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KR102028225B1 - 생체분자 분리 - Google Patents

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KR102028225B1
KR102028225B1 KR1020147022894A KR20147022894A KR102028225B1 KR 102028225 B1 KR102028225 B1 KR 102028225B1 KR 1020147022894 A KR1020147022894 A KR 1020147022894A KR 20147022894 A KR20147022894 A KR 20147022894A KR 102028225 B1 KR102028225 B1 KR 102028225B1
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키어런 쿠란
데이비드 맥과이어
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젠셀 바이오시스템즈 리미티드
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Abstract

시료 액체, 캡슐화 액체 및 자성 입자를 처리하기 위한 방법, 장치 및 시스템이 개시된다.

Description

생체분자 분리{Biomolecule isolation}
관련 출원
본 출원은 2012년 1월 25일 출원되고 그의 전체내용이 본원에 참고로 원용되는 미국 임시 출원 제61/590,499호의 이점을 청구한다.
생체분자의 분리는 임의 시료 처리 시스템의 핵심 부분이다. 자동 분자 분석 시스템의 개발로, 이제 가장 큰 제한은 시료의 제조 및 표적 시료의 정제가 되었다.
모든 생화학 처리에 있어서 시료 표적의 분리 및 정제는 그의 성공을 위해 중요하다. 파이로시퀀싱, 핵산 리게이션, 폴리머라제 연쇄반응, 디지탈 PCR, qPCR, 핵산 시퀀싱, 단백질 검출/단백질 농축, 유전적 비드 코팅, 희귀 세포 검출 및 세포 농축을 예로 들 수 있지만 이들로만 한정되지 않는 생화학 분석 처리에서 제한은 표적의 출발 농도 및 분석에 사용된 반응 시료내에 존재하는 생화학 억제제의 수준 때문이다.
대부분의 생화학 분석에서는, 초기 시료로부터 표적을 분리하고, 생화학 억제제를 제거하기 위해 일련의 사전 분석 단계가 시료에서 행해진다. 이들 단계는 전형적으로 노동 집약적이고 결국에는 표적의 출발 농도를 감소시키게 된다.
현재 시료 정제를 위해 바람직한 방법은 스핀 컬럼을 사용하는 것이다. 그러나, 스핀 컬럼은 다수의 원심분리 단계를 필요로 하고 따라서 자동 DNA 라이브러리 제조 플랫폼과 통합될 수 없다. 유사하게, 아가로스겔로부터 핵산 단편을 정제하기 위한 정제 기술 역시 핵산 분리를 위해 원심분리 단계를 필요로 한다.
시료 정제를 위한 한가지 기술은 상자성 비드-기반 정제이다. 이 방법은 개선된 DNA 회수율 및 특이적 DNA 단편 크기에 선택적으로 결합시키기 위해 사용될 수 있는 조정가능한 버퍼 상태를 제공할 수 있는 방식을 제공한다.
상자성 비드 기반 정제는 정적 웰 배치 처리이다. 현재의 방법은 비드-혼합물 - 상자성 비드 및 버퍼 -를 초기 시료와 함께 마이크로타이터 플레이트의 웰로 피펫팅하는 것을 포함한다. 용액을 피펫팅하고 혼합한 후, 실온에서 인큐베이션하여 DNA가 비드에 결합하도록 한다. 이어, 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트에 놓는다. 결합된 DNA를 가지고 있는 비드는 플레이트 끝으로 이동하고, 자석에 의해 고정된다. 그 다음, 상등액(폐물 함유)을 피펫으로 제거하고 버린다. 이 후, 수회의 세척 단계를 행하여 비드 펠렛 위/에 존재하는 잔류 폐물을 제거한다. 에탄올을 비드 펠렛을 함유한 플레이트에 피펫팅하여 인큐베이션한 뒤, 피펫으로 제거한다. 이 세척 단계를 2회 반복한다. 이어서 용출 버퍼를 첨가한다. 자성 플레이트에서 플레이트를 제거하고, 용출 버퍼를 피펫 혼합으로 혼합한다. 마이크로타이터 플레이트를 자성 플레이트 상에 다시 위치시킨다. 정제된 DNA를 함유하는 용리액을 피펫으로 빼낸다.
상자성 비드 기반 프로토콜은 노동 집약적 처리이고 상당수의 피펫팅 단계가 필요하기 때문에, 자동화가 용이치 않다. 많은 수의 피펫팅 단계는 또한 초기 및 최종 시료 부피를 증가시켜 측정값 당 높은 시약 비용을 초래한다.
한가지 적용 예를 들자면 차세대 시퀀싱 플랫폼을 위한 개선된 시료 정제를 위한 것이 있지만, 이에 제한되지 않는다. 많은 차세대 시퀀싱 플랫폼은 특정 염기쌍 길이 범위 내 DNA 단편으로 이루어진 DNA 라이브러리를 필요로 한다. 또한, 이들 DNA 단편은 시퀀스가 PCR을 사용하여 증폭되고 라이브러리 단편이 시퀀서 유동 세포에 어닐링되도록 특이적 뉴클레오티드 시퀀스(어댑터)로 태깅되어야 한다. 단일 유동 세포 내에서 시료를 복합화하는 경우 개별 시료를 확인하기 위해 시퀀스 특이적 인덱스가 또한 DNA 단편에 첨가될 수 있다. DNA의 태그먼트화(DNA는 단편화되고 어댑터로 태깅된다) 및 공통 어댑터 및 인덱스의 첨가는 두가지 별도의 생물학적 반응으로 이뤄진다. 이들 반응 후, DNA 라이브러리를 정화하여 과량의 뉴클레오티드, 효소, 프라이머, 염 및 기타 오염물들을 제거한다. 따라서, DNA를 태그먼트화하고, 태그먼트화된 DNA를 정제하고, 공통 어댑터 및 인덱스를 첨가하고, 최종 라이브러리 산물을 정제하기 위해 필요한 작업흐름은 복잡하고 노동 집약적이다.
본원에 개시된 시스템 및 방법은 무오염, 저부피, 고처리량, 저비용 및/또는 고 시료 농도라는 시료 처리의 달성을 도울 수 있다.
개요
생체분자 분리 및 처리에 상자성 비드를 사용하기 위한 장치, 시스템 및 방법
도 1은 연속 유동 모세관-기반 정제 시스템을 나타내는 도면이다.
도 2는 양방향 유동 모세관-기반 정제 시스템을 나타내는 도면이다.
도 3은 연속 유동 모세관-기반 정제 시스템에 대한 자성 정화 단계를 나타내는 도면이다.
도 4는 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 방법을 나타낸다.
도 5는 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 방법을 나타낸다.
도 6은 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 방법을 나타낸다.
도 7은 대조 프로토콜과 모세관 정화 프로토콜 간의 비교할 만한 회수율을 보여주는 분광광도법 결과를 나타낸다. 회수/용출된 DNA(액틴-베타 앰플리콘)의 농도가 대조 비드-기반 정제 및 모세관 비드-기반 정제에 대해 플롯팅되었다.
도 8은 대조 정화 및 모세관 정화에 대한 넥스테라(Nextera) 산물 얼룩(smear)을 나타내는 겔 이미지이다.
도 9는 대조 프로토콜 및 모세관 정화 프로토콜로부터 회수된 넥스테라 산물을 보여주는 qPCR 결과이다.
도 10은 모세관에서 비드-기반 정제를 사용하여 회수된 285bp 앰플리콘을 확인한 겔 결과를 나타낸다. 비정제 산물(레인 102, 103)과 정제된 산물(레인 104, 105)을 비교할 때, 프라이머 다이머와 같은 비특이적 산물이 성공적으로 제거되었음이 분명하다(레인 101은 사다리꼴이다).
도 11은 모세관 오염 제거의 qPCR 결과를 나타낸다 - 재사용가능성 예.
도 12는 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 방법을 나타낸다.
도 13은 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 방법을 나타낸다.
도 14는 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는, 광학 분석과 결합된 세포 농축의 방법을 나타낸다.
도 15는 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 세포 농축의 방법을 나타낸다.
도 16은 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 상자성 비드의 기능화 방법을 나타낸다.
도 17은 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 사용된 상자성 비드의 세정 및 제거 방법을 나타낸다.
도 18은 제어기 프로그래밍으로서 구현될 수 있는 복합 액체 세포(composite liquid cell) 기술과의 상호작용을 나타낸다.
상세한 설명
본 개시내용은 일부 실시양태에서, 도관 내에서 생체분자의 분리를 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 도관은 양 방향으로의 유동을 가질 수 있으며, 제어기로 제어된다.
일 실시양태에 있어서, 도 1A를 참조로, 상자성 비드 및 시료를 함유하는 슬러그 (2)와 비혼화성 유체 버퍼 (3)가 도관 (1) 내에서 유동한다. 시료는 표적 생체분자, 생화학 처리 억제제 및 오염물을 포함할 수 있다. 도관은 길이를 따른 한 구역에 자기장을 발생하기 위한 발생원 (4)를 가진다. 도 1B를 참조로, 상자성 비드 및 시료 슬러그 (2)와 용출 버퍼 슬러그 (5)가 비혼화성 유체 (3)으로 분리된다. 상자성 비드 및 시료 슬러그 (2)는 자기장 원(source) (4)에 도달하고, 그에 의해 비드가 자기장 내에 포획된다. 도 1C를 참조로, 상자성 비드 및 시료 슬러그 (2)는 도관 (1) 내에서 계속 유동하고 이동안 결합된 표적 생체분자를 가지는 상자성 비드 (6)은 자기장 원에 의해 포획된 채로 남는다. 도 1D를 참조로, 용출 버퍼 (5)가 자기장 원에 도달하여 포획된 상자성 비드를 덮는다. 도관 (1)을 따라 유동하는 동안 결합된 표적 생체분자가 용출 버퍼로 방출된다. 도 1E를 참조로, 용출 버퍼 및 표적 생체분자 (7)은 분배 또는 추가 분석을 위해 도관 (1) 내에 계속해서 있다.
