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KR101974509B1 - 보체 단백질의 간암 진단 용도 - Google Patents

보체 단백질의 간암 진단 용도 Download PDF

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KR101974509B1 KR1020160099610A KR20160099610A KR101974509B1 KR 101974509 B1 KR101974509 B1 KR 101974509B1 KR 1020160099610 A KR1020160099610 A KR 1020160099610A KR 20160099610 A KR20160099610 A KR 20160099610A KR 101974509 B1 KR101974509 B1 KR 101974509B1
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Abstract

보체 단백질 C7 및 CFH의 간암 세포의 검출 및 간암 진단을 위한 새로운 용도에 관한 것으로, C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 간암 세포 검출용 조성물 및 간암 진단용 조성물이 제공된다.

Description

보체 단백질의 간암 진단 용도 {Use of complement proteins for liver cancer diagnosis}
보체 단백질 (complement proteins) C7 및 CFH의 간암 세포의 검출 및 간암 진단을 위한 새로운 용도에 관한 것으로, C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 간암 세포 검출용 조성물 및 간암 진단용 조성물이 제공된다.
간암은 전세계에서 암중에서 5번째로 많이 발생하는 암으로서 암으로 인한 사망중 2번째로 높은 암종류이다. 간 세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 일차 간암의 70-85%에 해당하는 가장 주요한 조직학적 하위 유형이다. 비록, 국소적 (locoregional) 또는 외과적 치료 및 보다 발달된 경우에는 화학적 요법이 임상에서 적용되지만, 간 세포암 환자의 5년 생존율은 전이, 재발 및 화학 및 방사선치료에 대한 저항성으로 인해서 상당히 낮다.
간 세포암의 주요한 두 개의 특징은 높은 재발률 및 이질성 (heterogeneity)이다. 최근의 연구들에 의하면 이질성은 암 줄기 세포 (cancer stem cells, CSCs)라고 알려진 줄기/전구 세포의 특징을 가진 세포의 부분집합인 종양 세포의 계층적 구성으로 인해 나타난다. 이러한 종양의 덩어리 안의 암 줄기 세포들은 자기 재생 (self-renew), 분화, 및 새로운 종양의 생성할 수 있는 능력을 가지고 있다. 또한, 이것은 이질적 암 세포의 계층적 구성 및 암의 높은 재발률을 설명한다. 그러나, 간암 줄기세포가 어떻게 자기 재생 능력을 가지고 있는지 여부는 거의 알려져 있지 않다. 간 세포암이 스스로 발달하는 과정은 설명하기 어려운 현상이다. 그러나, 축적되는 증거들은 주변 환경이 종양의 발생에 매우 중요한 인자임을 나타낸다. 또한, 염증과 암 사이의 혼선 (crosstalk)이 암의 발생의 위험성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 종양 안의 염증 세포 및 인자가 필수적 요소인 특화된 미세환경에서 간암 줄기세포가 존재한다고 알려져 있다.
보체 시스템은 선척성 면역 시스템의 기본적인 구성 중 하나이며, 많은 다양한 단백질들이 연쇄반응 (cascade)으로 작용하여 복합체 구멍 구조 (complex pore structure)를 형성한다. 혈장에 존재하는 보체 단백질은 주로 간세포에서 합성되지만, 내피 세포 (endothelial cell), 적혈구, 및 상피 세포에 의해서 분비되기도 한다. 또한 혈관 밖의 조직에서, 보체 단백질들은 세포간의 의사소통에 참여하고 조직 재생, 혈관 생성, 상피-중간엽 전환 (epithelial-mesenchymal transition), 및 세포 이동에 관여한다. Markiewski 등은 종양 미세 환경에서 대표적인 보체 연쇄반응의 요소인 C5a 수용체 단백질에 의해서 유방 암의 조절 T 세포 (Tregs)가 활성화 됨을 증명하였다. 또한, C5a 수용체의 펩타이드 대항제 (antagonist)는 CD8+ T-세포 항암 반응을 증진하며 파클리탁셀 (Taxol) 화학 요법과 마찬가지로 종양 성장 억제 효과가 있다.
따라서, 종양의 생성 및 발달에서 보체 단백질의 역할을 확인하고, 이를 이용하여 암의 진단제, 치료법의 개발 및 암의 예방 또는 치료 약물의 스크리닝에 사용하기 위한 방법의 개발이 요구된다.
본 발명은 보체 단백질 C7 및 CFH의 간암 세포의 검출 및 간암 진단을 위한 새로운 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 간암 세포 검출용 조성물을 제공한다. 상기 간암 세포는 간암 줄기세포를 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 간암 세포 검출용 조성물을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다. 상기 간암은 간암 줄기세포를 포함하는 특징을 갖는 것일 수 있다.
다른 예는 환자로부터 분리된 생물 시료 내의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 간암은 간암 줄기세포를 포함하는 특징을 갖는 것일 수 있다.
다른 예는 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 상기 간암은 간암 줄기세포를 포함하는 특징을 갖는 것일 수 있다.
다른 예는 세포 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 상기 세포 시료에서의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표적물질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료에서의 표적 물질의 수준을 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료에서의 표적 물질의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료 약물의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 세포 시료는 간암 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 간암 세포는 간암 줄기세포를 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 포함하는, 간암줄기세포 저해용 조성물을 제공한다. 상기 간암 세포는 간암 줄기세포를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자는 C7 단백질, CFH 단백질, 및/또는 LSF-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 mRNA 서열을 의미할 수 있다.
상기 "C7 단백질" (Complement component C7 protein)은 세포 막 공격 복합체 (membrane attack complex, MAC)의 구성성분으로서 선천성 면역 및 후천성 면역 반응에서 목표 세포의 원형질 막 (plasma membrane)의 구멍을 내는 과정을 통해 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 C7 단백질은 인간(Homo sapiens) 등을 포함하는 영장류, 마우스 (Mus musculus), 래트 (Rattus norvegicus) 등을 포함하는 설치류 등의 포유류, 개구리 (Xenopus laevis) 등의 양서류 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 예컨대, C7은 인간 C7 (예컨대, NP_000578.2. (유전자: NM_000587.2.　), 마우스 C7 (예컨대, NP_001123635.1. (유전자:　NM_001130163.1.), 래트 C7 (예컨대, NP_001184261.1. (유전자: NM_001197332.1.), 개구리 C7 (예컨대, NP_001085116.1. (유전자: NM_001091647.1.) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "CFH 단백질" (Complement Factor H protein)은 factor I에 의한 C3b의 불활성에서 보조인자로 작용하는 것으로 알려져 있다.
