KR102001097B1 - 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균 - Google Patents
녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 호기성 균주와 임의성 균주 중 하천 등 수중에 존재하는 조류를 제어하는 살조세균 또는 살조균 (algicidal bacteria)에 관한 것으로, 수중에서 발생된 녹조를 자연친화형으로 사전 제어는 물론 사후에라도 효과적으로 제어할 수 있는 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균에 관한 것이다.
본 발명은 녹조 발생원으로 알려진 남조류의 우점종인 Microcystis sp. (특히, Microcystis aeruginosa)를 획기적으로 제어하기 위한 Rhizobium sp, Aeromonas medis strain, Aeromonas caviae strain, Stenotrophmonas maltophilia strain 의 4종과, Anabaena Flos-aquae를 효과적으로 제어하기 위한 Enterobacter sp., Arthrobacter sp., Comamonas sp., Enterobacter sp., Stenotrophomonas maltophilia strain, Microbacterium sp. 6종의 선택된 이들 미생물군을 목적하는 바에 따라 개별 또는 적절하게 혼합하여 서식 가능한 공간을 제공할 수 있는 미세공간(micropore)내 (예, 나무 조각 등) 고정하여 녹조를 제어하거나 살포하여 상기 녹조원인균의 성장을 저해하거나 사멸시킬 수 있는 매우 유용한 효과가 있다.
본 발명은 녹조 발생원으로 알려진 남조류의 우점종인 Microcystis sp. (특히, Microcystis aeruginosa)를 획기적으로 제어하기 위한 Rhizobium sp, Aeromonas medis strain, Aeromonas caviae strain, Stenotrophmonas maltophilia strain 의 4종과, Anabaena Flos-aquae를 효과적으로 제어하기 위한 Enterobacter sp., Arthrobacter sp., Comamonas sp., Enterobacter sp., Stenotrophomonas maltophilia strain, Microbacterium sp. 6종의 선택된 이들 미생물군을 목적하는 바에 따라 개별 또는 적절하게 혼합하여 서식 가능한 공간을 제공할 수 있는 미세공간(micropore)내 (예, 나무 조각 등) 고정하여 녹조를 제어하거나 살포하여 상기 녹조원인균의 성장을 저해하거나 사멸시킬 수 있는 매우 유용한 효과가 있다.
Description
본 발명은 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 호기성 균주와 임의성 균주 중 하천 등 수중에 존재하는 조류를 제어하는 살조세균 또는 살조균 (algicidal bacteria)에 관한 것으로, 인위적인 물질이 아닌 자연환경에서 발견된 미생물을 활용하여 친환경적이고 부차적인 악영향을 배제할 수 있으면서도, 수중에서 발생된 녹조를 사전 제어는 물론 사후에라도 효과적으로 제어할 수 있는 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균에 관한 것이다.
하천이나 호소에 자연정화 능력의 초과하는 오염된 오폐수가 유입되면 수중 및 바닥 등에 영양염류가 쌓이게 되어 수계가 부영양화되고, 이로 인해 녹조 (algal bloom) 내지 수화현상 (water bloom)을 야기하게 된다. 그래서 수면의 햇빛차단, 산소 전달의 제약 등으로 수중 용존산소가 감소하여 수중생태계가 파괴될 수 있다. 특히, 한국의 인공호에서는 녹조발생의 원인으로 남조류의 우점종인 Microsystis aeruginosa, Anabana Flos - aquae가 많이 발생하며 이 과정에서 독성물질이 생성되어 공중보건위생상의 문제를 유발하게 된다. 예를 들면, 조류 중에 일부 남조류에서는 간 또는 신경계를 손상시킬 수 있는 독성 물질을 생성하는데, 일례로 1979년 미국 펜실베니아주에서는 남조류가 발생한 호소에서 수영후 약 60여명이 두통, 복통, 구토, 설사, 눈 염증, 발진, 귀통 등의 증상이 알려지고 있다. 게다가, 이들 남조류는 식물플랑크톤, 동물플랑크톤, 원생동물 및 어류를 포함한 모든 동물이나 가축에게 직접적인 피해를 일으키기도 하였다.
