KR102001024B1 - 프로폴리스를 포함하는, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

프로폴리스를 포함하는 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 유효성분으로 프로폴리스 추출물 및 감초 추출물, 또는 여기에 올리브잎 추출물을 더 포함하는, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물은 천연물인 프로폴리스 추출물과 감초 추출물 또는 여기에 올리브잎 추출물을 더 혼합한 프로폴리스 복합물을 제조함으로써, 독성이 없으면서, 위염 및 헬리코박터 파일로리에 대해 치료 수준의 우수한 억제효과를 나타낸다.

Description

프로폴리스를 포함하는, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물{composition for anti-inflammatory and anti-Helicobacter pylori comprising propolis}

본 발명은 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물에 관한 것으로, 특히 유효성분으로 프로폴리스 추출물 등을 포함하는, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물에 관한 것이다.

프로폴리스(propolis)는 꿀벌들이 식물의 생장점과 상처난 부위를 보호하기 위해 분비하는 물질들을 자신의 타액과 혼합하여 만든 천연 왁스상 혼합물이다.

꿀벌은 벌집의 틈이 난 곳에 프로폴리스를 발라 병균이나 바이러스로부터 스스로를 보호하고, 말벌이나 쥐와 같은 적의 침입을 막음으로써 산란과 성장, 꿀의 숙성과 보관 등에 알맞은 서식처를 유지한다. 특히 여왕벌이 산란할 때에는 산란장소를 소독하여 청결하게 하는데 사용된다.

남미를 비롯한 여러 나라에서 민간요법으로 사용되는 프로폴리스는 최근 국내에서도 건강기능식품으로 다양한 질환의 치료 및 예방의 목적으로 사용되고 있으며, 프로폴리스 중에 포함된 성분인 플라보노이드(Flavonoids)와 테르페노이드(Terpenoids)가 나타내는 항산화작용에 기인한 다양한 약리작용에 대하여 많은 연구와 관심이 모아지고 있다. 특히 피부, 점막 및 구강감염에 대한 치료효과는 프로폴리스에서 분리동정된 다양한 물질에 기인한 것으로 적어도 150여개의 테르펜(terpene)류나, 카페인산 에스테르(caffeic acid ester)류, 플라보노이드(flavonoids) 및 아미노산 등과 같은 페닐프로판(phenylpropane) 유도체들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들 성분은 항균효과와 항진균효과뿐 아니라 방부작용까지 나타내어 다양한 영역에서 활용될 수 있음을 나타낸다.

프로폴리스의 에탄올 및 열수추출액은 생약으로 다양한 용도로 사용되고 있다. 프로폴리스 및 그 페놀성 성분은 사람 종양세포에서의 증식억제효과(Guarini et al., 1992), 항염효과(Dobrowolski et al., 1991), 항세균효과(Eley 1999; Grange et al., 1990; Steinberg et al., 1996), 항바이러스효과(Serkedjieva et al., 1992), 면역조절효과(Dimov et al., 1992), 항산화효과(Krol et al., 1990; Scheller et al., 1990) 및 항원충효과(Starzyk et al., 1977) 등의 다양한 약리작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 프로폴리스의 에탄올 추출물이 급성 및 만성 염증 및 통증을 유의성 있게 개선시키는 항염효과를 나타낸다는 것으로 보고되어 있다 (Park et al., 1996; Park and Khang, 1999). 이러한 프로폴리스 에탄올 추출물은 우수한 소염작용을 나타내면서도 일반적인 비스테로이드계 항염증소염제(NSAID)의 부작용인 위장관에 대한 부작용을 나타나지 않는 것으로 보고되고 있으며, 그 성분 중 강력한 항산화작용을 발휘하는 것으로 알려진 플라보노이드와 페놀산 등이 다량 함유되어 있다.

감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer)는 콩과에 속하는 다년생 초본식물로 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer), 광과감초(光果甘草, Glycyrrhiza glabra Linn) 또는 창과감초(脹果甘草, Glycyrrhiza inflata Batal. 콩과 Leguminosae)의 뿌리 및 뿌리줄기로서 그대로 또는 주피를 제거한 것이며, 건조시켜서 한약재로 사용하는데 그 맛이 달기 때문에 감초라 한다.

감초는 모든 약의 독성을 조화시켜서 약효가 잘 나타나게 하며 장부의 한열과 사기를 다스리고 모든 혈맥의 소통을 잘 시키며 근육과 뼈를 튼튼히 한다. 감초의 약리작용은 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진 등에 효과가 있으며, 진해·거담, 근육이완, 이뇨작용, 항염작용이 있으며 소화성궤양을 억제하는 효과가 있다.

올리브(olive)는 쌍떡잎식물 합판화군 용담목 물푸레나무과의 상록교목이다. 터키가 원산지이며, 이탈리아, 에스파냐, 그리스, 프랑스, 미국 등에서 주로 생산된다. 열매는 핵과(核果)로 타원형이며 자흑색으로 익고, 열매자체를 식용하거나 과육에서 짠 기름인 올리브유를 이용한다. 올리브 나무에 풍성하게 함유되어 있는 폴리페놀 성분 중 하나인 올러유러핀(Oleuropein)은 각종 미생물 및 병원균으로부터 올리브 나무를 보호하는 자정 및 방어 역할을 하는데, 올러유러핀은 올리브 나무 전체에 함유되어 있지만 가장 함유량이 높은 부분은 잎이므로 올리브잎이 주로 사용된다. 올리브의 잎은 강력한 산화 작용을 하여 피부상처의 감염을 치료하고 면역체계를 강화시키며, 감기와 같은 호흡기와 기관지 질환에 탁월한 효능을 보이고, 콜레스테롤과 혈당 조절 작용을 하며 전반적으로 신체 에너지 증진 및 건강도를 높여준다.

1. 대한민국 등록특허공보 제10-0420498호 2. 대한민국 등록특허공보 제10-1176521호 3. 대한민국 등록특허공보 제10-1323178호 4. 대한민국 등록특허공보 제10-1418366호 5. 대한민국 공개특허공보 제10-2004-0024057호 6. 대한민국 등록특허공보 제10-0897778호 7. 대한민국 등록특허공보 제10-0980254호 8. 대한민국 등록특허공보 제10-1348643호 9. 대한민국 등록특허공보 제10-0864006호

프로폴리스 자체의 여러 유효한 효과는 종전부터 알려져 있었고 항염효과에 대해서도 잘 알려져 있었으나, 프로폴리스 단독으로 유효한 치료효과를 갖기는 어려운 수준이었다. 또한, 항헬리코박터 파일로리 효과에서도 프로폴리스 단독으로는 유효한 효과를 나타내기 어려웠다. 따라서 프로폴리스는 항염이나 항헬리코박터 파일로리와 관련하여 주로 보조적인 성분으로 일부 이용되는 정도였다. 또한, 본 발명에서 확인한 결과 프로폴리스의 항염 및 항헬리코박터 파일로리 효과는 천연프로폴리스의 원산지마다 상당한 차이가 있어 재현성 있는 일정한 효과를 기대하기 어려웠다.

본 발명은 프로폴리스와 다른 천연물의 복합 작용을 통해 천연물만으로 이루어진 조성물로서 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제에 있어 치료 수준의 유효한 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로 본 발명에서는 프로폴리스 추출물에 감초 추출물을 혼합하여 또여기에 올리브잎 추출물을 더 혼합하여 치료수준의 뚜렷한 효과를 나타내는, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는 천연 프로폴리스의 산지에 따른 효능을 규명하여, 프로폴리스를 주성분으로 하면서도 재현성 있는, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는,

유효성분으로 프로폴리스 추출물 및 감초 추출물을 25~35:15~25의 중량비로 포함하는, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 유효성분으로 올리브잎 추출물을 더 포함할 수 있으며, 이때 바람직하게는, 프로폴리스 추출물, 올리브잎 추출물 및 감초 추출물을 25~35:5~15:15~25의 중량비로 포함할 수 있다.

상기 조성물에서, 상기 프로폴리스 추출물은 프로폴리스의 에탄올 추출물인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 프로폴리스 추출물은 프로폴리스 에탄올 추출물을 수용화시킨 수용성 추출물인 것이 좋다. 상기 수용성 추출물은, 천연프로폴리스의 이물질 및 왁스를 제거한 후 추출 및 농축시키는 단계와 수용화시키는 단계를 거쳐 얻은, 무알코올 수용성 프로폴리스인 것이 바람직하다. 상기 수용화 단계는, 친환경소재인 천연물질을 이용하여 수용화시키는 것이 더욱 바람직하며, 상기 프로폴리스 추출물은 이렇게 친환경 무알콜 수용성 프로폴리스로 제조되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 "천연프로폴리스"는 자연에서 채취된 상태 그대로의 아직 가공되지 않은 프로폴리스로 정의된다. 본 발명에서 "천연프로폴리스"는 종래 업계에서 관용적으로 사용되던 "프로폴리스 원괴"와 동일한 의미이다.

상기 조성물에서, 상기 프로폴리스 추출물은 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스, 브라질산 프로폴리스 및 한국산 프로폴리스 중에서 선택된 2종 이상의 프로폴리스의 혼합 추출물인 것이 바람직하다.

상기 조성물에서, 상기 프로폴리스 추출물은 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 한국산 프로폴리스의 혼합 추출물인 것이 바람직하다. 이때 상기 프로폴리스 추출물은 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 한국산 프로폴리스를 30~40:25~35:30~40의 중량비로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 조성물에서, 상기 프로폴리스 추출물은 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 브라질산 프로폴리스의 혼합 추출물인 것이 바람직하다. 이때 상기 프로폴리스 추출물은 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 브라질산 프로폴리스를 35~45:25~35:25~35의 중량비로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명에서는, 상기 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명에서 "건강기능식품"은 건강기능식품법 상의 건강기능식품을 포함하여 일반적으로 통용하는 건강식품과 기능성 식품을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명은 프로폴리스 추출물과 감초 추출물 또는 여기에 올리브잎 추출물을 더 혼합한, 천연물질로 이루어진 조성물을 제조함으로써, 독성이 없으면서, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제효과가 매우 우수한 조성물을 제공한다. 본 발명 조성물의 위염 억제효과는, 각 추출물을 단독으로 사용하는 경우에 비하여 NO 생성억제율이 크게 높고, IL-1β, IL-6 mRNA, TNF-α 등과 같은 염증성 사이토카인의 발현 억제율 또한 현저하게 높으며, 알코올성 위염을 유도한 동물실험에서 확인한 바와 같이 위염의 치료효과가 상당히 우수하다. 또한, 본 발명 조성물의 헬리코박터 파일로리 억제효과는, 디스크확산분석법, MIC, 요소분해효소 활성 등으로 확인되는 항헬리코박터 파일로리 효과가 크게 향상되고, 헬리코박터 파일로리로 위염을 유도한 동물실험에서의 치료효과 또한 우수하다.