상기 CFH 단백질은 인간 (Homo sapiens) 등을 포함하는 영장류, 마우스 (Mus musculus), 래트 (Rattus norvegicus) 등을 포함하는 설치류 등의 포유류, 개구리 (Xenopus laevis) 등의 양서류 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 예컨대, CFH은 인간 CFH (예컨대, NP_000177.2. (유전자: NM_000186.3.　) 등), 마우스 CFH (예컨대, NP_034018.2. (유전자: NM_009888.3.　) 등), 래트 CFH (예컨대, NP_569093.2. (유전자: NM_130409.2.　) 등), 개구리 CFH (예컨대, NP_001079684.1. (유전자: NM_001086215.1.　) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "LSF-1 단백질" (Lave SV40 Factor protein)은 전사인자로서 다양한 세포 내 및 바이러스의 프로모터에 결합하여 전사를 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 LSF-1 단백질은 인간 (Homo sapiens) 원숭이 (Macaca mulatta) 등을 포함하는 영장류, 마우스 (Mus musculus), 래트 (Rattus norvegicus) 등을 포함하는 설치류 등의 포유류, 제브라피쉬 (Danio rerio) 등의 어류, 개구리 (Xenopus laevis) 등의 양서류 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 예컨대, LSF-1은 인간 LSF-1 (예컨대, NP_001166923.1. (유전자:　NM_001173452.1.) 등), 원숭이 LSF-1 (예컨대, NP_001253146.1. (유전자: NM_001266217.1.) 등), 마우스 LSF-1 (예컨대, NP_001276532.1. (유전자: 　NM_001289603.1.) 등), 래트 LSF-1 (예컨대, NP_001128186.1. (유전자: NM_001134714.1.) 등), 제브라피쉬 LSF-1 (예컨대, XP_005162411.1. (유전자: XM_005162354.2.) 등), 개구리 LSF-1 (예컨대, NP_991396.1. (유전자: NM_205827.1.) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 간암 세포를 검출하기 위한 용도로서 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자 CFH 단백질을 암호화 하는 유전자 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 용도가 제공된다. 상기 간암 세포는 간암 줄기세포를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바로서, 용어 "암 줄기세포 (Cancer Stem CELL: CSC)"는 암 세포들 중에서 종양을 생성할 수 있는 능력을 가지는 세포를 의미하는 것으로, 종양을 형성하지 않은 암세포와 다르게 종양형성 (tumorigenic) 능력을 가지므로, 종양생성세포 (Tumor-initiating cells, TICs)라고도 칭해진다. 따라서, 본 명세서에서는 암 줄기세포와 종양생성세포는 서로 동일한 의미로 사용된다.
일 예에서, 간암 세포의 경우 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 양이 증가되어 있고, C7, CFH, 및/또는 LSF-1 유전자를 siRNA를 이용하여 녹다운 시켰을 경우 간암 세포의 줄기성 인자가 감소함을 확인하였다. 이를 통해, C7, CFH, 및/또는 LSF-1가 간암 세포를 검출하고 간암을 진단하는 용도로 사용 가능함을 알 수 있다.
이에, C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 간암 세포 검출용 조성물이 제공된다.
상기 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 수준은 상기 단백질 또는 유전자와 상호작용하는 물질을 이용하는 통상적인 모든 단백질 또는 유전자 분석 방법에 의하여 측정될 수 있다. 상기 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 상기 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 소분자 화학 물질 (chemical, small molecule), 단백질, 펩타이드, 핵산 분자 (폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 C7 단백질, CFH 단백질, 및/또는 LSF-1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 압타머, 및 C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부에 결합하는 핵산 분자(예컨대, 프라이머, 프로브, 압타머 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 상기 C7 단백질, CFH 단백질, 및/또는 LSF-1 단백질의 수준은 상기 C7 단백질, CFH 단백질, 및/또는 LSF-1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 압타머 등을 이용하는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피 (Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법 (Radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(Enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석 (Fluorescence immunoassay: FIA), 발광면역분석 (Luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴 블롯팅 (Western blotting), 마이크로어레이법, 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자 (DNA, cDNA 또는 mRNA)의 수준은 통상의 유전자 분석 방법을 이용하여 측정할 수 있으며, 예컨대 상기 유전자와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 또는 압타머를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법, 예컨대, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR; 예컨대 qPCR, real-time PCR 등), FISH (Fluorescent in situ hybridization), 마이크로어레이법, 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 프라이머는 C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000 bp 예컨대 10 내지 500 bp, 20 내지 200 bp, 또는 50 내지 200 bp의 유전자 단편을 검출할 수 있는 것으로, 상기 유전자 단편의 3'-말단 및 5'-말단 각각의 연속하는 5 내지 100 bp, 예컨대, 5 내지 50 bp, 5 내지 30 bp, 또는 10 내지 25 bp 부위와 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적인) 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프로브 또는 압타머는 총 길이가 5 내지 100 bp, 5 내지 50 bp, 5 내지 30 bp, 또는 5 내지 25 bp인 것일 수 있으며, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 100 bp, 5 내지 50 bp, 5 내지 30 bp, 또는 5 내지 25 bp의 유전자 단편과 결합 가능 또는 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적) 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 '결합 가능'하다 함은 상기 유전자 부위와 공유결합 등의 화학적 및/또는 물리적 결합에 의하여 결합할 수 있음을 의미할 수 있고, 상기 '혼성화 가능'하다 함은 상기 유전자 부위의 염기서열과 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할 수 있다.
정상 조직에 비해서 간암 환자의 조직에서의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 수준이 높음을 확인하였다.
이에, C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 수준을 상기 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 조성물을 이용하여 측정하고 이를 통해서 간암 세포를 검출하고 간암을 진단할 수 있다.
구체적으로, C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준이 높다함은 다음과 같은 기준으로 판단될 수 있다.
비교 기준 시료와 환자로부터 분리된 생물 시료 (예컨대, 간세포 또는 간 조직)에 존재하는 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 수준을 비교하여 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자 (DNA, cDNA 또는 mRNA)의 양이 많은 경우를 의미하는 것일 수 있다. 상기 비교 기준 시료는 정상 조직 (예컨대, 간암이 발생하지 않은 간세포 또는 간 조직)으로서, 생체로부터 분리되거나 인공적으로 배양된 세포, 조직, 또는 이의 배양물 (예컨대, 간암이 발생하지 않은 생체로부터 분리되거나 인공적으로 배양된 간세포, 간조직, 또는 이들의 배양물)일 수 있다.
다른 예는 환자로부터 분리된 생물 시료 내의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
구체적으로 i) 상기 생물 시료에서의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질을 이용하여 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 수준을 측정하는 단계; ii) 상기 비교 기준 시료에서의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 수준과 비교하는 단계; 및 iii) 상기 생물 시료에서의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자의 수준이 비교 기준 시료에서보다 높은 경우, 상기 생물 시료를 간암으로 진단할 수 있는 정보를 제공하는 단계를 포함하는 간암 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 예는 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
상기 억제제는 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 인식 및/또는 결합하여 이를 분해하거나 발현을 억제하거나 기능을 저해하는 모든 물질일 수 있다. 예컨대, 상기 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 억제제는 항-C7 항체, 항-CFH 항체, 항-LSF-1 항체, 이들의 항원 결합 단편, C7 유전자, CFH 유전자, 및/또는 LSF-1에 대한 저해 핵산 분자 (예컨대, siRNA, shRNA, microRNA), C7, CFH, LSF-1 및/또는 이들의 유전자에 대한 소분자 화합물 (small molecular chemical) 억제제, 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 예에서, 상기 소분자 LSF-1 억제제는 FQI1 (438210, Calbiochem)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C7, CFH, 및/또는 LSF-1을 항원으로 인식하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 항체는 C7 단백질, CFH 단백질, 및/또는 LSF-1 단백질 또는 상기 단백질의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하여 원래의 기능을 발휘하지 못하도록 하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 항체는 C7, CFH, 및/또는 LSF-1의 특정 부위, 예컨대 C7의 MACPF 또는 Sushi 도메인, CFH의 Sushi 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있다.
용어, "에피토프 (epitope)"는 항원 결정 부위 (antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 특정 단백질 (항원)의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 유래 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 것 또는 비자연적으로 발생한 것 (즉, 자연적으로 존재하지 않는 것)일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합적 또는 합성적으로 제조된 것일 수 있다.
