KR102009604B1 - 인동덩굴 추출물 및 후박 추출물을 포함하는 항균용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 개시는 인동덩굴 추출물 분획물 및 후박 추출물물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 또한, 본 개시는 인동덩굴 추출물 및 후박 추출물을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.

Description

인동덩굴 추출물 및 후박 추출물을 포함하는 항균용 조성물{ANTIMICROBIAL COMPOSITION COMPRISING LONICERA JAPONICA EXTRACT AND MAGNOLIA OBOVATA EXTRACT}

본 개시는 인동덩굴 추출물 또는 이의 분획물; 및 후박 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.

피부는 우리 몸의 최외각 방어망으로 자외선, 항원, 미생물 등의 외부 자극이나 화학 물질로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 피부는 피부 표면의 pH를 조절하거나 수분량, 피지선 분비물 등을 조절하거나, 땀 배출 등의 방법으로 신체를 보호한다. 그런데 피부 각질층의 장벽 기능이 약화되면 병원균 등이 피부에 쉽게 침투하게 되고 이로 인해 여러 가지 피부 질환이 발생하게 된다. 따라서 이러한 병원균들로부터 피부를 보호하기 위해 사람들은 피부의 항상성을 유지시켜주는 화장품을 사용한다. 최근 사람들의 미에 대한 관심이 높아지면서 화장품에 대한 수요가 급격히 증가하였다. 화장품에 대한 수요와 관심이 증가한 결과로, 자연 친화적이고 환경 친화적인 제품에 대한 소비자들의 요구 또한 높아졌다.

화장품법에 정의된 화장품이란, 인체를 청결·미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부·모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 경미한 것을 의미한다. 화장품은 수분을 다량 함유하고 있기 때문에 미생물이 서식하기에 매우 적합한 환경을 가지고 있다. 피부를 보호하기 위해 사용한 화장품이 미생물에 오염된다면, 피부에 오히려 악영향을 줄 수 있기 때문에 화장품을 미생물에 의한 오염으로부터 방지하기 위해 방부제를 첨가한다. 그러나, 화장품에 사용되는 방부제 중에 특히, 파라벤류 방부제의 유방암 발생 등의 부작용이 보고되면서 천연 화장품에 대한 수요가 증가하게 되었고 이에 따라 천연방부제에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 화장품에 사용될 수 있는 천연방부제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인동덩굴 추출물 및 후박 추출물의 향균 시너지 활성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

Korean J. Microbiol. Biotechnol. 2014, 42(4), 361-366

본 개시의 목적은 화장품에 대한 방부제로 사용될 수 있는 항균 활성을 가진 천연 물질을 제공하는 것이다. 구체적으로, 항균 시너지 활성을 갖는 인동덩굴 추출물 및 후박 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 개시는 인동덩굴 추출물 또는 이의 분획물; 및 후박 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 개시에서 항균용 조성물이란 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미로 사용되며, 바람직하게는 균의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.

인동덩굴(Lonicera japonica)은 우리나라 전역의 산에서 자라는 반상록활엽 덩굴성 관목으로, 한약재명으로는 “금은화”라고 한다. 예로부터 인동덩굴의 줄기, 꽃, 열매 등은 고열, 급성 간염, 염증 등에 약용으로 사용되어 왔다.

일본목련(Magnolia obovata)은 일본 및 중국 원산의 목련과 낙엽교목으로 향목련 또는 황목련이라고도 한다. 일본목련의 나무껍질은 소화, 이뇨, 소담, 구토 등에 약용으로 많이 사용되는데 나무껍질을 한약재명으로 후박이라고 한다.

일 실시예에서 상기 인동덩굴 및 후박의 추출물은 각각 물 또는 알코올 추출물이고, 구체적으로 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 또는 부탄올 추출물이고, 더 구체적으로는 에탄올 추출물이다. 일 실시예에서 상기 인동덩굴 추출물은 50% 에탄올 추출물이고, 상기 후박 추출물은 70% 에탄올 추출물이다. 일 실시예에서, 상기 인동덩굴 추출물은 실온에서 1 내지 48시간, 구체적으로 20 내지 30시간 동안 추출된 것이다. 일 실시예에서 상기 후박 추출물은 20 내지 40℃, 25 내지 35℃에서 1 내지 48시간, 구체적으로 20 내지 30시간 동안 추출된 것이다.