또한, 본 발명에서는 산지에 따른 프로폴리스의 효능을 규명하여 프로폴리스를 주성분으로 하면서도 재현성 있고 일정한, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제효과를 나타낼 수 있는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 특히 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

도 1은 위장해 유도된 동물에서 수용성 프로폴리스의 위염예방 효과를 시험한 결과이다.
도 2a 내지 2c는 LC/MS/MS를 이용하여 프로폴리스의 유효성분을 분석한 크로마토그램으로, 도 2a는 크리신(Chrysin), 도 2b는 갈랑긴(Galangin), 도 2c는 피노셈브린(Pinocembrin)의 크로마토그램이다.
도 3a 내지 3h는 수용성 프로폴리스의 유효성분을 분석한 크로마토그램으로, 도 3a는 신남산(Cinnamic acid), 도 3b는 카페인산(Caffeic acid), 도 3c는 아카세틴(Acacetin), 도 3d는 CAPE, 도 3e는 캠퍼롤(Kaempferol), 도 3f는 갈산(Gallic acid), 도 3g는 크리신(Chrysin), 도 3h는 페룰산(Ferulic acid)의 크로마토그램이다.
도 4는 감초 시료의 글리시리진산 관련 HPLC 프로파일 및 검량선 측정치를 나타낸 것이다.
도 5는 감초 시료의 리퀴리틴 관련 HPLC 프로파일 및 검량선 측정치를 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 원산지의 프로폴리스 시료가 세포생존율에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 다양한 원산지의 프로폴리스 시료가 NO 생성에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 혼합프로폴리스와 프로폴리스복합 조성물이 세포생존율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 혼합프로폴리스와 프로폴리스복합 조성물이 NO 생성에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 혼합프로폴리스와 프로폴리스복합 조성물이 사이토카인 관련 유전자를 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험의 개략도이다.
도 12는 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 간무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 비장게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 신장무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 위점막의 육안적 손상을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험의 결과를 나타낸 것으로, A는 위손상 면적을 측정한 결과를 나타낸 것이고, B는 위손상 억제율을 나타낸 것이다.
도 17은 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 조직병리학적 관찰을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 위조직의 산화적 손상을 측정한 결과를 나타낸 것으로, A는 MDA의 측정결과이고, B는 GSH의 측정결과이다.
도 19는 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 염증성 사이토카인의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 IL-6의 측정결과이고, B는 IL-1β의 측정결과이며, C는 TNF-α의 측정결과이다.
도 20는 다른 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험의 개략도이다.
도 21은 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 체중을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 장기무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 위점막의 육안적 손상을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험의 결과를 나타낸 것으로, A는 위손상 면적을 측정한 결과를 나타낸 것이고, B는 위손상 억제율을 나타낸 것이다.
도 25는 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 조직병리학적 관찰을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험에서 위조직의 산화적 손상을 측정한 결과를 나타낸 것으로, A는 MDA의 측정결과이고, B는 GSH의 측정결과이다.
도 27은 원산지별 프로폴리스 시료의 항헬리코박터 효과를 디스크 확산분석법으로 측정한 결과이다.
도 28은 혼합프로폴리스와 천연물 추출물의 헬리코박터 파일로리에 대한 활성을 나타낸 것이다.
도 29는 다양한 프로폴리스의 요소분해활성 저해능을 나타낸 것이다.
도 30은 혼합프로폴리스와 천연물 추출물의 요소분해활성 저해능을 나타낸 것이다.
도 31은 혼합프로폴리스와 천연물 추출물의 혼합물의 헬리코박터 파일로리 생육 저해 활성을 디스크 확산분석법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 32와 33은 혼합프로폴리스와 천연물 추출물의 혼합물의 헬리코박터 파일로리에 대한 항균력(MIC)을 나타낸 것이다.
도 34는 시료별 유효성분의 항헬리코박터 파일로리 효과를 디스크 확산분석법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 시료별 유효성분의 요소분해효소 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 프로폴리스 복합물의 안전성을 확인하기 위하여 혈청 내의 ALT와 AST를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서, 실험동물의 위 조직을 육안관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서, 실험동물의 위장을 현미경적으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 40은 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 헬리코박터 파일로리의 위부착력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 항헬리코박터 파일로리 동물실험의 개략도이다.
도 42는 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 간무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 43은 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 비장무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 44는 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 신장무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 45는 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 헬리코박터 파일로리의 위부착력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 46은 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 실험동물의 위조직을 조직병리학적으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 47은 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 염증성 사이토카인의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 IL-6, B는 TNF-α, C는 IL-1β의 발현을 확인한 결과이다.
도 48은 항헬리코박터 파일로리 동물실험에서 위조직의 산화적 손상을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 MDA, B는 GSH를 확인한 결과이다.

본 발명의 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물은, 유효성분으로 프로폴리스 추출물 및 감초 추출물, 또는 여기에 올리브잎 추출물을 더 포함한다.

상기 프로폴리스 추출물은 한정되는 것은 아니나 프로폴리스의 물 추출물 또는 에탄올 추출물을 사용할 수 있다. 프로폴리스의 에탄올 추출물을 사용하는 것이 바람직하며, 에탄올 추출물을 수용화시킨 수용성 추출물을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

상기 수용성 추출물은, 천연프로폴리스의 이물질 및 왁스를 제거한 후, 추출 및 농축시키는 단계와 수용화시키는 단계를 거쳐 얻은, 에탄올이 잔류하지 않는 무알코올 수용성 프로폴리스인 것이 바람직하다. 상기 수용화 단계는, 친환경소재인 천연물질을 이용하여 수용화시키는 것이 더욱 바람직하며, 상기 프로폴리스 추출물은 이렇게 친환경 무알콜 수용성 프로폴리스로 제조되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 프로폴리스 수용성 추출물의 제조방법은, 바람직하게는 천연프로폴리스의 이물질 및 왁스를 제거한 후 에탄올로 추출하고 농축시켜 잔류 에탄올을 제거하는 단계와; 그런 다음 정제수를 투입하여 프로폴리스를 수용화시키는 단계를 포함한다.

프로폴리스는 수집원이 되는 주변 식물의 종류와 수집되는 시기에 따라 구성 성분이 달라지고, 색, 향취 및 기능성 특성 역시 채집지역에 따라 많은 차이가 있다. 본 발명에서는 각 산지에 따른 특성 확인을 통해 다양한 원산지의 프로폴리스를 사용하면서도 유효성을 일정하게 유지한다.

본 발명의 프로폴리스 추출물로는 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스, 브라질산 프로폴리스 및 한국산 프로폴리스 중 선택된 2종 이상의 프로폴리스의 혼합 추출물인 것이 바람직하다.

상기 프로폴리스 혼합 추출물은 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 한국산 프로폴리스를 혼합하여 사용하는 것이 보다 바람직하고, 이때 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 한국산 프로폴리스를 30~40:25~35:30~40의 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 특히 바람직하다.

또한, 다른 실시예에서 상기 프로폴리스 혼합 추출물은 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 브라질산 프로폴리스를 혼합하여 사용하는 것이 보다 바람직하고, 이때 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 브라질산 프로폴리스를 35~45:25~35:25~35의 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 특히 바람직하다.

상기 감초 추출물과 올리브잎 추출물은 바람직하게는 에탄올 추출물을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 프로폴리스 추출물, 올리브잎 추출물 및 감초 추출물은 바람직하게는 25~35:5~15:15~25의 중량비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 조성물은 특히 건강기능식품으로 이용될 수 있다. 본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 "건강기능식품"은 건강기능식품법 상의 건강기능식품을 포함하여 일반적으로 통용하는 건강식품과 기능성 식품을 모두 포함한다. 상기 건강기능식품은 일반적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 일반 식품의 형태를 가질 수도 있다.

이하 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실험예 1>

프로폴리스의 위염예방 효과시험

프로폴리스 추출물의 위염예방효과를 확인하기 위하여, NCEED(국가지정 소화기질환 의료제품 유효성평가 서비스센터)에 의뢰하여 다음과 같이 실험하였다.

시험동물로는 5주령 Sprague-Dawley계 수컷 래트 66마리를 사용하였으며, 시험시료로는 수용성 프로폴리스인 노봉방(말벌, 말벌집) 프로폴리스와 프로비 프로폴리스, 지용성 프로폴리스를 캡슐로 가공한 노봉방 캡슐 에탄올 추출물인 중국산 프로폴리스를 사용하였다.

시험동물을 각각 6마리씩 11개의 시험군으로 구분하고, 프로폴리스를 7일간 1일 1회 경구투여한 후 1M HCl-60% 에탄올을 단회 경구투여하여 위궤양을 유도하였다. 정상군에는 아무 처리도 하지 않았고, 대조군에는 프로폴리스를 처리하지 않고 위궤양만을 유도하였으며, 양성 대조군으로는 오메프라졸(Omeprazole)을 사용하였다. 실험내용을 하기 표 1에 나타내었다.

위궤양을 유도한 후 실험동물을 개복하고 위를 적출하여 위손상 길이 및 면적(위손상 억제율 또는 손상 점수), 위약 분비량, 위산도 및 위점막 표면 pH 측정을 하여 프로폴리스 추출물의 위염억제효과를 확인하였다. 그 결과 프로폴리스 추출물들에 의하여 위 손상이 유의적으로 개선되는 효과를 볼 수 있었다(데이터는 나타내지 않음).

또한 상기 실험동물의 위 표면을 포르말린으로 고정한 후 촬영하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서, 모든 시료군들에서 손상부위 등이 대조군에 비해 상당히 완화 및 보호되는 것을 확인할 수 있다. 특히 노봉방군의 경우, 양성 대조군인 오메프라졸과 유사한 효과를 나타내어 다른 시험군들에 비해 위장해 보호효과가 큰 것을 확인할 수 있다.

< 실험예 2>

원산지별 프로폴리스의 분석

프로폴리스는 수집원이 되는 주변 식물의 종류와 수집되는 시기에 따라 구성 성분이 달라지고, 색, 향취 및 기능성 특성 역시 채집지역에 따라 많은 차이가 있다. 현재 시장에서 유통되고 있는 프로폴리스를 이용하여 유효성분 함량 등을 원산지(한국산, 중국산, 아르헨티나, 브라질산 등)별로 조사하고 이를 통해 항염증 효과 및 항헬리코박터 파일로리 효과가 있는 프로폴리스 원료를 선별하였다.

I. 원산지별 프로폴리스 추출물의 제조

한국, 중국, 아르헨티나 및 브라질의 천연프로폴리스 각 50g을 두 종류의 추출용매, 즉 95% 발효주정 100% 용액과, 95% 발효주정 70%와 정제수 25%의 혼합용액 150g 이용하여 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안, 상온에서 교반하면서 추출하고 24시간 동안 방치한 후 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과하였다.

Ⅱ. 유효성분의 분석

1. 총 플라보노이드 함량 측정

프로폴리스는 고시형 건강기능식품으로 건강기능식품 공전에서 기준으로 하는 총 플라보노이드(tetal flavonoids)를 지표성분으로 한다.

(1) 측정방법

총 플라보노이드 함량은 건강기능식품 공전에 따라 측정하였다. 이는 에탄올을 이용하여 시료로부터 플라보노이드계 물질을 추출하여 분광광도계를 이용하여 분석하는 방법으로, 플라보노이드의 최대 흡수파장인 415nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량한다.

프로폴리스 추출물 0.1~0.5g(㎖)을 칭량하고 90% 에탄올 20㎖를 가하여 용해 및 분리(3,000rpm, 10분)하여 상등액을 취하고, 잔류물은 80% 에탄올 8㎖로 3회 추출하고 전 추출액을 합한 후 80% 에탄올을 사용하여 전량을 50㎖로 만들어 시험용액으로 사용하였다. 이 시험용액 0.5㎖를 시험관에 취하고 에탄올 1.5㎖, 10% 질산알루미늄용액 0.1㎖, 1M 아세트산칼륨용액 0.1㎖ 및 물 2.8㎖를 가하여 충분히 교반하였다. 실온에서 40분간 정치 후 액층을 10mm 셀(cell)을 사용하여 물을 대조액으로 하여 UV/VIS 분광광도계(Spectrophotometer, Varian, Inc. USA)를 이용해 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 흡광도로부터 별도로 상기 조작 중 질산알루미늄용액 대신 물 0.1㎖를 가한 것의 흡광도를 뺀 흡광도차를 이용하여 하기 수학식 1에 의해 총 플라보노이드 함량을 산출하였다.

(2) 측정결과

그 결과인 원산지별 프로폴리스의 추출 수율 및 총 플라보노이드 함량을 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2의 결과에서, 동일한 조건에서 추출하여도 프로폴리스의 원산지에 따라, 추출용매에 따라 추출되는 유효성분의 함량이 다르다는 것을 알 수 있다.

2. LC/MS/MS를 이용한 유효성분(Chrysin, Galangin, Pinocembrin) 정량분석

상기 표 2에서 수율 및 유효성분의 함량 추출율이 높은 95% 발효주정 추출물을 이용하여 문헌에 보고된 항헬리코박터 파이로리 효과를 갖는 지표 성분인 크리신(Chrysin), 갈랑긴(Galangin) 및 피노셈브린(Pinocembrin) 3종을 LC/MS/MS로 분석하여 함량을 확인하였다.

이동상 시약으로는 아세포니트릴(Acetonitrile, HPLC grade, Merck)과 포름산(formic acid, Sigma Aldrich)을 사용하였고, 장비로는 Finnigan Surveyor MS pump plus and Autosampler와 Finnigan TSQ Quantum Discovery를 사용하였다. LC/MS/MS의 분석조건을 하기 표 3에 나타내었고, 화합물들의 최적화조건을 하기 표 4에 나타내었다.

