KR102013586B1

KR102013586B1 - 유전자 침묵에 내성인 변형된 인간 씨엠브이 프로모터

Info

Publication number: KR102013586B1
Application number: KR1020137019709A
Authority: KR
Inventors: 유안쉥 양; 마리아티 마리아티
Original assignee: 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date: 2010-12-24
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2031-12-22
Also published as: CN103502459A; KR20140012968A; WO2012087246A1; US20140017726A1; CN103502459B; SG191246A1; EP2655636A4; EP2655636A1; EP2655636B1

Abstract

본 발명은 헤르페스바이러스의 작용성 프로모터, 헤르페스바이러스의 작용성 인헨서, 및 aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 목적하는 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 또한 개시한다.

Description

유전자 침묵에 내성인 변형된 인간 씨엠브이 프로모터{MODIFIED HUMAN CMV PROMOTERS THAT ARE RESISTANT TO GENE SILENCING}

본 발명은 분자 생물학, 바이러스학 및 유전자 요법 분야에 있으며, 특히 헤르페스바이러스의 작용성 프로모터, 헤르페스바이러스의 작용성 인헨서, 및 aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 함유하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자의 용도 및 관심 폴리펩타이드 또는 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2010년 12월 24일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/427,121 호의 우선권의 이점을 청구하며, 그 내용은 모든 목적을 위해 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

발명의 배경

지금까지의 유전자 요법 연구에 있어서 대부분의 연구들은 바이러스 프로모터를 사용하여 왔다. 일반적으로, 효율적인 바이러스 증식을 위해 강한 바이러스 프로모터가 요구되며, 상기 프로모터는 숙주 전사 기구를 조절하고 보충하는 기전을 사용함으로써 진핵생물 프로모터보다 훨씬 더 높은 수준의 전사를 빈번히 유도한다. 더욱이, 바이러스 프로모터는 훨씬 더 간결하고 따라서 조작 및 유전자 요법 벡터내로의 수용이 더 용이한 경향이 있다.

주요 급속 초기 발현 유전자 프로모터인 인간 거대세포바이러스(hCMV)는 포유동물 세포에서 높은 수준의 재조합 단백질 생산을 위한 학문적 연구 및 산업적인 용도 모두에 널리 사용되었다. 예를 들어, hCMV에서 급속/초기 유전자 발현을 구동하는 인헨서/프로모터 요소는 진핵생물 발현 벡터에서 이종 유전자의 발현을 구동하기 위해 생물공학에 널리 사용되었다. 사용 중인 다른 바이러스 프로모터는 유인원 바이러스 40(SV40), 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부(RSV-LTR), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR, 및 다른 레트로바이러스 LTR 프로모터를 포함한다. 따라서 바이러스 프로모터의 사용은 널리 보급되어 있으며 시험관 내 및 생체 내 몇몇 용도에 성공적이었다. 그러나, 진핵생물 세포는 바이러스 트랜스유전자 발현을 탐지하고 침묵시키는 진화된 기전을 갖는다. 바이러스 프로모터는 생체 내에서 트랜스유전자 발현을 빈번히 지속시키지 못하였고, 바이러스 프로모터가 시험관 내 및 생체 내에서 불활성화하고 침묵하는 경향이 있다는 상당한 증거에도 불구하고, 대부분의 유전자 요법 용도들은 상기 프로모터를 트랜스유전자 발현의 구동에 계속해서 사용해 왔다. 그럼에도 불구하고, 포유동물 세포 내로 형질도입 시 이종 유전자는 일시적으로 충분한 수준으로 발현되며 이어서 장기간 배양 중에 안정하게 형질감염된 세포주에서 억제되고 점진적으로 침묵한다는 일반적인 문제가 존재한다. 따라서 유전자 침묵은 유전자 요법에서 큰 장애이다.

트랜스유전자 발현의 상실은 주로 CpG DNA 서열에서의 메틸화, 히스톤 탈아세틸화 또는 통합 부위 부근에서의 크로마틴 축합을 수반하는 전사 침묵에 기인한다. CpG 섬은 대개 200 bp 이상의 길이이고, GC 풍부이며, 약 60% 이상 빈도의 CpG 다이뉴클레오타이드를 함유한다. DNA 메틸화는 시토신의 5' 위치가 메틸화되는 공유 변형이다. 포유동물에서, 이러한 변형은 CpG 다이뉴클레오타이드에서 발생한다. 히스톤이 널리 분산되어 있는 개방 크로마틴에서, DNA는 메틸화되지 않으며(빈 원으로 나타낸다(도 1)), 유전자는 능동적으로 발현된다. 메틸화 시, 메틸 결합(MBD) 단백질은 히스톤 변형 단백질 및 보조억제물질을 상기 메틸화된 영역으로 모집하여, 크로마틴이 농축되게 하고, 상기 유전자를 침묵시킨다.

다양한 메틸화 방지 기법들이 유전자 침묵을 방지하기 위해 적용되었다. 예를 들어 세니글 에이치(Senigle, H)와 동료들(문헌[(Senigl, H; Plachy, J.; Hejnar, J., The core element of a CpG island protects avian sarcoma and leukosis virus-derived vectors from transcriptional silencing (2008) Journal of Virology, 82: 7818-7827])은 작은 크기의 바이러스 프로모터, RSV LTR(약 200 염기)의 인헨서와 프로모터 사이에 CpG 섬의 내부 요소(IE)의 삽입이 유전자 침묵을 방지함을 보였다. 그러나, 이러한 전략은, IE가 메틸화로부터 단지 약 150 염기만을 보호할 수 있는 것으로 보고되었기 때문에, 보다 큰 크기의 프로모터들에는 작용할 수 없다(문헌[(Siegfried, Z.; Eden, S., etc. DNA methylation represses transcription in vivo (1998) Nature genetics 22: 203-206]).

UCOE(편재하는 크로마틴 개방 요소)가 세포 배양 중 재조합 단백질 생성과 같은 연구 및 생물공학 용도에 사용되어 왔다. UCOE는 트랜스유전자 발현의 수준 및 안정성이 개선된, 증가된 비율의 생산적인 유전자 통합 사건들을 부여한다. UCOE를 당해 분야에서는 CpG 섬 관련된 요소라 칭하지만(WO 2006/095156), UCOE는 크로마틴을 구조적으로 느슨하게 하고 따라서 유전자가 헤테로크로마틴 내로 통합된다 하더라도 발현을 가능하게 하는 상이한 작용을 갖는 것으로 공지되어 있다. 따라서 UCOE가 각 핵산의 DNA 메틸화를 방지할 수 있는지의 여부는 분명하지 않다.

연장된 규모 확대 기간 동안 높은 생산성을 유지할 수 있는 세포주의 생성이 생물약학적 제조에 가장 중요하다. 생산 불안정성은 생성물 수율 및 생성물 일관성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 상기 생성물의 규제 승인을 위태롭게 한다. 현재 이용할 수 있는 발현 벡터들을 사용하여 생성시킨 대부분의 클론들은 불안정한 생산성을 갖는다. 그 결과, 다수의 클론을 안정한 고-생산 세포주를 수득하기 위해 선별해야 할 필요가 있다. 선행의 문헌 보고서들은 생산성의 상실이 프로모터 내 CpG 다이뉴클레오타이드의 메틸화를 수반하는 전사 침묵에 주로 기인함을 지적하였다.

생물공학에서 재조합 단백질 발현의 중요성을 고려하여, 개선된 프로모터 또는 인헨서 조합을 포함하는 개선된 발현 벡터가 여전히 필요하다.

발명의 요약

하나의 태양에서, 본 발명은 헤르페스바이러스의 작용성 프로모터, 헤르페스바이러스의 작용성 인헨서, 및 aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

두 번째 태양에서, 본 발명은 목적하는 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 제공하고(여기에서 상기 핵산 분자는 상기 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 헤르페스바이러스의 프로모터 및 상기 헤르페스바이러스의 인헨서에 작동적으로 결합한다), 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현을 허용함을 포함한다.

세 번째 태양에서, 본 발명은 본 발명에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

네 번째 태양에서, 본 발명은 본 발명에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

다섯 번째 태양에서, 본 발명은 관심 폴리펩타이드의 발현을 증대시키기 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 핵산 분자의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 핵산 분자는 상기 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 헤르페스바이러스의 프로모터 및 상기 헤르페스바이러스의 인헨서에 작동적으로 결합한다.