상기 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 억제제는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적용 (투여) 될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는, 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 억제제는 상기 성분들 이외에 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 억제제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 억제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서에 있어서 "약학적 유효량"은 약물이 약학적으로 의미있는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미한다. 1회 투여를 위한 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 억제제의 약학적 유효량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라서 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 1회 투여를 위한 상기 C7, CFH, 및/또는 LSF-1 억제제의 약학적 유효량은 0.001 내지 100 mg/kg, 또는 0.01 내지 10 mg/kg 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1회 투여를 위한 약학적 유효량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
다른 예는
세포 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
상기 세포 시료에서의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표적물질의 수준을 측정하는 단계;
상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료에서의 표적 물질의 수준을 후보 물질을 접촉시키지 않은 세포 시료에서의 표적 물질의 수준과 비교하는 단계; 및
상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료에서의 표적 물질의 수준이 후보 물질을 접촉시키지 않은 세포 시료에서의 표적 물질의 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 화합물을 간암의 예방 또는 치료 약물의 후보 물질로 결정하는 단계
를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료 약물 또는 간암 줄기세포 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 간암은 간암 줄기세포를 포함하는 특징을 갖는 것일 수 있다.
이 경우, 상기 간암의 예방 또는 치료 약물 또는 간암 줄기세포 억제제의 스크리닝 방법은 상기 결정하는 단계 이전에 상기 후보 물질을 접촉시키지 않은 세포 시료의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법들의 비교하는 단계 및 결정하는 단계는 생물 시료의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 비교 기준 시료의 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및/또는 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준과 비교하는 단계 및 상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료에서의 표적 물질의 수준이 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료에서의 표적 물질의 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 화합물을 간암의 예방 또는 치료 약물 또는 간암 줄기세포 억제제로 판단 (예측)하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료와 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료는 동종 또는 동일 조직에서 얻어진 세포일 수 있으며, 예컨대, 간세포, 보다 구체적으로 간암 세포일 수 있다. 상기 후보 화합물은 각종 화합물, 예컨대, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 이외의 각종 소분자 화학 물질 (small molecular chemicals), 천연물 및 천연물의 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것이 수 있다.
다른 예는 C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 포함하는, 간암 줄기세포 저해용 조성물을 제공한다.
보체 단백질 (complement proteins) C7 및 CFH의 간암 세포의 검출 및 간암 진단을 위한 새로운 용도에 관한 것으로, C7 단백질, CFH 단백질, LSF-1 단백질, C7 단백질을 암호화 하는 유전자, CFH 단백질을 암호화하는 유전자, 및 LSF-1 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 조성물을 이용하여 간암 세포 검출 및 간암 진단할 수 있는 기술을 제공한다.
도 1은 4명의 환자에서 얻은 일차 종양 세포에서 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대한 대표적인 사진들이다. 2D는 2D 배양 된 것을 의미하고, S는 구형 배양 된 것을 의미한다. 스케일 바는 100 uM를 나타낸다.
도 2는 3000 개의 종양구 세포들 (오른쪽)과 2D 배양 세포들 (왼쪽)을 NOD-SCID 마우스에 이식한 후 종양이 형성된 것을 나타낸 사진들이다. 화살표는 종양이 형성된 곳을 가리킨다.
도 3는 간 세포암과 환자에서 유래한 이종이식(PDX)에 대하여 H&E 염색과 항-Hep Par 1, p-CEA 및 CK7 항체로 면역조직화학적 염색을 수행하여 나타낸 조직학적 특징들이다.
도 4은 일차 간 세포암의 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 Nanog의 RNA를 측정한 결과이다.
도 5은 일차 간 세포암의 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 Oct4의 RNA를 측정한 결과이다.
도 6은 일차 간 세포암의 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 Sox2의 RNA를 측정한 결과이다.
도 7은 간암 세포주에서 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 Nanog의 RNA를 측정한 결과이다.
도 8은 간암 세포주에서 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 Oct4의 RNA를 측정한 결과이다.
도 9은 간암 세포주에서 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 Sox2의 RNA를 측정한 결과이다.
도 10는 일차 간 세포암의 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 C7의 RNA를 측정한 결과이다.
도 11는 일차 간 세포암의 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 CFH의 RNA를 측정한 결과이다.
도 12은 간암 세포주에서 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 C7의 RNA를 측정한 결과이다.
도 13은 간암 세포주에서 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 CFH의 RNA를 측정한 결과이다.
도 14은 SNU449와 Huh7 암 세포에서 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 면역블롯을 수행하여 C7과 CFH의 단백질 발현 양을 측정한 결과이다.
도 15은 SNU449와 Huh7 암 세포에서 유래한 종양구 배양에 대해 C7과 CFH 항체로 면역형광염색을 하고 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다. 화살표들은 C7 또는 CFH이 핵 속으로 끼어든 결과를 나타낸다.
도 16는 SNU449와 Huh7 암 세포에서 C7 또는 CFH 녹다운 한 후 종양구의 형태 분석한 결과이다. 상단은 SNU449와 Huh7에서 C7 또는 CFH를 녹다운을 면역블롯을 통해 확인한 결과이다. 하단은 종양구의 형태 분석 결과이다.
도 17는 SNU449와 Huh7 암 세포에서 C7을 트랜스펙션 한 후 줄기성 인자의 단백질 발현의 변화를 면역블롯으로 확인한 결과이다.
도 18는 SNU449와 Huh7 암 세포에서 CFH을 트랜스펙션 한 후 줄기성 인자의 단백질 발현의 변화를 면역블롯으로 확인한 결과이다.
도 19는 SNU449와 Huh7 암 세포에 C7을 트랜스펙션하여 제작한 안정적으로 C7을 발현하는 세포 주에 대해 면역블롯을 수행하여 줄기성 인자 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 20는 SNU449와 Huh7 암 세포에 CFH을 트랜스펙션하여 제작한 안정적으로 CFH을 발현하는 세포 주에 대해 면역블롯을 수행하여 줄기성 인자 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 21는 SNU449와 Huh7 암 세포에 Nanog, Oct4, Sox2 또는 c-Myc을 트랜스펙션 한 후 C7 또는 CFH 단백질의 발현의 변화를 면역블롯으로 확인한 결과이다.
도 22은 도 19 및 도 20에서 제작한 C7을 안정적으로 발현하는 세포주 및 CFH를 안정적으로 발현하는 세포주에서 유래한 종양구에 대한 현미경 이미지이다. 하단의 그래프는 상단의 현미경 이미지를 정량화한 것이다.
도 23은 SNU449와 Huh7 암 세포 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 qRT-PCR을 수행하여 LSF-1의 RNA를 측정한 결과이다.
도 24은 SNU449와 Huh7 암 세포 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 면역블롯을 수행하여 LSF-1의 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 25은 Huh7 암 세포 유래한 2D 배양과 종양구 배양에 대해 세포질과 핵으로 분별한 후, 각각에 대해 면역블롯을 수행하여 세포질과 핵에서의 LSF-1 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다. Lamin B와 GAPDH는 핵과 세포질로 분별하는데 대한 분별의 대조구 (fractionation control)로서 각각 사용되었다.
도 26은 SNU449와 Huh7 암 세포 유래한 종양구 배양에 대해 LSF-1으로 면역형광염색을 수행하고 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다. 화살표들은 LSF-1이 핵 속으로 끼어든 결과를 나타낸다.