또한, 정수처리시 공정의 기능저하를 유발하여 용수의 이용장애를 발생할 수 있다. 예를 들면, 정수시 핵심공정인 응집침전과 여과과정을 방해하는 등의 문제점을 초래하여 정수 비용을 증가시키게 된다. 또 남조류의 대사과정에서 생성되는 지오스민(Geosmin, 권고기준: 20 ppt)은 수돗물내에 악취를 유발하고 심하면 하천 및 호소의 수변가치를 저하시키는 경제적 손실을 야기하고 있다(Y.-H. Kang, J.-D.Kim, B.-H.Kim, D.-S.Kong, M.-S.Han (2005), Isolation and characterization of a bio-agent antagonistic todiatom, Stephanodiscushantzschii, Journal of Applied Microbiology, 98, 10301038, 2005). 무엇보다도 고온으로 정체된 수계는 부영향화로 인해 녹조의 발생이 용이하게되고, 결과적으로 조류로 뒤덮힌 녹조화된 물은 국민들에게 심미적으로 부정적인 영향을 끼치게 되고 문화, 예술, 관광, 레져 등과 같은 복합공간으로서의 활성화를 불가능하게 할 수 있다. 또한 생태학적인 측면에서도 조류의 대발생은 하천 스스로 수질개선 및 수생태계의 건강성을 회복하는 자기조절능력을 상실시키는 역할을 하는 문제점이 있었다.
현재, 녹조의 원인인 조류(algae, 특히, 남조류 등)를 제어하기 위해 다양한 물리적, 화학적, 및 생물학적 방법이 개발되고 있으나 효과적이지 않을 뿐만 아니라, 친환경적이면서도 효과적으로 녹조를 제어할 수 있는 실용화된 기술이 거의 알려진 바가 없으며, 특히 살조세균 또는 살조균 (algicidal bacteria)을 활용하여 수중에서 발생된 녹조를 자연친화형으로 제어하는 기술은 알려진 바가 없다.
본 발명의 배경기술로는 특허등록 제0356184호 "할로프로피닐 화합물 및 황 함유 트리아진의 혼합물을 포함하는 살생물 조성물"이 있다.
상기 배경기술에서는 "할로프로피닐 화합물 및 황 함유 s-트리아진의 혼합물을 포함하는 살진균 또는 살조류 조성물."을 제안한다.
그러나 상기 배경기술은 주로 화학적인 살균기능을 이용하는 특정 화학제라 할 수 있는데, 간단하게 말하자면 이들 화학제는 향균 기능을 가지고 있어 다종의 미생물군을 일시적으로 사멸하도록 하는 것이다. 하지만 이들 화학제는 향균기능을 가지도록 인위적으로 개발된 것이어서 대개 자연환경에서 존재하지 않는 물질이며, 따라서 자연 환경에 인위적으로 배출시에 그 향균 기능이 사라지면 새로운 환경오염물질로 부각되어 인류 및 자연생태계에 악영향을 끼치는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 녹조발생으로 인한 문제점을 극복하고자 녹조를 분해하는 최적 미생물을 자연환경에서 발견하고 분리하여, 수중에서 발생된 녹조를 자연친화형으로 사전 제어는 물론 사후에라도 효과적으로 제어할 수 있는 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 Microcystis sp.를 제어하기 위한 Rhizobium sp, Aeromonas medis strain, Aeromonas caviae strain, Stenotrophmonas maltophilia strain 중 어느 하나 또는 1개 이상을 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균을 제공하고자 한다.
또한, Anabaena Flos-aquae를 제어하기 위한 Enterobacter sp., Arthrobacter sp., Comamonas sp., Enterobacter sp., Stenotrophomonas maltophilia strain, Microbacterium sp.중 어느 하나 또는 1개 이상을 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균을 제공하고자 한다.