본 발명은 헤르페스바이러스의 작용성 프로모터, 헤르페스바이러스의 작용성 인헨서, 및 aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 목적하는 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명을 비제한적인 실시예 및 첨부된 도면과 함께 고려할 때 상세한 설명을 참고로 보다 잘 이해할 것이며, 도면에서:
도 1은 전사 유전자 침묵의 배후에 있는 기전의 도식적인 표현을 예시한다. 도 1A는 시토신의 5' 위치가 메틸화된 뉴클레오타이드의 공유 변형을 도시한다. 도 1B는 CpG 다이뉴클레오타이드에 존재하는 DNA 메틸화를 도시한다. 히스톤("H3")이 널리 분산되어 있는 개방 크로마틴에서, DNA는 메틸화되지 않고(빈 원으로 나타냄), 유전자는 능동적으로 발현된다. 메틸화 시, 메틸 결합("MBD") 단백질은 히스톤 변형 단백질(예를 들어 "HDAC": 히스톤 데아세틸라제) 및 보조억제물질(예를 들어 "HP1": 헤테로크로마틴 단백질 1)을 상기 메틸화된 영역으로 모집하여, 크로마틴이 농축되게 하고, 유전자를 침묵시킨다.
도 2는 햄스터 APRT 유전자 상에서 발견된 CpG 섬의 내부 요소(IE)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 4)을 나타낸다. 상기 내부 요소(IE)는 햄스터 APRT 유전자의 CpG 섬의 작은 영역이다(문헌[Brandeis, M.; Frank, D.; Keshet, I., etc. Sp1 Elements Protect A Cpg Island From De-Novo Methylation (1994) Nature 371: 435-438]).
도 3A는 인간 거대세포바이러스(CMV) 인헨서 및 프로모터를 함유하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 6)을 나타낸다. 상기 CG 다이뉴클레오타이드는 굵은 글씨로 나타내고, 이들은 모두 메틸화되어 유전자 침묵을 생성시킬 수 있다. 밑줄긋고 굵은 글씨로 나타낸 CTCGAG 서열은, IE의 삽입을 위해 상기 인헨서와 프로모터 사이에 부위 특이적 돌연변이를 사용하여 발생시킨 XhoI 부위를 가리킨다.
도 3B는 도 3A의 뉴클레오타이드 서열의 도식적인 표현을 나타낸다. 각각의 원은 상기 서열 중 CG 다이뉴클레오타이드를 가리킨다. 상기 CG 다이뉴클레오타이드는 모두 메틸화되어 유전자 침묵을 생성시킬 수 있다.
도 4는 본 발명의 다양한 실시태양들에 따른 12 개의 상이한 핵산 분자의 도식적 표현을 나타내며, 여기에서 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 또는 2 개의 IE를, 유전자 침묵을 방지하는 IE의 능력에 대한 위치, 방향 및 사본수 영향, 및 IE의 삽입이 프로모터 강도에 영향을 미치는지의 여부를 연구하기 위해서, 인헨서의 상류, 상기 인헨서와 프로모터(P) 사이, 및 프로모터(P)의 하류에 순방향 또는 역방향으로 삽입한다. 야생형 CMV를 나중에 WT CMV로서 지칭하고 변형된 CMV를 IE CMV로서 지칭한다.
도 5는 포유동물 세포에서 클로닝된 DNA 삽입물의 발현을 위한 CMV 인헨서 및 프로모터(P) 영역을 함유하는 벡터 서열을 나타낸다. MluI는 CMV 인헨서의 상부에 IE를 삽입하기 위한 것이고, XhoI는 CMV 인헨서와 프로모터 사이에 IE의 삽입을 위한 것이며, NheI는 프로모터의 하류에 IE의 삽입을 위한 것이다. IRESatt는 약화된 내부 리보솜 출입 부위(IRES)를 나타낸다. IRES는 하나의 프로모터의 조절 하에서 다수 유전자의 발현을 허용한다. IRES의 번역 효율의 약화는 고 생산 클론의 보다 효율적인 선택을 위한 것이다. 약화된 효소 활성을 갖는 돌연변이된 네오마이신 mNPT는 고 생산 클론의 보다 효율적인 선택을 허용한다.
도 6은 클론 생성, 및 세포 배양물에서 본 발명의 핵산 분자의 장기간 발현을 평가하는 개략적인 과정을 나타낸다.
도 7은 일시적인(도 7A) 및 안정한 유전자 발현(도 7B)에서 변형된 CMV 프로모터("IE CMV", 도 4 참조)를 함유하는 12 개 핵산 분자의 강도를 야생형 CMV 프로모터("WT CMV")와 비교한 것을 나타낸다. IE의 CMV 내로의 삽입 목적은 발현 수준을 저하시키지 않으면서 발현 안정성을 증대시키기 위한 것이었다. 유전자 발현에 있어서 상기 변형된 CMV 프로모터의 강도를 리포터 유전자로서 GFP를 사용하여 일시적인 및 안정한 형질감염에 있어서 상기 WT CMV와 비교하였다. 일시적으로 형질감염된 풀과 안정한 발현 클론의 평균 형광 강도를 FACS를 사용하여 측정하였다. 95% 신뢰도 수준에서 상기 WT CMV에 대한 유의수준 차이를 별표로 표시한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, CMV의 하류에 IE의 삽입은 일시적인 형질감염에서 발현 수준을 감소시킨 반면, 다른 위치에의 삽입은 보다 작은 효과를 갖는 듯하다. 안정한 형질감염에서, UF2, UR2 및 MR1은 야생형 CMV에 필적할만한 발현 수준을 가졌다.
도 8은 WT CMV를 사용하여 생성시킨 전형적인 클론 B4의 8 주 및 0 주째의 GFP 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 0 주째에, 모든 세포가 GFP를 발현하였다. 선택 시약 G418 없이 8 주 계대배양 후에, 단지 34%의 세포만이 여전히 GFP를 발현하였다.
도 9는 본 발명의 다양한 실시태양에 따른 IE CMV 프로모터(MF2)를 사용하는 전형적인 클론 B8의 0 주 및 8 주째의 GFP 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 상기 IE CMV 프로모터(MF2)는 상기 인헨서와 미니-프로모터 사이에 삽입된 2 개의 IE를 함유한다(도 9A). 0 주째에, 모든 세포가 GFP를 발현하였다. 선택 시약 G418 없이 8 주 계대배양 후에, 모든 세포가 여전히 GFP를 발현하였다.
도 10은 0 주 및 8 주째에 WT CMV를 사용하여 생성시킨 전형적인 클론 B4의 막대그래프를 나타낸다. GFP 발현의 유지(%)를 하기와 같이 0 주째의 경우에 대한 8 주째의 평균 형광 강도(MFI)의 비로서 계산한다:
GFP 발현의 유지% = MFI(8 주)/MFI(0 주)
도 11은 리포터 유전자로서 GFP를 사용하여 CHO 세포에서 8 주-계대배양 동안 변형된 CMV 프로모터(IE CMV, 도 4 참조)와 야생형 CMV(WT CMV)를 함유하는 핵산 분자들을 사용하는 GFP 발현의 유지의 비교를 나타낸다. 9 개의 클론을 각각의 벡터에 대해 3 개의 안정한 풀로부터 단리하였다. 이들을 선택 압력의 존재 없이 8 주에 걸쳐 배양하였다. 상기 WT 및 IE CMV 프로모터를 사용하여 생성시킨 각 클론의 GFP 발현을 생산 안정성의 척도로서 FACS를 사용하여 8 주에 걸쳐 모니터하였다. 도 11A는 GFP 양성 세포의 백분율에 관한 것이다. 도 11B는 GFP 발현의 유지 백분율에 관한 것이다. 안정성 시험 전에, 모든 클론들은 100%의 GFP 양성 세포를 가졌다. 8-주 계대배양 후, 대부분의 야생형 클론에서 GFP 양성 세포는 100% 이하로 떨어졌으며, 8 주 계대배양 후 평균적으로 원래 발현 수준의 20% 미만이 유지되었다. 상반되게, 상기 IE CMV를 사용하여 생성시킨 대부분의 클론, 예를 들어 UF2, UR2, MF2, MR1, MR2 및 DR2는 여전히 100% GFP 양성 세포에 가까웠으며, UF1, UR2, MR1, MR2, DF2 및 DR2를 사용하여 생성시킨 클론에서 원래 발현 수준의 40%에 가깝거나 그 이상이 유지되었다.
도 12는 본 발명의 다양한 실시태양에 따른 변형된 hCMV 프로모터(IE CMV)를 함유하는 3 개의 핵산 분자, 즉 "UR2"(여기에서 2 개의 IE가 역방향으로 상기 인헨서의 상류에 삽입되었다); "MR1"(여기에서 1 개의 IE가 역방향으로 상기 인헨서와 프로모터 사이에 삽입되었다); 및 "UR2 + MR1"(상기 인헨서의 상류에 삽입된 2 개의 IE(역방향) 및 상기 인헨서와 프로모터 사이에 삽입된 1 개의 IE(역방향)를 함유한다)의 도식적인 표현을 나타낸다. 18 개의 클론이, 장기간 배양 중 강도 및 발현 수준의 유지의 비교를 위해 각 벡터에 대해 3 개의 안정하게 형질감염된 풀로부터 단리되었다.
도 13은 안정한 발현에서 변형된 CMV들(IE CMV들), 즉 MR1, UR2 및 UR2+MR1(도 12 참조)의 강도를 야생형(WT CMV)과 비교함을 나타낸다. 도 11의 결과와 일관되게, UR2 및 MR1은 유전자 발현에 있어서 WT CMV에 필적하는 강도를 나타내었다. 그러나, UR2+MR1의 조합은 보다 낮은 유전자 발현 수준을 생성시켰다.
도 14는 8주 계대배양 후 GFP 양성 세포의 비율 유지에 대해서 변형된 CMV들, 즉 MR1, UR2 및 UR2+MR1을 야생형(WT CMV)과 비교함을 나타낸다. 도 11의 결과와 일관되게, UR2 및 MR1은 8 주 계대배양 동안 WT CMV에 비해 GFP 양성 세포의 비율을 증대시켰다. 그러나, UR2+MR1의 조합은 발현 안정성을 추가로 증대시키지 않았다.
도 15는 8주 계대배양 후 발현의 유지에 대해서 변형된 CMV들, 즉 MR1, UR2 및 UR2+MR1을 야생형(WT CMV)과 비교함을 나타낸다. 도 11의 결과와 일관되게, UR2 및 MR1은 8 주 계대배양 동안 WT CMV에 비해 발현 안정성을 증대시켰다. 그러나, UR2+MR1의 조합은 발현 안정성을 추가로 증대시키지 않았다.
도 16은 하기와 같은 2 개의 벡터 서열의 도식적인 표현을 나타낸다: A) "야생형 mCE"(마우스 CMV 인헨서 및 인간 EF1α 프로모터(인비보젠(Invivogen)에서 주문하였다)를 함유한다); 및 B) "mCE + 2IE"(여기에서 2 개의 IE가 상기 마우스 CMV 인헨서 및 인간 EF1α 프로모터로 이루어진 프로모터상에 적용되었다). 9 개의 클론이, 장기간 배양 중 강도 및 발현 수준의 유지의 비교를 위해 각 벡터에 대해 3 개의 안정하게 형질감염된 풀로부터 단리되었다.
도 17은 안정한 발현에서 변형된 mCE(mCE + 2IE)와 야생형 mCE의 강도 비교를 나타낸다. 2IE의 mCE 내로의 삽입은 야생형 mCE에 비해 보다 낮은 발현 수준을 생성시켰다.
도 18은 8 주 계대배양 후 GFP 양성 세포의 비율 유지에 대해서 변형된 mCE(mCE + 2IE)와 야생형 mCE의 비교를 나타낸다. 2IE의 mCE 내로의 삽입은 야생형 mCE에 비해 GFP 양성 세포의 보다 낮은 비율을 생성시켰다.
도 19는 8 주 계대배양 후 발현 유지에 대해서 변형된 mCE(mCE + 2IE)와 야생형 mCE의 비교를 나타낸다. 2IE의 상기 인헨서와 프로모터 사이에의 삽입은 GFP 발현 안정성을 개선시키지 않은 듯하다. 이러한 결과는 도 18의 결과와 함께, 상기 IE의 효과가 프로모터 특이적임을 가리켰다.
도 20은 상기 인헨서와 미니-프로모터 사이에 삽입된, 1 IE를 역방향으로 함유하는 핵산 분자 MR1의 침묵-방지 기전을 예시한다(도 4 참조). 각각 WT CMV 및 MR1을 사용하여 생성시킨 3 개의 클론은 8 주 계대배양 동안 GFP 발현 수준, 유전자 사본수, 및 mRNA 수준의 변화를 특징으로 하였다. 상기 GFP 유전자 사본수 및 mRNA 수준을 qRT-PCR을 사용하여 측정하였으며 β-액틴에 대해 표준화하였다. 도 20A는 GFP 발현 수준의 변화를 나타내고, 도 20B는 GFP 유전자 사본수의 변화를 나타내며, 도 20C는 WT CMV와 MR1 간의 GFP mRNA 수준의 변화를 나타낸다. WT CMV를 사용하여 생성시킨 클론들의 GFP 유전자 사본수는 장기간 배양 동안 변하지 않은 채로 남아있는 반면 mRNA 수준은 떨어졌으며 평균 형광 강도의 감소와 상관되었고, 이는 GFP 발현 수준의 상실이 전사 침묵에 기인함을 암시하였다. 대조적으로, MR1을 사용하여 생성시킨 클론은 장기간 배양 중에 GFP 유전자 사본수 및 mRNA 수준을 유지하였으며, 따라서 발현 수준의 보다 적은 하락을 나타내었다.