상기 분석결과인 원산지별 프로폴리스의 크리신, 갈랑긴 및 피노셈브린 함량을 하기 표 5에 나타내었고, 각 시료의 크로마토그램을 도 2a 내지 2c에 나타내었다.

3. 에탄올 추출 프로폴리스와 수용성 프로폴리스의 유효성분 함량 분석

에탄올 추출 프로폴리스는 물에 잘 녹지 않고 끈적거림이 심해서 섭취 시 입에 달라붙거나 컵 등에 달라붙고 잘 지워지지 않는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는 에탄올이 포함되지 않으면서 물에 쉽게 녹는 수용성 프로폴리스를 제조하여 사용한다.

본 발명에서 사용하는 수용성 프로폴리스는 에탄올 추출 후 농축시켜 에탄올을 제거하고 이어서 정제수로 수용화시켜 제조한다. 본 발명의 수용성 프로폴리스와 에탄올 추출 프로폴리스의 유효성분 차이를 확인하기 위하여 LC/MS/MS를 통해 유효성분으로 알려진 15종 성분에 대한 정량검사를 하기와 같이 실시하였다.

이동상 시약으로는 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade, Merck)을 사용하였고, 장비로는 Finnigan Surveyor MS pump plus and Autosampler와 Finnigan TSQ Quantum Discovery를 사용하였다. LC/MS/MS의 분석조건은 하기 표 6에 나타내었다. 표준용액으로는 표준품(Sigma)으로 1, 0.1ppm의 표준검량선 용액을 제조하여 검량선을 작성하였다.

그 결과, 에탄올 추출 프로폴리스를 수용성 프로폴리스로 가공하여도 유효성분의 함량이 크게 저하되지 않을 뿐 아니라 수용화 공정을 거치면서 농축되어 일부 유효성분의 함량이 증가하는 것을 확인하였다.

수용성 프로폴리스의 신남산(Cinnamic acid), 카페인산(Caffeic acid), 아카세틴(Acacetin), CAPE, 캠퍼롤(Kaempferol), 갈산(Gallic acid), 크리신(Chrysin), 페룰산(Ferulic acid)에 대한 정량분석 결과를 도 3a 내지 3h에 나타내었다.

< 실험예 3>

감초의 성분분석

1. 감초의 지표성분

대한약전에 표기된 감초 시험법을 활용하며 감초에 지표성분으로 알려진 글리시리진(glycyrrhizic acid)과 리퀴리티게닌(liquiritigenin)을 정량하여 지표성분으로 한다.

2. 감초 추출물의 제조

한약 건재상에서 구입한 감초 8kg에 50% 에탄올 수용액 48ℓ를 부가하여 90℃에서 4시간 동안 추출한 후, 1차 50% 에탄올 추출물을 확보하였다. 남아있는 감초에 다시 50% 에탄올 수용액 28ℓ를 부가하여 90℃에서 4시간 동안 추출한 후 2차 50% 에탄올 추출물을 확보하였다.

1차 추출물과 2차 추출물을 합한 후 27.6ℓ로 농축하였다. 그 중 300㎖를 동결건조하여 고형분 27.25g을 얻었고, 이를 감초 원물로부터 환산한 결과 감초 8kg으로부터 약 2.5kg의 추출 고형분을 얻을 수 있었다. 감초 원물대비 50% 에탄올 추출물의 수율은 31.3%로 나타났다.

3. 글리시리진산의 정량

(1) 표준용액의 조제

글리시리진산 1.2㎎을 칭량하여 1.2㎖의 70% 에탄올에 녹인 후 농도별로 희석하여 표준용액으로 사용한다. 표준용액의 조제를 하기 표 7에 나타내었다.

(2) 시험용액의 조제

상기 제조한 감초 추출물(시료) 분말을 70% 에탄올에 용해시켰다. 초음파분쇄기(Sonicator)를 이용하여 충분히 용해시킨 후 침전물은 원심분리하여 제거하였다.

(3) HPLC 분석 조건

① 칼럼 : Cosmosil C18 (i.d. 4.6×150mm)

② 주입부피(Injection volume) : 5㎕

③ 검출기 : 포토다이오드 어레이(Photo diode array) (UV 252nm)

④ 이동상 (약전에 의함) : 아세트산 수용액 (15배 희석)-아세토나이트릴 혼합액 (3:2)

⑤ 유속 : 1㎖/min

(4) 실험결과

① 정량값

하기 수학식 2에 따라 글리시리진산의 함량을 계산하였다.

시료의 정량값을 하기 표 8에 나타내었다.

② HPLC 프로파일 및 검량선 측정치

시료의 글리시리진산 관련 HPLC 프로파일 및 검량선 측정치를 도 4에 나타내었다.

3. 리퀴리틴의 정량

(1) 표준용액의 조제

리퀴리틴 10.2㎎을 칭량하여 10.2㎖의 70% 에탄올에 녹인 후 농도별로 희석하여 표준용액으로 사용한다. 표준용액의 조제를 하기 표 9에 나타내었다.

(2) 시험용액의 조제

시험용액은 상기 글리시리진산에서와 동일한 방법으로 조제하였다.

(3) HPLC 분석 조건

① 칼럼 : Cosmosil C18 (i.d. 4.6×150mm)

② 주입부피 : 5㎕

③ 검출기 : 포토다이오드 어레이 (UV 276nm)

④ 이동상 (약전에 의함) : 0.5% 아세트산 수용액 (15배 희석)-아세토나이트릴 혼합액 (8:2)

⑤ 유속 : 1㎖/min

(4) 실험결과

① 정량값

상기 수학식 2와 동일한 방식으로 리퀴리틴의 함량을 계산하였으며, 시료의 정량값을 하기 표 10에 나타내었다.

② HPLC 프로파일 및 검량선 측정치

시료의 리퀴리틴 관련 HPLC 프로파일 및 검량선 측정치를 도 5에 나타내었다.

< 실험예 4>

원산지별 프로폴리스의 혼합 비율 선정

프로폴리스에 함유되어 있는 유효성분의 종류 및 함량이 주변 환경에 따라서 달라지므로, 프로폴리스 주정 추출물 내에 함유되어 있는 유효 성분들의 함량을 LC/MS/MS를 이용하여 분석한 결과를 근거로 이들 원산지별 프로폴리스 주정 추출물을 혼합한 후 수용화과정을 거쳐 얻어진 수용액의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.

프로폴리스 주정 추출물의 혼합물은 아르헨티나와 중국산 프로폴리스 추출물의 혼합물을 기본으로 하여 국산과 브라질산 프로폴리스 추출물을 각각 첨가하였다.

1. 아르헨티나, 중국 및 한국 프로폴리스의 혼합

아르헨티나, 중국 및 한국 프로폴리스 주정 추출물을 하기 표 11의 중량비로 혼합하고, 수용화 과정을 거쳐 획득된 수용액의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.

그 결과 프로폴리스 주정 추출물을 아르헨티나산:중국산:국산 = 35:30:35의 비율로 혼합하여 수용화한 수용액에서 총 플라보노이드 함량이 0.8%로 다른 비율로 혼합된 프로폴리스 추출물의 수용액보다 높게 측정되었다.

2. 아르헨티나, 중국 및 브라질 프로폴리스의 혼합

아르헨티나, 중국 및 브라질 프로폴리스 주정 추출물을 하기 표 12의 중량비로 혼합하고, 상기 표 11과 같은 방법으로 수용화 과정을 거쳐 획득된 수용액의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.

아르헨티나산;중국산:브라질산=40:30:30의 비율로 혼합한 프로폴리스 추출물 혼합물을 수용화한 수용액의 총 플라보노이드 함량이 0.99%로 가장 높았으며 대체로 한국산이 혼합된 프로폴리스 추출물로 수용화한 수용액보다 총 플라보노이드 함량이 높게 측정되었다. 브라질산이 혼합된 주정추출물로 제조된 프로폴리스 수용액은 브라질 프로폴리스 특유의 매운 맛이 수용화된 후에도 감지되었으나 브라질산 프로폴리스 단독으로 제조된 수용액과 비교 시 매운 정도가 약하게 느껴졌다.

< 실험예 5>

프로폴리스 지표성분 및 기능성분 조사를 위한 MS 프로파일링

프로폴리스의 기능성분 및 지표성분을 분석하고 각각의 분석법을 확립하기 위해 각 기능성분에 대한 프로파일링을 진행하였다.

I. 프로폴리스 시료의 준비

1. 프로폴리스 유효성분 표준품 추출

프로폴리스 유효성분 표준품은 하기 표 13에 나타낸 바와 같은 20가지를 사용하였다. 100㎎의 표준품 샘플을 메탄올(HPLC grade)에 10㎎/㎖ 농도로 용해시키고 상온에서 2시간 동안 정치한 후 40℃ 초음파분쇄기(sonicator)에서 2시간 동안 추출하고 SpeedVac을 이용해 건조시켰다.

2. 천연프로폴리스 추출

100㎎의 천연프로폴리스를 메탄올(HPLC grade)에 10㎎/㎖ 농도로 용해시키고 상온에서 2시간 동안 정치한 후 40℃ 초음파분쇄기에서 2시간 동안 추출하고 SpeedVac을 이용해 건조시켰다. 원산지에 따른 추출수율을 하기 표 14에 나타내었다.

Ⅱ. MS 프로파일링 분석

1. 중국산 프로폴리스의 MS 프로파일링

먼저 중국산 프로폴리스의 기능성분 및 지표성분을 하기 표 15의 분석조건으로 분석하였으며, 문헌상 알려진 기능성분 표준품을 기준으로 함량을 조사하였다.

상기 공급원의 조건은 하기 표 16에 나타낸 바와 같다.

상기 방법에 의하여 분석한 중국산 프로폴리스의 MS 프로파일링 결과를 하기 표 17에 나타내었다.

< 실험예 6>

원산지별 프로폴리스 시료의 활성 확인

1. 원산지별 프로폴리스 시료의 세포독성 확인

원산지별 프로폴리스 시료들이 대식세포의 생장에 미치는 영향(독성)을 확인하기 위하여, 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 국산, 중국산, 브라질산 및 아르헨티나산 프로폴리스 추출물을 처리하고 24시간 후 MTT 분석법으로 세포독성을 확인하였다. 실험을 3회 반복하고, 결과는 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

국산 및 아르헨티나산 프로폴리스는 50㎍/㎖ 농도 이상에서는 독성을 나타내었다. 브라질산 프로폴리스는 100㎍/㎖ 농도까지는 독성을 거의 나타내지 않았으며, 중국산 프로폴리스는 50㎍/㎖ 농도까지는 독성을 거의 나타내지 않았으나 100 ㎍/㎖ 농도에서는 약한 독성을 나타내었다.

2. 원산지별 프로폴리스 시료의 NO 생성 억제활성 확인

원산지별 프로폴리스 시료가 NO 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Raw 264.7 세포를 LPS로 자극하고 농도별 프로폴리스 시료를 24시간 동안 처리한 후 생성되는 NO량을 그리스 반응분석법으로 측정하였다. 실험을 3회 반복하고, 결과는 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7의 결과에서 알 수 있듯이, 국산과 아르헨티나산 프로폴리스는 NO 생성 억제 활성을 나타내었으나 50㎍/㎖ 이상의 농도에서는 세포독성(도 6 참조)으로 인한 억제활성으로 생각되었다. 중국산과 브라질산 프로폴리스의 경우 농도의존적으로 억제활성을 나타내는 것을 확인하였다.

< 실험예 7>

프로폴리스 복합 조성물의 상승(synergy)효과 확인

1. 세포독성 확인

혼합프로폴리스와 프로폴리스 복합 조성물 시료들이 대식세포의 생장에 미치는 영향(독성)을 확인하기 위하여, 대식세포주인 Raw 264.7 세포에 시료를 처리하고 24시간 후 MTT 분석법으로 세포생존율을 확인하였다.