일 실시양태에 있어서, 도 2A를 참조로, 도관 (20) 내 자기장 원 (22)에서 상자성 비드 (23)로부터 용출 버퍼 (24) 중 표적 생체분자가 분리된 뒤, 유동이 역전된다. 도 2C를 참조로, 용출 버퍼 및 표적 생체분자가 자기장 원 (22)에 의해 포획된 상자성 비드 (23) 위 유동에서 복귀하여 분배를 위해 원 흡입 위치로 돌아온다.
일 실시양태에 있어서, 도 3A를 참조로, 도관 (31) 내 자기장 원 (34)에 의해 포획된 상자성 비드 (35)로부터 용출 버퍼 (36) 중 표적 생체분자가 분리된 뒤, 비혼화성 유체 (33)에 이어 비드 제거 및 세정 슬러그 (32)가 따른다. 도 3B를 참조로, 비드 제거 및 세정 슬러그 (32)가 상자성 비드 (35)를 덮음으로서, 자기장 원 (34)가 제거된다(물리적으로 또는 오프 상태로 변경). 도 3C를 참조로, 상자성 비드 (35)가 제거 및 세정 슬러그 (32)에 반응하고, 슬러그 (37)로서 도관 (31)을 따라 계속해서 유동한다. 이러한 비드 제거 및 세정 처리로 도관 (31)의 재사용이 가능하고, 시료의 어떤 오염이 끼어드는 것도 막을 수 있다.
일 실시양태에 있어서, 방법은 모세관 튜브, 펌프 및 모세관 튜브의 길이를 따라 한 위치에 국소 자기장의 채용을 포함한다. 먼저, 표적 생체분자와 버퍼 및 생화학 코팅을 가진 비드를 포함하는 비드-혼합물의 제1 슬러그가 모세관 튜브로 유입된다. 비드는 생화학 코팅을 가진 자성 비드 또는 상자성 코팅을 가진 비자성 비드(실리카, 세라믹, 폴리머 등)일 수 있다. 이어서 비혼화성 유체, 예를 들면 공기 또는 오일이 유입된 후 에탄올, 공기, 오일 및 용출 버퍼의 개별 슬러그가 유입된다. 슬러그는 국소 자기장을 통과하는 튜브 내를 유동하는데, 여기서 상자성 비드가 자기장 내에 포획되고, 비드-혼합물 슬러그의 다른 성분들은 튜브를 따라 계속 유동하며, 상자성 비드로부터 모든 비결합된 분자가 제거된다. 다음으로, 슬러그의 연속 유동이 오일 또는 공기 슬러그를 제공하는데, 이는 비드-혼합물 슬러그와 에탄올 슬러그의 혼합을 방지하기 위한 버퍼로서 사용된다. 에탄올 슬러그는 상자성 비드에서 임의의 잔류 오염물을 정화한다. 이 정화 단계는 초기 슬러그 픽업 시퀀스의 프로토콜에 따라 반복될 수 있다. 에탄올 슬러그 통과 후, 용출 버퍼 슬러그와의 혼합으로부터 튜브를 따라 에탄올의 임의 미량 원소들을 방지하기 위해 용출 버퍼의 슬러그에 앞서 오일 버퍼가 통과된다. 이어서, 용출 버퍼가 상자성 비드 위로 유동하여 상자성 비드로부터 용출 버퍼 슬러그로 생체분자 표적을 방출한다. 슬러그는 추가 생물학적 처리 및 분석을 위해 튜브를 따라 계속해서 유동한다.
일 실시양태에 있어서, 용출 버퍼 슬러그가 상자성 비드 위를 통과한 뒤, 유동 방향이 역전되고, 표적 생체분자를 가지는 용출 버퍼가 시스템으로부터 방출된다.
일 실시양태에 있어서, 용출 버퍼 슬러그의 통과후, 자기장이 제거되고, 그 다음 에탄올의 슬러그가 상자성 비드를 모세관 튜브 내 유동으로 복귀시킨다. 이 슬러그 뒤에 오일 슬러그, 에탄올 슬러그 및 오일 슬러그가 모세관 튜브를 정화하고, 다음 슬러그 반응의 임의 오염을 예방한다.
일 실시양태에 있어서, 에탄올 슬러그에 이어 공기 슬러그가 항상 뒤따르는데; 이렇게 함으로써 시스템 내에 모든 에탄올이 확실히 제거되도록 해준다. 공기 슬러그는 에탄올을 공기로 증발하도록 한다.
생체분자의 예로서는 세포, 핵산, 단백질, 효소, 혈액, 타액 및 유기 물질이 포함되나, 이들에만 한정되는 것은 아니다.
비드-믹스는 전형적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 염을 포함하는 버퍼 용액중의 비드로 구성된다.
비드 크기는 전형적으로 0.1 내지 500 미크론의 범위이다.
비드는 자성이거나, 또는 자기 코팅이 적용된다.
비드 재료는 자기 코팅이 적용된 폴리머, 세라믹 또는 금속일 수 있다.
일 실시양태에 있어서, 비드는 세포가 부착되도록 기능화된다.
일 실시양태에 있어서, 비드는 핵산이 부착되도록 기능화된다.
일 실시양태에 있어서, 비드는 효소, 시약, 프라이머 또는 유기 물질이 부착되도록 기능화되거나, 제한된다.
비혼화성 상의 생성을 위해 사용되는 오일은 실리콘 오일, 과불화탄소 오일, 및 퍼플루오로폴리에테르 오일을 포함할 수 있으나, 이들에만 한정되지는 않는다.
용출 버퍼는 멸균수; 적용에 따라 pH를 목적 범위내로 유지하기 위해 pH 버퍼가 첨가된 멸균수를 포함할 수 있으나, 이들에만 한정되지는 않는다.
도관은 모세관 튜브일 수 있다.
도관 재료는 폴리머, 세라믹 또는 금속일 수 있다.
도관은 소수성 표면을 가질 수 있다.
도관은 폴리머 모세관 튜브, 예컨대 PTFE 물질 모세관 튜브일 수 있다.
도관 직경은 전형적으로 10 미크론 내지 10 밀리미터 직경 범위 내이다.
일 실시양태에 있어서, 도관은 벽 두께가 적어도 10 미크론 이상이다.
도관의 내부 형태는 원형, 정사각형, 타원형, 직사각형이고, 파형 표면을 가지거나, 적어도 하나의 평평한 표면을 가지거나, 또는 표면 강화 특징을 가지는 모양일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
도관 내 유동 속도는 전형적으로 0.00001 μL/시간 내지 1000 mL/분의 범위내이다.
도관의 외부 형태는 원형, 정사각형, 타원형, 직사각형이고, 파형 표면을 가지거나, 적어도 하나의 평평한 표면을 가지거나, 또는 표면 강화 특징을 가지는 모양일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시양태에 있어서, 도관은 기판상에 식각된 채널이다.
일 실시양태에 있어서, 도관은 칩상에 성형된 채널이다.
일 실시양태에 있어서, 도관은 칩 기반 분석 시스템에 통합된다.
적어도 하나 이상의 자기장이 도관의 길이를 따라 위치한다. 자기장은 영구 자석 또는 특정 전자석 방법으로 발생될 수 있다.
일 실시양태에 있어서, 자기장은 제어가능하고, 이들은 자석의 이동/제거 또는 전자기장의 탈에너지화/중화로 탈불활성화될 수 있다.
일 실시양태에 있어서, 자기장 원은 다중극을 발생하도록 도관 주변 둘레에 배열된다.
일 실시양태에 있어서, 자기장 원은 다중극을 발생하도록 도관 길이를 따라 배열된다.
일 실시양태에 있어서, 시스템을 통한 유동은 정압으로 발생된다.
일 실시양태에 있어서, 시스템을 통한 유동은 부압으로 발생된다.
일 실시양태에 있어서, 방법은 모세관 튜브의 길이를 따른 한 위치에 모세관 튜브, 펌프 및 국소 자기장의 채용을 포함한다. 먼저, 비드-혼합물(버퍼 및 생화학 코팅을 가지는 비드)의 슬러그가 모세관 튜브로 유입된다. 이어서 비혼화성 유체, 예를 들면, 공기 또는 오일의 슬러그가 유입된 후, 정제용 시료의 슬러그가 유입된다. 그 후, 추가 비혼화성 슬러그가 유입되고, 에탄올, 공기, 오일 및 용출 버퍼의 추가 개별 슬러그가 유입된다. 슬러그는 튜브 내에서 유동하여 국소 자기장을 통과하는데, 이때 상자성 비드가 자기장 내에 포획되는 반면, 비드-혼합물 슬러그의 다른 성분들은 튜브를 따라 계속 유동한다. 유동 속도 및 자기장은 생화학 처리가 수행되기에 충분한 체류 시간이 확보되도록 제어된다. 유체의 유동은 계속 도관을 따라가, 산물을 비드에 결합시키고, 상자성 비드로부터 결합되지 않은 모든 분자들을 제거한다. 슬러그의 연속 유동은 오일 또는 공기 슬러그를 제공하며, 이는 비드-혼합물, 에탄올 및 희석 버퍼 슬러그를 예로 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 수성 슬러그의 혼합을 방지하기 위한 버퍼로서 사용된다. 에탄올 슬러그는 상자성 비드에서 남은 모든 오염물을 정화한다. 이 정화 단계는 초기 슬러그 픽업 시퀀스의 프로토콜에 따라 반복될 수 있다. 에탄올 슬러그 통과 후, 용출 버퍼 슬러그와의 혼합으로 튜브를 따라 에탄올의 임의 미량 원소들을 방지하기 위해 용출 버퍼의 슬러그에 앞서 오일 버퍼가 통과된다. 이어서, 용출 버퍼가 상자성 비드 위로 유동하여 상자성 비드로부터 용출 버퍼 슬러그로 생체분자 표적을 방출한다. 슬러그는 추가 생물학적 처리 및 분석을 위해 튜브를 따라 계속해서 유동한다.
