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KR102015116B1 - 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도 - Google Patents

표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도 Download PDF

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KR102015116B1
KR102015116B1 KR1020180052157A KR20180052157A KR102015116B1 KR 102015116 B1 KR102015116 B1 KR 102015116B1 KR 1020180052157 A KR1020180052157 A KR 1020180052157A KR 20180052157 A KR20180052157 A KR 20180052157A KR 102015116 B1 KR102015116 B1 KR 102015116B1
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leu
ala
ser
extracellular vesicles
lys
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KR1020180052157A
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윤지애
정현욱
추진호
송수민
송지윤
김용인
조승기
Original Assignee
(주)메디톡스
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Abstract

표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 그로부터 분리된 세포외 소낭 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도{Extracellular vesicle isolated from recombinant microorganism comprising polynucleotide encoding target protein and use thereof}
표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물 유래 세포외 소낭 및 그의 용도에 관한 것이다.
대부분의 동물세포는 다양한 크기와 성분을 갖는 세포 내 기원의 세포외 소낭을 분비한다. 원핵생물 및 진핵생물은 모두 세포외 소낭을 분비한다고 알려져 있다. 종래 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 유래된 세포외 소낭이 알려져 있었다(한국특허 공개 10-2011-0025603).
세포외 소낭은 작게는 직경 약 20 nm부터 크게는 직경 약 5 μm를 갖는 막 구조 소낭체이다. 세포외 소낭은 그 크기와 구성에 있어서 이질성이 있고, 엑소좀(exosome, 약 30 내지 100 nm), 엑토좀(ectosome), 마이크로소낭(microvesicle, 약 100-1,000 nm), 마이크로입자(microparticle), 외막소낭 (outer membrane vesicle) 등의 다수의 상이한 종을 포함한다. 세포외 소낭의 특성은 그 기원이 되는 세포의 특성에 영향을 받는다.
한편, 세포 내 물질(예컨대, DNA, RNA, 단백질 등)은 세포외 소낭에 자연적으로 탑재되어 세포외로 분비된다. 세포외 소낭은 생체 막 성분과 동일하여 생체 호환성(biocompatibility)이 높고, 그 크기가 나노 크기 정도로 작아 물질 전달 효율이 우수하다. 따라서, 기존의 리포좀 등의 전달 시스템을 대신하여 세포외 소낭을 이용한 약물을 전달하는 연구가 진행 중이다. 그러나, 세포외 소낭에 탑재 시 표적 단백질 외에 유전 물질뿐만 아니라 다른 불필요한 세포 내 단백질 등의 세포 내 물질들이 함께 탑재되므로 표적 단백질의 세포외 소낭으로의 탑재 효율이 낮았다. 따라서, 세포외 소낭에 표적 단백질을 우수한 효율로 안정적으로 탑재시킬 수 있는 기술에 대한 요구가 존재했다. 본 발명자들은 세포외 소낭에 표적 단백질을 우수한 효율로 안정적으로 탑재시켜, 자연적으로 대량의 단백질이 탑재된 세포외 소낭을 수득하는 기술을 발명하였다.
일 양상은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 미생물은 유산균 또는 효모인 것인 재조합 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 미생물 유래의 세포외 소낭을 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 미생물 유래의 세포외 소낭 및 담체를 유효 성분으로 포함하는 표적 단백질을 개체에게 전달하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체를 화장하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기한 미생물을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 세포외 소낭을 분리하는 단계를 포함하는, 세포외 소낭을 생산하는 방법을 제공한다.
제1 양상은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 미생물은 유산균 또는 효모인 것인 재조합 미생물을 제공한다.
상기 표적 단백질은 신호 펩티드가 연결되어 있는 것, 즉 신호 펩티드와 표적 단백질의 융합 단백질의 형태일 수 있다. 상기 미생물은 상기 표적 단백질을 증가된 양으로 상기 세포외 소낭에 탑재하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 재조합 미생물은 신호 펩티드가 없는 상기 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물에 비하여 증가된 세포외 소낭(extracellular vesicle: EV) 탑재능을 갖는 것일 수 있다. 세포외 소낭 탑재능이란 표적 단백질이 EV 중에 포함되는 정도 또는 표적 단백질이 EV 중에 발현되는 정도를 나타낸다. 세포외 소낭 탑재능은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 양친 미생물에 대한 탑재능을 나타내는 것일 수 있다.
상기 신호 펩티드는 서열번호 21 내지 60의 아미노산 서열 중 어느 하나와 이를 포함하는 서열이거나 이와 유사한 서열일 수 있다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus, Lactococcus, 및 Bifidobacterium 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 속하는 종인 것일 수 있다. 상기 유산균은 Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, 또는 Lactobacillus plantarum일 수 있다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 효모는 Saccharomyces, Pichia, 및 Hansenula 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 속하는 종인 것일 수 있다. Saccharomyces는 S.cerevisiae일 수 있다. Pichia는 Pichia pastoris, Hansenula는 Hansenula polymorpha일 수 있다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 표적 단백질은 성장인자, 시토킨, 항체, 효소, 저해 단백질, 또는 이들의 단편인 것일 수 있다. 상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자일 수 있다. 상기 표적 단백질은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor: FGF), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor: EGF), 간세포 성자인자(hepatocyte growth factor: HGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor: IGF), 태반 성장인자(placenta growth factor: PGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor: PDGF), 형질전환 성장인자(transforming growth factor: TGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor: VEGF), 티오레독신(thioredoxin: TRX), 인터류킨-1(interleukin-1: IL-1), 인터류킨-10, 인터류킨-22, 인터류킨-13, 및 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 표적 단백질은 예를 들면, IL-22, EGF, IGF1, FGF1(이하 aFGF (acidic fibroblast growth factor)라고도 함), FGF2 (이하 bFGF (basic fibroblast growth factor)라고도 함), FGF7 (이하 KGF (keratinocyte growth factor) 라고도 함), TGFa, 및 TRX로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 신호 펩티드는 서열번호 4에 의하여 코딩되는 것, 또는 서열번호 21 내지 60의 아미노산 서열 중 어느 하나일 수 있다. 상기 신호 펩티드를 코딩하는 유전자는 신호 펩티드가 상기 표적 단백질의 N 말단에 연결되도록 연결된 것일 수 있다. 상기 신호 펩티드는 상기 단백질에 대하여 자연적인 것 또는 외래적인 것(heterologous)일 수 있다. 상기 표적 단백질은 상기 미생물에 대하여 외래 단백질(heterologous protein)일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 상기 표적 단백질을 발현하는 것일 수 있다. 상기 표적 단백질은 신호 펩티드가 잘려진 상태로 EV에 탑재되는 것일 수 있다. 상기 표적 단백질은 EV의 막 또는 그 내부에 탑재되는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 가능한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 전사 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 또는 터미네이터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 번역 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 번역 조절 서열은 리보좀 결합 자리(ribosome binding site), 또는 리보좀 진입 서열(ribosome entry site sequence)일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 미생물의 게놈에 통합되어 있거나 독립적으로 존재하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 포함된 것일 수 있다. 상기 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드, 또는 바이러스성 벡터일 수 있다.
제2 양상은 상기한 재조합 미생물로부터 분리된 세포외 소낭을 제공한다.
제3 양상은 상기한 재조합 미생물 유래의 세포외 소낭 및 담체를 유효 성분으로 포함하는 표적 단백질을 개체에게 전달하기 위한 조성물을 제공한다.
