KR101990703B1 - 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법으로서, 상기 센서는 작동 전극의 표면 상에 고정되는 효소를 포함하며,
시료의 온도를 하기의 방법으로 결정되는 일정 온도(T)로 제어하는 단계;
상기 시료 내에 작동 전극을 일정 시간(t) 이상 침지하는 단계;
상기 침지된 작동 전극에 산화환원 전압을 인가하는 단계; 및
상기 전압에 대응하여 측정되는 전류값으로부터 시료 내 목적 물질의 농도를 계산하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 일정 온도(T)는,
(i) 목적 물질이 포함된 시료 및 상기 목적 물질과 반응하는 효소가 고정된 작동 전극을 포함하는 전기화학 센서를 준비하는 단계;
(ii) 상기 작동 전극을 10℃≤T1,T2,...,Tn≤100℃인 상이한 온도(T1,T2,...,Tn)로 조절된 시료에 침지한 후, 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법을 통해 각각의 온도에서 전압에 대한 전류값을 측정하는 단계;
(iii) 상기 측정된 전류값 중 최대값인 최대 전류값(Imax), 이에 대응하는 전압(VCV)을 결정하는 단계; 및
(iv) 상기 결정된 전압(VCV)과 동일한 전압에서 상기 최대 전류값(Imax)의 90% 이상인 전류값(Icv)를 갖는 온도(T)를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 결정되는 온도(T)는 │온도(T) - 20│이 최소값을 갖는 온도인 온도 결정 방법으로 결정되는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
시료의 온도를 하기의 방법으로 결정되는 일정 온도(T)로 제어하는 단계;
상기 시료 내에 작동 전극을 일정 시간(t) 이상 침지하는 단계;
상기 침지된 작동 전극에 산화환원 전압을 인가하는 단계; 및
상기 전압에 대응하여 측정되는 전류값으로부터 시료 내 목적 물질의 농도를 계산하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 일정 온도(T)는,
(i) 목적 물질이 포함된 시료 및 상기 목적 물질과 반응하는 효소가 고정된 작동 전극을 포함하는 전기화학 센서를 준비하는 단계;
(ii) 상기 작동 전극을 10℃≤T1,T2,...,Tn≤100℃인 상이한 온도(T1,T2,...,Tn)로 조절된 시료에 침지한 후, 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법을 통해 각각의 온도에서 전압에 대한 전류값을 측정하는 단계;
(iii) 상기 측정된 전류값 중 최대값인 최대 전류값(Imax), 이에 대응하는 전압(VCV)을 결정하는 단계; 및
(iv) 상기 결정된 전압(VCV)과 동일한 전압에서 상기 최대 전류값(Imax)의 90% 이상인 전류값(Icv)를 갖는 온도(T)를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 결정되는 온도(T)는 │온도(T) - 20│이 최소값을 갖는 온도인 온도 결정 방법으로 결정되는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 개시는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 현장 자가진단에 최적화된 효소 반응 온도 및 인큐베이션 시간을 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법 및 시간대전류(Chronoamperometry, CA)법을 통해 결정하여 그 온도 및 시간에 따라 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
현장 자가진단이란, 종래 병원에 가야만 진단 가능하던 질병을 전문 의료인력의 도움 없이도 현장(환자가 있는 곳)에서 빠르게 환자 스스로 검사하는 것을 의미한다. 질병의 진단 및 예후, 건강 상태 판정, 질병 치료효과 판정, 예방 등의 목적을 위하여, 인체로부터 채취된 소량의 시료를 사용하여 검사가 가능하다.
이러한 현장 자가진단을 위하여, 시료 내 목적 물질의 화학적 반응으로부터 전기적 신호를 측정하여 시료 내 목적 물질의 농도를 계산하는 전기화학센서 혹은 바이오센서가 많이 연구되고 있다. 최근에는 작동 전극 상에서의 목적 물질의 산화/환원 전극 반응에 의해 발생되는 전자의 이동, 즉 전류를 측정함으로써 목적 물질의 시료 내 농도를 계산하는 전기화학센서의 연구가 많이 진행되고 있다. 특히, 최근 현장 자가진단용 전기화학센서에 대하여 저비용, 간편성, 및 소형화 용이성 등이 요구됨에 따라, 센서의 사이즈를 소형화하여 휴대가 용이하게 함과 동시에 우수한 센싱 민감도를 갖는 전기화학센서에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 전기화학센서의 측정 대상으로서 면역 관련 물질(예컨대 항원 또는 항체)은 전기전도도가 매우 낮고, 전기화학적 반응성도 낮다. 이러한 면역 관련 물질과 더불어 산화 환원 기능이 없는 목적 물질의 경우에는 상기와 같은 산화/환원 전극 반응을 통한 분석이 어렵다는 문제점을 지닌다. 이에, 상기와 같은 목적 물질의 농도 측정을 위해서는 상기 목적 물질을 전기화학적으로 활성화 시킬 수 있는 표지 인자의 도입이 필수적이다. 상기 표지 인자로는 상기 목적 물질과 반응하여 전기화학적으로 활성도가 높은 생산물을 생산할 수 있는 효소가 일반적으로 많이 사용되고 있다.
다만, 이러한 효소들은 각각 상이한 최적 활성 조건을 가진다. 온도 증가에 따라 운동 에너지의 증가로 인해 일반적으로 활성이 증가하는 촉매와 달리, 효소의 경우, 최대로 활성화되기 위한 최적의 온도가 존재한다. 효소의 활성도는 전기화학센서의 민감도에 비례하는바, 센서의 민감도를 고려할 때 효소의 활성도가 최대가 되는 온도에서 측정을 하는 것이 가장 바람직하다. 그러나 현장 자가진단용이라는 목적에 있어서, 시료의 온도를 최대 활성 온도까지 조절하는 것은 시간적, 비용적 측면에서 바람직하지 못하다.
또한, 전기화학센서에 의한 센싱을 위해서는 상기 효소에 의해 생성되는 전기화학 활성도가 높은 시료 및 효소의 반응 생성물이 일정 농도에 도달하여야 할 것인바, 시료와 효소의 인큐베이션 시간도 센싱 민감도에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 이러한 인큐베이션 시간도 현장 자가진단용이라는 목적에 있어서, 상기 작동 전극 상에 효소 반응 생성물의 농도가 포화 상태에 도달할 때까지 긴 인큐베이션 시간을 갖는 것은 시간적 측면에서 바람직하지 못하다.
