 WT 생쥐와 비교할 때 400 배 증가된 혈액 매개 세균을 보였다. 이러한 효과는 C5 (-/-)가 말단 막 공격 복합체(MAC)를 조립하지 못하는 능력과 관련된다. 작가는, 패혈증 동안, C5a 차단이 MAC 형성을 가능하게 하면서 C5a의 역효과는 방지하기 때문에 C5a 또는 이의 수용체(C5 대신에)의 선택적 차단이 더욱 유망한 전략인 것으로 보인다고 판단을 내린다. 그에 따라서, C5a 수용체인 CD88 및 C5L2의 유전 삭제인 CD88의 약학 차단 또는 C5a의 약학 중화는 맹장 결찰과 천자(CLP) 유도 패혈증에서 방어적인 것으로 나타났다(Czermak et al. 1999; Rittirsch et al. 2008). 인간의 전혈을 이용한 수막염균 패혈증의 체외 모델에서의 전역은 선택적 C5a 억제(C5 분열의 차단과는 대조적으로)는 세균 제거를 포함하지 않고 잠재적으로 유해한 백혈구 활성화를 방지하는 것을 보여준다(Sprong et al. 2003). C5a의 억제는 전신 염증, 응고 및 다른 발병 기전을 제한함으로써 실험적 패혈증에서 다기관 기능부전을 방지한다(Huber-Lang et al. 2001; Huber-Lang et al. 2002; Laudes et al. 2002; Rittirsch et al. 2008; Ward 2010a). 본 발명에 따른 핵산은, C5에 결합해도, MAC 형성에 필요한 C5a 및 C5b로의 C5의 분열을 차단하지 않는다. 반대로, 본 발명의 핵산은 단백질 C5를 차지함으로써 말단의 혈장 반감기를 증가시키고, 예를 들어, C5 전환효소에 의해 유리되면 C5a의 활성을 선택적으로 차단한다. 패혈증 모델에서, 본 발명에 따른 핵산은 염증을 제한하고, 다기관 기능부전 및 부종 생성을 방지하며, 생존율을 향상시키는 것으로 나타났다.
패혈증 환자는 흔히 급성 폐손상(acute lung injury, ALI) 및 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS)으로 인해 기계적 환기를 필요로 한다. ALI/ARDS는 또한 폐렴에서 병원외 또는 병원내 감염으로 인한 폐의 직접적 감염으로 발병될 수 있다. ALI/ARDS에서 C5a의 병원성 역할에 대한 많은 증거가 있다. C5a 유도 조직 인자 발현은 ALI/ARDS 환자의 폐포에서 섬유소 침착의 원인이 된다(Kambas et al. 2008). 실험적 ALI는 C5-/- 생쥐에서 약화되며 C5a-중화 또는 폐에서의 C4aR의 침묵은 염증성 반응을 억제하고 혈관 누출을 방지한다(Bosmann & Ward 2012).
또한, 치료 및/또는 예방을 위해 본 발명에 따른 약제가 사용될 수 있는 질환 및/또는 장애 및/또는 질병은, 이에 제한되지 않으나, 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis, AS), 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 건선, 원형 탈모증, 온난 및 한랭 자가면역 용혈 빈혈(autoimmune hemolytic anemia, AIHA), 이형 용혈성 요독증, 악성 빈혈, 급성 염증성 질환, 자가면역 부신염, 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, CIDP), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 코간 증후군(Cogan syndrome), 크레스트 증후군(CREST syndrome CREST syndrome), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris) 및 낙엽성 천포창(pemphigus foliaceus), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatic), 다발성근염(polymyositis), 원발성 담즙 간경변(primary biliary cirrhosis), 췌장염, 복막염, 건선성 관절염, 류마티스성 열, 유육종증(sarcoidosis), 조겐센 증후군(Sjorgensen syndrome), 경피증(scleroderma), 소아 지방변증(celiac disease), 근육강직 증후군(stiff-man syndrome), 타카야수 동맥염(Takayasu arteritis), 일과성 글루텐 불내성(transient gluten intolerance), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 백반증(vitiligo), 다발연골염(polychondritis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis, DH) 또는 듀링병(Duhring's disease), 섬유근육통(fibromyalgia), 굿파스쳐 증후군(Goodpasture syndrome), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto thyroiditis), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(colitis ulcerosa), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 면역 복합체 질환, 사구체신염(glomerulonephritis), 결절성 다발성동맥염(polyarteritis nodosa), 항인지질항체 증후군(anti-phospholipid syndrome), 자가면역 다분비선 증후군(polyglandular autoimmune syndrome), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP), 두드러기, 자가면역 불임증(autoimmune infertility), 소아 류마티스성 관절염, 유육종증, 자가면역 심근증, 람버트-이튼 증후군(Lambert-Eaton syndrome), 경화 태선(lichen sclerosis), 라임병(Lyme disease), 그레이브스병(Graves disease), 베체트병(Behcet's disease), 메니에르 증후군(Meniere's disease), 반응성 관절염(reactive arthritis, 라이터 증후군(Reiter's syndrome))과 같은 자가면역 질환; HIV, HBV, HCV, CMV와 같은 바이러스 또는 레슈마니아(Leishmania), 리케차(Rickettsia), 클라미디아(Chlamydia), 콕시엘라(Coxiella), 플라스모디움(Plasmodium), 브루셀라(Brucella), 마이코박테리아(mycobacteria), 리스테리아(Listeria), 톡스플라즈마(Toxoplasma) 및 트리파노소마(Trypanosoma)와 같은 세포내 기생충에 의한 감염; 정신적 외상의 이차 손상; 국소 염증, 쇼크, 과민성 쇼크, 화상, 패혈성 쇼크, 출혈 쇼크, 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다기관 기능부전(multiorgan failure, MOF), 천식 및 알레르기, 측두 동맥염(arteritis temporalis), 혈관염, 혈관 누출 및 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)과 같은 맥관염; 중추 신경계의 급성 장해, 심근염(myocarditis), 피부근염(dermatomyositis), 치은염(gingivitis), 급성 호흡 부전, 만성 폐쇄성 폐질환, 뇌졸중, 심근 경색, 재관류 손상, 신경인지적 기능장애(neurocognitive dysfunction), 화상, 포도막염과 같은 눈의 염증성 질환, 연령 관련 황반 변성(age-related macular degeneration, AMD), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy, DR), 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema, DME), 안구 유천포창(ocular pemphigoid), 각결막염(keratoconjunctivitis), 스티븐-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome), 및 그레이브스 안병증(Graves ophthalmopathy), 전신 질환의 국소 증상, 맥관구조의 염증성 질환, 중추 신경계의 급성 장해, 1형 및 2형 당뇨병, 당뇨병의 증상, SLE, 및 눈, 뇌, 맥관구조, 심장, 폐, 신장, 간, 위장관, 비장, 피부, 뼈, 림프계, 혈액 또는 다른 기관계의 류마티스성 질환, 관상 동맥 우회로 이식술(coronary artery bypass graft, CABG), 심폐기 비가동 관상 동맥 우회로 이식술(off-pump coronary artery bypass graft, OPCABG), 최소 침습성 관상 동맥 우회로 이식술(minimally invasive direct coronary artery bypass graft, MIDCAB), 경피적 경혈관적 관상 동맥 형성술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA), 혈전용해(thrombolysis), 장기 이식, 및 혈관 클램핑 수술의 예방 및/또는 지지 및/또는 수술후 치료; 간, 신장, 장, 폐, 심장, 피부, 사지, 각막, 랑게르한스 섬, 골수, 혈관 및 췌장과 같은 이식된 장기 또는 이식될 장기의 장기 손상의 예방 또는 이식된 장기의 이식 거부의 치료; 태아 거부(fetal rejection)를 포함한다.
치료 및/또는 예방을 위해 핵산이 사용될 수 있는 다양한 질환 및 장애는 다음과 같이 그룹화될 수 있다:
1. 자가면역/염증성 질환
1.1 알레르기, 패혈성 쇼크, 정신적 외상의 이차 손상, 온난 및 한랭 자가면역 용혈 빈혈(AIHA), 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 출혈성 쇼크, 1형 당뇨병, 2 형 당뇨병, 당뇨병의 증상, 미만성 경피증(diffuse scleroderma), 치주염 및 이와 관련된 뼈 손실, 다발연골염, 자가면역 다분비선 증후군, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE) 및 이의 증상, 반응성 관절염(라이터 증후군으로도 알려짐)을 포함하는 전신 자가면역 및/또는 염증성 질환.
1.2 크론병, 궤양성 대장염, 소아 지방변증, 일과성 글루텐 불내성, 염증성 장 질환(IBD), 췌장염, 위장 알레르기성 과민반응, 괴사성 장염(necrotizing enterocolitis)을 포함하는 위장관의 자가면역 및/또는 염증성 질환.
1-3. 건선, 두드러기, 피부근염, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성 유천포창, 제한성/선상 경피증, 백반증, 포진성 피부염(DH), 듀링병, 경화 태선을 포함하는 피부의 자가면역 및/또는 염증성 질환.
1.4 맥관염(바람직하게는 측두 동맥염), 혈관염, 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch Schonlein purpura), 항호중성 세포질 항체(anti-neutrophil cytoplasmic antibody, ANCA) 관련 혈관염, 혈관 누출, 류마티스성 다발성근육통, 아테롬성 동맥경화증, 처그-스트라우스 증후군, 타카야수 동맥염, 굿파스쳐 증후군(항사구체 기저막 항체질환; 대부분 신장 사구체 및 폐에 영향을 미침), 사구체신염, 결절성 다발성동맥염, 베체트병을 포함하는 맥관구조의 자가면역 및/또는 염증성 질환.
다발성 경화증(MS), 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증(CIDP), 신경인지적 기능장애, 근육강직 증후군, 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 람버트-이튼 증후군, 시신경 척수염(데빅 증후군(Devic syndrome))을 포함하는 신경계의 자가면역 및/또는 염증성 질환.
류마티스성 관절염, 눈, 뇌, 폐, 신장, 심장, 간, 위장관, 비장, 피부, 뼈, 림프계, 혈액 또는 다른 기관계의 류마티스성 질환, 강직성 척추염(AS), 유육종증, 치주염 및 관련된 뼈 손실, 류마티스성 다발성근육통, 다발성근염, 건선성 관절염, 류마티스성 열, 다발연골염, 섬유근육통, 소아 류마티스성 관절염, 라임병, 반응성 관절염(라이터 증후군으로도 알려짐)을 포함하는 근골격계 자가면역 및/또는 염증성 질환.
그 밖의 자가면역 및/또는 염증성 질환은 코간 증후군, 자가면역 부신염, 면역 복합체 질환, 메니에르 증후군, 국소 염증, 원형 탈모증, 급성 염증성 질환, 원발성 담즙 간경변, 조겐센 증후군, 경피증, 미만성 경피증, 크레스트 증후군, 제한성/선상 경피증, 자가면역 포도막염, 하시모토 갑상선염(자가면역 갑상선 질환), 그레이브스병, 자가면역 간염, 비알콜성 지방간염, 사구체신염, 복막염, 항인지질항체 증후군, 특발성 폐섬유증, 신장 섬유증, 간 섬유증, 자가면역 불임증, 태아 거부 또는 유산 및 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)포함한다.
2. 포도막염, 결막염, 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병성 망막증(DR), 당뇨병성 황반 부종(DME), 망막 정맥 폐쇄, 녹내장, 백내장, 자가면역 망막 및 안구내 염증성 질환, 안구 유천포창, 각결막염, 스티븐-존슨 증후군, 및 그레이브스 안병증을 포함하는 안 질환.
3. 뇌졸중, 심근 경색, 재관류 손상, 이식후 혈전성 미소혈관증 또는 간(Arumugam et al. 2004), 신장(Arumugam et al. 2003), 장, 허파, 심장, 피부, 사지, 각막, 랑게르한스 섬(Tokodai et al. 2010), 골수, 혈관 및 췌장과 같은 이식된 장기의 장기 손, 장기 또는 골수 이식 후의 신장 손상을 포함하는 재관류 손상 및 이식 거부.
4. 간, 신장, 장, 폐, 심장, 피부, 사지, 각막, 랑게르한스 섬, 골수, 혈관 및 췌장과 같은 이식된 장기의 이식 거부를 포함하는 이식 거부 방지
5. 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심근 경색, 뇌졸중, 폐 동맥 고혈압 (pulmonary arterial hypertension, PAH), 복부 대동맥류, 맥관구조의 염증성 질환, 맥관염, 바람직하게는 측두 동맥염, 혈관염, 혈관 누출, 당뇨병의 증상, 전자간증(pre-eclempsia), 자가면역 심근증, 정맥 호스트 질환, 부정맥 우심실 이형성증/심근증, 관상 동맥 우회로 이식술(CABG)의 예방 및/또는 지지 및/또는 수술후 치료를 포함하는 심혈관계 질환.
6. 인슐린 저항, 포도당 불내성, 지방 염증, 및 식이성 비만에서의 심혈관계 기능장애를 포함하는 대사성 기능장애.
7. 천식, 급성 호흡 부전, 급성 폐손상, 수혈관련 폐손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 만성 폐색성 폐질환, 인공호흡기 유도 폐손상, 폐렴 및 이의 합병증을 포함하는 호흡기 질환.
8. 눈의 염증성 질환, 자가면역 포도막염(Copland et al. 2010), 결막염, 전신 질환의 국소 증상을 포함하는 염증성 질환.
9. 정신적 외상 및 골절의 이차 손상, 쇼크, 화상, 과민성 쇼크, 출혈성 쇼크, 다기관 기능부전(MOF), 중추 신경계의 급성 장해, 장기 또는 섬 이식 후와 같은 활성화된 응고 체계에 의한 C5a 과잉 생성으로 인한 급성 손상을 포함하는 급성 반응.
10. 통증, 급성 통증, 만성 통증, 신경병성 통증, 모르핀 내성 및 금단 유도 통각 과민증.
11. 신경장해, 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 알츠하이머병 및 파킨슨병(Farkas et al. 1998)을 포함하는 신경 및 신경퇴행성 장애.
12. 다음을 포함하는 전염병:
12.1 세균 감염, 바람직하게는 수막염, 라임병, 반응성 관절염(라이터 증후군으로도 알려짐), 요로 및 신장 감염, 전신 저관류, 산성증, 성인 호흡 곤란 증후군, 세포내 병원균에 의한 감염(Klos et al. 2009);
12.2 바이러스 감염, 바람직하게는 HIV, HBV, HCV, CMV, 바이러스성 수막염;
12.3 세포내 기생충, 바람직하게는 레슈마니아, 리케차, 클라미디아, 콕시엘라, 플라스모디움, 특히 뇌 말라리아, 브루셀라, 마이코박테리아, 리스테리아, 톡스플라즈마 및 트리파노소마.
13. 응고 및 피브린 분해 시스템의 활성화와 관련된 질환, 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation, DIC) 및/또는 혈전증, 악성 빈혈, 온난 및 한랭 자가면역 용혈 빈혈AIHA), 항인지질항체 증후군 및 이와 관련된 합병증, 정맥 및 동맥 혈전증, 재발성 유산 및 태아 사망 임신 합병증, 전자간증, 태반 기능부전, 태반 생장 제한, 자궁 리모델링 및 조산과 같은 임신 합병증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 이형 용혈성 요독 증후군(aHUS), 발작성 야간 혈색뇨증(PNH), 및 알레르기 수혈 반응을 포함하는 혈액 질환.
14. 혈액투석, 성분헌혈, 관절염의 점성보충, 심폐 바이패스, 보철 혈관 이식 및 심혈관 장치의 사용을 포함하는, 수술시 발생하는 생체재료에 의한 보체 활성화 및 응고 캐스케이드와 관련된 임상 합병증.
본 발명의 핵산은 또한 환자의 면역 체계의 유해 효과를 피하기 위해 수술중에, 더욱 바람직하게는 관상 동맥 우회로 이식술(CABG), 심폐기 비가동 관상 동맥 우회로 이식술(OPCABG), 최소 침습성 관상 동맥 우회로 이식술(MIDCAB), 경피적 경혈관적 관상 동맥 형성술(PTCA), 혈전용해, 장기 이식, 뇌 및 척수 수술, 재건 수술, 및 혈관 클램핑 수술의 예방 및/또는 지지 및/또는 수술후 치료를 위해, 혈관 누출 및/또는 폐기종과 같은 인공 호흡기 유도 폐질환 또는 이차 손상을 방지하기 위해 인공 환기 또는 환기 보조로 치료하는 동안, 간, 신장, 장, 폐, 심장, 피부, 사지, 각막, 랑게르한스 섬, 골수, 혈관 및 췌장과 같은 이식된 장기 또는 이식될 장기의 장기 손상의 예방 또는 이식된 장기의 이식 거부 및 재관류 손상의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산을 각각 포함하는 약제 및 약학적 조성물은 치료를 위해 어떠한 방식으로도 사용될 수 있다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다.
또 다른 실시형태에서, 약제는 추가적인 약학적 활성제를 포함한다. 이러한 추가적인 약학적 활성 화합물은, 그 중에서도, 칼시네우린(calcineurin) 저해제, 시클로스포린 A(cyclosporin A), 메토트렉사트(methotrexate), 아자티오프린(azathioprine), 타크로리무스(tacrolimus), 라파마이신(rapamycin), 클로람부실(chlorambucil), 레플루노마이드(leflunomide), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 브레퀴나르(brequinar), 미조리빈(mizoribin), 탈리도마이드(thalidomide), 또는 데옥시스페르구알린(deoxyspergualin)과 같은 면역 체계를 억제하는 것으로 알려진 것들이지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 추가적인 약학적 활성 화합물은 또한, 또 다른 실시형태에서, 메클로진(meclozin) 클레마스틴(lemastine), 디메틴덴(imetindene) 바미핀(bamipine), 케토티펜(ketotifen), 세티리진(cetirizine), 레보세티리진(levocetirizine), 데스로라타딘(desloratadine), 아젤라스틴(azelastine), 미졸라스틴(mizolastine), 레보카바스틴(levocabastine), 테르페나딘(terfenadine), 펙소페나딘(fexofenadine), 또는 에바스틴(ebastine)과 같은 히스타민 생성을 감소시키는 화합물 중 하나 일 수 있다. 이러한 화합물은 또한 스테로이드일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게 프레드니손(prednisone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 히드로코르티손(hydrocortisone), 덱사메타손(dexamethasone), 트리암시놀론(triamcinolone), 베타메타손(betamethasone), 발포정, 또는 부데소니드(budesonide)로 이루어진 군에서 선택된다. 또한, 이러한 화합물은 아미노글리코사이드(aminoglycosides), β-락탐(β-lactam) 항생제, 자이라아제(gyrase) 억제제, 글리코펩타이드 항생제, 린코사미드(lincosamide), 마크로라이드(macrolide) 항생제, 니트로이미다졸 유도체, 폴리펩타이드 항생제, 설폰아미드(sulfonamide), 트리메소프림(trimethoprim) 및 테트라시클린(tetracycline)과 같은 하나 이상의 항생제일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 베바시주맙(bevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab), IL-10, 에를리주밥(erlizumab), 톨레르맙(tolermab), 리툭시맙(rituximab), 고밀릭시맙(gomiliximab), 바실릭시맙(basiliximab), 다실주맙(daclizumab), 휴맥스-TAC(HuMax-TAC), 비실리주맙(visilizumab), 휴맥스CD4, 클레놀릭시맙(clenoliximab), MAX 16H5, TNX 100, 토랄리주맙(toralizumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), CY 1788, 갈릭시맙(galiximab), 펙셀리주맙(pexelizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), PMX-53, ETI 104, FG 3019, 베르틸리무맙(bertilimumab), 249417 (항인자 IX) 압식시맙(abciximab), YM 337, 오말리주맙(omalizumab), 탈리주맙(talizumab), 폰톨리주맙(fontolizumab), J695 (항-IL12), HuMaxIL-15, 메폴리주맙(mepolizumab, 엘실리모맙(elsilimomab), HuDREG, 아나킨라(anakinra), Xoma-052, 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 세르톨리주맙(certolizumab), 아펠리모맙(afelimomab), CytoFab, AME 527, 바팔릭시맙(Vapaliximab), 베바시주맙(bevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 비탁신(vitaxin), 벨리무맙(belimumab), MLN 1202, 볼로식시맙(volociximab), F200 (항-α5β1), 에팔리주맙(efalizumab), m60.11 (항.CD11b), 에타네르셉트(etanercept), 오네르셉트(onercept), 릴로나셉트(rilonacept), 아바타셉트(abatacept), 나탈리주맙(natalizumab), 또는 시플리주맙(siplizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 우스테키누맙(ustekinumab), ABT-874와 같이 더욱 구체적인 항염증성 또는 항혈관신생 생물제제가 함께 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 추가적인 약학적 활성제는, 케모카인(chemokine) 작용제 또는 길항제 또는 케모카인 수용체 작용제 또는 길항제일 수 있는 그 밖의 다른 케모카인의 활성의 조절제일 수 있으며, 상기 케모카인은 또한 화학주성 지질일 수 있다. 일 예는 S1P 수용체 조절제인 핀골리모드(fingolimod)이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 추가적인 약학적 활성제는 본 발명에 따른 추가적인 핵산이다. 대안적으로, 상기 약제는, C5a와는 다른 표적 분자에 결합하거나 본 발명에 따른 핵산과는 다른 기능을 보이는, 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
일반적으로, C5a 길항제는 다른 전염증성 분자 또는 이들의 수용체의 억제제와 결합될 수 있다. C5a 길항제와 함께 작용이 약화될 수 있는 전염증성 분자의 예는 IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-23, TNF, α4β7, α5β1, BlyS, 카드헤린(cadherin), CCR2, CD11a, CD11b, CD125, CD130, CD16, CD18, CD2, CD20,CD22, CD23, CD25, CD28, CD3, CD30, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45R, CD54, CD62E, CD62L, CD68, CD8, CD80, CD86, CD95, CEP, 가스트린-R, C1, C1-에스테라제, C5, 인자 D, MBL, 보체 수용체 1, CRTH2-수용체, CTGF, E- 및 P-셀렉틴, 에오탁신(eotaxin), 인자 IX, FGF-20, Fgl-2, GM-CSF, GP IIb/IIIa 수용체, HMG1, ICAM-1, IgE, 흉선세포(thymocyte), IFNγ, IFNr, IP-10, MCP-1, M-CSF 수용체, MIF, MMP9, PDGF-D, SDF-1, TGFβ1, 조직 인자, 티로신 키나아제 수용체, VAP-1, VCAM-1, VEGF, VLA1, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 스핑고신 1-인산(sphingosine 1 phosphate), 세라마이드 1 인산(ceramide-1 phosphate), 및 예를 들어, 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid)의 억제제와 같은 미토겐(mitogen)의 억제제이다.
마지막으로, 상기 추가적인 약학적 활성제는, 케모카인 작용제 또는 길항제 또는 케모카인 수용체 작용제 또는 길항제일 수 있는 그 밖의 다른 케모카인의 활성의 조절제일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 추가적인 약학적 활성제는 본 발명에 따른 추가적인 핵산이다. 대안적으로, 상기 약제는, C5a와는 다른 표적 분자에 결합하거나 본 발명에 따른 핵산과는 다른 기능을 보이는, 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
본 발명의 약제는, 원칙적으로, 상기 질환 치료를 위한 약제의 사용과 관련되어 개시된 질환 중 어느 하나를 예방하기 위해 대안적으로 또는 추가적으로 사용된다는 것이 본 발명의 범주 내에 있다. 따라서, 각각의 질환에 대한 각각의 마커는 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 바람직하게 각각의 마커는 C5a이다.
본 발명의 약제의 일 실시형태에서, 이러한 약제는 본원에 개시된 질환 중 어느 하나를 위한 다른 치료, 특히 본 발명의 약제가 사용될 치료와 관련하여 사용하기 위한 것이다.
"병용 요법"(또는 "공동 요법")은 본 발명의 약제 및 적어도 제 2 약제의 투여를 포함하며, 상기 제 2 약제는 이들 치료제, 즉, 본 발명의 약제 및 상기 제 2 약제의 공동 작용으로부터의 유리한 효과를 제공하도록 의도된 특정 치료 요법의 일부이다. 상기 조합의 바람직한 효과는 치료제의 조합으로 인한 약동학적 또는 약역학적 공동 작용을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 치료제의 병용 투여는 일반적으로 정의된 시간 기간(선택된 병용에 따라 보통 분, 시간, 일 또는 주)에 걸쳐 수행된다.
"병용 요법"은, 부수적으로 그리고 임의로 본 발명의 조합을 유발하는 별도의 단일 치료 요법의 일부로서, 이들 치료제 중 2 개 이상의 투여를 포함하는 것으로 의도되지만, 일반적으로는 포함하지 않는다. "병용 요법"은 이들 치료제의 투여를 순차적으로 즉, 각각의 치료제가 상이한 시간에 투여될 뿐만 아니라, 이들 치료제 또는 적어도 2개의 치료제가 실질적으로 동시에 투여되도록 의도된다. 실질적으로 동시 투여는 예를 들어, 각 치료제의 고정 비율을 갖는 단일 캡슐 또는 각각의 치료제에 대한 복수의 단일 캡슐을 대상에 투여함으로써 달성될 수 있다.
각 치료제의 순차적 또는 실질적 동시 투여는 국소 경로, 구강 경로, 정맥 경로, 근육 내 경로 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하여 적절한 경로에 의해 수행될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 치료제는 동일한 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합의 제 1 치료제는 주사로 투여되고 조합의 다른 치료제는 국소적으로 투여될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 모든 치료제는 국소적으로 투여될 수 있으며, 또는 모든 치료제는 주사에 의해 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 순서는 달리 명시하지 않는 한 제한적으로 중요하지 않다. 또한, "병용 요법"은 다른 생리학적 유효 성분과의 추가 조합으로 전술한 바와 같은 치료제의 투여를 수용할 수 있다. 병용 요법이 비-약물 치료를 더 포함하는 경우, 치료제의 병용과 비 약물 치료의 공동 작용으로부터의 바람직한 효과가 달성되는 한, 상기 비-약물 치료는 임의의 적절한 시점에 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 경우에, 비-약물 치료가 일시적으로 치료제의 투여에서 제거될 때, 아마도 몇 일 또는 몇 주까지 바람직한 효과는 여전히 달성된다.
위에서 일반적인 용어로 설명된 바와 같이, 본 발명에 따른 약제는 원칙적으로, 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 모든 형태로 투여될 수 있다. 투여의 바람직한 경로는 바람직하게는 주사에 의해, 더욱 바람직하게는 비경구 투여에 의한 전신 투여이다. 대안적으로, 약제는 국부적으로 투여될 수 있다. 투여의 다른 경로로는 효능을 보장하면서, 최소의 침습인 투여 경로로 주어지는 선호도에 따라 근육 내, 복강 내, 피하, 입을 통한, 비강 내, 기관 내, 또는 폐 경로를 포함한다.
비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육 또는 정맥 주사 및 주입에 사용된다. 또한, 비경구 투여를 위한 한 가지 방법은, 본 기술분야의 숙련자에 주지된, 일정 레벨의 복용량이 유지되는 것을 보장하는, 서방성 또는 지속적 방출 시스템을 사용한다.
또한, 본 발명의 바람직한 약제는 본 기술분야의 숙련자에게 주지된 경피 피부 패치의 형태를 사용하여 적합한 비강내 비히클, 흡입제의 국소 사용을 통해, 또는 경피 경로를 통해 비강내 형태로 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여되기 위해, 복용량 투여는 물론 투여 요법 내내 간헐적이기보다는 연속적일 것이다. 다른 바람직한 국소 제형은 크림, 연고, 로션, 에어로졸, 스프레이 및 겔을 포함하며, 유효 성분의 농도는 일반적으로 0.01% to 15%, w/w 또는 w/v의 범위일 수 있다.
본 발명의 약제는 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 매체에 용해 또는 분산된 본 발명의 핵산 분자를 포함하여 치료의 유효 성분(들)의 효과적인 양을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 약학적으로 허용 가능한 매체 또는 담체는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매체 및 제형의 사용은 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 보조 유효 성분이 본 발명의 약제에 또한 통합될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 약학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학적 조성물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 핵산 분자 및 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 비히클을 포함한다. 이러한 비히클은 본 기술 분야에서 사용되는 및/또는 공지된 임의의 비히클 또는 바인더일 수 있다. 보다 구체적으로, 이러한 바인더 또는 비히클은 본원에 개시된 약제의 제조와 관련하여 논의된 바와 같은 임의의 바인더 또는 비히클이다. 다른 실시형태에서, 약학적 조성물은 추가적인 약학적 활성제를 포함한다.
본 발명의 약제 및 약학적 조성물의 제조는 본 개시 내용을 고려하면 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 액체 용액이나 현탁액과 같은 주사용; 주입 전에 액체에서 용액 또는 현탁액으로 하기에 적합한 고체 형태; 경구 투여를 위한 정제 또는 다른 고체; 시간 제한 방출 캡슐; 또는 안약, 크림, 로션, 연고, 흡입제 증을 포함하여 현재 사용되고 있는 모든 다른 형태로 제조될 수 있다. 또한, 수술 분야에서 특정 부위를 치료하는 외과 의사, 의사 또는 의료 종사자에 의한 식염수 기반 세척과 같은 멸균 제형의 사용은 특히 유용하다. 또한, 조성물은 마이크로 장치, 마이크로 입자 또는 스폰지를 통해 전달될 수 있다.
제형에 따라, 약제는 투약 제형과 호환할 수 있는 방식으로 및 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 전술한 주사 가능한 용액의 유형과 같이, 다양한 투여 형태로 쉽게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등이 또한 사용될 수 있다.
이와 관련해서, 투여될 활성 성분의 양과 조성물의 양은 치료될 개인 또는 대상에 의해 결정된다. 투여에 필요한 활성 화합물의 구체적인 양은 개업의의 판단에 의해 결정되며 각각의 개인에 따라 다르다.
활성 화합물을 분산시키는데 필요한 약제의 최소량이 일반적으로 사용된다. 투여를 위한 적절한 요법은 또한 가변적이지만, 화합물을 최초로 투여하고 그 결과를 모니터링한 후 추가의 시간적 간격을 두고 추가의 제어된 투여량을 부여함으로써 전형화될 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐(예를 들어, 젤라틴 캡슐)의 형태로 경구 투여하기 위해, 활성 약물 성분, 즉, 본 발명에 따른 핵산 분자 및/또는 본원에서 치료제 또는 활성 화합물이라고도 하는 임의의 추가적인 약학적 활성제가, 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구의, 비독성, 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적절한 바인더, 윤활제, 붕해제, 및 착색제가 또한 혼합물에 포함될 수 있다. 적절한 바인더는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분풀, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 나트륨 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 글루코오스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수 감미료, 아카시아, 트라가칸트, 또는 알긴산나트륨과 같은 천연 및 합성검, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 이러한 투약 형태에서 사용되는 윤활제는 올레산나트륨, 스테아린산나트륨, 스테아린산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 활석, 스테아린산, 이의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함한다. 붕해제는 전분, 메틸셀룰로오스, 한천, 벤토나이트, 잔탄검 전분, 한천, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 또는 포화제 등을 제한 없이 포함한다. 희석제는, 예를 들어, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및/또는 글리신을 포함한다.
또한, 본 발명의 약제는 시간 제한 방출 및 지속적 방출 정제 또는 캡슐, 환제, 분말, 과립, 엘릭시르제, 팅크, 현탁액, 시럽 및 에멀젼과 같은 경구 투약 형태로 투여될 수 있다. 좌약은 지방산 에멀젼 또는 현탁액으로부터 유리하게 제조된다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 약제는 멸균될 수 있으며, 방부제, 안정화제, 습윤제, 또는 유화제와 같은 보조제, 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충액을 포함할 수 있다. 또한, 이들은 다른 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수도 있다. 조성물은 종래의 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조되며, 일반적으로 약 0.1% 내지 75%, 바람직하게는 약 1% 내지 50%의 유효 성분을 포함한다.
액체, 특히 주사용 조성물이, 예를 들어 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 활성 화합물은 예를 들어, 물, 생리 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 약학적으로 순수한 용매에 용해되거나 약학적으로 순수한 용매와 혼합됨으로써, 주사 가능한 용액 또는 현탁액을 형성한다. 또한, 주입 전에 액체에 용해하기에 적합한 고체 형태가 제형화될 수 있다.
