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KR101989054B1 - 지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기 - Google Patents

지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기 Download PDF

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KR101989054B1
KR101989054B1 KR1020180127183A KR20180127183A KR101989054B1 KR 101989054 B1 KR101989054 B1 KR 101989054B1 KR 1020180127183 A KR1020180127183 A KR 1020180127183A KR 20180127183 A KR20180127183 A KR 20180127183A KR 101989054 B1 KR101989054 B1 KR 101989054B1
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Abstract

본 발명은 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기에 대한 것으로, 상기 지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기는 단순한 사용방법으로 시각을 다투는 출혈 환자에 적용할 수 있으며, 독성이 없으며 혈액의 감염에 대한 문제점이 없으면서 생체분해속도가 빠르고, 지혈효과가 우수하여, 지혈제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기{HEMOSTATIC AGENT AND CONTAINER CONTAINING THE SAME}
본 발명은 지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기에 대한 것이다.
실란트(Sealant)와 지혈제(hemostats)를 포함하는 조직 접착제 분야의 연구개발은 빠르게 성장하고 있다. 1998년 미국 FDA에서 피브린 실란트(Fibrin sealant)가 허가되면서, 매년 새로운 조직 접착제들이 끊임없이 개발되고 있다. 이러한 조직 접착제는 기존에 외과적 또는 내과적 수술에서 사용되고 있는 봉합술, 클립술, 뜸술과 같은 기술을 대체할 수 있는 소재로 각광을 받고 있다.
봉합술 등과 같은 기존의 외과적인 기술은 강한 신장력(strong tensile strength)를 가지지만, 환자의 고통 유발 및 시술 후 제거 등의 문제를 가지고 있다. 반면, 조직 접착제는 빠른 접착시간, 간편한 사용, 시술 후 제거 불필요 등 수 많은 장점을 가지고 있지만 낮은 접착성 및 신장력(low adhesiveness and tensile strength)과 수분이 존재하는 경우 접착성이 현저히 떨어지는 제한점을 가지고 있다. 이러한 조직 접착제의 한계점을 극복하기 위한 연구가 지속되고 있다.
조직 접착제는 조직에 직접 접촉하므로 생체적합성이 요구된다. 또한, 의료용 접착제의 경우에는 통상적으로 생체 내에서 사용되기 때문에 접착이 본질적으로 체액과 혈액 중으로 흘러 들어가면 생체가 직접 관여하므로, 보다 엄격한 조건으로 독성과 위해성이 없어야 하고, 보다 엄밀한 생체 적합성과 생분해성 소재가 요구된다.
현재 상용화 및/또는 실용화되고 있는 조직 접착제는 크게 시아노아크릴레이트 순간 접착제, 피브린 글루, 젤라틴 글루 및 폴리우레탄계 등이 있다. 시아노아크릴레이트 순간 접착제는 최근 들어 고기능성 및 고성능을 갖는 순간 접착제의 연구에서 각광을 받고 있다. 특히, 생체적합성, 유연성 및 저독성의 생체 조직봉합용 의료용 순간 접착제는 지혈, 항균 효과뿐만 아니라 봉합사의 대체도 가능하기 때문에 선진국을 중심으로 연구가 활발히 진행되고 있다.
이러한 시아노아크릴레이트 계열 조직 접착제는 현재 더마본드(Dermabond; Johnson&Johnson)와 인더밀 (Indermil; US Surgical) 등의 제품으로 상용화되어 있다. 이러한 시아노아크릴레이트 계열 조직 접착제는 단일 물질로 짧은 시간에 실온에서 개시제 없이 수분에 의해서 경화되고 외관이 투명하고 접착강도가 큰 장점이 있지만, 충격에 약하고 내열성이 떨어지는 단점을 가지고 있다. 또한, 독성이 심해서 현재는 거의 사용되지 않으며 미국을 제외한 다른 국가에서 임상에서 부분적으로 사용하고 있지만 일부 조직 독성과 취약성 때문에 사용이 제한되고 있다.
또, 피브린 글루 접착제는 최초 1998년 미국 FDA에 의하여 심장외과에 응용이 허가되었다. 그 이후, 피브린 조직 접착제에 대한 연구 개발이 활발하게 이루어졌으며, 현재 Tisseel VH (Baxer)와 Evicel TM(Johnson&Johnson) 등과 같은 제품들이 상용화되어 있다. 피브린계 조직 접착제는 시아노아크릴레이트 계열과 함께 조직 접착제 시장의 대부분을 차지하고 있다. 피브린 조직 접착제는 피브린의 가교 반응을 이용하여 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘 및 선용 효소의 저해제를 조직 접착제로서 말초신경의 봉합, 미소 혈관의 봉합 등에 적용하여 봉합의 대용 또는 보강을 위한 임상 응용이 실시되고 있다. 이러한 피브린 글루 접착제는 접착부위의 수분에 영향을 받지 않고 빠르게 접착하고 혈소판과 응고장해가 없고 생체적합성이 우수한 장점을 가지고 있다. 하지만, 접착력이 약하고 생분해속도가 빠르며 혈액의 감염의 위험이 있는 제한점을 가지고 있다.
또, 젤라틴 글루는 생체 유래의 조직 접착제로 젤라틴-레조르시놀-포르말린(GRF)으로 가교시킨 것이 개발되었다. 그 외에서 젤라틴-글루타알데하이드와 같은 조직접착제가 개발되었으나, 조직 접착성은 높지만, 가교제로 사용되는 포르말린이나 글루타알데하이드이 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으키는 단점을 가지고 있다.
또, 폴리우레탄계 접착제는 경화 후 접합부의 유연성이 유지되는 탄성 접착제 형태로 개발되었다. 이 접착제는 생체 조직 표면의 물을 흡수하여 조직과의 밀착성을 높이고, 물과 반응하여 수분 이내에 경화하며, 경화물이 유연성을 가지는 것이 특징이며, 경화된 접착제가 적절히 생분해되는 장점을 가지고 있다. 하지만, 합성원료인 방향족 디아이소시아네이트가 생체 독성이 있다는 단점을 가지고 있다.
또, 'Avitene'(Alcon), 'Helitene'(두하메드)과 같이 콜라겐 단독 성분의 지혈제들은 비 혈액제제이나 매우 고가이고 단독성분으로서 조직접착효과가 없기 때문에 지혈제로서만 사용하고 있다.
또 다른 종래기술로 "Fibrin monomer based tissue adhesive, US Patent 5464471, 1995", "Hemostatic and tissue adhesive, US Patent 5883078, 1999", "Fibrinogen/chitosan hemostatic agents, US Patent 5773033, 1998", "Therapeu tic fibrinogen compositions, US Patent 5605887, 1997" 등이 소개되고 있지만 이들은 접착성 지혈제의 제품에 피브리노겐, 트롬빈, 혈액응고제, 아프로티닌 등의 혈액제제 및 소유래 단백질 등을 사용함으로써 이때 야기될 수 있는 특정질환의 감염 우려 및 원료확보, 저장, 제조과정 등에 소요되는 과다한 비용으로 제품가격이 고가인 문제점이 있다.