현재까지 현장 자가진단의 목적에 부합하면서 우수한 센싱 민감도를 가질 수 있는 효소의 반응 온도 조건 및 효소의 인큐베이션 시간 조건을 결정할 수 있는 전기 화학적 방법에 관한 선행 문헌은 존재하지 않는다.
예를 들어, 선행 특허 KR 10-1740098 B1은 알도오스 당 탈수소효소를 포함하는 바이오연료 전지에 관한 것으로서, 알도오스 당 탈수소효소의 활성은 반응 온도에 따르 크게 변화되므로, 이에 따른 차이를 확인하기 위해 25℃ 및 75℃에서의 순환전압법 곡선을 비교한다. 그러나 이는 단순히 보다 높은 온도에서 활성을 갖는 알도오스 당 탈수소효소에 대하여 75℃에서 더 높은 활성을 가짐을 보여준 것에 불과할 뿐, 현장 자가진단을 고려한 바람직한 효소 반응 온도 조건에 대해서는 교시하지 않는다.
또한, 선행 특허 US 6413411 B1은 체액으로부터 생물학적으로 중요한 화합물의 정량을 결정하기 위한, 새로운 일회용 전기분석 셀을 이용한 전류 측정 분석 방법에 관한 것으로서, 글루코스에 대한 특정 인큐베이션 시간을 제시하나, 이는 단순히 효소 생성물이 최대로 포화될 수 있는 충분한 시간을 제시하는 것일뿐, 현장 자가진단을 고려한 바람직한 인큐베이션 시간 조건에 대해서는 교시하지 않는다.
따라서, 본 개시의 관점은 현장 자가진단의 목적에 부합하면서 우수한 센싱 민감도를 가질 수 있는 효소 반응 온도 및 인큐베이션 시간을 목적 물질 및 효소별로 결정하여, 그 온도 및 시간에 따라 시료 내 목적 물질의 농도를 전기화학센서를 이용하여 측정하는 방법을 제공하는데 있다.
본 개시의 제1 관점을 달성하기 위한 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법으로서, 상기 센서는 작동 전극의 표면 상에 고정되는 효소를 포함하며, 시료의 온도를 하기의 방법으로 결정되는 일정 온도(T)로 제어하는 단계; 상기 시료 내에 작동 전극을 일정 시간(t) 이상 침지하는 단계; 상기 침지된 작동 전극에 산화환원 전압을 인가하는 단계; 및 상기 전압에 대응하여 측정되는 전류값으로부터 시료 내 목적 물질의 농도를 계산하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 일정 온도(T)는, (i) 목적 물질이 포함된 시료 및 상기 목적 물질과 반응하는 효소가 고정된 작동 전극을 포함하는 전기화학 센서를 준비하는 단계; (ii) 상기 작동 전극을 10℃≤T1,T2,...,Tn≤100℃인 상이한 온도(T1,T2,...,Tn)로 조절된 시료에 침지한 후, 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법을 통해 각각의 온도에서 전압에 대한 전류값을 측정하는 단계; (iii) 상기 측정된 전류값 중 최대값인 최대 전류값(Imax), 이에 대응하는 전압(VCV)을 결정하는 단계; 및 (iv) 상기 결정된 전압(VCV)과 동일한 전압에서 상기 최대 전류값(Imax)의 90% 이상인 전류값(Icv)를 갖는 온도(T)를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 결정되는 온도(T)는 │온도(T) - 20│이 최소값을 갖는 온도인 온도 결정 방법으로 결정된다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 일정 시간(t)는, (가) 목적 물질이 포함된 시료 및 상기 목적 물질과 반응하는 효소가 고정된 작동 전극을 포함하는 전기화학 센서를 준비하는 단계; (나) 상기 전극을 15초 ≤t1,t2,...,tm ≤60분인 상이한 시간(t1,t2,...,tm) 동안 시료에 침지한 후, 시간대전류(Chronoamperometry, CA)법을 통해 각각의 침지 시간에 대하여 전압 공급 시간에 대한 전류값을 측정하는 단계; (다) 상기 측정된 시간에 대한 전류값의 데이터를 이용하여 전압이 인가된 후 10초부터 15초까지의 전류값의 적분값을 각각의 침지 시간에 대하여 계산하는 단계; (라) 상기 계산된 적분값들 중 침지 시간이 상기 시간(t) 이상인 경우의 적분값들의 변동 계수가 2% 이내인 최소 시간(t)을 결정하는 단계를 포함하는 침지 시간 결정 방법으로 결정된다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 시료는 인체로부터 얻어진 체액이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 목적 물질은 항원, 항체, 단백질, 면역 분자, DNA, 및 RNA로 이루어진 군으로 선택되는 1종이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 효소는 목적 물질을 산화/환원 반응 가능한 효소 반응 생성물로 전환시킬 수 있는 효소이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 글루코스 옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라이제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)의 군으로부터 선택되는 1종의 효소이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 작동 전극은 ITO(Indium Tin Oxide)이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 효소는 작동 전극의 표면 상에 연결 화합물을 통해 고정된다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 n은 3≤ n ≤ 20인 정수이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, m은 3≤ m ≤ 15인 정수이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 단계 (나)에서 전압 공급 시간은 40 내지 60초이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 인가되는 산화환원 전압은 정전압 또는 순환전압이다.
본 개시의 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법을 통해, 효소 반응 온도를 센싱 민감도를 우수하게 유지하면서 상온에 최대한 근사한 온도로 결정하여 측정하는 것이 가능하다. 이를 통해 현장 자가진단용 전기화학센서에 불필요한 온도 컨트롤러를 제거 혹은 최소화할 수 있으므로 비용의 저렴화를 도모하는 것이 가능하다.
또한, 본 개시의 방법을 통해, 최적의 인큐베이션 시간을 결정하여 전기화학적 측정을 하는 것이 가능해지는바, 우수한 센싱 민감도를 가지면서도 종래의 현장 자가진단용 센서보다 신속한 측정이 가능하다.