고체 조성물에 대해, 부형제는 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로오스, 글리코오스, 수크로오스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 위에서 정의된 활성 화합물은 또한, 예를 들어, 프로필렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜을 담체로 사용하여 좌약으로 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제 및 핵산 분자는 각각 소형 단층 소포, 대형 단층 소포 및 다층 소포와 같은 리포좀 운반 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 포함하는 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분의 필름은 본 기술분야의 숙련자에 알려진 약물을 캡슐화하는 형태 지질층에 약물의 수용액으로 수화된다. 예를 들어, 본원에 개시된 핵산 분자는 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 방법을 사용하여 구성되는 친유성 화합물 또는 비-면역성의 고분자 화합물을 포함하는 복합체로서 제공될 수 있다. 따라서, 리포좀은 세포 사멸을 내부적으로 매개하기 위해 세포독성 물질을 표적으로 하고 포함하기 위해 이들의 표면에서 이러한 핵산 분자를 함유할 수 있다. 핵산 관련 복합체들의 일 예는 미국 특허 제 6,011,020호에서 제공된다.
또한, 본 발명의 약제 및 핵산 분자는 각각 표적 가능한 약물 전달체로서 가용성 폴리머와 결합될 수 있다. 이러한 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스판아미드페놀, 또는 팔미토일 잔류물로 대체된 폴리에틸렌옥사이드폴리리신을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제 및 핵산 분자는 각각 약물, 예를 들어, 폴리락트산, 폴리에프실론 카프로락톤, 폴리히드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시나아노아클리레이트 및 히드로겔의 가교 또는 양친매성 블록 공중합체의 제어된 방출을 달성하는 과정에서 유용한 생분해성 고분자의 부류와 결합될 수 있다.
또한, 원하는 경우, 투여되는 약학적 조성물 및 약제는 각각 소량의 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및 예를 들어, 초산나트륨 및 트리에탄올 아민 올레산염과 같은 다른 물질과 같은 비 독성 보조 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 약제 각각을 이용하는 투여 요법은 환자의 유형, 종, 나이, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료할 질병의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용되는 특정 앱타머 또는 이의 염을 포함하여 다양한 인자에 따라 선택된다. 일반적으로 숙련된 의사 또는 수의사는 질병의 진행을 예방, 대응, 또는 저지하기 위해 필요한 약물의 효과적인 양을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 효과적인 혈장 농도는 본원에 개시된 질환 중 어느 하나의 치료에서 바람직하게 500 fM 내지 500 μm의 범위이다.
본 발명의 핵산 분자 및 약제 각각은 바람직하게, 매일, 2일 또는 3일, 매주, 2주에 1회, 매월 또는 3달에 한번 투여량으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 약제는 본원에 개시된 약학적 조성물을 구성한다.
다른 양태에서, 본 발명은 이러한 치료를 필요로 하는 대상의 치료를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 약학적으로 활성인 양의 본 발명에 따른 적어도 하나의 핵산의 투여를 포함한다. 일 실시형태에서, 대상은 질환으로 고생하거나 그러한 질환이 진전될 위험이 있으며, 상기 질환은 본원에 개시된 질환 중 어느 하나, 특히 약제의 제조를 위해 본 발명에 따른 핵산 중 어느 하나의 사용과 관련하여 개시된 질환 중 어느 하나이다.
본 발명에 따른 핵산뿐만 아니라 길항제가 약제로서 또는 약제의 제조를 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 미용 목적, 특히 국소 염증 피부 병변에서 C5a의 관여와 관련되어 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 치료 또는 예방을 위해 본 발명에 따른 핵산, 약제 및/또는 약학적 조성물이 사용될 수 있는 추가의 질병 또는 질환은 국소 염증 피부 병변이다.
본원에서 바람직하게 사용된 바와 같이, 진단, 진단제, 또는 진단 수단은 C5a, 바람직하게 본원에 기재된 C5a, 그리고 더욱 바람직하게는 본원에 기재된 다양한 장애 및 질환과 관련되어 본원에 기재된 C5a를 직접 또는 간접적으로 검출하기에 적합하다. 진단은 본원에 기재된, 각각의 장애 및 질환 중 어느 하나의 검출 및/또는 후속 조치(follow-up)에 적합하다. 이러한 검출은 C5a에 대한 분 발명에 따른 핵산의 결합을 통해 가능하다. 이러한 결합은 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 각각의 방법 및 수단은 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 그 중에서도, 본 발명에 따른 핵산은 본 발명에 따른 핵산, 특히 C5a에 결합된 핵산의 검출을 허용하는 표지를 포함할 수 있다. 바람직하게, 이러한 표지는 방사성 표지, 효소 표지 및 형광 표지로 이루어진 군에서 선택된다. 원칙적으로, 항체를 위해 개발된 모든 공지된 분석법은 본 발명에 따른 핵산에 대해 채택될 수 있으며, 표적 결합 항체는 표적 결합 핵산에 의해 치환된다. 표지되지 않은 표적 결합 항체를 사용한 항체 분석법에서, 검출은 바람직하게 방사성 표지, 효소 표지 및 형광 표지로 변형되어 이의 Fc-단편에서 표적 결합 항체에 결합하는 이차 항체에 의해 수행된다. 핵산, 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산의 경우, 핵산은 이러한 표지를 사용하여 변형되며, 바람직하게, 이러한 표지는 비오틴, Cy-3 및 Cy-5로 이루어진 군에서 선택되며, 이러한 표지는 이러한 표지에 의해 검출되는 항체, 예를 들어 안티비오틴 항체, 안티-Cy3 항체 또는 안티-Cy5 항체에 의해 검출되며, 또는 표지가 비오틴 인 경우에는, 표지는 비오틴에 자연적으로 결합하는 스트렙타비딘 또는 아비딘에 의해 검출된다. 차례로, 이러한 항체, 스트렙타비딘 또는 아비딘은, 각각의 표지, 예를 들어, 방사성 표지, 효소 표지 또는 형광 표지(이차 항체와 유사)를 사용하여 바람직하게 변형된다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자들은 제 2 검출 수단에 의해 검출 또는 분석되며, 상기 검출 수단은 분자 비콘(beacon)이다. 분자 비콘의 방법론은 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 간략하게, 분자 비콘이라고도 하는 핵산 프로브는 검출될 핵산 샘플에 대해 역상보(reverse complement)이며 이로 인해 검출된 핵산의 일부와 혼성화된다. 핵산 샘플에 결합될 때, 분자 비콘의 형광단이 분리되며, 이는 형광 신호의 변화, 바람직하게는 세기의 변화를 유발한다. 이러한 변화는 존재하는 핵산의 양과 연관성이 있다.
본 발명에 따른 핵산을 사용한 C5a의 검출은 특히, 본원에서 정의된 바와 같은 C5a의 검출을 허용할 것이라는 것이 인식될 것이다.
C5a의 검출과 관련하여, 바람직한 방법은
(a) C5a의 존재 여부를 테스트할 샘플을 제공하는 단계,
(b) 본 발명에 따른 핵산을 제공하는 단계,
(c) 바람직하게 반응 용기에서 핵산과 샘플을 반응시키는 단계를 포함하며,
단계 (a)가 단계 (b) 이전에 수행되거나, 단계 (b)가 단계 (a) 이전에 수행될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 핵산과 샘플의 반응을 검출하는 단계 d)가 추가로 제공된다. 바람직하게, 단계 b)의 핵산은 표면에 고정화된다. 상기 표면은 반응관과 같은 반응 용기의 표면, 플레이트의 웰, 또는 예를 들어, 비드와 같이, 이러한 반응 용기에 포함되는 디바이스의 표면일 수 있다. 표면에 대한 핵산 분자의 고정화는 비공유 결합 또는 공유 결합을 포함하여 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게, 상기 결합은 표면과 핵산 사이의 공유 화합 결합을 통해 확립된다. 그러나, 본 발명의 핵산은 표면에 간접적으로 고정화될 수 있으며, 이러한 간접 고정화는 추가 성분 또는 한 쌍의 상호작용 파트너의 사용을 포함한다는 것 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 바람직하게, 이러한 추가 성분은 상호작용 파트너로도 또한 언급되는, 고정화되는 핵산과 특이적으로 상호작용함으로써 표면에 대한 핵산 분자의 부착을 매개하는 화합물이다. 바람직하게, 상기 상호작용 파트너는 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 및 항체로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게, 상기 상호작용 파트너는 항체, 더욱 바람직하게는 단일 클론 항체이다. 대안적으로, 상기 상호작용 파트너는 핵산, 바람직하게 기능성 핵산이다. 더욱 바람직하게, 이러한 기능성 핵산은 앱타머, 스피에겔머 및 적어도 부분적으로 핵산에 상보적인 핵산으로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 대안적 실시형태에서, 표면에 대한 핵산의 결합은 분절(multi-partite) 상호작용 파트너에 의해 매개된다. 바람직하게, 이러한 분절 상호작용 파트너는 한 쌍의 상호작용 파트너 또는 제 1 멤버 및 제 2 멤버로 이루어진 상호작용 파트너이며, 상기 제 1 멤버는 핵산 분자에 포함되거나 핵산 분자에 부착되며, 상기 제 2 멤버는 표면에 부착되거나 표면에 포함된다. 바람직하게, 상기 분절 상호작용 파트너는 비오틴과 아비딘, 비오틴과 스트렙타비딘 및 비오틴과 뉴트라비딘을 포함하는 상호작용 파트너 쌍으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게, 상호작용 파트너의 쌍의 제 1 멤버는 비오틴이다.
이러한 방법의 바람직한 결과는 C5a와 핵산의 고정화된 복합체의 형성이며, 더욱 바람직하게, 상기 복합체가 검출된다. 상기 복합체로부터 C5a가 검출되는 것이 일 실시형태 내에 있다.
이러한 요구 사항에 따른 각각의 검출 수단은, 예를 들어, C5a의 해당 부분/부분들에 대해 특이적인 임의의 검출 수단이다. 특히 바람직한 검출 수단은 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 검출 수단이며, 그 생성은 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다.
또한, C5a의 검출을 위한 방법은 샘플이 바람직하게 단계 c)를 수행하기 위해 사용된 반응 용기로부터 제거되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 또한 표면, 바람직하게 위에서 정의된 바와 같은 표면에 C5a의 상호작용 파트너를 고정화하는 단계를 포함하며, 상기 상호작용 파트너는 본원에서와 같이, 바람직하게 각각의 방법과 관련하여 상기와 같이 정의되며, 더욱 바람직하게, 이의 다양한 실시형태에서, 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 및 항체를 포함한다. 본 실시형태에서, 특히 바람직한 검출 수단은 본 발명에 따른 핵산이며, 이러한 핵산은 바람직하게 표지화되거나 표지화되지 않을 수 있다. 핵산 분자가 표지화되는 이러한 경우에, 핵산 분자는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 또한, 이러한 검출은 바람직하게, 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 및 본원에 개시된 다양한 실시형태에서의 실시형태들로 이루어진 군에서 또한 선택되는 제 2 검출 수단의 사용을 포함할 수 있다. 바람직하게, 이러한 검출 수단은 본 발명에 따른 핵산에 대해 특이적이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 제 2 검출 수단은 분자 비콘이다. 바람직한 실시형태에서, 핵산 또는 제 2 검출 수단 또는 양자 모두는 검출 표지를 포함할 수 있다. 바람직하게, 검출 표지는 비오틴, 브로모디옥시우리딘(bromo-deoxyuridine) 표지, 디그옥시제닌 표지, 형광 표지, UV 표지, 방사능 표지(radio-label) 및 킬레이터 분자로 이루어진 군에서 선택된다. 대안적으로, 제 2 검출 수단은, 바람직하게, 핵산에 함유되는, 핵산에 포함되는, 또는 핵산에 의해 부착되는 검출 표지와 상호작용한다. 특히 바람직한 조합은 다음과 같다:
검출 표지는 비오틴이고, 제 2 검출 수단은 비오틴에 대항하는 항체, 또는
검출 표지는 비오틴이고, 제 2 검출 수단은 아비딘 또는 아비딘 함유 분자, 또는
검출 표지는 비오틴이고, 제 2 검출 수단은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 함유 분자, 또는
검출 표지는 비오틴이고, 제 2 검출 수단은 뉴트라비딘 또는 뉴트라비딘 함유 분자, 또는
검출 표지는 브로모디옥시우리딘이고, 제 2 검출 수단은 브로모디옥시우리딘에 대항하는 항체, 또는
검출 표지는 디그옥시제닌이고, 제 2 검출 수단은 디그옥시제닌에 대항하는 항체, 또는
검출 표지는 킬레이터이고, 제 2 검출 수단은 방사성 핵종이며, 상기 검출 표지는 핵산에 부착되는 것이 바람직하다. 이러한 종류의 조합은 핵산이 표면에 부착되는 실시형태에 또한 적용할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이러한 실시형태에서, 검출 표지는 상호작용 파트너에 부착되는 것이 바람직하다.
마지막으로, 제 2 검출 수단은 제 3 검출 수단을 사용하여 검출되며, 바람직하게 제 3 검출 수단은 효소, 더욱 바람직하게 제 2 검출 수단의 검출에 대해 효소 반응 보여주는 효소이며, 또는 제 3 검출 수단은 방사선, 더욱 바람직하게 방사성 핵종에 의해 방출된 방사선을 검출하기 위한 수단이다. 바람직하게, 제 3 검출 수단은 제 2 검출 수단을 특이적으로 검출하고 및/또는 제 2 검출 수단과 상호작용하고 있다.
또한, C5a와 상호작용 파트너 사이에 형성되는 복합체에 바람직하게 첨가되는 본 발명에 따른 핵산 및 표면에 고정화되고 있는 C5a의 상호작용 파트너를 가진 실시형태에서, 샘플은 반응으로부터, 더욱 바람직하게 단계 c) 및/또는 단계 d)가 수행되는 반응 용기로부터 제거될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산은 형광 모이어티를 포함하며, 상기 형광 모이어티의 형광은 핵산과 C5a 및 핵산과 무-C5a 간의 복합체 형성 시 다르다.
또 다른 실시형태에서, 상기 핵산은 본 발명에 따른 핵산의 유도체이며, 상기 핵산의 유도체는 아데노신을 대체하는 아데노신의 적어도 하나의 형광 유도체를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 아데노신의 형광 유도체는 에테노아데노신(ethenoadenosin)이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산의 유도체 및 C5a로 이루어진 복합체는 형광성을 이용하여 검출된다.
상기 방법의 일 실시형태에서, 신호는 단계 (c) 또는 단계 (d)에서 생성되며, 바람직하게 상기 신호는 샘플의 C5a 농도와 관련이 있다.
바람직한 양태에서, 분석은 96-웰 플레이트에서 수행될 수 있으며, 여기서 성분은 상술한 바와 같은 반응 용기에서 고정되고, 웰은 반응 용기의 역할을 한다.
또한, 본 발명의 핵산은 신약 설계를 위한 출발 물질로 더 사용될 수 있다. 기본적으로, 두 개의 가능한 접근 방법이 있다. 하나의 접근 방법은 화합물 라이브러리의 스크리닝이며, 이러한 화합물 라이브러리는 바람직하게 저분자량 화합물 라이브러리이다. 일 실시형태에서, 상기 스크리닝은 고속 대량 스크리닝(high throughput screening)이다. 바람직하게, 고속 대량 스크리닝은 표적 기반 분석에서 화합물의 빠르고, 효율적인 시행 착오 평가이다. 최고의 경우에서, 분석은 비색 측정(colorimetric measurement)에 의해 수행된다. 이와 관련해서 사용되는 라이브러리는 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 핵산은 약물의 이론적 설계를 위해 사용될 수 있다. 바람직하게 이론적 약물 설계는 약학적 선도 구조의 설계이다. 일반적으로 X-선 결정학(X-ray crystallography) 또는 핵 자기공명 분광법(nuclear magnetic resonance spectroscopy)과 같은 방법에 의해 확인되는 표적의 3차원 구조로부터 출발해서 다양한 화학적 화합물의 구조를 포함하는 데이터베이스를 검색하기 위해 컴퓨터 프로그램이 사용된다. 선택은 컴퓨터에 의해 이루어지고, 확인된 화합물은 이후 실험실에서 테스트될 수 있다.
약물의 이론적 설계는 본 발명에 따른 임의의 핵산으로부터 출발할 수 있고 구조, 바람직하게는 본 발명의 핵산의 구조와 유사한 또는 본 발명의 핵산 구조의 결합 매개 부분과 동일한 3차원 구조를 포함한다. 어떠한 경우든, 이러한 구조는 여전히 본 발명의 핵산과 동일하거나 유사한 결합 특성을 보인다. 약물의 이론적 설계의 추가적인 단계 또는 대안적인 단계에서, 신결전달물질(neurotransmitter)과 결합하는 핵산의 부분의 바람직한 3차원 구조는 뉴클레오티드 및 핵산과는 다른 화학 그룹에 의해 모방된다. 이러한 모방에 의해 핵산과는 다른 화합물이 설계될 수 있다. 이러한 화합물은 바람직하게 저분자 또는 펩타이드이다.
본 기술분야의 숙련자에게 알려진 경쟁적 분석을 사용하는 것에 의한 것과 같은, 화합물 라이브러리의 스크린의 경우에서, 적절한 C5a 유사체, C5a 작용제 또는 C5a 길항제가 발견될 수 있다. 이러한 경쟁적 분석은 다음과 같이 설정될 수 있다. 본 발명의 핵산, 바람직하게 표적 결합 L-핵산인 스피에겔머는 고체상에 결합된다. C5a 유사체를 식별하기 위해, 표지된 C5a가 분석에 첨가될 수 있다. 잠재적인 유사체는 각각의 표지에 의해 얻은 신호에서의 감소를 동반하는 스피에겔머에 결합하는 C5a 분자와 경쟁한다. 작용제 또는 길항제에 대한 스크리닝은 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 세포 배양 분석의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는, 적어도 하나 이상의 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 적어도 하나 이상의 양성 또는 음성 대조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 양성 대조는 C5a, 특히 본 발명의 핵산이 선택되거나, 바람직하게, 액체 형태로 결합하는 C5a일 수 있다. 음성 제어는, 예를 들어 C5a와 유사한 생물 물리학적 특성 관점에서 정의되지만, 본 발명의 핵산에 의해 인식되지 않는 펩타이드일 수 있다. 또한, 상기 키트는 하나 이상의 버퍼를 포함할 수 있다. 다양한 성분이 건조 또는 동결 건조된 형태로 또는 액체에 용해되어 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는, 키트의 하나 이상의 성분을 순차적으로 포함할 수 있는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 키트는 키트를 사용하는 방법 및 이의 다양한 성분에 대한 정보를 사용자에게 제공하는 지시(instruction) 또는 지시 리플릿을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산의 약학적 및 바이오 분석적 결정은 인체 및 비-인체의 여러 체액, 조직 및 기관에서 이의 약동학 및 바이오 역학적 프로필의 평가를 위한 기초이다. 이러한 목적을 위해, 본원에 개시되거나 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 검출 방법 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자의 검출을 위한 샌드위치 혼성화 분석법(sandwich hybridisation assay)이 제공된다. 상기 검출 분석법에서, 캡처 프로브 및 검출 프로브가 사용된다. 상기 캡처 프로브는 본 발명에 따른 핵산자의 제 1 부분에, 상기 검출 프로브는 제 2 부분에 대해 상보적이다. 캡처 및 검출 프로브 모두는 DNA 뉴클레오티드, 변형된 DNA 뉴클레오티드, 변형된 RNA 뉴클레오티드, RNA 뉴클레오티드, LNA 뉴클레오티드 및/또는 PNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.
따라서, 캡처 프로브는 본 발명에 따른 핵산의 5' 말단에 상보적인 서열 스트레치를 포함하고, 검출 프로브는 본 발명에 따른 핵산의 3'-말단에 상보적인 서열 스트레치를 포함한다. 이러한 경우, 캡처 프로브는 이의 5'-말단을 통해 표면 또는 기질에 고정화되고, 따라서 캡처 프로브는 5'-말단과 표면 또는 기질 사이에서 링커를 통해 이의 5'-말단에 직접 고정될 수 있다. 그러나, 원칙적으로, 상기 링커는 캡처 프로브의 각각의 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 상기 링커는 본 기술분야에 알려진 소수성 링커 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.
대안적으로, 캡처 프로브는 본 발명에 따른 핵산의 3'-말단에 상보적인 서열 스트레치를 포함하고, 검출 프로브는 본 발명에 따른 핵산의 5'-말단에 상보적인 서열 스트레치를 포함한다. 이러한 경우, 캡처 프로브는 이의 3] 말단을 통해 표면 또는 기질에 고정화되고, 따라서 캡처 프로브는 3'-말단과 표면 또는 기질 사이에서 링커를 통해 이의 3'-말단에 직접 고정될 수 있다. 그러나, 원칙적으로, 상기 링커는 본 발명에 따른 핵산에 상보적인 서열 스트레치의 각각의 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 상기 링커는 본 기술분야에 알려진 소수성 링커 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산에 혼성화될 수 있는 캡처 및 검출 프로브의 뉴클레오티드의 수는 가변적이며 본 발명에 따른 캡처 및/또는 검출 프로브 및/또는 핵산 그 자체의 뉴클레오티드의 수와는 다를 수 있다. 본 발명에 따른 핵산에 혼성화될 수 있는 캡처 및 검출 프로브의 뉴클레오티드의 총수는 본 발명에 따른 핵산이 포함하는 뉴클레오티드의 수보다 커야 한다. 검출 및 캡처 프로브의 뉴클레오티드의 최소 개수(2 내지 10 개)는 본 발명에 따른 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단 각각에 혼성화될 수 있어야 한다. 본 발명에 따른 핵산 및 분석되는 샘플에서 발생하는 다른 핵산 사이의 높은 특이성과 선택성을 실현하기 위해, 캡처 및 검출 프로브의 뉴클레오티드의 총수는 본 발명에 따른 핵산이 포함하는 뉴클레오티드의 수이거나 커야 한다.
또한, 검출 프로브는 바람직하게 본원에서 전술한 바와 같이 검출될 수 있는 마커 분자 또는 표지를 갖는다. 상기 표지 또는 마커 분자는 원칙적으로 검출 프로브의 각각의 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 바람직하게, 상기 표지 또는 마커는 검출 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 위치하고, 따라서 상기 표지 또는 링커가 본 발명에 따른 핵산에 상보적인 검출 프로브 내의 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 상기 링커는 본 기술분야에 알려진 소수성 링커 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 검출은 다음과 같이 수행될 수 있다:
본 발명에 따른 핵산은 이의 그 말단 중 하나는 캡처 프로브와 혼성화하고, 다른 말단은 검출 프로브와 혼성화한다. 이후, 결합하지 않은 검출 프로브는, 예를 들어 한 번 이상의 세척 단계에 의해 제거된다. 바람직하게, 표지 또는 마커 분자를 갖는 결합된 검출 프로브의 양은 그 후에, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 제 WO/2008/052774호에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이 측정될 수 있다.
바람직하게 본원에서 사용되는 바와 같이, 치료라는 용어는, 바람직한 실시형태에서, 추가적으로 또는 대안적으로 예방 및/또는 후속 조치를 포함한다.
바람직하게 본원에서 사용되는 바와 같이, 질환 및 장애라는 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 동일한 의미로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 포함하다 라는 용어는 바람직하게 상기 용어에 의해 기재되거나 이어지는 주제를 제한하지 않는다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 포함하다 라는 용어는 포함의 의미로 이해되어야 하며, 이에 따라 이러한 용어에 의해 기재되거나 이어지는 주제를 제한하는 것으로 이해되어야 한다.
다양한 서열 번호: 본 발명에 따른 핵산 분자 및 본원에서 사용되는 표적 분자 C5a의 화학적 성질, 이들의 실제 서열 및 내부 참조 번호가 다음 표에 요약된다.
서열
번호		 내부 참조번호 서열
1 274-B5-002 L-RNA GCCUGAUGUGGUGUUGAAGGGUUGUGGGGUGUCGACGCACAGGC
2 274-D5-002 L-RNA GCCUGAUGUGGUGUUGAGGGGUUGUGGGGUGUCGACGCACAGGC
3 274-C8-002 L-RNA GCCUGAUGUGGUGUUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
4 274-C8-002-G14
(=NOX-D19001)		 L-RNA GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
5 274-C5-002 L-RNA GCCUGAUGUGGUGGUGAGGGGUUGUGGGGUGUCGACGCACAGGC
6 274-G6-002 L-RNA GCCUGAUGUGGUGGUGAGGGGAUGUGGGGUGUCGACGCACAGGC
7 274-H6-002 L-RNA GCCUGAUGUGGUGUUGAGGGGCUGUGGGGUGUCGACGCACAGGC
8 NOX-D19001-D09 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
9 NOX-D19001-D16 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGU dG AAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
10 NOX-D19001-D17 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGUG dA AGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
11 NOX-D19001-D30 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCACAGGC
12 NOX-D19001-D32 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUG dU CGACGCACAGGC
13 NOX-D19001-D40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA dC AGGC
14 NOX-D19001-D09-30 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCACAGGC
15 NOX-D19001-D09-32 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUG dU CGACGCACAGGC
서열
번호		 내부 참조번호 서열
16 NOX-D19001-D09-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA dC AGGC
17 NOX-D19001-D30-32 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCACAGGC
18 NOX-D19001-D30-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCA dC AGGC
19 NOX-D19001-D32-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUG dU CGACGCA dC AGGC
20 NOX-D19001-D09-30-32 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCACAGGC
21 NOX-D19001-D09-30-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCA dC AGGC
22 NOX-D19001-D09-32-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUG dU CGACGCA dC AGGC
23 NOX-D19001-D30-32-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGGC
24 NOX-D19001-D09-30-32-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGGC
25 NOX-D19001-D09-16-30-32-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGU dG AAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGGC
26 NOX-D19001-D09-17-30-32-40 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGUG dA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGGC
27 NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40
(= NOX-D19001-6xDNA)		 L-RNA/ L- DNA GCCUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGGC
서열
번호		 내부 참조번호 서열
28 NOX-D19001-6xDNA-007 L-RNA/ L- DNA CCUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G d U CGACGCA dC AGGC
29 NOX-D19001-6xDNA-008 L-RNA/ L- DNA CUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGGC
30 NOX-D19001-6xDNA-009 L-RNA/ L- DNA UGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGGC
31 NOX-D19001-6xDNA-010 L-RNA/ L- DNA GAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGGC
32 NOX-D19001-6xDNA-011 L-RNA/ L- DNA GCUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G d U CGACGCA dC AGC
33 NOX-D19001-6xDNA-012 L-RNA/ L- DNA GUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AC
34 NOX-D19001-6xDNA-013 L-RNA/ L- DNA UGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA d C A
35 NOX-D19001-6xDNA-018 L-RNA/ L- DNA GCCGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G d U CGACGCA dC GGC
36 NOX-D19001-6xDNA-019 L-RNA/ L- DNA GGCGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G d U CGACGCA dC GCC
37 NOX-D19001-6xDNA-020
(=NOX-D20001)		 L-RNA/ L- DNA GCGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC GC
38 NOX-D19001-6xDNA-021 L-RNA/ L- DNA CUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGC
39 NOX-D19001-6xDNA-022 L-RNA/ L- DNA UGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG d U G dU CGACGCA dC AGC
서열
번호		 내부 참조번호 서열
40 NOX-D19001-6xDNA-023 L-RNA/ L- DNA CGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGC
41 NOX-D19001-6xDNA-024 L-RNA/ L- DNA GAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC AGC
42 NOX-D19001-6xDNA-025 L-RNA/ L- DNA GCUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G d U CGACGCA dC AC
43 NOX-D19001-6xDNA-026 L-RNA/ L- DNA GCUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G d U CGACGCA dC C
44 NOX-D19001-6xDNA-027 L-RNA/ L- DNA GCUGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G d U CGACGCA dC A
45 NOX-D19001-6xDNA-028 L-RNA/ L- DNA CGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC GC
46 NOX-D19001-6xDNA-029 L-RNA/ L- DNA GAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC GC
47 NOX-D19001-6xDNA-030 L-RNA/ L- DNA GCGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC C
48 NOX-D19001-6xDNA-032 L-RNA/ L- DNA GCGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC
49 NOX-D19001-6xDNA-033 L-RNA/ L- DNA GGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC C
50 인간 C5a L-protein TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVASQLRANISHKDMQLGR
51 쥐 C5a L-protein DLQLLHQKVEEQAAKYKHRVPKKCCYDGARENKYETCEQRVARVTIGPHCIRAFNECCTIADKIRKESHHKGMLLGR
52 생쥐 C5a L-protein NLHLLRQKIEEQAAKYKHSVPKKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLCIRAFNECCTIANKIRKESPHKPVQLGR
서열
번호		 내부 참조번호 서열
53 Human C5 , alpha chain L-protein TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVASQLRANISHKDMQLGRLHMKTLLPVSKPEIRSYFPESWLWEVHLVPRRKQLQFALPDSLTTWEIQGIGISNTGICVADTVKAKVFKDVFLEMNIPYSVVRGEQIQLKGTVYNYRTSGMQFCVKMSAVEGICTSESPVIDHQGTKSSKCVRQKVEGSSSHLVTFTVLPLEIGLHNINFSLETWFGKEILVKTLRVVPEGVKRESYSGVTLDPRGIYGTISRRKEFPYRIPLDLVPKTEIKRILSVKGLLVGEILSAVLSQEGINILTHLPKGSAEAELMSVVPVFYVFHYLETGNHWNIFHSDPLIEKQKLKKKLKEGMLSIMSYRNADYSYSVWKGGSASTWLTAFALRVLGQVNKYVEQNQNSICNSLLWLVENYQLDNGSFKENSQYQPIKLQGTLPVEARENSLYLTAFTVIGIRKAFDICPLVKIDTALIKADNFLLENTLPAQSTFTLAISAYALSLGDKTHPQFRSIVSALKREALVKGNPPIYRFWKDNLQHKDSSVPNTGTARMVETTAYALLTSLNLKDINYVNPVIKWLSEEQRYGGGFYSTQDTINAIEGLTEYSLLVKQLRLSMDIDVSYKHKGALHNYKMTDKNFLGRPVEVLLNDDLIVSTGFGSGLATVHVTTVVHKTSTSEEVCSFYLKIDTQDIEASHYRGYGNSDYKRIVACASYKPSREESSSGSSHAVMDISLPTGISANEEDLKALVEGVDQLFTDYQIKDGHVILQLNSIPSSDFLCVRFRIFELFEVGFLSPATFTVYEYHRPDKQCTMFYSTSNIKIQKVCEGAACKCVEADCGQMQEELDLTISAETRKQTACKPEIAYAYKVSITSITVENVFVKYKATLLDIYKTGEAVAEKDSEITFIKKVTCTNAELVKGRQYLIMGKEALQIKYNFSFRYIYPLDSLTWIEYWPRDTTCSSCQAFLANLDEFAEDIFLNGC
54 붉은털 원숭이 C5a MLQEKIEEIAAKYKHLVVKKCCYDGVRINHDETCEQRAARISVGPRCVKAFTECCVVASQLRANNSHKDLQLGR
55 NOX-D19001-020 GCGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACGC
56 NOX-D19001-1xDNA-020 L-RNA/ L- DNA GCGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACGC
57 NOX-D19001-2xDNA-020 L-RNA/ L- DNA GCGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCACGC
서열
번호		 내부 참조번호 서열
58 NOX-D19001-3xDNA-020 L-RNA/ L- DNA GCGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCACGC
59 NOX-D19001-2dU-1dC-020 (=NOX-D21001) L-RNA/ L- DNA GCGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCA dC GC
60 NOX-D19001-3dU-1dC-020 L-RNA/ L- DNA GCGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC GC
61 L-RNA/ L- DNA AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA
여기서 n1은 U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU
62 L-RNA/ L- DNA AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA
여기서 n1은 U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU
63 L-RNA/ L- DNA AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA
여기서 n1은 U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU
64 L-RNA/ L- DNA AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA
여기서 n1은 U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU
65 L-RNA/ L- DNA AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA
여기서 n1은 U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU
서열
번호		 내부 참조번호 서열
66 L-RNA/ L- DNA AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA
여기서 n1은 U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU
67 L-RNA/ L- DNA AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA
여기서 n1은 U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU
68 L-RNA/ L- DNA AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA
여기서 n1은 U 또는 dU , n2는 G 또는 dG , n3은 A 또는 dA , n4는 U 또는 dU , n5는 U 또는 dU
69 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGKUGARGGGHUGUKGGGUGUCGACGCA
70 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGUUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA
71 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA
72 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGGUGAGGGGUUGUGGGGUGUCGACGCA
73 L-RNA/ L- DNA AUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA
74 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGGU dG AAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA
75 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGGUG dA AGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA
76 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCA
77 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUG dU CGACGCA
78 L-RNA/ L- DNA AUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCA
79 L-RNA/ L- DNA AUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUG dU CGACGCA
80 L-RNA/ L- DNA AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA
서열
번호		 내부 참조번호 서열
81 L-RNA/ L- DNA AUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA
82 L-RNA/ L- DNA AUG dU GGUGGU dG AAGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA
83 L-RNA/ L- DNA AUG dU GGUGGUG dA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA
84 L-RNA/ L- DNA AUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA
85 274-H6-002 D-RNA GCCUGAUGUGGUGUUGAGGGGCUGUGGGGUGUCGACGCACAGGC
86 274-D5-002 D-RNA GCCUGAUGUGGUGUUGAGGGGUUGUGGGGUGUCGACGCACAGGC
87 revNOX-D19 L-RNA/ L- DNA 40kDaPEG-CGGACACGCAGCUGUGGGUUGUUGGGAAGUGGUGGUGUAGUCCG
88 revNOX-D21 L-RNA/ L- DNA 40kDaPEG--CGdCACGCAGCUGdUGGGUUGUUGGGAAGUGGUGGdUGUAGCG
89 비오티닐화된 생쥐-D-C5a D-단백질 LLRQKIEEQAAKYKHSVPKKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLCIRAFNECCTIANKIRKESPHKPVQLGR- 비오틴
90 NOX-D19001-5[40kDa-PEG (= NOX-D19) L-RNA/ L- DNA 40kDaPEG-GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
91 NOX-D19001-6xDNA-020-5[40kDa-PEG (= NOX-D20) L-RNA/ L- DNA 40kDaPEG-GCGAUG dU GGUGGU dGdA AGGGUUGUUGGG dU G dU CGACGCA dC GC
92 NOX-D19001-2dU-1dC-020-5[40kDa-PEG (= NOX-D21) L-RNA/ L- DNA 40kDaPEG-GCGAUG dU GGUGGUGAAGGGUUGUUGGG dU GUCGACGCA dC GC
93 인간 des-ArgC5a D-단백질 TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVASQLRANISHKDMQLG
94 생쥐 des-ArgC5a D-단백질 NLHLLRQKIEEQAAKYKHSVPKKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLCIRAFNECCTIANKIRKESPHKPVQLG
추가적인 특징, 실시형태 및 이점이 선택될 수 있는 도면, 실시예 및 서열 목록을 사용하여 본 발명을 더 설명한다.
도 1은 표면 플라즈몬 공명 측정법에 의해 결정된, 인간 및 생쥐 C5a에 대한 상대적인 결합 활성 및 KD 값을 포함하여 인간 및 생쥐 C5a에 결합할 수 있는 핵산 분자의 서열의 정렬을 보여준다.
도 2는 표면 플라즈몬 공명 측정법에 의해 결정된, 인간 C5a에 대한 상대적인 결합 활성 및 KD 값을 포함하여 2'-데옥시리보뉴클레오티드 치환에 대해 하나의 리보뉴클레오티드를 갖는 핵산 분자 NOX-D19001의 유도체를 보여준다.
도 3은 표면 플라즈몬 공명 측정법에 의해 결정된, 인간 C5a에 대한 상대적인 결합 활성 및 KD 값을 포함하여 2'-데옥시리보뉴클레오티드 치환에 대해 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개 또는 여섯 개의 리보뉴클레오티드를 갖는 핵산 분자 NOX-D19001의 유도체를 보여준다.
도 4A 및 도 4B는 표면 플라즈몬 공명 측정법에 의해 결정된, 인간 C5a에 대한 상대적인 결합 활성 및 KD 값을 포함하여 핵산 분자 NOX-D19001-6xDNA의 절단을 보여준다.
도 5는 표면 플라즈몬 공명 측정법에 의해 결정된, 인간 C5a에 대한 상대적인 결합 활성 및 KD 값을 포함하여 2'-데옥시리보뉴클레오티드 치환에 대해 없거나, 한 개, 두 개, 세 개 또는 네 개의 리보뉴클레오티드를 갖는 핵산 분자 NOX-D20001의 유도체를 보여준다.
도 6은 인간 C5a에 대한 핵산 분자 NOX-D19001, NOX-D19001-D09 및 NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40(NOX-D19001-6xDNA라고도 함)의 비아코어(biacore) 측정에 의한 동력학적 평가를 보여주며, 여기서 500 nM의 스피에겔머 NOX-D19001, NOX-D19001-D09(약어 D09) 및 NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40(약어 D09-16-17-30-32-40)에 대한 데이터가 도시되어 있다.
도 7은 주화성 분석에서 5'-말단 40kDa PEG화 C5a 결합 스피에겔머 NOX-D19001-5´PEG(NOX-D19라고도 함) 및 NOX-D20(NOX-D19001-6xDNA-020-5'40kDa PEG라고도 함)의 효능을 도시한 도면이고, 여기서 세포는 다양한 양의 스피에겔머로 37℃에서 전배양된 0.1 nM huC5a로 이동하도록 하였다.
도 8은 인간 C5a, 쥐 C5a, 생쥐 C5a, 원숭이 C5a에 대한 핵산 분자 NOX-D20(NOX-D19001-6xDNA-020-5'40kDa PEG라고도 함)의 비아코어 측정에 의한 동력학적 평가를 보여주며, 여기서 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 및 1.95-0 nM의 스피에겔머 NOX-D20에 대한 데이터가 도시되어 있다.
도 9는 인간 C5 및 인간 desArg-C5a에 대한 핵산 분자 NOX-D20(NOX-D19001-6xDNA-020-5'40kDa PEG라고도 함)의 비아코어 측정에 의한 동력학적 평가를 보여주며, 여기서 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 및 1.95-0 nM의 스피에겔머 NOX-D20의 데이터가 도시되어 있다.
도 10은 인간 C5a, 인간 C5, 인간 desArg-C5a, 생쥐 C5a 및 생쥐 desArg-C5a에 대한 핵산 분자 NOX-D21(NOX-D19001-2dU-1dC-020-5´40kDa PEG라고도 함)의 비아코어 측정에 의한 동력학적 평가를 보여주며, 여기서 인간 C5a 및 인간 C5에 결합하는 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 및 1.95-0 nM의 스피에겔머 NOX-D21의 데이터가 도시되어 있다.
도 11은 인간, 붉은털 원숭이, 생쥐 및 쥐로부터의 C5a의 폴리펩타이드 서열 정렬을 보여준다.
도 12A는 인간 C5a 및 생쥐 C5a를 이용한 주화성 분석에서 C5a 결합 스피에겔머 NOX-D20의 효능을 도시한 도면이고, 세포는 다양한 양의 스피에겔머로 37℃에서 전배양된 0.1 nM huC5a 또는 0.3 nM mC5a로 이동하도록 하였으며, 여기서 a) 세포수는 각 데이터 세트의 가장 큰 값으로 표준화되어서 스피에겔머 농도에 대한 퍼센트 수로 도시되었으며, b) 주화성이 50%까지 억제되는 스피에겔머 농도(IC50)는 Prism5 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀법(4개의 매개변수 피트(fit))으로 계산되었다.
도 12B는 인간 C5a를 이용한 주화성 분석에서 C5a 결합 스피에겔머 NOX-D21의 효능을 도시한 도면이고, 세포는 다양한 양의 스피에겔머로 37℃에서 전배양된 0.1 nM huC5a로 이동하도록 하였으며, 여기서 a) 세포수는 각 데이터 세트의 가장 큰 값으로 표준화되어서 스피에겔머 농도에 대한 퍼센트 수로 도시되었으며, b) 주화성이 50%까지 억제되는 스피에겔머 농도(IC50)는 Prism5 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀법(4개의 매개변수 피트(fit))으로 계산되었다.
도 13은 인간 C5a를 이용한 1차 인간 PMNs의 주화성 분석(A) 및 엘라스타아제 방출 분석(B)에서 C5a 결합 스피에겔머 NOX-D19 및 NOX-D20의 효능을 도시한 도면이고, 여기서 세포는 1 nM huC5a로 이동하도록 하였으며 엘라스타아제 방출은 다양한 양의 스피에겔머로 37℃에서 전배양된 30 nM huC5a로 촉진되었다.
도 14는 스피에겔머 (A) NOX-19 및 NOX-D20, 및 (B) NOX D21를 이용한 양 적혈구 용혈 분석으로 평가한 C5 분열 억제를 보여준다. 양성 대조(C5C6) 및 음성 대조(revNOX D19 및 revNOX D21)가 도시되어 있다.
도 15는 다균성 패혈증의 맹장 결찰과 천자(CLP) 생쥐 모델에서의 생존율을 도시한 도면이고; 나타낸 투여량의 NOX-D19 또는 비히클을 CLP 수술 이후 즉시 시작하여 매일 복강내 투여하였다. 샴(sham) 동물은 CLP 없는 수술을 받았고 이후 비히클 주입이 이루어졌다.
도 16은 비히클 처리된 생쥐 및 샴 동물에서, 나타낸 투여량으로 NOX-D19로 처리된 생쥐에서 CLP 수술 전(4일) 및 수술 하루 뒤 혈청 크레아티닌 레벨(A) 및 혈액 요소 질소(blood urea nitrogen, BUN) 레벨(B)을 도시한 도면이다. 혈청 크레아티닌과 BUN은 신장 기능에 대한 바이오마커이다.
도 17은 비히클 처리된 생쥐 및 샴 동물에서, 나타낸 투여량으로 NOX-D19로 처리된 생쥐에서 CLP 수술 전(4일) 및 수술 하루 뒤 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT)의 혈청 레벨(A) 및 아스파라긴산 아미노전이효소(aspartate aminotransferase, AST) 의 혈청 레벨(B)을 도시한 도면이다. 혈청 ALT는 간세포 손상에 대한 바이오마커이다. 혈청 AST는 다기관 기능부전에 대한 바이오마커이다.
도 18은 다균성 패혈증의 맹장 결찰과 천자(CLP) 생쥐 모델에서의 생존율을 도시한 도면이고; 나타낸 투여량의 NOX-D20 또는 비히클을 CLP 수술 이후 즉시 시작하여 매일 복강내 투여하였다. 하나의 군은 CLP 수술 이후 즉시 1 mg/kg NOX D20의 1회 투여를 받았고 이후 매일 비히클 주입이 이루어졌다. 샴 동물은 CLP 없는 수술을 받았고 이후 비히클 주입이 이루어졌다.
도 19는 비히클 처리된 생쥐 및 샴 동물에서, 나타낸 투여량으로 NOX-D20으로 처리된 생쥐에서 CLP 수술 하루 뒤 혈청 크레아티닌 레벨(A), 혈액 요소 질소(BUN) 레벨(B) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 혈청 레벨(C)을 도시한 도면이다. 혈청 크레아티닌과 BUN은 신장 기능에 대한 바이오마커이다. 혈청 ALT는 간세포 손상에 대한 바이오마커이다.
도 20은 CLP 수술 하루 뒤 나타낸 투여량의 NOX D20 처리에 따른, 조직 손상에 대한 마커인 혈청 유산 탈수소효소(serum lactate dehydrogenase, LDH)에 대한 효과(A), 혈관 누출에 대한 효과(B), 및 PMN의 복막 침투에 대한 효과(C)를 도시한 도면이다. 비히클 처리된 생쥐 및 샴 동물을 대조군으로 나타내었다.
도 21은 국소빈혈/재관류 손상으로 유도된 급성 신부전 모델에서의 생존율을 도시한 도면이고, 나타낸 투여량의 NOX-D21 또는 비히클을 수술 전 1 시간에 정맥내 투여하고 난 후 3 일 동안 매 24 시간 마다 복강내 투입하였다.
도 22는 본 발명에 다른 핵산 분자가 구성하는 2'데옥시리보뉴클레오티드를 보여준다.
도 23은 본 발명에 다른 핵산 분자가 구성하는 리보뉴클레오티드를 보여준다.
실시예 1: 인간 및 생쥐 C5a 에 결합할 수 있는 핵산 분자
여러 개의 C5a 결합 핵산 분자 및 이의 유도체가 확인되었다: 이의 뉴클레오티드 서열을 도 1 내지 도 5에 나타내었다. C5a 결합 핵산 분자는,
a) 앱타머, 즉 직접 풀-다운(pull-down) 분석법(실시예 3) 또는 비교 경쟁 풀-다운 분석법(실시예 3)을 사용하는 D-핵산 분자,
b) 스피에겔머, 즉 표면 플라즈몬 공명 측정법(실시예 4)에 의한 및 인간 C5a 수용체를 발현하는 세포를 사용하는 체외 분석법(실시예 5)에 의한 L-핵산으로 특징지어졌다. 또한, 1차 인간 호중구(실시예 6) 및 체내(실시예 8, 9 alc 10)의 C5a-유도 활성화의 억제에 대해 스피에겔머를 테스트하였다.
스피에겔머 및 앱타머는 실시예 2 에 기재된 바와 같이 합성되었다.
그와 같이 생성된 핵산 분자는 약간 상이한 서열을 나타내며, 서열은 서열 집단(sequence family)으로 요약되거나 그룹화될 수 있다.
S 강함 G 또는 C;
W 약함 A 또는 U;
R 푸린 G 또는 A;
Y 피리미딘 C 또는 U;
K 케토 G 또는 U;
M 이미노 A 또는 C;
B A 아님 C 또는 U 또는 G;
D C 아님 A 또는 G 또는 U;
H G 아님 A 또는 C 또는 U;
V U 아님 A 또는 C 또는 G;
N 모두 A 또는 G 또는 C 또는 U.
달리 지시되지 않으면, 모든 핵산 서열 또는 스트레치의 서열은 각각 5' → 3' 방향으로 표시된다.
2'-데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드의 차별화를 위해, 다음과 같은 약어들이 사용된다:
2'-데옥시리보뉴클레오티드에 대해서: dG, dC, dT, dA 및dU(도 22 참조).
리보뉴클레오티드에 대해서: G, C, T, U(도 23 참조).
도 1 내지 도 5에 도시된 바와 같이, C5a 결합 핵산 분자는 잠재적인 C5a 결합 모티프를 정의하는 뉴클레오티드의 하나의 중앙 스트레치를 포함하며, 도 1은 서열 집단의 상이한 서열을 나타내며, 도 2 내지 도 5는 NOX-D20001(NOX-D19001-6x-DNA-020라고도 함, 도 4A) 및 NOX-D21001(NOX-D19001-2dU-1dC-020라고도 함, 도 5)를 포함하는 핵산 분자 NOX-D19001의 유도체를 나타낸다.
일반적으로, C5a 결합 핵산 분자는 5'-말단 및 3'-말단에 뉴클레오티드의 말단 스트레치, 즉, 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치를 포함한다. 상기 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 서로 혼성화할 수 있으며, 혼성화 시에, 이중 가닥 구조가 형성된다. 그러나 이러한 혼성화가 생체 내 및/또는 체외에서 반드시 분자에서 이루어지는 것은 아니다.
C5a 결합 핵산 분자의 뉴클레오티드의 세 가지 스트레치, 즉 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' → 3' 방향, 즉 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치-뉴클레오티드의 중앙 스트레치-뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치 순으로 서로 배열된다. 그러나, 대안적으로, 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' → 3' 방향, 즉 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치-뉴클레오티드의 중앙 스트레치-뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 순으로 서로 배열된다.
정의된 스트레치의 서열은 C5a에 대한 결합 친화도에 영향을 미치는 C5a 결합 핵산 분자 사이에서 서로 다를 수 있다. 상이한 C5a 결합 핵산 분자의 결합 분석에 따르면, 다음에 기재된 바와 같이 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 이의 뉴클레오티드 서열은 개별적으로 그리고, 더욱 바람직하게는 전부가 인간 C5a에 대한 결합을 위해 필수적이다.
도 1에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 C5a 결합 핵산 분자는 리보뉴클레오티드로 구성되며 도 1 내지 도 5에 도시되어 있다. C5a 결합 핵산 분자 274-H6-002를 앱타머로서 C5a 결합 핵산 분자 274-D5-002에 대한 비교 경쟁 풀-다운 분석법으로 테스트하였다. C5a 결합 핵산 분자 274-H6-002는 C5a 결합 핵산 분자 274-D5-002에 비해 약한 결합 친화도를 보였다. C5a 결합 핵산 분자 274-B5-002, 274-D5-002, 274-C8-002, 274-C8-002-G14(= NOX-D19001), 274-C5-002 및 274-G6-002를 스피에겔머로서 인간 및 생쥐 C5a에 결합하는 이들의 능력에 대해 플라즈몬 공명 측정법으로 테스트하였다(실시예 4 및 도 1 참조).
C5a 결합 핵산 분자 274-C8-002-G14(= NOX-D19001)는 생쥐 C5a에 대해 0.3 nM의 KD를 갖고 인간 C5a에 대해 1.38 nM의 KD를 갖는 최상의 결합 친화도를 보였다(도 1).
C5a 결합 핵산 분자 274-B5-002, 274-D5-002, 274-C8-002, 274-C8-002-G14(= NOX-D19001), 274-C5-002, 274-G6-002 및 274-H6-002는
5' AUGUGGUGKUGARGGGHUGUKGGGUGUCGACGCA 3' [서열 번호 69]를 공유하며,
여기서 G, A, U, C, H, K, 및 R은 리보뉴클레오티드이다.
C5a 결합 핵산 분자 274-C8-002, 274-C8-002-G14(= NOX-D19001) 및 274-C5-002는 C5a에 대한 최상의 결합 친화도를 보였으며, 중앙 스트레치에 대해 다음과 같은 서열을 포함한다:
a) 274-C8-002: 5' AUGUGGUGUUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [서열 번호 70],
b) 274-C8-002-G14: 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [서열 번호 71],
c) 274-C5-002: 5' AUGUGGUGGUGAGGGGUUGUGGGGUGUCGACGCA 3' [서열 번호72],
여기서 d G, A, U 및 C는 리보뉴클레오티드이다.
본 발명자들은 놀랍게도 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 서열 내에서 리보뉴클레오티드를 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 대체함으로써 C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도가 향상된다는 것을 발견하였다. 특히, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001에서 최대 여섯 개의 리보뉴클레오티드를 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 대체하면, 인간의 C5a에 대한 결합 친화도가 3.5 배 향상된다. 보다 상세하게, 발명자들은
a) C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 4, 11, 12, 25 또는 27 위치에서 하나의 리보뉴클레오티드를 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되고(도 2 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D09, NOX-D19001-D16, NOX-D19001-D17, NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D32);
b) C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 1 위치에서 하나의 리보뉴클레오티드를 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되고(도 2 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D40);
c) C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 4/25, 4/27, 또는 25/27 위치에서 두 개의 리보뉴클레오티드를 두 개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되고(도 3 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D09-30, NOX-D19001-D09-32, NOX-D19001-D30-32);
d) 두 개의 리보뉴클레오티드를 교체하면, 즉, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 1 위치에서 하나의 리보뉴클레오티드를 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하고, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 4, 25 또는 27 위치에서 하나의 리보뉴클레오티드를 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되고(도 3 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D09-40, NOX-D19001-D30-40, NOX-D19001-D32-40);
e) 세 개의 리보뉴클레오티드를 교체하면, 즉, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 1 위치에서 하나의 리보뉴클레오티드를 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하고, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 4/25, 4/27, 25/27 위치에서 두 개의 리보뉴클레오티드를 두 개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되고(도 3 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D09-30-40, NOX-D19001-D09-32-40, NOX-D19001-D30-32-40);
f) C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 04/25/27 위치에서 세 개의 리보뉴클레오티드를 세 개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되고(도 3 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D09-30-32);
g) 네 개의 리보뉴클레오티드를 교체하면, 즉, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 1 위치에서 하나의 리보뉴클레오티드를 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하고, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 04/25/27 위치에서 세 개의 리보뉴클레오티드를 세 개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되고(도 3 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D09-30-32-40);
h) 다섯 개의 리보뉴클레오티드를 교체하면, 즉, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 1 위치에서 하나의 리보뉴클레오티드를 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하고, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 04/11/25/27 또는 04/12/25/27위치에서 네 개의 리보뉴클레오티드를 네 개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되고(도 3 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D09-16-30-32-40, NOX-D19001-D09-17-30-32-40);
i) 여섯 개의 리보뉴클레오티드를 교체하면, 즉, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치의 1 위치에서 하나의 리보뉴클레오티드를 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하고, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 04/11/25/27 또는 04/11/12/25/27 위치에서 다섯 개의 리보뉴클레오티드를 다섯 개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도에 비해 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 향상되는(도 3 참조; 스피에겔머 NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40 = NOX-D19-001-6xDNA)것을 발견하였다.
C5a 결합 핵산 분자의 뉴클레오티드의 중앙 스트레치의 여러 위치에서 리보뉴클레오티드를 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체하면 C5a에 대한 결합이 향상된다는 것을 보여주는 데이터를 기반으로 하면, 테스트된 모든 C5a 결합 핵산 분자의 중앙 스트레치는 다음의 일반식
5' AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 61]으로 요약될 수 있으며,
여기서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU이고,
G, A, U, C, H, K 및 R는 리보뉴클레오티드이고, 및 dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이고,
여기서
a) 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 서열 5'　AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3'[서열 번호 62] (274-B5-002 참조)을 포함하고; 또는
b) 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 서열 5'　AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 63] (274-D5-002 참조)을 포함하고; 또는
c) 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 서열 5'　AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 64] (274-C8-002 참조)을 포함하고; 또는
d) 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 서열 5'　AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 65] (NOX-D19001 참조)을 포함하고; 또는
e) 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 서열 5'　AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 66] (274-C5-002 참조)을 포함하고; 또는
f) 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 서열 5'　AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 67] (274-G6-002 참조)을 포함하고; 또는
g) 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 서열 5'　AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' [서열 번호 68] (274-H6-002 참조)을 포함한다.
C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001-D09, NOX-D19001-D16, NOX-D19001-D17, NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D32, NOX-D19001-D09-30, NOX-D19001-D09-32, NOX-D19001-D09-40, NOX-D19001-D30-32, NOX-D19001-D30-40, NOX-D19001-D32-40, NOX-D19001-D09-30-32, NOX-D19001-D09-30-40, NOX-D19001-D09-32-40, NOX-D19001-D30-32-40, NOX-D19001-D09-30-32-40, NOX-D19001-D09-16-30-32-40, NOX-D19001-D09-17-30-32-40, NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40(도 2 및 도 3 참조)은 C5a에 대한 최상의 결합 친화도를 보였으며, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치에 대해 다음과 같은 서열을 포함한다:
a) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA　3' [서열 번호 73] (NOX-D19001-D09, NOX-D19001-D09-40 참조); 또는
b) 5' AUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA　3' [서열 번호 74] (NOX-D19001-D16 참조); 또는
c) 5' AUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA　3' [서열 번호 75] (NOX-D19001-D17 참조); 또는
d) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA　3' [서열 번호 76] (NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D30-40 참조); 또는
e) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 77] (NOX-D19001-D32, NOX-D19001-D32-40 참조); 또는
f) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA　3' [서열 번호 78] (NOX-D19001-D09-30, NOX-D19001-D09-30-40 참조); 또는
g) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 79] (NOX-D19001-D09-32, NOX-D19001-D09-32-40 참조); 또는
h) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 80] (NOX-D19001-D30-32, NOX-D19001-D30-32-40 참조); 또는
i) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 81] (NOX-D19001-D09-30-32, NOX-D19001-D09-30-32-40 참조); 또는
j) 5' AUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 82] (NOX-D19001-D09-16-30-32-40 참조); 또는
k) 5' AUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 83] (NOX-D19001-D09-17-30-32-40 참조); 또는
l) 5' AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA　3' [서열 번호 84] (NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40 = NOX-D19001-6xDNA 참조),
여기서 G, A, U 및 C는 리보뉴클레오티드이고, dG, dA 및 dU는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.
표면 플라즈몬 공명 측정법에 의해 결정되고 C5a 결합 핵산 NOX-D19001-D09 및 NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40(NOX-D19001-6xDNA라고도 함)에 대해 예시적으로 나타낸 바와 같이ㅡ 하나에서 최대 여섯 개의 리보뉴클레오티드를 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 교체함으로써 C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화도가 상당히 향상되었다(도 6).
NOX-D19001: 1.38 nM의 KD,
NOX-D19001-D09: 709 pM의 KD,
NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40: 361 pM의 KD.