본 발명은 명시된 위치 및 방향에서 헤르페스바이러스의 프로모터 영역 내로의 하나 이상의 코어 CpG 섬 요소(IE)의 삽입이 핵산 분자, 특히 DNA의 메틸화를 방지할 수 있으며, 따라서 유전자 발현 수준을 상기 프로모터 강도를 떨어뜨리지 않으면서 유지시킬 수 있다는 놀라운 발견을 기본으로 한다. 특히, 헤르페스바이러스의 변형된 프로모터 영역은 하나 이상의 IE의 존재로 인해 유전자 침묵에 더욱 내성이다. 따라서, 상기 전략을 큰 크기의 프로모터의 보호에 적용할 수 있다. 그러나, 소위 CpG 섬 관련된 모든 요소들이 임의의 핵산 서열에서 유전자 침묵을 방지하는 작용을 수행할 수 있는 것이 아니라(예를 들어 도 17 내지 19 참조), 상기 작용성은 프로모터-특이적일 수 있는 것으로 또한 밝혀졌다. 따라서, 상기 aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자의 내부 요소가 헤르페스바이러스의 핵산 서열 내 유전자 침묵을 방지할 수 있음은 놀라운 발견이었다. 이와 관련하여, 마우스 aprt 유전자의 내부 요소 내 SP1 결합 부위는 탈메틸화에 중요한 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 헤르페스바이러스의 작용성 프로모터, 헤르페스바이러스의 작용성 인헨서, 및 aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소(IE)를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

상기 aprt 유전자는 임의의 유기체 또는 종들로부터 유래될 수 있으며 예를 들어 단지 몇가지 언급하자면, 햄스터 aprt 유전자, 마우스 aprt 유전자, 래트 aprt 유전자, 인간 aprt 유전자, 소 aprt 유전자, 제브라피쉬 aprt 유전자, 페스트균 aprt 유전자, 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis) aprt 유전자, 곰팡이 aprt 유전자, 노랑초파리 aprt 유전자, 사카로마이세스 세리비지아에(Saccharomyces cerevisiae) aprt 유전자, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) aprt 유전자, 이 콜라이(E. coli) aprt 유전자, 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) aprt 유전자 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) aprt 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 햄스터의 aprt 유전자를 원하는 경우, 상기 햄스터는 임의의 속, 예를 들어 메소크리세투스(Mesocricetus), 포도푸스(Phodopus), 크리세투스(Cricetus), 크리세툴루스(Cricetulus), 알로크리세툴루스(Allocricetulus), 칸수미스(Cansumys) 및 체르스키아(Tscherskia)의 것 일 수 있다. 햄스터의 임의의 아종들을 사용할 수 있으며, 여기에는 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus), 크리세툴루스 스페시즈(Cricetulus sp.), 크리세툴루스 알티콜라(Cricetulus alticola), 크리세툴루스 바라벤시스(Cricetulus barabensis), 크리세툴루스 카멘시스(Cricetulus kamensis), 크리세툴루스 롱기카우다투스(Cricetulus longicaudatus), 크리세툴루스 미그라토리우스(Cricetulus migratorius) 및 크리세툴루스 소콜로비(Cricetulus sokolovi)가 포함될 수 있다. 마우스의 aprt 유전자를 원하는 경우, 상기 마우스는 임의의 아종, 예를 들어 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 페로마이스쿠스 류코푸스(Peromyscus leucopus) 또는 페로마이스쿠스 마니쿨라투스(Peromyscus maniculatus)의 것일 수 있다.

본 발명과 관련하여 사용된 바와 같이, "내부 요소"는 DNA 메틸화를 저절로 방지함으로써 유전자 침묵을 방지하는 뉴클레오타이드 신장부 및 상기 인헨서 및 최소 프로모터를 포함하는 프로모터 영역을 지칭한다.

다양한 실시태양들에서, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소는 전사 인자 Sp1에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 aprt 유전자가 햄스터 유전자인 경우, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 SP1 결합 부위는 서열 5'-GCCCCGCCCCGTCCCGCCCC-3'(서열번호 1)을 갖는다. 상기 aprt 유전자가 마우스 aprt 유전자인 경우, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 SP1 결합 부위는 서열 5'-CCCGCCC-3'(서열번호 2) 또는 서열 5'-TCCGCCC-3'(서열번호 3)을 갖는다. 상기 aprt 유전자가 햄스터 aprt 유전자인 경우, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 내부 요소는 서열:

5'-TCCAGCAAATGCGTTACTTCCTGCCAAAAGCCAGCCTCCCCGCAACCCACTCTCCCAGAGGCCCCGCCCCGTCCCGCCCCCTCCCGGCCTCTCCTCGTGCTGGATCGCTCCCTAAGGA-3'(서열번호 4)

을 갖는다.