또한, 종래 시료의 정량 측정에 사용되는 색 변화를 이용한 흡광도 측정 방식이 효소 반응 생성물의 색 변화로 인해 검사 횟수만큼 동일한 시료를 별개로 준비할 필요가 있는 것과 달리, 본 개시의 방법은 전기화학적 방식을 통하여 하나의 용기에 담기 시료를 가지고 연속적인 검사를 할 수 있는바, 보다 신속하고 간편하게 효소별 현장 자가진단에 적합한 효소 반응 온도 및 인큐베이션 시간의 결정이 가능하다.
도 1은 본 개시의 일 구체예에 따른 목적 물질의 효소 반응 및 산화환원 반응의 메커니즘이며;
도 2는 본 개시의 일 구체예에 따른 작동 전극 표면 상에 고정된 효소에 관한 개략도이며;
도 3은 본 개시의 일 구체예에 따른 각각의 온도에서 순환전압법에 의해 측정된 시간에 대한 전류값의 그래프이며;
도 4는 본 개시의 일 구체예에 따른 각각의 침지 시간에 대하여 시간대전류법에 의해 측정된 전압 공급 시간에 대한 전류값의 그래프이며;
도 5는 본 개시의 일 구체예에 따른 시간대전류법에 의해 측정된 10 내지 15초 동안의 전류값의 적분값에 관한 그래프이다.
도 2는 본 개시의 일 구체예에 따른 작동 전극 표면 상에 고정된 효소에 관한 개략도이며;
도 3은 본 개시의 일 구체예에 따른 각각의 온도에서 순환전압법에 의해 측정된 시간에 대한 전류값의 그래프이며;
도 4는 본 개시의 일 구체예에 따른 각각의 침지 시간에 대하여 시간대전류법에 의해 측정된 전압 공급 시간에 대한 전류값의 그래프이며;
도 5는 본 개시의 일 구체예에 따른 시간대전류법에 의해 측정된 10 내지 15초 동안의 전류값의 적분값에 관한 그래프이다.
본 개시의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이나, 본 개시가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 개시를 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
본 개시는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 센서는 작동 전극의 표면 상에 고정되는 효소를 포함하며, 시료의 온도를 일정 온도(T)로 제어하는 단계; 상기 시료 내에 작동 전극을 일정 시간(t) 이상 침지하는 단계; 상기 침지된 작동 전극에 산화환원 전압을 인가하는 단계; 및 상기 전압에 대응하여 측정되는 전류값으로부터 시료 내 목적 물질의 농도를 계산하는 단계를 포함한다.
본 개시에서 측정에 사용되는 시료는 동물로부터 얻어지는 체액일 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 시료는 인체로부터 얻어지는 체액일 수 있다. 여기서 상기 체액은 예컨대 혈액, 배뇨, 타액 등을 의미하며, 상기 예에 한정되지 않고, 분석하고자 하는 목적 물질이 체액 내 존재한다면 이용 가능하다.
본 개시에서 전기화학센서를 이용하여 측정하고자 하는 목적 물질은 항원, 항체, 비타민, 단백질, 면역 분자, DNA, 및 RNA 등일 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 목적 물질은 자체적으로 산화 반응 또는 환원 반응이 불가능한 물질일 수 있다. 이러한 목적 물질을 위해 본 개시의 방법에서는 후술하는 표지 인자의 이용을 수반한다. 상기 목적 물질은 예컨대 아스코르브산-2-포스페이트, 4-아미노페닐 포스페이트일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 개시에서 사용되는 표지 인자는 효소이며, 상기 효소는 목적 물질을 산화/환원 반응이 가능한 효소 반응 생성물로 전환시킬 수 있는 효소이다. 예를 들어, 상기 효소는 알칼리성 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP), 호스래디시 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase, HRP), 글루코스 옥시다제(Glucose Oxidase), 루시퍼라제(luciferase), 베타-디-갈락토시다제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase) 등일 수 있다. 특히 바람직하게는 상기 효소는 ALP 또는 HRP일 수 있다. ALP 및 HRP는 매우 민감한 반응성을 갖는 이점이 있으며, 특히 HRP의 경우 저렴하여 비용 측면에서 이점이 있다. 또한, ALP의 경우 약 24 내지 48시간의 긴 시그널 유지 시간을 갖는 점에서 유리한 이점이 있다.
예시적으로, 상기 ALP에 의한 효소 반응 및 효소 반응 생성물의 산화환원 반응에 대한 메커니즘이 도 1에 도시되어 있다. 도 1을 참조하면, 목적 물질인 아스코르브산-2-포스페이트(ascorbic acid-2-phosphate, AAP)는 ALP에 의해 포스페이트 작용기가 분리되어 효소 반응 생성물로서 아스코르브산(AA)으로 전환된다. 상기 아스코르브산은 산화 전압에 의해서 탈수소 아스코르브산염(dehydroascorbate)로 산화된다. 상기 산화 반응시 발생하는 전기적 신호, 즉 전자에 의해 전기화학센서는 시료 내 목적 물질의 정량 측정이 가능하다. 도 1에서, 농도를 측정하고자 하는 목적 물질인 아스코르브산-2-포스페이트 자체는 전압에 의한 산화환원 반응이 불가능하기 때문에 ALP를 이용하여 산화환원 반응이 가능한 아스코르브산으로 전환하는 효소 반응 공정이 수반된다.
본 개시에서 사용되는 작동 전극은 작동 전극 상에 효소의 고정이 가능하고, 효소 반응 생성물에 전류를 흐르게 할 수 있다면 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 작동 전극은 수은 전극, 아말감 전극, Pt, Au, Pd, Rh 전극과 같은 귀금속 전극, 열분해 흑연(pyrolytic graphite) 전극, 유리 탄소(glassy carbon) 전극, 탄소 페이스트 전극, 탄소 섬유 전극과 같은 탄소 전극, 인듐 산화 주석(Indium tin oxide, ITO) 전극 등일 수 있다. 바람직하게는, 상기 작동 전극은 ITO 전극일 수 있다. 특히, ITO 전극의 경우 바이오 센서에 적용 시, 노이즈 신호를 줄일 수 있고 별도의 점착층 없이도 유기 기판 상에 ITO 박막이 침적된 기판을 그대로 사용할 수 있는 장점이 있다. 상기 ITO 기판은 디스플레이 산업 등에서 대형 기판 상에 높고 안정적인 전기전도성 특성을 갖는 박막 기판 제조 공정을 동일하게 활용할 수 있으므로, 매우 저렴하게 전극으로 제작이 가능하다는 이점을 갖는다.