상기 인동덩굴 추출물 및 후박 추출물의 분획물은 유기 용매, 구체적으로 에틸 아세테이트로 분획한 것일 수 있으며, 2 내지 4회 분획한 것일 수 있다.

본 개시의 항균 조성물은 상기 인동덩굴 추출물 또는 이의 분획물;과 상기 후박 추출물 또는 이의 분획물을 각각 10:1 내지 0.1:1의 중량비, 구체적으로 6:1 내지 0.5:1의 중량비, 더 구체적으로 4:1 내지 1:1의 중량비로 포함할 수 있다. 균주의 활성을 억제하기 위해 필요한 각 추출물 또는 분획물의 농도가 상이하므로, 상기 중량비 역시 균주에 따라 조절될 수 있다.

본 개시에서 상기 인동덩굴 및 후박의 추출물 또는 이의 분획물은 각각 혼합하여 항균활성을 갖는 것으로 확인되었으며, 이들 중에서 황색포도상구균, 고초균 및 효모에서는 특히 향균 시너지 활성이 나타났다. 일 실시예에서, 항균 활성을 갖는 것으로 확인된 균은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 고초균(Bacillus subtilis), 그람음성 세균인 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 진균류인 효모(Candida albicans) 및 검정곰팡이(Aspergillus　niger)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이다. 상기 균은 화장품 적용 규제 미생물일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 인동덩굴 및 후박의 추출물 또는 이의 분획물은 각각 항균활성을 갖는 것으로 확인되었으며, 이들 중에서 황색포도상구균, 고초균 및 호묘에서는 특히 향균 시너지 활성이 나타났다. 즉, 각각의 개별적인 추출물 또는 분획물만을 사용하는 경우에 비해 이들을 혼합하여 사용하는 경우 단순히 혼합으로 인한 항균 활성의 증가를 넘어서는 상승 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 본 개시에서는 이를 checkboard test를 통한 FIC 지수를 통해 확인하였다 (도 1참조).

본 개시에 따른 항균 조성물이 항균제로 사용되는 경우, 항균제의 제형은 사용방법 및 용도에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 예컨대 액제, 현탁제, 과립제, 방향수제, 산제, 시럽제, 에어로졸제, 엑스제, 연고제, 유도엑스제, 유제, 전제, 점안제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제일 수 있다.

한편, 본 개시의 항균 조성물은 병원성 세균이나 독소를 생성시키는 곰팡이의 생성 및 성장을 억제하기 위한 용도로서, 세정제, 약제, 식품첨가제, 방향제, 화장제, 도료의 형태로 제공될 수 있다. 약제로 사용되는 경우 소독제, 치료제, 예방제 등으로 사용될 수 있으며, 식품 첨가제로 사용되는 경우 항균용 조성물은 식품의 종류 및 사용방법에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 개시의 항균 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 각각의 추출물 또는 분획물의 혼합물을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 항균 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

본 개시의 또 다른 양태는 인동덩굴 추출물 또는 이의 분획물; 및 후박 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다. 상기 인동덩굴 추출물, 이의 분획물과, 상기 후박 추출물, 이의 분획물은 앞서 설명한 것과 같다. 또한, 이들의 혼합 중량비 역시 앞서 설명한 것과 같다.

본 개시의 화장품 조성물은 보다 우수한 항균 활성을 나타내어 피부에 각종 염증 및 질병을 발생시키는 균으로부터 피부를 보호하고 화장품 내에 존재할 수 있는 균을 저해 및 멸균시킬 수 있다.

본 개시의 화장품 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 팩으로 이루어지는 군에서 선택되는 형태로 제형화되어 제공될 수 있다.