시스템에 유입된 슬러그는 비드-믹스; 오일; 용출 버퍼; 에탄올; 물; 공기; 시료; 생화학 믹스(시약, 효소 등), 비드 기능화 믹스; 글루코스; 버퍼; 첨가제; 광학 마커; 형광 마커; 및 세포를 포함할 수 있으나, 이들에만 한정되지는 않는다.
장치 내에 사용된 슬러그 시퀀스는 다음을 포함하나. 이들에만 한정되지는 않는다:
비드 믹스 및 시료 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 및 시료 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 및 시료 - 공기 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 및 시료 - 공기 - 에탄올 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 및 시료 - 오일 - 에탄올 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 및 시료 - 공기 - 에탄올 - 공기 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 및 시료 - 오일 - 에탄올 - 오일 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 및 시료 - 오일 - 에탄올 - 오일 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 생화학 믹스 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 - 오일 - 시료 - 오일 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 생화학 믹스 - 오일 - 용출 버퍼.
비드 믹스 - 오일 - 비드 기능화 혼합물 - 오일 - 현탁 버퍼
비드 믹스 - 오일 - 비드 기능화 혼합물 - 오일 - 시료 - 오일 - 에탄올 - 공기 - 오일 - 생화학 믹스 - 오일 - 용출 버퍼.
이들 시퀀스 및 기타의 것들은 시스템으로부터 비드 제거를 위한 추가 단계 (즉, 슬러그 통과)를 포함할 수 있다. 이 단계는 제어기 및 튜브를 따라 자기장에서의 교란(perturbation)을 이용하여 수행될 수 있다.
일 실시양태에 있어서, 광학 검출이 자기장 원에서 사용된다.
일 실시양태에 있어서, 광학 검출이 슬러그 분석을 위해 자기장 원의 상류에서 사용된다.
일 실시양태에 있어서, 광학 검출이 슬러그 분석을 위해 자기장 원의 하류에서 사용된다.
일 실시양태에 있어서, 모세관 튜브의 다중 평행 라인이 단일 자기장을 거쳐 사용된다.
일 실시양태에 있어서, 모세관 튜브의 다중 평행 라인이 다수의 국소 자기장을 거쳐 사용된다.
일 실시양태에 있어서, 도관의 적어도 하나 이상의 라인이 펌프 및 제어기를 갖춘 시스템으로의 통합을 위해 카세트에서 함께 조립된다.
일 실시양태에 있어서, 표적 분자를 함유한 용출 버퍼가 추가 생화학 처리 및 분석을 위해 복합 액체 세포에 분배된다.
일 실시양태에 있어서, 일회용 모세관 튜브가 사용된다. 이들 튜브는 각 시료 처리마다 교체된다.
일 실시양태에 있어서, 도관은 재사용가능하다.
일 실시양태에 있어서, 도관이 재사용되는 경우, 시스템의 오염제거와 정화를 위해 스팀이 시스템 내에 사용된다.
일 실시양태에 있어서, 도관이 재사용되는 경우, 시스템의 오염제거와 정화를 위해 표백제가 시스템 내에 사용된다.
일 실시양태에 있어서, 도관이 재사용되는 경우, 시스템의 오염제거와 정화를 위해 상업적 DNA 소화 효소가 시스템 내에 사용된다.
일부 실시양태는 상자성 비드 및 시료-유체 투입, 비혼화성 유체 투입, 용출 버퍼 투입, 유체 도관, 자기장 원, 액체 처리 시스템, 및 액체 처리 시스템 및 자기장 원에 작동가능하도록 연결된 제어기를 갖춘 시료 처리 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제어기는, (1) (a) 자기장 원을 지나고, (b) 여기서 상자성 비드 및 결합된 표적 생체분자가 포획되고, (c) 잔류 시료 함량이 자기장 원을 지나 슬러그 내에서 연속 유동하도록 상자성 비드 및 시료 슬러그의 인입; (2) 비혼화성 유체의 슬러그 인입; (3) (a) 자기장 원을 지나고, (d) 결합된 표적 생체분자가 자기장 내 상자성 비드로부터 용출 버퍼로 방출되고, (e) 분배 또는 추가 분석을 위해 슬러그가 도관 내에서 계속 유동하도록 용출 버퍼의 슬러그가 인입되게 프로그램화될 수 있다. 예시적인 유동도를 도 4-6, 12-18에 도시하였다.
일부 실시양태에서, 액체 처리 시스템은 도관 및 드라이버를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제어기는 도관이 단계 (1) 및 (2) 수행 후, 일반적으로 에탄올 슬러그인 정화 프로토콜용 슬러그를 인입하고, 단계 (3) 및 (4)를 수행할 수 있게 드라이버가 작동되도록 프로그램화될 수 있다(도 5). 일부 실시양태에서, 제어기는 또한 도관이 단계 (5) 후, 단계 (3) 전에 (6) 생화학 시약의 슬러그를 인입하게 드라이버가 작동되도록 프로그램화될 수 있다(도 6).
일부 실시양태에서, 자기장 원은 고정된 자석을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제어기는 단계 (1), (2), (3) 및 (4) 수행 후, (a) 자기장 원을 지난 슬러그를 인입하게 드라이버가 작동되도록 프로그램화될 수 있다(도 12). 일부 실시양태에서, 제어기는 도관이 (a) 작업이 수행되는 동안 단계 (1), (2), (5), (6), (3), 및 (4)가 수행되게 드라이버가 작동되도록 프로그램화될 수 있다(도 13).
일부 실시양태에서, 제어기는 도관이 자기장 원에서 (a) 및 (f) 광학 검출 작업이 수행되는 동안 (7) 상자성 비드의 슬러그를 인입하고, (8) 항체의 슬러그를 인입하고, (9) 생물학적 시료의 슬러그를 인입한 후, 단계 (3)이 수행되고 이어 단계 (4)가 수행되게 드라이버가 작동되도록 프로그램화될 수 있다(도 14). 일부 실시양태에서, 제어기는 작업 (f)를 수행하지 않을 수도 있다(도 15).
일부 실시양태에서, 자기장 원은 가변 상태의 자기장 원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제어기는 도관이 (a) 작업이 수행되는 동안 (10) 상자성 비드의 슬러그를 인입한 후, (11) 상자성 비드 기능화 믹스의 슬러그를 인입한 다음, (12) 상자성 비드 버퍼의 슬러그를 인입하고, 제어기가 (13) 버퍼 내에 기능화된 상자성 비드의 용량을 분배하기 전에 (f) 슬러그가 오프 상태에서 자기장 원을 지나 유동하도록 자기장 원의 상태를 변경하게 드라이버가 작동되도록 프로그램화될 수 있다(도 16).
일부 실시양태에서, 제어기는 (12) 상자성 비드 버퍼의 슬러그를 인입하고, (f) 수행을 위해 자기장 원을 변경하고, (14) 버퍼 용액 내에 사용된 상자성 비드의 일 부피를 분배하기 전에 단계 (5) 후 (6)이 수행되도록 하기 위해 (a) 작업이 수행되는 동안 단계 (4), (5) 및 (6)이 따르도록 추가로 프로그램화된다(도 17).
일부 실시양태에서, 제어기는 (15) 캡슐화 액체 투입으로부터 캡슐화 액체를 회수하고, 단계 (4) 전에, (16) 회수한 캡슐화 액체가 담체 액체의 자유 표면상으로 배출되어 안정화 특징에 근접하도록 추가로 프로그램화된다. 일부 실시양태에서, 제어기는 단계 (4) 대신 단계 (13) 또는 단계 (14)가 수행되도록 프로그램화될 수 있다.
모세관 비드-기반 정제는 표준 프로토콜에 비해 많은 이점을 제공한다. 자동 정화 방식은 수동 시간을 없애 총 프로토콜 시간을 상당히 줄인다. 이 방식은 또한 DNA 정제 단계의 반복성을 개선할 것으로 판단된다. 마이크로유체 모세관 방식은 피펫팅 소부피와 관련된 상당한 부피 손실 없이 나노리터 부피의 정화를 가능케 한다. 이로서 극히 작은 시료 부피의 처리가 가능하여 시약 소비를 감소시킨다. 표준 정제 프로토콜에서 다른 중요한 요소는 사용자에 의해 유발되는 가변성이다. 본 발명의 시스템 및 방법은 정제 프로토콜로부터 이러한 가변성을 제거하였다.
적용
모세관 정화 및 복합 액체 세포 처리
일 실시양태에 있어서, 표적 생체분자를 함유한 용출 버퍼는 상호 비혼화성 담체 유체의 자유 표면 상에 위치한 비혼화성 유체 세포에 분배된다. 생성된 복합 유체 세포는 최대로 운반 및/또는 병합 및/또는 혼합 및/또는 생화학적 처리될 수 있다.
일 실시양태에 있어서, 표적 생체분자를 함유한 용출 버퍼는 기계적 안정화 특징을 가지는 상호 비혼화성 담체 유체의 자유 표면 상에 위치한 비혼화성 유체 세포에 분배된다.
일 실시양태에 있어서, 도관으로 유입된 유체의 시퀀스는 상호 비혼화성 담체 유체의 자유 표면 상에 분배 시 도관으로부터 복합 액체 세포를 생성한다.
일 실시양태에 있어서, 상자성 비드는 표면의 재기능화를 위해 도관 정화 프로토콜에 따라 복합 액체 세포에 분배된다.
일 실시양태에 있어서, 처리를 위해 도관으로 유입된 유체는 복합 액체 세포이다.
일 실시양태에 있어서, 시스템으로 유입된 복합 액체 세포는 상자성 비드 및 버퍼를 가진다.
일 실시양태에 있어서, 시스템으로 유입된 복합 액체 세포는 초기 시료를 함유한다.
일 실시양태에 있어서, 시스템으로 유입된 복합 액체 세포는 표적 생체분자의 방출을 위한 용출 버퍼를 함유한다.
일 실시양태에 있어서, 시스템으로 유입된 복합 액체 세포는 도관 내 자기장 원에서 상자성 비드에서의 처리를 위한 생화학 믹스를 함유한다.
