KR102001528B1 - 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커, 키트, 및 이를 이용한 한국 재래돼지 식별 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면, 한국 재래돼지 고유의 유전자 서열을 이용하여 모색이 유사한 경우에도 한국 재래돼지를 신속, 정확하고 경제적으로 식별할 수 있다.
Description
본 발명은 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 한국 재래돼지 고유의 SNP 마커를 이용하여 한국 재래돼지를 신속, 정확하고 경제적으로 식별할 수 있는 한국 재래돼지 식별용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 한국 재래돼지 식별 방법에 관한 것이다.
한국 재래돼지(Korean Native pig, KNP)는 일반 개량종에 비해 단단한 지방 조직, 백색의 지방색, 풍부하고 담백한 육즙과 쫄깃하고 부드러운 식감 및 육색이 붉고 마블링이 우수한 특성이 있어 소비자의 선호도가 높은 것으로 보고되었다.
특히 한국 재래돼지 중 제주도의 흑돼지는 기름기가 적고 육질이 부드러워 선호도가 매우 높고 판매가격도 상대적으로 높은 편이다.
이에 흑모색의 버크셔가 제주 흑돼지로 둔갑하여 판매되는 경우가 종종 발생하고 있다.
한편, 모색은 질적 형질로 알려져 있으나, 사실상 품종 또는 개체 수준에서 품종식별에는 어려움이 있다. 따라서, 유전자 수준에 신속, 정확하고 경제적으로 한국 재래돼지를 식별할 수 있는 방법에 대한 요구가 있어 왔다.
본 발명의 배경기술로는 한국 공개특허제10-2016-006348호에 흑돈육과 비흑돈육 판별에 유용한 단일염기다형성 마커 및 이의 용도에 대해 기재되어 있다.
본 발명 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 발명에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 한국 재래돼지 식별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 한국 재래돼지 식별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 마커에 의한 유전자형을 확인하여 한국 재래돼지를 식별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 386번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 386번째 염기를 포함하는 5 내지 600개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 제제는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 및 버크셔 품종과 한국 재래돼지 품종을 식별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 버크셔 품종과 제주 재래돼지 품종을 식별할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 마이크로어레이가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 상기 추출된 핵산으로부터 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 재래돼지 식별 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 b)에서 증폭은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 대립 유전자형이 A/A 형인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 A인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 G인 경우 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 또는 버크셔 품종으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 한국 재래돼지 고유의 유전자 서열을 이용하여 한국 재래돼지를 신속, 정확하고 경제적으로 식별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 한국 재래돼지 식별을 위한 유전자 진단 체계 기반을 마련할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 모색이 유사한 경우에도 한국 재래돼지 품종을 외래돼지 품종과 정확하게 식별할 수 있어 돈육의 투명한 유통체계를 확립하는 데 일조할 수 있다.
도 1은 백색품종인 랜드레이스와 흑모색의 제주 재래돼지를 교배하여 나오는 자손의 모색을 분류하여 나타낸 사진이다.
도 2는 제주 재래돼지와 랜드레이스 교배 축군에서 전신 흑모색에 대한 GWAS 분석을 한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 KIT 유전자의 엑손2 영역의 c.586 G>A 신규 돌연변이를 나타내는 서열분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한 품종간 네트워크 분석을 한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 엑손2 염기서열(서열번호 1) 중 SNP 마커 위치를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의해 서열번호 1의 염기서열에서 386번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형, A/A형으로 나타남을 확인한 결과의 도면이다.
도 2는 제주 재래돼지와 랜드레이스 교배 축군에서 전신 흑모색에 대한 GWAS 분석을 한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 KIT 유전자의 엑손2 영역의 c.586 G>A 신규 돌연변이를 나타내는 서열분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한 품종간 네트워크 분석을 한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 엑손2 염기서열(서열번호 1) 중 SNP 마커 위치를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의해 서열번호 1의 염기서열에서 386번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형, A/A형으로 나타남을 확인한 결과의 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 한국 재래돼지를 외래 돼지와 식별할 수 있는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커가 제공된다.