NOX-D19001-6xDNA는 리보뉴클레오티드 대신에 다섯 개의 2'-데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드의 중앙 스트레치, 다섯 개의 리보뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 및 네 개의 리보뉴클레오티드와 하나의 2'-데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치를 포함한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 뉴클레오티드의 제 1 및 제 2 말단 스트레치가 네 개 또는 세 개의 뉴클레오티드에 대한 친화도의 감소 없이 절단될 수 있다는 것을 보여줄 수 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, NOX-D19001-6xDNA의 뉴클레오티드의 제 1 및 제 2 말단 스트레치는 친화도를 유지하면서 다섯 개 내지 세 개의 뉴클레오티드(NOX-D20001라고도 하는 NOX-D19001-6xDNA-020 참조)로부터 절단될 수 있다(도 4A).
도 4는 리보뉴클레오티드/2'-데옥시리보뉴클레오티드 치환 및 절단의 성공적인 조합을 보여준다: NOX-D19001-6xDNA 및 NOX-D19001-6xDNA-020(NOX-D20001이라고도 함)의 모분자(mother molecule)인 NOX-D19001는 리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드의 제 1 및 제 2 말단 스트레치로 구성되며, 다섯 개의 뉴클레오티드 각각은 1.38 nM의 결합 친화도(KD)를 갖는다. 여섯 개의 리보뉴클레오티드/2'-데옥시리보뉴클레오티드 치환(NOX-D19001-6xDNA로 이어짐) 및 세 개의 뉴클레오티드를 이용하는 스트레치의 제 1 및 제 2 말단 스트레치에 대한 절단(NOX-D20001이라고도 하는 NOX-D19001-6xDNA-020으로 이어짐) 이후, 인간 C5a에 대한 결합 친화도가 4 배 이상 향상되었다(NOX-D20001, 0.3 nM의 KD). 하나의 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드의 제 1 또는 제 2 스트레치의 절단은 감소된 활성으로 이어졌지만, 이러한 분자를 10 nm 이하의 KD로 C5a에 여전히 결합한다(도 4A 및 도 4B).
2'-데옥시리보뉴클레오티드에 의한 리보뉴클레오티드의 성공정인 치환의 또 다른 예가 도 5에 도시되어 있다. 분자 NOX-D19001-020은 NOX-D19001의 절단된 유도체이며, NOX-D19001에 대해 결정된 1.38 nM(도 1 및 도 2 참조) 대신에, 11.3 nM의 KD를 갖는다(도 5 참조). 분자 모두는 리보뉴클레오티드의 동일한 중앙 스트레치를 포함하지만, NOX D19001-020은 다섯 개의 리보뉴클레오티드 대신에 오직 세 개의 리보뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 및 다섯 개의 리보뉴클레오티드 대신에 오직 세 개의 리보뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치를 포함한다. 뉴클레오티드의 중앙 스트레치에서 두 개 또는 세 개의 리보뉴클레오티드를 2'-데옥시리보뉴클레오티드 치환함으로써 그리고 선택적으로 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치에서 한 개의 리보뉴클레오티드를 2'-데옥시리보뉴클레오티드 치환함으로써, NOX-D19001-020의 결합 친화도를 10 배 이상 향상시킬 수 있다(도 5, NOX-D19001-2xDNA-020, NOX-D19001-3xDNA-020, NOX-D21001이라고도 하는 NOX-D19001-2dU-1dC-020, NOX-D19001-3dU-1dC-020 참조).
종합하면, C5a 결합 핵산 분자의 제 1 및 제 2 말단 스트레치는 하나, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 뉴클레오티드를 포함하며(도 1 내지 도 5 참조), 상기 스트레치는 선택적으로 서로 혼성화하며, 혼성화 시에, 이중 가닥 구조가 형성된다. 그러나 이러한 혼성화가 반드시 분자에서 이루어지는 것은 아니다.
테스트된 모든 C5a 결합 핵산 분자의 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치를 분석하면, 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치에 대한 일반식은 5' Z1Z2Z3Z4G 3'이고 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치에 대한 일반식은 5' Z5Z6Z7Z8 Z9 3'이며,
Z1 is G or absent, Z2 is S or absent, Z3 is S or absent, Z4 is B or absent, Z5 is C or dC, Z6 is V or absent, Z7 is S or absent, Z8 is S or absent, Z9 is C 또는 존재하지 않고, 및
G, S, B, C, V는 리보뉴클레오티드이며, 및 dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이고,
바람직하게, 제 1 실시형태에서,
a) Z1은 G, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 rV, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
b) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 존재하지 않거나, 또는
c) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
d) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않거나, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
e) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
f) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
g) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
h) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 존재하지 않거나, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 C이거나, 또는
i) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 존재하지 않거나, 또는
j) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 존재하지 않거나, 또는
k) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 존재하지 않거나, Z5는 C 또는 dC, Z6는 V, Z7은 S, Z8은 S, Z9는 존재하지 않거나, 또는
l) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
m) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않거나, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
n) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 존재하지 않거나, Z5는 C, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
o) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 존재하지 않거나, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
p) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않거나, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않거나, 또는
q) Z1은 존재하지 않거나, Z2는 존재하지 않거나, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 존재하지 않거나, Z7은 존재하지 않거나, Z8은 존재하지 않거나, Z9는 존재하지 않고,
제 2 실시형태에서,
a) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCCUG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 comprises a nucleotide sequence 5' CAGGC, 또는
b) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCCUG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAGGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
c) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' CCUG 3' 또는 5' CUG 3' 또는 5' UG 3' 또는 5' G 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAGGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
d) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCUG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
e) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCCG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
f) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GGCG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGCC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
g) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' CUG 3' 또는 5' UG 3' 또는 5' CG 3' 또는 5' G 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
h) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCUG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAC 3' 또는 5' dCC 3' 또는 5' dCA 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
i) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GUG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCAC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
j) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' UG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCA 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
k) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
l) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' CG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
m) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' G 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
n) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
o) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
p) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' dCC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또는
q) 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5' GCG 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5' CGC 3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
이들의 기능을 입증하기 위해, C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19001, NOX-D20001 및 NOX-D21001를 이의 5'-말단에서 아미노기를 갖는 스피에겔머로서 합성하였다. 상기 아미노-변형 스피에겔머에 40 kDa PEG-모이어티를 결합시켜서 C5a 결합 스피에겔머 NOX-D19, NOX-D20 및 NOX-D21을 생성하였다. 스피에겔머의 합성 및 PEG화는 실시예 2에서 설명된다.
향상된 결합 친화도의 효과는 C5a 결합 핵산 분자의 기능에 대해 나타낼 수 있다. 주화성 분석(실시예 5)에 의해 확인된 바와 같이, 리보뉴클레오티드로만 구성된 C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19(IC50 = 1.9 nM)는 여섯 개의 리보뉴클레오티드/2'-데옥시리보뉴클레오티드 치환(IC50 = 0.28 nM)을 포함하는 C5a 결합 핵산 분자 NOX-D19의 유도체인 NOX-D20보다 인가나 C5a의 기능을 억제하는데 덜 강력했다(도 7).
NOX-D20는 19 pM의 해리 상수 KD로 쥣과의 C5a에 대해 매우 높은 결합 친화도를 보인 반면, 인간 C5a에 대해서는 299 pM의 KD가 확인되었다(실시예 4, 도 8). NOX-D20는 주화성 분석에서 확인된 바와 같이, 275 pM의 억제 상수 IC50을 갖고 인간 C5a의 기능을 억제한다(실시예 5, 도 7 및 도 12A). 화학양론적인 이유로, 300 pM인 생쥐 C5a의 자극 농도로 인해 생쥐 C5a에 대한 주화성 분석의 민감도는 50 pM으로 제한된다. 따라서, 생쥐 C5a에 대해, 140 pM의 IC50이 NOX-D20에서 측정되었다(실시예 5, 도 12A).
NOX-D20은 쥐 또는 붉은털 원숭이의 C5a에 대해 결합하지 않았으며, 이는 매우 높은 표적 특이성(도 8)을 나타낸다. 인간, 생쥐, 쥐 및 붉은털 원숭이의 C5a의 폴리펩타이드 서열 정렬로부터, 인간 C5a의 세린16 및 발린28의 잔기는 C5a에 대한 필수적인 결합 잔기일 가능성이 높은 것을 알 수 있다. 이들은 인간 및 쥣과의 C5a에서 보존되지만, 붉은털 원숭이와 쥐의 C5a에서는 다르다.
NOX-D21은 NOX-D20의 중요한 친화도 향상 부위를 포함하며, 비아코어 측정에 의해 나타난 바와 같이 인간 및 쥣과의 C5a에 대해 높은 친화도를 보였다(KD(쥣과 C5a) = 29 pM, KD(인간 C5a) = 815 pM, KD(인간C5) = 413 pM, 도 11 참조).
체외에서, C5a의 절단된 형태는 des-Arg-C5a(C5adesArg라고도 함)로 알려진 C-말단 아르기닌 잔기의 효소 분열에 의해 생성된다. des-Arg-C5a의 생물학적 기능은 완전히 이해되지 않지만, des-Arg-C5a가 백혈구 활성화 기능을 보유하고 있다는 증거가 있다. 따라서, NOX D20도 des-Arg-C5a에 결합하는지를 연구하였다. NOX D20은 고정된 재조합 인간 des-Arg-C5a에 대해 투여 의존적 결합을 보였다(도 9).
상기한 바와 같은 상세한 동력학적 평가는 각각 316 pM 및 299 pM의 해리 상수로 생쥐 및 전장 인간 C5a에 대한 비교할 만한 친화도를 갖고 인간 des-Arg-C5a가 NOX-20에 의해 결합된다는 것을 보였다. NOX-D21는 각각 28 pM 및 854 pM의 해리 상수를 갖고 생쥐 및 인간 des-Arg-C5a에 결합하였다(도 10). 따라서, C5a를 des-Arg-C5a로 분열시킨 이후에도, NOX-20 및 NOX-D21과 같은 C5a 결합 핵산 분자는 여전히 이들의 표적에 결합한다.
놀랍게도, NOX-D20 과 NOX-D21 은 각각 164 pM 및 413 pM의 친화도를 갖고 인간 혈장에서 정제된 C5에 결합하는 것으로 나타났다(도 9 및 도 10). 이러한 현상은 예상할 수 없었다. 그러나, 이는 C5a가, 보체계가 활성화될 때 C5 전환효소에 의해 또는 활성화된 응고 체계의 트롬빈 또는 다른 요소에 의해 분열되는 C5의 일부이기 때문에 그럴듯하다. 또한, 인간 혈장에서 정제된 C5는 아스파라긴64 상에서 고유의 글리코실화 구조를 갖고 있다. 글리코실화는 NOX-D19, NOX-D20, NOX D21 및 본 발명에 따른 다른 핵산 분자의 확인을 위해 사용되는 쥣과의 거울상 C5a 폴리펩타이드 상에 존재하지 않는다.
C5로의 결합은, C5 거대 단백질의 예상되는 낮은 제거율과 공개된 350-390 nM의 혈장 농도로 인해 약물동력학(pharmacokinetics)에 영향을 줄 수 있다. C5로의 결합은 또한 약력학(pharmacodynamics)에 영향을 줄 수 있다.
실시예 2: 앱타머 및 스피에겔머의 합성 및 유도체화
소규모 합성
2'TBDMS RNA 포스포라미다이트 화학(Damha and Ogilvie, 1993)을 사용하여 ABI 394 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 고체상 합성에 의해 앱타머(D-RNA 핵산) 및 스피에겔머(L-RNA 핵산)을 생성하였다. D- 및 L- 구성에서 rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, 및 rU- 포스포라미다이트를 ChemGenes(Wilmington, MA)에서 구입하였다. 앱타머와 스피에겔머는 겔 전기영동에 의해 정제되었다.
대규모의 합성 및 변형
스피에겔머를 2'TBDMS RNA 포스포라미다이트 화학(Damha and Ogilvie, 1993)을 사용하여 AktaPilot100 합성기(Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg)로 고체상 합성에 의해 생성하였다. L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, 및 L-rU- 포스포라미다이트는 ChemGenes(Wilmington, MA)에서 구입하였다. 5'-아미노-변형자(modifier)는 American International Chemicals Inc.(Framingham, MA, USA)에서 구입하였다. 변형되지 않은 또는 5'-아미노 변형 스피에겔머의 합성은 기공 크기 1000 Å(Link Technology, Glasgow, UK)의 L-riboG, L-riboC, L-riboA 또는 L-riboU 변형된 CPG 상에서 개시되었다. 결합을 위해(사이클당 15분), 아세토니트릴에서의 0.3 M 벤질티오테트라졸(CMS-Chemicals, Abingdon, UK) 및 아세토니트릴에서의 각각의 0.2M 포스포라미다이트 용액의 3.5 당량이 사용되었다. 산화-캐핑 사이클이 사용되었다. 또한, 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 표준 용액 및 시약은 Biosolve(Valkenswaard, NL)에서 구입하였다. 스피에겔머는 DMT-ON 합성되었다; 탈보호(deprotection)후, 스피에겔머는 Source15RPC 배지(Amersham)를 사용하여 조제용 RP-HPLC(Wincott et al., 1995)를 통해 정제되었다. 5'DMT-작용기는 80% 아세트산(실온에서 30분)으로 제거되었다. 그 후, 2M NAOAc 수용액이 첨가되었고, 5K 재생성된 셀룰로오스 멤브레인(Millipore, Bedford, MA)을 사용하여 접선 유동 여과법(tangential-flow filtration)으로 스피에겔머를 탈염시켰다.
스피에겔머의 PEG 화
생체 내에서 스피에겔머의 혈장 체류 시간을 연장하기 위해, 스피에겔머를 5'-말단에서 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티와 공유 결합시켰다.
PEG화(PEG화에 대한 방법의 기술적 상세 설명은 유럽 특허 출원 EP 1,306,382 참조)를 위해, 정제된 5'-아미노 변형 스피에겔머가 H2O(2.5 ml), DMF(5 ml) 및 완충액 A(5 ml; 구연산·H22O[7 g], 붕산[3.54 g], 인산[2.26 ml] 및 1 M NaOH[343 ml]를 혼합하고, 최종 부피가 1L가 될 때까지 물을 첨가하여 제조, pH=8.4 1M HCl로 조절되었다)의 혼합물에 용해시켰다.
스피에겔머 용액의 pH는 1 M NaOH를 사용하여 8.4로 조절되었다. 이후, 75 내지 85%의 최대 수율에 도달할 때까지, 40 kDa PEG-NHS 에스테르(Jenkem Technology, Allen, TX, USA)를 0.25 당량의 6개의 부분으로 37℃에서 매 30분마다 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 PEG-NHS 에스테르를 첨가하는 동안 1M NaOH를 사용하여 8 내지 8.5로 유지하였다.
반응 혼합물을 4ml의 요소 용액(8 M) 및 4ml의 완충액 B(H2O에서의 0.1 M의 트리에틸암모늄아세테이트)와 혼합하여, 15분 동안 95℃ 로 가열하였다. 이후, PEG화된 스피에겔머를 아세토니트릴 구배(gradient)(완충액 B; 완충액 C: 아세토니트릴에서의 0.1 M 트리에틸암모늄아세테이트)를 사용하여, 소스 15RPC 배지(Amersham)로 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 초과 PEG는 5%의 완충액 C에서, PEG화된 스피에겔머는 10-15%의 완충액 C에서 용출하였다. (HPLC에 의해 평가된 바와 같이) >95%의 순도를 가진 생성물 일부를 40 ml의 3 M NaOAC와 결합시키고 혼합하였다. PEG화된 스피에겔머를 접선 유동 여과(5K 재생 셀룰로오스 멤브레인, Millipore, Bedford MA)에 의해 탈염시켰다.
실시예 3: 앱타머에 대한 C5a 의 결합 상수 확인(풀-다운 결합 분석)
직접 풀-다운 분석
C5a 결합 핵산의 친화도를 37℃에서 풀-다운 분석법으로 바이오티닐화된 D-C5a (서열 번호 89)에 대한 앱타머(D-RNA 핵산)의 결합으로서 측정하였다. 앱타머는 [γ-32P]-표지된 ATP(Hartmann Analytic, Braunschweig, Germany)를 사용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Invitrogen)에 의해 표지된 5'-포스페이트였다. 표지된 앱타머의 비 방사능은 200,000-800,000 cpm/pmol이였다. 분석은 선택 완충액(pH 7.4의 Tris-HCl 20 mM; 150 mM의 NaCl; 5 mM의 KCl; 1 mM의 MgCl2; 1 mM의 CaCl2; 4 U/ml RNase inhibitor (RNaseOUT, Invitrogen); 사용된 플라스틱 용기 또는 고정화 기질의 표면으로의 결합 파트너의 흡착을 방지하기 위해 50 μg/ml의 소 혈청 알부민(Sigma) 및 10 μg/ml의 비특이성 스피에겔머를 함유한 0.1% [w/vol]의 Tween-20)에서 수행하였다. 낮은 농도에서 평형 상태에 도달하기 위해 3 내지 4 시간 동안 다양한 농도의 바이오티닐화된 생쥐 D-C5와 함께 선택 완충액에서 0.2-1 nM 농도와 37℃에서 변성 및 복원한 이후 앱타머를 배양하였다. 바이오티닐화된 생쥐 D-C5의 농도 범위는 640 pM 내지 10 μM로 설정하였으며; 총 반응 부피는 80-200 μl이었다. 바이오티닐화된 생쥐 D-C5 및 바이오티닐화된 생쥐 D-C5와 앱타머의 복합체를 선택 완충액으로 사전 평형화된 5 μl의 뉴트라비딘 아가로스 플러스(NeutrAvidin Agarose Plus) 입자(Pierce Biotechnology)에서 고정시켰다. 입자를 온도조절 믹서에서 37℃로 30 분 동안 현탁액에 보관하였다. 상층액을 분리하고 적절한 세척을 한 이후 고정화된 방사능을 신틸레이션 카운터(scintillation counter)에서 정량화하였다. 결합의 비율을 바이오티닐화된 생쥐 D-C5의 농도에 대해 나타냈으며, 해리 상수를 1:1 화학양론으로 가정하여 소프트웨어 알고리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 얻었다.
경쟁적 풀-다운 분석
다양한 D-C5a 결합 핵산을 경쟁시키기 위해, 경쟁 순위 분석(competitive ranking assay)을 수행하였다. 이를 위해, 이용 가능한 가장 친화적인 앱타머를 방사능 표지하였고(상기 참조) 기준으로 사용하였다. 변성 및 복원 이후, 경쟁 없이 4 μl의 뉴트라비딘 아가로스 플러스 입자에서 고정화 및 세척 이후 바이오티닐화된 생쥐 D-C5에 대략 5 내 지 10% 결합을 유도하는 조건에서 바이오티닐화된 생쥐 D-C5로 37℃의 선택 완충액에서 배양하였다. 변성되고 복원된 과잉의 미-표지 D-RNA 앱타머 변종을, 표지된 기준 앱타머와 함께, 9 pM 내지 400 nM 범위의 농도로 병행 결합 반응에 첨가하였고, 총 반응 부피는 160 내지 400 μl이었다. 배양 3 내지 4 시간 이후, 바이오티닐화된 생쥐 D-C5 및 바이오티닐화된 생쥐 D-C5와 앱타머의 복합체를 고정시켰고 상기한 바와 같이 분석하였다. 테스트될 앱타머를 표적 결합을 위한 기준 앱타머와 경쟁시켜, 이들의 결합 특정에 따른 결합 신호를 감소시켰다. 본 분석에서 가장 활성인 것으로 나타난 앱타머를 이후에 추가의 앱타머 변종의 비교 분석을 위한 새로운 기준으로 사용할 수 있었다.]
실시예 4: C5a 및 관련 펩타이드에 대한 스피에겔머 결합의 비아코어 측정
장비를 37℃의 지속 온도로 설정하였다. 새로운 칩의 각각의 실험/고정화를 시작하기 전에 DESORB 방법을 사용하여 비아코어 2000 장비를 세척하였다. 유지 칩(maintenance chip)을 결합한 후, 장비를 흡수제 용액 1(0.5% 도네실 황산나트륨(SDS)), 흡수 용액 2(50 mM 글리신, pH 9.5) 및 HBS-EP 완충액으로 연속해서 프라임하였다. 시스템을 HBS-EP 완충액으로 프라임하였다.
비아코어 실험을 위해, C5a 결합 스피에겔머를 멸균수에서 제조하였고 100 μm의 농도를 가졌다.
CM5 칩을 HBS-EP 완충액으로 프라임하였고 안정적인 기선(baseline)이 관찰될 때까지 평형시켰다. 유세포를 유세포 4에서 시작하여 유세포 1까지 고정화하였다. 0.4 M EDC 및 0.1 M NHS의 1:1 혼합물 100 μl를 QUICKINJECT command를 사용하여 10 μl/분의 유량으로 주입하였다. 유세포의 활성화를 NHS/ EDC 주입 이후(CM5 칩에 대해 일반적으로150 내지 500 RU) RU의 증가로 관찰하였다. C5a에 대한 10 mM NaAc(pH5.5) 또는 인간 C5에 대한 10 mM NaAc(pH5.5) 내의 0.1-1 μg/ml의 용액을 바이알에 옮기고 MANUALINJECT command를 사용하여 10 μl/분의 유량으로 주입하였다. 1000-3000 RU를 칩에 고정시켰다. 70 μl의 1 M염산 에탄올아민(pH 8)을 10 μl/분의 유량으로 주입하여 모든 유세포를 블로킹하였다. 재생 용액(1 M NaCl)을 30 μl/분의 유량으로 주입하여 비특이적으로 결합된 단백질을 칩 표면에서 제거하였다.
가장 낮은 농도에서 시작하여, 러닝(running) 완충액으로 희석된 2,000 - 1,000 - 500 - 200 - 125 - 62.5 - 31.3 - 15.6 (2x) - 7.8 - 3.9 - 1.95 -0.98 - 0.48 - 0.24 - 0.12 - 0 nM의 농도로 일련의 스피에겔머 주입에 의해 동력학적 매개변수 및 해리 상수를 평가하였다. 모든 실험에서, 분석은 30 μl/분의 유량으로 240 초의 결합 시간 및 240초 내지 360초의 해리 시간을 정의하는 Kinject command를 사용하여 37℃에서 수행하였다. 분석을 두 번 참조하였고, FC1을 (차단된) 표면 대조(각 스피에겔머 농도의 벌크 기여)로 사용하였고, 분해물질이 없는 일련의 완충액 주입으로 완충액 자체의 벌크 기여를 확인하였다. 적어도 하나의 스피에겔머 농도를 두 번 주입하여 실험 동안의 재상 효율과 칩 완전성을 관찰하였다. 60 μl의 1M NaCl을 30 μl/분의 유량으로 주입하여 재생을 수행하였다. 각각의 재생 사이클 이후의 기선의 안정화 시간을 30 μl/분에서 1로 설정하였다.
데이터 분석 및 해리 상수(KD)의 계산은 상수 RI를 갖는, 수정된 랭뮤어 1:1 화학 양론적 피팅 알고리즘을 사용하는 BIAevaluation 3.1.1 소프트웨어(BIACORE AB, Uppsala, Sweden) 및 1 x 107 [RU/M*s]의 물질 운반 계수 kt를 사용한 물질 전달 평가로 수행하였다.
실시예 5: 주화성 분석에서 억제 농도의 확인
C5a 에 대한 인간 수용체를 발현하는 세포주의 생성
인간 C5a 수용체(NCBI accession NM_001736 in pcDNA3.1+)에 대해 코딩하는 프라스미드로 BA/F3 생쥐 프로 B 세포를 형질감염시켜 C5a에 대한 인간 수용체를 발현하는, 안정적으로 형질감염된 세포주를 생성하였다. 제네티신(geneticin)으로 처리하여 C5aR을 발현하는 세포를 선택하였고 발현에 대해서 RT-PCR로 그리고 기능에 대해서 주화성 분석으로 테스트하였다.
주화성 분석
실험 전날, 세포를 새로운 플라스크에 0.3 x 106/ml로 접종하였다. 실험을 위해, 세포를 원심분리하고, HBH(HBSS, 1 mg/ml 소 혈청 알부민 및 20 mM HEPES 함유)로 1회 세척한 후 1.33 x 106 세포/ml로 재현탁하였다. 이 현탁액의 75 μl를 5 μm의 기공을 갖는 96 웰 코닝 트랜스웰 플레이트(Costar Corning, #3388; NY, USA)의 상단 칸에 첨가하였다. 하단 칸에서는, 세포를 첨가하기 전 20 내지 30 분 동안 37℃의 235 μl HBH에서 다양한 농도의 스피에겔머와 함께 재조합 인간 C5a(서열 번호 50) 또는 생쥐 C5a(서열 번호 54)를 전배양하였다. 세포를 37℃에서 3 시간 동안 이동하도록 하였다. 이후, 삽입 플레이트(상단 칸)를 제거하고 인산완충 식염수 내의 30 μl의 440 μM 레자주린(Sigma, Deisenhofen, Germany)을 하부 칸에 첨가하였다. 37℃에서 2.5 시간 동안 배양한 후, 544 nm의 여기 파장과 590 nm의 방출 파장에서 형광을 측정하였다.
형광 값은 배경 형광(웰에 C5a가 없음)에 대해 보정하고 스피에겔머 농도로 나타낸다. IC50 값은 GraphPad Prism을 사용하여 비선형 회귀(4 매개변수 적합)로 결정된다. 대안적으로, 스피에겔머를 갖는(C5a 만 갖는) 샘플에 대한 값을 100%로 설정하고 스피에겔머를 갖는 샘플에 대한 값을 이의 퍼센트로 계산한다. 퍼센트 값을 스피에겔머 농도로 나타내고 IC50 값을 상기한 바와 같이 결정한다.
인간 및 생쥐 C5a 에 대한 반-최대 유효 농도의 확인
다양한 인간 C5a 또는 생쥐 C5a 농도에 대해 BA/F3/huC5aR 세포를 이동시킨 후 3 일에, huC5a에 대한 0.1 nM 및 mC5a 대한 0.3 nM의 반 유효 농도(EC50)를 나타내는, 인간 및 생쥐 C5a에 대한 용량 반응 곡선을 얻었다. 스피에겔머에 의한 주화성 억제에 대한 실험을 위해 0.1 nM의 인간 C5a 및 0.3 nM의 생쥐 C5a를 사용하였다.
실시예 6: 1차 인간 호중구의 C5a 유도 활성화 억제
인간 PMN 의 분리
상온에서 불연속 농도 구배에 의해 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocytes, PMN)를 전혈에서 분리하였다. 채혈관(Sarstedt)을 포함하는 혈액을 산 시트르산 덱스트로스 용액에서 채혈하였다. 덱스트린 500(Accurate Chemical)을 2% w/v의 최종 농도로 첨가하고 혈액/덱스트린을 히스토파크(Histopaque, 1.077 g/ml, Sigma) 위에 적층하였다. 원심분리 후, 구배 인터페이스 상의 모든 액체와 세포를 제거하였다. 펠렛 및 대략 80%의 잔류 액체를 수집하여 볼루벤(Voluven) 80% v/v(Fresenius Kabi), PBS 16% v/v(Sigma) 및 ACD 4% v/v(Sigma)의 혼합물과 1:1 희석하였다. 혼합물을 400 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 수집하여 1,000 rpm에서 7 분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 부드럽게 재현탁하였고 잔류 적혈구를 용해에 의해 제거하였다.
인간 PMN 의 C5a 유도 주화성 억제
주화성 플레이트의 하부 챔버 내에서 인간 C5a(1 nM)를 HBSS + 0.01% BSA + 25 mM HEPES 내의 NOX-D19 또는 NOX-D20의 나타낸 농도로 전배양하였다. 인간 호중구를 주화성 플레이트의 상부 챔버에 첨가하고, 주화성을 37℃ 및 5% CO2에서 25 분 동안 수행하였다. 배양 이후, 상부 챔버를 Accutase를 포함하는 백색 형광 플레이트로 고정하여 주화성 메시의 아래쪽에 결합된 세포를 수확하였다. Glo 시약(Promega)을 첨가하고 10 분 동안 평형화시켰다. Biotek Synergy 2 플레이트 리더를 사용하여 발광을 측정하였다.
인간 PMN 에 의한 C5a 유도 엘라스타아제 방출 억제
인간 호중구를 37℃, 5% CO2에서 30 분 동안 TNFα(10 ng/ml) 및 사이토칼라신 B(5 μg/ml)로 프라임하였다. 나타낸 농도의 NOX-D19 또는 NOX-D20로 전배양된 인간 C5a(30 nM)로 세포를 45 분 동안 자극하였다. 이후 세포를 원심분리로 분리하였고 37℃에서 1 시간 동안 상층액 25 μl를 Tris-HCl 0.1 M(pH 7.4)에서 엘라스타아제 기질(Calbiochem)로 배양하였으며, 매 5 분 마다 405 nm의 흡광도에서 측정값을 취했다. 동역학 데이터를 분석하여 각각의 샘플에 대한 vmax를 결정하였다. 대조군에 대한 평균 백분율 엘라스타아제 활성을 각각의 샘플에 대해 계산하였다(배경은 차감하지 않음).
결과
NOX-D19 및 NOX-D20는 갓 분리한 인간 말초 혈액 PMN의 활성을 C5a에 의해 억제한다. 10 nM의 NOX-D19 또한 NOX-D20은 인간 PMN의 huC5a 유도 주화성의 85% 이상을 차단하기에 충분하였다(도 13A). 항균성 엘라스타아제의 HuC5a 유도 방출은 NOX-D19 및 NOX D20에 의해 효과적으로 억제되었다(도 13 B). 30 nM의 NOX D19 또는 NOX-D20은 C5a 유도 엘라스타아제 방출의 대략 50%를 억제하였다. 물론, 화학양론적인 이유로, 엘라스타아제 방출이 30 nM의 huC5a에 유도기 때문에, 본 분석의 민감도는 IC50 = 15 nM로 제한된다.
실시예 7: C5a 결합 핵산은 보체 의존성 용혈을 방해하지 않는다.
보체 캐스케이드의 최종 생성물은 C5b-9로 이루어진 기공인 막 공격 복합체(MAC)이다. MAC는 병원균의 세포막에 삽입되어 세포막 누출의 유도로 이들을 사멸시키는 것으로 생각된다.
본원에 제시된 C5a 결합 핵산(스피에겔머)은 C5의 맥락에서 C5a를 인식하는 것으로 나타났다(실시예 1, 도 9 및 도 10 참조). 따라서, MA의 일부인 아나필라톡신 C5a 및 C5b로의 C5의 분열이 이들 스피에겔머에 의해 억제되는지를 확인하였다. 이는 보체 의존 양 적혈구 용혈 테스트를 이용하여 이루어졌다.
방법
재구성된 인간의 동결건조 혈청("인간 보체 혈청" Sigma Aldrich, Germany)을 96-웰 플레이트(Nunc-Immuno™ Plate, MaxiSorp Surface™)에서 10 nM 내지 10,000 nM의 범위에서 PEG화 스피에겔머 NOX-D19, NOX-D20 및 NOX D21로 전배양하였다. 양성 대조군으로서, C5 분열을 억제하는 최대 2'OMe 푸린 및 2'플루오로 피리미딘 치환(Biesecker et al. 1999)(실험실 합성)을 갖는 C5 결합 앱타머 C5C6를 동일한 농도 범위에서 사용하였다. 분석에 대해 잠재적인 비특이성 스피에겔머의 효과에 대한 대조군으로서, NOX-D19 및 NOX D21의 역방향 서열을 갖는 PEG화 스피에겔머인 revNOX-D19 및 revNOX D21을 포함시켰다. revNOX-D19 및 revNOX D21은 비아코어 및 세포 기반 분석에서 예상보다 일찍 C5a를 억제하지 않는 것으로 나타났다. 37℃에서 1 시간 배양한 후, 용혈계(Institut Virion/Serion GmbH, Germany)로 알려진 토끼 항-양 적혈구 항체로 옵소닌화된 양의 적혈구를 전배양된 혈청 보체 억제제 혼합물에 첨가하였다. 보체는 고전적 경로를 통해 활성화되어 C5를 C5a 및 C5b로 분열시킨다. 그리고 나서 C5b를 C6-C9와 결합시켜 용해 막 공격 복합체(MAX)를 형성한다. MAC 형성에 의한 양의 적혈구 용혈을 원래의 세포를 스핀 다운한 후 비색 측정에 의해 30 분 후에 확인하였다. 용혈의 정도가 높을수록 405 nm에서의 흡수가 높다(Fluo Star plate reader에서 측정됨).
결과
앱타머 C5C6는 대략 1 μM의 IC50으로 양의 적혈구의 보체 의존성 용해를 억제하였다(도 14A 및 도 14B). 테스트된 스피에겔머, 즉 C5 및 C5a 결합 핵산 NOX-D19 및 NOX-D20(도 14 A) 및 NOX D21(도 14 B) 그리고 비-C5- 또는 C5a 결합 스피에겔머 revNOX-D19(도 14 A) 및 revNOX D21(도 14 B)은 용혈을 억제하지 못했다.
논의
테스트된 C5a 결합 스피에겔머는 MAC 형성을 억제하지 않는 것으로 나타났고, 따라서 C5a만의 선택적 길항제이다. 약제로 사용될 경우, 이는 유리할 수 있는데, 그 이유는 MAC 형성의 억제가 주로 그람 양성 세균인 침입 병원균에 대한 신체의 방어 기전을 손상시킬 수 있기 때문이다.
실시예 8: C5a 결합 핵산 NOX - D19 는 다균성 패혈증에 대한 맹장 결찰과 천자 쥣과 모델에서 효능을 보인다.
다균성 패혈증 과정에서 NOX-D19의 복강내 주입의 효과를 설치류 맹장 결찰과 천자(CLP) 모델에서 테스트하였다.
방법
동물 모델