본 개시에서 상기 효소는 작동 전극 상에 고정된다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 효소는 연결 화합물을 통하여 작동 전극 상에 고정될 수 있다. 여기서 연결 화합물이란 작동 전극 및 효소를 연결하는 화합물을 의미한다. 상기 연결 화합물로서 생화학적 반응 결합물인 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘(streptavidin)이 이용될 수 있다. 또한, 화학적 공유 결합물로서, 단백질의 프라이머리 아민과 결합하는 카보디이미드(carbodiimide) 가교제 또는 석신이미드(succinimide) 가교제가 이용될 수 있다. 바람직하게는 비오틴-아비딘 결합 화합물이 이용될 수 있다. 화학적 공유결합을 이용하여 효소를 고정하는 방법의 경우, 고정화되는 효소의 방향성의 무작위성이 존재하지만, 비오틴-아비딘 결합 화합물을 이용하는 경우, 고정화되는 효소의 바인딩 사이트의 표면적 표출 방향성의 제어가 용이하여, 표면 상에 효소의 적절한 방향성 제어로 효소의 바인딩 사이트의 표면적 표출을 극대화할 수 있고, 이를 통해 시료 내 목적 물질의 검출 능력을 극대화시킬 수 있다.
도 2는 본 개시의 일 구체예에 따른 작동 전극의 플랫폼의 개략적인 이미지이며, ITO 전극 상에 비오틴-아비딘의 결합을 통해 ALP가 고정되는 것을 도시한다.
본 개시에서 전기화학센서를 이용한 시료 검사 시에 시료의 온도는 일정 온도(T)로 제어될 수 있다. 상기 일정 온도(T)는 하기의 방법에 의해 결정될 수 있다:
온도(T) 결정 방법으로서,
(i) 목적 물질이 포함된 시료 및 상기 목적 물질과 반응하는 효소가 고정된 작동 전극을 포함하는 전기화학 센서를 준비하는 단계;
(ii) 상기 작동 전극을 10℃≤T1,T2,...,Tn≤100℃인 상이한 온도(T1,T2,...,Tn)로 조절된 시료에 침지한 후, 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법을 통해 각각의 온도에서 전압에 대한 전류값을 측정하는 단계;
(iii) 상기 전류값 중 최대값인 최대 전류값(Imax), 이에 대응하는 전압(VCV)을 결정하는 단계; 및
(iv) 상기 결정된 전압(VCV)과 동일한 전압에서 상기 최대 전류값(Imax)의 90% 이상인 전류값(Icv)를 갖는 온도(T)를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 결정되는 온도(T)는 │온도(T) - 20│이 최소값을 갖는 온도이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 일정 온도(T)의 결정은 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용하여 목적 물질의 시료 내 농도를 측정하는 것과 별개로, 우선적으로 수행될 수 있다. 상기 일정 온도(T)의 결정은 다양한 온도 상에서의 복수의 측정이 요구되는바, 신속한 진단이 요구되는 현장보다는 실험실에서 수행되는 것이 바람직하다.
먼저, 목적 물질을 선정하여, 상기 목적 물질을 포함하는 시료를 준비하고, 상기 목적 물질과 반응하여 산화환원 가능한 반응 생성물을 생성할 수 있는 효소를 고정한 작동 전극을 갖는 전기화학센서를 준비한다. 상기 목적 물질, 시료, 및 효소에 대해서는 전술한 본 개시의 구체예들이 적용 가능하나, 이에 한정되지는 않는다.
이어서, 상기 시료를 상이한 온도(T1,T2,...,Tn)로 조절한 뒤, 상기 시료 내에 작동 전극을 침지한다. 상기 침지는 시료 및 효소의 인큐베이션을 위해 수행된다. 본 개시의 일정 온도(T)의 결정을 위하여 상기 침지는 동일한 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 상이한 온도들은 Tn -1 < Tn일 수 있다. 여기서 Tn은 Tn -1에서의 전류 측정 이후 그 다음 전류 측정이 수행되는 온도이다. 본 개시의 다른 구체예에 따르면, Tn -o-1 < Tn < Tn - o일 수 있다. 여기서 o는 1 ≤ o ≤ n-2인 정수이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, Tn-Tn -1은 일정할 수 있다. 이 때 상기 Tn-Tn -1은 10℃, 보다 바람직하게는 5℃ 이하인 것이 일정 온도(T) 결정의 정밀도의 관점에서 바람직하다. 본 개시의 다른 구체예에 따르면, Tn-Tn -1은 상이할 수 있다. 상기 온도별 측정을 진행하는 과정에서 앞서 측정된 Tn -m-1 및 Tn - m사이에서 높은 전류값의 측정이 예상될 수 있는바, 이 경우, 보다 최적화되는 일정 온도(T)의 결정을 위해서는 Tn-Tn-1은 상이할 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 상이한 온도(T1,T2,...,Tn)는 10℃≤ T1,T2,...,Tn ≤100℃일 수 있고, 여기서 n은 3≤n≤20인 정수이다. 바람직하게 상기 n은 4≤n≤15, 보다 바람직하게는 5≤n≤10일 수 있다. 상기 n이 3 미만인 경우, 최대 전류값(Imax)에 대한 신뢰도가 낮아지는 문제가 발생할 수 있다. 반면, n이 20을 초과하는 경우, 과도한 반복 측정으로 인한 시간적, 비용적 문제가 발생할 수 있다.
