KR102022118B1 - 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 세린 유도체 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관-뇌 관문 (blood-brain barrier, BBB)에 대한 투과력이 개선된 신규한 세린 유도체 화합물 (serine derivative compound) 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, L-세린 (L-serine)과 비교하여 혈관-뇌 관문 투과력이 보다 개선된 신규한 세린 유도체 화합물과 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증 등의 중추신경계 질환 (centralnervous system diseases)의 예방 또는 치료/개선를 위한 약학 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명의 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등의 유효성분으로서 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 L-세린과 비교하여 현저히 개선된 혈관-뇌 관문 투과율을 나타내며, 신경세포의 증식을 활성화시키고, 산화적 스트레스에 의한 미토콘드리아 막전위 손상 및/또는 소포체 스트레스에 따른 신경세포사멸을 억제하는 신경세포 보호 효과를 통하여 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증 등의 중추신경계 질환의 예방, 치료 및 개선의 효과가 우수하므로, 상기 화합물 등은 의약 산업, 식품 산업 및 축산업에 매우 유용한 발명이다.

Description

중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 세린 유도체 화합물{SERINE DERIVATIVE COMPOUND FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF CENTRALNERVOUS SYSTEM DISEASES}

본 발명은 혈관-뇌 관문 (blood-brain barrier, BBB)에 대한 투과력이 개선된 신규한 세린 유도체 화합물 (serine derivative compound) 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, L-세린 (L-serine)과 비교하여 혈관-뇌 관문 투과력이 보다 개선된 신규한 세린 유도체 화합물과 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증 등의 중추신경계 질환 (centralnervous system diseases)의 예방 또는 치료/개선를 위한 약학 조성물 등에 관한 것이다.

L-세린은 생체 내에서 단백질의 구성 성분일 뿐만 아니라, 퓨린 (purine), 피리미딘 (pyrimidine), 글리신 (glycine), 시스테인 (cystein) 등의 생합성과 뇌에서의 스핑고미엘린 (sphingomyeline), 세레브로시드 (cerebrosides), D-세린 (D-serine) 등의 생합성에도 중요하게 관여하는 아미노산으로서, 식품으로 공급될 수 있으나, 생체에서 합성이 가능하여 비필수 아미노산으로 분류된다. 그러나, L-세린은 혈관-뇌 관문을 통과하는데 낮은 투과력을 나타내어, 뇌에서의 생합성 결함이 소뇌증, 뇌전증, 지적장애 등의 뇌신경 발달 장애의 병인으로 알려진다. 따라서, 최근에 L-세린은 "conditionally essential amino acid"로 인식되고 있다 [Smith QR, 1987; de Koning et al., 2003; Metcalf et al., 2018].

뇌에서의 세린 생합성 경로의 결함에 의한 뇌신경 발달 장애의 병인으로는 L-세린이 신경세포의 신경영양인자 (neurotrophic factor)로서 작용할 뿐 아니라 [Furuya et al., 2000], N-메틸-D-아스파르테이트 (N-methyl-D-aspartate, NMDA) 수용체의 공작용제 (co-agonist)인 D-세린 공급과 연관하여 뇌 신경 발달, 시냅스 정교화 (synapse refinement), 신경 가소성 (neuronal plasticity) 및 흥분세포독성 (excitotoxicity) 등에 중요한 역할을 하기 때문인 것으로 보고되었다 [Wolosker et al., 2002; Lench et al., 2014].

세린의 생합성 유전자인 3-포스포글리세레이트 디하이드로게나아제 (3-phosphoglycerate dehydrogenase, PHGDH), 포스포세린 아미노트랜스페라아제 (phosphoserine aminotransferase, PSAT) 및 포스포세린 포스파타아제 (phosphoserine phosphatase, PSP)의 변이에 따른 세린 대사 결함 환자에서 선천성 정신지체장애, 사지 기형 (limb malformation), 소두증 (microcephaly), 신경관 결손 (neural tube defects)이 확인되고, 이들 환자에게 L-세린을 100~600 mg/kg/day로 경구 투여하면 증상 개선 및 치료가 가능하고 [Pineda et al., 2000; De Koning et al., 2002], 세린 200~700 mg/kg과 글라이신 200~300 mg/kg을 동시에 투여하면 경련 감소, 뇌백질 볼륨 증가 및 수초화 회복이 된다고 보고 [Tabatabaie et al., 2011; El-Hattab 2016] 등의 연구 결과를 바탕으로 하여, 뇌에서의 세린 대사 결함에 따라 요구되는 L-세린을 공급하는 것이 타겟 질환 치료에 매우 중요하다고 알려지게 되었다.