10 내지 12 주령 수컷 C57BL/6 생쥐(Charles River Laboratories, Germany)를 연구에 사용하였다. 가벼운 이소플루란 마취 하에 수술로 복막염을 유도하였다. 복강의 좌상 사분면을 절개하였다(맹장의 정상 위치). 맹장을 노출시키고, 소장의 삽입부에서 먼 쪽에서 봉합을 하고(75%가 결찰됨) 단단한 고정장치를 맹장 주위에 배치하였다. 24-게이지 바늘로 맹장에 하나의 천자 상처를 만들고, 상처에서 소량의 맹장 내용물을 짜냈다. 맹장을 다시 복강에 넣고 개복 부위를 닫았다. 500 μl의 식염수를 체액 보충액으로 피하로 주입하였다. 맹장의 결찰과 천자를 제외하고 동일한 방식을 샴 동물에 시행하였다. 마지막으로, 동물을 이들의 우리로 돌려보내고 사료와 물에 자유로운 접근을 허용하였다.
연구 그룹
4 개의 그룹(샴 수술군 n=6 생쥐 및 CLP 수술군당 n=10 생쥐)을 테스트하였다: (1) 비히클(식염수) 처리의 샴 수술군, (2) 비히클 처리의 CLP 수술군, (3) 저용량의 NOX-D19(1 mg/kg) 처리의 CLP 수술군, 및 (4) 고용량의 NOX-D19(10 mg/kg) 처리의 CLP 수술군. 처리 요법에 대해 연구자의 눈을 가려 비히클 또는 베럼(verum)이 어떠한 화합물을 포함하는지 알지 못하게 했다.
생존
각 그룹에서 7일 동안 추적이 이루어졌다. 생쥐를 매일 관찰하였고, GraphPad Prism 4 소프트웨어를 사용하여 카플란-마이어(Kaplan Meier) 생존 곡선을 생성하였다.
채혈
수술 전(기선, 4일) 그리고 수술 후 1일 해면 정맥동(cavernous sinus)의 모세혈관에서 가벼운 에테르 마취 하에 혈액 샘플을 채취하여 급성 신부전(혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소(BUN)) 및 급성 간부전(알라닌-아미노전이효소, 혈청 ALT)의 일상적인 혈청 마커를 측정하였다. 아스파라긴산 아미노전이효소(혈청 AST)의 레벨을 다기관 기능부전의 마커로 혈청에서 측정하였다. 임상 화학 매개변수의 측정을 Olympus 분석기(AU400) 상에서 수행하였다.
통계
통계적 유의성을 스튜던트 T-테스트에 의해 계산하였다. 카플란-마이어 생존 곡선을 생성하였고 유의성에 대한 로그 순위 검정을 수행하였다. GraphPad Prism 4 소프트웨어가 사용되었다.
결과
생존
예상한 바와 같이, CLP 없는 샴 수술의 동물에서 사망이 발생하지 않았다(도 15). CLP 수술을 받고 비히클 만으로 처리된 생쥐에서 평균 생존은 1.5일 이었다. CLP 수술 이후 NOX D19 처리는 평균 생존을 향상시켰다(도 15). 저용량의 NOX-D19(1 mg/kg)로 처리한 생쥐는 가장 긴 평균 생존을 보였다(5 일, p < 0.0001, 비히클 대비). 고용량의 NOX-D19(10 mg/kg)로 처리한 생쥐는 3 일의 평균 생존을 보였는데, 이는 비히클 처리된 생쥐(p = 0.0401)보다는 상당히 길지만, 저용량의 NOX-D19(p = 0.4875)와는 많이 다르다. 비히클 생쥐의 100%가 CLP 수술 4 일 이내 사망하였다. 각각 저용량 및 고용량의 NOX-D19로 처리한 생쥐에서 100% 및 90%의 사망률이 7 일 이전에는 발생하지 않았다(도 15).
임상 화학
신기능( renal function )
혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소(BUN)) 농도는 신기능의 매개변수이다. 신기능은 본 연구의 시작 이전(4 일) 및 CLP 수술 이후 1일째 평가하였다.
1일째, CLP는 비히클 처리된 생쥐에서 혈청 크레아티닌 레벨의 상당한 증가를 유도하였다. 저용량의 NOX-D19 처리(1 mg/kg)는 이러한 증가를 방지하였다(도 16A). 고용량의 NOX-D19(10 mg/kg)로 처리한 생쥐에서, 혈청 크레아티닌 레벨의 중간이지만 통계적으로는 유의성이 없는 증가가 관찰되었다(p = 0.1873, 비히클 대비)(도 16 A).
크레아티닌보다는 더욱 민감한 신기능의 매개변수인 BUN(도 16B)은 비히클 처리된 생쥐에서 CLP 수술 후 1일째 상당히 증가하였다. 저용량 및 고용량의 NOX-D19로 처리한 생쥐의 경우 CLP에 대해 BUN의 증가를 상당히 억제하였다(도 16B).
간 기능
간세포성 손상 또는 괴사의 가장 신뢰할 만한 마커는 혈청 알라닌 아미노전이효소(혈청 ALT)이다. 모든 그룹은 CLP 수술 후 1일 째 혈청 ALT의 증가를 보였다. 그러나, NOX-D19로 처리된 패혈성 생쥐의 두 그룹은 비히클 처리된 생쥐에 비해 향상된 간 기능을 나타냈다(도 17A).
다기능 부전
아스파라긴산 아미노전이효소(혈청 AST)의 혈청 레벨(도 17B)을 다기능 부전의 마커로서 측정하였는데, 그 이유는 AST가 심근 경색, 급성 장염, 급성 용혈성 빈혈, 중화상, 급성 질환, 근골격계 질환, 및 정신적 외상과 같은 간 이외의 다른 장기에 영향을 주는 질병에서 상승하는 것으로 나타났기 때문이다.
ALT와 유사하게, 모든 그룹은 CLP 수술 후 1일 째 AST 레벨의 증가를 보였다(p < 0.001, 샴 대비). 그러나, 간 기능과 유사하게, NOX-D19 처리된 패혈성 생쥐의 두 그룹은 비히클 처리된 생쥐에 비해 덜 현저한 AST 레벨을 나타냈다(도 17B).
실시예 9: 향상된 C5a 결합 핵산 NOX - D20 은 다균성 패혈증에 대한 맹장 결찰과 천자 쥣과 모델에서 효능을 보인다.
다균성 패혈증의 과정에서 NOX-D20의 복강내 주입의 효과를 설치류 맹장 결찰과 천자(CLP) 모델에서 테스트하였다.
방법
동물 모델
실시예 8에 개시한 바와 같이 맹장의 50-75%가 결찰된 10 내지 12 주령 수컷 C57BL/6 생쥐(Charles River Laboratories, Germany)에서 다균성 패혈증을 유도하였다
생존
각 그룹에서 7일 동안 추적이 이루어졌다. 생쥐를 매일 관찰하였고, GraphPad Prism 4 소프트웨어를 사용하여 카플란-마이어(Kaplan Meier) 생존 곡선을 생성하였다.
연구 그룹
5 개의 그룹(샴 수술군 n=5 생쥐 및 CLP 수술군당 n=10 생쥐)을 테스트하였다: (1) 비히클(식염수) 처리의 샴 수술군, (2) 비히클 처리의 CLP 수술군, (3) 매일 저용량의 NOX-D20 (1 mg/kg) 처리의 CLP 수술군, (4) 매일 고용량의 NOX-D20 (10 mg/kg) 처리의 CLP 수술군, 및 (5) 수술 이후 단일 저용량의 NOX-D19(1 mg/kg) 처리 후 매일 비히클 처리한 CLP 수술군. 처리 요법에 대해 연구자의 눈을 가려 비히클 또는 베럼(verum)이 어떠한 화합물을 포함하는지 알지 못하게 했다.
임상 화학 및 염증 매개변수
실시예 8에 개시한 바와 같이, 수술 후 1일 해면 정맥동의 모세혈관에서 가벼운 에테르 마취 하에 혈액 샘플을 채취하였다. 급성 신부전(혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소(BUN), 급성 간부전(혈청 ALT) 및 내피세포 손상(혈청 유산 탈수소효소, 혈청 LDH)의 일상적인 혈청 마커를 측정하였다. 3 ml의 PBS를 사용하여 복막 관류법(Peritoneal lavage, PL)을 수행하였다. 채취한 PL의 부피를 각각의 샘플에서 측정하였으며, 혈구계(hemocytometer, Neubauer Zaehlkammer, Gehrden, Germany)를 사용하여 총 세포수를 평가하였다. 종양 괴사 인자알파(tumor necrosis factor alpha, TNF-α), 인터류킨-6 (IL-6), 및 CCL2(= 대식세포 화학주성인자 단백질-1, MCP-1)의 혈청 및 PL 레벨을 비드-기반 유세포 분석(CBA Kit, BD Biosciences, Heidelberg, Germany)에 의해 정량화하였다. CXCL1(= 각질세포 화학주성인자, KC) 및 CXCL2(= 대식세포 염증 단백질-2, MIP-2)의 혈청 및 PL 레벨을 ELISA(R&D Systems, Wiesbaden, Germany)에 의해 확인하였다. PL에서의 백혈구 백분율 검사(differential cell count)를 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색된 시스토핀(cytospin4, Thermo Scientific)에서 수행하였다
모세관 누출
CLP 수술 이후 즉시, 0.25% w/v 에반스 블루(200 μl)을 정맥 주사하였다. 18 시간 이후 생쥐를 희생시킨 후 상기한 바와 같이 PL을 수행하였다. 혈청 및 PL 액체 내의 에반스 블루 염료의 농도를 620 nm에서 분광 측정하였다. 헴 색소(heme pigment)로 인한 오염에 대해 광학 밀도를 보정하기 위해 다음의 식을 사용하였다: E620 (보정) = E620 (raw) - (E405 (raw) x 0.014). 혈장 삼출(plasma exudation)을 혈장에서의 소멸에 대한 PL 액체에서의 소멸의 비율로 정량화하였다.
통계
통계적 유의성을 일원 분산분석(one-way ANOVA) 및 두네트 검정(Dunnett's test)에 의해 계산하였다. 유의성에 대한 로그 순위 검정을 수행하였다. GraphPad Prism 4 소프트웨어가 사용되었다.
결과
생존
예상한 바와 같이, 수술 이후 7 일 이내에 샴 처리 생쥐에서 사망이 발생하지 않았다(도 18). 비히클 처리된 CLP 생쥐에서 평균 생존은 3일 이었다. CLP 수술 이후 NOX D19 처리는 평균 생존을 향상시켰다(도 15). 저용량의 1 mg/kg의 NOX-D20으로 처리한 생쥐는 평균 생존을 7 일로 크게 연장하였다(p=0.0043, 비히클 대비). 3 mg/kg NOX-D20로 투여량을 증가해도 추가적인 보호 효과를 보이지 않았으며 6.5 일의 유사한 평균 생존을 보였다(p=0.0092, 비히클 대비). 특히, CLP 수술 이후 1 mg/kg NOX D20의 단일 주사는 매일 처리하는 것과 같이 효과적이었으며 평균 생존을 6.5 일로 크게 연장하였다(도 18). 비히클 처리된 생쥐의 100%가 5 일 이내에 사망하였지만, NOX D20로 처리된 생쥐의 30-40%는 실험의 끝인 7 일째까지 생존하였다(도 18).
장기 기능
전신 염증은 종종 복합 장기 부전을 유발한다. 크레아티닌과 BUN의 증가된 혈청 레벨은 감소된 사구체 여과율 및 신부전에 대한 매개변수이다. 두 매개변수 모두는 샴 생쥐에 비해 CLP 수술 후 1 일째 비히클 처리된 생쥐에서 상당히 증가하였다. NOX-D20 처리는 이들 두 마커의 증가를 효과적으로 방지하였으며, 이는 신기능에 대한 NOX-D20의 보호 효과를 시사한다(도 19A 및 도 19B).
알라닌 아미노전이효소(ALT)는 간세포성 손상 및 괴사의 공통 마커이며, CLP 유도 패혈증은 ALT 혈청 레벨의 증가와 관련이 있었다. NOX-D20로 처리된 생쥐는 비히클 처리된 생쥐에 비해 상당히 감소된 레벨의 혈청 ALT를 보였으며, 이는 향상된 간 기능을 시사한다(도 19C). 유산 탈수소효소(LDH)의 증가된 혈청 레벨은 조직 손상 이후 발생하며 따라서 장기 부전의 일반적인 마커이다.
CLP에 의해 유발된 LDH의 증가가 NOX-D20에 의해 효과적으로 차단되었다(도 20A). 내피 장벽의 와해와 부종 형성은 패혈증의 흔한 치명적 현상이다. 패혈증 유도는 샴 처리 생쥐에 비해 비히클 처리된 생쥐에서 상대적인 혈장 단백질의 혈관외유출(extravasation)에서 두 배의 증가를 유발하였다. NOX D20 처리는 모세관 누출을 상당히 억제하였다(도 20B). 여기서 테스트된 모든 매개변수에 대해, 1 mg/kg의 NOX-D20는 장기 기능을 크게 개선시키기에 충분하였으며, 이는 NOX-D20로 처리된 생쥐의 향상된 생존에 반영되었다.
염증
CLP는 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 강력한 국부 및 전신 상향조정을 유발했다. NOX-D20에 의한 C5a의 차단은 CLP 이후 1 일째 복막 및 혈청에서 TNFα, IL 6, CCL2, CXCL1 및 CXCL2의 농도를 효과적으로 감소시켰다. 이들 케모카인의 상향조절은 복막으로의 다형핵 백혈구(PMN)의 동원과 관련된다. 따라서, NOX-D20에 의한 C5a 억제는 복강에서 PMN의 축적을 억제한다(도 20C). 마찬가지로, 단핵구의 침투가 NOX-D20에 의해 차단되었다.
실시예 : 허혈성 재관류 유도 급성 신부전 모델에서 NOX - D21 의 효능
급성 신부전(AKI)에 대한 NOX-D21의 효과를 국소빈혈/재관류 손상(IRI)의 설치류 모델에서 테스트하였다.
방법
동물 모델
12 내지 15 주령 수컷 C57BL/6 생쥐(Charles River Laboratories, Germany)를 이소플루란을 사용하여 코 마스트를 통해 마취한 후 체온을 32℃로 유지시키기 위해 난방 테이블 상에 반듯이 눕혔다. 정중선 절개를 수행하였고 좌우 신경(renal pedicle)을 30 분 동안 미세혈관 클립으로 고정하였다. 클립과 피부의 봉합선을 제거한 후, 생쥐를 우리로 갖다 놓고 완전히 깰 때까지 관찰하였다.
연구 그룹
3의 그룹(그룹당 n=10)을 테스트하였다: (1) 비히클 처리의 IRI 수술군, (2) 저용량의 NOX-D21(1 mg/kg) 처리의 IRI수술군, 및 (3) 고용량의 NOX-D21(10 mg/kg) 처리의 IRI 수술군. 처리 요법에 대해 연구자의 눈을 가려 비히클 또는 베럼(verum)이 어떠한 화합물을 포함하는지 알지 못하게 했다. NOX-D21를 d0에서 수술 1 시간 전에 그리고 그 다음 3 일 동안(d1-d3) 정맥내 주사하였고 매일 한번씩 복강내 주사하였다.
생존
생쥐를 14 일 동안 매일 관찰하였다. 카플란-마이어 생존 곡선을 생성하였고 GraphPad Prism 4 소프트웨어를 사용하여 로그 순위 검정으로 유의성을 확인하였다.
결과
생존율이 고용량의 NOX-D21의 처리에 의해 크게 향상되었다(도 21). 저용량의 NOX-D21 처리는 분명하지만 통계적으로 유의하지 않은 생존의 개선을 보였다. 비히클로만 처리된 대조군에서, 한 마리의 생지가 14 일까지 생존하였다. NOX-D21 처리는 생쥐의 생존율을 45 내지 55%로 향상시켰다(도 21).
(참조문헌)
본원에 참조로 포함되어 있는 인용된 문서의 모든 서지 정보는, 달리 지시되지 않은 한, 다음과 같다.
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990), Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215(3):403-10.
Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402.
Arumugam TV, Shiels IA, Strachan AJ, Abbenante G, Fairlie DP, Taylor SM (2003) A small molecule C5a receptor antagonist protects kidneys from ischemia/reperfusion injury in rats. Kidney Int 63(1): 134-142
Arumugam TV, Woodruff TM, Stocks SZ, Proctor LM, Pollitt S, Shiels IA, Reid RC, Fairlie DP, Taylor SM (2004) Protective effect of a human C5a receptor antagonist against hepatic ischaemia-reperfusion injury in rats. J Hepatol 40(6): 934-941
Bergh K, Iversen OJ, Lysvand H. (1993). Surprisingly high levels of anaphylatoxin C5a des Arg are extractable from psoriatic scales. Arch Dermatol Res 285(3):131-134.
Biesecker G, Dihel L, Enney K, Bendele RA (1999) Derivation of RNA aptamer inhibitors of human complement C5. Immunopharmacology 42(1-3): 219-230.
Bonifati DM, Kishore U. (2007) Role of complement in neurodegeneration and neuroinflammation. Mol Immunol 44(5): 999-1010.
Bosmann M, Ward PA (2012) Role of C3, C5 and anaphylatoxin receptors in acute lung injury and in sepsis. Adv Exp Med Biol 946: 147-159
Breivik T, Gundersen Y, Gjermo P, Taylor SM, Woodruff TM, Opstad PK (2011) Oral treatment with complement factor C5a receptor (CD88) antagonists inhibits experimental periodontitis in rats. J Periodontal Res 46(6): 643-647
Chen M, Daha MR, Kallenberg CG (2010) The complement system in systemic autoimmune disease. J Autoimmun 34(3): J276-286
Copland DA, Hussain K, Baalasubramanian S, Hughes TR, Morgan BP, Xu H, Dick AD, Nicholson LB (2010) Systemic and local anti-C5 therapy reduces the disease severity in experimental autoimmune uveoretinitis. Clin Exp Immunol 159(3): 303-314
Czermak BJ, Sarma V, Pierson CL, Warner RL, Huber-Lang M, Bless NM, Schmal H, Friedl HP, Ward PA (1999) Protective effects of C5a blockade in sepsis. Nat Med 5(7): 788-792
Damha MJ and Ogilvie KK, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, p. 81-114, Humana Press Inc. (1993)
Ehrnthaller C, Ignatius A, Gebhard F, Huber-Lang M (2011) New Insights of an Old Defense System: Structure, Function, and Clinical Relevance of the Complement System. Mol Med 17(3-4): 317-329
Farkas I, Baranyi L, Liposits ZS, Yamamoto T, Okada H (1998) Complement C5a anaphylatoxin fragment causes apoptosis in TGW neuroblastoma cells. Neuroscience 86(3): 903-911
Fernandez HN, Hugli TE (1978) Primary structural analysis of the polypeptide portion of human C5a anaphylatoxin. Polypeptide sequence determination and assignment of the oligosaccharide attachment site in C5a. J Biol Chem 253(19): 6955-6964
Flierl MA, Rittirsch D, Nadeau BA, Day DE, Zetoune FS, Sarma JV, Huber-Lang MS, Ward PA (2008) Functions of the complement components C3 and C5 during sepsis. FASEB J 22(10): 3483-3490
Fonseca MI, Ager RR, Chu SH, Yazan O, Sanderson SD, LaFerla FM, Taylor SM, Woodruff TM, Tenner AJ (2009) Treatment with a C5aR antagonist decreases pathology and enhances behavioral performance in murine models of Alzheimer's disease. J Immunol 183(2): 1375-1383
Gueler F, Rong S, Gwinner W, Mengel M, Brocker V, Schon S, Greten TF, Hawlisch H, Polakowski T, Schnatbaum K, Menne J, Haller H, Shushakova N (2008) Complement 5a receptor inhibition improves renal allograft survival. J Am Soc Nephrol 19(12): 2302-2312
Heller T, Hennecke M, Baumann U, Gessner JE, zu Vilsendorf AM, Baensch M, Boulay F, Kola A, Klos A, Bautsch W, Kohl J. (1999) Selection of a C5a receptor antagonist from phage libraries attenuating the inflammatory response in immune complex disease and ischemia/reperfusion injury. J Immunol 163(2):985-994.
Hillmen P, Muus P, Duhrsen U, Risitano AM, Schubert J, Luzzatto L, Schrezenmeier H, Szer J, Brodsky RA, Hill A, Socie G, Bessler M, Rollins SA, Bell L, Rother RP, Young NS (2007). Effect of the complement inhibitor eculizumab on thromboembolism in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood, 110(12):4123-8
Huber-Lang M, Sarma VJ, Lu KT, McGuire SR, Padgaonkar VA, Guo RF, Younkin EM, Kunkel RG, Ding J, Erickson R, Curnutte JT, Ward PA (2001) Role of C5a in multiorgan failure during sepsis. J Immunol 166(2): 1193-1199
Huber-Lang MS, Younkin EM, Sarma JV, McGuire SR, Lu KT, Guo RF, Padgaonkar VA, Curnutte JT, Erickson R, Ward PA (2002) Complement-induced impairment of innate immunity during sepsis. J Immunol 169(6): 3223-3231
Jacob A, Hack B, Bai T, Brorson JR, Quigg RJ, Alexander JJ (2010a) Inhibition of C5a receptor alleviates experimental CNS lupus. J Neuroimmunol 221(1-2):46-52
Jacob A, Hack B, Chiang E, Garcia JG, Quigg RJ, Alexander JJ (2010b) C5a alters blood-brain barrier integrity in experimental lupus. FASEB J 24(6):1682-8
Kambas K, Markiewski MM, Pneumatikos IA, Rafail SS, Theodorou V, Konstantonis D, Kourtzelis I, Doumas MN, Magotti P, Deangelis RA, Lambris JD, Ritis KD (2008) C5a and TNF-alpha up-regulate the expression of tissue factor in intra-alveolar neutrophils of patients with the acute respiratory distress syndrome. J Immunol 180(11): 7368-7375
Khan MA, Jiang X, Dhillon G, Beilke J, Holers VM, Atkinson C, Tomlinson S, Nicolls MR (2011) CD4+ T cells and complement independently mediate graft ischemia in the rejection of mouse orthotopic tracheal transplants. Circ Res 109(11): 1290-1301
Kirschfink M. (1997) Controlling the complement system in inflammation. Immunopharmacology 38(1-2):51-62.
Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, Ager RR, Reis ES, Kohl J (2009) The role of the anaphylatoxins in health and disease. Mol Immunol 46(14): 2753-2766
Klussmann S. (2006). "The Aptamer Handbook - Functional Oligonucleotides and their Applications." Edited by S. Klussmann. WILEY-VCH, Weinheim, Germany, ISBN 3-527-31059-2
Kohl J. (2001) Anaphylatoxins and infectious and non-infectious inflammatory diseases. Mol Immunol 38(2-3):175-187.
Kusser W (2000). J Biotechnol 74:27-38
Laudes IJ, Chu JC, Sikranth S, Huber-Lang M, Guo RF, Riedemann N, Sarma JV, Schmaier AH, Ward PA (2002) Anti-c5a ameliorates coagulation/fibrinolytic protein changes in a rat model of sepsis. Am J Pathol 160(5): 1867-1875
Lewis AG, Kohl G, Ma Q, Devarajan P, Kohl J. (2008) Pharmacological targeting of C5a receptors during organ preservation improves kidney graft survival. Clin Exp Immunol 153(1): 117-126.
Li K, Wang N, Peng Q, Lu B, Ma L, Lambris JD, Sacks S, Zhou W (2012) C5a/C5aR signaling is an important negative regulator of murine nature killer cell homeostasis and effector function. Immunobiology 217(11): 1146
Makrides SC. (1998) Therapeutic inhibition of the complement system. Pharmacol Rev 50(1):59-87.
Manderson AP, Botto M, Walport MJ. (2004) The role of complement in the development of systemic lupus erythematosus. Annu Rev Immunol 22: 431-456
Markiewski MM, DeAngelis RA, Benencia F, Ricklin-Lichtsteiner SK, Koutoulaki A, Gerard C, Coukos G, Lambris JD (2008) Modulation of the antitumor immune response by complement. Nat Immunol.(11):1225-35
McGinnis S, Madden TL (2004) BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32(Web Server issue):W20-5.
Min X, Wei L, Li Z, Sacks S, Zhou W, Li K (2012) Negative regulation of human nature killer cells by complement. Immunobiology 217(11): 1189
Muller-Ladner U, Jones JL, Wetsel RA, Gay S, Raine CS, Barnum SR. (1996) Enhanced expression of chemotactic receptors in multiple sclerosis lesions. J Neurol Sci 144(1-2):135-141.
Needleman & Wunsch (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 48(3):443-53.
Nozaki M, Raisler BJ, Sakurai E, Sarma JV, Barnum SR, Lambris JD, Chen Y, Zhang K, Ambati BK, Baffi JZ, Ambati J. (2006) Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proc Natl Acad Sci U S A 103(7): 2328-2333
Ostrand-Rosenberg S (2008) Cancer and complement. Nat Biotechnol. 26(12):1348-9.
Patel SN, Berghout J, Lovegrove FE, Ayi K, Conroy A, Serghides L, Min-oo G, Gowda DC, Sarma JV, Rittirsch D, Ward PA, Liles WC, Gros P, Kain KC (2008) C5 deficiency and C5a or C5aR blockade protects against cerebral malaria. J Exp Med 205(5): 1133-1143
Pearson & Lipman (1988) Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444
Piccolo MT, Wang Y, Sannomiya P, Piccolo NS, Piccolo MS, Hugli TE, Ward PA, Till GO. (1999) Chemotactic mediator requirements in lung injury following skin burns in rats. Exp Mol Pathol 66(3):220-226.
Ricklin D, Lambris JD. (2007) Complement-targeted therapeutics. Nat Biotechnol 25(11): 1265-1275
Riley RD, Sato H, Zhao ZQ, Thourani VH, Jordan JE, Fernandez AX, Ma XL, Hite DR, Rigel DF, Pellas TC, Peppard J, Bill KA, Lappe RW, Vinten-Johansen J. (2000) Recombinant human complement C5a receptor antagonist reduces infarct size after surgical revascularization. J Thorac Cardiovasc Surg 120(2):350-358.
Rittirsch D, Flierl MA, Nadeau BA, Day DE, Huber-Lang M, Mackay CR, Zetoune FS, Gerard NP, Cianflone K, Kohl J, Gerard C, Sarma JV, Ward PA (2008) Functional roles for C5a receptors in sepsis. Nat Med 14(5): 551-557
Sim RB, Laich A. (2000) Serine proteases of the complement system. Biochem Soc Trans 28(5):545-550.
Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482
Sprong T, Brandtzaeg P, Fung M, Pharo AM, Hoiby EA, Michaelsen TE, Aase A, van der Meer JW, van Deuren M, Mollnes TE (2003) Inhibition of C5a-induced inflammation with preserved C5b-9-mediated bactericidal activity in a human whole blood model of meningococcal sepsis. Blood 102(10): 3702-3710
Tokodai K, Goto M, Inagaki A, Nakanishi W, Ogawa N, Satoh K, Kawagishi N, Sekiguchi S, Nilsson B, Okada N, Okada H, Satomi S (2010) Attenuation of cross-talk between the complement and coagulation cascades by C5a blockade improves early outcomes after intraportal islet transplantation. Transplantation 90(12): 1358-1365
van der Pals J, Koul S, Andersson P, Gotberg M, Ubachs JF, Kanski M, Arheden H, Olivecrona GK, Larsson B, Erlinge D (2010) Treatment with the C5a receptor antagonist ADC-1004 reduces myocardial infarction in a porcine ischemia-reperfusion model. BMC Cardiovasc Disord 10:45
Venkatesan N, Kim SJ, Kim BH (2003) Novel phosphoramidite building blocks in synthesis and applications toward modified oligonucleotides. Curr Med Chem 10(19): 1973-1991
Wagner E, Frank MM (2010) Therapeutic potential of complement modulation. Nat Rev Drug Discov 9(1): 43-56
Walport MJ. (2001a) Complement. First of two parts. N Engl J Med 344(14):1058-1066.
Walport MJ. (2001b) Complement. Second of two parts. N Engl J Med 344(15):1140-1144.
Wang Y. (2006) Complementary therapies for inflammation. Nat Biotechnol 24(10): 1224-1226
Ward PA (2010a) The harmful role of c5a on innate immunity in sepsis. J Innate Immun 2(5): 439-445
Ward PA (2010b) Role of C5 activation products in sepsis. ScientificWorldJournal 10: 2395-2402
Wincott F, DiRenzo A, Shaffer C, Grimm S, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C, Scaringe S, and Usman N (1995). Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribosomes. Nucleic Acids Res. 23:2677-2684.
Woodruff TM, Arumugam TV, Shiels IA, Reid RC, Fairlie DP, Taylor SM. (2003) A potent human C5a receptor antagonist protects against disease pathology in a rat model of inflammatory bowel disease. J Immunol 171(10):5514-5520.
Woodruff TM, Strachan AJ, Dryburgh N, Shiels IA, Reid RC, Fairlie DP, Taylor SM. (2002) Antiarthritic activity of an orally active C5a receptor antagonist against antigen-induced monarticular arthritis in the rat. Arthritis Rheum 46(9):2476-2485.
Yao YM, Redl H, Bahrami S, Schlag G. (1998) The inflammatory basis of trauma/shock-associated multiple organ failure. Inflamm Res 47(5): 201-210.
Zheng X, Zhang X, Feng B, Sun H, Suzuki M, Ichim T, Kubo N, Wong A, Min LR, Budohn ME, Garcia B, Jevnikar AM, Min WP (2008) Gene silencing of complement C5a receptor using siRNA for preventing ischemia/reperfusion injury. Am J Pathol 173(4): 973-980.
명세서, 청구범위, 서열 목록 및/또는 도면에 개시된 본 발명의 특징은 별도로 그리고 이들의 조합으로 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 자료일 수 있다.