도 27은 SNU449와 Huh7 암 세포에 대하여 C7을 트랜스펙션 한 후에, 면역블롯을 수행하여 LSF-1의 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 28은 SNU449와 Huh7 암 세포에 대하여 CFH을 트랜스펙션 한 후에, 면역블롯을 수행하여 LSF-1의 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 29은 SNU449와 Huh7 암 세포에 대하여 C7을 녹다운 한 후에, 면역블롯을 수행하여 줄기성 인자 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 30은 SNU449와 Huh7 암 세포에 대하여 CFH을 녹다운 한 후에, 면역블롯을 수행하여 줄기성 인자 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 31은 SNU449와 Huh7 암 세포에 대하여 LSF-1을 녹다운 한 후에, 종양구에대해 형태 분석을 수행하여 형태적 변화를 관찰한 결과이다.
도 32은 SNU449와 Huh7 암 세포에 대하여 LSF-1을 녹다운 한 후에, 면역블롯을 수행하여 줄기성 인자 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 33은 SNU449 암 세포에 대하여 pGL3-Nanog, Oct4, Sox2, 및 c-Myc 프로모터 리포터들 중 하나와 LSF-1을 공동 트랜스펙션 한 후, Dual Luciferase Reporter assay를 수행한 결과이다.
도 34은 Huh7 암 세포에 대하여 pGL3-Nanog, Oct4, Sox2, 및 c-Myc 프로모터 리포터들 중 하나와 LSF-1을 공동 트랜스펙션 한 후, Dual Luciferase Reporter assay를 수행한 결과이다.
도 35은 Huh7 암 세포 유래한 2D 배양과 종양구 배양에서 LSF-1가 Oct4, Sox2, 및 c-Myc 프로모터에 결합하는지 여부를 크로마틴 면역침강 (Chromatin immunoprecipitation) 검정을 통해 확인 한 결과이다. 크로마틴 면역침강 검정에서는 LSF-1에 대한 항체와 정상 마우스 IgG에 대한 항체를 사용하였고, 신호를 측정하기 위해서 Sox2, Oct4, 및 c-Myc 유전자 프로모터의 부분을 타겟으로 하는 프라이머를 사용하였다.
도 36은 SNU449와 Huh7 암 세포에 대하여 LSF-1을 트랜스펙션 한 후에, 면역블롯을 수행하여 줄기성 인자 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 37은 Huh7 암 세포에 대하여 LSF-1을 트랜스펙션하여 제작한 안정적으로 LSF-1을 발현하는 세포주에서 유래한 종양구에 대한 현미경 이미지이다. 하단의 그래프는 상단의 현미경 이미지를 정량화한 것이다.
도 38의 왼쪽은 도 37에서 제작한 LSF-1을 안정적으로 발현하는 세포주를 마우스에 이종이식 한 후, 그 마우스에서 유래한 종양 덩어리 사진이다. 오른쪽 그래프는 왼쪽의 종양 덩어리에 대한 무게를 측정한 결과이다.
도 39은 간 세포암 (T)과 주위의 비종양 (N) 간 샘플에 대하여 면역블롯을 수행하여 C7, CFH, 및 LSF-1 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 40은 C7/CFH/LSF-1 발현과 종양 크기의 상관성 분석을 한 결과이다. 높음 (High) 또는 낮음 (Low)은 대조구 쌍에 대비하여 종양에서의 C7/CFH/LSF-1의 발현이 높거나 낮은 샘플을 나타낸다.
도 41는 간 암줄기세포에서 C7과 CFH가 줄기성을 촉진하는 분자적 작용기전을 도식화한 것이다. C7과 CFH는 LSF-1의 발현을 촉진하고, 핵에 위치한 LSF-1은 Nanog, Oct4, Sox2, 및 c-Myc 유전자의 프로모터에 결합하여 각각의 유전자 발현을 증가시킨다.
도 42은 SNU449와 Huh7 암 세포에 대하여 LSF-1을 녹다운 (왼쪽) 하거나 LSF-1을 트랜스펙션 (오른쪽) 한 후, 면역블롯을 수행하여 C7, CFH, 및 LSF-1 단백질의 발현 변화를 측정한 결과이다.
이하 본 발명을 참고예 및 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
< 참고예 1> 항체와 DNA 구성 (constructs)
사용 된 일차 항체 종류와 그 희석 배수는 다음과 같다: 항-Nanog (1:1000; sc-134218, Santa Cruz Biotechnology), 항-Oct4A (1:1000; #2840, Cell Signaling), 항-Sox2 (1:1000; sc-20088, Santa Cruz Biotechnology), 항-c-Myc (1:1000; #9402, Cell Signaling), 항-C7 (1:1000; GTX63807, Genetex), 항-CFH (1:1000; #9402, Cell Signaling), (1:500; GTX63521, Genetex), 및 항-LSF-1 (1:1000; 610818, BD Transduction Laboratories). 면역조직화학 분석 (Immunohistochemistry)을 위해, 항-CK7 (1:400; M7018, DAKO), 항-p-CEA (1:600; A0115, DAKO), 및 항-Hep Par1 (1:200; M7158, DAKO)을 사용하였다. 염색에는 Alexa-488 또는 Alexa-555 (Molecular Probes)를 사용하였고, 면역형광으로 염색된 세포들은 형광 현미경 (Zeiss LSM 710)을 사용하여 관찰하였다.
인간의 C7, CFH, 및 LSF-1 서열을 포함하는 발현 벡터들은 GE Healthcare에서 구입하였다 (C7: MHS6278-202760004, clone ID: 6184213; CFH: MHS6278-202800294, clone ID: 40148771; LSF-1: OHS5898-219582217, clone ID: PLOHS_100073456; all from Dharmacon).
< 참고예 2> 세포 주 배양
4 개의 간암 세포 주들 (SNU398, SNU423, SNU449, 및 Huh7; 한국세포주은행)을 RPMI 1640 배지 (Gibco)에서 배양하였고, 2 개의 간암 세포들 (Hep3B 및 HepG2; 한국세포주은행)은 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS, 16000-044; Life Technologies), 100 units/mL penicillin, 및 100 ug/mL streptomycin을 포함한 DMEM 배지 (Gibco)에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
< 참고예 3> 형태 (Morphology) 분석과 면역조직화학 분석
원래 종양과 구형 세포 (sphere cells)로부터 얻어진 접목된 (engrafted) 종양 사이의 형태적 분석은 2 명의 독립된 병리학자가 수행하였다. H&E (Hematoxylin　&　Eosin)염색을 하고 300 dpi로 세포 사진을 찍어 병리학적 형태 (pathologic type), 분화 등급 (differentiation grading), 및 종양의 구성 (tumor architecture)을 확인하였다.
원래 종양과 이종 이식된 종양 사이의 면역조직화학 비교를 위해서, 포말린(formalin)에 의해서 고정된 파라핀 내장된 조직 부분을 자동 면역조직화학 염색 장치 (Benchmark XT; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)를 사용하여 면역조직화학적 염색하였다. 간략하게, 4 um 두께의 2D 배양된 조직 부분들을 poly-l-lysine으로 코팅된 접착 슬라이드로 옮기고, 74
Figure 112016076021399-pat00001
에서 30분간 건조하였다. 자동염색기 (autostainer)안에서 EDTA (ethylene diamine tetra-acetic acid (pH 8.0)) 용액하에서 1시간 동안 가열을 통해 에피토프를 복구 (epitope retrieval)시키고, 그 후에 샘플들은 지정된 항체와 배양하였다. 이어서 항체와 배양된 위 조직부분들은 이차 항체와 배양하고, 그리고 나서 ultra View Universal DAB Detection kit (Ventana Medical Systems, Inc)를 사용하여 시각화하였다. 핵은 Harris hematoxylin에 의해서 대비염색하였다.