또한, β-N-메틸아미노-L-알라닌 (β-N-methylamino-L-alanine, L-BMAA)에 의한 괌인의 근위축성 측색 경화증 (Guamanian amyotrophic lateral sclerosis, ALS)/파킨슨증 치매 복합체 (Parkinsonism dementia complex, PDC) 치료 연구 [Dunlop et al., 2018]와 근위축성 측색 경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis) 치료를 위한 임상 연구에 L-세린의 효과가 보고 [Dunlop et al., 2018]되면서 L-세린의 신경질환 치료제로서의 가능성이 크게 알려지게 되었다.

이와 같은 L-세린의 치료제로서의 잠재성 (therapeuic potential)은 세린이 티미딘 (thymidine)과 퓨린 생합성에 필요한 하나의 탄소 (one-carbon)를 폴레이트 사이클 (folate cycle)로 제공하고, 생체 내 산화환원 (redox) 항상성을 유지할 뿐 아니라, 글리신과 시스테인 전구체 및 세포성 항산화제 (cellular antioxidant)인 글루타치온 (GSH)의 항산화계 전구체로도 이용되기 때문이다.

한편, 자폐스펙트럼장애 (autism spectrum disoeder, ASD)를 포함한 인지 장애 [Valenti et al., 2014], 알츠하이머병 (Alzheimer) [Wang et al., 2014], 파킨슨병 (Parkinson's Disease) [Franco-Iborra et al., 2018]과 근위축성 측색 경화증 (amyotropic lateral sclerosis, ALS) [Cozzolino and Carri, 2012]과 같은 신경계 질환의 발병 원인이 생체 에너지 대사와 산화환원 유지에 밀접한 관계가 있는 미토콘드리아의 손상에 따른 산화적 스트레스에 의한 신경세포사멸에 기인한다고 보고되고 있다. 미토콘드리아는 세포의 사멸 (apoptosis) 또는 괴사 (necrosis)의 실행기관으로서 외부 환경적 스트레스로부터 세포 항상성 유지를 위해 미토콘드리아의 분열 및 융합과 같은 미토콘드리아 수의 양적 조절을 수행하여 세포를 보호하거나 손상된 세포를 회복 또는 제거한다 [Youle and van der Bliek, 2012; Ni et al., 2014].

특히, 신경세포는 타 조직의 세포에 비해 높은 에너지 대사를 요구하고, 과산화 (peroxidation)되기 쉬운 지방산과 금속이온 비율이 높으면서 세포 항산화계 수준이 비교적 낮은 분열 후 비증식 세포 (post-mitotic non-proliferating cell)로서, 활성 산소종이나 활성 질소종에 의한 산화적 스트레스에 매우 취약하다 [Ogawa et al., 2007; Bhat et al., 2015]. 이와 같은 신경세포의 특징에 기인하여, 주 발병 원인은 서로 다르나, 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군과 같은 신경 발달 장애와, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증과 같은 퇴행성 신경 질환에 있어 공통적 증상은 산화적 스트레스에 의한 미토콘드리아 기능장애 (mitochondrial dysfunction)라고 보고되고 있다.