상기 SNP 마커는 KIT 유전자의 엑손2에 위치하며 한국 재래돼지와 외래 돼지를 정확하게 식별할 수 있어, 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커로서 유용하게 활용될 수 있다. 상기 SNP 마커는 KIT 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 용어 "KIT" 유전자는, 멜라노사이트 이동과 생존에 중요한 역할을 하며 비만/줄기세포 성장 인자 수용체(mast/stem cell growth factor receptor)를 암호화하는 유전자로서, 돼지의 KIT 유전자는 8번 염색체에 암호화되어 있으며 21개의 엑손으로 이루어져 있다. 한국 재래돼지 품종과 외래 품종을 정확하게 식별할 수 있는 KIT 유전자에서 유래한 본 발명의 SNP 마커는 알려진 바가 없고, 본 발명자에 의해 최초 발견되었다.
본 발명의 용어 "SNP(Single Nucleotide Polymorphism)"란, 단일염기다형성으로, 게놈에서 단일염기(A, T, C, 또는 G)가 종의 멤버들간 또는 한 개체의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.
본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성이라고 한다.
본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대 SNP는 두 종류의 대립인자를 갖는다.
백색품종인 랜드레이스와 흑모색의 제주 재래돼지를 교배하여 F2 자손 1200여두를 생산하여 생산되는 자손의 모색은 다양하게 나오는데 이를 정리를 해보면 크게 6가지 형태로 구분된다(도 1).
백색품종인 랜드레이스와 흑모색의 제주 재래돼지의 교배 참조축군을 대상으로 유전자형을 이용한 GWAS(Genome wide association study) 분석을 수행한 결과 한국 재래돼지의 특이적인 유전자가 8번 염색체 상에 존재함을 확인할 수 있었다(도 2).
KIT 유전자에 대해 서열 분석을 한 결과 KIT 유전자의 엑손2 영역에 c.586 G>A 돌연변이를 존재함을 확인할 수 있었다(도 3).
또한, 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한 품종간 네트워크 분석한 결과 제주 재래돼지는 외래 돼지 품종과 비교해서 유전적으로 독립된 집단으로 구분됨을 확인할 수 있었다(도 4).
본 발명의 일 실시예에 의하면, KIT 엑손2의 SNP 마커에 의한 유전자형은 G/G 유전자형 및 A/A 유전자형이 존재하며, A/A 형인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다(도 5, 도 6 및 표 1). 표 1에 나타난 바와 같이, 제주 재래돼지 및 내륙 재래돼지는 A/A 유전자형인 반면, 외래 돼지 품종은 모두 G/G 유전자형을 가지고 있다.
따라서, 본 발명의 SNP 마커 부위를 증폭하고 파이로 시퀀싱(Pyro-sequencing) 방법으로 상기 SNP 마커의 유전자형을 확인하면, 한국 재래돼지 여부를 정확하게 식별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 및 버크셔 품종과 한국 재래돼지 품종을 식별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 유사한 흑색의 모색을 가진 버크셔 품종과 제주 재래돼지 품종을 식별할 수 있다.
본 발명에 있어, "파이로시퀀싱(pyrosequencing)"은 표지된 프라이머(labeled primer)가 필요하지 않으며 젤 전기영동 과정이 없이, DNA의 염기 서열을 30~40 염기쌍(bp) 정도만을 염기 서열 분석함으로써 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 파이로시퀀싱 방법은 실시간으로 수행되는, 전기영동을 하지 않고 이루어지는 시퀀싱 방법으로서, 프라이머-디렉티드 PCR에서 한번에 하나씩 순차적인 뉴클레오티드의 첨가와 병합에 의해 이루어지고 뉴클레오티드가 병합되면서 방출되는 파이로포스페이트는 ATP 설파릴레이즈(sulfurylase) 및 루시퍼레이즈(luciferase) 효소와 짝지어져 빛을 방출시키며, 이 빛을 검출하는 방식으로 이루어진다. 방출된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 뉴클레오티드의 반응 순서대로 신호 피크를 나타내고, 이 빛은 병합된 뉴클레오티드의 수와 비례하여 상대적 높이를 갖는 피크로 보여지고, 이를 보고 실시간으로 시퀀스를 결정할 수 있다.