< 참고예 4> RNA 추출과 qRT - PCR
전체 RNA는 TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 세포와 조직에서 분리하였다. 단일 서열 cDNA 합성을 위해서, MultiScribeTM Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 사용하여 1 ug의 전체 RNA를 역전사하였다. 합성한 cDNA에 대하여 syberGreen master mix (ENZO)를 사용하여 하기의 표 1의 조건으로 qRT-PCR을 수행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) RNA와 18S ribosomal RNA 발현 수준을 세포 내부 대조구 (endogenous control)로 사용하였다. 유전자의 발현 수준은 2컴Ct 방법을 사용하여 세포 내부 대조구와 대비하여 정규화하였고, p < 0.05이 통계적으로 유의 한 것으로 간주되었다 (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001). qRT-PCR에서 각각의 유전자를 증폭하기 위해서 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
C7_F : GAG ATC CTG CGT TGG AGA AAC (서열번호 1)
C7_R : TCT TTC AAG GCA GGA GGT GAT (서열번호 2)
CFH_F : TGC ACT GAA TCT GGA TGG CGT (서열번호 3)
CFH_R : TCT CGG AGC AGG TAT CCA GCC (서열번호 4)
Nanog_F : ACC TCA GCC TCC AGC AGA TGC A (서열번호 5)
Nanog_R : GGT GCT GAG GCC TTC TGC GT (서열번호 6)
Oct4_F : GAA GGA TGT GGT CCG AGT GT (서열번호 7)
Oct4_R : GCC TCA AAA TCC TCT CGT TG (서열번호 8)
Sox2_F : AAA ACA GCC CGG ACC GCG TC (서열번호 9)
Sox2_R : CTC GTC GAT GAA CGG CCG CT (서열번호 10)
LSF-1_F : ACA GTG GAG TTC CTG TGG GAC (서열번호 11)
LSF-1_R : ATT TGT ACT CGG AAT GGC ACC (서열번호 12)
qRT-PCR 증폭 조건
Genes Number of cycles Tm
C7 35 63℃
CFH 35 63℃
Nanog 35 60℃
Oct4A 35 60℃
SOX2 35 60℃
LSF -1 35 60℃
< 참고예 5> 면역블롯 분석 ( Immunoblot analysis)
세포들은 protease inhibitor cocktail kit (P3100-005; GenDEPOT, Barker, TX), 및 phosphatase inhibitor (sc-45065; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 포함한 세포 용해 버퍼를 사용하여 분해하였다 (#9803; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). 20 ug의 세포 용해물을 포함하는 부분 표본은 SDS-polyacrylamide 젤 상에서 전기영동하여 분리하였고, 그리고 나서 transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% [v/v] methanol [pH 8.3])상에서 60 V와 40℃에서 180 분 동안 니트로셀루로즈 막 (Amersham, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 막은 상온에서 60분 동안 0.1% (v/v) Tween-20를 포함하는 5% (w/v) BSA의 PBS로 블락킹하고, 그리고 나서 표시된 항체와 배양하였다. 이차 항체에는 HRP-결합된 염소 항-토끼 IgG (1:5000; ADI-SAB-300-J, Enzo Life Bioscience) 또는 염소 항-마우스 IgG (1:5000; ADI-SAB-100-J, Enzo Life Bioscience)가 사용되었다. ECL western blot analysis system (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 블롯들을 현상하였다.
< 참고예 6> 통계학적 분석
하기의 결과들은 평균값 ± 표준 편차 (SD)로 표현하였다. 평균값들 사이에 대한 차이의 유의도는 two-tailed Student's t-테스트를 사용하여 결정하였다. 0.05 이하의 p-값은 통계적으로 유의 있다고 간주하였다. 정언적 변수 (categorical variables)들 사이의 결합은 Fisher's exact 테스트를 사용하여 분석하였다. 0.05 이하의 P-값은 통계적으로 유의 있다고 간주하였다. 통계적 분석에는 SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL)를 사용하였다.
< 실시예 1> 종양구 배양 ( Tumorsphere culture)을 사용한 간암 샘플로부터 암줄기세포 ( CSC , Cancer Stem Cell)의 분리
간 암줄기세포에 대한 새로운 표면 마커를 확인하기 위해서, 4 명의 환자 (3 명의 간 세포암 (hepatocellular carcinomas, HCC; HCC-1~HCC-3)과 1 명의 간세포의 담관암종 (combined hapatocellular-cholangiocarcinoma; HCC-4)에서 얻은 일차 종양 세포를 2D 배양 (2D culture)을 위해서 콜라젠으로 코팅된 플레이트와 종양 구 배양 (tumor sphere culture)을 위해 줄기 세포 배지로 보충된 낮은 접착성 플레이트에서 배양하였다. 자세한 일차 종양 세포 배양 방법은 다음과 같다.
아산 병원의 임상 시험 심사위원에서 윤리적 승인하에 일차 암세포들 (primary cancer cells)은 아산 바이오 자원 센터에서 수집된 일차 간암 조직에서 외과적으로 절제하여 얻었다 (IRB-20120112). 저장을 위해 간 시료를 얼리기 전에, 일차 암 세포주를 수립하기 위해 작은 조각의 암 조직을 분리하고 처리하였다. 구체적으로, 암 조직은 가위로 잘게 자르고, 이어서 그 조각들을 37℃의 DMEM/F12에서 60분간 1 mg/mL의 type IV collagenase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 사용하여 분해하였다. 배양 후에, 위 조직을 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum, 16000-044; Life Technologies)를 포함한 배지로 세척하였다. 상피 암 세포의 접착과 성장을 촉진하기 위해서, human epidermal growth factor (hEGF), hydrocortisone, insulin, transferrin, GA-1000, ascorbic acid, BSA-FAF, 및 10% (v/v) FBS 를 포함한 Hepatocyte Basal Medium (HBM; Lonza, Walkersville, MD)에서 일차 간암 세포를 배양하였다. 위 일차 간암 세포들은 5% CO2 및 37℃ 조건의 습식 배양기 안의 collagen type 1 그릇에 플레이팅 하였다. 낮은 접착성 그릇 안에서 세포를 구형으로 배양 (sphere culture)하기 위해서, 1X N2, 1X B27, 및 10 uM Rock inhibitor를 포함하는 HBM (-FBS) 및 5 n MHGF를 배양 배지로 사용하였다.
상기와 같은 방법으로 배양한 일차 간암 세포를 참고예 4의 방법으로 형태 분석을 수행한 결과 도 1에서 나타난 것과 같이 그릇에 부착된 암 세포들은 전형적인 상피 세포 형태를 나타냈고, 반면에 줄기 세포 배지에서 배양된 종양구는 낮은 접착성 플레이트에 형성되었다. 암줄기세포가 종양구 배양에 분리되었는지 여부를 확인하기 위해서, 3000 개의 종양구 세포들을 NOD-SCID (Nonobese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency) 마우스에 이식하였다. 종양구 세포를 마우스에 주입한 후 3-4달이 지났을 때 종양을 관찰할 수 있었고, 이를 통해서 종양구 배양에 암줄기세포가 존재하고 있음을 알 수 있었다. 도 2에서와 같이 3000 개의 종양구 세포들과 2D 배양 세포들을 NOD-SCID 마우스에 주입했을 때, 8 개의 대조구 2D 세포에서 겨우 2 개의 종양을 발견한 것과 비교하여 종양구 세포 이종이식 (xenografts)에서는 8 개의 중 7 개에서 종양을 관찰할 수 있었다.