<110> NOXXON Pharma AG <120> New C5a binding nucleic acids <130> N 10103 PCT <140> PCT/EP2013/000056 <141> 2013-01-10 <160> 94 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 1 gccugaugug guguugaagg guuguggggu gucgacgcac aggc 44 <210> 2 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 2 gccugaugug guguugaggg guuguggggu gucgacgcac aggc 44 <210> 3 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 3 gccugaugug guguugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 4 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 4 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 5 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 5 gccugaugug guggugaggg guuguggggu gucgacgcac aggc 44 <210> 6 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 6 gccugaugug guggugaggg gauguggggu gucgacgcac aggc 44 <210> 7 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 7 gccugaugug guguugaggg gcuguggggu gucgacgcac aggc 44 <210> 8 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 8 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 9 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 9 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 10 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 10 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 11 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 11 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 12 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 12 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 13 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 13 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 14 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 14 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 15 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 15 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 16 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 16 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 17 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 17 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 18 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 18 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 19 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 19 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 20 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 20 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 21 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 21 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 22 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 22 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 23 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 23 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 24 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 24 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 25 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 25 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 26 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 26 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 27 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 27 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 28 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 28 ccugaugugg uggugaaggg uuguugggug ucgacgcaca ggc 43 <210> 29 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 29 cugauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacag gc 42 <210> 30 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 30 ugauguggug gugaaggguu guuggguguc gacgcacagg c 41 <210> 31 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (36) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 31 gauguggugg ugaaggguug uugggugucg acgcacaggc 40 <210> 32 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 32 gcugaugugg uggugaaggg uuguugggug ucgacgcaca gc 42 <210> 33 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 33 gugauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacac 40 <210> 34 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 34 ugauguggug gugaaggguu guuggguguc gacgcaca 38 <210> 35 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 35 gccgaugugg uggugaaggg uuguugggug ucgacgcacg gc 42 <210> 36 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 36 ggcgaugugg uggugaaggg uuguugggug ucgacgcacg cc 42 <210> 37 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 37 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 38 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 38 cugauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacag c 41 <210> 39 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 39 ugauguggug gugaaggguu guuggguguc gacgcacagc 40 <210> 40 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 40 cgauguggug gugaaggguu guuggguguc gacgcacagc 40 <210> 41 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (36) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 41 gauguggugg ugaaggguug uugggugucg acgcacagc 39 <210> 42 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 42 gcugaugugg uggugaaggg uuguugggug ucgacgcaca c 41 <210> 43 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 43 gcugaugugg uggugaaggg uuguugggug ucgacgcacc 40 <210> 44 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (8) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 44 gcugaugugg uggugaaggg uuguugggug ucgacgcaca 40 <210> 45 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 45 cgauguggug gugaaggguu guuggguguc gacgcacgc 39 <210> 46 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (36) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 46 gauguggugg ugaaggguug uugggugucg acgcacgc 38 <210> 47 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 47 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacc 39 <210> 48 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 48 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcac 38 <210> 49 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 49 ggauguggug gugaaggguu guuggguguc gacgcacc 38 <210> 50 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 1 5 10 15 Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu 20 25 30 Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile 35 40 45 Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn 50 55 60 Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg 65 70 <210> 51 <211> 77 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 51 Asp Leu Gln Leu Leu His Gln Lys Val Glu Glu Gln Ala Ala Lys Tyr 1 5 10 15 Lys His Arg Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Arg Glu Asn 20 25 30 Lys Tyr Glu Thr Cys Glu Gln Arg Val Ala Arg Val Thr Ile Gly Pro 35 40 45 His Cys Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr Ile Ala Asp Lys Ile 50 55 60 Arg Lys Glu Ser His His Lys Gly Met Leu Leu Gly Arg 65 70 75 <210> 52 <211> 77 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Asn Leu His Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu Glu Gln Ala Ala Lys Tyr 1 5 10 15 Lys His Ser Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Arg Val Asn 20 25 30 Phe Tyr Glu Thr Cys Glu Glu Arg Val Ala Arg Val Thr Ile Gly Pro 35 40 45 Leu Cys Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr Ile Ala Asn Lys Ile 50 55 60 Arg Lys Glu Ser Pro His Lys Pro Val Gln Leu Gly Arg 65 70 75 <210> 53 <211> 999 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 1 5 10 15 Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu 20 25 30 Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile 35 40 45 Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn 50 55 60 Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu His Met Lys Thr Leu 65 70 75 80 Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr Phe Pro Glu Ser Trp 85 90 95 Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys Gln Leu Gln Phe Ala 100 105 110 Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln Gly Ile Gly Ile Ser 115 120 125 Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys Ala Lys Val Phe Lys 130 135 140 Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser Val Val Arg Gly Glu 145 150 155 160 Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr Arg Thr Ser Gly Met 165 170 175 Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly Ile Cys Thr Ser Glu 180 185 190 Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser Ser Lys Cys Val Arg 195 200 205 Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val Thr Phe Thr Val Leu 210 215 220 Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe Ser Leu Glu Thr Trp 225 230 235 240 Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg Val Val Pro Glu Gly 245 250 255 Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu Asp Pro Arg Gly Ile 260 265 270 Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro Tyr Arg Ile Pro Leu 275 280 285 Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile Leu Ser Val Lys Gly 290 295 300 Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu Ser Gln Glu Gly Ile 305 310 315 320 Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala Glu Ala Glu Leu Met 325 330 335 Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr Leu Glu Thr Gly Asn 340 345 350 His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile Glu Lys Gln Lys Leu 355 360 365 Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn 370 375 380 Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp 385 390 395 400 Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln Val Asn Lys Tyr Val 405 410 415 Glu Gln Asn Gln Asn Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu 420 425 430 Asn Tyr Gln Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln 435 440 445 Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser 450 455 460 Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp 465 470 475 480 Ile Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Asn 485 490 495 Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu Ala 500 505 510 Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro Gln Phe 515 520 525 Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val Lys Gly Asn 530 535 540 Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu Gln His Lys Asp Ser 545 550 555 560 Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val Glu Thr Thr Ala Tyr 565 570 575 Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp Ile Asn Tyr Val Asn Pro 580 585 590 Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr 595 600 605 Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser 610 615 620 Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg Leu Ser Met Asp Ile Asp Val Ser Tyr 625 630 635 640 Lys His Lys Gly Ala Leu His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe 645 650 655 Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Val Ser 660 665 670 Thr Gly Phe Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val 675 680 685 His Lys Thr Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile 690 695 700 Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser 705 710 715 720 Asp Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Arg Glu 725 730 735 Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu Pro 740 745 750 Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val Glu Gly 755 760 765 Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly His Val Ile 770 775 780 Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu Cys Val Arg Phe 785 790 795 800 Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu Ser Pro Ala Thr Phe 805 810 815 Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys Gln Cys Thr Met Phe Tyr 820 825 830 Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys Val Cys Glu Gly Ala Ala Cys 835 840 845 Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly Gln Met Gln Glu Glu Leu Asp Leu 850 855 860 Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gln Thr Ala Cys Lys Pro Glu Ile 865 870 875 880 Ala Tyr Ala Tyr Lys Val Ser Ile Thr Ser Ile Thr Val Glu Asn Val 885 890 895 Phe Val Lys Tyr Lys Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu 900 905 910 Ala Val Ala Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys Lys Val Thr 915 920 925 Cys Thr Asn Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu Ile Met Gly 930 935 940 Lys Glu Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Ile Tyr 945 950 955 960 Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg Asp Thr Thr 965 970 975 Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala Glu 980 985 990 Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 995 <210> 54 <211> 74 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 54 Met Leu Gln Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Leu 1 5 10 15 Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Val Arg Ile Asn His Asp Glu 20 25 30 Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Val Gly Pro Arg Cys Val 35 40 45 Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn 50 55 60 Asn Ser His Lys Asp Leu Gln Leu Gly Arg 65 70 <210> 55 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 56 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 56 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 57 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 57 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 58 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 58 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 59 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 59 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 60 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 60 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 61 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is G or dG <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is A or dA <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n is U or dU <400> 61 augnggugku nnrggghugu kgggngncga cgca 34 <210> 62 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is G or dG <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is A or dA <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n is U or dU <400> 62 augngguguu nnaggguugu ggggngncga cgca 34 <210> 63 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is G or dG <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is A or dA <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n is U or dU <400> 63 augngguguu nngggguugu ggggngncga cgca 34 <210> 64 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is G or dG <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is A or dA <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n is U or dU <400> 64 augngguguu nnaggguugu ugggngncga cgca 34 <210> 65 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is G or dG <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is A or dA <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n is U or dU <400> 65 augngguggu nnaggguugu ugggngncga cgca 34 <210> 66 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is G or dG <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is A or dA <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n is U or dU <400> 66 augngguggu nngggguugu ggggngncga cgca 34 <210> 67 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is G or dG <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is A or dA <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n is U or dU <400> 67 augngguggu nnggggaugu ggggngncga cgca 34 <210> 68 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is G or dG <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is A or dA <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is U or dU <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n is U or dU <400> 68 augngguguu nnggggcugu ggggngncga cgca 34 <210> 69 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <400> 69 auguggugku garggghugu kgggugucga cgca 34 <210> 70 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <400> 70 augugguguu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 71 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <400> 71 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 72 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <400> 72 augugguggu gagggguugu ggggugucga cgca 34 <210> 73 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 73 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 74 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 74 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 75 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 75 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 76 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 76 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 77 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 77 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 78 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 78 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 79 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 79 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 80 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 80 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 81 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 81 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 82 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 82 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 83 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 83 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 84 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 84 augugguggu gaaggguugu ugggugucga cgca 34 <210> 85 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> D-nucleic acid <400> 85 gccugaugug guguugaggg gcuguggggu gucgacgcac aggc 44 <210> 86 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> D-nucleic acid <400> 86 gccugaugug guguugaggg guuguggggu gucgacgcac aggc 44 <210> 87 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Polyethylene glycol (PEG) attached <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 87 cggacacgca gcuguggguu guugggaagu ggugguguag uccg 44 <210> 88 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Polyethylene glycol (PEG) attached <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 88 cgcacgcagc uguggguugu ugggaagugg ugguguagcg 40 <210> 89 <211> 74 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu Glu Gln Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 1 5 10 15 Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Arg Val Asn Phe Tyr Glu 20 25 30 Thr Cys Glu Glu Arg Val Ala Arg Val Thr Ile Gly Pro Leu Cys Ile 35 40 45 Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu 50 55 60 Ser Pro His Lys Pro Val Gln Leu Gly Arg 65 70 <210> 90 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Polyethylene glycol (PEG) attached <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-nucleic acid <400> 90 gccugaugug guggugaagg guuguugggu gucgacgcac aggc 44 <210> 91 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Polyethylene glycol (PEG) attached <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 91 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 92 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Polyethylene glycol (PEG) attached <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> Deoxyribonucleotide rather than ribonucleotide <400> 92 gcgauguggu ggugaagggu uguugggugu cgacgcacgc 40 <210> 93 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 1 5 10 15 Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu 20 25 30 Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile 35 40 45 Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn 50 55 60 Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly 65 70 <210> 94 <211> 76 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 94 Asn Leu His Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu Glu Gln Ala Ala Lys Tyr 1 5 10 15 Lys His Ser Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Arg Val Asn 20 25 30 Phe Tyr Glu Thr Cys Glu Glu Arg Val Ala Arg Val Thr Ile Gly Pro 35 40 45 Leu Cys Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr Ile Ala Asn Lys Ile 50 55 60 Arg Lys Glu Ser Pro His Lys Pro Val Gln Leu Gly 65 70 75