시료로는 (1) 혼합프로폴리스(WEEP-3　), (2) 혼합프로폴리스와 올리브잎 추출물의 혼합물, (3) 혼합프로폴리스와 감초 추출물의 혼합물, (4) 혼합프로폴리스, 올리브잎 추출물 및 감초 추출물을 혼합한 복합 조성물, (5) 올리브잎 추출물과 감초 추출물의 혼합물을 사용하였다. 이때 혼합프로폴리스는 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 브라질산 프로폴리스의 추출물을 40:30:30 의 중량비로 혼합한 것을 사용하였다. 각 혼합물과 복합 조성물의 조성과 혼합비(중량비)를 하기 표 18에 나타내었다.

실험을 3회 반복하고, 결과는 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 시료들은 모두 독성을 나타내지 않았다.

(2) NO 생성 억제활성 확인

혼합프로폴리스와 프로폴리스 복합 조성물 시료들의 NO 생성 억제활성을 확인하기 위하여, 혼합프로폴리스와 프로폴리스 복합 조성물을 LPS-처리된 RAW 264.7 세포에 농도별로 처리하고 생성되는 NO량을 측정하였다. 실험을 3회 반복하고, 결과는 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 혼합프로폴리스에 비하여 복합 조성물에서 NO 생성 억제활성이 높았다. 또한, 프로폴리스와 감초의 복합 조성물도 혼합프로폴리스에 비하여 NO 생성 억제활성이 높았다.

(3) 사이토카인 관련 유전자 억제효과 확인

혼합프로폴리스와 프로폴리스 복합 조성물 시료들의 사이토카인 관련 유전자 억제효과를 확인하기 위하여, 혼합프로폴리스와 프로폴리스 복합 조성물을 1㎍/㎖ LPS를 처리하거나 처리하지 않고 각 농도의 50% 에탄올 추출물을 24시간 동안 처리한 RAW 264.7 세포에 농도별로 처리하고 LPS 자극에 의해서 생성되는 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 mRNA 생성 정도를 정량적 RT-PCR에 의하여 측정하였다. 실험을 3회 반복하고, 결과는 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

IL-1β의 경우 50㎍/㎖ 농도에서 복합 조성물이 혼합프로폴리스보다 약 49% 억제활성을 나타내었으며, IL-6의 경우 50㎍/㎖ 농도에서 복합 조성물이 혼합프로폴리스보다 약 35% 억제활성을 나타내었다. TNF-α의 경우 복합 조성물에서 혼합프로폴리스보다 탁월한 억제활성을 나타내었다.

< 실험예 8>

알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험

알코올로 유발된 설치류의 위손상 모델에서 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과를 평가하기 위하여 다음과 같이 시험을 실시하였다.

I. 시험방법

1. 시험동물

시험동물로는 Sprague-Dawley계 래트를 사용하였으며, (주)오리엔트바이오(경기도 성남)에서 공급받아 사용하였다.

입수시 체중은 150~180g이고, 수컷 래트였다. 입수 후 1주일 동안 검역 및 순화기간을 가져 건강한 동물만 시험에 사용하였다. 투여개시시 체중범위는 180~200g이었으며, 총 82마리의 동물을 시험에 사용하였다. 온도 20±2℃, 습도 40~60%, 12시간 밤/낮 주기에서 사육하였다.

2. 알코올성 위염의 유도

래트를 24시간 절식시킨 후 무수알코올(absolute alcohol) 5㎖/kg을 위관영양법으로 투여한 후 시험물질을 각각 1시간, 12시간 뒤에 투여하였다. 알코올 투여 24시간 뒤에 부검하여 위염 병변을 비교하였다. 실험디자인의 개략도를 도 11에 나타내었다.

3. 시험군의 구성

시험군은 총 11개군(G1~G11)으로 각 그룹별로 5 또는 7마리의 동물을 사용하였다. 시험군의 구성을 하기 표 19에 나타내었다.

4. 투여용량 및 방법

알코올, 대조약물(양성대조군; 오메프라졸) 및 시험약물의 투여용량과 방법은 하기 표 20과 같다.

Ⅱ. 실험방법

1. 사망 및 임상증상 관찰

시험기간 중 1일 1회 임상증상 및 사망/빈사동물 발생여부에 대하여 개체 별로 관찰하였다. 임상증상을 보이는 개체에 한하여 기록을 유지하며(정상인 경우 기록하지 않음), 주말 및 공휴일은 오전 1회 관찰로 대신하였다. 단, 투여 당일의 경우 최소 1일 2회 관찰하였다.

2. 체중 측정

입수 시, 순화기간 중 주 1회, 군분리 시 및 시험기간 중 개체 별 체중을 측정하였다. 특히 시험기간 중 체중측정은 매 측정시 오차를 최소화하기 위하여 동일한 요일과 동일한 시간대(오후 4시 전후)에 동일한 저울을 사용하여 측정하였다.

3. 부검

알코올 투여 24시간 후에 CO₂ 마취하에서 개복한 후 복대동맥과 복대정맥을 절단하여 방혈 치사시켰다, 육안적으로 내부 장기의 이상 유무를 관찰한 후 각 장기(간, 비장, 신장)의 절대 장기중량을 측정하여 부검 전 절식된 체중에 대한 상대 장기중량 산출하였다.

4. 조직병리학적 분석

안락사후 개체 별로 위장을 적출하여 그 일부를 10 % 중성완충포르말린용액 (10% buffered neutral formalin)에 고정하였다. 고정된 조직을 일정한 두께로 삭정한 다음, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하여 4~5㎛의 조직절편을 제작한 후 일반적인 염색방법인 헤마톡실린&에오신 염색(H&E stain)을 실시하여 조직병리학적 소견 (염증세포의 침윤, 상피세포의 구조파괴, 궤양 및 출혈 등의 조직병리학적인 변화)을 관찰하였다.

5. 위손상 억제율 측정

적출한 위를 대만부를 따라 절개한후 발생된 손상길이(mm)및 손상면적(mm2)을 현미경으로 측정하여 하기 수학식 3에 따라 계산하였다. 5% 유의수준 (p<0.05) 하에서 대조군, 양성대조군 보다 유의적인 효과가 입증될 경우 유효성이 있는 것으로 판정하였다.

6. 위 조직에서 산화적 손상 측정

(1) 위 조직의 분획

위 조직의 일부를 4배의 150mM KCl을 가하여 균질기를 이용하여 균질화하였다. 균질화한 조직을 4,000rpm에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 취하여 글루타티온(GSH)을 측정하고, 나머지는 20,000rpm에서 1시간 동안 다시 원심분리한 후 상등액을 취하여 말론디알데히드(MDA)를 측정하였다.

(2) GSH

글루타티온 분석키트 (Cell Biolabs, USA)를 이용하여 축정하였으며, 405nm에서 흡광도를 측정한 후 GSH의 농도를 계산하였다.

(3) 지질과산화

TBARS 분석키트(Cell Biolabs, USA)를 이용하여 측정하였으며, 586nm에서 흡광도를 측정한 후 MDA를 계산하였다.

7. 위 조직에서 염증관련 사이토카인 측정

(1) 총 RNA의 분리 및 cDNA 합성

위 조직에 트리졸 라이시스 버퍼를 각각 1㎖씩 분주한 후 균질화하여 용해시켰다. 클로로포름 200㎕를 분주하여 20초간 뒤집어준(inverting) 후 13,200rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 이소프로판올 500㎕가 들어 있는 튜브에 옮겨 섞어주었다. 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액을 제거한 후 70% 에탄올을 각 튜브에 1㎖씩 분주하여 13,000rpm에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거하고 실온에서 건조시켰다. DEPC가 포함된 D.W.를 40㎕씩 분주하여 RNA를 녹인 후, 이 RNA 용액 1㎕를 취하여 NanoDrop 장비에서 260/280nm 흡광도를 측정하여 용액의 총 RNA 농도를 계산하였다. 추출한 RNA와 RT DriyMIX cDNA 합성 키트를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

(2) 실시간 PCR

IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 유전자 발현을 알아보기 위하여 실시간-PCR을 실시하였다. 실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 21에 나타내었다.

8. 통계처리

통계처리는 GraphPad PRISM 프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며 각 군 간의 차이를 검증하기 위하여 터키테스트(Turkey test)를 이용하여 사후분석하였다. 통계학적인 유의수준은 p < 0.5로 판정하였다.

Ⅲ. 실험 결과

1. 사망률 및 임상증상

순화기간 중 모든 동물에서는 특별한 임상증상이 관찰되지 않았으며, 시험당일 빈사동물은 없었다. 알코올을 투여한 후 1시간 이내에 G7 및 G11에서 각각 1마리씩 폐사하였다. 결과를 하기 표 22에 나타내었다.

2. 체중측정

알코올을 투여한 모든 군(G2~G11)에서 체중이 줄어드는 것을 확인할 수 있었으며 G1에 비하여 G2, G3, G4, G9, G10 및 G11군이 통계학적으로 유의적으로 체중이 감소하였다. 결과를 하기 표 23에 나타내었다.(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

3. 장기무게 측정

(1) 간무게

절식된 체중에 대한 간의 상대 장기중량을 산출한 결과 알코올을 투여한 후 간의 무게가 증가하였으며, G1과 비교하여 G2, G3, G4, G5, G6, G7, G9, G10 및 G11군이 통계학적으로 유의적으로 간무게가 증가하였다. 그러나 G2와 비교하여 G3 및 복합 조성물을 투여한 군(G4~G11)사이에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 결과를 도 12에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(2) 비장무게

절식된 체중에 대한 비장의 상대 장기중량을 산출한 결과 알코올 투여후 비장의 무게가 증가하였으나 통계학적으로 유의적인 차이를 보이는 군은 없었다. 결과를 도 13에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄).

(3) 신장무게

절식된 체중에 대한 신장의 상대 장기중량을 산출한 결과 알코올 투여후 신장의 무게가 증가하였으며, G1과 비교하여 G2, G3, G5, G6, G7, G9 및 G11군이 유의적으로 신장의 무게가 증가하였다. 그러나 G2와 비교하여 G3 및 복합 조성물을 투여한 군(G4~G11)사이에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 결과를 도 14에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다)

4. 위점막 손상

(1) 위점막의 육안적 손상

알코올은 직접적으로 위점막을 자극하고 점막하 근육층에 부종을 유발시켜 일시적인 허혈상태를 발생시킴으로써 산화적 손상으로 인한 세포의 괴사를 유발함과 동시에 위점막에 직접적인 자극을 가하여 출혈 및 궤양을 일으킨다. 알코올 투여로 유발된 위점막 손상에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과를 평가하기 위해 부검 후 육안적으로 병변을 관찰한 결과 G1은 육안적으로 이상 소견이 관찰되지 않았으나 알코올을 투여한 군(G2~G11)에서는 위점막에 굵은 띠모양으로 출혈 소견이 관찰되었다. 그러나 G2와 비교하여 G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10 및 G11에서 이러한 출혈 부위가 감소하는 것으로 나타났다. 결과를 도 15에 나타내었다.

(2) 위손상 면적

위점막의 손상길이 및 손상면적(mm2)을 측정하여 전체 위점막의 면적에 대한 상대면적을 비교한 결과, G1(정상군; 0.0±0.0 %)과 비교하여 G2(알코올투여군)에서 가장 많은 손상(20.7±1.7%)이 관찰되었으며, G2와 비교하여 G3~G11 모든 군에서 유의성있게 위점막 손상 부위가 감소하였다. 그 중 가장 위 손상 면적이 적은 군은 G10(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+감초 추출물 투여군; 6.1±0.9 %)으로 나타났다. 결과를 도 16의 A에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(3) 위손상 억제율

G2(알코올투여군; 0.0±0.0 %)와 비교하여 G3~G11 모든 군에서 유의성 있게 위점막 손상 억제율이 증가하였으며, 그 중 가장 위 손상 억제율이 좋은 군은 G10 (알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+감초 추출물 투여군; 70.7±4.6%)이었다. 결과를 도 16의 B에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

5. 조직병리학적 관찰

적출 위 조직을 H&E 염색을 통해 조직의 손상 정도를 확인하였다. G1의 경우 위 점막을 비롯한 모든 층에서 이상 소견이 관찰되지 않았으나, G2는 위 점막층 (mucosa)의 탈락과 함께 괴사(necrosis)와 출혈(hemorrhage)이 관찰되었고 일부 벽세포(HCL-secreting cells; parietal cells)와 주세포(pepsinogen-secreting cells; chief cells)의 손상이 확인되었다. 또한 점막 및 점막하층(submucosa)에서 대식구(macrophages), 호중구(neutrophils) 등의 염증세포의 침윤이 관찰되었다. 하지만 이러한 위점막의 손상이 G3~G11 모든 군에서 감소하였으며, 특히 육안적인 소견과 마찬가지로 G10(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+감초 추출물 투여군)에서 위점막의 손상이 가장 적게 나타났다. 결과를 도 17에 나타내었다.