또한, 젤라틴 매트릭스 성분을 포함한 Floseal(Baxter)은 가장 많이 사용되고 있는 제품으로, 젤라틴 매트릭스에 염화칼슘 용액에 혼합된 트롬빈을 가하여 지혈효과를 나타내는 제품이다. 이는 특히 눈 이외의 부위에 대한 여러 영역의 외과적 수술 시, 결찰(ligature) 또는 일반적인 절차로 효과적으로 조절되지 않거나 조절이 불가능한 출혈에 사용할 수 있다. 다만, 이는 트롬빈, 젤라틴, 염화칼슘 용액으로 크게 3개로 분리되어 있으며, 이의 각 용액을 한 번에 혼합하는 것이 아닌 2 step으로 나누어 혼합하여야 하므로 다소 시간 소요된다. 따라서, 외과적 수술 시, 심각한 결찰 및 출혈이 일어나는 시초를 다툴 정도로 급박한 상태에서는 복잡한 제품의 지시서에 따라 혼합할 여유가 없고, 순차적으로 진행시키는 과정은 시각을 다투는 출혈 환자의 생명을 위협할 수 있으며, 사용자에게 매우 번거로운 문제가 있다.
또한, 상기와 같은 지혈용 제품은 사람에게 적용되므로 최종 생성물 및 그의 성분의 품질에 대한 최고의 안전기준, 저장 안정성 및 단순한 사용방법을 제공하여만 한다. 특히, 2 종 이상의 성분을 혼합하여 사용하는 경우에는 "사용 준비가 된(ready-to-use)" 형태로 만들어야 하며, 혼합이 용이한 상태로 제공해야 한다.
이로써, 독성이 매우 적으며 저장 및 취급이 용이하고, 사용방법이 단순하여 시각을 다투는 출혈 환자에 적용할 수 있으며, 생체분해성이 뛰어난 지혈제 개발이 필요하다.
미국특허등록 5464471호 미국특허등록 5773033호 미국특허등록 5605887호
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 콜라겐, 안정화제, 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기를 개발하여, 단순한 사용방법으로 시각을 다투는 출혈 환자에 적용할 수 있으며, 독성이 없으며 혈액의 감염에 대한 문제점이 없으면서 생체분해속도가 빠르고, 지혈효과가 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 콜라겐, 안정화제, 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 지혈용 조성물이 채워진 제1 용기 및 희석액이 채워진 제2 용기를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 지혈용 키트를 이용하여 제조된 하이드로겔을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따르면 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물이되, 상기 콜라겐과 트롬빈 사이에 안정화제가 배치되어 콜라겐과 트롬빈이 서로 분리된 지혈용 조성물을 제공한다.
상기 콜라겐은 가교된 콜라겐일 수 있다.
상기 가교된 콜라겐은
S1) 콜라겐을 에탄올 또는 메탄올에 처리하는 단계;
S2) 상기 S1) 단계에서 처리된 콜라겐에 산을 첨가하여 pH 2~4의 콜라겐 용액으로 제조하는 단계;
S3) 상기 S2) 단계로부터 제조된 콜라겐 용액을 중성상태로 만든 후 원심분리하여 에스테르화 콜라겐을 제조하는 단계;
S4) 상기 S3) 단계로부터 제조된 에스테르화 콜라겐에 가교제를 첨가하여 가교된 콜라겐을 제조하는 단계; 및
S5) 상기 S4) 단계로부터 제조된 가교된 콜라겐을 정제수에 분산시킨 후 동결건조 시키는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 가교된 콜라겐의 분자량은 100,000 내지 1,000,000 Dalton 일 수 있다.
상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 콜라겐이 40 내지 97 중량%으로 포함될 수 있다.
상기 안정화제는 알부민(human serum albumin), 만니톨, 아세트산나트륨(C2H3NaO2), 수크로스, 트레할로스, 소르비톨 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 안정화제는 만니톨일 수 있다.
상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 안정화제가 1 내지 30 중량%으로 포함될 수 있다.
상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 트롬빈이 2 내지 50 중량%으로 포함될 수 있다.
상기 지혈용 조성물은 분말제 형태일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 지혈용 조성물을 포함하는 용기를 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물이 채워진 제1 용기; 및 희석액이 채워진 제2 용기를 포함하는 지혈용 키트이되, 상기 제1 용기는 콜라겐과 트롬빈 사이에 안정화제가 배치되어 콜라겐과 트롬빈이 서로 분리된 지혈용 키트를 제공한다.
상기 희석액은 정제수, 염화칼슘(CaCl2) 용액, 염화나트륨(NaCl) 용액, 사람 혈청 알부민(human serum albumin), 및 아세트산나트륨(C2H3NaO2) 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
이때, 바람직하게 상기 희석액은 염화칼슘 용액이고, 상기 희석액의 총 중량에 대하여, 상기 염화칼슘이 0.001 내지 30 중량%로 포함될 수 있다.
상기 지혈용 키트는 제1 용기와 제2 용기가 서로 결합하여 지혈용 조성물과 희석액이 혼합되어 하이드로겔을 형성할 수 있다.
상기 하이드로겔의 평균기공 사이즈는 50㎛ 내지 200㎛일 수 있다.
상기 하이드로겔의 pH는 6 내지 8일 수 있다.
상기 제1 용기에 트롬빈, 안정화제, 콜라겐 순으로 채워질 수 있다.
상기 지혈용 키트의 지혈용 조성물은 앞서 서술한 바와 동일하므로, 이하 생략한다.
본 발명의 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물은 지혈효과가 우수하다.
또한, 본 발명의 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물을 포함하는 용기는 빠르고 간편하게 사용할 수 있으며, 독성이 없고 혈액의 감염에 대한 문제점이 없으면서 생체분해속도가 빠르며, 혈액과 접촉시 팽창되고 이의 팽창율이 크므로 지혈효과가 우수하다.
따라서, 본 발명의 지혈용 조성물 및 이를 포함하는 용기는 지혈 키트로 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 2, 실시예 4 및 비교예 1를 염화칼슘 용액과 혼합하여 만들어진 각 하이드로겔에 대한 SEM 이미지이다.
도 2는 가교된 콜라겐 및 가교된 젤라틴에 대한 각각의 팽창속도를 측정하여 얻은 그래프이다.
도 3은 실시예 2 및 비교예 1을 토끼 장간막 절단 모델에 각각 처리하여 지혈 성공율(왼쪽)과 지혈에 걸리는 시간(오른쪽)을 측정하여 얻은 그래프이다.
도 4는 실시예 2 및 비교예 1을 돼지 상대정맥 손상 모델에 각각 처리한 후 H&E 염색하여 얻은 조직의 이미지이다.