본 발명의 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균은 수중에서 발생된 녹조를 자연친화형으로 사전 제어는 물론 사후에라도 효과적으로 제어할 수 있는 효과가 있으며, 특히, 한국에서 주로 발생되는 녹조 발생원으로 알려진 남조류의 우점종인 Microsystis sp. (특히, Microsystis aeruginosa)와 Anabana Flos-aquae를 효과적으로 제어할 수 있어, 매우 효과적으로 녹조의 성장을 저해하거나 사멸시킬 수 있는 매우 유용한 효과가 있다.
또한, 본 발명은 녹조를 효과적으로 제어하기 위해 인위적인 물질이 아닌 자연환경에서 발견된 미생물을 활용하여 친환경적이면서도 부차적인 악영향을 배제할 수 있는 효과도 있다.
본 명세서에서 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 예시하는 것이며, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 첨부한 도면에 기재된 사항에만 한정되어서 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 남조류를 분해하는 미생물 분리 실험의 예시를 도시한 도.
도 2는 M1, M2, M3, M4 균주 30℃ 성장 비교 곡선.
도 3은 M1, M2, M3, M4 균주 35℃ 성장 비교 곡선.
도 4는 M3 균주 온도별 성장 곡선.
도 5는 M1, M2, M3, M4 혼합 균주 온도별 성장 곡선.
도 6은 M3 균주 배양시간에 따른 pH별 성장 곡선.
도 7은 Microcystis sp. 생분해시 시간에 따른 Chlorophill-a 및 개체수.
도 1은 남조류를 분해하는 미생물 분리 실험의 예시를 도시한 도.
도 2는 M1, M2, M3, M4 균주 30℃ 성장 비교 곡선.
도 3은 M1, M2, M3, M4 균주 35℃ 성장 비교 곡선.
도 4는 M3 균주 온도별 성장 곡선.
도 5는 M1, M2, M3, M4 혼합 균주 온도별 성장 곡선.
도 6은 M3 균주 배양시간에 따른 pH별 성장 곡선.
도 7은 Microcystis sp. 생분해시 시간에 따른 Chlorophill-a 및 개체수.
아래에서 본 발명은 실시 예를 참조하여 상세하게 설명이 되지만 제시된 실시 예는 본 발명의 명확한 이해를 위한 예시적인 것으로 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 호기성 균주와 임의성 균주 중 하천 등 수중에 존재하는 조류를 제어하는 살조세균 또는 살조균 (algicidal bacteria)에 관한 것으로, 수중에서 발생된 녹조를 자연친화형으로 사전 제어는 물론 사후에라도 효과적으로 제어할 수 있는 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균에 관한 것이다.
특히, 본 발명에서는 한국에서 주로 발생되는 녹조 발생원으로 알려진 남조류의 우점종인 Microsystis sp. (특히, Microsystis aeruginosa)를 획기적으로 제어하기 위한 Rhizobium sp, Aeromonas medis strain, Aeromonas caviae strain, Stenotrophmonas maltophilia strain 의 4종과, Anabana Flos-aquae를 효과적으로 제어하기 위한 Enterobacter sp., Arthrobacter sp., Comamonas sp., Enterobacter sp., Stenotrophomonas maltophilia strain, Microbacterium sp. 6종의 선택된 이들 미생물군을 목적하는 바에 따라 개별 또는 적절하게 혼합하여 서식 가능한 공간을 제공할 수 있는 미세공간(micropore)내 (예, 나무 조각 등) 고정하여 녹조를 제어하거나 살포하여 상기 녹조원인균의 성장을 저해하거나 사멸시키는데 고유의 특장점을 지니고 있다.
본 발명에서는 적절한 미생물 균주를 먼저 확보하여 녹조원인 미생물을 분해하는 균주를 먼저 탐색하고, 녹조발생 지역, 하수 슬러지(sludge) 등으로부터 적절한 미생물 균주를 확보하였다.
상기 미생물 균주들의 동정은 16S rRNA gene을 sequencing함으로써 이루어졌다. 16S rRNA는 genomic extraction과 이에 상응하는 PCR에 따르는 한 쌍의 20F(5 M)(5'- AGAGTTTGATCCTGGCTC)와 1510R(5 M) (5'-ACGGCTACCTT GTTAGA) primer를 사용하여 증폭하였다.