피크의 패턴은 호모 및 헤테로, 야생형 및 돌연변이 시료 간 다르게 나타나므로, 야생형의 유전자 염기서열과 분석된 염기서열을 비교하여, 염기서열 차이를 통해 돌연변이의 타입 및 정확한 위치를 확인, 결정할 수 있으며, 빠르고, 간단하고, 경제적인 방식으로 다량의 시료를 처리할 수 있는 장점이 있다.
종래의 직접적 DNA 시퀀싱 방법은 현재 자동화된 염기서열분석기기에 의해 수행됨에도 불구하고, 염기서열 분석할 PCR 산물과 같은 DNA 시료를 수득한 후에 정제하여 시퀀싱 반응을 수행한 후, 시퀀싱 반응으로 생성된 DNA를 침전시키고, 이를 자동화된 DNA 염기서열분석기기에 로딩하여 서열을 읽게 되므로 서열분석에 요구되는 시간이 훨씬 많은 단점이 있는 반면, 파이로시퀀싱은 염기서열 분석할 PCR 산물만 준비된다면 시퀀싱 프라이머를 가지고 반응시키고, 이는 파이로시퀀싱 기기에 의해 대략 10분 내에 염기서열의 분석이 가능하다.
또한, 뉴클레오티드 분배 순서 (nucleotide dispensation order)가 디자인될 수 있으므로 단일 뉴클레오티드에 의해 달라지는 염기서열 변이는 여러 피크에서 다른 양상으로 나타나는 뚜렷한 파이로그램으로 생성된다. 더욱이, 특정 뉴클레오티드 분배 전략을 사용함으로써 파이로시퀀싱 사이클의 수를 감소시킬 수 있고, 이에 따라 서열의 질과 판독 길이를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서 사용될 수 있는 공정을 간단히 설명하면 이하와 같다. 파이로시퀀싱을 통해 변이(Mutation 혹은 Variation)를 검출하고자 하는 염기서열을 포함하는 유전자를 pyro-PCR 프라이머 세트(한쪽 가닥의 분리 정제를 위해 순방향 혹은 역방향 프라이머의 한쪽의 5' 말단에 바이오틴을 컨쥬게이션한다)를 이용하여 RT-PCR 및 PCR을 통해 증폭하고, 이렇게 증폭된 PCR 산물은 아비딘이 컨쥬게이션된 비드와 반응 후 아비딘과 바이오틴의 친화력을 이용하여 PCR로 증폭된 DNA의 한쪽 가닥만 분리 비드에 고정한다. 이렇게 분리 정제된 한쪽 가닥의 DNA 주형을 이용하여 파이로시퀀싱 프라이머와 어닐링한 후 파이로시퀀서(pyro-sequencer)에서 뉴클레오티드 분배 순서에 따라 분주된 뉴클레오티드가 기질/효소와 함께 DNA 주형과 반응하여 나타난 파이로그램(pyrogram)을 이용하여 염기서열의 변이의 정도를 분석한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 386번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 386번째 염기를 포함하는 5 내지 600개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, SNP 마커를 증폭 또는 검출할 수 있는 제제는 상기와 같은 유전자 변이 부위, 즉 SNP 마커를 증폭 및 파이로시퀀싱 방법을 통해 검출하여 한국 재래돼지 여부를 식별할 수 있는 조성물을 의미하며, 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 파이로시퀀싱 프라이머, 및 PCR 방법에 이용되는 증폭용 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 제제는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머들의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
도 5에는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 엑손2 염기서열(서열번호 1) 중 SNP 마커 및 분석용 프라이머 제작을 위한 위치가 나타나 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 키트가 제공된다.
본 발명에 있어 상기 키트는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트는 한국 재래돼지를 식별할 수 있는 유전자를 증폭시킨 후 제한효소로 절단하여 나타나는 밴드의 양상을 확인함으로써 한국 재래돼지 여부를 식별할 수 있다. 상기 PCR 키트는, SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 각각의 프라이머쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 키트는 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 수행을 위한 키트일 수 있다.