상기 aprt 유전자가 마우스 aprt 유전자인 경우, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 내부 요소는 서열:

5'-

AGGATGGACATCGCACATCCCCTTTCCACCCATATATCTTTGAGGTAGGGATGCTTGTGTTTAGGCAGCTCAAGAAATCTAACCCCTGACTCAGGCCCCACACACACCTCGCAGAGGCCCCGCCTCTCAGCCTGTCCCGCCCCTCGTGCTAGACCAACCCGCACCCAGAAGCCCCGCCCATCGAGGACGCTCCGCCCTTGTTCCCCCCGGGATTGACGTG-3'(서열번호 5)

을 갖는다.

다양한 실시태양들에서, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 본 발명의 핵산 분자 중에, 상기 프로모터의 서열에 비해 순방향(센스) 또는 역방향(안티센스)으로 독립적으로 배열할 수 있다. 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 다수의 내부 요소, 예를 들어 2, 3, 4, 5 이상의 내부 요소를 본 발명의 핵산 분자 중에 독립적으로 배열할 수 있다.

다양한 실시태양들에서, 상기 핵산 분자는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 발현성 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 발현성 뉴클레오타이드 서열은 상기 헤르페스바이러스의 프로모터 및 상기 헤르페스바이러스의 인헨서에 작동적으로 결합된다. 작동적 결합은 본 발명에 따른 조절성 DNA 서열 및 발현시키고자 하는 DNA 서열이 유전자 서열 발현을 허용하는 바와 같은 방식으로 연결되는 결합이다. 따라서, 상기 발현성 뉴클레오타이드 서열은 상기 헤르페스바이러스의 작용성 프로모터로부터 전사될 수 있다. 상기 전사의 수준을 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소에 의해 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60 이상의 발현 주기에 걸쳐 증대 및/또는 안정화시킨다.

다양한 실시태양들에서, 상기 발현성 뉴클레오타이드 서열은 이종 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 발현성 뉴클레오타이드 서열은 일부 실시태양에서 상기 헤르페스바이러스의 프로모터 및 상기 헤르페스바이러스의 인헨서로부터 하류에 배열될 수 있다. "이종"이라는 용어는 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산 분자에 관하여 사용될 때 상기 핵산 분자가 도입된(또는 도입되는) 각각의 세포 중에 자연적으로 존재하지 않는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 따라서 이종 핵산 서열은 상기 각각의 세포 이외의 출처로부터 기원하며 자연적으로 또는 비자연적으로 존재할 수 있다. 각각의 이종 핵산 서열을 예를 들어 본 발명의 핵산 분자 내에 통합시킬 수도 있다.

상기 작용성 프로모터 및 인헨서는 동일한 헤르페스바이러스의 것이거나 또는 상이한 유형의 헤르페스바이러스의 것일 수 있다. 상기 헤르페스바이러스는 임의의 헤르페스바이러스일 수 있다. 비제한적인 예시적인 예는 거대세포바이러스, 예를 들어 hCMV, 라디노바이러스, 로세올로바이러스, 단순바이러스, 바리셀로바이러스, 마르디바이러스, 일토바이러스, 베타헤르페스바이러스, 감마헤르페스바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 쥐 감마헤르페스바이러스-68, 헤르페스 시미안 B 바이러스, 헤르페스 단순-1 바이러스 및 카포시 육종-관련된 헤르페스 바이러스를 포함할 수 있다. 다양한 실시태양들에서, 상기 거대세포바이러스는 인간 거대세포바이러스(hCMV)이다.

상기 헤르페스바이러스의 핵산 분자는 프로모터 영역(작용성 인헨서 및 최소 프로모터를 포함한다)을 함유하고 임의의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 프로모터 영역은 약 300 염기쌍 이상, 약 350 염기쌍 이상, 약 400 염기쌍 이상, 약 450 염기쌍 이상, 약 500 염기쌍 이상, 약 550 염기쌍 이상, 또는 약 600 염기쌍 이상의 크기를 가질 수 있다.

다양한 실시태양들에서, 상기 작용성 프로모터 및 작용성 인헨서는 하기의 서열들에 포함될 수 있다:

5'-TTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACTCGAGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC-3'(서열번호 6).

다양한 실시태양들에서, 상기 작용성 프로모터는 하기의 서열을 갖는다:

5'-TGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC-3'(서열번호 7).

다양한 실시태양들에서, 상기 작용성 인헨서는 하기의 서열을 갖는다:

5'-TGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA-3'(서열번호 8).

전형적으로, 상기 헤르페스바이러스의 인헨서를 상기 헤르페스바이러스의 프로모터의 상류에 배열한다.

다양한 실시태양에서, 상기 aprt 유전자 또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소 중 하나 이상을 상기 헤르페스바이러스의 프로모터의 상류에 또는 상기 헤르페스바이러스의 프로모터의 하류에 인접하여 배열한다. 상기 aprt 유전자 또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 상기 헤르페스바이러스의 프로모터의 상류에 배열하는 경우, 상기 내부 요소(들)를 (i) 상기 헤르페스바이러스의 인헨서와 상기 헤르페스바이러스의 프로모터 사이에, 또는 (ii) 상기 헤르페스바이러스의 인헨서의 상류에 인접하여 배열할 수 있다.

다양한 실시태양에서, 상기 aprt 유전자 또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소 중 하나 이상을 상기 헤르페스바이러스의 인헨서에 인접하여, 또는 상기 헤르페스바이러스의 프로모터에 인접하여 배열한다. 핵산 서열 요소와 관련하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "인접한" 또는 "인접하여"는 하나의 서열 요소의 3' 단부가 다른 서열 요소의 5'에 직접 연결되는 실시태양을 포함한다. 다른 실시태양에서, 각각의 서열 요소들은 제 1 서열 요소에도 제 2 서열 요소에도 속하지 않고, 오히려 링커-유형 서열을 한정하는 20 개 미만의 추가적인 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수도 있다. 상기 2 개의 서열이 상기와 같은 링커-유형 서열에 의해 분리되는 경우, 이들은 여전히 인-프레임일 수 있다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 링커-유형의 추가적인 뉴클레오타이드 서열은 3, 6, 9, 12, 15 또는 18 개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.

상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 본 발명의 핵산 분자 중에 순방향(센스) 또는 역방향(안티센스)으로 독립적으로 배열할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자를 도 4에 예시할 수 있으며, 여기에서 1) 상기 aprt 유전자 또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 상기 헤르페스바이러스의 인헨서의 상류에 인접하여 순방향 또는 역방향으로 배열하고(UF1, UF2, UR1 및 UR2 참조); 2) 상기 aprt 유전자 또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 상기 헤르페스바이러스의 인헨서와 프로모터 사이에 순방향 또는 역방향으로 배열하고(MF1, MF2, MR1 및 MR2 참조); 3) 상기 aprt 유전자 또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 상기 헤르페스바이러스의 프로모터의 하류에 인접하여 순방향 또는 역방향으로 배열한다(DF1, DF2, DR1 및 DR2 참조).

본 발명에 사용된 바와 같이, "핵산" 및 "핵산 분자"는 호환적으로 사용되며 임의의 가능한 형태, 예를 들어 선형화된 단일 가닥, 이중 가닥 또는 이들의 조합의 임의의 산을 지칭한다. 핵산은 비제한적으로 DNA 분자(예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어 mRNA), 뉴클레오타이드 동족체 또는 핵산 화학을 사용하여 생성시킨 상기 DNA 또는 RNA의 동족체, cDNA 합성 DNA, DNA와 RNA의 공중합체, 올리고뉴클레오타이드, 및 PNA(단백질 핵산)를 포함한다. DNA 또는 RNA는 게놈 또는 합성 기원의 것일 수 있으며 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 각각의 핵산은 더욱 또한 비-천연 뉴클레오타이드 동족체를 함유하고/하거나 친화성 태그 또는 표지에 결합될 수도 있다. 또한 핵산 동족체, 예를 들어 펩타이드 핵산 등이 포함된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "뉴클레오타이드"란 일반적인 용어는 뉴클레오사이드 모노-, 다이- 및 트라이포스페이트를 포함한다. 그러나, 뉴클레오타이드 서열, 즉 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여, 상기 뉴클레오타이드는 포스페이트 주쇄, 즉 모노포스페이트와 중합된다. "뉴클레오타이드"란 용어는 또한 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 비제한적으로 포포로티오에이트 뉴클레오타이드 및 데아자퓨린 뉴클레오타이드, 2'-메톡시 뉴클레오타이드 및 다른 뉴클레오타이드 동족체를 포함한다.

다양한 실시태양에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 실시태양에서, 상기 헤르페스바이러스의 작용성 프로모터는 상기 핵산 분자 중에 포함된 유일한 프로모터이다.