* PCR(polymerase chain reaction) 혼합은 2 ul dNTP, 2 ul buffer, 0.2 ul의 5, 35 M primer, 10 ul DNA template, 5 ul rTaq이 포함되었음. PCR 샘플은 먼저 94에서 5분 동안 denature, 60에서 30초간 annealing, 72에서 90초간 extension하여 30회 cycle을 반복한 다음 72에서 5분 동안 extension하였다.
16S rRNA를 포함하는 plasmid vector는 선택된 cell의 nucleotide 서열 분석을 위해 pGEM-T Easy vector(Promega, Madison, WI, USA)와 E. coli cell을 변형시켜 사용하였다. 16S rRNA는 automated sequencer(Model 4200; DNA Analyzer Gene READIR, Li-COR, Inc., USA)를 사용하여 염기서열이 분석되었다. 16S rRNA 서열분석 결과를 이용하여 염기서열상 가장 가까운 위치에 있는 균들과 비교하기 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI, 미국) Blast search program을 사용하여 database로부터 비교분석하였다.
상기와 같은 미생물 균주의 동정 과정을 거쳐, 확보된 미생물 균주는 녹조를 분해하는 호기성균과 임의성 균주 중에서 선택하였으며, 이 중 녹조 발생원으로 알려진 남조류의 우점종인 Microsystis sp . (특히, Microsystis aeruginosa)를 분해하는 균주와 Anabana Flos - aquae를 효과적으로 제거할 수 있는 균주를 선택하였다.
이를 통해 선택된 미생물 균주를 배양하고 이 균주를 사용목적에 맞게 선택한 다음, 선택된 미생물 균주의 적절한 서식 환경을 제공하기 위해 다양한 다수의 담체에 접종한 후에 녹조제거에 관한 실험을 수행하였다.
예를 들면, 다수의 미생물 서식공간을 제공할 수 있는 다공성 우드칩(woodchip, 일종의 나무조각으로 미세한 구멍이 다수개를 가짐)과 같은 재료에 적절하게 선택된 미생물 균주를 접종한 방법으로 상기의 녹조원인균의 분해를 조사하였다. 접종된 미생물 균주는 전계방출주사현미경[Field Emission Scanning Electron Microscopy(FE-SEM), S-4800 모델, Hitachi]을 이용하여 미생물 균주의 접종 여부 및 고정된 환경을 정량적으로 관찰하여 조사하였다.
또한, 상기에서 선택된 미생물 균주의 형태학적 특징은 살조류 미생물의 형태와 배양상태를 관찰하기 위하여 광학현미경(Olympus CX40, Japan)으로 검경하여 균주의 운동성, 및 성장상태를 관찰하였다.
바람직한 실험예를 통하여 본 발명의 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균의 배양 및 미생물 분해 과정을 순서대로 설명하면 다음과 같다.
1.남조류 배양
본 발명에서는 남조류 분해 미생물의 분리 및 분해 특성을 조사하기 위해 공시 조류로 알려진 Microsystis sp.(KMMCC-1520)와 Anabana Flos-aquae(KCCM-11922)를 한국해양미세조류은행(KMCC)로부터 분양을 받았다.
남조류는 Jaworski`s Medium(Stocks per 200 ml Ca (NO3)2 . 4H2O 4.0 g, KH2PO4 2.48 g, MgSO4 . 7H2O 10.0 g, NaHCO3 3.18g, EDTAFeNa 0.45 g, EDTANa2 0.45 g, H3BO3 0.496 g, MnCl2 . 4H2O 0.278 g, (NH4) 6Mo7O24 . 4H2O 0.20 g, Cyanocobalamin 0.008 g, Thiamine HCl 0.008 g, Biotin 0.008 g, NaNO3 16.0 g, Na2HPO4 . 12H2O 7.2 g / Medium per liter to stock solution 1 ml each)를 사용하였다. 남조류의 배양조건은 25, 100rpm의 조건에서 진탕하여 배양하였다.