본 발명은 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물이되, 상기 콜라겐과 트롬빈 사이에 안정화제가 배치되어 콜라겐과 트롬빈이 서로 분리된 지혈용 조성물을 제공한다.
상기 콜라겐은 지혈용 조성물에 포함되며, 출혈 부위의 혈액을 흡수하며 혈소판을 끌어당기어 지혈효과를 일으킬 수 있다. 또한 상기 콜라겐은 혈소판과 부착될때에는 아무 것도 없는 상태에서 결합되는 것이 아니라 접착제와 같은 작용을 하는 물질인 vWF(von Willebrand's factor)와 결합하여 혈소판의 세포 표면상에 존재하는 막당단백인 GPIb/IX 복합체와 결합을 촉진시켜 1차 지혈을 수행할 수 있다.
상기 콜라겐은 각종 동물의 조직을 산 또는 알칼리 처리를 하거나, 펩신 등의 효소를 처리하여 추출되는 단백질일 수 있다.
상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 콜라겐이 40 내지 97 중량%로 포함될 수 있다. 이때, 40 중량% 미만으로 포함될 경우 지혈효과가 매우 떨어질 수 있으며, 97 중량% 초과하여 포함될 경우 상대적으로 상기 트롬빈 및 안정화제가 적게 포함되게 되어 전체 지혈용 조성물의 화학안정성이 떨어지거나 지혈효과가 낮아질 수 있다.
또한, 상기 콜라겐은 가교된 콜라겐일 수 있으며, 이때 가교된 콜라겐은 분자량이 100,000 내지 1,000,000 Dalton 것이 바람직하나, 이에 제한하지 않는다. 상기 가교된 콜라겐의 분자량이 100,000 Dalton 미만일 경우에는 혈액 흡수력은 빠르나 혈액응고가 늦어져 지혈효과가 떨어질 수 있고, 1,000,000 Dalton 초과할 경우에는 혈액 흡수력이 현저히 떨어질 수 있다.
상기 가교된 콜라겐은 화학적 가교법, 물리적 가교법, 또는 이들의 조합에 의한 방법으로 제조될 수 있으며, 이때 화학적 가교법에 의한 가교된 콜라겐은 가교제를 이용하여 자가 가교결합(crosslinking)된 콜라겐이다. 한편 물리적 가교법에 의한 가교된 콜라겐은 건열 처리, 자외선 조사, 감마선 조사로 인하여 가교된 콜라겐이다.
여기서, 상기 가교제는 Formaldehyde, Glutaraldehyde, Carbodiimides(EDC), Polyepoxy compounds으로 이루어진 군에서 선택된 어느 1종이상의 가교제일 수 있다. 바람직하게는 Carbodiimides(EDC)이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 가교된 콜라겐은 기계적 강도가 우수하여 물리적 압박지혈 효과를 나타낼 수 있어 다량의 출혈을 지혈시킬 수 있다.
상기 가교된 콜라겐은 에스테르화된 콜라겐을 가교하여 얻은 콜라겐일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 가교된 콜라겐은
S1) 콜라겐을 에탄올 또는 메탄올에 처리하는 단계;
S2) 상기 S1) 단계에서 처리된 콜라겐에 산을 첨가하여 pH 2~4의 콜라겐 용액으로 제조하는 단계;
S3) 상기 S2) 단계로부터 제조된 콜라겐 용액을 중성상태로 만든 후 원심분리하여 에스테르화 콜라겐을 제조하는 단계;
S4) 상기 S3) 단계로부터 제조된 에스테르화 콜라겐에 가교제를 첨가하여 가교된 콜라겐을 제조하는 단계; 및
S5) 상기 S4) 단계로부터 제조된 가교된 콜라겐을 정제수에 분산시킨 후 동결건조 시키는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 S1) 단계는 콜라겐을 에탄올 또는 메탄올에 처리하는 단계로 콜라겐을 에탄올 또는 메탄올에 용해하여 추후 가교제를 혼합할 시 용이하게 하기위한 단계이며, 콜라겐 용액을 제조하는 단계이다.
상기 S1) 단계 이전에, 콜라겐을 동물 피부조직을 산성 용액에 처리하여 아텔로 콜라겐을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 S2) 단계는 상기 S1) 단계에서 처리된 콜라겐에 산을 첨가하여 pH 2~4의 콜라겐 용액으로 제조하는 단계로, 콜라겐 용액에 산을 첨가하여 콜라겐을 완전히 에탄올 또는 메탄올에 용해된 상태를 만들기 위한 단계이다.
상기 S3) 단계는 상기 S2) 단계로부터 제조된 콜라겐 용액을 중성상태로 만든 후 원심분리하여 에스테르화 콜라겐을 제조하는 단계로, 콜라겐의 양쪽 말단에 있는 약 12~27개의 아미노산으로 구성된 비나선 구조인 텔로펩타이드(telopeptide)를 제거하고, 상기 텔로펩타이드가 제거된 부분을 에스테르화 시키는 단계이다. 여기서, 텔로펩타이드는 생체 내 콜라겐이 투입되었을 때 면역반응을 일으키는 주된 원인으로 알려져 있으며, 이에 따라 의약품 등의 원료로 사용 시 면역반응을 피하기 위하여 텔로펩타이드를 제거하여 아텔로 콜라겐 또는 에스테르화 콜라겐을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 S3) 단계는 중성상태로 만들어진 콜라겐 용액에 펩신효소를 처리하여 텔로펩타이드가 제거되고 에스테르 작용기를 갖는 에스테르화 콜라겐을 1차적으로 만든 다음 원심분리를 이용하여 고순도의 에스테르화 콜라겐을 분리시키는 단계일 수 있다.
이때, 상기 원심분리는 에스테르화 콜라겐만 침삭될 수 있도록 1000rpm 내지 30,000rpm 으로, 5분 내지 3시간 동안 수행하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 상기 고순도의 에스테르화 콜라겐을 분리하는 방법은
(a) 텔로펩타이드가 제거된 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 용기 내에 준비하는 단계와
(b) 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에 압력을 인가하여 상기 시료가 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되도록 하는 한외여과 과 정을 수행하는 단계와,
(c) 상기 한외여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 에스테르화 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,
(d) 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되는 에스테르화 콜라겐 용액의 유량을 측정하여 한외여과 속도를 결정하는 단계와,
(e) 상기 한외여과 속도가 일정한 속도 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지하는 단계와,
(f) 상기 시료 중 상기 여과 멤브레인을 통과하지 못하고 상기 용기로 복귀되는 잔류물에 물을 첨가한 후 이를 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시켜 정용여과 과정을 수행하는 단계와,
(g) 상기 정용여과 과정을 통해 상기 여과 멤브레인을 통과하면서 여과되어 상기 여과모듈로부터 유출되는 에스테르화 콜라겐 용액을 수집하는 단계와,
(h) 상기 (f) 단계와 상기 (g) 단계를 반복하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 펌프에 의한 펌핑 작용에 의해 상기 아텔로 콜라겐을 포함하는 시료를 상기 용기로부터 상기 여과 멤브레인이 구비된 여과모듈로 유입시키고, 상기 여과모듈에는 약 10~30psi의 압력을 인가할 수 있다.