본 개시의 화장품 조성물은 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 개시의 화장학적으로 허용 가능한 담체의 종류는 본 개시 화장품 조성물의 활성 및 특성을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 화장품학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 화장품학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 본 출원의 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

본 개시의 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장품 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본 개시의 화장품 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시의 화장품 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시의 화장품 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시의 화장품 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시의 화장품 조성물의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시의 화장품 조성물의 제형이 팩인 경우에는, 폴리비닐알코올 등을 함유하는 필오프 팩, 일반유화형 화장품에 카올린, 탈크, 산화아연, 또는 이산화티탄 등의 안료가 함유된 워시오프(wash off) 팩, 또는 마스크 시트 팩의 형태를 모두 포함하며, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시의 화장품 조성물은 물, 계면활성제, 보습제, 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올, 킬레이트제, 살균제, 산화방지제, 방부제, 색소 및 향료 등의 통상적인 피부 외용제 성분에 포함되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 개시의 또 다른 양태는 인동덩굴 추출물 또는 이의 분획물; 및 후박 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 인동덩굴 추출물, 이의 분획물과, 상기 후박 추출물, 이의 분획물은 앞서 설명한 것과 같다. 또한, 이들의 혼합 중량비 역시 앞서 설명한 것과 같다.

본 개시의 의약외품 조성물은 보다 우수한 항균 활성을 나타내어 피부에 각종 염증 및 질병을 발생시키는 균으로부터 피부를 보호하고 의약외품 내에 존재할 수 있는 균을 저해 및 멸균시킬 수 있다.

본 개시에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 대한민국 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

본 개시의 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 형태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 개시의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 본 개시의 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 개시에 따른 항균용 조성물은 천연 방부제로서, 기존의 각각의 추출물이 갖던 항균 활성을 보다 증대시킨 것이다. 특히 화장품 규제에 포함되는 균주들에 대한 항균 활성을 갖고 일부 균에 대해서는 개별적인 추출물에 비해 시너지 효과를 가져 보다 우수한 항균력을 갖는다. 따라서, 화장품 분야 또는 그 밖의 항균 활성을 필요로 하는 분야에 천연 방부제로서 사용될 수 있다.

도 1은 실험예 2-1에서 확인한, 인동덩굴 분획물 및 후박 분획물의 다양한 농도 조합에서 각각의 균주에 대한 항균 활성을 확인한 FIC 지수를 나타낸 것이다. (a)는 황색포도상구균 (S. aureus), (b)는 고초균(B. subtilis), (c)는 대장균(E. coli), (d)는 녹농균(P. aeruginosa), (e)는 효모(C. albicans), 및 (f)는 검정곰팡이(A. niger)에 대한 결과이다.
도 2는 실험예 2-1에서 확인한 고초균에 대한 시간에 따른 생균수를 나타낸 것이다. 대조군 (control)은 메틸 파라벤을 처리한 것이고 인동덩굴 분획물 단독 처리한 것(Lonicera japonica), 후박 분획물 단독 처리한 것(Magnolia Obovata), 및 인동덩굴 분획물 및 후박 분획물의 혼합물 (combination)에 대한 그래프를 각각 나타내었다.
도 3은 실험예 3-1에서 확인한, 인동덩굴 분획물 및 후박 분획물 각각의 성분 분석을 위한 TLC 결과이다.
도 4는 실험예 3-2-1에서 확인한, 각 개별 성분들의 저해환을 나타낸 것이다. MP는 대조군으로 사용된 메틸파라벤, EA는 각각의 에틸 아세테이트 분획물을 나타낸 것이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실험에 사용된 물질

에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 비교물질로 사용한 카페산(caffeic acid), 루테올린(luteolin)은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였고 마그놀롤(magnolol), 호노키올(honokiol)은 ActivON에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 인동덩굴은 2017년 4월 서울 경동시장에서 구입하였으며, 후박은 2017년 11월 초원한방플러스에서 구입하여 사용하였다.