본 발명은 상기 종래 기술의 연장선 상에서 논의될 수 있는 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는, 혈관-뇌 관문에 대한 투과력이 현저히 개선된 신규한 세린 유도체 화합물 (serine derivative compound) 및 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증 등의 중추신경계 질환 (centralnervous system diseases)의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물 등을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물, 상기 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 수화물 또는 이성질체를 제공한다:

(Ⅰ)

또한, 본 발명은 2-클로로트리틸 클로라이드 레진 (2-Chlorotrityl chloride resin)에 H-Ser(Trt)-OH를 연속 3회 도입하고, H-Lys(Boc)-OH를 도입한 후, 레진을 절단하는 단계를 포함하는 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 중추신경계 질환은 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

상기 중추 신경계 질환은 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 신경세포사멸 억제용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인 비트로 (in vitro) 상에서, 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 신경세포에 처리하는 것을 포함하는 신경세포의 세포사멸 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등의 유효성분으로서 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 L-세린과 비교하여 현저히 개선된 혈관-뇌 관문 투과율을 나타내며, 신경세포의 증식을 활성화시키고, 산화적 스트레스에 의한 미토콘드리아 막전위 손상 및/또는 소포체 스트레스에 따른 신경세포사멸을 억제하는 신경세포 보호 효과를 통하여 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증 등의 중추신경계 질환의 예방, 치료 및 개선의 효과가 우수하므로, 상기 화합물 등은 의약 산업, 식품 산업 및 축산업에 매우 유용한 발명이다.

도 1은 본 발명의 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 세린 유도체 화합물 (이하, "AST-009"로도 표시됨)의 처리 농도에 따른 mouse hippocampal neuronal HT-22 cells의 세포 활성화를 보여준다. (A)는 세린/글라이신 결핍 배지에서의 cell viability를 나타내고, (B)는 완전 배지에서의 cell viability를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 세린 유도체 화합물 (AST-009)의 처리 농도에 따른 DMNQ (2,3-dimethoxy-1,4-napthoquinone)가 처리된 mouse hippocampal neuronal HT-22 cells의 세포 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 세린 유도체 화합물 (AST-009)을 ICR 마우스에 투여한 후, 혈액과 뇌에 분포하는 농도를 정량하고, 뇌/혈중 비율을 구하여 약물의 혈관-뇌 관문 투과력을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 신경발달장애를 갖는 환자에게 효과를 나타내는 것으로 알려진 L-세린의 낮은 혈관-뇌 관문 투과력을 개선하고, 선천성 신경 질환 및 퇴행성 신경 질환 등 중추신경계와 관련된 질환에 효과를 나타낼 수 있는 신규한 세린 유도체 화합물을 개발하고자 하였다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물, 상기 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 수화물 또는 이성질체를 제공한다:

(Ⅰ)

상기 화학식 (I)의 화합물은 염기-부가 염 또는 산-부가 염의 형태로 존재할 수 있다. 상기 부가 염은 본 발명의 일부에 포함된다. 상기 염은 유리하게는 약학적으로 허용가능한 산에 의해 제조되지만, 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물을 정제하거나 분리하는데 유용한 다른 산들의 염도 역시 본 발명의 일부에 포함된다. 상기 산은, 예를 들어, 피크르산, 옥살산 또는 광학활성산, 예컨대, 타르타르산, 디벤조일타르타르산, 만델산 또는 캠퍼설폰산, 및 생리학적으로 허용가능한 염, 예컨대, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 설페이트, 히드로겐 설페이트, 디히드로겐 포스페이트, 말레이트, 푸마레이트, 2-나프탈렌설포네이트 또는 파라-톨루엔설포네이트를 형성하는 산일수 있다. 생리학적으로 허용가능한 염에 대해서는, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002)]을 참조할 수 있다.

상기 용매화물 또는 수화물은 합성 과정 이후에 직접 획득될 수 있으며, 화합물 (I)은 수화물, 예컨대, 일수화물 또는 반수화물의 형태로 분리되거나, 또는 반응 또는 정제 용매의 용매화물의 형태로 분리될 수 있다.

또한, 상기 화학식 (I)의 화합물은 이성질체, 예를 들어, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 회전이성질체의 형태로 존재할 수 있다. 상기 화학식 (I)의 화합물의 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 회전이성질체는 본 발명의 일부에 포함된다.