상기 (e) 단계에서 상기 한외여과 속도가 약 1g/분 이하로 감소되면 상기 한외여과 과정을 중지시킬 수 있다.
상기 (f) 단계에서 상기 용기로 복귀되는 잔류물에는 한외여과 과정을 통해 여과된 용액과 동일한 양의 정제수를 첨가할 수 있다.
상기 (f) 단계 및 (g) 단계에서의 정용여과 과정은 적어도 5회 수행하는 것이 바람직하다.
이에 따라, 상기 (a) 내지 (h) 단계를 통해 아텔로 콜라겐을 에스테르화시키면서, 고순도의 에스테르화 콜라겐을 얻을 수 있다.
한편, 상기 S4) 단계는 상기 S3) 단계로부터 제조된 에스테르화 콜라겐에 가교제를 첨가하여 가교된 콜라겐을 제조하는 단계로 에스테르화 콜라겐을 가교시켜 물리적 압박지혈 효과를 나타낼 수 있으면서 면역반응을 일으키지 않는 가교된 콜라겐을 제공하기 위한 단계이다.
또한, 상기 S4) 단계에서의 가교제는 앞서 서술한 바와 같이 Formaldehyde, Glutaraldehyde, Carbodiimides(EDC), Polyepoxy compounds으로 이루어진 군에서 선택된 어느 1종이상의 가교제일 수 있으며, 이하 상세한 설명은 생략한다.
상기 S5) 단계는 상기 S4) 단계로부터 제조된 가교된 콜라겐을 정제수에 분산시킨 후 동결건조 시키는 단계로, 가교된 콜라겐에 남아있는 가교제 및 텔로펩타이드가 제거되지 않은 콜라겐을 제거하기 위한 단계이다. 이에 상기 S5) 단계는 상기 S4) 단계로부터 제조된 가교된 콜라겐을 정제수에 분산시킴으로써 미량의 가교제 및 텔로펩타이드가 제거되지 않은 콜라겐을 정제수에 용해시키고 동결건조를 통해 정제수에 용해된 채로 동결되어 제거될 수 있다. 또한, 이때 동결건조는 해당 기술분야에서 사용되는 통상적인 방법일 수 있다.
상기 안정화제는 지혈용 조성물에 포함되어 상기 콜라겐과 트롬빈이 서로 혼합되지 않도록 하기 위해 상기 콜라겐과 트롬빈의 단백질을 사이에 두어 이들 단백질의 고유 특성을 유지시킨다. 따라서, 상기 안정화제가 지혈용 조성물에 포함됨으로써, 강한 지혈효과를 갖는 콜라겐과 트롬빈을 분리시킬 뿐만 아니라 비활성 물질로 지혈용 조성물의 화학안정성 및 생물학적 활성을 유지하는 것을 보장할 수 있다.
상기 안정화제는 알부민(human serum albumin), 만니톨, 아세트산나트륨(C2H3NaO2), 수크로스, 트레할로스, 소르비톨 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
이때, 상기 안정화제는 알부민, 만니톨 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상을 포함함으로써, 트롬빈의 화학적 안정성 및 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
또한, 상기 안정화제는 만니톨, 수크로스, 트라할로스, 소르비톨 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함함으로써, 지혈시간의 연장을 억제하고 혈액 응고 활성을 유지시킬 수 있다.
상기 안정화제는 바람직하게는 만니톨이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 만니톨은 버섯·석류의 뿌리 등 식물에 광범위하게 존재하는 백색의 침상(針狀) 또는 주상(柱狀)의 결정으로, 물에 잘 녹으며 완하제로 사용되기도 하며, 글리세롤의 대체제롤 사용된다.
상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 안정화제가 1 내지 30 중량%로 포함될 수 있다. 이때, 1 중량% 미만으로 포함될 경우 상기 콜라겐과 트롬빈을 분리하기 어려워 화학안정성이 떨어질 수 있으며, 30 중량% 초과하여 포함될 경우 상대적으로 상기 콜라겐 및 트롬빈이 적게 포함되게 되어 전체 지혈용 조성물의 지혈효과가 낮아질 수 있다.
상기 트롬빈은 지혈용 조성물에 포함되고 이는 강력한 지혈인자로써 혈액응고에 관여하여 혈액속의 가용성 피브리노겐을 가수분해하여 불용성의 피브린으로 변화시키는 반응에 있어 촉매역할을 한다. 또한, 상기 트롬빈은 2차 지혈과정인 혈액 응고인자의 활성화에 의해 섬유소가 형성되는 과정에 있어서 혈소판 활성화를 유도할 수 있다.
상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 트롬빈이 2 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 이때, 3 중량% 미만으로 포함될 경우 지혈효과가 매우 떨어질 수 있으며, 50 중량% 초과하여 포함될 경우 상대적으로 상기 콜라겐 및 안정화제가 적게 포함되게 되어 전체 지혈용 조성물의 화학안정성이 떨어지거나 지혈효과가 낮아질 수 있다.
상기 지혈용 조성물은 분말제 형태일 수 있으며, 이에 건조된 분말제 형태인 지혈용 조성물은 외부 환경 및 수분에 의하여 쉽게 액체상태로 변질되지 않도록 제조된 분말제 형태인 것이 바람직하다. 상기 지혈용 조성물은 분말제 형태로써, 각 성분에 의하여 화학안정성을 가질 수 있으며 서로 혼합되지 않은 상태로 유지시키는 것이 용이할 수 있다. 또한, 취급 및 보관이 편리한 장점을 가진다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 지혈용 조성물을 포함하는 용기를 제공할 수 있다.
이때, 상기 지혈용 조성물을 포함하는 용기는 지혈효과를 갖는 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈 모두 채워진 상태이므로, 사용방법이 매우 단순하여 시각을 다투는 출혈 환자에 적용할 수 있는 장점을 가질 수 있다. 특히, 외과적 수술 시 심각한 결찰 및 출혈이 일어나는 급박한 상태, 시초를 다투는 상태에서 오직 희석액과 혼합하여 바로 출혈부위에 적용할 수 있으므로 사용자의 편리성을 물론이고 전문적인 기술자가 아니더라도 손쉽게 이용할 수 있을 정도로 매우 사용방법이 매우 단순한 장점을 가진다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 지혈용 조성물이 채워진 제1 용기; 및 희석액이 채워진 제2 용기를 포함하는 지혈용 키트이되, 상기 제1 용기는 콜라겐과 트롬빈 사이에 안정화제가 배치되어 콜라겐과 트롬빈이 서로 분리된 지혈용 키트를 제공한다.