상기 상이한 온도에서 시료 내에 침지된 작동 전극은 순환전압법을 통해 각각의 온도에서 전압에 대한 전류값이 측정될 수 있다. 순환전압법이란 작동 전극의 전압을 일정 속도로 순환시켜 전류를 측정하는 방법으로서, 이를 통해, 도 3과 같은 순환전압전류 곡선을 얻을 수 있다. 순환전압법을 통해 전극 표면상에서 발생하는 산화환원 반응을 파악할 수 있다. 순환전압법에 있어서 초기 전압 및 역전전압은 전극의 산화환원 신호를 관찰 가능하도록 효소별로 적절하게 설정될 수 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 예컨대 ALP에 의해 생성된 AA의 산화환원 반응을 파악하기 위하여 0 내지 0.6 V의 전압이 설정될 수 있다.
종래 목적 물질의 정량은 주로 목적 물질 또는 효소 반응 생성물이 산화될 때의 색의 변화를 가져오는 색소원을 이용하여 색의 변화 정도를 광도계를 사용하여 빛의 반사도 또는 투과도를 측정하여 정량하였다. 이 경우 정량 횟수만큼 동일한 시료를 별개로 준비할 필요가 있다는 문제가 존재한다. 이와 달리, 본 개시에서 이용하는 순환전압법을 사용하는 경우, 하나의 용기에 담기 시료를 가지고 연속적인 정량을 할 수 있는바, 보다 신속하고 간편하게 효소별 현장 자가진단에 적합한 효소 반응의 일정 온도(T)를 결정하는 것이 가능하다. 한편, 이러한 순환전압법을 이용하여 현장 자가진단에 적합한 효소 반응 온도를 결정하는 방법에 대하여는 본 개시의 출원 전에 개시된 바가 없는 것으로 확인되었다.
상기 순환전압법을 통하여 각각의 온도에서 전압에 대한 전류값을 측정함으로써, 이 데이터를 통해 효소의 최대 전류값(Imax)를 결정할 수 있다. 상기 최대 전류값(Imax)은 상이한 온도에서의 모든 측정 결과에 대하여 측정된 가장 높은 전류값을 의미한다. 가장 많은 효소 반응 생성물의 생성은 가장 높은 전류값을 의미하는바, 상기 최대 전류값(Imax)을 통해 효소가 가장 많이 활성화될 수 있는 최대 활성 온도를 특정하는 것이 가능하다.
또한, 상기 최대 전류값(Imax)이 결정될 때 인가된 전압(VCV)도 함께 특정될 수 있다. 상기 측정된 데이터로부터 특정 온도에서 상기 전압(VCV)과 동일한 전압을 인가한 경우의 전류값과 상기 최대 전류값(Imax)을 비교하는 것이 가능하다. 이에, 상기 전압(VCV)에서의 전류값(ICV)이 상기 최대 전류값(Imax)의 90% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상인 온도(T)를 결정할 수 있다. 이와 동시에, 상기 온도(T)는 현장 자가진단의 목적에 부합하기 위하여, 상온에 가장 근사한 온도일 것이 요구되는바, │온도(T)-20│이 최소값을 갖는 온도이다. 상기 전류값(ICV)이 최대 전류값(Imax)의 90% 미만인 경우, 온도는 상온에 보다 근사할 수 있으나, 센싱 민감도의 성능이 감소하는 문제가 발생할 수 있고, 이로 인해 소량의 시료만을 대상으로 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 과정에서 정밀도가 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
한편, 본 개시에서 전기화학센서를 이용한 시료 검사 시에 작동 전극은 시료 내에 일정 시간(t) 동안 인큐베이션 또는 침지될 수 있다. 상기 일정 시간(t)은 하기의 방법에 의해 결정될 수 있다:
침지 시간(t) 결정 방법으로서,
(가) 목적 물질이 포함된 시료 및 상기 목적 물질과 반응하는 효소가 고정된 작동 전극을 포함하는 전기화학 센서를 준비하는 단계;
(나) 상기 전극을 5초 ≤t1,t2,...,tm ≤60분인 상이한 시간(t1,t2,...,tm) 동안 시료에 침지한 후, 시간대전류(Chronoamperometry, CA)법을 통해 각각의 침지 시간에 대하여 전압 공급 시간에 대한 전류값을 측정하는 단계;
(다) 상기 측정된 시간에 대한 전류값의 데이터를 이용하여 전압이 인가된 후 10초부터 15초까지의 전류값의 적분값을 각각의 침지 시간에 대하여 계산하는 단계;
(라) 상기 계산된 적분값들 중 침지 시간이 상기 시간(t) 이상인 경우의 적분값들의 변동 계수가 2% 이내인 최소 시간(t)을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 일정 시간(t)의 결정은 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용하여 목적 물질의 시료 내 농도를 측정하는 것과 별개로, 우선적으로 수행될 수 있다. 상기 일정 시간(t)의 결정은 다양한 침지 시간에서의 복수의 측정이 요구되는바, 신속한 진단이 요구되는 현장보다는 실험실에서 수행되는 것이 바람직하다.
먼저, 목적 물질을 선정하여, 상기 목적 물질을 포함하는 시료를 준비하고, 상기 목적 물질과 반응하여 산화환원 가능한 반응 생성물을 생성할 수 있는 효소를 고정한 작동 전극을 갖는 전기화학센서를 준비한다. 상기 목적 물질, 시료, 및 효소에 대해서는 전술한 본 개시의 구체예들이 적용 가능하나, 이에 한정되지는 않는다.