제2 또는 제3 양상에 있어서, 상기 세포외 소낭은 상기 미생물의 배양액으로부터 분리된 것일 수 있다. 즉, 상기 세포외 소낭은 세포외로 분비되는 것일 수 있다. 상기 세포외 소낭은 20 내지 500 nm, 예를 들면, 20 내지 200 nm, 100 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다. 상기 세포외 소낭은 상기한 표적 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적 단백질은 상기 세포외 소낭의 막 또는 그 내부에 위치하는 것일 수 있다.
상기 세포외 소낭은 배양액으로부터 그를 분리할 수 있는 임의의 방법에 의하여 분리된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 세포외 소낭은 원심분리, 초원심분리, 필터에 의한 여과, 한외여과, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 침전, 및 면역 침강, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동, 또는 이들의 조합에 의하여 분리될 수 있다. 상기 분리 방법은 불순물의 제거를 위한 세척, 및 농축 등의 과정을 포함할 수 있다. 상기 세포외 소낭은 하기하는 상기 세포외 소낭을 분리하는 방법에 의하여 생산된 것일 수 있다. 상기 세포외 소낭은 상기 미생물 배양액을 컷오프 100 kD 이상, 예를 들면, 300 kD 이상, 또는 500 kD 이상의 초미세필터를 사용하여 한외 여과하는 방법으로 생산된 것일 수 있다. 상기 세포외 소낭은 상기 미생물 배양액을 100,000 xg 이상의 초원심 분리에서 침강하는 것일 수 있다. 상기 분리는 하기하는 제7 양상에 따른 세포외 소낭을 생산하는 방법에 의하여 생산된 것일 수 있다.
제3 양상에 있어서, 상기 담체는 생리적으로 허용가능한 것, 예를 들면, 약제학적으로 또는 화장품 제조학적으로 허용가능한 것일 수 있다. 상기 담체는 통상적으로 사용되는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충액, 시클로덱스트린, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 담체는 항산화제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여용 제형을 갖는 것일 수 있다. 상기 비경구 투여 제형은 국소 투여 제형일 수 있다. 국소 투여 제형은 피부 또는 점막 투여 제형일 수 있다. 상기 비경구 투여 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 피부 외용제, 스프레이, 또는 퍼프의 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 피부 적용, 점막 적용, 또는 비강 투여 등에 의하여 개체에 투여될 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 달라질 수 있다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 유효 성분의 양을 의미한다. 투여량은 몸무게 70 kg인 성인 개체를 기준으로 할 때, 0.01 내지 1000 mg/일, 0.01 내지 500 mg/일이며, 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여될 수 있다.
상기 조성물은 화장용 조성물일 수 있다. 상기 화장용 조성물은 화장 조성물에 통상적으로 이용되는 성분이 포함될 수 있다. 상기 화장용 조성물은 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장용 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 클림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이일 수 있다. 상기 화장용 조성물은 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 개체서 섬유아세포 또는 각질형성세포의 성장 또는 콜라겐 합성을 촉진하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 피부 노화 방지, 또는 주름 개선을 위하여 사용하기 위한 것일 수 있다. 이 경우, 상기 표적 단백질은 성장인자일 수 있다.
상기 조성물은 상기 개체에 국소적으로 표적 단백질을 전달하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 피부, 경구, 또는 점막을 통하여 전달하기 위한 것일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 고양이, 말, 또는 돼지일 수 있다.
제5 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 개, 고양이, 말, 또는 돼지일 수 있다. 상기 질병은 염증성 질환, 창상, 아토피 피부염, 건선, 또는 여드름일 수 있다.
제6 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체를 화장하는 방법을 제공한다. 상기 투여는 개체의 피부에 도포하는 것일 수 있다. 상기 투여는 노화된 피부 또는 주름진 피부 부위에 도포하는 것일 수 있다. 상기 화장하는 방법은 노화된 피부 또는 주름진 피부를 개선하기 위한 것일 수 있다.
제7 양상은 상기한 미생물을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 세포외 소낭을 분리하는 단계를 포함하는, 세포외 소낭을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 상기 미생물의 성장에 유용한 배지 중에서 인큐베이션하는 것일 수 있다. 상기 배양은 유산균 또는 효모에 적당하다고 알려진 조건, 예를 들면, 온도 및 교반 조건에서 수행될 수 있다.
상기 배양물로부터 세포외 소낭을 분리하는 단계는 배양물로부터 세포외 소낭을 분리하는 것이면 어느 것이나 포함된다.
상기 분리하는 단계는, 상기 배양물을 원심분리하고 상등액을 얻는 단계; 상기 상등액을 여과하는 단계; 및 상기 여과물을 초원심분리하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 분리 단계에서, 상등액을 얻는 단계에서 원심분리는 1,000 내지 20,000 xg에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 상등액을 여과하는 단계에서, 상기 여과는 초미세필터를 사용한 여과일 수 있다. 상기 여과는 상기 상등액을 컷오프 100 kD 이상, 예를 들면, 300 kD 이상, 또는 500 kD 이상의 초미세필터를 사용하여 한외 여과하는 것일 수 있다. 상기 여과물을 초원심분리하여 침전물을 얻는 단계에서, 상기 초원심분리는 100,000 xg 이상, 예를 들면, 100,000 xg 내지 200,000 xg에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법은 침전물을 현탁하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 미생물에 의하면, 세포외 소낭, 또는 그로부터 표적 단백질을 효율적으로 분리하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 상기한 세포외 소낭 및 표적 단백질을 개체에게 전달하기 위한 조성물에 의하면, 표적 단백질을 개체에 효율적으로 전달하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 질병을 치료하는 방법에 의하면, 상기 질병을 효율적으로 치료할 수 있다.
다른 양상에 따른 개체를 화장하는 방법에 의하면, 개체를 효율적으로 화장할 수 있다.
다른 양상에 따른 세포외 소낭을 생산하는 방법에 의하면, 세포외 소낭을 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 표적 단백질을 효모 세포에서 발현하기 위한 발현 벡터를 나타낸다.
도 2는 p416G-MF-hEGF1 (IGF1, FGF1, FGF2, TGF alpha, 및 TRX)로 형질전환된 S.cerevisiae로부터 상등액 및 세포외 소낭에 표적 단백질이 발현된 정도를 나타내는 도면이다.
도 3은 p416G-MF-hFGF1 또는 hTRX 또는 p416G-hFGF1, 또는 hTRX로 형질전환된 S.cerevisiae로부터 상등액 및 세포외 소낭에 표적 단백질이 발현된 정도를 나타내는 도면이다.
도 4는 효모로부터 분리된 성장인자 함유 세포외 소낭의 세포 증식에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 5는 IL-22를 포함하는 세포외 소낭 및 IL-22를 포함하지 않은 세포외 소낭으로 각각 처리된 세포에서 IL-10 생산량을 나타내는 도면이다.
도 6은 CFSE로 표지된 세포외 소낭이 세포와 융합하는 정도를 세포 흐름 분석을 통하여 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 효모 유래 세포외 소낭의 피부에 대한 독성을 측정한 도면이다.
도 8은 형질전환된 유산균으로부터 분리된 EV의 크기 및 농도 분포를 나타낸 도면이다.
도 9는 EV 용액에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다.