일 실시양태에 있어서, 복합 액체 세포 기술이 상자성 비드 및 초기 시료의 병합을 위해 사용된다. 복합 액체 기술은 오염을 방지하고, 정제 전 시료의 처리 및/또는 인큐베이션; 및/또는 저장; 및/또는 수송; 및/또는 혼합을 용이하게 한다.
일 실시양태에 있어서, 다중 복합 유체 세포는 평행하게 발생된다.
본 발명의 시스템 및 방법에 적용될 수 있는 복합 액체 세포 시스템의 예가, 예를 들어 본원에 참고로 원용되는 PCT/IE2011/000040호에 기술되었다.
자성 입자 및 비혼화성 캡슐화 액체를 함유하는 시료 액체를 처리하기 위한 몇가지 방법은 다음을 포함한다: 도관 내 캡슐화 액체의 유동; 시료 액체가 (a) 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 도관 내 예정 포획 장소(trapping site)에 위치하도록 도관 내 시료 액체의 유동; 포획 장소에 자기장을 인가하여 포획 장소에 자성 입자의 고정; 및 (a) 용출 액체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 시료 액체가 포획 장소로부터 유출되고, (c) 용출 액체가 포획 장소로 유동하고 고정된 자성 입자를 둘러싸도록 도관 내 용출 액체의 유동. 표적 분자는 자성 입자에 결합될 수 있다. 결합은 시료 액체가 유동하기 전 시료 액체에서, 또는 다른 처리 지점에서 또는 다른 액체 매질중에서에서 일어날 수 있다. 표적 분자, 예를 들면, 생체분자는 또한 입자가 용출 액체로 둘러싸여 자성 입자로부터 유리(비결합)될 수 있다. 입자는 처리 동안 동원되거나(mobilized) 동원되지 않을 수 있다. 예를 들어, 입자는 시료 액체가 포획 장소에 있는 동안, 용출 액체가 포획 장소에 있는 동안, 또는 다른 유체가 포획 장소에 있는 동안 동원될 수 있다. 방법은 또한 용출 액체중 자성 입자의 동원, 및 자성 입자 및/또는 유리된 표적 분자와 함께 포획 장소에서 떨어진 용출 액체의 유동을 포함할 수 있다. 용출 액체는 또한 자성 입자가 고정된 채로 유지되는 동안 표적 분자와 포획 장소로부터 유출될 수 있다.
방법은 또한 (a) 정화 유체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 정화 유체가 고정 자성 입자를 둘러싸도록 도관 내 하나 이상의 정화 유체가 포획 장소로 유동하는 것을 포함할 수 있다. 정화 유체가 포획 장소에 있는 동안 자성 입자는 정화 유체중에 동원될 수 있다. 정화 유체는 또한 포획 장소에서 떨어져 도관 내를 유동할 수 있다. 동원된 경우, 자성 입자는 정화 유체와 함께 운반될 수 있다. 선택적으로 자성 입자는 포획 장소에서 정화 유체내로 동원된 후, 다시 고정될 수 있다. 이어, 정화 유체는 자성 입자가 포획 장소에서 머무르는 동안 포획 장소에서 떨어져 도관 내를 유동할 수 있다. 제2 정화 유체가 또한 도관 내를 유동할 수 있다.
자성 입자, 제2 시료 액체, 및 캡슐화 액체를 함유하고, 양 시료 액체는 캡슐화 액체와 비혼화성인 제1 시료 액체를 처리하기 위한 일부 방법은 다음을 포함한다: 캡슐화 액체가 도관 내를 유동하고; 제1 시료 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 도관 내 예정 포획 장소에 위치하도록 도관에서 제1 시료 액체가 유동하고; 포획 장소에 자기장을 인가하여 자성 입자를 포획 장소에 고정시키고; 자성 입자가 포획 장소에 고정되어 남아 있는 동안 제1 시료 액체가 포획 장소로부터 유출되도록 도관에서 제1 시료 액체가 유동하고; 제2 시료 액체가 (a) 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 고정된 자성 입자를 둘러싸도록 도관에서 제2 시료 액체가 유동한다.
제2 시료 액체는 제2 시료 액체가 자성 입자를 둘러 쌀 때 자성 입자에 결합되는 표적 분자, 예를 들면, 생체분자를 함유할 수 있다. 자성 입자는 제2 시료 액체에 고정되어 남아 있거나, 또는 제2 시료 액체에서 동원될 수 있다. 방법은 또한 제2 시료 액체의 유동 후, (a) 용출 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제2 시료 액체가 포획 장소로부터 유출되고, (c) 용출 액체가 포획 장소로 유동하여 고정된 자성 입자를 둘러싸도록 용출 액체가 도관에서 유동하는 것을 포함할 수 있다. 용출 액체의 유동은 자성 입자를 용출 액체가 둘러싸 자성 입자로부터 표적 생체분자를 방출시키는 것을 포함할 수 있다. 자성 입자는 용출 액체 내로 동원되거나, 용출 액체중에 고정된 채로 유지될 수 있다.
방법은 또한, 예를 들어: 제2 시료 액체의 유동 후, (a) 제1 정화 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제2 시료 액체가 포획 장소로부터 유출되고, (c) 제1 정화 액체가 포획 장소로 유동하여 고정된 자성 입자를 둘러싸도록 제1 정화 액체가 도관에서 유동하고; 제1 정화 액체의 유동 후, (a) 용출 액체가 캡슐화 액체에 의해 둘러싸이고, (b) 제1 정화 액체가 포획 장소로부터 유출되고, (c) 용출 액체가 포획 장소로 유동하여 고정된 자성 입자를 둘러싸도록 용출 액체가 도관에서 유동하도록 정화 유체의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법에서, 시료 액체 및 캡슐화 액체는 개시된 방법의 일정 시점에, 또는 전반에 걸쳐 복합 액체 세포를 구성할 수 있다. 유사하게, 개시된 임의의 방법에서, 마커가 표적 분자와 함께 사용될 수 있다. 이러한 마커는 포획 장소의 광학적 또는 형광 호출(interrogation)로 검출될 수 있다. 임의의 이들 방법에서, 도관은, 예를 들어, 모세관 튜브일 수 있다.
액체 처리 시스템은 예정된 포획 장소를 갖는 도관, 상기 도관 내 한 위치에 정압, 부압을 인가하거나 외부압을 인가하지 않도록 구성된 펌프, 작동시에 포획 장소에서 자기장을 인가하고 비작동시에 자기장을 실질적으로 인가하지 않도록 구성된 자기장 원, 그리고 제어기가 펌프 및/또는 자기장 원을 작동할 수 있기 위해서 펌프 및 자기장 원에 작동가능하도록 부착된 제어기를 포함할 수 있다. 제어기는 캡슐화 액체가 도관에서 유동하게 펌프를 작동시키고; 시료 액체가 (a) 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 도관 내 포획 장소에 위치하고, 시료 액체가 자성 입자를 함유하는 방식으로 시료 액체가 도관에서 유동하게 펌프를 작동시키고; 자성 입자가 포획 장소에서 고정되도록 자기장 원을 작동시키고; (a) 용출 액체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 시료 액체가 포획 장소로부터 유출되고, (c) 용출 액체가 포획 장소로 유동하여 자성 입자를 둘러싸도록 펌프를 작동시게 프로그램화될 수 있다. 더욱 특징적으로, 제어기는 개시된 임의의 방법을 수행하기 위해 펌프를 작동시키고, 자기장 원을 작동 및/정지시키도록 프로그램화될 수 있다. 도관은 예를 들어, 모세관 튜브일 수 있다. 펌프는 도관에 정압 및/또는 부압을 인가하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 펌프는 정압하에서 도관내 유체가 한 방향으로 유동하고, 부압하에서 도관내 유체가 다른 방향으로 유동하도록 구성될 수 있다.
시퀀싱
많은 차세대 시퀀싱(NGS) 플랫폼은 특정 염기쌍 길이 범위 내 DNA 단편으로 이루어진 DNA 라이브러리를 필요로 한다. 또한, 이들 DNA 단편은 시퀀스가 PCR을 사용하여 증폭되고 라이브러리 단편이 시퀀서 유동 세포에 어닐링되도록 특이적 뉴클레오티드 시퀀스(어댑터)로 태깅되어야 한다. 단일 유동 세포 내에서 시료를 복합화하는 경우 개별 시료를 확인하기 위해 시퀀스 특이적 인덱스가 또한 DNA 단편에 첨가될 수 있다. DNA의 태그먼트화(DNA는 단편화되고 어댑터로 태깅된다)와 공통 어댑터 및 인덱스의 첨가는 두가지 별도의 생물학적 반응으로 이뤄진다. 이들 반응 후, DNA 라이브러리를 정화하여 과량의 뉴클레오티드, 효소, 프라이머, 염 및 기타 오염물들을 제거한다. 따라서, DNA를 태그먼트화하고, 태그먼트화된 DNA를 정제하고, 공통 어댑터 및 인덱스를 첨가하고, 최종 라이브러리 산물을 정제하기 위해 필요한 작업흐름은 복잡하고 노동 집약적이다. 일 실시양태에 있어서, 모세관-기반 정화 시스템은 유전적 시퀀싱 내에서 필요한 시료 정제 및 DNA 분리 단계의 자동화를 위해 사용될 수 있다. 이 처리의 완전한 실시예를 아래에 기술한다.
유전적 시퀀싱 비드 코팅
유전적 시퀀싱 비드 제조는 용도-특이적 화학에서 소형 비드가 코팅되는 방법이다. 일 실시양태에 있어서, 유전자 선별 전 비드 코팅은 비드 믹스 슬러그의 유동 후, 정상 자기장을 거치는 도관 내에서 비드를 코팅하기 위해 사용되는 특이적 프라이머 화학물질로 이뤄진다. 이어 용출 버퍼 슬러그가 통과되는데, 비드 농도는 슬러그 내에 사용된 용출 버퍼의 부피로 조절될 수 있다. 자기장이 제거되고, 기능화된 비드 믹스가 추가 처리를 위해 도관을 따라 유동한다.
일 실시양태에 있어서, 도관 내 유동은 역전될 수 있고, 기능화된 비드 믹스는 저장 또는 추가 생화학 처리를 위해 분배된다.