본 발명에서, PCR-RFLP 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 마이크로어레이가 제공된다.
본 발명에 있어 "마이크로어레이"란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 상기 추출된 핵산으로부터 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 재래돼지 식별 방법이 제공된다.
본 발명에 있어, 상기 a) 및 b) 단계에서 돼지 시료로부터 핵산을 추출하고 SNP 마커의 다형성을 부위를 증폭하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다. 대상 시료로부터 핵산을 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 시료는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다. 이에 한정되는 것은 아니나, 피부조직일 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 b) 단계에서 증폭은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 c) 단계에서 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, AffymetrixGeneChip), 및 BeadArrayTechnologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.
상기 혼성화란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다. 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다.
혼성화 정도를 검출하기 위해, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지물질로 표지될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 P32 또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.
상기 서열 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다.
DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 세트로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.
도 6에는 본 발명의 일 실시예에 의해 서열번호 1의 염기서열에서 386번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형, A/A형으로 나타나는 것이 분석되었다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 대립 유전자형이 A/A 형인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 A인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 G인 경우 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 또는 버크셔 품종으로 판단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 SNP의 유전자형을 검출하거나 또는 상기 유전자형을 검출할 수 있는 프라이머를 이용하면, 한국 재래돼지 품종만 선별적으로 정확하게 식별할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 한국 재래돼지 관련
GWAS
(genome-wide association study) 분석
백색 품종인 랜드레이스 돼지와 흑모색의 제주 재래흑돼지의 교배 참조축군을 대상으로 흑모색에 대한 SNP chip(Porcine 60K Beadchip, Illumina)을 이용하여 GWAS 분석을 수행하였다(도 2). 도 2는 제주 재래돼지와 랜드레이스 교배 축군에서 전신 흑모색에 대한 GWAS 분석을 한 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 2에 나타난 바와 같이, GWAS 분석 결과 8번 염색체에서 가장 유의성이 높았으며, 그 영역에는 돼지의 모색과 관련된 KIT 유전자가 있어 이를 후보 유전자로 선정하였다.
돼지 KIT 유전자는 백색과 유색을 식별하는데 사용되는 중요한 모색유전자로 알려져 있다. 구체적으로 백색의 모색을 가진 품종으로는 랜드레이스, 대 요크셔 품종이 있으며 이들 품종은 KIT 유전자가 최소 2개 이상 반복되는 CNV(copy number variation)를 갖고 있는 특성이 있다. 따라서 유전자 구조가 복잡하고 그 길이가 길어서 변이체 탐색에 있어 가장 빠른 방법을 선정하기 위하여 돼지 피부를 채취하여 mRNA 서열을 RT-PCR 방법으로 증폭하여 상기 시퀀싱 방법으로 염기서열을 해독하였다. 그 결과 exon2에서 단백질 서열이 변화하는 Non-synonymous SNP(c.586G>A )가 확인되었다(도 3).
실시예
2: 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한
품종간
네트워크 분석
예비 실험단계에서 돼지 KIT 유전자를 대상으로 6품종(랜드레이스, 대요크셔, 두록, 제주재래돼지, 버크셔 및 햄프셔)에 대하여 KIT 유전자의 5'-UTR, exon, 3'-UTR 영역에서 변이체를 확인하고 이 변이체의 염기서열 상동성을 이용하여 유전적 거리를 계산하여 네트워크 분석을 진행하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한 품종간 네트워크 분석을 한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 제주 재래돼지가 외래 돼지 품종에 비해 유전적으로 독립된 집단으로 구분되는 것이 확인되어 제주 재래돼지 특히 서열이 존재할 가능성이 크다.
실시예
3: SNP 유전자형 분석
파이로-시퀀서(Pyro-sequencer)를 이용한 유전자형 분석을 수행하여 상기 SNP(c.586G>A) 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.