상기 지혈용 키트는 앞서 서술한 지혈용 조성물을 이용하고 있으므로, 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈 역시 동일하므로, 이하 상세한 설명은 생략한다.
상기 제1 용기는 지혈용 조성물이 채워져 있으며, 콜라겐과 트롬빈 사이에 안정화제가 채워져 있는 것으로, 외부 물리적 힘에 의해 배치된 순서가 바뀌지 않도록 한다. 또한, 상기 제1 용기에 채워진 콜라겐, 안정화제, 트롬빈이 배치된 순서에 따라 추후 희석액과 혼합되어 가지는 흐름성(flowability)이 달라질 뿐만 아니라 팽창률 및 팽창속도가 달라질 수 있다. 이에 따라, 상기 제1 용기는 콜라겐, 안정화제, 트롬빈 또는 트롬빈, 안정화제, 콜라겐 순서대로 채워지는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 트롬빈, 안정화제, 콜라겐의 순서이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제2 용기는 희석액이 채워져 있으며, 이때 희석액은 상기 제1 용기의 지혈용 조성물을 용해하거나 분산시키기 위한 것으로 용매 또는 분산매로 사용될 수 있다. 예로, 정제수, 염화칼슘(CaCl2) 용액, 염화나트륨(NaCl) 용액, 사람 혈청 알부민(human serum albumin), 및 아세트산나트륨(C2H3NaO2) 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 염화칼슘 용액 또는 염화나트륨 용액이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 희석액이 염화칼슘 용액일 경우, 상기 희석액의 총 중량에 대하여, 상기 염화칼슘이 0.001 내지 30 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 지혈용 조성물과 혼합이 잘 이루어지는 범위의 중량%라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 제1 용기 또는 제2 용기의 모양 및 소재는 특별히 제한하지 않으며, 의약 및 바이오 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 예로, 상기 제1 용기 또는 제2 용기의 모양은 주사기이며, 상기 제1 용기 또는 제2 용기의 소재는 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈 중 선택된 어느 하나와 화학반응을 일으키지 않는 소재이다.
한편, 상기 지혈용 키트는 제1 용기와 제2 용기가 서로 결합하여 지혈용 조성물과 희석액이 혼합되어 하이드로겔을 형성할 수 있다.
상기 제1 용기와 제2 용기가 서로 결합할 수 있도록 제1 용기의 전단부에는 체결돌기를 포함하고, 제2 용기는 제1 용기의 전단부에 있는 체결돌기와 결합하도록 체결홈을 포함할 수 있다.
또한, 상기 하이드로겔은 다공성이며, 이로써 지혈제로 사용시 혈액 흡수율이 높고, 혈액을 흡수한 후에도 하이드로겔의 형태가 유지되어 지혈효과가 떨어지지 않아 우수한 지혈효과를 나타낼 수 있다.
또한, 상기 하이드로겔의 평균기공 사이즈는 50㎛ 내지 200㎛일 수 있다. 평균기공 사이즈가 50㎛ 미만이면 혈액 흡수율이 줄어들고, 200㎛를 초과하면 혈액을 흡수한 후 하이드로겔의 형태가 유지되지 못하여 지혈효과가 떨어질 수 있다.
또한, 상기 하이드로겔 형성시간은 5초 내지 5분으로 시초를 다툴 정도로 급박한 상태에 심각한 결찰 및 출혈을 막을 수 있다. 또한, 짧은 시간내에 하이드로겔을 형성함으로써, 사용자가 손쉽게 사용할 수 있다.
상기 하이드로겔은 지혈용 조성물과 희석액이 혼합되어 중성상태의 pH를 짐으로써, 상기 하이드로겔을 생체에 적용시 생체적합성 및 생체안전성을 확보할 수 있다. 더불어 독성이 적고 감염안전성을 가질 수 있다. 이에따라 상기 하이드로겔의 pH는 6 내지 8일 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
제조예 1: 에스테르화 콜라겐 분말 제조
하기 과정을 통해 에스테르화 콜라겐 분말을 제조하였다.
① 에탄올에 콜라겐을 첨가한 후 냉장상태에서 교반하였다.
② 0.5M HCl을 이용하여 시료의 pH를 6.7±0.3으로 조정하였다.
③ 위의 용액을 dialysis tubing에 넣고 정제수를 이용하여 투석을 시행하였다.
④ 위의 용액을 동결 및 동결건조하여 에스테르화 콜라겐 분말을 얻었다.
제조예 2: 가교된 콜라겐 분말 제조
하기 과정을 통해 가교된 콜라겐 분말을 제조하였다.
① 상기 제조예 1로부터 제조된 에스테르화 콜라겐을 정제수에 넣고 교반하였다.
② 충분히 섞인 에스테르화 콜라겐 용액에 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)를 넣어줬다.
③ EDC가 에스테르화 콜라겐과 충분히 반응할 수 있게 잘 섞어줬다.
④ 냉장상태에서 2~3일 방치하였다.
⑤ 가교화되어 굳어진 가교된 콜라겐 용액을 정제수에 넣고 분산시켰다.
⑥ 상기 가교된 콜라겐 용액을 방치하여 층분리가 일어났을 때, 가교된 콜라겐만 취하고 용액은 버렸다.
⑦ 상기 ⑥의 과정을 3~5회 반복하여 가교된 콜라겐만 얻었다.
⑧ Buffer(sodium phosphate/sodium chloride)에 가교된 콜라겐을 넣고 냉장에서 1~2일 방치하여 Buffer 중화시켰다.
⑨ Buffer 중화 후 정제수에 세척하고 콜라겐을 동결 및 동결건조 하였다.
⑩ 동결건조가 끝난 위의 시료를 blender에 넣고 갈았다.
⑪ 위의 파우더를 체에 걸러 200~355㎛ 크기의 입자를 선별하였다.
제조예 3: 가교된 젤라틴
에스테르화 콜라겐 분말 대신 시중에 지혈제로 판매되는 젤라틴 분말(FloSeal Hemostatic Matirx, Baxter A.G., 미국)을 이용하여 가교된 젤라틴을 얻었다.
실험예 1: 흐름성( Flowability ) 확인
지혈용 조성물 내 콜라겐, 만니톨, 트롬빈이 배치된 순서에 따라, 희석액인 염화칼슘 용액(농도)과 혼합 시 흐름성의 차이를 확인하기 위한 것으로, 하기 표 1과 같이 실시예를 준비하였다. 이때, 만니톨 및 트롬빈은 파우더타입으로 시중에서 판매되는 제품을 사용하였으며, 에스테르화 콜라겐은 상기 제조예 1로부터 얻어진 것을 사용하였으며, 가교된 콜라겐은 상기 제조예 2로부터 얻어진 것을 사용하였다. 또한, 흐름성 비교분석을 위해 상기 제조예 3로부터 얻어진 가교된 젤라틴을 사용하였다.