제조예: 인동덩굴 및 후박의 추출물 및 분획물 제조

건조된 인동덩굴 400 g을 잘게 분쇄하여 50% 에탄올 8L에 24 시간 동안 침적시킨 후 여과하였다. 이 여액을 감압·건조하여 분말을 얻었다. 그리고 50% 에탄올 추출물을 에틸 아세테이트로 3회 분획하여 얻은 에틸 아세테이트 분획을 감압농축하여 파우더를 얻었다.

건조된 후박 300 g을 잘게 분쇄하여 70% 에탄올 3 L에 24 시간 동안 30 ℃에서 교반 침적시킨 후 여과하였다. 이 여액을 감압·건조하여 분말을 얻었다. 그리고 70% 에탄올 추출물을 1:1 비율로 에틸 아세테이트로 3회 분획하여 얻은 에틸 아세테이트 분획을 감압농축하여 파우더를 얻었다.

건조된 인동덩굴 400 g을 이용하여 얻어낸 50% 에탄올 추출물의 수율은 4.85 %이고 에틸 아세테이트 분획물의 수율은 0.41 %이다. 건조된 후박 300 g을 이용하여 얻어낸 70% 에탄올 추출물의 수율은 14.52 %이고 에틸 아세테이트 분획물의 수율은 4.47 %이다.

표 1: 인동덩굴의 추출 수율

용매	수율 (%, w/w)*
50% EtOH 추출물	4.85
EtOAc 분획물	0.41

* 수율 (%, w/w) = (건조된 추출물의 중량/건조된 원료 물질의 중량) × 100

표 2: 후박의 추출 수율

용매	수율 (%, w/w)*
70% EtOH 추출물	14.52
EtOAc 분획물	4.47

실험예 1: 개별 추출물 및 분획물의 항균 활성

1-1. 균 배양

인동덩굴과 후박 추출물을 이용하여 화장품 미생물 규제에 포함되는 6가지의 균주에 대한 항균 활성을 평가하였다. 구체적으로 황색포도상구균 (S. aureus) ATCC6538, 고초균 (B. subtilis) ATCC19659, 대장균 (E. coli) ATCC23736, 녹농균 (P. aeruginosa) ATCC29336, 효모(C. albicans) ATCC10231 및 검정곰팡이(A. niger) ATCC16404로 한국 미생물 보존센터(KCCM, 서울, 대한민국)에서 분양받았다. S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa 및 C. albicans는 트립신-콩 (Tryptic-Soy) 배지(Merck)를 사용하였으며, 균을 접종한 후 37 ℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. A. niger는 감자-덱스트로오스(Potato-Dextrose) 배지(Merck)를 사용하였으며, 균을 접종한 후 30 ℃ 배양기에서 48 시간 동안 배양하였다.

1-2. 항균활성 평가 방법 - 최소저해농도(MIC) 및 최소살균농도(MBC)

최소저해농도 (Minimum Inhibitory Concentration)와 최소살균농도 (Minimum Bactericidal Concentration)를 측정하기 위하여 각각의 균주를 3 ~ 5 × 10⁶ 콜리니-형성 단위 (colony-forming units; CFU)/ml로 조절한 후 사용하였다. 메틸파라벤을 대조군으로 사용하였다. 시료는 2배 희석법을 이용하여 DMSO로 희석한 후에 사용하였고, 시료 또는 메틸파라벤20 ㎕, 균액 20 ㎕, 배지 160 ㎕를 96 웰 플레이트에 주입하여 배양하였다. 배양 후 육안으로 관찰하였을 때, 각각의 균들이 증식되지 않는 농도를 최소저해농도로 결정하였고, 멸균된 면봉으로 평판배지에 도말하여 배양해 콜로니를 형성하지 않은 농도를 최소살균농도로 결정하였다.

1-3. 각 추출물 및 분획물의 개별적인 항균 활성 평가

앞선 실험예 1-2에 기재된 방법에 따라 최소저해농도(MIC) 및 최소살균농도(MBC) 평가를 진행하였으며 실험 결과는 표 3에 나타내었다.