이어서, 상기 작동 전극을 상이한 시간(t1,t2,...,tm) 동안 시료 내에 침지한다. 본 개시의 일정 침지 시간(t)의 결정을 위하여 상기 시료의 온도는 동일한 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 온도는 전술한 일정 온도(T)를 결정 방법에 의해 결정된 온도일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 상이한 시간들은 tm -1 < tm일 수 있다. 여기서 tm은 tm -1에서의 전류 측정 이후 그 다음 전류 측정을 하는 작동 전극이 침지되는 시간이다. 본 개시의 다른 구체예에 따르면, tm -p-1 < tm < tm - p일 수 있다. 여기서 p는 1 ≤ p ≤ m-2인 정수이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, tm-tm -1은 일정할 수 있다. 이 때 상기 tm-tm -1은 2분, 바람직하게는 1분, 보다 바람직하게는 30초 이하인 것이 일정 시간(t) 결정의 정밀도의 관점에서 바람직하다. 본 개시의 다른 구체예에 따르면, tm-tm -1은 상이할 수 있다. 상기 침지 시간에 따른 측정을 진행하는 과정에서 앞서 측정된 tm -p-1 및 tm -p 사이에서 최적의 침지 시간이 존재할 수 있는바, 이와 같은 경우에 일정 시간(t)의 결정을 위하여 tm-tm-1은 상이할 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 상이한 시간(t1,t2,...,tm)는 15초≤ t1,t2,...,tm ≤60분일 수 있고, 여기서 m은 3≤m≤15인 정수이다. 바람직하게 상기 m은 4≤m≤12, 보다 바람직하게는 5≤m≤10일 수 있다. 상기 m이 3 미만인 경우, 변동 계수에 대한 신뢰도가 낮아지는 문제가 발생할 수 있다. 반면, m이 15를 초과하는 경우, 과도한 반복 측정으로 인한 시간적, 비용적 문제가 발생할 수 있다.
상기 상이한 시간 동안 침지된 작동 전극에서 각각의 침지 시간에 대하여 시간대전류법 통해 전압 공급 시간에 대한 전류값이 측정될 수 있다. 시간대전류법이란 평형을 이루고 있는 전극에 전기화학 반응을 유도할 수 있는 충분히 큰 값의 전압을 스텝으로 인가하게 되면 전류의 흐름이 관찰되는데, 이와 같이 인가한 전압 스텝에 대하여, 시간에 따른 전류 신호를 관찰하는 방법을 의미한다. 이를 통해 도 4와 같은 시간대전류 곡선을 얻을 수 있다. 시간대전류법에 있어서, 인가되는 정전압은 산화환원 반응에 의한 전류 신호를 관찰 가능하도록 효소별로 적절하게 설정될 수 있다.
전술한 바와 같이, 종래 목적 물질의 정량은 주로 목적 물질 또는 효소 반응 생성물이 산화될 때의 색의 변화를 가져오는 색소원을 이용하여 색의 변화 정도를 광도계를 사용하여 빛의 반사도 또는 투과도를 측정하여 정량하였다. 이 경우 정량 횟수만큼 동일한 시료를 별개로 준비할 필요가 있다는 문제가 존재한다. 이와 달리, 본 개시에서 이용하는 시간대전류법을 사용하는 경우, 하나의 용기에 담기 시료를 가지고 일정 시간 침지 후 정전압을 인가하고, 전류의 변화를 관찰한 뒤, 다시 일정 시간 침지를 하는 방법으로 연속적인 정량을 할 수 있는바, 보다 신속하고 간편하게 효소별 현장 자가진단에 적합한 효소 반응의 일정 온도(T)를 결정하는 것이 가능하다. 한편, 이러한 시간대전류법을 이용하여 현장 자가진단에 적합한 작동 전극의 침지 시간을 결정하는 방법에 대하여는 종래 개시된 바 없는 것으로 확인되었다.
상기 시간대전류법을 통하여 상이한 침지 시간에 대하여, 시간에 대한 전류값을 측정함으로써, 이 데이터를 통해 특정 시간 동안의 전류값의 적분값을 계산하는 것이 가능하다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 측정된 시간에 대한 전류값의 데이터를 이용하여 전압이 인가된 후 10초부터 15초까지의 전류값의 적분값을 각각의 침지 시간에 대하여 개별적으로 계산할 수 있다. 전압이 인가되는 시점에서부터 인가된 후 10초 동안의 경우는 정전압 인가시에 발생하는 노이즈 등으로 인해 침지 시간별 적분값이 비교가 정확하지 않은 문제가 발생할 수 있다. 반면, 15초 이후의 시간대를 기준으로 적분값을 계산하는 경우, 산환환원 반응이 진행되어 반응시 방출 또는 흡수되는 전자의 양이 감소하여 침지 시간별 적분값의 차이를 통한 비교가 어려워지는 문제가 발생할 수 있다.
상기 계산된 침지 시간에 따른 적분값들을 비교하여, 침지 시간이 시간(t)인 경우의 적분값 및 침지 시간이 상기 시간(t) 이상인 경우의 적분값들의 변동 계수가 2% 이내, 바람직하게는 1.8%, 보다 바람직하게는 1.5% 이내인 최소 시간(t)을 결정할 수 있다. 현장 자가진단의 목적에 부합하기 위하여, 우수한 센싱 민감도를 가지면서 침지 시간이 짧은 것이 유리한바, 상기 변동 계수의 한계 범위를 만족하면서 최소의 시간을 결정하는 것이 중요하다.
여기서 변동 계수(coefficient of variation)란, 표준 편차를 산술 평균으로 나눈 것으로 정의되며, 본 개시에서는 각 침지시간별 시간대전류법의 결과값에서, 10 내지 15초 사이의 적분값들에 대한 표준 편차를 산술 평균으로 나누어 변동 계수를 계산하였다.
상기 변동 계수가 2%를 초과하는 경우, 상기 작동 전극 상에 효소 반응 생성물이 충분히 침적된, 즉 포화 상태에 도달한 것이 아니어서, 정량 측정에 있어 오차 유발의 문제가 있다.
상기의 결정 방법들에 의해 결정된 효소 반응 온도 및 작동 전극 침지 시간은 본 개시의 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법에 적용될 수 있다.
이후, 상기 일정 시간(t) 이상 침지된 작동 전극에 대하여, 산화환원 전압을 인가한다. 상기 인가되는 전압은 산화환원 반응을 유도할 수 있도록 효소 반응 생성물별로 적절하게 인가될 수 있다.
상기 인가되는 전압에 대응하여 전류값을 측정할 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 전류값의 측정을 위하여 순환전압법 또는 시간대전류법이 사용될 수 있다. 상기 측정된 전류값으로부터 효소 반응 생성물의 산화환원 반응식을 고려하여 효소 반응 생성물의 농도를 계산할 수 있고, 상기 효소 반응 생성물의 농도로부터 시료 내 목적 물질의 농도를 계산할 수 있다.