구분 배치순서
실시예 1 가교된 콜라겐 - 만니톨 - 트롬빈
실시예 2 트롬빈 - 만니톨 - 가교된 콜라겐
실시예 3 에스테르화 콜라겐 - 만니톨 - 트롬빈
실시예 4 트롬빈 - 만니톨 - 에스테르화 콜라겐
비교예 1 트롬빈-만니톨-가교된 젤라틴
상기 표 1과 같이 준비된 실시예 1 내지 4 및 비교예 1은 하기 방법을 통해 혼합시 필요한 힘을 측정하여 이의 결과를 표 2에 나타냈다.
1) 두 개의 시린지를 준비하고, 하나의 시린지는 상기 실시예 1 내지 4 또는 비교예 1를 상기 표 1와 같은 배치순서로 충진하고, 나머지 하나의 시린지는 염화칼슘 용액을 충진하였다.
2) 두 개의 시린지를 연결하였다(통 끝을 서로 돌려 끼워 결합).
3) 기계를 이용하여 실시예 1 내지 4 또는 비교예 1이 충진되어 있는 시린지(male type)를 고정시켰다(집는다).
4) 기계를 이용하여 염화칼슘 용액이 충전되어 있는 시린지(female type)의 밀대를 밀어, 실시예 1 내지 4 또는 비교예 1이 들어있는 시린지에 넣었다.
5) 시린지의 위치를 변경하여 기계에 빈 시린지를 고정시켰다(집는다).
6) 혼합된 내용물이 충전되어 있는 시린지(male type)의 밀대를 밀어, 혼합된 내용물을 빈 시린지에 넣었다.
7) 4)~5)를 반복하여, 혼합 시 필요한 힘을 측정하였다. 여기서, 4) 단계를 수행할 때마다 필요한 힘(N1, N3, N5, N7)을 측정하였다.
한편, 시린지 안에 채워진 지혈용 조성물은 고체 분말이므로 높은 밀도로 시린지에 채워져 있어, 염화칼슘 용액을 지혈용 조성물이 채워진 시린지 안으로 주입하는 힘은 반대로 지혈용 조성물을 염화칼슘 용액이 채워진 시린지 안으로 주입하는 힘에 비해 상대적으로 클 수밖에 없다. 이에 염화칼슘 용액을 지혈용 조성물이 채워진 시린지 안으로 주입시키는데 필요한 힘(N1, N3, N5, N7)을 측정함으로써, 혼합 시 흐름성의 차이를 확인하였다.
혼합횟수(회) 최대값 하중(N)
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 비교예 1
N1 4.36 3.94 22.57 21.84 19.43
N3 10.83 7.05 5.12 13.1 8.39
N5 10.18 6.52 5.83 21.98 61.07
N7 9.97 7.04 22.32 7.69 22.16
평균 8.84 6.14 13.96 16.15 27.76
상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 실시예 1 내지 4는 비교예 1에 비해 상대적으로 혼합에 필요한 힘, 즉 혼합 시 발생하는 압력의 크기가 모두 낮았으며, 한편, 실시예 2가 실시예 1보다 평균적으로 혼합 시 발생하는 압력의 크기가 작게 나타냈다. 이에 따라, 트롬빈과 만니톨이 주사기 입구 쪽에 배치된 것이 혼합 초기부터 원재료의 혼합에 필요한 압력을 줄여주고 원재료가 잘 혼합되도록 도와주는 것을 확인하였다.
반면, 가교된 젤라틴이 충진된 비교예 1은 실시예 1 내지 4와는 다르게 발생하는 압력이 일정한 패턴을 보이지 않았다. 가교된 젤라틴은 혼합 시 발생하는 압력의 크기가 가교된 콜라겐이 충진된 실시예 1과, 실시예2 내지 실시예 4에 비해 평균을 비롯하여 전체적으로 높게 나타냈으며, N5에서는 적게는 약 3배 많게는 약 10배 정도로 크게 차이를 보였다.
실험예 2: SEM (Scanning Electron Microscope)을 통한 미세구조 확인
상기 실험예 1를 수행한 후에, 염화칼슘 용액과 혼합한 실시예 2, 실시예 4, 및 비교예 1를 SEM을 이용하여 각각의 미세구조 이미지를 얻었다. 이의 이미지는 도 1에 나타냈다.
상기 도 1에서 볼 수 있듯이, 실시예 2 및 실시예 4는 미세하고 밀집된 다공성막 구조를 확인할 수 있고, 반면, 비교예 1에서는 실시예 2와 실시예 4에 비해 다공성막 구조가 적게 확인되고, 질서없이 엉겨 있는 구조가 확인되었다. 이에 따라, 실시예 2 및 실시예 4는 상대적으로 비교예 1에 비해 염화칼슘 용액과 혼합 후 균일한 다공성 구조에 의해 혈액이 흡수되고 응집되어 지혈을 돕는 다공성막 구조를 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 팽창률 및 팽창속도 확인
본 발명에 따른 지혈용 조성물이 희석액과 혼합 후에 나타내는 팽창속도를 확인하기 위해, 먼저 상기 실험예 1의 표 1에 기재된 방식을 따라, 실시예 2 및 비교예 1를 각각 준비하였다. 준비한 실시예 2 및 비교예 1의 입자면적을 각각 측정하였다. 그 다음 각 시료를 염화칼슘 용액과 혼합 후 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30분 간격으로 입자면적을 측정하여 이에 면적변화율을 계산하여 팽창속도를 산출하였다. 이의 결과를 도 2에 나타냈다.
상기 도 2에서 볼 수 있듯이, 실시예 2와 비교예 1은 초기 1분 이내 급격히 팽창하여 2, 3, 5, 10분까지 계속 팽창하지만, 10분 이후로는 팽창률이 포화상태가 되는 것을 확인했다. 또한, 가교된 콜라겐이 포함된 실시예 2는 비교예 1에 비해 팽창속도가 빠르고 면적변화가 크므로 가교된 콜라겐이 가교된 젤라틴에 비해 동일한 시간 내에 더 빠르게 입자의 팽창으로 물리적 압박 작용을 수행할 수 있어 지혈효과에 큰 도움이 될 수 있음을 확인했다.