6. 위 조직의 산화적 손상

(1) MDA

지질과 산화물은 ROS나 자유라디칼 등의 산화스트레스에 의하여 조직 내 인지질 세포막의 수소 원자가 제거되어 조직이 손상되며 생기는 것으로 지질과산화 생성물은 세포막의 투과성을 증가시켜 체액의 손실 및 단백질 변화를 유발한다. 위 손상의 지표로 간 조직의 지질과산화 생성물인 MDA를 측정하여 알코올로 인한 위 조직 손상에 대하여 복합 조성물의 치료 효과를 측정하였다. G1 (정상군; 1.2±0.6μmol/㎎ 단백질)군과 비교하여 G2 (알코올투여군; 11.7±1.8μmol/㎎ 단백질)에서 위 조직의 MDA가 유의적으로 증가하였으며, G2와 비교하여 G3, G4, G6, G7, G8, G9 및 G10에서 MDA 수치가 유의적으로 감소하였다. 특히 G6 (알코올/감초 추출물 투여군; 2.7±0.8μmol/㎎ 단백질), G8(알코올/프로폴리스+감초 추출물 투여군; 2.5±0.8μmol/㎎ 단백질) 및 G10(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+감초 추출물 투여군; 2.9±0.9μmol/㎎ 단백질)에서 가장 낮은 MDA의 수치가 측정되었다. 결과를 도 18의 A에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(2) GSH

GSH는 자유 라디칼이나 과산화물에 의해 유발된 산화 스트레스에 의한 손상을 막아주는 생체 내 항산화물질 중에 하나이다. 본 실험에서는 G1(정상군; 1.2±0.6μmol/㎎ 단백질)군과 비교하여 G2 (알코올투여군; 17.0±2.4μmol/㎎ 단백질)에서 위 조직의 GSH가 유의적으로 감소하였다. 그러나 G2와 비교하여 G3(양성대조군) 및 복합 조성물을 투여한 군(G4~G11)사이에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다, 결과를 도 18의 B에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

7. 염증성 사이토카인의 발현

(1) IL-6

알코올 투여로 인한 위의 염증반응과 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과를 평가하기 위해 위 조직에서 IL-6 수준을 측정하였다. G1(정상군; 1.0배)군과 비교하여 G2(알코올투여군; 7.4배)에서 IL-6의 발현이 유의적으로 증가하였으며, G2와 비교하여 G3(양성대조군, 알코올/오메프라졸; 1.1배), G6(알코올/감초 추출물 투여군; 1.1배), G8(알코올/프로폴리스+감초 추출물 투여군; 1.3배) 및 G10(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+ 감초 추출물 투여군; 0.6배)에서 IL-6의 발현이 유의적으로 감소하였다. 특히 G10에서 가장 낮은 IL-6의 발현이 관찰되었다. 결과를 도 19의 A에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(2) IL-1β

G1(정상군; 1.0배)과 비교하여 G2(알코올투여군; 77.0배)에서 IL-1β의 발현이 유의적으로 증가하였으며, G2와 비교하여 G3(양성대조군, 알코올/오메프라졸; 11.9배), G6(알코올/감초 추출물 투여군; 8.8배), G7(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물 투여군; 13.3배), G8(알코올/프로폴리스+감초 추출물 투여군; 7.6배) 및 G10(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+감초 추출물 투여군; 8.1배)에서 IL-1β의 발현의 감소가 관찰되었다. 결과를 도 19의 B에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(3) TNF-α

G1(정상군; 1.0배)과 비교하여 G2(알코올투여군; 77.0배)에서 TNF-α의 발현이 유의적으로 증가하였으며, G3~G11군 모두에서 G2와 비교하여 TNF-α 발현의 유의적인 감소가 관찰되었다. 결과를 도 19의 C에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

8. 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과 종합 검토

알코올 투여후 손상된 위점막에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과를 조사하기 위해 육안적 소견, 병리조직학적 소견, 산화스트레스 분석 및 전염증성 사이토카인의 발현 분석을 실시하여 종합적으로 비교 검토하였다. 결과를 하기 표 24에 나타내었다.

상기 표 24에서 보는 바와 같이 프로폴리스 단독은 종합적으로 항궤양, 항산화 및 항염증 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 프로폴리스에 항산화 및 항염증 효과가 우수한 감초 추출물을 혼합한 경우 프로폴리스 단독보다 항산화 및 항염증 효과가 더 증가하였으며, 프로폴리스 및 감초 추출물에 올리브잎 추출물을 더 혼합한 경우 TNF-α를 제외한 모든 검사 항목에서 가장 우수한 효과를 나타내었다. 하지만 프로폴리스, 올리브잎 추출물 및 감초 추출물의 1/2 혼합물은 항염증 효과가 우수한 것으로 나타났으나 프로폴리스, 올리브잎 추출물 및 감초 추출물 혼합물과 비교하여 그 효과가 더 낮게 나타났다.

< 실험예 9>

알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과시험

알코올로 유발된 설치류의 위손상 모델에서 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과를 평가하기 위하여 다음과 같이 시험을 실시하였다.

I. 시험방법

1. 시험동물

시험동물로는 Sprague-Dawley계 래트를 사용하였으며, (주)오리엔트바이오(경기도 성남시)에서 공급받아 사용하였다.

입수시 체중은 150~180g이고, 수컷 래트였다. 입수 후 1주일 동안 검역 및 순화기간을 가져 건강한 동물만 시험에 사용하였다. 투여개시시 체중범위는 180~200g이었으며, 총 75마리의 동물을 시험에 사용하였다. 온도 20±2℃, 습도 40~60%, 12시간 밤/낮 주기에서 사육하였다.

2. 알코올성 위염의 유도

래트를 24시간 절식시킨 후 무수알코올(absolute alcohol) 5㎖/kg을 위관영양법으로 투여한 후 시험물질을 각각 1시간, 12시간 뒤에 투여하였다. 알코올 투여 24시간 뒤에 부검하여 위염 병변을 비교하였다. 실험디자인의 개략도를 도 20에 나타내었다.

3. 시험군의 구성

시험군은 총 11개군(G1~G11)으로 각 그룹별로 5 또는 7마리의 동물을 사용하였다. 시험군의 구성을 하기 표 25에 나타내었다.

4. 투여용량 및 방법

알코올, 대조약물(양성대조군; 오메프라졸) 및 시험약물의 투여용량과 방법은 하기 표 26와 같다.

Ⅱ. 실험방법

1. 사망 및 임상증상 관찰

시험기간 중 1일 1회 임상증상 및 사망/빈사동물 발생여부에 대하여 개체 별로 관찰하였다. 임상증상을 보이는 개체에 한하여 기록을 유지하며(정상인 경우 기록하지 않음), 주말 및 공휴일은 오전 1회 관찰로 대신하였다. 단, 투여 당일의 경우 최소 1일 2회 관찰하였다.

2. 체중 측정

입수 시, 순화기간 중 주 1회, 군분리 시 및 시험기간 중 개체 별 체중을 측정하였다. 특히 시험기간 중 체중측정은 매 측정시 오차를 최소화하기 위하여 동일한 요일과 동일한 시간대(오후 4시 전후)에 동일한 저울을 사용하여 측정하였다.

3. 부검

알코올 투여 24시간 후에 CO₂ 마취하에서 개복한 후 복대동맥과 복대정맥을 절단하여 방혈 치사시켰다, 육안적으로 내부 장기의 이상 유무를 관찰한 후 각 장기(간, 비장, 신장)의 절대 장기중량을 측정하여 부검 전 절식된 체중에 대한 상대 장기중량 산출하였다.

4. 조직병리학적 분석

안락사후 개체 별로 위장을 적출하여 그 일부를 10 % 중성완충포르말린용액 (10% buffered neutral formalin)에 고정하였다. 고정된 조직을 일정한 두께로 삭정한 다음, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하여 4~5㎛의 조직절편을 제작한 후 일반적인 염색방법인 헤마톡실린&에오신 염색(H&E stain)을 실시하여 조직병리학적 소견 (염증세포의 침윤, 상피세포의 구조파괴, 궤양 및 출혈 등의 조직병리학적인 변화)을 관찰하였다.

5. 위손상 억제율 측정

적출한 위를 대만부를 따라 절개한후 발생된 손상길이(mm)및 손상면적(mm2)을 현미경으로 측정하고 상기 수학식 2에 따라 계산하였다. 5% 유의수준 (p<0.05) 하에서 대조군, 양성대조군 보다 유의적인 효과가 입증될 경우 유효성이 있는 것으로 판정하였다.

6. 위 조직에서 산화적 손상 측정

(1) 위 조직의 분획

위 조직의 일부를 4배의 150mM KCl을 가하여 균질기를 이용하여 균질화하였다. 균질화한 조직을 4,000rpm에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 취하여 글루타티온(GSH)을 측정하고, 나머지는 20,000rpm에서 1시간 동안 다시 원심분리한 후 상등액을 취하여 말론디알데히드(MDA)를 측정하였다.

(2) GSH

글루타티온 분석키트 (Cell Biolabs, USA)를 이용하여 측정하였으며, 405nm에서 흡광도를 측정한 후 GSH의 농도를 계산하였다.

(3) 지질과산화

TBARS 분석키트(Cell Biolabs, USA)를 이용하여 측정하였으며, 586nm에서 흡광도를 측정한 후 MDA를 계산하였다.

7. 통계처리

통계처리는 GraphPad PRISM 프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며 각 군 간의 차이를 검증하기 위하여 터키테스트(urkey test)를 이용하여 사후분석하였다. 통계학적인 유의수준은 p < 0.5로 판정하였다.

Ⅲ. 실험 결과

1. 사망률 및 임상증상

순화기간 중 모든 동물에서는 특별한 임상증상이 관찰되지 않았으며, 시험당일 빈사동물은 없었다. 또한 시험물질(7일) 및 알코올을 투여한 후 부검을 실시할 때까지 폐사한 동물은 없었다.

2. 체중측정

시험물질을 일주일 동안 투여하는 동안 G1과 비교하여 모든 군(G2~G11)군에서 유의적인 체중 차이는 관찰되지 않았다. 결과를 도 21에 나타내었다.

3. 장기무게 측정

절식된 체중에 대한 간의 상대 장기중량을 산출한 결과 G1과 비교하여 모든 군(G2~G11)에서 통계학적으로 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한 절식된 체중에 대한 비장 및 신장의 상대 장기중량도 유의적인 차이를 보이지 않았다. 결과를 도 22에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄).

4. 위점막 손상

(1) 위점막의 육안적 손상

알코올 투여로 유발된 위점막 손상에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과를 평가하기 위해 부검 후 육안적으로 병변을 관찰한 결과 G1은 육안적으로 이상 소견이 관찰되지 않았으나 알코올을 투여한 군(G2~G11)에서는 위점막에 굵은 띠모양으로 출혈 소견이 관찰되었다. 그러나 G2와 비교하여 G3, G6, G10 및 G11에서 이러한 출혈 부위가 감소하는 것으로 나타났다. 결과를 도 23에 나타내었다.

(2) 위손상 면적

위점막의 손상길이 및 손상면적(mm2)을 측정하여 전체 위점막의 면적에 대한 상대면적을 비교한 결과, G1(정상군; 0.0±0.0 %)과 비교하여 G2(알코올투여군)에서 가장 많은 손상(17.3±2.0%)이 관찰되었으며, G2와 비교하여 G3, G6, G10에서는 이러한 출혈부위가 유의적으로 감소하였다. 결과를 도 24의 A에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(3) 위손상 억제율

G2(알코올투여군; 0.0±0.0 %)와 비교하여 G3, G6, G10 및 G11에서 유의성 있게 위손상 억제율이 증가하였다. 결과를 도 24의 B에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

5. 조직병리학적 관찰

적출 위 조직을 H&E 염색을 통해 조직의 손상 정도를 확인하였다. G1의 경우 위 점막을 비롯한 모든 층에서 이상 소견이 관찰되지 않았으나, G2는 위 점막층 의 탈락과 함께 괴사와 출혈이 관찰되었고 일부 벽세포와 주세포의 손상 및 위축이 확인되었다. 또한 점막 및 점막하층에서 대식구, 호중구 등의 염증세포의 침윤이 소수 관찰되었다. 하지만 이러한 위점막의 손상이 G3~G11 모든 군에서 감소하였으며, 특히 육안적인 소견과 마찬가지로 G6(알코올/감초 추출물 투여군) 및 G10(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+감초 추출물 투여군)에서 가장 낮게 나타났다. 결과를 도 25에 나타내었다.