균주	MIC (MBC) (μL/ml)
	그램 양성 박테리아		그램 음성 박테리아		효모	몰드
	S. aureus	B. subtilis	E. coli	P. aeruginosa	C. albicans	A. niger
인동덩굴 50% EtOH 추출물	5000 (10000)	- ( - )	- ( - )	5000 ( - )	- ( - )	- ( - )
인동덩굴EtOAc 분획물	78 (312)	10000 (10000)	5000 (5000)	312 (1250)	1250 (10000)	10000 ( - )
후박 70% EtOH 추출물	78 (156)	2500 (2500)	2500 (5000)	1250 (1250)	1250 (5000)	10000 ( - )
후박 EtOAc 분획물	39 (78)	2500 (5000)	2500 (2500)	625 (625)	625 (625)	2500 ( - )
메틸 파라벤	2500(5000)	2500 (10000)	1250 (5000)	1250 (1250)	1250 (5000)	625 (5000)

인동덩굴 50% 에탄올 추출물은 황색포도상구균(S. aureus)과 녹농균(P. aeruginosa)에서만 항균 활성을 나타내었다. 다만, 대조군으로 사용된 메틸파라벤과 비교하여 높은 항균 활성을 나타내지는 않았다. 반면, 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 모든 균주에서 항균 활성을 나타내었으며, 특히 황색포도상구균(S. aureus)과 녹농균(P. aeruginosa)에서 메틸파라벤보다 높은 항균 활성을 나타내었다. 또한 효모(C. albicans)에서도 메틸파라벤과 비슷한 항균 활성을 나타내었다.

후박 추출물은 70% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물 모두 6개의 균주에서 효과적인 항균 활성을 나타내었다. 특히 황색포도상구균(S. aureus)과 고초균(B. subtilis), 녹농균(P. aeruginosa), 효모(C. albicans)에서 대조군과 비슷하거나 높은 항균 활성을 나타내었다. 고초균(B. subtilis)과 대장균(E. coli)를 제외한 다른 균주에서는 70% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물의 항균력이 약 2배 ~ 4배 차이가 나는 것을 확인하였다.

실험예 2: 인동덩굴 및 후박 추출물의 항균 시너지 활성

인동덩굴과 후박 추출물의 항균 활성 평가 결과, 6개 균주에서 모두 항균 효과를 나타낸 인동덩굴과 후박 각각의 에틸아세테이트 분획물을 이용하여 두 추출물 간의 항균 시너지 효과를 확인하였다. Checkerboard test를 이용하여 항균 시너지 효과를 확인하였으며 구체적으로 FIC 지수을 구하여 상승 효과, 부가 효과, 무관함을 판단하였다. 또한, 6개의 균주 중 고초균에 대해 시너지 효과를 확인한 농도를 이용하여 Kill-time 분석을 진행하였다.

2-1. Checkboard test

인동덩굴과 후박 각각의 에틸아세테이트 분획물을 각각 10 ㎕씩 혼합하여 이를 시료로서 사용하였다. 이 점을 제외하고는 상기 실험예 1-2의 최소저해농도 평가와 동일하게 진행하였다. 이 때, Checkerboard test에서 모든 웰에는 2개의 시료를 각각 다른 농도 조합으로 포함시켰다. 시료 A를 2배 희석하여 희석액을 만든 후, 2배씩 희석한 시료 B를 첨가하여 농도 조합을 만들고 배양하였다. 배양 후, 균의 증식이 육안으로 확인되지 않는 농도의 배합 비율을 구하였다. 이는 부분 억제 농도(Fractional inhibition concentration, FIC)와 FIC 지수를 이용하여 확인하였다.

FIC 지수 ≤ 0.5이면 상승 효과(synergistic effect); 0.5 ＜ FIC 지수 ≤ 1이면 부가 효과(additive effect); 1 ＜ FIC 지수 ≤ 4이면 무관함(indifferenct); FIC 지수 ＞ 4이면 상쇄 효과(antagonistic effect)가 있는 것으로 판단하였다.