본 발명의 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기와 같은 제조 방법에 의하여 높은 수율과 순도로 합성될 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명은 2-클로로트리틸 클로라이드 레진 (2-Chlorotrityl chloride resin)에 H-Ser(Trt)-OH를 연속 3회 도입하고, H-Lys(Boc)-OH를 도입한 후, 레진을 절단하는 단계를 포함하는 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물의 제조 방법을 제공한다.

화학식 (Ⅰ)의 세린 유도체 화합물의 구체적인 제조 방법을 합성계획 (scheme)을 참고하여 설명하면 다음과 같다:

[Scheme]

(1) CLTR Swelling 및 H-Ser(Trt)-OH 도입

1) 4 L반응기에 2-Chlorotrityl chloride resin (0.1mmol)과 MC (0.4 L)를 넣고, 2 시간 동안 swelling 한다.

2) Swelling된 resin에 DMF (0.2 L)에 Fmoc-Ser(trt)-OH (1.5 eq)와 DIPEA (3 eq)를 넣고, RT에서 6 시간 동안 반응한다.

3) 반응 완료 후, DMF (0.2 L)로 세척한다.

4) MC/MeOH/DIPEA (255:30:15) 혼합액을 넣어 실온에서 2 시간 동안 Capping shaking 반응을 진행한다.

5) Capping 완료 후, DMF (0.2 L)로 세척한다.

6) De-blocking (DMF 0.3 L 중의 20 % piperidine) 용액을 넣고 실온에서 2 시간 동안 반응한다.

7) De-Blocikng 완료 후, DMF (0.2 L)로 3 회 세척하고, MC (0.2 L)로 2 회 세척한다.

(2) H-Ser(Trt)-OH 도입

1) 상기 (1) 공정을 완료한 후, 그 반응기 내에서 Fmoc-Ser(trt)-OH (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DMF (0.3 L)를 녹인 후, HBTU (1.5 eq)를 DMF (0.2 L)에 녹인 용액에 DIPEA (2 eq)를 신속히 넣어 반응기에 넣고 6 시간 이상 상온에서 반응한다.

2) 반응 완료시 DMF (0.2 L)로 세척한다.

3) De-blocking (DMF 0.3 L 중의 20 % piperidine) 용액을 넣고 실온에서 2 시간 동안 반응한다.

4) DMF (0.2 L)로 3 회, MC (0.2 L)로 2 회 세척한다.

(3) H-Ser(Trt)-OH 도입

1) 상기 (2) 공정을 완료한 후, 그 반응기 내에서 Fmoc-Ser(trt)-OH (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DMF (0.3 L)를 녹인 후, HBTU (1.5 eq)를 DMF (0.2 L)에 녹인 용액에 DIPEA (2 eq)를 신속히 반응기에 넣고 6 시간 이상 반응한다.

2) 반응 완료시 DMF (0.2 L)로 세척한다.

3) De-blocking (DMF 0.3 L 중의 20 % piperidine) 용액을 넣고 상온에서 2 시간 동안 반응한다.

4) DMF (0.2 L)로 3 회, MC (0.2 L)로 2 회 세척한다.

(4) H-Lys(Boc)-OH 도입

1) 상기 (3) 공정을 완료한 후, 그 반응기 내에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DMF (0.3 L)를 녹인 후, HBTU (1.5 eq)를 DMF (0.2 L)에 녹인 용액에 DIPEA (2 eq)를 신속히 반응기에 넣고 6 시간 이상 반응한다.

2) 반응 완료시 DMF (0.2 L)로 세척한다.

3) De-blocking (DMF 0.3 L 중의 20 % piperidine) 용액을 넣고 상온에서 2 시간 동안 반응한다.

4) DMF (0.2 L)로 3 회, MC (0.2 L)로 2 회 세척한다.

(5) Cleavage Crude H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH의 합성

1) 합성이 완료된 resin에 TFA, TIS, H₂0를 넣고 cleavage한다.

2) Cleavage된 Resin을 Glass filter를 통하여 Resin을 여과하고, 여과된 여액을 Ether에 분산 후, 원심분리하여 Crude 제품을 얻는다.