도 10은 신호 펩티드 유전자와 융합 또는 융합되지 않은 aFGF를 코딩하는 유전자를 포함한 pMT172 재조합으로 형질전환된 LMT1-21로부터 분리된 EV에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다.
도 11은 유산균으로부터 분리된 성장인자 함유 세포외 소낭의 세포 증식에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.
도 12는 LMT1-21 유래 EV와 접촉된 세포 유래 단백질을 전기영동한 사진이다.
도 13은 CFSE로 표지된 세포외 소낭이 세포와 융합하는 정도를 세포 흐름 분석을 통하여 관찰한 결과를 나타낸다.
도 14는 효모 유래 세포외 소낭의 피부에 대한 독성을 측정한 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 효모 세포 유래의 세포외 소낭
표적 단백질을 발현하는 재조합 효모를 제작하고, 그 효모로부터 세포외 소낭을 생산하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다. 효모 세포는 Saccharomyces cerevisiae를 사용하였다.
1. 발현 벡터의 제작
도 1은 표적 단백질을 효모 세포에서 발현하기 위한 발현 벡터를 나타낸다. 이 벡터는 플라스미드 pRS416 GPD(서열번호 1)의 서열을 이용하여 제작되었으며, 표적 단백질은 hEGF1, hIGF1, hFGF1, hFGF2, hTGF alpha, 및 hTRX이다. hEGF1, hIGF1, hFGF1, hFGF2, hTGF alpha, 및 hTRX는 각각 서열번호 14, 15, 12, 13, 17, 또는 18의 아미노산 서열을 갖고, 이들은 서열번호 5, 6, 7, 8, 10 및 11의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩될 수 있다. FGF7은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 그의 아미노산 서열은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 아미노산 서열일 수 있다.
도 1의 벡터는 표적 단백질에 따라, p416G-MF-hEGF1 (IGF1, FGF1, FGF2, TGF alpha, 및 TRX)로 명명하였다.
먼저, S.cerevisiae의 코돈 사용 빈도에 따라 코돈 최적화된 표적 단백질 유전자, 즉 사람 EGF1, IGF1, FGF1, FGF2, TGF alpha, 및 TRX 유전자를 마크로젠 사에 의뢰하여 합성하였다. 이들 유전자를 p416GPD 벡터 (ATCC87360)(서열번호 1)를 사용하여, 도 1의 발현 벡터를 제작하였다. 도 1의 발현 벡터는 S.cerevisiae의 mating factor alpha-1 신호 펩티드 (MF)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4)를 표적 단백질 유전자의 상류에 연결된 서열을 포함한다. 대조군으로서, 신호 펩티드 (MF)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4)가 연결되지 않은 유전자를 사용하였다. 또한, p416GPD (ATCC 87360) 벡터 대신 p426GPD 벡터 (ATCC 87361)(서열번호 2)를 사용하여 동일하게 벡터를 제작하였다. p416GPD 벡터는 낮은 카피(low copy)로 세포 내에 존재하는 벡터이고, p426GPD는 높은 카피 (high copy)로 세포 내에 존재하는 벡터이다. p416GPD 및 p426GPD에서 GPD는 프로모터 GPD의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 나타낸다.
도 1에서, 상기 벡터는 S.cerevisiae의 복제 원점인 CEN/Ars 서열, 암피실린 저항성 유전자 Ampr 서열, 대장균 복제 원점 서열인 ColE1 ori 서열, S.cerevisiae의 프로모터 서열인 프로모터 GPD 서열, S.cerevisiae의 CYC terminator 서열인 ScCYC term 서열, 박테리아오파지의 복제 원점인 F1 ori 서열, S.cerevisiae의 프로모터, ORF, 터미네이터 서열(ScURA3p-URA3)을 포함하고 있다.
2. 효 모에서 표적 단백질의 발현
p416G-MF-hEGF1 (IGF1, FGF1, FGF2, TGF alpha, 및 TRX) 벡터를 각각 S.cerevisiae CEN.PK2-1 균주에 LiCl 방법에 따라 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환 균주를 2 mL의 minimal ura-drop out 배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. No. Y0626) 6.7 g/L, 및 Yeast synthetic drop-out without uracil (Sigma-Aldrich: Cat. No. Y1501) 1.92 g/L, 포도당 2 (w/v)%)에서 하루 동안 1차 배양하고, 배양된 균주를 카사미노산(Casamino acids)이 1 % 포함된 15 mL의 minimal ura-drop 배지에 시작 OD600이 0.5가 되도록 접종하고 본 배양을 하였다. 본 배양은 30℃에서 2일 동안 220 rpm으로 교반 배양하며, 균체를 제거한 상등액을 직접 사용한 시료군을 준비하였다. 또한, 상기 상등액을 100 kDa 컷-오프 막 (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane (100K), millipore: Cat. No. UFC910024)을 사용하여 여과하여 농축된 여과액을 얻고, 이를 50,000 g에서 2 시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하여 세포외 소낭(EV)을 분리하여 1ml PBS에 현탁하였다. 여기서 상등액 및 얻어진 세포외 소낭 시료에 대하여 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하여, 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
도 2는 p416G-MF-hEGF1 (IGF1, FGF1, FGF2, TGF alpha, 및 TRX)로 형질전환된 S.cerevisiae로부터 상등액 및 세포외 소낭에 표적 단백질이 발현된 정도를 나타내는 도면이다. 레인 1 및 2는 각 표적 단백질이 신호 펩티드 MF에 연결된 융합 단백질의 발현 정도를 나타내는 웨스턴블롯 사진이다. 레인 1은 효모 세포 내에서 발현되어 배양액에 분리된 모든 단백질, 즉, 세포외 소낭에 탑재된 것과 탑재되지 않은 표적 단백질 모두를 포함한다. 레인 2는 세포외 소낭에 탑재된 표적 단백질만을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 6개 실험군 모두에서 세포외 소낭에 표적 단백질이 현저하게 증가된 양으로 탑재되어 있다.
도 3은 p416G-MF-hFGF1 또는 hTRX 또는 p416G-hFGF1, 또는 hTRX로 형질전환된 S.cerevisiae로부터 상등액 및 세포외 소낭에 표적 단백질이 발현된 정도를 각각 나타내는 도면이다. 즉, 신호 펩티드의 유무에 따른 세포외 소낭에 포획되는 정도를 나타낸다.
레인 1은 신호 펩티드가 없이 발현시킨 균주의 배양액으로부터 획득한 세포외 소낭 내 표적 단백질을 나타내고, 레인 2는 신호 펩티드 서열과 함께 발현시킨 균주의 배양액으로부터 획득한 세포외 소낭 내 표적 단백질이 발현된 것을 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 표적 단백질을 세포 내에서 발현시킨 것, 즉 1억개 EV 당 FGF1: 0.667ng, TRX: 0.047ng 보다 세포 밖으로 분비 발현시켰을 때 세포외 소낭에 발현되는 표적 단백질의 양, 즉 1억개 EV 당 FGF1: 2.648ng, TRX: 35.518ng이 현저하게 많았다.