Claims (54)

  1. 인간 C5a 및 생쥐 C5a에 결합할 수 있는 L-핵산 분자로,
    상기 L-핵산 분자는 뉴클레오티드의 중앙 스트레치를 포함하고,
    상기 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
    5'　AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA　3' (서열 번호 61)을 포함하며,
    상기 뉴클레오티드 서열에서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU이고, G, A, U, C, H, K 및 R는 리보뉴클레오티드이며, dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인, L-핵산 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는
    a) 5'　AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' (서열 번호 62),
    b) 5'　AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' (서열 번호 63),
    c) 5'　AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA　3' (서열 번호 64),
    d) 5'　AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA　3' (서열 번호 65),
    e) 5'　AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' (서열 번호 66),
    f) 5'　AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' (서열 번호 67), 및
    g) 5'　AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA　3' (서열 번호 68)로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
    상기 뉴클레오티드 서열에서 n1은 U 또는 dU, n2는 G 또는 dG, n3은 A 또는 dA, n4는 U 또는 dU, n5는 U 또는 dU 이고, G, A, U 및 C는 리보뉴클레오티드이며, dU, dG 및 dA는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인, L-핵산 분자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 리보뉴클레오티드 및 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 구성되는, L-핵산 분자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 중앙 스트레치는 리보뉴클레오티드로 구성되는, L-핵산 분자.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치, 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치를 5'→ 3' 방향으로 포함하고,
    상기 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 1개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 1개 내지 5 개의 뉴클레오티드를 포함하는, L-핵산 분자.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 3개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 3개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하는, L-핵산 분자.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 3 개의 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 3 개의 뉴클레오티드를 포함하는, L-핵산 분자.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 제 1 말단 스트레치는 5'　Z1Z2Z3Z4G　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드의 제 2 말단 스트레치는 5'　Z5Z6Z7Z8Z9　3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
    상기 뉴클레오티드 서열에서 Z1은 G 또는 존재하지 않거나, Z2는 S 또는 존재하지 않거나, Z3은 S 또는 존재하지 않거나, Z4는 B 또는 존재하지 않거나, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V 또는 존재하지 않거나, Z7은 S 또는 존재하지 않거나, Z8은 S 또는 존재하지 않거나, Z9는 C 또는 존재하지 않으며, G, S, B, C, V는 리보뉴클레오티드이고, dC는 2'-데옥시리보뉴클레오티드인, L-핵산 분자.
  9. 제 8 항에 있어서,
    a) Z1은 G, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 C, 또는
    b) Z1은 존재하지 않고, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    c) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않고, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    d) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 존재하지 않고, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않고, Z8은 존재하지 않고, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    e) Z1은 존재하지 않고, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 C, 또는
    f) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 C, 또는
    g) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 존재하지 않고, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 C, 또는
    h) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 존재하지 않고, Z4는 존재하지 않고, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 C, 또는
    i) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    j) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 존재하지 않고, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    k) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 존재하지 않고, Z4는 존재하지 않고, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 S, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    l) Z1은 존재하지 않고, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않고, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    m) Z1은 존재하지 않고, Z2는 S, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않고, Z8은 존재하지 않고, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    n) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 존재하지 않고, Z4는 존재하지 않고, Z5는 C, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않고, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    o) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 존재하지 않고, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 S, Z8은 존재하지 않고, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    p) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 V, Z7은 존재하지 않고, Z8은 존재하지 않고, 및 Z9는 존재하지 않고, 또는
    q) Z1은 존재하지 않고, Z2는 존재하지 않고, Z3은 S, Z4는 B, Z5는 C 또는 dC, Z6은 존재하지 않고, Z7은 존재하지 않고, Z8은 존재하지 않고, 및 Z9는 존재하지 않는, L-핵산 분자.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 90으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 90으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 L-핵산 분자와 85% 이상의 상동성을 갖는 L-핵산 분자, 또는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 90으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 L-핵산 분자와 상동인 L-핵산 분자를 포함하며, 상기 상동성은 85% 이상인, L-핵산 분자.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 서열 번호 14, 서열 번호 21, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 37, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 91 및 서열 번호 92로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호 14, 서열 번호 21, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 37, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 91 및 서열 번호 92로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 L-핵산 분자와 85% 이상의 상동성을 갖는 L-핵산 분자, 또는 서열 번호 14, 서열 번호 21, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 37, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 91 및 서열 번호 92로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 L-핵산 분자와 상동인 L-핵산 분자를 포함하며, 상기 상동성은 85% 이상인, L-핵산 분자.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 L-핵산은 인간 C5a, 생쥐 C5a, 또는 이들의 혼합물에 의해 매개되는 활성의 길항제인, L-핵산 분자.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 변형기(modification group)를 포함하며, 유기체 유래의 상기 변형기를 포함하는 상기 L-핵산 분자의 배설율(excretion rate)은 상기 변형기를 포함하지 않는 L-핵산에 비해 감소되는, L-핵산 분자.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 L-핵산 분자는 변형기(modification group)를 포함하며, 상기 변형기를 포함하는 상기 L-핵산 분자는 상기 변형기를 포함하지 않는 L-핵산 분자에 비해 유기체에서의 증가된 체류 시간(retention time)을 갖는, L-핵산 분자.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 변형기는 생분해성 및 비생분해성 변형으로 이루어진 군에서 선택되는, L-핵산 분자.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 변형기는 폴리에틸렌 글리콜, 선형 폴리에틸렌 글리콜, 분기된 폴리에틸렌 글리콜, 히드록시에틸 전분, 펩타이드, 단백질, 다당류, 스테롤, 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시아미데이트 및 폴리(2-히드록시에틸)-L-글루타민으로 이루어진 군에서 선택되는, L-핵산 분자.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 L-핵산 분자를 포함하는, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 안질환, 국소빈혈/재관류 손상, 지연 이식 기능, 이식 거부, 심혈관계 질환, 호흡기 질환, 전염병, 신경 질환, 신경퇴행성 질환, 섬유증 질환, 혈액 질환, 대사 질환 및 종양으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 전신성 염증 반응 증후군은 패혈증 및 정신적 외상 또는 중화상의 이차 손상으로 이루어진 군에서 선택되는, 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
  21. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자 및 추가 성분을 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 추가 성분은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 약학적으로 활성인 제제(agent)로 이루어진 군에서 선택되고, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 안질환, 국소빈혈/재관류 손상, 지연 이식 기능, 이식 거부, 심혈관계 질환, 호흡기 질환, 전염병, 신경 질환, 신경퇴행성 질환, 섬유증 질환, 혈액 질환, 대사 질환 및 종양으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 L-핵산 분자를 포함하는, 약제 제조용 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 L-핵산 분자를 포함하는, 진단 수단 제조용 조성물.
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 약제는 자가 면역 질환, 염증성 질환, 전신성 염증 반응 증후군, 안 질환, 국소빈혈/재관류 손상, 지연 이식 기능, 이식 거부, 심혈관계 질환, 호흡기 질환, 급성 반응, 전염병, 신경 질환, 신경퇴행성 질환, 섬유증 질환, 혈액 질환, 대사 질환, 종양 및 생체재료에 의한 보체 활성화와 관련된 임상 합병증의 치료 또는 예방을 위한 것인, 약제 제조용 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 전신성 염증 반응 증후군은 패혈증 및 정신적 외상 또는 중화상의 이차 손상으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인, 약제 제조용 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 L-핵산 분자 및 C5a를 포함하는 복합체로, 상기 복합체는 결정성 복합체(crystalline complex)인, 복합체.
  27. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 L-핵산 분자를 포함하는, C5a 검출용 조성물.
  28. C5a에 의해 매개되는 활성의 길항제의 스크리닝을 위한 방법으로,
    C5a에 의해 매개되는 활성의 후보 길항제를 제공하는 단계;
    제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자를 제공하는 단계;
    C5a에 의해 매개되는 활성의 길항제의 존재 하에 신호를 제공하는 테스트 시스템을 제공하는 단계; 및
    C5a에 의해 매개되는 활성의 상기 후보 길항제가 C5a에 의해 매개되는 활성의 길항제인지 여부를 결정하는 단계;를 포함하는, 방법.
  29. C5a의 검출을 위한 키트로,
    제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 L-핵산 분자; 및 지시 리플릿 또는 반응 용기;를 포함하는, 키트.
  30. 샘플에서 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산의 검출을 위한 방법으로,
    a) 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자의 제 1 부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 캡처 프로브 및 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자의 제 2 부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 검출 프로브; 또는 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자의 제 2 부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 캡처 프로브 및 제 1 항 내지 제 16항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자의 제 1 부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 검출 프로브를 제공하는 단계;
    b) 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자를 포함하거나, 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자를 포함하는 것으로 추정되는 샘플에 상기 캡처 프로브 및 상기 검출 프로브를 별도로 또는 함께 첨가하는 단계;
    c) 상기 캡처 프로브 및 상기 검출 프로브가 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 L-핵산 분자 또는 이의 일부와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 반응하도록 하는 단계;
    d) 상기 캡처 프로브가 단계 a)에서 제공된 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 상기 L-핵산 분자에 혼성화되는지 여부를 검출하는 단계; 및
    e) 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의된 상기 L-핵산 분자, 상기 캡처 프로브 및 상기 검출 프로브로 구성되는, 단계 c)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계;를 포함하는, 방법.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
KR1020147022321A 2012-01-10 2013-01-10 새로운 C5a 결합 핵산 Active KR102034203B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPPCT/EP2012/000089 2012-01-10
EP12000106.0 2012-01-10
EP12000106 2012-01-10
PCT/EP2012/000089 WO2012095303A1 (en) 2011-01-10 2012-01-10 Nucleic acid molecule having binding affinity to a target molecule and a method for generating the same
EP12006960.4 2012-10-08
EP12006960 2012-10-08
PCT/EP2013/000056 WO2013104540A1 (en) 2012-01-10 2013-01-10 New c5a binding nucleic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140111703A KR20140111703A (ko) 2014-09-19
KR102034203B1 true KR102034203B1 (ko) 2019-10-18