이들 방법은 현재 통상적인 기술을 사용하여 달성이 불가능한 마이크로리터 이하 부피의 유체를 조작하고 배합하는데 편리한 방식을 제공함으로써, 초기 시료 부피를 줄이고, 반응 부피 감소에 따라 비드 코팅 효율을 개선할 수 있다. PCR 및 열적 사이클링 및 유전적 시퀀싱을 사용한 추가 처리은 용도-특이적이다.
이러한 기술의 채용은 이렇게 비교적 작은 표적 부피에 대한 수집 절차를 크게 간소화한다. 처리중에 생물학적 시료가 임의의 피펫팅 손실을 초래하지 않기 때문에 시스템은 100% 부피의 회수를 가능케 한다. 이러한 특징들은 생화학 처리의 자동화를 좀 더 용이하게 만든다.
소형 RNA의 크기 선별
소형 RNA 분자의 시퀀싱은 역전사 후 백그라운드 비특이적 산물의 양이 압도적이고, 그의 길이가 소형 표적 분자의 것 보다 아주 약간 작기 때문에 복잡하다. 현재, 소형 표적 cDNA 분자(RNA로부터 역전사된)는 목적하는 겔 전기이동 밴드의 배제로 크기를 선별한다. 일반적으로, 겔 슬라이스로부터 DNA가 추출되고, PCR 반응에 첨가된 뒤, 스핀 컬럼 기반 방법으로 정화된다. 작업 흐름은 노동 집약적이고, DNA 수율/회수율은 좋지 않다.
일 실시양태에 있어서, 정제 및 크기 선별은 모세관에 필요한 시약의 펌핑으로 달성된다. 특정 부피의 DNA 비드 용액, 에탄올, 공기 및 용출 버퍼를 도관 내에 인입하고 유동시킨다. DNA-비드 용액이 자기장을 통해 유동할 때, 비드 및 결합된 DNA가 용액으로부터 제거되어 도관벽에서 펠렛을 형성한다. 차후 에탄올 슬러그가 고정화된 펠렛을 지나갈 때 비드-DNA 펠렛이 세척된다. 이어, DNA가 비드에서 용출되고, 용출 버퍼가 비드 펠렛을 지나 유동할 때 용액으로 유입된다. 펌프는 역전되고, NGS 라이브러리 제조 작업흐름의 후속 단계동안 정제된 DNA를 함유하는 용리액이 회수된다.
일 실시양태에 있어서, 상자성 비드는 cDNA 산물과 혼합된다. 특정 버퍼 조건을 선택하여(상이한 버퍼 조건의 이용으로 상이한 크기의 DNA가 결합될 수 있다) 자성 비드의 크기 선별 특성을 이용함으로써, 남은 분자가 용액에 잔류하여 폐물로 전달되는 동시에 소형 cDNA 분자를 비드에만 결합되도록 할 수 있다. 용출 버퍼가 고정된 비드 펠렛을 통과함에 따라 소형 표적 분자가 용출된다.
일 실시양태에 있어서, 크기 선별 처리는 에탄올 슬러그 없이 수행된다.
NGS 시퀀싱을 위한 DNA 라이브러리의 크기 선별
각각의 차세대 시퀀서는 최적의 판독 길이(염기쌍)를 갖는다. 라이브러리 작성 동안, DNA는 넓은 염기쌍 길이 범위를 가지는 DNA 분자로 단편화된다. 크기 선별은 현재 마이크로타이터 플레이트 상에서 상자성 비드를 사용하여 수행되고 있으며, 노동 집약적이고, 피펫팅 오차 및 사용자의 프로토콜 변동로 인한 비효율성을 겪고 있다. 모세관-기반 도관 시스템이 DNA 라이브러리의 크기 선별을 위해 사용될 수 있다.
핵산 정제
모세관-기반 도관 시스템은 PCR 전 및/또는 후에 시료의 정제 및/또는 분리를 위해 사용될 수 있다. 상자성 비드는 핵산의 정제 및/또는 분리를 위한 부분으로서 사용된다.
상자성 비드는 PCR 후 과량의 혼입되지 않은 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 염 및 효소를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 유전형 분석, 생어(sanger) 및 차세대 시퀀싱과 같은 다운스트림 적용에서의 성공을 확신하기 위해 이들 오염물의 효율적인 제거가 필요하다. 비드-기반 정제는 앰플리콘의 높은 회수율, 오염물의 효율적인 제거 및 정화에서의 유연성을 제공한다. 가능한 실시양태 방법의 일부 예를 하기에 기술한다.
단백질 농축
단백질 농축은 또한 모세관-기반 도관 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 상자성 비드는 표적 단백질을 농축하기 위한 부위로서 사용된다.
비드는 항체에 고친화성인 매질로 코팅된다. 표적 단백질에 특이적인 항체가 비드에 첨가되고, 비드 표면 상에 놓인 결합 부위에 커플링된다. 이어서 표적 단백질을 함유하는 생물학적 시료가 첨가되어 항체에 부착된다. 자기장 인가로 백그라운드 분자를 함유하는 생물학적 시료로부터 단리 및 분리가 가능하다. 상등액을 버리고 용출 버퍼를 첨가하여 정제된 표적 단백질을 얻는다. 비드-기반 단백질 농축 방식을 자동, 고처리 방식으로 단백질 농축을 허용하는 모세관-기반 시스템을 사용하여 이룰 수 있다.
빌드(build) 합성 핵산 구조체:
상자성 비드가 핵산 구조체(올리고뉴클레오티드)의 조립을 돕기 위해 본원에서 기술한 것과 유사한 시스템에 사용될 수 있다.
자성 비드는 관련 결합 화학 성질들을 드러내는데 중요한 큰 표면 대 부피 비를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 합성은 성장 쇄의 5' 말단에 뉴클레오티드 잔기를 목적하는 시퀀스가 조립될 때까지 단계식으로 첨가하여 수행된다. 단계는 탈블록킹(탈트리틸화)를 포함하는데, 여기서는 커플링 전에 작용기가 산 용액으로 제거된다. 커플링은 다음 염기의 형성을 위해 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 도입하고 결합시킨다. 이어 캡핑으로 더 이상의 쇄 연장을 방지한다. 이는 보통 고체 지지체를 아세트산 무수물 및 1-메틸이미다졸로 처리함으로써 수행된다. 이어 산화를 수행하여 안정성을 증가시킨다.
세포 농축/분리
상자성 비드는 생물학적 시료로부터 표적 세포를 분리하고 농축하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 생물학적 시료로부터 컬럼의 사용 없이 세포를 직접 농축시킴으로써 높은 세포 생존성 및 수율을 보장한다. 이는 특히 표적 세포가 극히 희귀한 최소 잔존 질병에서 종양 세포 분석과 같은 적용에 중요하다.
농축은 생물학적 시료에 특이적인 세포 마커에 대한 항체로 코팅된 상자성 비드를 첨가함으로써 이뤄진다. 표적 세포는 비드에 결합되고, 자석의 사용으로 분리된다. 이어, 백그라운드 세포를 함유하는 상등액을 버린다. 표적 세포를 분석용으로 회수할 수 있다. 이러한 상자성 비드 기반 세포 분리 및 농축 방식은 모세관-기반 시스템에서 시행될 수 있어서, 자동 세포 농축 및 하류 분석을 위한 다른 마이크로유체 기술과의 통합을 가능케 한다.
실시예
하기 실시예가 특정 실시양태를 설명하나, 개시된 특허 대상의 범위를 제한하는 것으로 보아서는 안된다.
285bp 앰플리콘의 정제 및 회수
본 실시예는 GenCell Biosystems의 모세관-기반 핵산 정제 시스템으로부터의 데이터를 나타낸다. 본 실험은 모세관 정제 시스템이 PCR 산물을 정제 및 회수할 수 있음을 입증하기 위해 수행되었다.
액틴-베타 유전자 상에 285bp 단편을 표적으로 하는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR로 목적 산물을 증폭하였다. 이어, 산물을 모세관-기반 상자성 비드 정제 장비의 성능 평가에 사용하였다. 18 μL의 비드-버퍼 믹스(AMPure Xp, Agencourt)를 PCR 튜브 내의 10 μL PCR 산물에 피펫팅하였다. 1.8×비드-믹스 농도는 100bp 보다 큰 단편이 회수되었음을 확인해 준다. 비드-DNA 믹스를 피펫 혼합하고, AMPure Xp 프로토콜 권고에 따라 실온에서 5 분동안 인큐베이션하여 DNA가 비드에 결합되도록 하였다. 28 μL 비드-DNA 용액, 이어서 70% 에탄올의 5 μL 슬러그 2 분획, 10 μL 공기 슬러그, 2.5 μL의 폴리디메틸실록산 오일 및 10 μL의 용출 버퍼(뉴클레아제 유리수)를 PTFE 모세관 튜브(400 미크론 내경)로 흡인하였다. DNA-비드 믹스, 에탄올, 공기, 오일 및 용출 버퍼 슬러그를 시린지 펌프(PHD 2000, Harvard Apparatus)를 사용하여 10 μL/min의 일정한 유동 속도로 순서대로 펌핑하였다. 기술된 순서의 시약들을 AMPure Xp 프로토콜에 의해 명시된 정제 단계로 모방하였다. 비드 및 결합된 표적 DNA는 용액이 자석을 통과하는 동안 비드-DNA 용액으로부터 모세관벽으로 제거되었다. 에탄올 슬러그를 현재 고정된 DNA-비드 펠렛 위로 통과시켜 펠렛을 세척하고, 잔류 오염물을 제거하였다. 이어 공기 및 오일 슬러그를 펠렛을 거쳐 전달하여 잔류 에탄올을 제거하였다. 정제 처리의 최종 단계에서, 용출 버퍼 슬러그가 비드 펠렛을 통과함에 따라 표적 DNA를 비드로부터 용액으로 용출하였다. 펌프를 역전시키고, 용리액을 분석용으로 멸균 PCR 튜브에 회수하였다. 이 실험을 중복 수행하였다. 용리액을 겔 전기이동으로 분석하였다.