KIT_new_ex2F: biotin-GGC-CAT-TCA-AAC-TCC-TGA-TT(서열번호 2)
KIT_ new_ex2R: CAG-AAG-CAA-GCC-AGC-AAG-AG(서열번호 3)
KIT_ new_ex2_MINI: GAT-ACT-CGC-GCT-TCA-CGT-TT(서열번호 4)
입력 [C/T]TGATGGTGATGCC(서열번호 5)
PCR product size: 344bp
집단분석을 위해 상기와 같이 프라이머 1쌍을 제작하였는데 KIT_new_ex2F에는 biotin-dye를 결합하여 제작하였다.
PCR 증폭 후에 파이로-시퀀서를 이용하여 매뉴얼에 따라 유전자형 분석을 진행하여 유전자형을 판독하였다. 이때 유전자 증폭은 95℃에서 5분간 denaturation을 진행하고, 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 총 35 cycle 후에 72℃에서 10분간 extension 후에 8℃에서 보관하였다.
상기 파이로-시퀀싱 분석 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 서열번호 1의 염기서열에서 386번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형 및 A/A형으로 각각 나타나는 것을 알 수 있었다.
실시예
4: 돼지 품종별 KIT
엑손2
유전자형 집단분석
국내에서 사육하고 있는 대표적인 돼지 품종인 랜드레이스, 두록, 대요크셔 및 흑모색의 버크셔 품종과 재래돼지돼지 품종별 KIT 엑손2 유전자형을 분석하여 표 1에 나타내었다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 재래돼지는 제주재래돼지 44두와 내륙 재래돼지 5두를 포함하여 전체 49두가 A/A 유전자형으로 고정되어 있는 반면, 나머지 4개의 품종은 G/G 유전자형을 가지고 있다.
따라서, 본 발명의 SNP의 유전자형을 검출하거나 또는 상기 유전자형을 검출할 수 있는 프라이머를 이용하면, 한국 재래돼지 품종만 선별적으로 정확하게 식별할 수 있다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> Gene marker for discrimination of Korean Native pig and use
thereof
<130> NPF31848
<160> 5
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120
nnnnnnnnag cattttagat ttttatcaca tgttttcagt gtctgtgacc ggccattcaa 180
actcctgatt gttgatatgc tgcagatcct gagaagcttt tcctcgtcga ccctcccttg 240
tatgggaagg aggacaatga cgcgctggtc cgatgtcctc tgacggaccc agaggtgacc 300
aattactccc tcacgggctg cgaggggaaa ccccttccca aggatttgac cttcgtcgcg 360
gaccccaagg ccggcatcac catcagaaac gtgaagcgcg agtatcatcg gctctgtctc 420
cactgctccg ccaaccaggg gggcaagtcc gtgctgtcga agaaattcac cctgaaagtg 480
agggcaggta cgagctcttg ctggcttgct tctgggagct ggcatatccg ctgatctaaa 540
agtagacatc tctcttctca ctggtccatg tttgtatgtc acttggatag ccgctctggt 600
cttttccccc agcttcaa 618
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR PRIMER
<400> 2
ggccattcaa actcctgatt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR PRIMER
<400> 3
cagaagcaag ccagcaagag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR PRIMER
<400> 4
gatactcgcg cttcacgttt 20
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR PRIMER
<400> 5
tgatggtgat gcc 13
Claims (11)
- 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 386번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 386번째 염기를 포함하는 5 내지 600개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 조성물로서, 상기 조성물은 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 및 버크셔 품종과 한국 재래돼지 품종을 식별할 수 있는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
버크셔 품종과 제주 재래돼지 품종을 식별할 수 있는, 한국 재래돼지 식별용 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 키트.
- 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 마이크로어레이.
- a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
b) 상기 추출된 핵산으로부터 제1항의 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 및 버크셔 품종으로부터 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
- 제7항에 있어서,
단계 b)에서 증폭은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하는, 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
- 제7항에 있어서,
단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 대립 유전자형이 A/A 형인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단하는, 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
- 제7항에 있어서,
단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 A인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단하는, 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
- 제7항에 있어서,
단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 G인 경우 랜드레이스, 두록, 대요크셔 또는 버크셔 품종으로 판단하는, 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
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| KR20220133515A (ko) * | 2021-03-25 | 2022-10-05 | (주)티엔티리써치 | 돼지 품종 판별용 조성물 및 이의 용도 |
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-
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