3. 성장인자 함유 세포외 소낭이 세포 증식에 미치는 효능 확인
2절에 기재된 방법에 따라 분리된 세포외 소낭내 표적 단백질의 농도를 측정한 후, 이를 20 uL 사용한 것을 시작 농도로 하여 순차적으로 10배씩 단백질 농도를 PBS로 4 단계 희석하였다. 각 희석액 20 uL를 NIH3T3 세포주 또는 HaCat 세포를 각 웰당 5,000 세포씩 포함하는 96-웰 플레이트에 첨가한 후 37 ℃에서 48 시간 배양하였다. 그 후 Cell Counting Kit-8 (Dojindo) 용액 10 uL를 각 웰에 첨가하였다. 2 시간 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. aFGF, bFGF, 및 IGF의 경우 NIH3T3 세포, TGFa 및 EGF의 경우, HaCat 세포를 사용하였다.
도 4는 효모로부터 분리된 성장인자 함유 세포외 소낭의 세포 증식에 미치는 효과를 나타낸 도면이다. 도 4에서 SC는 Saccharomyces cerevisiae를 나타낸다.
그 결과, 상기 표적 단백질 함유 세포외 소낭은 용량 의존적으로 세포의 수를 증가시켰다. 도 4에서, Pichia EV-aFGF, 및 Hansenula EV-aFGF는 aFGF로 형질전환된 Pichia pastoris 또는 Hansenula polymorpha를 사용한 것을 제외하고는 S. cerevisiae를 사용한 것과 동일한 과정을 거친 것이다. 도 4에서, 가로축은 배지내 세포외 소낭내 표적 단백질 함유 농도(w/v, ng/ml)를 나타낸다. 세로축은 사용된 세포외 소낭 함유 용액이 세포의 증식의 정도를 대조군(100%)과 비교하여 이를 백분율로 나타낸 것이다.
4. IL-22 발현의 확인
표적 단백질을 IL-22로 하여 1절에 기재된 바에 따라 발현 벡터 p426G-MF-IL-22를 제작하고, 2절에 기재된 바에 따라 S.cerevisiae CEN.PK2-1 균주에 형질전환하였다. 대조군으로는 IL-22를 포함하지 않는 것을 제외하고 동일한 p426G-MF 벡터를 사용하였다.
구체적으로, Colo205 세포주를 96-웰 플레이트에서 RPMI 배지 중에 48 시간 배양한 후, p426G-MF-IL22 벡터 및 p426G-MF 벡터로 형질전환되어 각각 IL-22를 발현하는 효모 및 그를 발현하지 않는 효모 유래 세포외 소낭을 정제하였다. 상기 세포외 소낭을 0.5 mg/mL의 농도로 PBS 중에 현탁하고, 이들을 20 uL 씩 96웰 플레이트의 웰에 첨가하고 6 시간 추가 배양하였다. 그 후 세포주에서 단백질을 추출하여 IL-10의 발현량을 비교하였다. IL-22는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는다. IL-22는 세포에서 IL-10 생산을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
도 5는 IL-22를 포함하는 세포외 소낭 및 IL-22를 포함하지 않은 세포외 소낭으로 각각 처리된 Colo205 세포주에 단백질을 추출하여 확인한 IL-10 단백질 생산량을 나타내는 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, IL-22를 포함하지 않은 세포외 소낭에 비하여 IL-22를 포함하는 세포외 소낭을 세포와 접촉시켜 배양한 경우, IL-10의 단백질 생산량이 현저하게 증가하였다. 도 5에서 레인 1은 IL-22를 포함하지 않는 세포외 소낭을 처리한 Colo205 세포주의 IL-10 단백질 생산 정도를 나타낸 것이고 레인 2는 IL-22를 포함하는 세포외 소낭을 처리한 Colo205 세포주의 IL-10 단백질 생산 정도를 나타낸 것이다.
5. 효모 유래 세포외 소낭과 세포의 융합
형질전환되지 않은 S.cerevisiae CEN.PK2-1 균주로부터 상기한 바와 같이 세포외 소낭을 분리하였다. 분리된 세포외 소낭 (0.5 mg/ ml PBS) 1 ml를 CFSE (5-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester) (5 uM) 용액 중에서 상온에서 30 분 동안 두었다. 그 후, 용액을 PD-10 탈염 칼럼(desalting column)(GE)을 이용하여 남아 있는 CFSE를 제거하여, CFSE로 표지된 세포외 소낭을 얻었다. NIH3T3 세포주를 96 웰 플레이트의 웰에서 RPMI 배지 0.2 mL 중에서 48 시간 배양한 후, PBS 중 CFSE로 표지된 세포외 소낭 10 uL (적색) 또는 20 uL (녹색)를 첨가하고 24 시간 추가 배양하였다. 그 후, PBS로 세포를 세척하였다. 남아 있는 세포를 흐름 분석기(flow cytometer)를 통하여 통과시키고 그에 대한 형광도를 측정하였다. 대조군으로는 BSA 0.5 ug/ml를 같은 CFSE로 표지시켜 20 ul 사용하였다.
도 6은 CFSE로 표지된 세포외 소낭이 세포와 융합하는 정도를 세포 흐름 분석을 통하여 관찰한 결과를 나타낸다. 도 6에서, 대조군(negative control)(좌측 도면)은 CFSE로 표지시킨 BSA와 세포를 접촉시킨 것이고, 실험군(우측)은 CFSE로 표지된 세포외 소낭 10 uL(적색)와 20 uL(녹색)와 세포를 접촉시킨 후 관찰된 결과를 나타낸다. 그 결과, 도 6의 우측에 나타낸 바와 같이, 세포가 CFSE로 염색되는 것으로 보아, 세포외 소낭이 세포와 융합하여 세포외 소낭의 성분이 세포로 도입되는 것을 확인하였다. NIH3T3 세포는 표준 섬유아세포(fibroblast) 세포주이다.
6. 효모 유래 세포외 소낭의 피부독성 확인
효모 유래 세포외 소낭의 피부에 대한 독성을 OECD 가이드라인에 따라 인공피부에 대한 독성 실험을 통하여 측정하였다. 인공피부는 NeodermTM-ED (태고사이언스사 제품)를 사용하였다.
S.cerevisiae, Pichia pastoris, 또는 Hansenula polymorpha 유래 세포외 소낭을 분리하였다. S.cerevisiae 유래 세포외 소낭은 2절에 기재된 바에 따라 분리하였다. Pichia pastoris, 또는 Hansenula polymorpha 유래 세포외 소낭은 Pichia pastoris, 및 Hansenula polymorpha을 사용한 것을 제외하고는 2절에 기재된 바에 따라 분리하였다.
분리된 세포외 소낭 각각 및 음성 대조군으로서 PBS 및 양성 대조군으로서 5 % SDS를 각각 30 uL를 NeodermTM-ED 인공피부에 도포하고 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이후 상기 인공피부를 PBS로 세척한 후 12 웰 플레이트에 있는 2 ml 분석 매질(assay medium) (태고사이언스사)에 침지시켜 42 시간 추가 인큐베이션하였다.
인큐베이션된 인공피부를 건져 0.3 % MTT 용액 (0.3 mg/ml)으로 옮긴 후 3시간 인큐베이션하였다. 이후 다시 인공피부를 건져 8 mm 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 조직을 분리하고 0.04N HCl-이소프로판올 500 ul에 넣고 4시간 탈색시켰다. 570 nm에서 흡광도를 잰 후 인공피부를 반응시키지 않은 대조군 흡광도와 비교하여 생존도 (%)를 구하였다. 그 결과, 측정된 생존도가 양성 대조군과 음성 대조군 값의 중간값 이상이면 독성이 없는 것으로 결정하였다. 생존도는 하기 식에 따라 계산하였다.