(6) 최종 화합물(H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH)의 정제

1) 건조한 Crude 제품을 물에 녹이고, Prep LC를 이용하여 순도 90 % 이상의 H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH를 얻는다.

2) 정제된 제품을 동결 건조하여 최종 H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH을 얻는다.

본 발명의 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 L-세린의 낮은 혈관-뇌 관문 투과력을 개선하고, 선천성 신경 질환 및 퇴행성 신경 질환 등 중추신경계와 관련된 질환에 효과를 나타낼 수 있으므로, 상기 질환들의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 의약 용도로 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 유효성분은 의약 용도로서 중추신경계 관련 질환에 적용될 수 있으며, 상기 중추신경계 질환은 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 유효성분은 신경세포 증식 활성화를 유도하는 것이 바람직하다. 상기 용어 "신경세포 증식 활성화"는 신경세포의 세포 분열을 촉진시키는 작용, 신경세포의 사멸이나 괴사를 억제할 수 있는 작용을 모두 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

상기 유효성분은 신경세포 보호 활성을 갖는 것이 바람직하다. 상기 용어 "신경세포 보호"는 신경세포가 외부적 요인이나 세포 내부적 요인에 의하여 세포사멸이나 괴사가 발생하는 것을 억제할 수 있는 작용을 의미하는 것이다.

상기 신경세포 보호는 산화적 스트레스로부터의 보호인 것이 바람직하다. 상기 용어 "산화적 스트레스"는 세포가 활성 산소종에 의하여 정상적이지 않은 상태에 놓인 것을 의미한다.

상기 산화적 스트레스로부터의 보호는 미토콘드리아 막전위 손상에 따른 세포사멸의 억제에 의한 것이 바람직하다.

상기 산화적 스트레스로부터의 보호는 소포체 스트레스에 따른 세포사멸의 억제에 의한 것이 바람직하다.

상기 유효성분은 혈관-뇌 관문에 대한 투과력을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 유효성분은 L-세린이 갖는 낮은 혈관-뇌 관문 투과력을 현저히 개선시킨 것으로서, L-세린 생합성 결함을 갖는 환자에 투여시 뇌로 효과적으로 전달될 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 당 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 100 내지 3,000 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3 회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 중추신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

상기 중추 신경계 질환은 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 치매, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군, 취약X증후군, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측색 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 건강 기능 식품은 중추신경계 관련 질환의 예방과 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g을 사용한다.

상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 상기 활성 분획물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.

상기 사료첨가용 조성물은 동물용일 수 있다. 상기 "동물"은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배성 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 성게류 또는 해삼류와 같은 극피동물, 게, 새우, 대하 등의 갑각류를 포함하는 절지동물, 두족류, 복족류 또는 이매패류 등의 연체동물, 참돔, 도미, 대구, 가자미, 넙치 등의 어류, 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 돼지, 소, 양, 말, 염소, 개, 고양이 등의 포유류일 수 있다.

상기 사료첨가용 조성물은 본 발명의 유효성분에 곡물, 식물성 단백질 사료, 동물성 단백질 사료, 당분 또는 유제품을 추가로 포함할 수 있다. 상기 곡물은 구체적으로는 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀일 수 있고, 상기 식물성 단백질 사료는 구체적으로는 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것일 수 있으며, 상기 동물성 단백질 사료는 구체적으로는 혈분, 육분, 골분 및 생선분일 수 있고, 상기 당분 또는 유제품은 구체적으로는 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분일 수 있다.

상기 사료첨가용 조성물은 추가로 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성창 촉진제 또는 질병 예방제와 같은 성분을 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 사료첨가용 조성물은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 최종 생산된 사료 1kg을 기준으로 상기 사료첨가용 조성물이 0.1 내지 100 g 포함될 수 있다.