본 개시에서 사용되는 전기화학센서는 측정하고자 하는 시료 내 목적 물질 및 이와 반응하는 효소에 대응하여 적절한 효소 반응 온도 및 침지 시간이 미리 결정될 수 있다. 필요에 따라서 상기 전기화학센서는 온도 조절 장치를 포함할 수 있다. 종래의 센서들이 효소의 활성이 최대화되는 것만을 고려하여 온도 조절 장치를 통해 상승시켜야 했던 온도가 높고, 그에 따라 소요되는 시간이 길었던 것과 달리, 본 개시의 전기화학센서는 상온에 근사한 온도로 효소 반응 온도를 결정하는바, 온도 조절 장치에 요구되는 에너지 및 시간을 감소시키는데 유리한 이점을 갖는다. 특히 바람직하게는, 효소 반응 온도가 상온인 경우, 전기화학센서는 온도 조절 장치를 포함하지 않을 수 있다. 한편, 침지 시간에 대해서는 본 개시의 방법을 통해 결정된 일정 시간 이상을 침지할 것을 설명서 등을 통해 제공하여 현장에서 사용자들의 편의를 도모할 수 있다.
이하, 본 개시의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 개시를 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 개시가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
플랫폼의 제조
도 2에 도시된 바와 같은 플랫폼의 제조를 위하여, ITO 전극 표면(24mm2)을 10mL의 Trichloroethylene 용액, 에탄올 용액, 및 DI water 각각에서 15분간 Sonication처리를 하고 난 후 Ammonium hydroxide 용액, Hydrogen peroxide, DI water를 1:1:5로 배합한 용액에 전극을 담그고 75℃의 항온조에서 1시간 30분 동안 반응시킨 후, DI water에 전극을 씻어 최종적으로 전극 표면상에 OH기를 활성화 시켰다. 100㎍/ml의 아비딘 15㎕와 상온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 소수성 상호작용을 통해 아비딘이 ITO 전극 표면 상에 물리적으로 흡착되었다. 이후, 상기 전극과 15㎕의 1% BSA(bovine serum albumin)를 4℃에서 약 24시간 동안 반응시켰다. 그리고 상기 전극과 비오틴이 부착된 ALP(10㎍/ml) 15㎕를 4℃에서 약 30분간 반응시켰다.
현장 자가진단용 전기화학센서의 효소 반응 온도의 결정
아스코르브산-2-포스페이트(AAP)를 목적 물질로 하였고, 효소로 ALP를 사용하였다. 상기 AAP를 포함하는 시료의 온도를 15℃로 조절한 후, 시료 내에 앞서 제조한 플랫폼을 작동 전극으로 하여 침지하였다. 침지 후 순환전압법을 이용하여 전압에 대한 전류값을 측정하였다. 전압은 0 내지 0.6V 사이에서 순환되었다.
50mM Tris-HCl(pH 9.6), 10mM MgCl2및 물을 이용하여 제조한 버퍼 용액에 1mM의 고형 AAP 분말을 용해시킨 것을 시료로 하여, 시료의 온도를 20℃, 25℃, 및 30℃로 각각 조절한 후, 상기와 동일한 방법으로 전압에 대한 전류값을 측정하였다. 이에 따라 구해진 순환전압전류 곡선은 도 3과 같다.
ALP를 포함하는 작동전극을 시료 내에 침지하면 ALP와 시료 내 AAP가 반응하여 아스코르브산(AA)을 생성하고, 이는 ITO 표면 상에 침적된다. 이후 상기 전극 상에 전압을 인가하면 AA가 탈수소 아스코르브산염으로 산화되면서 전류를 생성한다. 이에 측정되는 전류값이 크면 클수록 산화반응이 잘 이루어진 것인바, AA가 시료 내에 많이 생성되었음을 알 수 있고, 이는 동일한 침지 시간 동안에 특정 온도에서의 효소의 활성화가 잘 되었음을 알 수 있게 해준다.
도 3에 나타난 바와 같이, 각 온도에서의 전압에 대한 전류값을 살펴보면, 30℃, 0.34V에서 최대 전류값(Imax at 30℃ = 6.10㎂)을 가짐을 알 수 있다. 다른 온도에서 0.34V가 인가된 경우의 전류값을 살펴보면, 25℃의 경우, 최대 전류값(Imax at 30 ℃ = 6.10㎂)의 90% 이상의 전류값(I=6.09㎂)이 측정되었음을 알 수 있다. 이에 비해 15℃ 및 20℃에서의 0.34V 인가 시의 전류값(각각 I=2.51㎂, I=4.64㎂)은 최대 전류값(Imax at 30℃ = 6.10㎂)의 90% 미만인 것으로 확인되었다.
상기 측정 결과로부터 현장 자가진단용에 적합한 효소의 반응 온도는 약 25℃인 것으로 결정된다.
현장 자가진단용 전기화학센서의 침지 시간의 결정
상기 효소 반응 온도의 결정과 동일한 목적 물질, 시료, 및 효소를 사용하였다. ALP와 AAP가 반응하여 생성되는 AA는 ITO의 표면 상에 ITO의 표면이 포화 상태에 도달할 때까지 침적된다. 이를 고려하면, ITO의 표면이 포화 상태에 도달하는 최소 시간을 현장 자가진단용 전기화학센서에 요구되는 최적의 침지 시간으로 볼 수 있다. 이에, 앞서 제조된 플랫폼을 작동 전극으로 하여, 상기 작동 전극이 시료 내에 침지되는 시간을 변수로 하여, 시간대전류법을 통해 전류값의 변화를 측정하였다. 작동 전극과 상대 전극 사이에 걸어준 전압은 Ag/AgCl 기준 전극에서 0.45V의 정전압이었다.
시료 내에 작동 전극을 5초간 침지한 후, 상기 전압을 인가하였다. 시간대전류법을 통해 전류값의 변화를 약 50초간 측정하였다. 이후 전압 인가를 중단하고 다음 침지 시간동안 침지시켰다. 30초, 1분, 1분 30초, 2분, 3분, 5분, 7분에서 이를 반복하였다. 상기 시간대전류법에 따라 측정된 시간대전류 곡선은 도 4에 도시된 바와 같다.