생존도 = 시험물질 흡광도 /음성대조군 흡광도 X 100
도 7은 효모 유래 세포외 소낭의 피부에 대한 독성을 측정한 도면이다. 도 7에서, 1: 음성 대조군 (PBS), 2: 양성 대조군 (5 % SDS), 3: S.cerevisiae, 4: P.pastoris, 5: H. polymorpha 유래 세포외 소낭을 나타낸다.
실시예 2: 유산균(lactic acid bacteria: LAB) 세포 유래의 세포외 소낭
표적 단백질을 발현하는 재조합 유산균을 제작하고, 그 유산균으로부터 세포외 소낭을 생산하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다. 유산균 세포는 Lactobacillus paracasei LMT1-21(KCTC13422BP), Lactobacillus brevis LMT1-46(KCTC13423BP) 및/또는 Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC13421BP)를 사용하였다.
1. 유전자 발현 벡터의 제작
표적 유전자는 단백질의 아미노산 서열로부터 Codon optimization tool(http://sq.idtdna.com/CodonOpt)을 사용하여 사용되는 유산균에 최적화된 코돈을 갖는 뉴클레오티드 서열을 도출하고, 이 서열의 양말단에 BamHI 및 XhoI 제한 효소의 인지 서열을 갖는 서열을 고안하고, 이 서열을 갖는 DNA를 합성하였다(마크로젠 사, 한국). 합성한 유전자는 BamHI 및 XhoI 제한 효소를 사용하여 절단하였다. 또한, 모벡터 pMT182-PR4 (서열번호 20)도 동일한 제한효소를 사용하여 절단하고 Gel purification kit를 사용하여 정제한 후 알칼리 포스파타제(AP)를 사용하여 탈인산화시켰다. 이 모벡터는 표적단백질을 발현시킬 수 있도록, 프로모터와 신호 펩티드 PR4 (서열번호 21)에 해당하는 DNA를 포함하고 있다.
이렇게 준비된 벡터 DNA 1 uL, 삽입체(insert) DNA 3 uL, T4 DNA 리가제(Takara 사, 일본) 0.5 uL, 및 완충용액 1 uL를 증류수 5.5 uL에 첨가하여 총 부피가 10 uL가 되게 하였다. 이 반응 용액을 16 ℃에서 12 시간 인큐베이션시켜 결합 반응을 시키고, 얻어진 결합체를 삼브룩 등의 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed.1989)에 따라 대장균 top10 균주를 형질전환하였다. 각 콜로니로부터 얻어진 플라스미드의 서열을 분석하여 확인하였다. 표적 단백질은 FGF1, FGF2, EGF, IGF, KGF, TGFa, TRX, 및 IL-22를 사용하였다. 이들은 각각 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8의 아미노산 서열을 갖는다.
2. 유산균 형질전환
상기 얻어진 균주를 3종의 유산균에 형질전환시켰다. 각 균주를 50 mL의 MRS에서 OD600이 0.5가 될 때까지 배양한 후 4 ℃, 7,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고, 25 mL ice-cold EPS (1 mM K2HPO4 KH2PO4, pH 7.4, 1mM MgCl2 및 0.5 M sucrose 함유)로 2회 세척하였다. 이 세포를 1 mL ice-cold EPS에 현탁하여 전기천공법(electroporation)에 사용될 컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하고, -80 ℃ 냉장고(deep freezer)에 보관하였다. 컴피턴트 세포 40 uL와 벡터 1 ug/uL DNA를 큐벳에 옮기고 5 분간 얼음에 방치하였다. 25 uF, 8 kV/cm, 및 400 ohms 조건에서 펄스를 준 후, 즉시 1 mL MRS 액체 배지를 첨가하고 37 ℃에서 1 시간가량 배양하였다. 이 세포를 10 ug/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS 배지에서 도말한 후 49 시간 37 ℃에서 배양하여 형질전환된 세포를 얻었다.
3. 세포외 소낭 (EV) 분리
얻어진 각 형질전환된 상기 유산균 균주 중 KCTC13422BP 균주를 MRS 액체 배지에서 37 ℃에서 16 시간 동안 정치 배양한 후, 이것을 다시 MRS 액체 배지에 2 % 부피를 접종한 후 16 시간 동안 정치 배양하였다. 얻어진 배양물을 5,000 xg로 15 분 동안 원심분리하여 유산균을 제거한 상등액을 얻어낸 후, 이것을 분자량 컷오프(MWCO) 100 kDa 초미세여과 막을 이용하여 한외여과하여 20 배 농축하였다. 이 농축액을 150,000 xg로 3 시간 동안 초원심분리하여 가라앉은 펠렛을 얻어낸 후, 이 펠렛을 PBS로 재현탁하고 EV 용액을 얻었다. NanoSight NS300 (Malvern)을 이용하여 얻어진 EV의 크기와 개수를 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 형질전환된 유산균으로부터 분리된 EV의 크기 및 농도 분포를 나타낸 도면이다. 도 8에서, 가로축은 직경이고, 세로축은 농도(입자/ml)이다. 도 8에서, 사용된 유산균은 KCTC13422BP 균주이고, 표적 단백질은 aFGF이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, EV는 80 내지 250 nm에서 90 %의 입자가 분포하였다.
4. EV에 표적 단백질이 존재하는지 확인
3절에서 얻어진 EV 용액에 대하여 웨스턴 블롯을 수행하여, 표적 단백질이 EV에 존재하는지 확인하였다. 상기 EV는 pMT182-PR4에 aFGF, 및 TRX를 코딩하는 유전자를 클로닝한 벡터로 형질전환된 KCTC13422BP 균주(이하 LMT1-21이라고도 함)로부터 분리된 것이다. 이때 상기 유전자는 신호 펩티드 즉, SP4 서열과 융합되거나 융합되지 않은 서열을 사용하였다.
웨스턴 블롯은 다음과 같이 수행하였다. EV 용액 5 uL에 4 x 로딩 버퍼(thermo), 10x 환원제(reducing agent)(thermo)를 첨가한 후 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)용 겔에 전기영동하였다. 이 겔의 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮긴 후, 이 막을 차단 용액 5% 탈지유 함유 TBST(Tris-buffered saline with tween 20)에서 2 시간 동안 인큐베이션하여 차단하였다. 이후 TBST를 사용하여 5 분 동안 3번 세척한 후, 차단 용액에 막과 1차 항체를 첨가하여 2 시간 인큐베이션하여 항원-항체 결합을 유도하였다. TBST 세척 후, 2차 항체를 첨가하였다. 1 시간 방치한 후, ECL(enhanced electrochemical) 시스템을 사용하여 표적 단백질의 양 및 위치를 확인하였다.
도 9는 EV 용액에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 신호펩티드와 융합된 aFGF, 및 TRX를 pMT182-PR4에 클로닝하여 얻어진 벡터로 형질전환된 LMT1-21로부터 분리된 EV에는 aFGF 및 TRX가 발현되고 있어서, 이들이 EV에 존재하는 것을 알 수 있다.
도 10은 신호 펩티드 유전자와 융합 pMT182-PR4 또는 융합되지 않은 aFGF를 코딩하는 유전자를 포함한 재조합 벡터 즉, pMT182-PR4-aFGF 벡터로 형질전환된 LMT1-21로부터 분리된 EV에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸다. 도 10에서, 레인 1은 신호 서열 없이 aFGF 유전자를 발현시켰을 경우의 EV를 나타내고, 레인 2는 신호 서열이 aFGF와 융합된 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시킨 경우의 EV를 나타낸다.