또한, 상기 사료첨가용 조성물은 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질로 제조될 수 있으며, 상기 조성물은 메쉬로 공급되거나 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성시킬 수 있으며, 저장을 위해 펠렛화, 팽창화 또는 압출 공정을 거칠 수 있으며, 저장의 용이성을 위해 바람직하게는 과잉의 물이 건조 제거될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 연구용 시약 조성물, 바람직하게는 신경세포사멸 억제용 시약 조성물을 제공한다.

상기 신경세포는 프라이머리 신경세포, 형질전환 신경세포, 또는 신경세포주일 수 있다.

상기 시약은 신경세포 증식 활성화, 미토콘드리아의 산소 소비율 증가에 따른 신경세포 증식 활성화, 신경세포 보호, 산화적 스트레스에 기인한 신경세포 손상의 억제, 산화적 스트레스에 의한 미토콘드리아 막전위 손상에 따른 신경세포사멸의 억제, 산화적 스트레스에 의한 소포체 스트레스에 따른 신경세포사멸의 억제의 용도로서 적용될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 시약을 신경세포에 처리하는 것을 포함하는 신경세포의 세포사멸 억제 방법을 제공한다.

상기 방법에 의하여 신경세포의 증식, 미토콘드리아의 산소 소비율 증가에 따른 신경세포 증식 활성화, 신경세포 보호, 산화적 스트레스에 기인한 신경세포 손상의 억제, 산화적 스트레스에 의한 미토콘드리아 막전위 손상에 따른 신경세포사멸의 억제, 산화적 스트레스에 의한 소포체 스트레스에 따른 신경세포사멸의 억제의 효과를 얻을 수 있을 것이다.

상기 방법에 있어서, 세포 배양법, 시약 처리법 등은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이며, 특히, 시약의 처리 농도 등은 본 명세서에 기재된 사항의 범위 내 또는 그 효과가 변화되지 않는 범위 내에서의 적절한 변형이 가능하다.

상기 방법은 인 비트로 (in vitro) 상에서 수행되는 것이 바람직하다.

이하에서는, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것은 아니다.

[실시예]

1. 재료 및 방법

1.1. 배지 및 시약

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)와 스트렙토마이신-페니실린 (streptomycin-penicillin) 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서 구입하였다.

1.2. 신규 세린 유도체 화합물 (AST-009)의 제조

4 L 반응기에 2-Chlorotrityl chloride resin (0.1 mmol)과 MC (0.4 L)를 넣고, 2 시간 동안 swelling하였다. Swelling된 resin에 DMF (0.2 L) 중의 Fmoc-Ser(trt)-OH (1.5 eq)와 DIPEA (3 eq)를 넣고, RT에서 6 시간 동안 반응시키고, 반응 완료 후, DMF (0.2 L)로 세척하였다. MC/MeOH/DIPEA (255:30:15) 혼합액을 넣어 RT에서 2 시간 동안 Capping shaking 반응을 진행한 후, DMF (0.2 L)로 세척하였다. De-blocking (20 % piperidine in DMF=0.3 L)) 용액을 넣고 RT에서 2 시간 동안 반응시키고, De-Blocikng 완료 후, DMF (0.2 L)로 3 회 세척하고, MC (0.2 L)로 2 회 세척하였다. 다음으로, 상기 반응기에 Fmoc-Ser(trt)-OH (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DMF (0.3 L)를 녹인 후, HBTU (.15 eq)를 DMF (0.2 L)에 녹인 용액에 DIPEA (2 eq)를 신속히 반응기에 넣고, 6 시간 이상 상온에서 반응시켰다. 반응 완료시 DMF (0.2 L)로 세척하고, De-blocking (20 % piperidine in DMF=0.3 L) 용액을 넣고 RT에서 2 시간 반응시킨 후, DMF (0.2 L)로 3 회, MC (0.2 L)로 2 회 세척하였다. 다음으로, 그 반응기에 Fmoc-Ser(trt)-OH (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DMF (0.3 L)를 녹인 후, HBTU (1.5 eq)를 DMF (0.2 L)에 녹인 용액에 DIPEA (2 eq)를 신속히 반응기에 넣고 6 시간 이상 반응시킨 후, DMF (0.2 L)로 세척하였다. De-blocking (20 % piperidine in DMF=0.3 L) 용액을 넣고 RT에서 2 시간 동안 반응한 후, DMF (0.2 L)로 3 회, MC (0.2 L)로 2 회 세척하였다. 다음으로, 그 반응기에 Fmoc-Lys(Boc)-OH (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DMF (0.3 L)를 녹인 후, HBTU (1.5 eq)를 DMF (0.2 L)에 녹인 용액에 DIPEA (2 eq)를 신속히 반응기에 넣고, 6 시간 이상 반응시킨 후, DMF (0.2 L)로 세척하였다. De-blocking (20 % piperidine in DMF=0.3 L) 용액을 넣고 RT에서 2 시간 반응시킨 후, 다시 DMF (0.2 L)로 3 회, MC (0.2 L)로 2 회 세척하였다. 다음으로, 합성이 완료된 resin에 TFA, TIS, H₂0를 넣고 cleavage한 후, Cleavage된 Resin을 Glass filter를 통하여 Resin을 여과하고, 여과된 여액을 Ether에 분산 후, 원심분리하여 Crude 제품을 얻었다. 마지막으로, 건조한 Crude 제품을 물에 녹이고, Prep LC를 이용하여 순도 90 % 이상의 H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH를 얻은 후, 정제된 제품을 동결 건조하여 최종 H-Lys-Ser-Ser-Ser-OH을 얻었다.