두 용리액 시료를 비정제된 285-bp 액틴-베타 산물과 비교한 겔 전기이동 결과를 도 10에서 확인할 수 있다. 도 10을 참조하면, 기술된 모세관 정제 기술이 385bp를 성공적으로 회수하였음이 분명하다. 용리액 밴드를 정화되지 않은 PCR 산물과 비교하였더니, 정제 절차가 프라이머-다이머와 같은 비특이적 산물을 제거한 것으로 명백히 나타났다.
DNA 회수율: 통상적인 DNA 분리 프로토콜과 비교
본 실시예는 통상적인 비드-기반 정제 프로토콜과 모세관 비드-기반 정제 프로토콜 간의 회수율을 비교한 GenCell Biosystems 모세관 핵산 정제 시스템으로부터의 데이터를 제공한다. 이들 실험을 이용하여 모세관 비드-기반 정제 방식의 성능을 평가하였다.
285bp 액틴-베타 앰플리콘을 정제용 DNA 템플레이트로서 사용하였다. 상기 285bp 앰플리콘의 정제 및 회수 실시예에 기술된 모세관 비드-기반 정제 프로토콜에 따라 앰플리콘을 정제하고, 회수하였다. 본 실험을 사중으로 수행하고, 용리액 시료를 분석용으로 저장하였다.
별도의 실험으로, 285bp 앰플리콘을 함유하는 10 μL의 템플레이트 용액을 AMPure Xp 프로토콜에 따라 정화하였다. 18 μL의 AMPure Xp 비드 믹스를 10 μL의 템플레이트 용액을 함유하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 피펫팅하였다. DNA-비드 혼합물을 피펫 혼합하고, 실온에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트에 놓고, 결합된 DNA를 함유하는 비드를 용액으로부터 분리하였다. 상등액을 피펫으로 흡입하여 버렸다. 200 μL의 70% 에탄올을 비드 펠렛에 첨가하고, 실온에서 30 초간 인큐베이션하였다. 이어 에탄올을 피펫으로 흡입하여 버렸다. 이를 총 2회 세척을 위해 반복하였다. 최종 세척 단계 후, 펠렛을 건조하여 미량의 모든 에탄올을 제거하였다. 10 μL의 용출 버퍼(뉴클레아제 유리수)를 웰에 첨가하고, 자성 플레이트에서 떨어진 비드 펠렛에 피펫팅하고, DNA를 비드에서 용액으로 용출되도록 하였다. 마이크로타이터 플레이트를 자성 플레이트 상에 위치시키고, 용리액을 새 플레이트로 옮겼다. 본 실험을 삼중으로 수행하고, 시료를 분석용으로 저장하였다.
통상적인 정화 프로토콜 및 모세관 정화법으로 회수된 용리액을 UV-vis 분광광도법 측정(NanoDrop 2000, Thermo Scientific)으로 정량하였다. UV-vis 분광광도법 정량 결과는 도 7에서 확인할 수 있다. 도 7에 나타낸 정량 결과는 모세관 정화 회수율이 통상적인 프로토콜을 사용하여 달성된 것과 동일하다고 나타냈다. 이러한 결과는 DNA 회수율이 통상적인 AMPure Xp 프로토콜을 사용하여 달성된 것과 동일하다는 것을 입증하는 것이다. 본원에 기술된 모세관 DNA 정제법은 성능의 상충없이 고도의 자동 정제를 제공한다.
DNA 라이브러리 작성
본 실시예는 차세대 시퀀싱을 위해 모세관 비드-기반 정제를 어떠한 방식으로 DNA 라이브러리 작성 프로토콜에 도입할 수 있는지를 보여준다. 여기에서 제공되는 데이터는 DNA 라이브러리 작성 프로토콜 내에서 다양한 생물학적 처리 후 지금 수행되는 정제 단계가 모세관 정화법을 사용하여 대체될 수 있어 차세대 시퀀서를 위한 DNA 라이브러리 작성에 완전 자동, 고처리 접근법임을 입증한다.
본 실시예에서는, 넥스테라 시료 Prep Kit(Illumina)에서 현재 사용되고 있는 정화 단계 대신 모세관 정화를 사용하였다. 9 μL 태그먼트화 반응물을 제조하였다. 이 반응물은 대조 게놈 DNA, 고분자량 버퍼, 넥스테라 효소 믹스 및 뉴클레아제 유리수를 함유하였다. 본 반응에서는, DNA를 단편화하고, 어댑터로 태깅하였다. 태그먼트화 반응물을 준비하고, 55 ℃에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 태그먼트화 후, 시료를 권장되는 Zymo Clean and Concentrator Kit(Zymo Research) 세정 대신 모세관 비드-기반 정제 시스템을 사용하여 정제하였다. 9 μL의 태그먼트화된 산물을 16.2 μL의 AMPure Xp 비드 용액에 첨가하고, 피펫 혼합한 후, 실온에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 이어 DNA-비드 용액을 PTFE 모세관(내경 400 미크론)으로 흡입하였다. 모세관에 2.5 μL 공기, 10 μL DNA 결합 버퍼 슬러그, 2.5 μL 공기 슬러그, 2 분량의 5 μL 에탄올 슬러그, 분리하여 2.5 μL 공기 슬러그, 10 μL 공기 슬러그, 2.5 μL 오일 슬러그 및 15 μL 용리액 버퍼 슬러그(뉴클레아제 유리수)를 로딩하였다. 시약 슬러그 군을 시린지 펌프(PHD2000, Harvard)를 사용하여 10 μL/분으로 펌핑하였다. 비드 및 결합된 표적 DNA는 용액이 자석을 통과하는 동안 비드-DNA 용액으로부터 모세관벽으로 제거되었다. 이어서 DNA-결합 버퍼(Zymo Clean and Concentrator Kit, Zymo Research)를 고정화된 비드 펠렛에 통과시켜 트랜스포라제 효소를 단편화된 표적 DNA - 공지된 PCR 억제제에서 해리하였다. 그 후, 에탄올 세척 단계를 비드-DNA 펠렛에 허용하여 잔류 오염물을 제거하였다. 공기 및 오일 슬러그를 펠렛에 통과시켜 잔류 에탄올을 제거하였다. 마지막으로, 용출 버퍼를 펠렛에 통과시켜 태그먼트화된 DNA를 비드에서 용출시켰다. 펌프를 역전시키고, 용출 버퍼를 넥스테라 라이브러리 작성 프로토콜의 후속 단계를 위해 회수하였다.
11 μL의 용출물을 PCR 반응(25 μL 최종 부피)에 첨가하였다. 제한된 사이클의 PCR을 GeneAmp PCR 시스템 9700(Applied Biosystems)을 사용하여 넥스테라 프로토콜에 명시된 열 사이클 조건에 따라 수행하였다. PCR 반응물을 3 분간 72 ℃, 30 초간 95 ℃, 이어서 10 초간 95 ℃, 30 초간 62 ℃, 3 분간 72 ℃의 9 사이클로 가열하였다. PCR 단계동안, 브릿지 PCR 대응 부위(compatible site) 및 특정 인덱스를 태크먼트화된 DNA 말단에 가하였다. 제한된 사이클의 PCR 단계 후, DNA 라이브러리 산물을 AMPure Xp 정제 키트 또는 권장되는 Zymo DNA Clean and Concentrator Kit(Zymo Research) 대신 모세관 비드-기반 정제 시스템을 사용하여 정제하였다. 25 μL PCR 반응물중 15 μL를 25 μL의 AMPure Xp 비드 용액에 첨가하고, 피펫 혼합한 후, 실온에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 비드-DNA 용액을 PTFE 모세관(내경 400 미크론)으로 흡입하였다. 모세관에 2.5 μL의 공기, 2 분량 5 μL 에탄올 슬러그, 분리된 공기 슬러그, 및 이어서 10 μL 공기 슬러그, 2.5 μL 오일 슬러그 및 15 μL 용리액 버퍼 슬러그(뉴클레아제 유리수)를 로딩하였다. 비드 및 결합된 표적 DNA는 용액이 자석을 통과하는 동안 비드-DNA 용액으로부터 모세관벽으로 제거되었다. 그 후, 에탄올 세척 단계를 비드-DNA 펠렛에 허용하여 잔류 오염물을 제거하였다. 공기 및 오일 슬러그를 펠렛에 통과시켜 잔류 에탄올을 제거하였다. 마지막으로, 용출 버퍼를 펠렛에 통과시켜 DNA 라이브러리 시퀀스를 비드에서 용출시켰다. 펌프를 역전시키고, 용출 버퍼를 분석용으로 회수하였다. 이 실험을 중복 수행하였다.
회수된 DNA 라이브러리를 겔 전기이동으로 분석하였다. 겔 전기이동 결과를 도 8에서 확인할 수 있다. 겔 결과의 조사로, 넥스트라 프로토콜에서 시행된 두 모세관 정화 단계가 라이브로리 시퀀스를 성공적으로 정화하고 정제하였음을 명백히 알 수 있다. 200bp를 초과하는 DNA 라이브러리 단편에 상응하는 얼룩진 밴드를 도 8에서 확인할 수 있는데, 이는 모세관 비드-기반 정화가 태그먼트화 후 트랜스포라제 효소를 제거하고, 태그먼트화 및 제한된 사이클의 PCR 후 산물을 정제하는데 효과적임을 입증하는 것이다. 이는 모세관 비드-기반 정화 시스템이 DNA 라이브러리 작성 프로토콜 내 통상적인 정제 단계에 실행가능한 대안임을 말해준다.
DNA 라이브러리 작성: 통상적인 DNA 정제 프로토콜과 비교
본 실시예는 DNA 라이브러리 작성 프로토콜에 사용하기 위한 모세관 비드-기반 정제 시스템을 입증한다. DNA 라이브러리 작성 프로토콜은 프로토콜에 따라 모세관 정화 단계를 이용하여 수행하였다. 양 실험으로부터의 최종 라이브러리 산물을 비교한 후, 통상적인 정화 단계를 대신한 모세관 정화 단계의 효율을 확인하였다.