또한, 상기 이종이식 된 종양이 출처가 된 원래 환자가 가진 종양의 특성을 여전히 보유하고 있는지 여부를 조사하기 위해 조직학적 분석 (Histological analysis)을 수행하였다.
참고예 4와 같은 방법으로 면역조직학적 분석을 수행하였다. 도 2에서와 같이 이종이식 된 종양과 일차 종양의 조직학적 유사성을 평가하기 위해서 헤마톡실린과 에오신 (H&E) 염색 또는 cytokeratin 7 (CK7), polyclonal carcinoembryonic antigen (p-CEA), 및 hepatocyte paraffin-1 (Hep Par1)에 대한 항체로 면역 염색을 수행하였다. 그 결과 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이 H&E 염색한 경우 이종이식 된 종양과 일차 종양 사이에 기본적인 세포적 및 조직학적 특징이 유사했고, CK7, p-CEA, 및 HepPar1에 대한 항체로 수행한 면역조직화학 염색의 경우도 이종이식 된 종양과 그들의 모 종양은 조직학적 유사성이 있었다.
참고예 4에서와 같은 방법으로 2D 배양과 종양구 배양에서 각각 전체 RNA를 추출한 후, 줄기성 인자 (Stemness factors)로 알려진 Nanog, Sox2, 및 Oct4에 대해서 qRT-PCR을 수행하여 그 발현양을 확인함으로써 암줄기세포가 종양구로 분리되었는지를 추가적으로 확인하였다. 도 4 내지 6에서 나타난 바와 같이, 종양구 세포들은 대조구 세포들에 비해서 줄기성 인자를 더 많이 발현했고, 이를 통해서 종양구에 암줄기세포 집단이 더 많이 존재하고 있음을 알 수 있다.
도 7 내지 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 종양구에서 암줄기세포가 존재하는 위 결과들이 간암 세포에서도 유효한지 확인하기 위해서 일차 간암 세포에서 종양구 배양을 형성하는 방법과 동일한 방법을 사용하여 간암 세포 주로부터의 종양구 배양을 생성하였다. 위 종양구 배양에 대하여 참고예 4와 같은 방법으로 전체 RNA을 추출한 후 qRT-PCR을 수행하여 줄기성 인자의 mRNA 수준이 증가됨을 확인하였다.
상기 결과들을 종합해 보면, 간 일차 또는 세포 주에서 유래한 암줄기세포가 종양구 배양에 분리되어 존재하고 있는 것을 알 수 있다.
< 실시예 2> 간의 암줄기세포에서 선척성 면역의 가장 핵심적인 요소중의 하나인 보체 (Complement)의 증가
실시예 1에서 종양구 배양에서 암줄기세포가 분리되어있다는 사실을 확인한 후에, FACS (Fluorescence-activated cell sorting) 분석을 이용하여 종양구 배양에서 줄기세포 마커 (Stem cell marker)의 발현 수준을 2D 배양 세포에서의 것과 대비하여 확인하였다.
FACS 분석은 다음과 같이 수행되었다. 일차 및 구형-배양 세포들은 PBS로 부유하고 30분 동안 0.1% (w/v) BSA 블락킹 시약에서 배양하였다. 그리고 나서, 세포들은 형광표지가 직접적으로 결합된 단클론 항체 (conjugated monoclonal antibody)인 항-human CD133-PE, 항-human EpCAM-PE, 항-human-CD90-APC (Miltenyi Biotec, Germany), 항-human CD44-FITC, 및 항-human CD49f-FITC (BD Biosciences)을 사용하여 4℃에서 60분 동안 염색하였다. 또한, 위 실험구와 동시에 대조구도 병렬적으로 배양하여 사용하였다. 아산 생명과학 실험실과 아산병원 유세포 분석법 거점시설에서 BD FACS CantoTM (BD Biosciences)를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다.
상기 얻어진 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112016076021399-pat00002
FACS 분석결과 4 개의 종양구 배양 중 2 개에서 EpCAM (epithelial cellular adhesion molecule)의 약간의 증가를 보이는 것으로 관찰되었다. 또한 CD49f 및 CD133는 4 개의 종양구 배양 중 오직 1개에서만 각각 증가하였다. 또한, 간암 줄기 세포 마커로 알려진 CD90는 모든 종양구 배양에서 유의미한 증가가 관찰되지 않았다.
상기와 같은 결과에 바탕하여, 간 종양 세포 집단에서 새로운 암줄기세포 마커를 선별하기 위해서 NanoString Counter GX 인간 면역학 분석을 사용하였다. NanoString 분석은 다음과 같이 수행되었다.
7일 차 환자로부터 일차 배양 세포와 구형-배양 세포의 전체 RNA를 참고예 4와 같은 방법으로 추출하였다. 상기 전체 RNA에 대하여 Counter GX Human Immunology Analysis system (NanoString Technologies, Inc)을 사용하여 cDNA microarray 분석을 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112016076021399-pat00003
표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, NanoString 결과에는 보체와 응고 케스케이드 (Coaculation cascade) 유전자들이 종양구 세포에서 가장 두드러지게 증가해 있었다.
또한, 상기의 결과에서 종양구에서 증가한 인자에 대해서, 참고예 4와 동일한 방법으로 qRT-PCR 분석을 수행하여 그 RNA 발현의 증가를 실시간으로 확인하였다. 도 10, 11에서 볼 수 있는 바와 같이 보체 단백질 C7 및 CFH는 일차 종양구 세포에서 2D 배양 세포에 비해서 mRNA 발현량이 높았다.
또한, 간암 세포 주에서 얻은 종양구 배양에서 참고예 4와 같은 방법으로 전체 RNA를 추출하고 이어서 qRT-PCR을 수행하여 일차 종양구 세포에서의 결과와 마찬가지로 보체 단백질의 mRNA 발현량이 종양구에서 증가하는지 여부를 확인하였다. 그 결과 도 12, 13에서 볼 수 있는 바와 같이 간암 세포 주에서 얻은 종양구 배양에서도 보체의 발현이 증가되어 있는 것을 확인했다. 또한, 도14에서 볼 수 있는 바와 같이, 간암 세포주 SNU449 및 Huh7에서 얻은 2D 배양과 종양구 배양에 대하여 참고예 5와 같은 방법으로 면역블롯 분석을 수행하여, 종양구에서 C7과 CFH mRNA의 발현이 증가됨과 더불어 그 단백질 발현도 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 공초점 현미경을 사용하여 종양구에서 mRNA의 발현과 단백질의 발현이 증가한 C7과 CFH의 세포내의 위치를 확인하였다. 하기와 같은 방법으로 면역형광 염색을 하고 공초점 현미경을 사용하여 관찰하였다.