6. 위 조직의 산화적 손상

(1) MDA

위 손상의 지표로 간 조직의 지질과산화 생성물인 MDA를 측정하여 알코올로 인한 위 조직 손상에 대하여 복합 조성물의 치료 효과를 측정하였다. G1(정상군; 20.0±2.9μmol/㎎ 단백질)군과 비교하여 G2(알코올투여군; 55.3±12.3μmol/㎎ 단백질)에서 위 조직의 MDA가 증가하였으며, G2와 비교하여 G3~G11에서 모두 MDA 수치가 유의적으로 감소하였다. 특히 G10(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+감초 추출물 투여군; 13.0±2.1μmol/㎎ 단백질) 및 G11(알코올/프로폴리스+올리브잎 추출물+감초 추출물 1/2 복합 조성물 투여군; 8.1±1.1μmol/㎎ 단백질)에서 가장 낮은 MDA의 수치가 측정되었다. 결과를 도 26의 A에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(2) GSH

G1(정상군; 1.2±0.6μmol/㎎ 단백질)군과 비교하여 G2(알코올투여군; 17.0±2.4μmol/㎎ 단백질)에서 위 조직의 GSH가 유의적으로 감소하였으나 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 또한 G2와 비교하여 G3(양성대조군) 및 복합 조성물을 투여한 군(G4~G11)사이에는 통계학적인 차이가 없었다. 결과를 도 26의 B에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

7. 알코올성 위염에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과 종합 검토

알코올 투여후 손상된 위점막에 대한 프로폴리스 복합 조성물의 치료 효과를 조사하기 위해 육안적 소견, 병리조직학적 소견 및 산화스트레스 분석을 실시하여 종합적으로 비교 검토하였다. 결과를 하기 표 27에 나타내었다.

상기 표 27에서 보는 바와 같이 프로폴리스 단독으로도 항궤양 및 항산화효과를 보였다. 그러나 프로폴리스에 올리브잎 추출물과 감초 추출물을 혼합한 경우 프로폴리스 단독보다 항산화 및 항염증 효과가 더 증가하였으며, 각각의 물질을 단독으로 사용하였을 때보다 모든 검사 항목에서 가장 우수한 효과를 나타내었다. 하지만 프로폴리스, 올리브잎 추출물 및 감초 추출물의 1/2 혼합물은 프로폴리스, 올리브잎 추출물 및 감초 추출물 혼합물과 비교하여 그 효과가 더 낮게 나타났다.

< 실험예 10>

항헬리코박터 파일로리 활성 확인

I. 실험의 준비

1. 시료의 준비

(1) 프로폴리스 시료의 준비

프로폴리스 시료로는 한국산(D), 브라질산(B), 중국산(C) 및 아르헨티나산(A) 프로폴리스의 50% 에탄올 추출물을 사용하였다.

(2) 천연물 시료의 준비

천연물시료로 하기 표 28에 나타낸 약초(Herbs)를 실험에 사용하였다. 각 재료는 이물질을 제거하고 세척한 후 음건하여 실험재료로 사용하였다.

50% 에탄올을 시료 중량의 5배 양을 가하여 100℃에서 4시간 동안 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 얻어진 추출물들은 원심분리, 여과, 농축 및 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 실험에 사용하였다. 각 시료의 수득율을 하기 표 29에 나타내었다.

2. 헬리코박터 파일로리 균주의 배양

실험에는 4종의 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 사용하였으며, 실험에 사용된 헬리코박터 파일로리 균주의 종류를 하기 표 30에 나타내었다. 헬리코박터 파일로리의 전 배양 및 본 배양을 위한 액체 배지로는 브루셀라 브로스(Brucella broth, BD, USA)에 10% 신생송아지혈청(New Born Calf serum)을 추가하여 사용했고, 고체 배지로는 브루셀라 브로스(BD, USA)에 10% 신생송아지혈청과 박토-아가(Bacto-agar, BD, USA)를 첨가하여 사용하였다. 배양조건은 10% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 37℃로 배양하였다.

Ⅱ. 실험방법

1. 디스크 확산 분석법(Disc diffusion assay)

항균력은 페이퍼 디스크 아가확산(paper disc agar diffusion)법으로 측정하였다. 즉, 평판 배지에 배양된 각 균주를 1백금이 취해서 액체배지 10㎖에서 18~24시간 동안 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체배지 10㎖에 균액을 0.1㎖ 접종하여 3~6시간 동안 본배양하였다. 본배양 후 평판배지 1개당 균수가 약 1×107cells이 되도록 접종하여 멸균면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 필터페이퍼 디스크(filter paper disc, 8mm, Whatman, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 0.5㎎/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시켜 37℃에서 72시간 동안 배양하고 디스크 주위의 클리어존(clear zone)(mm)의 직경을 측정하였다.

2. 최소억제농도 분석법(MIC assay)

MIC(minimum inhibitory concentrations)는 항생물질의 항균력 또는 발육저지력을 나타낼 때 사용되는 단위로서, 특정 미생물에 대해 발육저지력을 지니는 대상물질의 최소농도(㎎/ℓ)를 말한다. 이 농도값 이상에서 해당 미생물은 발육하지 않고 일정한 수를 나타낸다.

헬리코박터 파일로리에 대한 최소저지농도를 측정하기 위하여, 각 시료를 1㎎/㎖ 농도로 함유하도록 배지로 계열희석한 다음 균체를 O.D.600=0.1 농도로 접종하고 미호기적 조건에서 16시간 동안 배양하면서 반응시켰다. 반응 후 PBS로 10-3이 되도록 희석하여 플레이트에 로딩(loading)하고 미호기적 조건에서 3일 동안 배양한 후 형성된 콜로니 수를 세었다.

또는 시료 처리 후 유레아 브로스(urea broth)를 동량 넣고 10% CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 반응시킨 후 560nm 분광광도계(spectrophotometer)로 생균수를 간접적으로 측정하였다.

3. 요소분해효소 활성(Urease activity) 측정

헬리코박터 파일로리의 병원성 기작은 아직 완전히 밝혀져 있지 않지만 위 내에 존재하는 헬리코박터 파일로리는 강력한 요소분해효소를 생산하는 능력이 있어 이를 이용하여 위 내 요소(urea)를 분해하여 생기는 암모니아(ammonia)가 위의 pH를 중화시키면서 위에서 생존할 수 있다고 밝혀져 있다. 현재 헬리코박터 파일로리의 항균력을 측정하는 방법으로 가장 많이 사용되고 있는 요소분해효소 활성 측정은 요소분해효소 활성도의 측정이 용이하고 헬리코박터 파일로리 생균수 측정과의 상관관계도 매우 높은 것으로 확인되어 요소분해효소 활성도를 전반적인 항균작용의 분석법으로 채택하였다.

요소분해효소 활성 억제능을 측정하기 위해 헬리코박터 파일로리를 배양하여 세포만 분리한 후 초음파분쇄기(sonicator)로 파쇄하여 12,000rpm, 4℃, 30분 동안 초고속원심분리를 하여 상등액만 취하여 총단백질(total protein)을 얻었다. 시료 5㎎/㎖와 총단백질 50㎕를 유레아 브로스 100㎕와 혼합하여 반응시켰다. 유레아의 분해에 따른 페놀-레드(phenol-red)의 색상강도(color intensity)의 변화를 분광광도계(TECAN, USA)를 이용하여 560nm에서 측정하였다.

Ⅲ. 실험결과

1. 원산지별 프로폴리스 시료의 항헬리코박터 파일로리효과 확인

원산지별 프로폴리스 시료의 항헬리코박터 효과를 디스크 확산분석법으로 측정한 결과를 하기 표 31과 도 27에 나타내었다. 균주별로 약간 상이한 결과를 보이기는 하지만 평균적으로 프로폴리스 A, C, D, B 순으로 높은 효과를 보였다. 특히 A와 C의 프로폴리스 시료의 효과가 더 우수하였다.

2. 혼합프로폴리스와 천연물 추출물의 항헬리코박터 파일로리 효과 확인

혼합프로폴리스(WEEP-3), 비자열매, 감초 및 올리브잎의 50% 에탄올 추출물의 헬리코박터 생육 저해 활성을 디스크 확산분석법으로 측정하였다. 이때 혼합프로폴리스는 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 브라질산 프로폴리스의 추출물을 40:30:30 의 중량비로 혼합한 것을 사용하였다. 그 결과를 하기 표 32와 도 28에 나타내었다.

표 32와 도 28의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 각 시료의 항 헬리코박터 효과를 측정한 결과, 혼합프로폴리스(WEEP-3), 감초 추출물, 올리브잎 추출물의 순으로 높은 효과를 보였다. 특히 혼합프로폴리스(WEEP-3)에서 높은 항 헬리코박터 효능을 보이는 것을 확인하였다.

3. 원산지별 프로폴리스 시료의 요소분해효소 활성 확인

원산지별 프로폴리스 시료의 요소분해효소 활성 저해능을 확인하고 그 결과를 하기 표 33와 도 29에 나타내었다. 원산지별 프로폴리스 시료의 요소분해 활성 저해도는 B, D, A, C 순으로 나타났다. 이러한 결과는 상기 디스크 확산시험과는 조금 다른 결과인데, 이는 프로폴리스 내의 주요물질이 요소분해효소의 활성에 영향을 주어 항헬리코박터 파일로리의 활성을 보이나, 이 외의 다른 메카니즘에도 영향을 주기 때문으로 보인다.

4. 혼합프로폴리스 및 천연물 추출물 시료의 요소분해효소 활성 확인

감초 및 올리브잎 추출물의 50% 에탄올 추출 시료와, 혼합프로폴리스(WEEP-3)의 요소분해효소 활성 저해능을 확인하고 그 결과를 하기 표 34과 도 30에 나타내었다.

올리브잎 추출물의 경우 저해능이 0%로 대조구와 비교해 전혀 차이를 보이지 않았다. 그러나 감초 추출물, 혼합프로폴리스(WEEP-3)는 50% 이상의 저해능을 확인할 수 있었고, 비자열매에서도 미미한 요소분해효소 활성 저해를 확인할 수 있었다.

< 실험예 11>

프로폴리스 복합물의 효과 확인

1. 시료의 준비

시료로는 (1) 혼합프로폴리스(WEEP-3　)+ 올리브잎 추출물, (2) 혼합프로폴리스 + 감초 추출물, (4) 복합물(혼합프로폴리스+ 올리브잎 추출물+ 감초 추출물)을 사용하였다. 이때 혼합프로폴리스는 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 브라질산 프로폴리스의 추출물을 40:30:30의 중량비로 혼합한 것을 사용하였다. 각 혼합물과 복합물의 조성과 혼합비를 하기 표 35에 나타내었다.

2. 항헬리코박터 파일로리 효과 확인

상기 시료의 헬리코박터 생육 저해 활성을 디스크 확산분석법으로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 36, 및 도 31에 나타내었다.

복합물은 혼합프로폴리스보다 높은 효과를 나타내었으며, 2가지 혼합물도 혼합프로폴리스보다 높은 효과를 나타내었다.

2. 항균력 확인

상기 시료의 항균력을 MIC 분석법으로 측정하였다. 그 결과를 도 32와 33에 나타내었다.