1.3. 세포 배양

Murine hippocampal neuronal cell line HT-22은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 fetal bovine serum (FBS) 10 %와 100 μg/ml gentamycin을 가한 배지에서 37 ℃, 5 % CO₂ atmosphere 환경 하에서 배양하였다. 본 실시예에는 세포계대 회수 15 회 이하인 세포를 사용하였다.

1.4. Cell viability assay

세포 증식 활성은 cell viability를 측정하는 MTT assay로 조사하였다. 먼저, hippocampal neuronal cell HT-22 (1×10⁴ cells)를 단계별로 희석한 시료용액과 함께 96-well plates에서 16 시간 incubation시킨 다음, 50 μl의 MTT (3-(4,5-dimethyl thiazolyl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액 (1.1 mg/ml)과 혼합한 후, 4 시간 동안 더 배양하였다. 형성된 formazan crystal을 150 μl의 MTT 용액으로 용해시키고, 이를 plate reader를 이용하여 540 nm에서 OD를 측정하였다.

1.5. Flow cytometry 분석

먼저, 1×10⁶ 세포를 2 %의 FBS를 함유한 PBS 용액으로 3 회 수세한 후, 수세한 세포를 70 % ethanol에 현탁하고 4 ℃에서 1 시간 동안 고정한다. 고정된 세포를 다시 같은 용액으로 2 회 세척한 후, 50 μg/ml 농도의 RNase A 용액 250 μl에 현탁하고, 37 ℃에서 30 분 동안 처리하여 세포 내 RNA를 제거하고, 50 μg/ml의 propidium iodide/1.12 % sodium citrate buffer (pH 8.45) 용액 250 μl를 가해 실온에서 20 분 동안 세포 내 DNA를 염색한다. 이를 flow cytometer (FACS Calibur)로 분석하여 각 세포 내 염색된 DNA의 함량을 기준으로 세포주기의 분포를 조사하였다.

1.6. Blood-Brain Barrier (BBB) 투과력 검정

L-세린, AST-099를 500 mg/kg로 7 주령의 ICR 마우스 (n = 3)에 투여한 후, 뇌 조직과 혈액을 채취하여 LC/Ms를 이용하여 혈액과 뇌에 분포하는 L-세린의 농도를 정량하고, 뇌/혈중 비율을 구하여 약물간의 BBB 투과력을 비교하였다.