구체적으로, 위에서 사용된 간암 세포주인 SNU449 및 Huh7 세포들을 PBS로 두 번 세척하고 상온에서 30분 동안 4% (v/v) 폼알데하이드로 고정하고 PBS로 다시 세 번 세척한 후, 상온에서 10분 동안 0.1% (v/v) Triton X-100의 PBS로 투과시켰다 (permeabilized). 투과 된 세포들은 PBS로 세 번 세척하고 3% (w/v) BSA의 PBS로 1 시간 동안 블락킹하였다. 그리고 나서, 세포들은 일차 항체와 이차 항체와 각각 1시간 동안 배양하였고, 각 항체의 배양 사이에 3 번씩 세척하였다. 핵은 PI로 대비 염색하였다. ZEN 2012 소프트웨어 및 X40 oil immersion 대물 렌즈를 사용하여 이미지들을 얻었다.
그 결과, 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이 C7과 CFH는 주로 종양구 세포의 핵에 위치하였다.
상기와 같은 결과들를 종합해 볼 때, C7과 CFH는 종양구 세포에서 농축되어 있는 보체 인자로서, 이들은 핵에서 존재하는 보체 단백질이며, 종래에 알려지지 않은 새로운 기능을 함을 알 수 있다.
< 실시예 3> 보체 C7과 CFH에 의한 줄기성 인자 발현 및 종양구 형성의 조절
간 암줄기세포에서 C7과 CFH의 역할을 결정하기 위해서, 도 16에서 보는바와 같이 siRNA를 사용하여 이 두 보체 유전자의 발현을 저해했다 (silence). C7과 CFH의 RNA의 녹다운 (Knockdown)은 다음과 같은 방법으로 수행되었다.
제조사의 프로토콜에 따라서 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 C7, CFH를 타겟팅하는 서열의 siRNA들 또는 뒤섞인 서열 (scrambled sequence)의 siRNA를 최종 농도가 50 nM가 되도록하여 두 개의 간암세포 주인 SNU449 및 Huh7에 트랜스펙션 (Transfection)하였다. 트랜스펙션 후 7 일째에, 검정을 위해 세포들을 수집하였다. 인간의 C7, CFH, 및 LSF-1을 타겟팅 하는 siRNA 서열과 뒤섞인 서열의 siRNA 서열은 하기에 나타나 있다 (하기 서열은 5'에서 3' 방향으로 표시되어 있다).
C7_#1_F : ACA UAG AAC UUA CUG GAA AUU (서열번호 13)
C7_#1_R : UUU CCA GUA AGU UCU AUG UUU (서열번호 14)
C7_#2_F : CAU AGA ACU UAC UGG AAA UUU (서열번호 15)
C7_#2_R : AUU UCC AGU AAG UUC UAU GUU (서열번호 16)
CFH_#1_F : GCA AAG AAG UGA AAG UGG AUU (서열번호 17)
CFH_#1_R : UCC ACU UUC ACU UCU UUG CUU (서열번호 18)
CFH_#2_F : ACA CAG AAC UGG AGA UGA AUU (서열번호 19)
CFH_#2_R : UUC AUC UCC AGU UCU GUG UUU (서열번호 20)
LSF-1_#1 F: GCAGAUUUAUUGAAAUUAAUU (서열번호 29)
LSF-1_#1 R: UUAAUUUCAAUAAAUCUGCUU (서열번호 30)
LSF-1_#2 F: GUAGAAACUCUACAUAAUUUU (서열번호 31)
LSF-1_#2 R: AAUUAUGUAGAGUUUCUACUUU (서열번호 32)
LSF-1_#3 F: GGAAUUGUGUGAUGUUUAAUU (서열번호 33)
LSF-1_#3 R: UUAAACAUCACACAAUUCCUU (서열번호 34)
Scrambled_siRNA_F : CCU CGU GCC GUU CCA UCA GGU AGU U (서열번호 21)
Scrambled_siRNA_R : CUA CCU GAU GGA ACG GCA CGA GGU U (서열번호 22)
상기와 같은 방법으로 SNU449 및 Huh7 세포에서 C7과 CFH 발현을 저해한 후참고예 3과 같은 방법으로 형태분석을 수행하였다. 그 결과, 도 16의 하단 왼쪽에서 볼 수 있는 바와 같이 SNU449 세포에서 C7과 CFH 발현을 저해한 것에서는 종양구가 잘 형성되지 않았고, 반면에 Huh7 세포에서 C7과 CFH의 녹다운 한 경우는 분화하여 섬유아세포와 유사한 형태로 세포가 부착하였다.
C7과 CFH 유전자의 발현을 증가시키기 위해, 일시적으로 트랜스펙션하는 방법과 안정적으로 트랜스펙션하는 방법을 사용하였다. 일시적 트랜스펙션은 제조사의 프로토콜에 따라서 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 수행하였다.
안정적으로 트랜스펙션은 다음과 같이 수행되었다. 대조구 플라스미드와 C7, CFH, 및 LSF-EGFP-C1 발현 벡터들은 제조사의 프로토콜에 따라서 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 SNU449 및 Huh7 세포에 트랜스펙션하였다. 약에 저항성 있는 클론을 얻기 위하여 G418 (Invitrogen; SNU449에 대하여 800 ug/mL 그리고 Huh7에 대하여 500 ug/mL)과 함께 4주 이상 배양하여 생존하는 세포들을 선별하였다. 안정적으로 위 플라스미드를 발현하는 단일 클론을 선별하고, 그것에서 C7, CFH, 및 LSF-1 발현 수준을 참고예 5와 같은 방법으로 면역블롯 분석을 수행하여 평가하였다.
상기의 녹다운 실험 결과와 일치하게 도 17, 18에서 볼 수 있는 바와 같이, C9 또는 CFH를 상기 방법으로 트랜스펙션하여 일시적으로 발현 (transient expression)시킨 경우 줄기성 인자인 Nanog, Oct4, Sox2, 및 c-Myc의 발현 수준이 증가하였다. 상기의 일시적 트랜스펙션 결과와 유사하게, 도 19와 20에서와 같이 C7과 CFH을 안정적으로 발현 (stable expression)시킨 경우 비록 세포주-특이적인 차이가 있었지만, 앞서 와 같이 줄기성 인자의 발현이 증가하였다. 도 19에서 볼 수 있는 바와 같이, SNU449 세포에서 유래한 C7 안정적 발현 세포의 경우 Oct4와 c-Myc의 발현이 증가했고, Huh7 세포에서 유래한 C7 안정적 발현 세포의 경우 Oct4, Sox2, 및 c-Myc가 증가했다. 도 20에서 볼 수 있는 바와 같이, SNU449 세포에서 유래한 CFH를 안정적 발현 세포의 경우, Oct4, Nanog, Sox2, 및 c-Myc의 발현이 증가했고, 반면에 Huh7 세포에서 유래한 CFH 안정적 발현 세포의 경우에는, Oct4와 c-Myc의 발현이 증가하였다.
보체 C7과 CFH에 의해서 줄기성 인자가 조절되는 위의 결과를 바탕으로, 역으로 줄기성 인자들이 보체 단백질의 발현을 조절하는지 확인해보았다. 그 결과 도 21에서 볼 수 있는 바와 같이 줄기성 인자들에 의해서 보체 단백질의 발현이 조절되는지 않았다.
또한, Huh7 세포에서 유래한 C7 및 CFH를 안정적 발현하는 세포주 (C7 및 CFH stable cell lines)에 대하여 참고예 3과 같은 방법으로 형태 분석을 수행했다. 그 결과, 도 22에서 볼 수 있는 바와 같이 대조구 세포에 비해서 C7 및 CFH를 안정적 발현하는 세포주에서 더 많은 종양구를 형성했다 (도 22의 상단에서 검은 원은 종양구의 형성을 나타냄; 수량화(종양구의 개수)는 도 22의 하단에 나타나 있다).