다양한 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자는 벡터 중에 포함된다. "벡터"란 용어는 세포 내로 도입될 수 있고, 예를 들어 형질감염될 수 있고 세포 게놈 내에서 또는 상기 게놈과 독립적으로 복제될 수 있는 단일 또는 이중 가닥 환상 핵산 분자에 관한 것이다. 환상 이중 가닥 핵산 분자를 절단할 수 있으며 이에 의해 제한 효소에 의한 처리 시 선형화될 수 있다. 핵산 벡터, 제한 효소의 조합, 및 제한 효소에 의해 절단된 뉴클레오타이드 서열들에 대한 지식은 당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 입수 가능하다. 본 발명에 따른 핵산 분자를, 제한 효소에 의해 벡터를 절단하고 상기 두 조각을 함께 연결함으로써 상기 벡터 내에 삽입할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터이다. 다른 실시태양에서, 상기 벡터는 플라스미드이다. 상업적으로 입수할 수 있는 플라스미드, 예를 들어 pBR322, puC19, pBluescript 등을 사용할 수 있다. 전형적으로, 포유동물 발현 벡터를 사용할 수 있으며 상기 벡터를 상업적으로 입수할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 비제한적으로 pCDM8(문헌[B. Nature, 1987, 329:840]), pMT2PC(문헌[Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195]), pCI 및 pSI 포유동물 벡터를 포함할 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 핵산 분자는 적합한 숙주 세포 내에 포함된다. 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포는 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포일 수 있다. 이와 관련하여, 상기 (형질전환된) 숙주 세포를 본 발명의 핵산 분자의 발현에 적합한 조건 하에서 배양할 수 있다. 숙주 세포를 확립시키고, 적응시키고 무혈청 조건 하에서, 및 임의로 동물 기원의 어떠한 단백질/펩타이드도 없는 배지에서 완전히 배양시킬 수 있다. 상업적으로 입수할 수 있는 배지, 예를 들어 RPMI-1640(시그마(Sigma)), 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM; 시그마), 최소 필수 배지(MEM; 시그마), CHO-S-SFMII(인비트로젠(Invitrogen)), 무혈청-CHO 배지(시그마), 및 무단백질 CHO 배지(시그마)가 예시적인 적합한 영양 용액들이다. 상기 배지 중 어느 하나를 필요에 따라 다양한 화합물들, 예를 들어 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들어 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염(예를 들어 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제(예를 들어 HEPES), 뉴클레오사이드(예를 들어 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 다른 등가의 에너지 공급원, 항생제, 미량 원소로 보충할 수 있다. 임의의 다른 필수 보충제들이 또한 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 적합한 농도로 포함될 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 핵산 분자는 단리된 핵산 분자이다. 본 발명의 "단리된" 핵산 분자는, 상기 핵산 분자의 천연 공급원 중에 존재하는 다른 핵산 분자들과 분리된 것을 지칭할 수 있다. 단리된 분자, 예를 들어 DNA 분자는 다른 세포 물질, 또는 재조합 기법에 의해 생성 시 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성 시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 즉, 단리된 핵산 분자는 상기 핵산이 유래된 세포 또는 유기체의 게놈 DNA 중의 핵산에 인접한 서열들(예를 들어 단백질 암호화 서열들)(즉 상기 핵산의 5' 및 3' 단부에 위치한 서열들)이 없거나 또는 실질적으로 없을 수 있다.

전형적으로, 본 발명에 사용된 바와 같은, "작용성 변체"란 용어는 그의 각각의 원래 서열, 즉 대개는 상응하는 aprt 유전자에 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상, 또는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 일치성을 갖는 서열을 지칭한다. "서열 일치성"은 서열들의 유사성 또는 관계를 측정하는 상기 서열들의 성질을 의미한다. 상기 용어는 각각, 문제의 핵산 서열, aprt 유전자와 핵산 서열과의 상동성 정렬 후 획득된 쌍으로 일치하는 잔기들의 백분율을 지칭하며, 여기에서 상기 백분율 숫자는 상기 두 서열 중 보다 긴 서열 중의 잔기의 수를 지칭한다.

또한 상기 핵산 서열에 실질적으로 상보성인 핵산 서열이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 사용된 바와 같이 "실질적으로 상보성"은 주어진 핵산 서열이 또 다른 핵산 서열에 90% 이상, 예를 들어 95% 이상, 및 일부 실시태양에서 100% 상보성이라는 사실을 지칭한다. "상보성" 또는 "보체"란 용어는 서로 다수의 유리한 상호작용들을 형성할 수 있는 2 개의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기와 같은 유리한 상호작용은 와트슨-크리크 염기 짝짓기를 포함하거나 독점적으로 상기 짝짓기일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은, 제 1 서열의 뉴클레오타이드가 모두 제 2 서열의 뉴클레오타이드 모두에 상보성인 경우, 또 다른 뉴클레오타이드 서열에 완전한 보체이다.

본 발명은 또한 목적하는 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명에 따른 핵산 분자를 제공하고(여기에서 상기 핵산 분자는 상기 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 헤르페스바이러스의 프로모터 및 상기 헤르페스바이러스의 인헨서에 작동적으로 결합한다), 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현을 허용함을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 "폴리펩타이드"란 용어는 천연 단백질뿐만 아니라 재조합적으로 또는 합성에 의해 생성되는 것들을 포함함을 의미한다. 상기 "폴리펩타이드"란 용어는 특정 길이의 암호화된 생성물로 제한되지 않으며, 따라서 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질을 포함한다. 상기 "폴리펩타이드"란 용어는 또한 상기 암호화된 생성물을 형성하기 위해 결합된 2 개 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드는 또한 2 개 이상의 상이한 폴리펩타이드(여기에서 하나 이상은 상기 폴리펩타이드가 발현되는 세포에 대해 이종일 수도 있다)로부터 수득된 부분적인 또는 완전한 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 하이브리드 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드는 상기 언급한 폴리펩타이드 및 하이브리드 폴리펩타이드의 천연 대립유전자 및 가공된 변이를 추가로 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 이종 뉴클레오타이드 서열이다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 단계는 본 발명에 따른 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 상기 숙주 세포에서의 발현에 적합한 벡터 중에 포함된다.

상기 숙주 세포는 임의의 적합한 세포, 예를 들어 진핵생물 세포일 수 있다. 상기 진핵생물 세포는 예를 들어 동물 세포, 식물 세포(예를 들어 단자엽 식물, 쌍자엽 식물, 조류), 진균, 효모 세포, 편모, 미포자충 또는 원생생물일 수 있다. 동물 세포는 포유동물, 예를 들어 몇 가지 언급하자면 영장류, 인간, 쥐, 소, 설치류, 인간, 곤충, 파충류, 또는 조류로부터 유래할 수 있다. 동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포의 예는 중국 햄스터 난소 세포(예를 들어 CHO-K1), COS 세포(예를 들어 COS-1, COS-7), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 인간 배아 신장(HEK)(예를 들어 HEK 293), 보우스 흑색종 세포, 래트 골수종 세포, 마우스 골수종 세포, 항체 생산-하이브리도마 세포, 인간 백혈병 세포 등을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 신경세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 줄기 세포이다. 효모 세포는 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에, 사카로마이세스 폼베, 칸디다 알비칸스, 또는 사카로마이세탈레 세포일 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현은 약 30 세대 이상에 걸쳐 숙주 세포에서 허용된다. 상기 실시태양의 맥락 내에서, 상기 숙주 세포의 약 30 세대 이상 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준은, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자와 비교 시, 증대된다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드를 다수의 숙주 세포에서 발현시키며, 여기에서 상기 숙주 세포의 약 30 세대 이상 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드를 여전히 발현하는 숙주 세포의 수는, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 다수의 숙주 세포와 비교 시, 증대될 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현은 약 4 주 이상의 기간에 걸쳐 허용된다. 상기 실시태양의 맥락 내에서, 상기 4 주 이상의 기간 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준은, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자와 비교 시, 증대될 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드를 다수의 숙주 세포에서 발현시키며, 여기에서 상기 4 주 이상의 기간 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드를 여전히 발현하는 숙주 세포의 수는, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 다수의 숙주 세포와 비교 시, 증대된다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현은 약 60 세대 이상에 걸쳐 상기 숙주 세포에서 허용된다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현은 8 주 이상의 기간에 걸쳐 허용된다. 상기 실시태양의 맥락 내에서, 상기 8 주 이상의 기간 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준은, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 핵산 분자와 비교 시, 증대된다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드를 다수의 숙주 세포에서 발현시키며, 여기에서 8 주 이상의 기간 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드를 여전히 발현하는 숙주 세포의 수는, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 다수의 숙주 세포와 비교 시, 증대된다.

본 발명은 또한 관심 폴리펩타이드의 발현을 증대시키기 위한 본 발명에 따른 핵산 분자의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 핵산 분자는 상기 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 헤르페스바이러스의 프로모터 및 상기 헤르페스바이러스의 인헨서에 작동적으로 결합된다.

일부 실시태양에서, 관심 폴리펩타이드는 적합한 숙주 세포에서 발현된다. 일부 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드의 발현은 약 30 세대 이상에 걸쳐 상기 숙주 세포에서 허용된다. 일부 실시태양에서, 상기 관심 폴리펩타이드의 발현은 약 60 세대 이상에 걸쳐 상기 숙주 세포에서 허용된다.

일부 실시태양에서, 상기 숙주 세포의 약 30 세대 이상 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준은, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자와 비교 시, 증대된다.