도 32에서 알 수 있듯이, 단일 물질 MIC100은 프로폴리스에서 50~60ug/㎖, 감초는 225~250ug/㎖를 나타내었다. 그러나 올리브잎 추출물의 경우 10㎎/㎖까지도 생육저해농도를 찾을 수가 없었다(data not shown). 혼합프로폴리스와 복합물의 차이를 확인하고자, MIC50을 찾기 위하여 농도를 더 세분화하여 결과를 도 33에 나타내었다. 모든 균주에서 복합물이 혼합프로폴리스보다 더 높은 효과를 보는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 12>

각 시료별 유효성분의 항헬리코박터 효과 확인

프로폴리스, 감초 및 올리브잎 추출물의 어떤 성분이 항헬리코박터 효능을 가지고 있는지 확인하기 위하여 하기 표 37에 나타낸 바와 같은 주요성분을 선별하고, 이를 이용하여 항헬리코박터 실험을 진행하였다.

1. 디스크 확산분석법에 의한 항헬리코박터 효과 확인

디스크 확산분석법에 의하여 상기 성분들의 항헬리코박터 효과를 확인하였고, 그 결과를 도 34에 나타내었다. 도 34에서 알 수 있듯이, 다양한 성분들이 항헬리코박터 효과를 보였으며, 특히 플라본과 플라바논, CAPE, 신남산에서 더 큰 클리어존이 나타난 것을 확인할 수 있었다.

2. 요소분해효소 활성 측정

상기 성분들을 이용하여 요소분해효소 활성을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 38과 도 35에 나타내었다.

상기 표 38의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 대상균주에 따라 그 저해도가 다소 다르게 나타났으나, 전반적으로 CAPE, 아세카틴, 리코칼콜 A, 포르모노네틴 등이 높은 요소분해효소 활성 저해도를 보였다.

< 실험예 13>

항 헬리코박터 파일로리 동물 실험 (예비 실험)

헬리코박터 파일로리로 유발된 마우스의 위염 모델에서 혼합프로폴리스, 올리브잎 추출물, 감초 추출물 및 프로폴리스 복합물의 항 헬리코박터 효과를 검정하기 위하여, 헬리코박터 파일로리 위부착 억제 효과와 위 보호 효과를 다음과 같이 평가하였다.

I. 시험방법

1. 시험물질과 시험동물

시험물질로는 프로폴리스 복합물을 사용하였고, 시험동물은 5주령 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다.

2. 헬리코박터 파일로리에 의한 위염모델

헬리코박터 파일로리에 의한 위염모델을 얻기 위하여, C57BL/6 마우스에 헬리코박터 파일로리를 1×10⁹cfu/㎖로 준비하여 마우스 한 마리당 0.3㎖씩 위관영양법(oral gavage)으로 일주일간 격일로 3번 접종하여 감염시킨 후 3주 동안 관찰하였다. 이때 헬리코박터 파일로리는 아주대학교 의과대학에서 분양받은 시드니 균주(Sydney Strain) (SS1, cagA+/vacA+)을 마우스에 적응(adaptation)시켜 사용하였다.

3. 시험군 구성 및 투여용량 설정

시험군 구성 및 투여용량은 하기 표 39와 같이 구성하였다.

4. 투여부위 및 투여방법

경구투여하였으며, 투여직전 체중을 근거로 개체별 투여량을 환산하였다.

5. 투여횟수

헬리코박터 파일로리를 감염시키는 모델에서 3주 동안 1회/일 시험물질을 투여하였다.

6. 검사항목

① 프로폴리스 복합물의 안전성 평가

② 육안 및 현미경적 관찰

③ 헬리코박터 파일로리 위부착력 (H.pylori colonization)

Ⅱ. 시험결과

1. 프로폴리스 복합물의 안전성 평가

(1) 사망률 및 임상증상

시험기간 동안 모든 동물에서는 특별한 임상증상이 관찰되지 않았다. 사망 동물은 없었으며 시험당일 빈사동물도 없었다.

(2) 체중측정

총 4주의 사육기간 중 각 군의 체중 증가는 모든 군에서 정상적인 성장곡선을 보여주었고 통계적인 체중차이는 나타나지 않았다.

(3) 혈청학적 검사

프로폴리스 복합물의 안전성을 평가하기 위해 혈청내의 ALT 및 AST를 측정하였고, 그 결과를 도 36에 나타내었다. 아무것도 처치하지 않은 G1군(무처리대조군)과 헬리코박터 파일로리를 투여한 G2군을 비교한 결과 ALT 및 AST의 수치에 유의적인 차이가 없었다. 또한 G1군과 비교하여 G3군(양성대조군), G4군(프로폴리스 투여군), G5군(프로폴리스/올리브잎 혼합물), G6군(프로폴리스 복합물)에서도 유의적인 차이가 없었다.

(4) 조직학적 검사

마우스를 CO₂ 안락사시키고 개체별로 간, 폐, 비장, 신장을 적출하여 10 % 중성완충포르말린용액(10% buffered neutral formalin)으로 고정하였다. 고정된 조직을 일정한 두께로 삭정한 다음, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하여 4~5㎛의 조직절편을 제작한 후 일반적인 염색방법인 헤마톡실린&에오신염색(Hematoxylin & Eosin stain, H&E stain)을 실시하였다. 염색한 조직을 현미경적으로 관찰한 결과 모든 군에서 특별한 조직 병변이 관찰되지 않았다(도 37).

2. 육안 및 현미경적 관찰

(1) 육안 관찰

헬리코박터 파일로리 및 시험물질을 투여한 3주 후에 마우스를 희생시킨 후 위 조직을 적출하여 형태학적 변화를 관찰하였으며, 그 결과를 도 38에 나타내었다. 도 38에서 알 수 있듯이, 모든 군에서 특별한 조직 병변이 관찰되지 않았다.

(2) 현미경적 관찰

위장을 적출하여 그 일부를 10% 중성완충포르말린용액으로 고정한 후 H&E 염색을 실시하여 조직병리학적 소견(염증세포의 침윤, 상피세포의 구조파괴 등의 조직병리학적인 변화)을 관찰하였으며, 그 결과를 도 39에 나타내었다.

도 39에서 알 수 있듯이, 헬리코박터 파일로리 감염 3주 후에 마우스의 위를 관찰한 결과 G2, G3, G4군에서 약간의 염증 세포의 침윤이 관칠 되었으나, 이외 특별한 조직 병변이 관찰되지 않았다.

3. 헬리코박터 파일로리의 위부착력(H. pylori colonization)

헬리코박터 파일로리 감염이 위장 질환을 유발하는 기전은 헬리코박터 파일로리가 위의 점액층을 투과하여 위 점막층에 부착함으로써(colonization) 증식하여 염증을 일으키고 이때 염증세포에서 생산되는 염증 매개물질이 질병을 일으키는 것이다. 프로폴리스 및 프로폴리스 복합물이 이러한 헬리코박터 파일로리의 위부착력에 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위해 위 점막에 부착되어 있는 헬리코박터 파일로리 양을 측정하였다. 각각의 마우스에서 위를 떼어내어 DNA을 추출한 후 헬리코박터 파일로리의 16s DNA에 대해 실시간(real-time) PCR을 실시하여 헬리코박터 파일로리를 정량하였다. 그 결과를 도 40에 나타내었다.

그 결과 헬리코박터 파일로리를 투여한 G2군과 비교하여 G3 및 G4군에서 헬리코박터 파일로리 감염수가 약간 감소하였으나 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 하지만 G5 및 G6군에서는 헬리코박터 파일로리가 전혀 검출되지 않았다.

4. 프로폴리스 복합물의 항 헬리코박터 효력시험 종합 검토

헬리코박터 파일로리로 유발된 마우스의 위염 모델에서 프로폴리스 복합물의 헬리코박터 파일로리 위부착 억제 효과와 위 보호 효과를 평가한 결과, 프로폴리스를 단독으로 투여한 군(G4)에서는 약물을 처리하지 않고 헬리코박터 파일로리만 감염시킨 군(G2)과 유의적인 차이가 관찰되지 않았으나 치료제로 사용하고 있는 오메프라졸(G3)과 비슷한 효과가 나타났다. 또한 프로폴리스와 올리브잎의 혼합물을 투여한 군(G5)과 프로폴리스 복합물을 투여한 군(G6)에서는 헬리코박터 파일로리가 전혀 검출되지 않았다. 이러한 결과는 프로폴리스 자체에 기존 치료제와 비슷한 위 보호 효과가 있음을 나타내며, 프로폴리스 복합물의 경우 기존 치료제와 프로폴리스보다 더 우수한 위 보호 효과가 있음을 나타낸다.

< 실험예 14>

항 헬리코박터 파일로리 동물 실험

헬리코박터 파일로리로 유발된 마우스의 위염 모델에서 프로폴리스 복합물의 헬리코박터 파일로리 위부착 억제 효과와 위 보호 효과를 다음과 같이 평가하였다.

I. 시험방법

1. 시험동물

시험동물로는 C57BL 마우스를 사용하였으며, 헬리코박터가 감염되지 않은 청정마우스를 한국생명공학연구원에서 공급받아 사용하였다.

입수 시 체중은 9~14g이고, 4주령 수컷 마우스였다. 입수 후 1주일 동안 검역 및 순화기간을 가져 건강한 동물만 시험에 사용하였다. 투여개시시 5주령이었고, 체중범위는 10~15g이었으며, 총 120마리의 동물을 시험에 사용하였다. 온도 20±2℃, 습도 40~60%, 12시간 밤/낮 주기에서 사육하였다.

2. 시험군의 구성

시험군은 총 11 군으로 각 그룹별로 10마리의 동물을 사용하였으며, 시험군의 구성은 하기 표 40에 나타내었다.

3. 헬리코박터 파일로리에 의한 위염 유발

마우스를 24시간 절식시킨 후 헬리코박터 파일로리를 위관영양법으로 투여하였다.

헬리코박터 파일로리는 마우스에 감염율이 높은 시드니 균주(Sydney Strain) (SS1, cagA+/vacA+)를 아주대학교 의과대학에서 분양받아 사용하였다.

C57BL/6 마우스에 헬리코박터 파일로리를 1×10⁹cfu/㎖로 준비하여 마우스 한 마리당 0.2㎖씩 위관영양법으로 일주일간 격일로 3번 접종하여 감염시킨 후 8주 동안 관찰하였다. 정상대조군은 PBS를 경구투여하였다. 8주 뒤에 부검하여 위의 병변을 비교하였다. 실험디자인의 개략도를 도 41에 나타내었다.

4. 시험물질의 투여 방법

대조약물로는 오메프라졸 또는 오메프라졸+아목시실린+클래리트로마이신을 사용하였다. 오메프라졸은 프로톤 펌프 억제제(proton pump inhibitor, PPI)로서, 위산분비의 가장 마지막 단계인 수소이온펌프를 저해하여 위산분비를 강력하게 차단하여 헬리코박터 파일로리의 성장을 저해하는 것으로 알려져 있다. 2009년 대한소화기학회의 헬리코박터 파일로리 감염의 진단 및 치료 가이드라인에 따르면 세균치료로서 PPI(오메프라졸 등. 표준투여량 1일 2회)＋아목시실린(1g, 1일 2회)＋클래리트로마이신(500㎎, 1일 2회)의 표준 삼제요법을 1-2주간 복용하도록 권장하고 있다. 본 실험에서는 마우스의 체중을 고려하여 Sander et al 등의 방법에 따라 투여하였다.

시험시료와 대조약물의 투여용량, 방법 및 횟수는 하기 표 41에 나타낸 바와 같다.

주¹⁾ 단위: ㎎/kg/day. 복합한 소재별 각각에 대한 투여 용량의 합으로 표기하였음.

Ⅱ. 실험방법

1. 사망 및 임상증상 관찰

시험기간 중 1일 1회 임상증상 및 사망/빈사동물 발생여부에 대하여 개체 별로 관찰하였다. 임상증상을 보이는 개체에 한하여 기록을 유지하며 (정상인 경우 기록하지 않음), 주말 및 공휴일은 오전 1회 관찰로 대신하였다. 단, 투여 당일의 경우 최소 1일 2회 관찰하였다.

2. 체중 측정

입수 시, 순화기간 중 주 1회, 군분리 시 및 시험기간 중 개체 별 체중을 측정하였다. 특히 시험기간 중 체중측정은 매 측정시 오차를 최소화하기 위하여 동일한 요일과 동일한 시간대 (오후 4시 전후)에 동일한 저울을 사용하여 측정하였다.