태그먼트화 후 및 제한된 사이클의 PCR 후에 DNA 라이브러리 작성 실시예에 기술된 바와 같이, 넥스테라 라이브러리 작성 프로토콜을 모세관 정화 단계를 이용하여 수행하였다. 본 과정을 중복으로 수행하고, 최종 라이브러리 산물을 회수한 뒤, 분석용으로 저장하였다.
넥스테라 라이브러리 작성 프로토콜을, 태그먼트화 후 정화를 AMPure Xp 정제 키트를 사용하여 수행하는 것만을 제외하고, 권고 프로토콜에 따라 수행하였다. 태그먼트화 반응물을 상기 DNA 라이브러리 작성 실시예에서 기술된 바와 같이 제조하였다. 이어 9 μL 태그먼트화 반응물을 AMPure Xp 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 9 μL의 태그먼트화된 산물을 마이크로타이터 플레이트의 웰 내 16.2 μL의 AMPure Xp 비드 용액에 첨가하고, 피펫 혼합한 뒤, 실온에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트에 놓고, 결합된 DNA를 함유하는 비드를 용액으로부터 분리하였다. 상등액을 피펫으로 흡입하여 버렸다. 200 μL의 DNA 결합 버퍼를 비드 펠렛에 첨가하고, 실온에서 60 초간 인큐베이션하여 태그먼트화된 DNA로부터 트랜스포스 효소를 해리하였다. 200 μL의 70% 에탄올을 비드 펠렛에 첨가하고, 실온에서 30 초간 인큐베이션하였다. 이어 에탄올을 피펫으로 흡입하여 버렸다. 이를 총 2회 세척을 위해 반복하였다. 최종 세척 단계 후, 펠렛을 건조하여 미량의 모든 에탄올을 제거하였다. 15 μL의 용출 버퍼(뉴클레아제 유리수)를 웰에 첨가하고, 자성 플레이트에서 제거된 비드 펠렛에 피펫팅하여 비드를 용출 버퍼에 재현탁시키고, DNA를 비드에서 용액으로 용출되도록 하였다. 마이크로타이터 플레이트를 자성 플레이트 상에 재위치시키고, 비드 및 용리액을 분리한 후, 용리액을 PCR 반응을 위해 옮겼다(25 μL 최종 부피).
제한된 사이클의 PCR을 DNA 라이브러리 작성 실시예에 기술된 바와 같이 수행하였다. PCR 후, 25 μL PCR 반응물중 15 μL를 마이크로타이터 플레이트의 웰 내 25 μL AMPure Xp 비드 용액에 첨가하였다. DNA-비드 혼합물을 피펫 혼합하고, 실온에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 마이크로타이터 플레이트를 자기 플레이트에 놓고, 결합된 DNA를 함유하는 비드를 용액으로부터 분리하였다. 상등액을 피펫으로 흡입하여 버렸다. 200 μL의 70% 에탄올을 비드 펠렛에 첨가하고, 실온에서 30 초간 인큐베이션하였다. 이어 에탄올을 피펫으로 흡입하여 버렸다. 이를 총 2회 세척을 위해 반복하였다. 최종 세척 단계 후, 펠렛을 건조하여 미량의 모든 에탄올을 제거하였다. 15 μL의 용출 버퍼(뉴클레아제 유리수)를 웰에 첨가하고, 자성 플레이트에서 제거된 비드 펠렛에 피펫팅하여 비드를 용출 버퍼에 재현탁시키고, DNA를 비드에서 용액으로 용출되도록 하였다. 마이크로타이터 플레이트를 자성 플레이트 상에 재위치시켜 비드를 용리액에서 분리한 후, 최종 라이브러리 산물을 함유하는 용리액을 분석을 위해 새 플레이트로 옮겼다. 본 실험을 중복으로 수행하였다.
통상적인 프로토콜 및 모세관 정화 단계가 있는 프로토콜을 이용하여 회수된 최종 라이브러리 산물을 겔 전기이동으로 분석하였다. 겔 결과를 도 8에서 확인할 수 있다. 겔 결과를 참조하면, 모세관 정화 프로토콜로부터 회수된 산물의 얼룩 강도 및 크기가 통상적인 프로토콜을 사용하여 작성된 라이브러리의 것과 거의 동일함이 명확하다. 이는 모세관 비드-기반 정제 단계를 프로토콜에서 수행하면 통상적인 프로토콜을 사용하여 얻은 것과 회수율 및 라이브러리 질이 유사함을 증명하는 것이다. 모세관-기반 방식은 다른 작성 기술과 통합될 수 있는 노동 집약적이지 않은 고처리 방법으로서 완전 자동 DNA 라이브러리 작성 시스템을 제공한다.
저 부피 DNA 라이브러리 작성: 통상적인 DNA 정제 프로토콜과 비교
본 실시예는 저 부피 DNA 라이브러리를 작성하는데 모세관 비드-기반 정제 시스템의 효율성을 강조한다. DNA 라이브러리 작성 프로토콜을 프로토콜 대로, 그리고 반응 부피를 감소하기 위한 모세관 정화 단계를 이용하여 수행하였다. 양 실험으로부터의 최종 라이브러리 산물을 비교하고, 저 부피의 DNA 라이브러리를 작성하는 경우, 통상적인 정화 단계 대신 모세관 정화 단계를 사용하는데 이점이 있음을 확인하였다.
본 실험의 제1 부분으로서, 2.5 μL 태그먼트화 반응물을 제조하고, 55 ℃에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 태그먼트화 후, 2.5 μL 태그먼트화 반응물을 4.5 μL AMPure Xp 비드 용액에 첨가하고, 피펫 혼합한 후, 실온에서 5 분동안 인큐베이션하였다. 용액을 상기 실시예에 기술된 바와 같이, DNA 결합 버퍼 단계를 추가해 AMPure Xp 프로토콜에 따라 정제하였다. 태그먼트화된 산물을 1.1 μL의 뉴클레아제 유리수에 용출하고, PCR 반응에 첨가하였다. 2.5 μL PCR 반응물을 AMPure Xp 프로토콜에 따라 정제하고, 최종 라이브러리 산물을 4 μL의 뉴클레아제 유리수에 용출시킨 뒤, 분석용으로 저장하였다. 본 실험의 제2 부분으로서, 동일한 부피를 상기 실시예에 기술된 바와 같이, 모세관 정화 단계를 이용하여 정제하였다. 양 방법을 중복으로 수행하였다.
최종 DNA 라이브러리 산물을 20 μL PCR 반응에 첨가하고, 정량적 PCR(qPCR)을 이용하여 분석하였다. 정방향 및 역방향 프라이머는 시퀀서 이용 단편만이 정량화될 수 있도록, DNA 라이브러리 단편의 말단에 첨가된 어댑터에 특이적이었다. SYBR 그린 검출 화학물질을 이용하였다. KAPA Biosystems에서 공급한 표준을 또한 동일한 qPCR 플레이트에서 실행하여 회수된 라이브러리 산물이 절대 정량되도록 하였다. qPCR 플레이트를 KAPA Biosystems 라이브러리 정량 키트에 따라 40 사이클화하였다(ABi StepOne, LifeTechnologies).
qPCR 결과를 도 9에서 확인할 수 있다. 모세관 정화를 사용하여 회수된 두 라이브러리는 통상적인 프로토콜을 사용하여 회수된 라이브러리보다 먼저 정량 사이클(Cq) 값을 가졌다. Cq는 형광 신호가 백그라운드 형광 수준을 초과하는 사이클 수로서 정의되며, 출발 산물의 양과 관련된다. 모세관 정화된 산물에 대한 Cq 값은 2.8 및 2.9이었다. 통상적인 방법을 사용하여 정화된 산물에 대한 Cq 값은 3.6 및 4.0으로서, 모세관 정화된 산물 보다 상당히 뒤임을 알 수 있다. 이는 DNA 라이브러리를 저 부피로부터 작성하는 경우에, 모세관 정화의 회수율이 우수함을 입증하는 것이다. 이는 피펫팅 오차가 상당한 통상적인 프로토콜에 비해 모세관 접근법과 관련하여 시료 손실이 감소된 것에 의할 수 있다.
모세관 정화와 관련된 우수한 DNA 라이브러리 회수율이 다음 실시예에서 추가로 입증된다.
모세관 비드-기반 분리를 이용하여 저 시료 부피로부터 DNA 회수
본 실시예는 소규모 DNA 라이브러리 부피 처리 시에 모세관 정화 방식이 뛰어난 회수율을 제공함을 입증한다. 본 실시예에서는, 모세관 정화를 사용하여 DNA 라이브러리 회수율을 조사하기 위해서 다수의 실험을 수행하였다.
완전 넥스테라 프로토콜을 통상적인 프로토콜에 따라 수행하였다. 최종 DNA 라이브러리 산물을 저장하고, 템플레이트로 사용하였다. 2.5 μL의 DNA 라이브러리를 4.5 μL의 AMPure Xp 비드 용액에 첨가하고, 피펫 혼합한 후, 상기 실시예에서 기술된 모세관 정화 절차에 적용하였다. 이어 회수된 산물을 PCR 반응에 첨가하였다. 2.5 μL의 템플레이트를 함유하는 양성 대조군을 삼중으로 실행하고, 분석하였다. 회수된 라이브러리 산물 및 양성 대조군을 qPCR로 분석하였다. 양성 대조군 및 용리액 Cq 값을 표 1에 나타내었다. 양성 대조군 Cq 값은 임의의 정제 처리 전 DNA 라이브러리 산물의 출발량을 나타낸다. 2.5 μL의 DNA 라이브러리 산물이 양성 대조군에 사용되고, 소규모 부피 모세관 정화 처리에 투입되었기 때문에, 회수 효율 100%를 가정할 때 양자의 Cq 값은 동일하여야 한다. 양성 대조군 및 용리액에 대한 Cq 값을 조사하였더니, 시료가 모세관 비드-기반 정화에 적용된 뒤, 라이브러리 산물의 전부는 아니지만 대부분이 회수된 것으로 나타났다. 용리액 Cq 값은 양성 대조군과 거의 비슷하였으며, 이는 DNA 라이브러리 산물의 회수가 효율적임을 증명한다.