실험예 4: 분해도 시험
본 발명에 따른 지혈용 조성물 내 포함된 콜라겐에 대한 생체분해성 및 분해도를 측정하여 생체적합성을 가지는지 분해성이 낮아 감염위험성을 없는지 확인하기 위하여 분해도 시험을 수행했다. 먼저, 상기 제조예 1로부터 얻어진 에스테르화 콜라겐, 상기 제조예 2로부터 얻어진 가교된 콜라겐, 상기 제조예 3로부터 얻어진 가교된 젤라틴을 준비하여, 각각의 시료 무게를 측정하였다. 그 다음, 각 시료를 micro-centrifuge tube에 넣고 25units/mL의 콜라겐 분해효소(Collagenase)가 포함된 1XPBS buffer 1~2 mL을 넣어 가득 채웠다. 시료가 들어있는 tube를 37 ℃ water bath에 넣어 24~72시간 방치하였다. 24, 48, 72 시간 경과 후 시료를 꺼내 동결건조한 후 무게를 측정하였다. 분해도 시험 전후로 측정한 시료의 무게를 하기 계산식을 이용하여 남은 중량비를 계산하였다. 이의 결과를 표 3에 나타냈다.
<남은 중량비 계산식>
남은 중량비(%) = 분해도 시험 후 시료의 건조 무게/분해도 시험 전 시료의 건조 무게 * 100
구분 분해시간 별 남은 중량비( % )
24시간 후 48시간 후 72시간 후
가교된 콜라겐 73.0±3.1 38.7±1.2 0
에스테르화 콜라겐 68.0±2.0 34.6±1.2 0
가교된 젤라틴 79.0±2.3 43.3±3.0 3.3±1.2
가교된 콜라겐 및 에스테르화 콜라겐은 72시간 이내에 콜라겐분해효소에 의해 시료가 완전히 분해되었음을 확인했다. 반면, 가교된 젤라틴은 72시간 후 남은 중량비가 3.3±1.2 %로 콜라겐분해효소에 의해 시료가 완전히 분해되지 않았다. 따라서, 가교된 젤라틴에 비해 가교된 콜라겐과 에스테르화 콜라겐이 동일한 조건에서 빠른 분해능을 갖는 것을 확인하여 생체분해성이 높고 감염위험성이 매우 적은 것을 확인하였다.
실험예 5: 토끼 장간막 절단 모델에서 지혈 성능 비교
본 발명에 따른 지혈용 조성물의 지혈능을 확인하기 위하여 상기 실험예 1과 동일하게 실시예 2 및 비교예 1을 준비하였다. 지혈능의 비교는 토끼의 장간막 절단 모델을 이용하였다. 장간막을 절단하여 출혈을 유도한 후 실시예 2 혹은 비교예 1을 적용한 후 30초간 지혈 압박을 시도하여 출혈 여부를 확인하고 출혈이 일어난 경우 추가 30초의 지혈 압박을 반복하였다. 90초 내에 지혈이 성공할 확률과 지혈에 걸리는 시간을 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 도 3에서 볼 수 있듯이, 실시예 2는 15마리 토끼 모두 90초 내에 지혈이 성공한 반면, 비교예 1은 15마리의 토끼 중 10마리만이 90초 내에 지혈이 완료되었다. 또한 지혈에 걸리는 시간에 있어서, 실시예 2는 64 ± 4.957초인 반면, 비교예 1은 86 ± 8.718 초로 측정되었으며 t-test 결과 통계적 유의성이 확인되었다 (p < 0.05). 이에 따라, 본 발명에 따른 지혈용 조성물을 이용할 경우 지혈 성공율이 높고, 지혈시간이 단축되므로 탁월한 지혈능을 가지는 것을 확인했다.
실험예 6: 돼지 상대 정맥 손상 모델에서 체내 분해도 및 염증 반응 비교
본 발명에 따른 지혈용 조성물의 체내 분해도 및 염증 반응 정도를 확인하기 위하여 상기 실험예 1과 동일하게 실시예 2 및 비교예 1을 준비하였다. 돼지의 상대정맥을 부분 절개하여 출혈을 유도한 후 실시예 2 혹은 비교예 1을 적용하여 지혈하였다. 실험 1주 후 돼지를 희생하여 검체를 회수하고 H&E 염색을 통해 남아 있는 지혈 조성물의 양과 염증 반응을 비교하였다. 이의 결과를 하기 표 4에 나타냈으며, H&E 염색 후 조직의 이미지는 도 4에 나타냈다.
실시예 2 비교예 1
염증반응 + ++
잔여물 + ++
(표 4의 + 는 mild(가벼운, 약간의), ++는 moderate(보통)를 의미한다.)
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 돼지 상대정맥 손상 모델에서 사용된 지혈제 조성물의 잔여물은 실시예 2가 약간 남은 정도이고 비교예 1은 보통 정도 남은 상태였으며, 염증 반응 또한 잔여물의 양과 비례하여 실시예 2가 약한 염증 반응, 비교예 1이 보통의 염증 반응을 나타냈다.
또한, 상기 도 4는 각각 실시예 2 및 비교예 1의 H&E 염색 후 조직의 이미지로 실시예 2의 잔여물의 양이 비교예 1의 잔여물의 양보다 비교적 적은 것을 확인할 수 있으며, 잔여물의 양과 비례하여 염증세포의 수도 실시예 2가 비교예 1보다 적음을 알 수 있다. 이는 상기 실험예 4의 결과와 마찬가지로 빠른 분해능을 갖는 조성물이 생체분해성이 높고 염증 반응 등의 감염위험성이 적은 것으로 볼 수 있다. 이에 따라 본 발명에 따른 지혈용 조성물을 이용할 경우 생체적합성을 향상시키고, 부작용을 줄이며 지혈제로 인하여 새로 발생되는 감염위험성을 낮출 수 있다.
실험예 7: 백서 부분 신절제 모델에서 지혈제 조성물의 생체적합성 확인
본 발명에 따른 지혈용 조성물의 생체적합성을 확인하기 위하여 상기 실험예 1과 동일하게 실시예 2 및 비교예 1을 준비하였다. 백서의 신장 일부를 절제하여 출혈을 유도한 후 실시예 2 혹은 비교예 1을 절단면에 적용하여 지혈하였다. 실험 1주 후 백서를 희생하여 검체를 회수하고 병리학적 검경을 통해 지혈제 조성물의 차이에 따른 생체적합성을 비교 확인하여 하기 표 5에 나타냈다.
조직 평가지표 등급
실시예 2 비교예 1
개체1 개체2 개체1 개체2
Renal cortex Tissue alteration, bleeding 0 0 2 1
Epithelial regressive changes (edema, necrosis) 0 0 3 1
Glomerular necrosis 0 0 0 0
Glomerular hyaline microthrombi 0 0 0 0
Inflammation 4 4 5 5
Extraglomerular hemorrhage 0 0 0 0
Intraglomerular hemorrhage 0 0 0 0
Fibroblast activation 2 2 3 3
Fibrosis 2 1 3 3
Fistula 0 0 0 0
Microvascular proliferation 2 2 2 1
Hyaline in the tubules 2 1 2 1
Interstitial hemorrhage 1 0 2 3
Polymorphonuclears 3 3 2 2
Collagen scar 0 0 0 0
Extra fat tissue Granuloma/inflammation around kidney 2 4 4 5
Destruction score 18 17 28 25
상기 표 5에서 등급은 하기 기준에 따라 매겨졌다.