3. 부검

헬리코박터 파일로리 마지막 감염 8주 후에 CO₂ 마취하에서 개복한 후 복대동맥과 복대정맥을 절단하여 방혈 치사시켰다. 육안적으로 내부 장기의 이상 유무를 관찰한 후 각 장기(간, 비장, 신장)의 절대 장기중량을 측정하여 부검 전 절식된 체중에 대한 상대 장기중량을 산출하였다.

4. 조직병리학적 분석

안락사후 개체 별로 위장을 적출하여 그 일부를 10 % 중성완충포르말린용액 (10% buffered neutral formalin)에 고정하였다. 고정된 조직을 일정한 두께로 삭정한 다음, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하여 4~5㎛의 조직절편을 제작한 후 일반적인 염색방법인 헤마톡실린&에오신 염색(Hematoxylin & Eosin stain, H&E stain)을 실시하여 조직병리학적 소견(염증세포의 침윤, 상피세포의 구조파괴, 궤양 및 출혈 등의 조직병리학적인 변화)을 관찰하였다.

5. 헬리코박터 파일로리 위부착력 분석

(1) DNA 분리

각각의 마우스에서 위를 떼어내어 DNA 정제 키트를 이용하여 DNA를 추출하였다.

(2) 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)

헬리코박터 파일로리(SS1)의 16s DNA에 대해 TaqMan 탐침(probe)을 이용하여 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR에 사용된 프라이머 서열을 하기 표 42에 나타내었다.

6. 위 조직에서 산화적 손상 측정

(1) 위 조직의 분획

위 조직의 일부를 4배의 150mM KCl을 가하여 균질기(homogenizer)를 이용하여 균질화하였다. 균질화한 조직을 4,000rpm에서 30분동안 원심분리하고 상층액을 취하여 글루타티온(glutathione, GSH)을 측정하고, 나머지는 20,000rpm에서 1시간 동안 다시 원심분리한 후 상등액을 취하여 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)를 측정하였다.

(2) GSH 측정

글루타티온 분석 키트(glutathione assay kit, Cell Biolabs, USA)를 이용하여 측정하였으며, 405nm에서 흡광도를 측정한 후 GSH의 농도를 계산하였다.

(3) 지질과산화(Lipid peroxidation) 측정

TBARS 분석키트 (Cell Biolabs, USA)를 이용하여 측정하였으며, 586nm에서 흡광도를 측정한 후 MDA를 계산하였다.

7. 위 조직에서 염증관련 사이토카인 측정

(1) 총 RNA의 분리 및 cDNA 합성

위 조직에 트리졸 라이시스 버퍼(Trizol lysis buffer)를 각각 1㎖씩 분주한 후 균질화하여 용해시켰다. 클로로포름 200㎕를 분주하여 20초간 뒤집어준(inverting) 후 13,200rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 이소프로판올 500㎕가 들어 있는 튜브에 옮겨 섞어주었다. 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 상등액을 제거한 후 70% 에탄올을 각 튜브에 1㎖씩 분주하여 13,000rpm에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거하고 실온에서 건조시켰다. DEPC가 포함된 D.W.를 40㎕씩 분주하여 RNA를 녹인 후, 이 RNA 용액 1㎕를 취하여 NanoDrop 장비에서 260/280nm 흡광도를 측정하여 용액의 총 RNA 농도를 계산하였다. 추출한 RNA와 RT DriyMIX cDNA 합성 키트를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

(2) 실시간 PCR

IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 유전자 발현을 알아보기 위하여 실시간-PCR을 실시하였다. 실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 43에 나타내었다.

8. 통계처리

통계처리는 GraphPad PRISM 프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며 각 군 간의 차이를 검증하기 위하여 터키테스트(Turkey test)를 이용하여 사후분석 하였다. 통계학적인 유의수준은 p < 0.5로 판정하였다.

Ⅲ. 실험 결과

1. 사망률 및 임상증상

순화기간 중 모든 동물에서는 특별한 임상증상이 관찰되지 않았으며, 시험당일 빈사동물은 없었다. 헬리코박터 파일로리(HP)를 투여한 후 3주 이내에 G6, G8 에서 각각 1마리씩 폐사하였다. 그 결과를 하기 표 44에 나타내었다.

2. 체중측정

G1 내지 G11 모든 군에서 시험기간 총 8주 동안 체중의 감소가 관찰되지 않았으며 군 간의 차이도 없었다. 또한 모든 군에서 시험기간 동안 정상적인 체중 증가가 관찰되었다. 그 결과를 하기 표 45에 나타내었다.

3. 장기무게 측정

(1) 간무게

헬리코박터 파일로리 투여후 8주 부검시 절식된 체중에 대한 간의 상대 장기중량을 산출하였다. G2와 비교하여 G2 사이에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 그 결과를 도 42에 나타내었다(데이터는 평균±SEM으로 나타냄).

(2) 비장무게

절식된 체중에 대한 비장의 상대 장기중량을 산출한 결과 통계학적으로 유의적인 차이를 보이는 군은 없었다. 그 결과를 도 43에 나타내었다(데이터는 평균±SEM으로 나타냄).

(3) 신장무게

절식된 체중에 대한 신장의 상대 장기중량을 산출한 결과 통계학적으로 유의적인 차이를 보이는 군은 없었다. 그 결과를 도 44에 나타내었다.(데이터는 평균±SEM으로 나타냄).

4. 헬리코박터 파일로리의 위부착력 확인

각각의 마우스에서 위를 떼어내어 DNA을 추출한 후 헬리코박터 파일로리의 16s DNA에 대해 실시간 PCR을 실시하였다. 그 결과 G1과 비교하여 G2에서 헬리코박터 파일로리 감염수가 유의적으로 증가하였다. 그러나 G9와 G11 은 G2에 비해헬리코박터 파일로리 감염수가 유의적으로 감소하였으며, G4에 비하여 더 우수한 효과를 나타내었다. 그 결과를 도 45에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

5. 조직병리학적 관찰

적출한 위 조직을 H&E 염색을 통해 조직의 손상 정도를 확인하고, 결과를 도 46에 나타내었다. G1의 경우 위 점막을 비롯한 모든 층에서 이상 소견이 관찰되지 않았으나, G2에서는 점막 및 점막하층(submucosa)에서 대식구(macrophages), 호중구 (neutrophils) 등의 염증세포의 침윤이 관찰되었다. 그 외 모든 군에서 염증 등의 이상 소견이 관찰되지 않았다.

6. 염증성 사이토카인의 발현

헬리코박터 파일로리 감염의 초기 단계엔 점막고유판(lamina proproa) 내의 호중구의 증가를 보이고, 만성적으로 진행되면 림프구(lymphocytes), 단핵구(plasma cells), 호산구(eosinophils) 등의 증가가 관찰된다. 호중구의 활성증가는 IL-8과 같은 케모카인(chemokine) 뿐만 아니라 IL-1β, IL-6, TNF-α 등 여러 염증성 사이토카인의 생성을 유도하여 더 많은 염증 세포들을 위점막 내로 유입시키고 위점막의 위축 및 위상피세포의 세포자멸사(apoptosis) 등을 유발하게 된다. 헬리코박터 파일로리 감염으로 인한 위의 염증반응과 프로폴리스 복합물의 치료 효과를 정량적으로 평가하기 위해 위 조직에서 IL-1β, IL-6, TNF-α 수준을 측정하였다. 그 결과를 도 47에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(1) IL-6

G1에 비해 G2에서 IL-6의 발현이 유의적으로 증가하였으며, G7, G9, G10, 및 G11가 G2에 비해 IL-6의 발현이 유의적으로 감소하였다. 또한 G10 와 G11은 양성대조군인 G3에 비해 우수한 효과를 나타내었다(도 47의 A).

(2) TNF-α

G1에 비해 G2에서 TNF-α의 발현이 통계학적인 차이가 관찰되지 않았으며, G2와 비교하여도 모든 시험군에서 유의적인 차이가 없었다. 하지만 t-테스트(t-test)를 이용하여 비교하였을 때 G1에 비해 G2에서 TNF-α의 발현이 유의적으로 증가하였으며, G6, G9, G10 및 G11이 G2에 비하여 TNF-α의 발현이 유의적으로 감소하였다(도 47의 B).

(3) IL-1β

TNF-α 결과와 마찬가지로 모든 군에서 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 하지만 t-테스트를 이용하여 비교하였을 때 G1에 비해 G2에서 IL-1β의 발현이 유의적으로 증가하였으며, G5, G9 및 G11이 G2에 비해 IL-1β의 발현이 유의적으로 감소하였다(도 47의 C).

7. 위 조직의 산화적 손상

헬리코박터 파일로리가 위상피세포에 감염되면 세포의 면역반응으로 인해 먼저 활성산소(reactive oxygen species, ROS)가 증가하고, 이 ROS는 세포 내의 단백질이나 지질 등의 거대분자를 산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고, 세포를 자멸시키는 등의 작용으로 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발한다. 헬리코박터 파일로리가 위상피세포에 유도하는 산화적 손상에 대한 프로폴리스 복합물의 보호효과를 평가하였다. 그 결과를 도 48에 나타내었다(데이터는 평균± SEM으로 나타냄. *and** 는 G1과 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01; ^†and^††,G2와 비교할 때 각각 P < 0.05 and P < 0.01이다).

(1) MDA

지질과 산화물은 ROS나 자유라디칼 등의 산화 스트레스에 의하여 조직 내 인지질 세포막의 수소 원자가 제거되어 조직이 손상되며 생기는 것으로 지질과산화 생성물은 세포막의 투과성을 증가시켜 체액의 손실 및 단백질 변화를 유발한다. 위 손상의 지표로 위 조직의 지질과산화 생성물인 MDA를 측정하여 헬리코박터 파일로리로 인한 위 조직 손상에 대하여 프로폴리스 복합물의 치료 효과를 측정하였다. 그 결과 G1에 비하여 G2에서 MDA 수치가 유의적으로 증가하였으며, G3를 제외한 모든 군에서 G2에 비해 MDA의 수치가 유의적으로 감소하였다. 또한 사람의 삼제 요법인 G4에 비하여 G9, G10 및 G11이 더 우수한 효과를 나타내었다(도 48의 A).

(2) GSH

GSH는 자유 라디칼이나 과산화물에 의해 유발된 산화 스트레스에 의한 손상을 막아주는 생체 내 항산화물질 중에 하나이다. G1에 비하여 G2에서 GSH 수치가 감소하였으나 유의적인 차이를 보이지 않았으며, G2에 비하여 G3만 GSH의 수치가 유의적으로 증가하였다(도 48의 B).

8. 프로폴리스 복합물의 항 헬리코박터 효력시험 종합 검토

헬리코박터 파일로리 감염 후 손상된 위점막에 대한 프로폴리스 복합물의 치료 효과를 조사하기 병리조직학적 소견, 헬리코박터 파일로리 위부착, 전염정성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 발현 분석 및 산화 스트레스 분석을 실시하여 종합적으로 비교 검토하였으며, 그 결과를 하기 표 46에 나타내었다.

상기 표 46에서 보는 바와 같이 프로폴리스 단독은 종합적으로 항파일로리 부착, 항산화 및 항염증 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 프로폴리스, 올리브잎 추출물 또는 감초 추출물을 각각 단독으로 사용하였을 때보다 프로폴리스와 올리브잎 추출물, 감초 추출물을 모두 혼합한 경우 항헬리코박터 파일로리 부착, 항산화 및 항염증효과가 높아졌으며, 모든 검사항목에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

Claims (8)

1. 유효성분으로 프로폴리스 추출물, 감초 추출물 및 올리브잎 추출물을 25~35:5~15:15~25의 중량비로 포함하고,
   상기 프로폴리스는, 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 한국산 프로폴리스를 30~40:25~35:30~40의 중량비로 포함하거나, 또는 아르헨티나산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스 및 브라질산 프로폴리스를 35~45:25~35:25~35의 중량비로 포함하는 혼합 프로폴리스이며,
   상기 프로폴리스 추출물은 천연 프로폴리스의 이물질 및 왁스를 제거한 후 에탄올로 추출 및 농축시키는 단계와 수용화시키는 단계를 거쳐 얻은, 무알코올 수용성 프로폴리스 추출물인 것을 특징으로 하는, 위염 및 헬리코박터 파일로리 억제를 위한 조성물.
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8. 제1항의 조성물을 포함하는 건강기능식품.
   

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