2. 남조류 분해 미생물의 분리
균주의 분리원은 하수처리장의 활성슬러지 등을 이용하였다. C-medium에 각각 남조류인 Microsystis sp.와 Anabana Flos-aquae를 7일 동안 배양하여 이를 8000rpm, 10분간 원심분리 하여 이를 기질로 첨가하였다. C-midium의 조성은 아래 <표 1>과 같다. 3% 남조류를 첨가한 C-medium에 활성슬러지를 0.3ml (3%) 접종하여 25에서 100rpm, 12D:12L조건으로 5일 동안 배양하였다. 육안으로 활성슬러지를 접종하지 않은 대조군과 비교 하였을 때 조류 특유의 색인 녹색을 띄지 않은 것과 투명해진 것으로 선별하여, LB agar에서 순수 배양하였다(<표 2>).
| Component | Amount |
| (NH4)2SO4 | 5.0g |
| KH2PO4 | 1.0g |
| K2HPO4 | 2.0g |
| MgSO4ㅇ7H2O | 0.2g |
| NaCl | 2.0g |
| CaCl2ㅇ2H2O | 10mg |
| FeSO4ㅇ7H2O | 10mg |
| Trace element solution | 2.0ml |
| 증류수 | 1000ml |
| pH | 7.0 |
| Component | Amount |
| Trypton | 10.0g |
| yeast extract | 5.0g |
| NaCl | 10.0g |
| Agar | 15.0g |
| 증류수 | 1000ml |
| pH | 7.0 |
3. 남조류 미생물의 동정
분리된 균주를 광학현미경을 이용하여 Gram straining을 통하여 그람 음성균과 그람 양성균 감별을 하여 균의 형태를 확인 하였다.
또한 분리된 균주를 동정하기 위하여 솔젠트(주)에 의뢰하여 16s rRNA sequncing 분석을 통해 polymerase chain reaction (PCR) 증폭에 의해 확인되었다. 염기서열 primer 27F, 1492R 양방향으로 하여 판정된 결과를 토대로 유전자은행 NCBI 데이터 베이스를 통해 비교 검색하여 균주의 이름을 판정하였다.
4. 남조류 미생물의 성장특성
1)최적의 초기 pH 조사
최적 초기 pH를 알아보기 위하여 LB medium 100ml을 300ml 삼각 플라스크에 넣고 LB medium에서 전배양된 균주를 1%농도로 접종하여 각 초기 pH 조건에서 배양하여 성장을 관찰하였다. pH 범위는 pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10으로 10N-NaOH와 HCl로 조절하였으며 30℃, 120rpm의 조건에서 진탕배양 하였다. 배양시간에 다른 균체 성장은 2시간 마다 배양액 1ml을 채취하여 분광광도기(UV/vis spectrophotometer, Shimadzu, Japan)를 이용하여 600nm에서 Optical density를 측정하였다.
2) 최적의 온도 조사
균주의 최적 배양 온도를 조사하기 위해 LB medium 100ml을 300ml 삼각 플라스크에 넣고 LB medium에서 전배양된 균주를 1%농도로 접종하여 각 온도 조건에서 배양하였다. 온도 조건은 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃로 조절 하였다. 배양시간에 다른 균체 성장은 2시간 마다 배양액 1ml을 채취하여 분광광도기를 이용하여 600nm에서 Optical density를 측정하였다.
3) 최적의 기질 농도 조사
균주의 최적 기질 농도를 조사하기 위해 저영양염류인 C-medium 100ml을 300ml 삼각 플라스크에 넣고 LB medium에서 전배양된 균주를 1%농도로 접종하여 남조류인 기질을 첨가하여 배양하였다. 기질 조건은 0%, 1%, 5%, 10%, 15%로 조절 하였다. 배양시간에 다른 균체 성장은 2시간 마다 배양액 1ml을 채취하여 분광광도기를 이용하여 600nm에서 Optical density를 측정하였다.
5.