6개 균주에서 모두에 대한 항균 활성을 확인한 실험 결과를 도 1에 나타내었다. 실험 결과, 황색포도상구균(a), 고초균(b) 및 효모(e)에서 항균 시너지 효과를 확인하였다.

구체적으로, 황색포도상구균에 대해서 인동덩굴 20 ppm, 후박 10 ppm인 경우 FIC 값이 0.5로 나타나 항균 시너지 효과를 가짐을 확인하였다. 또한 이외에도 4개의 농도 조합에서 부가 효과를 나타났다. 고초균의 경우, 인동덩굴 2500 ppm, 후박 625 ppm에서 0.5의 FIC 값을 나타났으며 총 항균 시너지 효과를 나타내는 혼합 농도 조합이 2개, 부가 효과를 나타내는 농도 조합이 8개로 나타났다. 효모균의 경우 인동덩굴 313 ppm, 후박 156 ppm에서 0.5의 FIC 값을 나타났으며 총 항균 시너지 효과를 나타내는 농도 조합과 부가 효과를 나타내는 농도 조합이 각각 3개, 7개로 나타났다. 대장균과 검정곰팡이에 대한 인동덩굴과 후박 추출물의 항균 시너지 효과는 나타나지 않았으나 일부 농도 조합에서 부가 효과는 확인되었다. 녹농균에서는 시너지 및 부가 효과를 나타내지 않았다. 따라서 인동덩굴과 후박 에틸아세테이트 분획물의 혼합물은 황색포도상구균, 고초균, 효모균에서 항균 시너지 효과를 나타냄을 확인하였다.

2-2. Kill-time 분석

시료를 첨가한 균 배양액의 균수 변화를 시간에 따라 측정하는 방법으로, checkerboard test의 결과를 바탕으로 특정 농도를 선택하여 실험을 진행하였다. 이 때 균주는 앞서 항균 시너지 활성이 있음을 확인한 황색포도상구균, 고초균, 효모균 중에서 가장 많은 시너지 및 부가 효과를 나타낸 고초균을 선택하였다.

10⁵ CFU/ml로 현탁된 균액 4.5 ml에 시료 0.5 ml를 첨가한 뒤, 3시간 간격으로 18시간 동안 배양하여 균수의 변화를 확인하였다. 특정 시간 동안 배양된 배양액의 균수는 육안으로 확인이 가능할 때까지 생리식염수로 희석하여 배양 후 확인하였다.

대조군은 DMSO만 처리한 군이고 상기 시료 중 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물은 2500 ppm 농도, 후박 에틸아세테이트 분획물은 625 ppm 농도, 인동덩굴과 후박 추출물의 조합은 인동덩굴 후박의 최종 농도가 각각 2500 ppm, 625 ppm가 되도록 하여 각각을 처리하였다. 이들의 시간 경과에 따른 생균수를 확인하였다. 실험 결과는 도 2에 나타내었다.

실험 결과, 인동덩굴 추출물을 첨가한 경우 시간 경과에 따라 균이 점차 증가하였다. 후박 추출물을 첨가한 경우 또한, 시간 경과에 따라 균이 점차 증가하였으나 인동덩굴과 비교하여 약간 낮은 균수를 나타내었다. 인동덩굴과 후박 추출물 모두 대조군보다 낮은 균수를 나타내어 미세하지만 추출물 자체의 항균 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 반면, 인동덩굴과 후박 추출물의 혼합물을 첨가한 경우 추출물을 각각 첨가한 군보다 약 10배 낮은 균수를 나타내어 이 두 추출물을 조합하여 사용하였을 때 항균 효과가 높아진다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 고초균에 대한 인동덩굴과 후박 추출물의 항균 시너지 효과를 Kill-time 분석을 통해 재확인하였다.