본 실시예는 모세관 정화 방식이 소부피로부터 DNA 라이브러리를 효율적으로 회수한다는 것을 입증한다.
시험 1 시험 2 시험 3 시험 4
종류 Cq Cq Cq Cq
양성 대조군 1 4.8 5.0 4.5 5.4
양성 대조군 2 5.1 4.9 4.4 5.3
양성 대조군 3 5.0 5.1 4.4 5.2
평균 양성 대조군 4.96 5.0 4.43 5.3
용리액 4.7 4.7 6.0 5.3
모세관의 오염제거 - 재사용가능성
앞의 실시예에 기술된 모세관 정화 절차는 전형적으로 PCR 산물 또는 DNA 라이브러리와 같이 고농도 시료를 정제한다. 비드가 용액에서 분리되어 모세관벽에 고정되기 때문에 모세관은 반드시 소량의 표적 DNA로 오염되게 되어 있다. 라인 처리를 하지 않으면, 이는 시료간 오염을 일으키게 될 것이다. 명백히, 이는 바람직하지 않다. 본 실시예는 일련의 세척 단계가 모세관 비드-기반 정제 수행 후 모세관에 잔류하는 임의의 핵산을 충분히 제거 또는 파괴하여 모세관을 재사용할 수 있게 해줌을 보여준다.
PCR 산물은 저 부피 시료로부터 DNA를 회수하는 것에 대해 명시된 정확한 프로토콜에 따라 모세관 비드-기반 분리 실시예를 이용하여 모세관 정화법으로 정제하였다. 9 μL 모세관 음성 슬러그(뉴클레아제 유리수)를 모세관을 따라 통과시키고, 라인이 오염되었는지를 조사하기 위해 회수하였다. 그 후, 모세관에 정화 시약(LookOut DNA Erase, SigmaAldrich)을 3 분동안 채웠다. 정화 시약을 폐물로 펌핑하고, 라인을 멸균수로 확 씻어 내렸다. 오염 제거후, 멸균된 두 9 μL 모세관 음성 슬러그를 모세관을 따라 통과시켜 세척 단계 후 오염 수준을 조사하였다. 회수된 용리액 및 모세관 음성군을 PCR 반응에 첨가하였다. 양성 및 무 템플레이트 대조군을 또한 제조하고, qPCR(ABi StepOne, LifeTechnologies)로 분석하였다. qPCR 결과를 도 11에서 볼 수 있다. 도 11을 참조하면, 모세관 정화를 수행한 직후에 모세관이 상당히 오염되었음을 명백히 알 수 있다. 오염제거 단계 후, 모세관 음성 Cq 값은 무 템플레이트 대조 Cq 값 범위내로 떨어졌다. 무 템플레이트 대조군 및 모세관 음성군에 의해 나타난 Cq 값은 프라이머 다이머 산물에 해당한다. 모세관 음성군은 표적 산물에 대해 음성으로 남아 있는데, 이는 모세관 세척후 오염 제거가 효과적으로 일어났음을 제시한다.
기술된 세척 단계를 실시함으로써 각 정제/크기 선별 실험후 라인을 재사용할 수 있다.
정의
본원 명세서에서 사용된 용어 "슬러그"는 용어 플러그(plug)와 상호호환적으로 사용될 수 있으며, 도관 내를 유동하는 유체의 적당한(discreet) 부피를 가리킨다.

Claims (23)

  1. 자성 입자 및 캡슐화 액체를 함유하는 시료 액체의 처리 방법으로서,
    여기서 시료 액체와 캡슐화 액체는 비혼화성이고,
    상기 방법은,
    캡슐화 액체를 도관에 유동시키고;
    시료 액체가 (a) 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 도관 내 지정된 포획 장소에 위치하도록, 시료 액체를 도관에 유동시키고;
    포획 장소에 자기장을 인가하여 포획 장소에 자성 입자를 고정시키고;
    (a) 용출 액체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 시료 액체가 포획 장소로부터 멀어지게 유동되고, (c) 용출 액체가 포획 장소로 유동하여 고정된 자성 입자를 둘러싸도록, 용출 액체를 도관에 유동시키는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    시료 액체를 도관에 유동시키기 전에 표적 생체분자를 자성 입자에 결합시키는 것을 추가로 포함하고;
    여기서 용출 액체의 유동은 용출 액체가 자성 입자를 둘러쌈으로써 자성 입자로부터 표적 생체분자를 유리시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 용출 액체의 유동 후 자기장을 제거하여 용출 액체에서 자성 입자를 이동시키는(mobilizing) 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 이동된 자성 입자를 함유하는 용출 액체를 포획 장소로부터 멀어지게 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 인가된 자기장으로 자성 입자를 고정된 상태로 유지하는 동안 유리된 표적 생체분자를 함유하는 용출 액체를 포획 장소로부터 멀어지게 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 제1 정화 유체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 제1 정화 유체가 고정된 자성 입자를 둘러싸도록, 도관 내 제1 정화 유체를 포획 장소로 유동시키고;
    자기장을 제거하여 자성 입자를 제1 정화 유체로 이동시키고;
    도관 내 이동된 자성 입자를 함유하는 제1 정화 유체를 포획 장소로부터 멀어지게 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 도관에 제2 정화 유체를 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    (a) 제1 정화 유체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 제1 정화 유체가 고정된 자성 입자를 둘러싸도록, 도관 내 제1 정화 유체를 포획 장소로 유동시키고;
    자기장을 제거하여 자성 입자를 제1 정화 유체로 이동시키고;
    자기장을 재인가하여 이동된 자성 입자를 고정시키고;
    도관 내 제1 정화 유체를 포획 장소 및 고정된 자성 입자로부터 멀어지게 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 도관에 제2 정화 유체를 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 자성 입자를 함유하는 제1 시료 액체, 제2 시료 액체, 및 캡슐화 액체의 처리 방법으로서,
    여기서 두 시료 액체는 모두 캡슐화 액체와 비혼화성이며,
    상기 방법은
    캡슐화 액체를 도관에 유동시키고;
    제1 시료 액체가 (a) 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 도관 내 지정된 포획 장소에 위치하도록, 제1 시료 액체를 도관에 유동시키고;
    포획 장소에 자기장을 인가하여 포획 장소에 자성 입자를 고정시키고;
    자성 입자가 포획 장소에 고정된 상태로 유지되는 동안 제1 시료 액체를 포획 장소로부터 멀어지게 유동하도록, 제1 시료 액체를 도관에서 유동시키고;
    제2 시료 액체가 (a) 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 고정된 자성 입자를 둘러싸도록, 제2 시료 액체를 도관에서 유동시키는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 제2 시료 액체가 고정된 자성 입자를 둘러쌀 때 제2 시료 액체가 자성 입자에 결합하는 표적 생체분자를 함유하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 제2 시료 액체를 유동시킨 후, (a) 용출 액체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 제2 시료 액체가 포획 장소로부터 멀어지게 유동되고, (c) 용출 액체가 포획 장소로 유동하여 고정된 자성 입자를 둘러싸도록, 도관에 용출 액체를 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 용출 액체의 유동이, 용출 액체가 자성 입자를 둘러쌈으로써 자성 입자로부터 표적 생체분자를 유리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 용출 액체의 유동 후 자기장을 제거하여 용출 액체에서 자성 입자를 이동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    제2 시료 액체의 유동 후, (a) 제1 정화 액체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 제2 시료 액체가 포획 장소로부터 멀어지게 유동되고, (c) 제1 정화 액체가 포획 장소로 유동하여 고정된 자성 입자를 둘러싸도록, 도관에 제1 정화 액체를 유동시키고;
    제1 정화 액체의 유동 후, (a) 용출 액체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 제1 정화 액체가 포획 장소로부터 멀어지게 유동되고, (c) 용출 액체가 포획 장소로 유동하여 고정된 자성 입자를 둘러싸도록, 도관에 용출 액체를 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 제2 시료 액체의 유동 후, 자기장을 제거하여 자성 입자를 제2 시료 액체로 이동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 제2 시료 액체 및 캡슐화 액체가 복합 액체 세포(composite liquid cell)를 구성하는 방법.
  18. 제11항에 있어서, 포획 장소의 광학 또는 형광 호출(interrogation)로 마커의 존재 여부를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 도관이 모세관 튜브인 방법.
  20. 지정된 포획 장소를 갖는 도관; 상기 도관 내 한 위치에 정압 또는 부압을 인가하거나 외부압을 인가하지 않도록 구성된 펌프; 작동시에 포획 장소에서 자기장을 인가하고 비작동시에 자기장을 실질적으로 인가하지 않도록 구성된 자기장 원; 및 펌프, 자기장 원, 또는 이들 둘 다를 작동할 수 있도록 펌프 및 자기장 원에 작동가능하게 부착된 제어기를 포함하는 액체 처리 시스템으로서,
    상기 제어기는
    캡슐화 액체가 도관에서 유동하도록 펌프를 작동시키고;
    자성 입자를 함유하는 시료 액체가 (a) 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 도관 내 포획 장소에 위치하는 방식으로 시료 액체가 도관에서 유동하도록 펌프를 작동시키고;
    자성 입자가 포획 장소에서 고정되도록 자기장 원을 작동시키고;
    (a) 용출 액체가 캡슐화 액체로 둘러싸이고, (b) 시료 액체가 포획 장소로부터 멀어지게 유동되고, (c) 용출 액체가 포획 장소로 유동하여 자성 입자를 둘러싸는 방식으로 용출 액체가 도관에서 유동하도록 펌프를 작동시키게 프로그램화된,
    액체 처리 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 도관이 모세관 튜브인 시스템.
  22. 제20항에 있어서, 캡슐화 액체, 시료 액체 및 용출 액체가 펌프에 의해 도관에 인가된 부압으로 유동되는 시스템.
  23. 제20항에 있어서, 캡슐화 액체, 시료 액체 및 용출 액체가 펌프에 의해 도관에 인가된 정압으로 유동되는 시스템.
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