일부 실시태양에서, 상기 숙주 세포의 약 60 세대 이상 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준은, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자와 비교 시, 증대된다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드를 다수의 숙주 세포에서 발현시키며, 여기에서 상기 숙주 세포의 약 30 세대 이상 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드를 여전히 발현하는 숙주 세포의 수는, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 다수의 숙주 세포와 비교 시, 증대된다.

일부 실시태양에서, 상기 목적하는 폴리펩타이드를 다수의 숙주 세포에서 발현시키며, 여기에서 상기 숙주 세포의 약 60 세대 이상 후의 상기 목적하는 폴리펩타이드를 여전히 발현하는 숙주 세포의 수는, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소를 갖지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 다수의 숙주 세포와 비교 시, 증대된다.

일부 실시태양에서, 상기 aprt 유전자 및/또는 그의 작용성 변체의 CpG 섬의 내부 요소는 상기 작용성 프로모터 및/또는 상기 작용성 인헨서의 메틸화를 방지하며, 이에 의해 상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준의 감소를 감소시키고/시키거나 방지한다.

본 발명의 핵산 분자를 예를 들어 포유동물 세포에서 재조합 단백질 생산, 세포 공학, 단백질 공학 또는 유전자 요법에 사용할 수 있다.

하기의 예시적인 데이터는 본 발명에 따른 핵산 분자의 유용성 및 이점을 예시한다.

실시예

IE CMV 프로모터의 생성

장기간 배양 동안 유전자 발현을 유지하는 능력을 시험하기 위한 IE CMV 및 벡터의 생성을 도 4 및 5에 요약하였다. 상기 IE 요소들을 PCR을 사용하여 합성하여 2 개의 프라이머, 즉

IE-순방향: 5'-TCCAGCAAATGCGTTACTTCCTGCCAAAAGCCAGCCTCCCCGCAACCCACTCTCCCAGAGGCCCCGCCCC-3'(서열번호 12); 및

IE-역방향: 5'-TCCTTAGGGAGCGATCCAGCACGAGGAGAGGCCGGGAGGGGGCGGGACGGGGCGGGGCCTCTGGGAGA-3'(서열번호 13)

을 어닐링시켰다.

IE의 2 개의 사본을 중복 PCR에 의해 결합시켰다. pCIN 중의 야생형 CMV 프로모터를 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)로부터 클로닝하였다. IE CMV를 생성시키기 위해서, XhoI 부위를 퀵체인지(QuickChange) 부위 특이적 돌연변이 키트(스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 사용하여 CMV 인헨서와 최소 프로모터(mP) 사이에 생성시켰다. 이어서 IE의 하나의 사본 또는 2 개의 사본을 순방향으로 또는 역방향으로 MluI 부위를 사용하여 CMV 프로모터의 상류에, XhoI 부위를 사용하여 인헨서와 mP 사이에, 및 NheI 부위를 사용하여 CMV 프로모터의 하류에 삽입하였다. 벡터 제작에 사용된 모든 제한 효소 및 리가제는 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(미국 메사추세츠주 입스위치 소재)에서 주문하였다.

CHO 세포에서 GFP 발현의 FACS 분석

FACSCalibur(상표) 시스템(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 미국 캘리포니아주 소재)을 다양한 클론들의 녹색 형광 수준 평가에 사용하였다. 525 nM의 녹색 형광이 대수 이득과 함께 269 또는 516의 PMT 전압에서 FL1 세트를 통해 검출되었다. 10000 개의 세포를 각 샘플에 대해 분석하였다. 데이터 분석을 플로우조(Flowjo) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

GFP 유전자 사본수 및 mRNA 수준의 분석

게놈 DNA 및 RNA를 각각 퓨어진(PureGene) DNA 정제 키트(젠트라 시스템스(Gentra Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재) 및 RNA수성-4PCR 키트(앰비온(Ambion), 미국 텍사스주 오스틴 소재)를 사용하여 세포로부터 단리하였다. 첫 번째 가닥 cDNA를 임프롬(ImProm)-II 역 전사 시스템(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 mRNA로부터 제조하였다. 각각의 역 전사 반응을 위해서 100 ng의 전체 RNA를 사용하였다. 상대적인 GFP 트랜스유전자 사본수 및 mRNA 수준을 실시간 정량적인 PCR(qRT-PCR)을 사용하여 측정하였다. 하우스키핑 유전자인 β-액틴은 샘플들 간의 DNA 또는 RNA의 투입량의 가능한 변화를 표준화하기 위한 내부 대조군으로서 작용하였다. iTag SYBR 그린 슈퍼믹스(Green Supermix)(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)와 함께 ABI 프리즘 7000 서열 검출 시스템을 사용함으로써 qRT-PCR을 수행하였다. 상기 수집된 데이터를 2^-ΔΔCt 방법(문헌[Livak and Schittgen, 2001, Methods 25 (4): 402-408])을 사용하여 분석하였다.

실시예 1: 단-세포 클론의 생성

IE가 삽입된 상이한 변형된 CMV 프로모터들을 함유하는 벡터들을 6-웰 플레이트에서 일렉트로포레이션을 사용하여 CHO K1 세포 내로 형질감염시킨다. 형질감염 후 48 시간째에, 선택 시약인 G418을 게놈 내 통합된 벡터를 갖는 세포의 선택을 위해 첨가한다. 2 내지 3 주 선택 후에, 대부분의 생존된 세포는 GFP를 안정하게 발현할 것이다. 이어서 제한 희석 방법을 사용하여 단세포 클론을 수득하고 보관한다.

실시예 2: 장기간 유전자 발현의 시험

단계 1에서 수득된 단세포 클론을 해동하고 6-웰 플레이트에서 증식시켰다. 0 주째에, 현미경 하에서 상이한 클론들에 대해 사진을 촬영하여 GFP 양성 세포의 백분율을 추정한다. 각각의 클론 및 발현 수준에 대한 GFP 양성 세포의 백분율을 또한 FAC를 사용하여 정량적으로 측정한다. 이어서 상기 세포를 8 주 동안 G418의 부재 하에서 계대배양한다. 사진을 촬영하고 FACS 분석을 다시 수행하고 0 주째 결과와 비교한다.

상기 aprt 유전자의 코어 CpG 섬 요소(IE)를 사용함으로써 유전자 침묵에 보다 내성인 변형된 hCMV 프로모터를 여기에 개시한다. 야생형 hCMV 프로모터는 인헨서와 프로모터로 이루어진다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 인헨서의 상류에 또는 상기 인헨서와 프로모터의 사이에 단일 IE 요소를 삽입하는 것은 장기간 유전자 발현을 유지하는 hCMV의 능력을 개선시키며 높은 수준의 발현을 위한 프로모터 강도를 저하시키지 않는다. 또한 상기 최소 프로모터의 하류에의 IE의 삽입이 또한 상기 hCMV를 유전자 침묵으로부터 보호하지만 유전자 발현은 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 각각의 위치에서 IE의 보호 효과는 상이하며 그의 방향에 따라 변한다.

본 발명의 핵산 분자를 사용하는 또 다른 이점은 높은 안정성을 갖는 세포주의 생성이다. 상기 변형된 CMV를 사용하여 생성시킨 모든 클론들은, 다수의 비-발현 세포를 함유하고 20% 미만으로 발현을 유지한 야생형 CMV를 사용하여 생성시킨 클론들에 비해, 100% GFP 양성 세포를 함유하였으며 GFP 발현을 8 주의 계대 배양 후 원래 수준의 50% 이상 유지하였다. 또한, 상기 변형된 IE CMV는 유전자 발현에 있어서 일시적인 및 안정한 형질감염 모두에서 야생형 CMV에 필적하는 강도를 갖는다. 상기 IE 요소에 의해 제공된 상기 침묵-방지 보호는 높은 안정성을 갖는 세포주의 생성에 유리할 것임에 틀림없다.

본 명세서에서 앞서 공개된 문헌의 목록 또는 논의는 상기 문헌이 최신 기술의 일부이거나 또는 통상의 일반적인 지식임을 인정하는 것으로서 반드시 간주해야 할 필요는 없다. 나열된 모든 목록들은 본 발명에 참고로 인용된다.

본 원에서 예시적으로 개시된 발명을 본 원에서 구체적으로 개시하지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시할 수도 있다. 따라서, 예를 들어 "포함하는", "함유하는" 등의 용어들은 포괄적이고 비제한적으로 판독될 것이다. 또한, 본 원에 사용된 용어 및 표현들은 제한이 아닌 설명으로서 사용되었고, 도시되거나 개시된 특징들 또는 그의 일부의 임의의 등가물의 제외와 같은 용어 및 표현의 사용을 의도하지 않으며, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능함을 인정한다. 따라서, 본 발명을, 바람직한 실시태양에 의해 구체적으로 개시하였지만, 본 원에 개시된 발명의 변형 및 변화는 당해 분야의 숙련가들에 의해 복원될 수 있으며 상기와 같은 변형 및 변화는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주됨은 물론이다.