실험예 3: 인동덩굴 및 후박 추출물 각각의 성분 평가

3-1. 각 추출물의 성분 분석

인동덩굴과 후박 추출물 중 에틸아세테이트 분획물을 100% 에탄올에 녹인 후, 실린지 필터 (Milliopore 0.45 ㎛)를 이용하여 여과한 후 여과된 추출물 용액을 이용하여 극성 TLC (정상 상) 분석에 이용하였다. TLC 분석 시 사용한 전개 용매는 표 4에 나타내었다. 성분은 이미 보고된 분광학적 자료와 자외선 및 NP-PEG (natural products-polyethylene glycol, 2-aminoethyl diphenylborinate), 바닐린-황산 발색법을 이용한 띠의 색상 등을 통해 확인하였다. TLC 크로마토그램 결과는 도 3에 나타내었다.

용출 시스템
인동덩굴	헥산:에틸아세테이트:아세트산 = 21 : 14 : 5 (v/v)
후박	벤젠:메탄올 = 27 : 1 (v/v)

인동덩굴 에틸아세테이트 분획물의 TLC 크로마토그램 분석 결과, NP 발색을 했을 때 4개의 띠로 구분되었다. 그 중 가장 진한 색의 띠를 나타낸 성분이 각각 카페산와 루테올린으로 나타났다. 페놀성 화합물인 카페산은 주로 커피콩, 과일, 백리향과 같은 허브 등에서 발견되며, 항산화, 항암 효과 등을 가지고 있으며, 루테올린은 플라본 구조로 인동덩굴 이외에 땅콩 껍질, 목서초, 국화, 파슬리, 샐러리 등에 존재하며, 항산화, 항염증, 세포 보호 효과를 가지고 있다.

후박 에틸아세테이트 분획물의 TLC 크로마토그램 분석 결과, 황산 발색을 했을 때 2개의 진한 띠가 나타났다. 이는 각각 마그놀롤과 호노키올 로 나타났다. 마그놀롤과 호노키올은 리그난으로 분류되며 서로 이성질체로 존재한다. 이것은 목련의 나무껍질에서 주로 발견되며 항산화, 항균 효과 등을 가지고 있다.

3-2. 각 추출물 내 개별 성분들의 항균 활성 평가

성분 분석을 통해 확인한 각 추출물의 성분의 항균 활성을 평가하여 추출물과 단일 성분 간의 항균 활성 관계를 확인하였다. 항균 활성 평가는 저해환(clear zone)을 확인하는 Disc diffusion assay와 최소저해농도 평가로 진행하였다.

3-2-1. Disc diffusion 어세이

각 추출 조건에 따른 추출물의 항균 활성은 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 배양된 균주는 3 ~ 5 × 10⁶ CFU/ml으로 조절한 후 사용하였다. 평판배지에 배양된 균주를 멸균된 면봉을 이용하여 100 ㎕씩 도말하여 준비하였고, 시료를 페이퍼 디스크 (diameter 8 mm, Roshi kaisha. Ltd., Tokyo, Japan)에 천천히 흡수시킨 후, 건조 과정을 거쳐 용매를 휘발시켰다. 이 때 루테올린의 경우 디스크 당 0.05 mg으로, 나머지 물질의 경우 디스크 당 5 mg이 되도록 하였다. 각각의 시료가 흡수된 페이퍼 디스크를 도말한 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 배양한 후 디스크 주변에 생성된 저해환(clear zone, mm)을 측정하여 항균 활성을 비교하였다.

6개의 균주에 대한 인동덩굴과 후박 추출물의 disc diffusion 실험 결과, 가장 또렷한 저해환을 나타낸 균주인 녹농균을 도 4에 나타내었다. 녹농균에서 인동덩굴 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서 각각 8 mm, 9 mm의 저해환을 나타내어 대조군인 메틸파라벤(18 mm)보다 작은 활성을 나타내었지만 인동덩굴의 성분인 카페산은 10 mm의 저해환을, 루테올린은 저해환을 나타내지 않았다. 그리고 후박 추출물에서는 대조군인 메틸파라벤(16 mm)보다 작은 활성을 나타내었지만 후박 70% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서 각각 11 mm, 10 mm의 저해환을 나타내었다. 또한, 후박 추출물의 주성분인 마그놀롤과 호노키올의 경우 저해환을 나타내지 않았다.