5. 유산균 유래 성장인자 함유 세포외 소낭이 세포 증식에 미치는 효능 확인
3절에 기재된 방법에 따라 1 L 유산균 배양액에서 분리된 세포외 소낭을 PBS 1 ml에 현탁시켰다. DMEM 배지 중 NIH3T3 세포주 (또는 HaCat 세포)를 96-웰 플레이트의 각 웰에 5,000 세포씩 접종(seeding)한 후 37℃에서 48 시간 배양하였다. 그 후 상기 성장인자를 발현하는 세포외 소낭 함유 용액 또는 대조군 PBS 20 uL씩 첨가하였다. 동일한 조건에서 48 시간 배양한 후 Cell Counting Kit-8 (Dojindo) 용액 10 uL를 각 웰에 첨가하였다. 2 시간 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. aFGF, bFGF, 및 IGF의 경우 NIH3T3 세포, KGF, TGFa 및 EGF의 경우, HaCat 세포를 사용하였다.
도 11은 유산균으로부터 분리된 성장인자 함유 세포외 소낭의 세포 증식에 미치는 효과를 나타낸 도면이다. 도 11에서 LAB는 lactic acid bacterium (KCTC13422BP 균주)을 나타낸다. 그 결과, 상기 표적 단백질 함유 세포외 소낭은 용량 의존적으로 세포 농도를 증가시켰다. 도 11에서, 가로축은 세포외 소낭에 포함된 표적 단백질의 농도(w/v)를 나타낸다. 세로축은 사용된 세포외 소낭 함유 용액이 세포의 증식의 정도를 대조군에 대비하고 이를 백분율로 나타낸 것이다.
6. 성장인자를 포함한 EV의 효능: IL-10 발현의 확인
1 및 2절에 따라 IL-22를 발현하는 벡터를 제작하고 이 벡터를 LMT1-21에 형질전환하였다. 3절에 따라 IL-22를 발현하는 벡터로 형질전환된 LMT1-21로부터 EV를 분리하였다. 이 EV가 세포에서 IL-10 발현을 촉진하는지를 확인하여, 간접적으로 IL-22의 존재 여부를 추정하였다.
구체적으로, Colo205 세포주를 96-웰 플레이트에서 RPMI 배지 중에 48 시간 배양한 후, 여기에 IL-22를 발현하는 유산균 및 그를 발현하지 않는 유산균 유래 세포외 소낭을 분리하고, 이 세포외 소낭을 0.5 mg/mL의 농도로 PBS 중에 현탁하고, 이들을 20 uL 씩 웰에 첨가하고 6 시간 추가 배양하였다. 그 후 세포주에서 단백질을 추출 즉, 세포 파쇄(lysis) 후 파쇄물(lysate)을 얻고 그 중 IL-10의 발현량을 비교하였다.
도 12는 LMT1-21 유래 EV와 접촉된 세포 유래 단백질을 웨스턴 블롯한 사진이다. 도 12에서, 레인 1은 PBS이고, 레인 2는 LMT1-21 유래 EV, 레인 3은 IL-22를 발현하는 LMT1-21 유래 EV를 처리한 것을 나타낸다.
7. 유산균 유래 세포외 소낭과 세포의 융합
형질전환되지 않은 유산균 균주(KCTC13422BP)로부터 상기한 바와 같이 세포외 소낭을 분리하였다. 분리된 세포외 소낭 (0.5 mg/ml) 1 ml를 CFSE (5 uM) 용액 중에서 상온에서 30 분 동안 두었다. 그 후, 용액을 PD-10 탈염 칼럼(desalting column)(GE)을 이용하여 남아 있는 CFSE를 제거하여, CFSE로 표지된 세포외 소낭을 얻었다. NIH3T3 세포주를 96 웰 플레이트의 웰에서 RPMI 배지(Gibco 사) 0.25 mL 중에서 48 시간 배양한 후, PBS 중 CFSE로 표지된 세포외 소낭 10 uL (적색) 또는 20 uL (녹색)를 첨가하고 24 시간 추가 배양하였다. 그 후, PBS로 세포를 세척하였다. 남아 있는 세포를 흐름 분석기(flow cytometer)를 통하여 통과시키고 그에 대한 형광도를 측정하였다. 대조군으로는 BSA 0.5 ug/ml를 같은 CFSE로 표지시켜 20 ul 사용하였다.
도 13은 CFSE로 표지된 세포외 소낭이 세포와 융합하는 정도를 세포 흐름 분석을 통하여 관찰한 결과를 나타낸다. 도 13에서, 대조군(negative control)(좌측 도면)은 CFSE로 표지시킨 BSA와 세포를 접촉시킨 것이고, 실험군(우측)은 CFSE로 표지된 세포외 소낭 10 uL(적색)와 20 uL(녹색)와 세포를 접촉시킨 후 관찰된 결과를 나타낸다. 그 결과, 도 13의 우측에 나타낸 바와 같이, 세포가 CFSE로 염색되는 것으로 보아, 세포외 소낭이 세포와 융합하여 세포외 소낭의 성분이 세포로 도입되는 것을 확인하였다. NIH3T3 세포는 표준 섬유아세포(fibroblast) 세포주이다.
8. 유산균 유래 세포외 소낭의 피부독성 확인
유산균 유래 세포외 소낭의 피부에 대한 독성을 OECD 가이드라인에 따라 인공피부에 대한 독성 실험을 통하여 측정하였다. 인공피부는 NeodermTM-ED (태고 사이언스사 제품)를 사용하였다.
LMT1-21, LMT1-9, 또는 LMT1-46 유래 세포외 소낭을 분리하였다. 이들 세포외 소낭은 2절에 기재된 바에 따라 분리하였다. 분리된 세포외 소낭 각각 및 대조군으로서 PBS 및 양성 대조군으로서 5 % SDS를 각각 30 uL를 NeodermTM-ED 인공피부에 도포하고 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이후 상기 인공피부를 PBS로 세척한 후 12 웰 플레이트에 있는 2 ml 분석 매질(assay medium) (태고 사이언스)에 침지시켜 42 시간 추가 인큐베이션하였다.
인큐베이션된 인공 피부를 건져 0.3% MTT 용액 (0.3 mg/ml)으로 옮긴 후 3시간 인큐베이션하였다. 이후 다시 인공피부를 건져 8 mm 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 조직을 분리하고 0.04 N HCl-이소프로판올 500 ul에 넣고 4 시간 탈색시켰다. 570 nm에서 흡광도를 잰 후 인공피부를 반응시키지 않은 대조군 흡광도와 비교하여 생존도 (%)을 구하였다. 그 결과, 측정된 생존도가 양성 대조군과 음성 대조군 값의 중간값 이상이면 독성이 없는 것으로 결정하였다. 생존도는 하기 식에 따라 계산하였다.
생존도 = 시험물질 흡광도 /음성대조군 흡광도 X 100
도 14는 유산균 유래 세포외 소낭의 피부에 대한 독성을 측정한 도면이다. 도 14에서, 1: 음성 대조군 (PBS), 2: 양성 대조군 (5 % SDS), 3: LMT1-46, 4: LMT1-9, 5: LMT1-21 유래 세포외 소낭을 나타낸다.