다른 실시태양들은 하기의 청구의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 태양을 마쿠시 그룹에 의해 개시하는 경우, 숙련가는 본 발명이 상기 마쿠시 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 하위그룹에 의해 또한 개시됨을 알 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Agency for Science, Technology and Research <120> MODIFIED HUMAN CMV PROMOTER THAT IS RESISTANT TO GENE SILENCING <130> P105962 <150> US 61/427,121 <151> 2010-12-24 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> SP1 binding site of CpG island of hamster aprt gene <400> 1 gccccgcccc gtcccgcccc 20 <210> 2 <211> 7 <212> DNA <213> SP1 binding site of CpG island of mouse aprt gene <400> 2 cccgccc 7 <210> 3 <211> 7 <212> DNA <213> SP1 binding site of CpG island of mouse aprt gene <400> 3 tccgccc 7 <210> 4 <211> 118 <212> DNA <213> internal element of CpG island of hamster aprt gene <400> 4 tccagcaaat gcgttacttc ctgccaaaag ccagcctccc cgcaacccac tctcccagag 60 gccccgcccc gtcccgcccc ctcccggcct ctcctcgtgc tggatcgctc cctaagga 118 <210> 5 <211> 220 <212> DNA <213> internal element of CpG island of mouse aprt gene <400> 5 aggatggaca tcgcacatcc cctttccacc catatatctt tgaggtaggg atgcttgtgt 60 ttaggcagct caagaaatct aacccctgac tcaggcccca cacacacctc gcagaggccc 120 cgcctctcag cctgtcccgc ccctcgtgct agaccaaccc gcacccagaa gccccgccca 180 tcgaggacgc tccgcccttg ttccccccgg gattgacgtg 220 <210> 6 <211> 587 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus containing functional promoter and functional enhancer <400> 6 ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 60 cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 120 caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 180 gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 240 tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 300 ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 360 attagtcatc gctattactc gagtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 420 gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 480 ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 540 aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctc 587 <210> 7 <211> 204 <212> DNA <213> CMV mini promoter <400> 7 tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 60 caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 120 ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180 gggaggtcta tataagcaga gctc 204 <210> 8 <211> 376 <212> DNA <213> CMV enhancer <400> 8 tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc 60 ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc 120 aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 180 actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 240 caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 300 tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 360 ttagtcatcg ctatta 376 <210> 9 <211> 3960 <212> DNA <213> nucleotide sequence containing hamster aprt gene <400> 9 ggatccggac aacacccaca ccggcccctc caggtccaga aagctggccc tgcgagaagc 60 gggactgaaa aggcgtgcgg gagccagaaa tccaaaaggg tgccaaggca tgcgtccttt 120 ttccacccag aaataacccc aggctttcaa tttgaggtta tttcaatatc cagcaaatgc 180 gttacttcct gccaaaagcc agcctccccg caacccactc tcccagaggc cccgccccgt 240 cccgccccct cccggcctct cctcgtgctg gatcgctccc taaggacgcc ccgctccaga 300 agccccacct accaaggacg ccccaccctt gttcccggac tggtatgacc ccagcctgct 360 gacatccctc cgccctttct cgtgcacgcg gctatggcgg aatctgagtt gcagctggtg 420 gcgcagcgat ccgcagtttc cccgacttcc ccatccccgg cgtgctgttt aggtgagatc 480 acgagccagc aaggcgttgg agccctgttc ctgggctccc ggcgaggcgc atgggcagtc 540 tcggggatct tgtggggtct ccgcccccct ttccccggcc accagcctct ccttgttccc 600 agggatatct cgcccctcct gaaggacccc gcctccttcc gagcttccat ccgcctcctg 660 gccagtcacc ttaagtccac gcatggcggc aagatcgact acatcgcagg cgagtggcca 720 tgccaggccg tgctggtccc ccactgtgca ggctcccctc ccttccctta tgtcaccctc 780 agtccatccc acacccatcc cttctttctt caacccctaa tcctctttta gcactctgtt 840 tctcttgcct tggtccctcg ttgaccctgg atgagtactg cgtctcccac ccctgctagg 900 tctctgacct ccgccctcag tgcctgttct actagagatg aactctgctc ggtccttgtt 960 cagggccagc ccttctctct tggggtgtga agttggctag cagcctggag gcaggactgt 1020 aagaagcata cgtgtgcttt gagaactttg aggaaggccc tggaacctcc ttgctaggag 1080 tagcacctaa gatgaactag atgctaaaaa atgctgtatc tttggggcac acgagggcat 1140 gcctgggcag gcttagagcc tggtagtctc aggggctgca ccaaagtgta attcttgtgc 1200 taaataactt tcacttacca gtgccaagca cgggcttcag aaacacccta gggtcgctga 1260 atgtccacca ggggagtcag acatgtccag agggtgagaa ccccagagaa ttcggtagcc 1320 ctgacatgtg ctacaattac tgatgcccac ttcctactgg ttcctcctgg ccatacctca 1380 ggaattaggg catgctttct gcctgctaca gtagctcatc ctccctggaa gtgaccccag 1440 acatataccc tgaactgtaa ccgataaagt gcgcctgggc agatgtattt gagaggtggc 1500 aaaagtaaac cataggtgtc cccgagctag atacagaagg cagataacat ccccaaggct 1560 aagctgctgc cccaatagcc atcagccttc tagttatagc tagtaagacc tagtattcct 1620 ggtcaatact attcactcaa tccttacacc tcagccctaa cacgccccct ctctcatcct 1680 aacaggccta gactccaggg gattcttgtt tggcccctcc ctagctcagg agctgggcct 1740 gggctgtgtg ctcatccgga agcgagggaa gctgccaggc cccacagtgt cagcctccta 1800 tgctctcgag tatggcaagg taagcaggca gtgggtagct gtctaggagt 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ctaccctgct ttcccctgcg 360 ctctagccca cacacagtgc actcccacct ctggacctag actatccatc agctcccttc 420 cggtaatttc aggaaagcag gggctgaatc tcaggccctt gtactatgcg cgagggaagg 480 aacgcaaggc caaaccactc cagcggacct gggcaagacc cgtccctgct cccccaggtc 540 cagaagacta gcccctggaa aagcaggact gaaaaagcgt gtgtggggca aaaccaaaaa 600 aggatggaca tcgcacatcc cctttccacc catatatctt tgaggtaggg atgcttgtgt 660 ttaggcagct caagaaatct aacccctgac tcaggcccca cacacacctc gcagaggccc 720 cgcctctcag cctgtcccgc ccctcgtgct agaccaaccc gcacccagaa gccccgccca 780 tcgaggacgc tccgcccttg ttccccccgg gattgacgtg agtttagcgt gctgatacct 840 acctcctccc tgcctcctac acgcacgcgg ccatgtcgga acctgagttg aaactggtgg 900 cgcggcgcat ccgcgtcttc cccgacttcc caatcccggg cgtgctgttc aggtgcggtc 960 acgagccggc gaggcgttgg cgctgtacgc tcatcccccg gcgcaggcgg taggcagcct 1020 cggggatctt gcggggcctc tgcccggcca cacgcgggtc actctcctgt ccttgttcct 1080 agggatatct cgcccctctt gaaagacccg gactccttcc gagcttccat ccgcctcttg 1140 gccagtcacc tgaagtccac gcacagcggc aagatcgact acatcgcagg cgagtggcct 1200 tgctaggtcg tgctcgtccc ccacggtcct agcccctatc ccctttcccc ctcgtgtcac 1260 ccacagtctg ccccacaccc atccattctt cttcgacctc tgacacttcc tccttggttc 1320 ctcactgcct tggacgcttg ttcaccctgg atgaactatg taggagtctc ccttccctgc 1380 taggtaccct aaggcatctg ccctcggtgc ttgttcctag agacgaactc tgctctgtcc 1440 ttgtgtccag aaccaggcct ccctctttta gggcacaaag ctggccagca tcctgacagc 1500 aggctgggag accctggaac ctccagatga cggacatcct tgcttagggg tagcctctgg 1560 gatgaactag atactaaaaa ttaggtaacc ttggttgggc gtggcgtgcc tgggcagacc 1620 tcaagcctgg tagcttcagg ggctgtttct ccccaggact acaccggggc atctttctct 1680 tgttccctca cacaagcttg tgttaaacaa ctgctgtcta cttggctcca tgcctgagct 1740 tgagaaacac cctaggacag ctgaatgtcc accaggagtg tccagaggga gggtgggcac 1800 cccagagaac agagtggcct tggtaagtgc tcggggacca cagactttgc cacttcactt 1860 cctattggta cccttggcca tgctccagaa attagggcat gtatgtatcc ttcccacgac 1920 agctagatgc tgcatttgaa ggtggcaaga ccaccatagg tggccctgag ctgttcagaa 1980 ggcaggtagg atccccaagg ctgagatgat gagttgatgg ctacccagta gccatcaacg 2040 ttcttctaac cgtagtcagc aagacctagt gttcctagca agtgttgacc tcgcccatac 2100 ttggcctcta gattcccatg cccctcagct ccatcccaca accttccctc cttaccctaa 2160 caggtctaga ctccaggggc ttcctgtttg gcccttccct agctcaggag ctgggcgtgg 2220 gctgtgtgct catccggaaa caggggaagc tgccgggccc cactgtgtca gcctcctatt 2280 ctctggagta tgggaaggta agcgagctgt gtgtagagga agggcagggt cttatcacgg 2340 ctaccagtgt ctaggagtaa atgtgggtgc tcagagaggt tgagacattg ggtcaggttt 2400 acaccaccca gaaacgctcg agcctaggga ggtggccact tgttcgcgcc tagactctgt 2460 cttacactac ttcctgtctg caggctgagc tggaaatcca gaaagatgcc ttggaacccg 2520 ggcagagagt ggtcattgtg gatgacctcc tggccacagg aggtaaagaa ccaacccaag 2580 acaaacagac ttcaaagggc cagaccctgt cctgggtgct gactaagcaa agagcttgaa 2640 cacctcctct ttctctgtcc cttcccccca ggaaccatgt ttgcggcctg tgacctgctg 2700 caccagctcc gggctgaagt ggtggagtgt gtgagcctgg tggagctgac ctcgctgaag 2760 ggcagggaga ggctaggacc tataccattc ttctctctcc tccagtatga ctgaggagct 2820 ggctagatgg tcacacccct gctcccagca gcactaggaa ctgcttggtg gctcagccta 2880 ggcgcctaag tgacctttgt gagctaccgg ccgccctttt gtgagtgtta tcactcattc 2940 ctttggtcag ctgatccgcc gtgcctgtgg acccctggat ccttgtactt tgtacacgtc 3000 ccacacaccc tggagcatag cagagctgtg ctactggaga tcaataaacc gttttgatat 3060 gcatgc 3066 <210> 11 <211> 543 <212> DNA <213> cDNA nucleotide sequence for the exon regions of mouse aprt gene <400> 11 atgtcggaac ctgagttgaa actggtggcg cggcgcatcc gcgtcttccc cgacttccca 60 atcccgggcg tgctgttcag ggatatctcg cccctcttga aagacccgga ctccttccga 120 gcttccatcc gcctcttggc cagtcacctg aagtccacgc acagcggcaa gatcgactac 180 atcgcaggtc tagactccag gggcttcctg tttggccctt ccctagctca ggagctgggc 240 gtgggctgtg tgctcatccg gaaacagggg aagctgccgg gccccactgt gtcagcctcc 300 tattctctgg agtatgggaa ggctgagctg gaaatccaga aagatgcctt ggaacccggg 360 cagagagtgg tcattgtgga tgacctcctg gccacaggag gaaccatgtt tgcggcctgt 420 gacctgctgc accagctccg ggctgaagtg gtggagtgtg tgagcctggt ggagctgacc 480 tcgctgaagg gcagggagag gctaggacct ataccattct tctctctcct ccagtatgac 540 tga 543 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> artificial <220> <223> forward primer for internal element <400> 12 tccagcaaat gcgttacttc ctgccaaaag ccagcctccc cgcaacccac tctcccagag 60 gccccgcccc 70 <210> 13 <211> 68 <212> DNA <213> artificial <220> <223> reverse primer for internal element <400> 13 tccttaggga gcgatccagc acgaggagag gccgggaggg ggcgggacgg ggcggggcct 60 ctgggaga 68