이후 도 4의 곡선에서 각 침지 시간 별로 10~15초 구간의 전류값의 적분값을 계산하였다. 각 침지 시간별 상기 적분값은 도 5에 나타난다.
각각의 변동계수 계산값은 하기 표 1과 같다.
| 10-15s 구간에서 침지 시간별 적분값의 평균 (N=3)* |
5s | 30s | 1m | 1.5m | 2m | 3m | 5m | 7m | 평균 | 표준편차 | 변동 계수(CV) |
| 침지 시간 5s-7m | 1.47E-05 | 1.72E-05 | 1.86E-05 | 1.93E-05 | 2.01821E-05 | 2.05796E-05 | 2.06213E-05 | 2.09043E-05 | 1.90E-05 | 2.15E-06 | 11.33% |
| 침지 시간 30s-7m |
1.72E-05 | 1.86E-05 | 1.93E-05 | 2.01821E-05 | 2.05796E-05 | 2.06213E-05 | 2.09043E-05 | 1.96E-05 | 1.36E-06 | 6.91% | |
| 침지 시간 1m-7m |
1.86E-05 | 1.93E-05 | 2.01821E-05 | 2.05796E-05 | 2.06213E-05 | 2.09043E-05 | 2.00E-05 | 8.87E-07 | 4.43% | ||
| 침지 시간 1.5m-7m |
1.93E-05 | 2.01821E-05 | 2.05796E-05 | 2.06213E-05 | 2.09043E-05 | 2.03E-05 | 6.11E-07 | 3.01% | |||
| 침지 시간 2m-7m |
2.01821E-05 | 2.05796E-05 | 2.06213E-05 | 2.09043E-05 | 2.06E-05 | 2.97E-07 | 1.44% |
* 같은 방식으로 제조된 3개의 전극 플랫폼을 이용하여 그 전류의 평균값들을 이용함.
여기서 침지 시간이 2분 이상인 경우의 적분값들의 변동계수는 2% 이하인 것으로 확인된다.
이와 달리, 침지 시간이 1분 30초 이상인 경우의 적분값들의 변동계수는 2%를 초과한다. 이에, 목적 물질이 AAP고 효소가 ALP인 경우의 현장 자가진단용 전기화학센서의 침지 시간은 약 2분이 바람직한 것으로 결정된다.
이상으로 본 개시의 바람직한 실시예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 개시는 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 개시의 요지를 벗어남이 없이 당해 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형 실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형 실시들은 본 개시의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안될 것이다.
Claims (12)
- 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법으로서, 상기 센서는 작동 전극의 표면 상에 고정되는 효소를 포함하며,
시료의 온도를 하기의 방법으로 결정되는 일정 온도(T)로 제어하는 단계;
상기 시료 내에 작동 전극을 일정 시간(t) 이상 침지하는 단계;
상기 침지된 작동 전극에 산화환원 전압을 인가하는 단계; 및
상기 전압에 대응하여 측정되는 전류값으로부터 시료 내 목적 물질의 농도를 계산하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 일정 온도(T)는,
(i) 목적 물질이 포함된 시료 및 상기 목적 물질과 반응하는 효소가 고정된 작동 전극을 포함하는 전기화학 센서를 준비하는 단계;
(ii) 상기 작동 전극을 10℃≤T1,T2,...,Tn≤100℃인 상이한 온도(T1,T2,...,Tn)로 조절된 시료에 침지한 후, 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법을 통해 각각의 온도에서 전압에 대한 전류값을 측정하는 단계;
(iii) 상기 측정된 전류값 중 최대값인 최대 전류값(Imax), 이에 대응하는 전압(VCV)을 결정하는 단계; 및
(iv) 상기 결정된 전압(VCV)과 동일한 전압에서 상기 최대 전류값(Imax)의 90% 이상인 전류값(Icv)를 갖는 온도(T)를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 결정되는 온도(T)는 │온도(T) - 20│이 최소값을 갖는 온도인 온도 결정 방법으로 결정되는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 일정 시간(t)는,
(가) 목적 물질이 포함된 시료 및 상기 목적 물질과 반응하는 효소가 고정된 작동 전극을 포함하는 전기화학 센서를 준비하는 단계;
(나) 상기 전극을 15초 ≤t1,t2,...,tm ≤60분인 상이한 시간(t1,t2,...,tm) 동안 시료에 침지한 후, 시간대전류(Chronoamperometry, CA)법을 통해 각각의 침지 시간에 대하여 전압 공급 시간에 대한 전류값을 측정하는 단계;
(다) 상기 측정된 시간에 대한 전류값의 데이터를 이용하여 전압이 인가된 후 10초부터 15초까지의 전류값의 적분값을 각각의 침지 시간에 대하여 계산하는 단계;
(라) 상기 계산된 적분값들 중 침지 시간이 상기 시간(t) 이상인 경우의 적분값들의 변동 계수가 2% 이내인 최소 시간(t)을 결정하는 단계를 포함하는 침지 시간 결정 방법으로 결정되는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
시료는 인체로부터 얻어진 체액인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 목적 물질은 항원, 항체, 단백질, 면역 분자, DNA, 및 RNA로 이루어진 군으로 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 효소는 목적 물질을 산화/환원 반응 가능한 효소 반응 생성물로 전환시킬 수 있는 효소인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단을 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 글루코스 옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라이제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)의 군으로부터 선택되는 1종의 효소인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 작동 전극은 ITO(Indium Tin Oxide)인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 효소는 작동 전극의 표면 상에 연결 화합물을 통해 고정되는 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 n은 3≤ n ≤ 20인 정수인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 2에 있어서,
m은 3≤ m ≤ 15인 정수인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 2에 있어서,
상기 단계 (나)에서 전압 공급 시간은 40 내지 60초인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 인가되는 산화환원 전압은 정전압 또는 순환전압인 것을 특징으로 하는 현장 자가진단용 전기화학센서를 이용한 시료 내 목적 물질의 농도를 측정하는 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210078001A (ko) | 2019-12-18 | 2021-06-28 | 한국전자기술연구원 | 현장 자가 진단을 위한 비표지 전기화학센싱 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20190056821A (ko) | 2019-05-27 |
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