살조균에
의한 남조류 분해 실험
JM배지 3L를 5L의 비이커 4개에 각각 Microsystis sp.를 15%씩 분주해 넣고 25℃ 12D:12L 조건으로 7일 동안 배양 후, 대수성장기의 남조류 분해 미생물 1.8 O.D.(600nm Optical density)인 균주를 다공성 세라믹 미생물 담체 1kg에 고정하였다.
남조류의 개체 수 변화를 측정하기 위하여 1일 간격으로 Hemocytometer를 이용하여 측정하였으며, 또한 녹조유발의 대표적인 지표(indicator)인 남조류의 chlorophyll-a를 측정하여 엽록소의 양을 측정하는 방법으로 아세톤 용액을 이용하여 시료를 여과한 여과지로부터 클로로필 색소를 추출하고, 추출액의 흡광도를 663, 645, 630 및 750 nm에서 측정하여 클로로필 a의 양을 계산하였다.
1) 남조류 분해 미생물 분리 및 배양
C-medium에 남조류인 Microsystis sp.와 Anabaena Flos-aquae를 3% 유일한 기질로 하여 25℃, 100rpm, 12D:12L 조건으로 활성슬러지를 이용하여 분리 하였으며, LB medium로 순수분리 하였다. 분리된 균주를 C-medium에서 원심 분리한 Microsystis sp.를 기질로 하였다. 기질 (3%)을 첨가하여 시험관에서 배양된 결과를 도 1에 도시하였다.
도 1에서, C는 대조군으로는 균주를 넣지 않고 기질인 Microsystis sp.를 3%만 첨가 하였다. 도 1에서 시험관 1, 2, 3은 모두 기질인 Microsystis sp.를 3%첨가후, 활성슬러지의 용출액 1%를 접종한 결과를 나타낸 것이다. 남조류를 분해하는 미생물을 분리하기 위하여 Microsystis sp.를 3%첨가 후 활성슬러지 1%를 접종하여 남조류가 활성슬러지를 접종하지 않은 대조군인 C와 비교하였을 때 투명해졌거나 황토색으로 변하면 조류를 기질로 이용한다고 판단되는 균주를 선별하였다. 분리된 균주는 M1, M2, M3, M4으로 명명하였으며, 분해 균주를 솔젠트(주)에 의뢰하여 균주의 16s rRNA 염기서열을 해독하였다. Sequecing 결과를 NCBI의 BLAST 검색 프로그램을 통하여 유사성을 판단한 결과와 균주 명을 <표 3>에 나타내었다. 이 균주를 현미경 관찰하여 그람 음성균과 그럼 양성균을 판별한 결과를 <표.3>에 나타내었다. 이와 동일한 방법으로 수행된 실험을 통해 Anabaena Flos-aquae를 분해하는 미생물의 형태상의 실험결과를 <표 4>에 나타내었다.
| Carbon source | Isolated strain |
The closest relative based on 16S rDNA | Max ident |
Liquid culture | Solid culture |
| Microcystis sp | M1 | Rhizobium sp | 99% |
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| M2 | Aeromonas medis strain | 99% |
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| M3 | Aeromonas caviae strain | 99% |
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| M4 | Stenotrophmonas maltophilia strain | 99% |
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| Carbon source | Isolate strain | The closest relative based on 16S rDNA | Max ident |
Liquid culture | Solid couture |
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Anabaena
Flos - aquae |
A1 | Enterobacter sp | 87% |
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| A2 | Arthrobacter sp | 99% |
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| A3 | Comamonas sp | 99% |
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| A4 | Enterobacter sp | 99% |
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| A5 | Stenotrophomonas maltophilia strain | 99% |
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| A6 | Microbacterium sp | 99% |
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2) Microcystis sp 분해 균주 최적온도
균주의 최적 배양 온도를 조사하기 위해 LB medium 100ml에서 전 배양된 균주를 1%농도로 접종하여 배양시간에 다른 균체 성장은 UV(sizuma, Japan)를 이용하여 600nm에서 Optical density를 측정하였다. M1, M2, M3, M4의 균주를 초기 균체 선별을 위한 배양 시 온도 30℃, 35℃로 조절하여 배양한 후 우수한 균주 M3와 M1, M2, M3, M4 혼합균주 선정하여 각 온도 조건 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃로 조절하여 배양하였다 (도 2 내지 도 5).