0 : no change(아무런 변화 없음)
1 : minimal(아주 작은 변화)
2 : mild(가벼운 또는 약간의 변화)
3 : moderate(보통)
4 : marked(뚜렷한 변화)
5 : maximum(최고의 또는 극한 변화)
상기 표 5에서 볼 수 있듯이, 비교예 1을 적용한 백서 개체에서는 술후에 조직변형과 출혈이 관찰되었으나 실시예 2를 적용한 백서 개체에서는 술후 조직변형이나 술후 출혈 등이 관찰되지 않았다. 섬유아세포의 활성도나 섬유아세포 증식에 의한 섬유화는 비교예 1을 적용한 개체에서 더 크게 나타났으며, 세포간 출혈도 비교예 1에서 크게 나타났다. 특히, 비교예 1을 적용한 신절제면 주위의 지방조직에서 육아종 및 염증 반응이 크게 나타났다.
한편, 병리학적으로 유해함을 나타내는 지표인 destruction score는 실시예 2에서 평균 17.5를 비교예 1에서 평균 26.5인 것으로 나타났다. 이로서 실시예 2의 생체적합성이 비교예 1보다 우수하다는 것을 알 수 있다.

Claims (26)

  1. 용기 내에 충진되는 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 분말제 형태의 지혈용 조성물이되,
    상기 콜라겐 또는 트롬빈이 용기 하부에 충진되어 제1층을 형성하고,
    상기 안정화제가 상기 제1층의 상부에 적층되어 제2층을 형성하며,
    그 다음 상기 제1층에 포함되지 않은 콜라겐 또는 트롬빈이 제2층의 상부에 적층되어 제3층을 형성함으로써, 콜라겐 및 트롬빈이 용기 내에서 서로 혼합되지 않고 분리된 지혈용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 콜라겐은 가교된 콜라겐인 것을 특징으로 하는 지혈용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 가교된 콜라겐은
    S1) 콜라겐을 에탄올 또는 메탄올에 처리하는 단계;
    S2) 상기 S1) 단계에서 처리된 콜라겐에 산을 첨가하여 pH 2~4의 콜라겐 용액으로 제조하는 단계;
    S3) 상기 S2) 단계로부터 제조된 콜라겐 용액을 중성상태로 만든 후 원심분리하여 에스테르화 콜라겐을 제조하는 단계;
    S4) 상기 S3) 단계로부터 제조된 에스테르화 콜라겐에 가교제를 첨가하여 가교된 콜라겐을 제조하는 단계; 및
    S5) 상기 S4) 단계로부터 제조된 가교된 콜라겐을 정제수에 분산시킨 후 동결건조 시키는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 지혈용 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 가교된 콜라겐의 분자량은 100,000 내지 1,000,000 Dalton 인 것을 특징으로 하는, 지혈용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 콜라겐이 40 내지 97 중량%으로 포함된 것을 특징으로 하는, 지혈용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 안정화제는 알부민(human serum albumin), 만니톨, 아세트산나트륨(C2H3NaO2), 수크로스, 트레할로스, 소르비톨 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 지혈용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 안정화제는 만니톨인 것을 특징으로 하는, 지혈용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 안정화제가 1 내지 30 중량%으로 포함된 것을 특징으로 하는, 지혈용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 트롬빈이 2 내지 50 중량%으로 포함된 것을 특징으로 하는, 지혈용 조성물.
  10. 삭제
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한항의 지혈용 조성물을 포함하는 용기.
  12. 콜라겐, 안정화제 및 트롬빈을 포함하는 분말제 형태의 지혈용 조성물이 채워진 제1 용기; 및
    희석액이 채워진 제2 용기를 포함하는 지혈용 키트이되,
    상기 제1 용기는
    상기 콜라겐 또는 트롬빈이 제1 용기의 하부에 충진되어 제1층을 형성하고;
    상기 안정화제가 제1층의 상부에 적층되어 제2층을 형성하며;
    그 다음 상기 제1층에 포함되지 않은 콜라겐 또는 트롬빈이 제2층의 상부에 적층되어 제3층을 형성함으로써, 콜라겐 및 트롬빈이 용기 내에서 서로 혼합되지 않고 분리된 지혈용 키트.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 희석액은 정제수, 염화칼슘(CaCl2) 용액, 염화나트륨(NaCl) 용액, 사람 혈청 알부민(human serum albumin), 및 아세트산나트륨(C2H3NaO2) 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지혈용 키트.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 희석액은 염화칼슘 용액이고,
    상기 희석액의 총 중량에 대하여, 상기 염화칼슘이 0.001 내지 30중량%로 포함된 것을 특징으로 하는 지혈용 키트.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 지혈용 키트는
    제1 용기와 제2 용기가 서로 결합하여 지혈용 조성물과 희석액이 혼합되어 하이드로겔을 형성하고,
    상기 하이드로겔의 평균기공 사이즈는 50㎛ 내지 200㎛인 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 하이드로겔의 pH는 6 내지 8인 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  17. 제 12항에 있어서,
    상기 제1 용기에 트롬빈, 안정화제, 콜라겐 순으로 채워진 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  18. 제 12항에 있어서,
    상기 콜라겐은 가교된 콜라겐인 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 가교된 콜라겐은
    S1) 콜라겐을 에탄올 또는 메탄올에 처리하는 단계;
    S2) 상기 S1) 단계에서 처리된 콜라겐에 산을 첨가하여 pH 2~4의 콜라겐 용액으로 제조하는 단계;
    S3) 상기 S2) 단계로부터 제조된 콜라겐 용액을 중성상태로 만든 후 원심분리하여 에스테르화 콜라겐을 제조하는 단계;
    S4) 상기 S3) 단계로부터 제조된 에스테르화 콜라겐에 가교제를 첨가하여 가교된 콜라겐을 제조하는 단계; 및
    S5) 상기 S4) 단계로부터 제조된 가교된 콜라겐을 정제수에 분산시킨 후 동결건조 시키는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로, 지혈용 키트.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 가교된 콜라겐의 분자량은 100,000 내지 1,000,000 Dalton 인 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  21. 제 12항에 있어서,
    상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 콜라겐이 40 내지 97 중량%으로 포함된 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  22. 제 12항에 있어서,
    상기 안정화제는 알부민(human serum albumin), 만니톨, 아세트산나트륨(C2H3NaO2), 수크로스, 트레할로스, 소르비톨 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 안정화제는 만니톨인 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  24. 제 12항에 있어서,
    상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 안정화제가 1 내지 30 중량%으로 포함된 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  25. 제 12항에 있어서,
    상기 지혈용 조성물의 총 중량에 대하여, 상기 트롬빈이 2 내지 50 중량%으로 포함된 것을 특징으로 하는, 지혈용 키트.
  26. 삭제
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