Family

ID=48781063

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147022321A Active KR102034203B1 (ko) 2012-01-10 2013-01-10 새로운 C5a 결합 핵산

Country Status (18)

Country Link
US (4) US9518265B2 (ko)
EP (1) EP2802660B1 (ko)
JP (1) JP6415327B2 (ko)
KR (1) KR102034203B1 (ko)
CN (1) CN104145018B (ko)
AU (2) AU2013209131A1 (ko)
BR (1) BR112014016877B1 (ko)
CA (1) CA2860806C (ko)
DK (1) DK2802660T3 (ko)
ES (1) ES2786007T3 (ko)
IL (1) IL233516B (ko)
IN (1) IN2014DN05665A (ko)
MX (1) MX362061B (ko)
PL (1) PL2802660T3 (ko)
PT (1) PT2802660T (ko)
RU (1) RU2645261C2 (ko)
SG (2) SG11201403771SA (ko)
WO (1) WO2013104540A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3733868A3 (en) 2013-10-28 2021-01-13 DOTS Technology Corp. Allergen detection
WO2015103438A2 (en) 2014-01-02 2015-07-09 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
US11172873B2 (en) 2018-05-17 2021-11-16 The Procter & Gamble Company Systems and methods for hair analysis
WO2019222340A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 The Procter & Gamble Company Systems and methods for hair coverage analysis
EP3586865A1 (en) * 2018-06-21 2020-01-01 Charité - Universitätsmedizin Berlin Complement anaphylatoxin binders and their use in treatment of a subject having an ocular wound and/or fibrosis
EP3814504A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 The Procter & Gamble Company Aptamers for personal care applications
MX2021005525A (es) * 2018-11-12 2021-06-18 Aptarion Biotech Ag Acidos nucleicos que se enlazan a la cxcl8.
US11806419B2 (en) 2019-04-16 2023-11-07 The Procter & Gamble Company Aptamers for odor control applications
US12039732B2 (en) 2021-04-14 2024-07-16 The Procter & Gamble Company Digital imaging and learning systems and methods for analyzing pixel data of a scalp region of a users scalp to generate one or more user-specific scalp classifications
CN113150106B (zh) * 2021-04-26 2022-08-16 华中农业大学 来源于补体成分C5a的抗菌肽及其应用

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6140490A (en) 1996-02-01 2000-10-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US6395888B1 (en) 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6395029B1 (en) 1999-01-19 2002-05-28 The Children's Hospital Of Philadelphia Sustained delivery of polyionic bioactive agents
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
EP1306382A1 (de) 2001-10-26 2003-05-02 Noxxon Pharma AG Modifizierte L-Nukleinsäure
DK1438321T5 (da) 2001-10-26 2011-02-21 Noxxon Pharma Ag Modificeret L-nukleinsyre
EP2138575B8 (en) 2002-02-20 2013-07-24 Mersana Therapeutics, Inc. Conjugates comprising a biodegradable polymer and uses therefor
US7595304B2 (en) 2003-04-13 2009-09-29 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric oligonucleotide prodrugs
GB0314472D0 (en) 2003-06-20 2003-07-23 Warwick Effect Polymers Ltd Polymer
US20070116710A1 (en) 2004-02-03 2007-05-24 Leonard Bell Methods of treating hemolytic anemia
JP5193468B2 (ja) 2004-02-09 2013-05-08 ノクソン・フアルマ・アクチエンゲゼルシヤフト 多糖とポリヌクレオチドの複合体を製造する方法
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
SI2860251T1 (en) 2004-02-12 2018-07-31 Archemix Llc Aptameric therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
ES2741524T3 (es) 2004-03-23 2020-02-11 Ascendis Pharma Gmbh Profármaco polimérico con un enlazador autoinmolador
CN101098703B (zh) 2004-11-05 2011-08-03 费城儿童医院 用于分子治疗的生物降解连接剂
BRPI0606647A2 (pt) * 2005-01-17 2009-07-14 Jerini Ag antagonistas do receptor de c5a
RU2477137C2 (ru) 2006-03-08 2013-03-10 АРКЕМИКС Эл Эл Си Связывающие комплемент аптамеры и средства против с5, пригодные для лечения глазных нарушений
CN101534643A (zh) 2006-09-15 2009-09-16 安佐制药股份有限公司 用于递送寡核苷酸的基于位阻酯的生物可降解连接体
WO2008052774A2 (en) 2006-10-31 2008-05-08 Noxxon Pharma Ag Methods for detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
CN101809154A (zh) 2007-09-24 2010-08-18 诺松制药股份公司 C5a结合核酸
CN102421350B (zh) 2009-03-11 2014-12-17 奥林巴斯医疗株式会社 图像处理系统、其外部装置及其图像处理方法
WO2010108657A2 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Noxxon Pharma Ag C5a binding nucleic acids and the use thereof
WO2011131371A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Noxxon Pharma Ag Lipid binding nucleic acids
US9976145B2 (en) * 2011-01-10 2018-05-22 Noxxon Pharma Ag Nucleic acid molecule having binding affinity to a target molecule and a method for generating the same
SG11201401362TA (en) 2011-10-21 2014-05-29 Noxxon Pharma Ag Glucagon binding nucleic acids
KR20140111704A (ko) 2012-01-10 2014-09-19 녹손 파르마 아게 Cgrp에 특이적으로 결합하는 핵산

Also Published As

Publication number Publication date
PL2802660T3 (pl) 2020-07-27
CA2860806A1 (en) 2013-07-18
MX2014008454A (es) 2015-02-05
HK1198371A1 (en) 2015-04-10
PT2802660T (pt) 2020-04-21
BR112014016877B1 (pt) 2022-03-15
EP2802660A1 (en) 2014-11-19
US20210163946A1 (en) 2021-06-03
US20180223285A1 (en) 2018-08-09
EP2802660B1 (en) 2020-02-19
IN2014DN05665A (ko) 2015-05-15
MX362061B (es) 2019-01-07
US9518265B2 (en) 2016-12-13
US20140364487A1 (en) 2014-12-11
SG11201403771SA (en) 2014-07-30
RU2014132708A (ru) 2016-02-27
RU2645261C2 (ru) 2018-02-19
AU2013209131A1 (en) 2014-07-10
IL233516A0 (en) 2014-08-31
US12188021B2 (en) 2025-01-07
IL233516B (en) 2018-07-31
KR20140111703A (ko) 2014-09-19
CN104145018A (zh) 2014-11-12
CN104145018B (zh) 2019-05-10
SG10201605594UA (en) 2016-09-29
US11492625B2 (en) 2022-11-08
US10590424B2 (en) 2020-03-17
AU2018271388A1 (en) 2018-12-20
WO2013104540A1 (en) 2013-07-18
JP6415327B2 (ja) 2018-10-31
DK2802660T3 (da) 2020-05-18
US20240384275A1 (en) 2024-11-21
AU2018271388B2 (en) 2021-03-11
BR112014016877A2 (pt) 2019-10-29
ES2786007T3 (es) 2020-10-08
CA2860806C (en) 2020-10-20
JP2015509705A (ja) 2015-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12188021B2 (en) C5a binding nucleic acids
JP5798320B2 (ja) Ｃ５ａに結合する核酸
CA2620582A1 (en) Methods of altering an immune response induced by cpg oligodeoxynucleotides
KR20220155301A (ko) 보체 억제를 위한 rna
US20120065254A1 (en) C5A binding nucleic acids and the use thereof
JP2020059698A (ja) 腎障害治療の手段および方法
AU2022202115A1 (en) Complement binding aptamers and anti-C5 agents useful in the treatment of ocular disorders
HK1198371B (en) New c5a binding nucleic acids
AU2016204713B2 (en) Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders
HK1146296A (en) C5a binding nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20140808

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20180110

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20190116

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20190815

N231 Notification of change of applicant
PN2301 Change of applicant

Patent event date: 20191007

Comment text: Notification of Change of Applicant

Patent event code: PN23011R01D

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20191014

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20191014

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220915

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230919

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20240919

Start annual number: 6

End annual number: 6