2. 결 과

2.1. 신규 L-세린 유도체 개발

L-세린은 생체 내에서 생합성되는 비필수 아미노산이나 낮은 BBB 투과력으로 뇌에서 충분한 L-세린 공급이 되지 않으면 심각한 신경발달장애의 원인이 된다. 혈중의 L-세린은 neutral amino acid transporter ASC-1 (alanine, serine, cysteine transporters)에 의해 선택적으로 수송되기 때문에 신경발달장애 관련 질환의 개선 및 치료를 위한 L-세린 공급에 제한이 많다. 따라서, L-세린과 같이 세포보호 활성이 뛰어나면서 BBB 투과능도 개선된 세린 유도체를 개발하고자 15 여 종의 L-세린 유도체를 개발하였다. 개발한 15 종 중 약물동태학적 평가 및 세포독성 평가를 통하여 본 발명의 세린 유도체 화합물 (AST-009)을 선별하였다.

2.2. 신경세포 증식 활성 평가

선별된 본 발명의 세린 유도체 화합물 (AST-009)의 신경세포 증식 활성을 평가하기 위하여, AST-009와 함께 L-세린를 대조구로 하여 세포 증식 활성을 농도별 (25~10,000 μg)로 첨가하여 비교하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 완전 배지에서는 L-세린과 AST-009간에 세포증식에 대한 영향은 큰 차이가 없었으나 (도 1의 B), L-세린과 글라이신 결핍 배지에서는 L-세린과 AST-009 공히 무첨가구에 비해 HT-22세포 증식을 활성화시켰다 (도 1의 A). 이때, L-세린은 처리 농도 500 μg/ml까지 세포증식을 최대 125 %까지 활성화시켰으나, 1 mg/ml 농도 이상에서는 오히려 세포증식을 약간 저해하였다. 이에 반해, AST-009은 처리 농도 10,000 μg/ml (=10 mg/ml)까지 세포 독성 없이 hippocampal HT-22 세포의 증식을 139 %까지 활성화시킴을 확인하였다.

2.3. 신경세포 보호 활성 평가

선발한 약물 (AST-009)의 DMNQ에 의해 유도되는 산화적 스트레스 (oxidative stress)에 대한 세포 보호 활성을 DiOC₆ 염색법으로 비교한 결과, 도 2와 같이, DMNQ (10 μM) 단독 처리 시 세포 손상율이 77.8 %인데 반해, L-세린을 0.5, 1, 5 mg/ml 농도로 처리하면, membrane potential loss 비율이 농도 의존적으로 보호되어 59.9 %, 58.7 %, 및 54.5 %로 회복되었다. 이에 반해, AST-009의 경우, 같은 처리 농도에서 64.3 %, 45.5 %, 및 20.0 %로 L-세린 처리구보다 미토콘드리아 membrane potential loss가 낮아져 세포보호 활성이 훨씬 강함을 알 수 있었다. 즉, AST-009가 L-세린보다 세포 증식을 활성화시킬 뿐 아니라, 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 활성도 L-세린보다 우수함을 확인할 수 있었다.

2.4. 신규 L-세린 유도체의 Blood-Brain Barrier (BBB) 투과력 검정

선발한 세린 유도체 AST-009의 뇌로 이행 여부를 L-세린과 비교하였으며, 그 결과를 도 3 및 표 1에 나타내었다. 도 3과 표 1에 나타난 바와 같이, AST-009 약물의 C_brain/C_plasma 수치는 L-세린의 4.16±2.03보다 높은 6.66±1.03으로 나타나 BBB 투과력이 L-세린보다 현저히 개선된 약물로 확인되었다.

[표 1]

Claims (9)

1. 삭제
2. 2-클로로트리틸 클로라이드 레진 (2-Chlorotrityl chloride resin)에 H-Ser(Trt)-OH를 연속 3회 도입하고, H-Lys(Boc)-OH를 도입한 후, 레진을 절단하는 단계를 포함하는 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물의 제조 방법:
   
   

   

   
   (Ⅰ)
3. 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군 및 취약X증후군으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
   

   

   
   (Ⅰ)
4. 삭제
5. 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인지장애, 지적장애, 소뇌증, 뇌전증, 신경발달장애, 자폐스펙트럼장애, 다운증후군, 레트증후군 및 취약X증후군으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품:
   

   

   
   (Ⅰ)
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제

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