<110> Medytox Co., Ltd. <120> Recombinant microorganism comprising polynucleotide encoding fusion protein between signal peptide and target protein and use thereof <130> PN121525KR <160> 60 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5778 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRS416 GPD vector <400> 1 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60 cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 120 atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 180 aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 240 atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 300 gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 360 tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 420 aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 480 attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 540 atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Leu Pro Val Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe Arg 35 40 45 Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Asp Val Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu 85 90 95 Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn Val 100 105 110 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Val 145 <210> 20 <211> 4271 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMT182-PR4 <400> 20 ggtacctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 60 gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 120 aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 180 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 240 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 300 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 360 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 420 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 480 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 540 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 600 tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 660 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 720 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 780 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 840 ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 900 tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtgaa ttcgcaaggt atagcccaat 960 atactttact tcgtaaagtt tgagctctgc gaggcaaaaa cgtcagatat tgaatctaaa 1020 caagagtata ataaacacag ttacacaaat aaaaacaaaa ggagtagatc ttaaaaatgg 1080 aagcaaatcc aaagtggcaa gaaacaggaa gacaacaaaa agtaaaacaa cttgactatt 1140 cagaaacatt agcagtaaga atagacaatg tggaattata caactcagaa aagaaattat 1200 attatctagt aattcaaacc cttcttggga atccccaaaa aaatgaatgg cgtatccagg 1260 gacaaagtca aatattaaaa gaatcaaaac aaaaaataat tgtgtcataa aattattgca 1320 cattaaaagt cctaaaaatt attttgcatt aaagatttca aaactcattt aatgtaaaat 1380 aattttttct ttgataatcc catttagcaa caatctcgcg taccacttgg tcaacctttt 1440 gatcatcact atccgtatta atcaaatcac cattctcaac gtcttctaat tgcaactgct 1500 tgcgaatttc tttcagcaaa ccgccatagc taatttgccg ggaaccagcc aaagctcgtt 1560 ccaaatcatc aattacttgt aggtcttgtt cttgattatt agtcaaaata tctttagatt 1620 ttacctgata tttagccgtt tcttgagcac tagccaataa cgaattttta tggcgattca 1680 tattcggttt aactgcctca acattcacca ttggtacata agtcaatttc attgcccgtt 1740 gccaaaaacc agtccattct acttgtgaaa tatagttatc agtcccctta aaataatggt 1800 tcttcacaaa aagcaaaaca tgcatatgat ggtggtacat tggctgaccc gcttcatgat 1860 taacagtcac ttcagtcgaa cgtacatagc ccaataaatt tttggcaact tttgtatact 1920 gaaaaatttt tgcaacagct cgtcccattt gacgtaactc actcttcaat tgatcaccag 1980 ttgtattctc aaccgtcaac gttaaaaata agaaccggcc cgtctttcgt tgtttaacag 2040 cttccgtcaa aatctgtgtt aactgattgg attgcttcat tgcccgccgc caattacata 2100 acggacacaa acgagaatgg caaaaccaag tctgcgccaa tttcttgtga ccatttttat 2160 cttccacaaa acgcaaaact tcgccacatt ctttaactcg atgagctttc ttataatgca 2220 atatttgtaa atagtcacca tactgcaagt tctccaactt gcgctcccgc cacggccgaa 2280 ctttccctga ctttgaccga tcaaccaaga ctttttcatt agccaaaata aaaactcccc 2340 tcaccaacca cgtgagaaga gttaatctgt tatgtacttg cttcacttaa atcagtcaga 2400 aggcttgacg gcaaagggtt caagctttaa actatgtcta gtaaatccaa atacgatttt 2460 tacaagatta actcacgcgt tcgaggtcgg caaactttcg aagctcacgt gggttttttt 2520 tatatttatt ttataccaca ataatacgcc taaacccagt tgtgtcaagg gtttacctca 2580 ctttttgaaa atgacgttgt ttctaatagt atcaagataa gaagaaaccg tcgaaaaaac 2640 gacggtttca aaccccaaaa agcagagaat tcggtacctg gagctgtaat ataaaaacct 2700 tcttcaacta acggggcagg ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg 2760 cattatctca tattataaaa gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt 2820 cataaacaat cctgcatgat aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg 2880 taaatatatt gaattacctt tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta 2940 attactatta ttattgatat ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga 3000 aagagaaaaa gcattttcag gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata 3060 tttctctaca tcagaaaggt ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt 3120 ccaaatacca gagaatgttt tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt 3180 atcccaataa cctaactctc cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt 3240 tatcaccctt gtcactaaga aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat 3300 gtttcggtat aaaacactaa tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt 3360 caaataatga ttaaatatct cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt 3420 catttgatat gcctcctaaa tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct 3480 ttcttcatta gaatcaatcc ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt 3540 ttaaaaatat cccactttat ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa 3600 gaataaagac cacattaaaa aatgtggtct aagcttctgc aggatatccg atcgtccaca 3660 atcaaggtgc ttggcttttt cgatcgcgag gtcaccatgt acatcagtcg tgagagcatt 3720 gtgttgacag tgatcggcat cgtgttcggc tatctgctcg gcaatttgct gacagcctac 3780 attttgtatc aagccgaaac tgaggccgtg gtttttccac tcacgatcag cattgtcggc 3840 tacctcacgg ccacgttact catgttggcc ttcaccggcg tcgtcacctg gctcacgcat 3900 cgtcgactcc aacgggtgga catggtcgaa gccctgaaat caaacgaata acctacaatt 3960 ttgtcaggca gcgtcgtcac ggcgctgctt ttttcataca aaattcatca aaaattggga 4020 ttaaaaacgt tcatgatcgc aattttgaag cgcaaatgaa gattgagacc aactcctaac 4080 agtcctgtaa cgctgacgta acattgacac agtaaagtag cctttagtta atcaaattaa 4140 gggtgaggtc aaaaatgaaa ttcaataaag tcatgatcac gttggttgct gcagttacct 4200 tagcaggttc tgctagcgcc gtaacaccag ttttcgctga tacaagcgga tcctctagaa 4260 tcgatctcga g 4271 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide PR4 <400> 21 Met Lys Phe Asn Lys Val Met Ile Thr Leu Val Ala Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 Ala Gly Ser Ala Ser Ala Val Thr Pro Val Phe Ala Asp Thr Ser 20 25 30 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide1 <400> 22 Met Lys Lys Leu Leu Ser Thr Val Leu Phe Ser Ala Val Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ala Val Ala Leu Ser Lys Pro Ser His Val Ser Ala Ala Thr 20 25 30 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide2 <400> 23 Met Lys Lys Phe Leu Val Ser Val Gly Leu Leu Gly Met Leu Val Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala His Ala Ala Asp 20 25 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide3 <400> 24 Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala 20 25 <210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide4 <400> 25 Met Lys Asn Lys Leu Leu Met Ser Leu Val Leu Val Cys Ala Phe Leu 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ala His Thr Val His Ala Ala Asp 20 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Met Lys Phe Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala Gly Val Ser Ala 1 5 10 15 Ser Val Ile Asn Tyr Lys Arg Asp Gly Asp Ser Lys Ala Ile Thr Asn 20 25 30 Thr Thr Phe Ser Leu Asn Arg Pro 35 40 <210> 31 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide4 <400> 31 Met Lys Ala Phe Thr Ser Leu Leu Cys Gly Leu Gly Leu Ser Thr Thr 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Ile Ser Leu Gln Arg Pro Leu Gly Leu Asp Lys Asp 20 25 30 Val Leu Leu Gln Ala Ala Glu Lys 35 40 <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide5 <400> 32 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide7 <400> 33 Met Phe Tyr Asn Arg Trp Leu Gly Thr Trp Leu Ala Met Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ile Arg Ile Ser Val Ser 20 <210> 34 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide8 <400> 34 Met Thr Leu Ser Phe Ala His Phe Thr Tyr Leu Phe Thr Ile Leu Leu 1 5 10 15 Gly Leu Thr Asn Ile Ala 20 <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide9 <400> 35 Met Gln Leu Leu Arg Cys Phe Ser Ile Phe Ser Val Ile Ala Ser Val 1 5 10 15 Leu Ala <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide10 <400> 36 Met Leu Lys Ser Ala Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Val Asn 1 5 10 15 Ala <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide11 <400> 37 Met Phe Thr Phe Leu Lys Ile Ile Leu Trp Leu Phe Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Ser Ala <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide12 <400> 38 Met Phe Ala Phe Tyr Phe Leu Thr Ala Cys Ile Ser Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Gly <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide13 <400> 39 Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Phe Ala 1 5 10 15 Ser Gln Val Leu Gly 20 <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide14 <400> 40 Met Lys Leu Ser Val Leu Thr Phe Val Val Asp Ala Leu Leu Val Cys 1 5 10 15 Ser Ser Ile Val Asp Ala 20 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide15 <400> 41 Met Lys Leu Gln Leu Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Val Leu Thr Ser 1 5 10 15 Pro Ala Phe Gly 20 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide16 <400> 42 Met Phe Tyr Asn Arg Trp Leu Gly Thr Trp Leu Ala Met Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ile Arg Ile Ser Val Ser 20 <210> 43 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide17 <400> 43 Met Leu Ser Phe Thr Thr Lys Asn Ser Phe Arg Leu Leu Leu Leu Ile 1 5 10 15 Leu Ser Cys Ile Ser Thr Ile Arg Ala 20 25 <210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide18 <400> 44 Met Lys Phe Ser Thr Ala Leu Ser Val Ala Leu Phe Ala Leu Ala Lys 1 5 10 15 Met Val Ile Ala 20 <210> 45 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide19 <400> 45 Met Lys Ile Phe Asn Thr Ile Gln Ser Val Leu Phe Ala Ala Phe Phe 1 5 10 15 Leu Lys Gln Gly Asn Cys Leu Ala 20 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide20\ <400> 46 Met Ser Leu Leu Tyr Ile Ile Leu Leu Phe Thr Gln Phe Leu Leu Leu 1 5 10 15 Pro Thr Asp Ala 20 <210> 47 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide21 <400> 47 Met Arg Phe Ser Thr Thr Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala Leu Phe Phe 1 5 10 15 Thr Ala Ser Gln Val Ser Ala 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide22 <400> 48 Met Gln Arg Pro Phe Leu Leu Ala Tyr Leu Val Leu Ser Leu Leu Phe 1 5 10 15 Asn Ser Ala Leu Gly 20 <210> 49 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide23 <400> 49 Met Asn Leu Lys Gln Phe Thr Cys Leu Ser Cys Ala Gln Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ile Leu Leu Phe Ile Phe Ala Phe Phe Pro Arg Lys Ile Val Leu Thr 20 25 30 <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide24 <400> 50 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala <210> 51 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide25 <400> 51 Met Lys Val Arg Lys Tyr Ile Thr Leu Cys Phe Trp Trp Ala Phe Ser 1 5 10 15 Thr Ser Ala <210> 52 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yeast Signal peptide26 <400> 52 Met Ile Leu Leu His Phe Val Tyr Ser Leu Trp Ala Leu Leu Leu Ile 1 5 10 15 Pro Leu Thr Asn Ala 20 <210> 53 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 53 Met Lys Lys Lys Met Arg Leu Lys Val Leu Leu Ala Ser Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Leu Ser Gly 20 <210> 54 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 54 Met Gln Arg Lys Lys Lys Gly Leu Ser Ile Leu Leu Ala Gly Thr Val 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ala Leu Ala Val Leu Pro Val Gly Glu Ile Gln Ala Lys 20 25 30 Ala <210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 55 Met Lys Lys Trp Phe Ile Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Thr Val Thr 1 5 10 15 Leu Ala Gly <210> 56 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 56 Met Lys Lys Tyr Arg Lys Ile Leu Ala Met Leu Ala Val Leu Ala Ile 1 5 10 15 Val Leu Val Leu Ser Gly 20 <210> 57 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 57 Met Asn Asn Ala Leu Ser Phe Glu Gln Gln Phe Thr Asp Phe Ser Thr 1 5 10 15 Leu Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Val Glu Gly Gly 20 25 <210> 58 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 58 Met Lys Ser Lys Lys Gly Leu Thr Leu Thr Ile Thr Leu Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Leu Phe Leu Ser Gly 20 <210> 59 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 59 Met Asp Lys Ile Ile Lys Phe Gln Gly Ile Ser Asp Asp Gln Leu Asn 1 5 10 15 Ala Val Ile Gly Gly 20 <210> 60 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 60 Met Gln Ser Ser Leu Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ser Phe Ala Gly Val Ala Ala Val Ser Thr Thr Ala Ser Ala 20 25 30

Claims (14)

  1. 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로부터 분리된 세포외 소낭(extracellular vesicle)으로서, 상기 미생물은 효모로서, 상기 효모는 사카로미세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 및 한세눌라(Hansenula) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 속에 속하는 종이고, 상기 표적 단백질은 신호 펩티드가 연결되어 있는 것이고, 상기 미생물은 상기 표적 단백질을 증가된 양으로 상기 세포외 소낭에 탑재하는 것인 세포외 소낭
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 단백질은 성장인자, 시토킨, 항체, 효소, 저해 단백질, 또는 이들의 단편인 것인 세포외 소낭.
  6. 삭제
  7. 유효 성분으로서 청구항 1, 및 5 중 어느 하나의 재조합 미생물로부터 분리된 세포외 소낭 및 담체를 포함하는 표적 단백질을 개체에게 전달하기 위한 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 피부, 경구, 또는 점막을 통하여 전달하기 위한 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 화장학적 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 세포외 소낭은 상기 미생물의 배양액으로부터 분리된 것인 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 세포외 소낭은 20 내지 500 nm의 직경을 갖는 것인 조성물.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 세포외 소낭은 상기 미생물의 배양액을 100,000 xg 이상의 초원심분리에서 침강하는 것인 조성물.
  13. 청구항 7에 있어서, 개체에서 피부 주름을 개선하기 위한 것, 피부 미백을 개선하기 위한 것, 자외선을 차단하기 위한 것, 또는 섬유아세포의 성장을 촉진하기 위한 것인 조성물.
  14. 유효 성분으로서 청구항 1의 재조합 미생물로부터 분리된 세포외 소낭 및 담체를 포함하는 표적 단백질을 개체에게 전달하기 위한 조성물로서, 염증성 질환, 창상, 아토피 피부염, 건선, 또는 여드름을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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