3-2-2. 최소저해농도(MIC) 평가

인동덩굴과 후박 추출물의 단일 성분에 대한 정확한 항균 활성을 평가하기 위해 최소저해농도 평가를 진행하였다. 실험 결과는 표 5에 나타내었다.

균주	MIC (μL/ml)
	그램 양성 박테리아		그램 음성 박레리아		효모	몰드
	S. aureus	B. subtilis	E. coli	P. aeruginosa	C. albicans	A. niger
메틸 파라벤	1250	1250	1250	1250	1250	625
카페산	312	5000	5000	2500	5000	> 10000
루테올린	25	200	200	50	200	200
마그놀롤 및 호노키올의 혼합물(1:1)	31.2	10000	10000	1250	5000	39

카페산은 황색포도상구균과 녹농균에서 높은 항균 활성을 나타내며, 고초균, 대장균, 효모균에서도 항균 활성을 나타내었다. 하지만 검정곰팡이에 대해서는 고농도에서도 항균 활성을 나타내지 않았다. 반면, 루테올린은 낮은 농도에서 모든 균주에 항균 활성을 나타내었으며 특히 황색포도상구균과 녹농균에서 뛰어난 항균 활성을 나타내었다. 이를 통해 앞선 disc diffusion assay 결과에서 루테올린이 저해환을 나타내지 않은 것이 낮은 농도로 처리되었기 때문임을 예상할 수 있다. 인동덩굴 50% 에탄올 추출물은 황색포도상구균과 녹농균에서 항균 활성을 나타내는데(표 3) 이것은 비교적 극성이 높은 카페산에 의한 활성으로 예측할 수 있다. 인동덩굴 에틸아세테이트 분획물의 항균 활성은 6개 균주에서 나타났으며, 이는 비극성 성분인 루테올린의 영향에 의한 결과로 예상할 수 있다.

마그놀롤과 호노키올은 모든 균주에서 항균 활성을 나타내었으며 특히, 황색포도상구균과 녹농균, 검정곰팡이에서 높은 항균 활성을 나타내었다. 이를 통해 6개 균주에 대한 후박 추출물의 항균 효과는 마그놀롤과 호노키올의 영향으로 나타난 결과라는 것을 짐작할 수 있다. 또한, 단일 성분의 항균 효과보다 추출물에서의 효과가 뛰어난 것을 통해 마그놀롤, 호노키올과 다른 성분 간의 상호 작용에 의해 후박 추출물의 항균 시너지 효과가 나타났을 것으로 예측할 수 있다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (5)

1. 인동덩굴 추출물 및 후박 추출물을 포함하는 항균 조성물로서, 상기 인동덩굴 추출물은 루페올린 및 카페산을 유효 성분으로 포함하고, 상기 후박 추출물은 호노키올 및 마그놀롤을 유효 성분으로 포함하는 것이고,
   상기 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 고초균(Bacillus subtilis), 및 진균류인 효모(Candida albicans) 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 균에 대해 항균 활성을 갖는 것인, 항균 조성물.
   
2. 인동덩굴 추출물 및 후박 추출물을 포함하는 화장품 조성물로서, 상기 인동덩굴 추출물은 루페올린 및 카페산을 유효 성분으로 포함하고, 상기 후박 추출물은 호노키올 및 마그놀롤을 유효 성분으로 포함하는 것이고,
   상기 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 고초균(Bacillus subtilis), 및 진균류인 효모(Candida albicans) 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 균에 대해 항균 활성을 갖는 것인, 화장품 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 추출물인, 항균 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 인동덩굴 추출물; 및 상기 후박 추출물은 각각 10:1 내지 0.1:1의 중량비로 포함하는, 항균 조성물.
   

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