3) Microcystis sp 분해균주 최적의 pH
최적 초기 pH를 알아보기 위하여 LB medium 100ml에서 전배양된 균주를 1%농도로 접종하여 각 초기 pH 조건에서 배양하여 성장을 관찰하였다. pH 범위는 pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10으로 10N-NaOH와 HCl로 조절하였으며 30℃, 120rpm의 조건에서 진탕배양 하였다. 배양시간에 다른 균체 성장은 UV(sizuma, Japan)를 이용하여 600nm에서 Optical density를 측정하였다 (도 6).
4) Microcystis sp 분해균주 현미경 관찰
Microcystis sp의 생분해를 관찰하기위해 광학현미경(olimpus, japan)를 이용하여 1000배로 확대하여 관찰하였다. 각 M1, M2, M3, M4 미생물에 의해 Microcystis sp가 분해되어 세포가 터져 있는 것을 확인하였다 (<표. 5>).
| 균주 | Optical microscope (x 1000) A | Optical microscope (x000) B |
| Microcystis sp |
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| M1 |
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| M2 |
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| M3 |
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| M4 |
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6.
살조균
남조류를 분해하는 미생물 분해 실험
상기에서 서술된 담체 1kg에 대수성장기의 남조류 분해 미생물 1.8 O.D.(600nm Optical density)인 균주를 고정시켰다.
JM medium 3L에 Microsystis sp를 각 15%(6.5x106cells/mL)접종하였다. Microsystis sp.의 시간에 따른 개체 수 변화를 측정하기위하여 25℃ 12D:12L조건으로 15일 동안 Hemocytimeter를 이용하여 측정한 결과는 도 7a와 같다. 초기 6.5x06cells/mL에서 5일 후 47.70x06cells/mL로 증가 한 것을 알 수 있었다. 시간에 따른 Microsystis sp.가 증가로 염록소가 증가할 것으로 판단하여 Chloropill-a를 측정하여 M1부터 M4까지 복합 미생물(균)로 하여 고정한 담체와 15% Microsystis sp.를 접종한 것과 Microsystis sp. 15%만을 취한 것을 대조군으로 한결과는 도 7b와 같다. 85~90% 분해 한 것으로 확인하였다. 조류분해가 우수한 균주 M3 미생물을 고정한 담체 생물을 고정하고 15일 후 조류 분해 실험을 한 결과는 도 7b와 같다.
상기와 같은 본 발명의 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균은 수중에서 발생된 녹조를 자연친화형으로 사전 제어는 물론 사후에라도 효과적으로 제어할 수 있는 효과가 있으며, 특히, 한국에서 주로 발생되는 녹조 발생원으로 알려진 남조류의 우점종인 Microsystis sp . (특히, Microsystis aeruginosa)와 Anabana Flos - aquae를 효과적으로 제어할 수 있어, 매우 효과적으로 녹조의 성장을 저해하거나 사멸시킬 수 있으며, 녹조를 효과적으로 제어하기 위해 인위적인 물질이 아닌 자연환경에서 발견된 미생물을 활용하여 친환경적이면서도 부차적인 악영향을 배제할 수 있는 효과도 있다.
지금까지 본 발명은 제시된 실시 예를 참조하여 상세하게 설명이 되었지만 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 제시된 실시 예를 참조하여 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형 및 수정 발명을 만들 수 있을 것이다. 본 발명은 이와 같은 변형 및 수정 발명에 의하여 제한되지 않으며 다만 아래에 첨부된 청구범위에 의하여 제한된다.
Claims (2)
- Microcystis sp.를 제어하기 위한 Aeromonas medis M2(기탁번호 : KACC91857P)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 녹조발생 저감 및 제어가 가능한 자연친화형 살조균.
- 삭제
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