Claims

(ⅰ) 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 거대세포바이러스의 작용성 프로모터, (ⅱ) 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 거대세포바이러스의 작용성 인헨서, 및 (ⅲ) aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 포함하며,
상기 작용성 프로모터 및 작용성 인헨서가 서열번호 6의 서열에 포함되며,
상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소 중 하나 이상이 전사 인자 Sp1에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하며,
상기 aprt 유전자가 햄스터 aprt 유전자이고, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 SP1 결합 부위가 서열 5'-GCCCCGCCCCGTCCCGCCCC-3'(서열번호 1)을 포함하는, 핵산 분자.
(ⅰ) 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 거대세포바이러스의 작용성 프로모터, (ⅱ) 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 거대세포바이러스의 작용성 인헨서, 및 (ⅲ) aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 포함하며,
상기 작용성 프로모터 및 작용성 인헨서가 서열번호 6의 서열에 포함되며,
상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소 중 하나 이상이 전사 인자 Sp1에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하며,
상기 aprt 유전자가 마우스 aprt 유전자이고, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 SP1 결합 부위가 서열 5'-CCCGCCC-3'(서열번호 2) 또는 서열 5'-TCCGCCC-3'(서열번호 3)을 포함하는, 핵산 분자.
(ⅰ) 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 거대세포바이러스의 작용성 프로모터, (ⅱ) 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 거대세포바이러스의 작용성 인헨서, 및 (ⅲ) aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 포함하며,
상기 작용성 프로모터 및 작용성 인헨서가 서열번호 6의 서열에 포함되며,
상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소 중 하나 이상이 전사 인자 Sp1에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하며,
상기 aprt 유전자가 햄스터 aprt 유전자이고, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 내부 요소가 서열:
5'-TCCAGCAAATGCGTTACTTCCTGCCAAAAGCCAGCCTCCCCGCAACCCACTCTCCCAGAGGCCCCGCCCCGTCCCGCCCCCTCCCGGCCTCTCCTCGTGCTGGATCGCTCCCTAAGGA-3'(서열번호 4)
을 포함하는 핵산 분자.
(ⅰ) 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 거대세포바이러스의 작용성 프로모터, (ⅱ) 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 거대세포바이러스의 작용성 인헨서, 및 (ⅲ) aprt(아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소를 포함하며,
상기 작용성 프로모터 및 작용성 인헨서가 서열번호 6의 서열에 포함되며,
상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소 중 하나 이상이 전사 인자 Sp1에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하며,
상기 aprt 유전자가 마우스 aprt 유전자이고, 상기 aprt 유전자의 CpG 섬의 내부 요소가 서열:
5'-AGGATGGACATCGCACATCCCCTTTCCACCCATATATCTTTGAGGTAGGGATGCTTGTGTTTAGGCAGCTCAAGAAATCTAACCCCTGACTCAGGCCCCACACACACCTCGCAGAGGCCCCGCCTCTCAGCCTGTCCCGCCCCTCGTGCTAGACCAACCCGCACCCAGAAGCCCCGCCCATCGAGGACGCTCCGCCCTTGTTCCCCCCGGGATTGACGTG-3'(서열번호 5)
을 포함하는, 핵산 분자.
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제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소가 핵산 분자 중에, 프로모터의 서열에 비해 순방향 또는 역방향으로 독립적으로 배열되는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
aprt 유전자의 CpG 섬의 다수의 내부 요소를 포함하는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
관심 폴리펩타이드를 암호화하는 발현성 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함하고, 상기 발현성 뉴클레오타이드 서열이 거대세포바이러스의 프로모터 및 거대세포바이러스의 인헨서에 작동적으로 결합되는 핵산 분자.
제 10 항에 있어서,
발현성 뉴클레오타이드 서열이 이종 뉴클레오타이드 서열인 핵산 분자.
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제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소 중 하나 이상이 (i) 거대세포바이러스의 인헨서와 거대세포바이러스의 프로모터 사이에, 또는 (ii) 거대세포바이러스의 인헨서의 상류에 인접하여 배열되는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
aprt 유전자의 CpG 섬의 하나 이상의 내부 요소 중 하나 이상이 거대세포바이러스의 인헨서에 인접하여 또는 거대세포바이러스의 프로모터에 인접하여 배열되는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
거대세포바이러스의 작용성 프로모터가 핵산 분자 중에 포함된 유일한 프로모터인 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
벡터 중에 포함되는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
적합한 숙주 세포 중에 포함된 핵산 분자.
목적하는 폴리펩타이드의 제조 방법으로,
-제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 제공하고, 여기에서 상기 핵산 분자는 상기 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 거대세포바이러스의 프로모터 및 거대세포바이러스의 인헨서에 작동적으로 결합하며,
-상기 목적하는 폴리펩타이드의 발현을 허용함
을 포함하는 방법.
제 20 항에 있어서,
목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 이종 뉴클레오타이드 서열인 방법.
제 20 항에 있어서,
목적하는 폴리펩타이드의 발현을 허용함이, 상기 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내에 도입시킴을 포함하는 방법.
제 22 항에 있어서,
상기 핵산 분자를 숙주 세포에서의 발현에 적합한 벡터 중에 포함시키는 방법.
제 22 항에 있어서,
목적하는 폴리펩타이드의 발현을 30 세대 이상에 걸쳐 숙주 세포에서 허용하는 방법.
제 24 항에 있어서,
숙주 세포의 30 세대 이상 후의 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준이, aprt 유전자의 CpG 섬의 내부 요소를 포함하지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자와 비교 시 증대되는 방법.
제 24 항에 있어서,
4 주 이상의 기간 후의 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준이, aprt 유전자의 CpG 섬의 내부 요소를 포함하지 않는 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자와 비교 시 증대되는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
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