상기와 같은 결과를 종합하여, C7과 CFH가 간암세포의 줄기성을 유지하기 위해서 줄기성 인자를 증가시킴을 알 수 있다.
< 실시예 4> 보체 단백질의 조절을 통해 줄기성 인자의 조정자 (mediator of stemness factor) 역할을 하는 LSF -1의 확인
간 암줄기세포에서 보체의 역할을 확인하기 위해서, C7과 CFH가 줄기성 인자를 조절하는 내부 메커니즘을 살펴보았다. C7과 CFH은 전사 활성이 있음이 알려진 바 없기 때문에, C7과 CFH에 의한 상기 조절에 관여하는 중간자 전사 인자 (mediating transcription factor)가 존재할 것이라고 예상하고, 중간자 전사 인자로서 가능한 후보자들 가운데 LSF-1에 주목하였다.
종양구 세포에서 LSF-1의 발현이 증가되어 있는지 확인하였다. 도 23, 24에서 나타난 것과 같이, SNU449 세포와 Huh7 세포에서 형성된 2D 배양과 종양구 배양에서 참고예 4와 참고예 5에서 나타난 방법을 각각 사용하여 각각 qRT-PCR과 면역블롯을 수행하였다. 그 결과 LSF-1의 mRNA 및 단백질의 발현이 SNU449와 Huh7에서 유래한 종양구 모두에서 증가하였다.
또한, 도 25에서와 같이 Huh7에서 유래한 2D 배양과 종양구를 Qproteome Cell Compartment Kit (Catalog #37502; Qiagen)를 사용하여 세포질과 핵으로 분별(fractionation)하고 그에 대해서 각각 면역 블롯을 수행하였다.
상기와 같은 방법으로 세포질과 핵으로 분별을 수행한 후 면역블롯을 한 결과, 도 25에서 볼 수 있는 바와 같이 종양구 세포의 LSF-1는 세포질 보다 핵 내에서 더 발현이 증가해 있었다. 또한, 실시예 2과 같은 방법으로 SNU449와 Huh7 세포를 면역형광염색을 하고 공초점 현미경을 사용하여 관찰하였다. 도 25에서 볼 수 있는 바와 같이, SNU449와 Huh7 세포 모두에서 LSF-1은 대개 핵에 위치하였고, LSF-1의 양은 종양구에서 증가해 있었다.
C7과 CFH에 의해서 LSF-1의 발현이 조절되는지 확인하기 위해서, 실시예 3과같은 방법으로 제조사의 프로토콜에 따라서 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 C7과 CFH를 SNU449와 Huh7 세포에 트랜스펙션하였다. 도 27, 28에서 볼 수 있는 바와 같이, C7과 CFH를 트랜스펙션하여 그 단백질 수준을 증가시킨 경우, SNU449와 Huh7 세포 모두에서 LSF-1의 단백질 발현 수준이 증가하였다. 이러한 결과를 통해서, LSF-1은 C7과 CFH에 의해서 그 발현이 조절되며, C7과 CFH의 하위 인자임을 알 수 있다. 또한, 실시예 3에서와 같은 방법으로 C7과 CFH를 녹다운 시켰을 경우, 도 29, 30에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포 내부 (endogenous)의 LSF-1가 감소됨에 따라서 줄기성 인자들의 단백질 발현도 동시에 감소함을 확인했다.
그 다음에, LSF-1가 암 세포의 줄기성에 어떤 영향을 미치는지 살펴보기 위해서 SNU449와 Huh7 세포에서 실시예 3과 같은 방법으로 LSF-1을 사일런싱 (silencing)하고 참고예 3과 같은 방법으로 형태 분석을 수행하였다. 도 31에서 볼 수 있는 바와 같이, SNU449와 Huh7 세포에서 LSF-1 녹다운 한 경우 종양구 형성이 저해되었고, 이러한 결과는 실시예 3의 도 16에서 보체 유전자 (C7 또는 CFH)를 녹다운 했을 때의 결과와 유사했다.
상기의 SNU449와 Huh7 세포에서 LSF-1을 사일런싱 (실시예 3의 siRNA를 사용)하여 형태 분석에 사용한 세포의 추출물을 사용하여 참고예 5와 같은 방법으로 면역블롯을 수행하였다. 그 결과 도 32에서 관찰할 수 있는 것과 같이 LSF-1을 녹다운 한 경우 Nanog, Oct4, Sox2, 및 c-Myc등의 줄기성 인자의 발현이 현저하게 감소했다.
상기의 SNU449와 Huh7 세포에서 LSF-1의 사일런싱 (실시예 3의 siRNA를 사용; 도 42의 A) 또는 LSF-1 트랜스펙션 (실시예 3의 LSF-1 발현 벡터 트랜스펙션; 도 42의 B)이 C7, CFH 등의 보체 단백질의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 참고예 5와 같은 방법으로 면역블롯을 수행하였다. 그 결과 도 42에서 관찰할 수 있는 것과 같이 LSF-1을 녹다운하거나 과발현시킨 경우 C7, CFH 등의 보체 단백질의 발현 수준에 영향이 없음을 확인하였다.
위와 같은 결과들을 종합하여 판단할 때, LSF-1은 C7 또는 CFH에 의해서 그발현이 유도되는 전사인자이며, LSF-1은 간의 암 줄기세포에서 줄기성 인자의 발현을 조절하는데 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
< 실시예 5> LSF -1에 의한 Nanog , Oct4 , Sox2 , 및 c- Myc 프로모터의 직접적 조절과 LSF -1 발현에 의한 종양구 형성과 in vivo 종양 성장의 증가
LSF-1이 줄기성 인자의 발현에서 작용하는 역할을 보다 명확하게 확인하기 위해서, Nanog, Oct4, Sox2, 및 c-Myc에 대한 프로모터 리포터 플라스미드 (김장환 박사로부터 얻음 [한국생명공학연구원, 대전, 대한민국])를 이용하여 LSF-1이 상기의 프로모터들을 활성화시키는지를 다음과 같은 방법을 사용하여 확인했다.
구체적으로, Luciferase 리포터 검정을 위해서, 세포들을 24-웰 플레이트에 플레이팅하였고, 그 다음날에 공벡터 (pGL3-basic), pGL3-C7 프로모터 (C7 프로모터를 포함하는 luciferase 리포터 플라스미드), pGL3-CFH 프로모터, pGL3-LSF-1 프로모터, 및 내부 대조구로서 Renilla luciferase 발현 플라스미드 (SV40-Luc)가 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션은 실시예 3에서와 같은 방법으로 제조사의 프로토콜에 따라서 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. Luciferase 검정은 Dual Luciferase Reporter assay kit (E1910, Promega)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라서 수행하였다.
도 33, 34에서 볼 수 있는 바와 같이, SNU449 및 Huh7 세포 모두에서 LSF-1과 각각의 프로모터를 공동으로 트랜스펙션했을 때, LSF-1이 Nanog, Oct4, Sox2, 및 c-Myc 프로모터를 활성화시켰다.
또한, 다음과 같이 크로마틴 면역침강 (Chromatin immunoprecipitation)방법을 사용하여 LSF-1과 Oct4, Sox2, 및 c-Myc 유전자의 프로모터와의 상호작용을 확인했다. 구체적으로, SNU449 및 Huh7 세포들을 1% (v/v) 폼알데하이드로 크로스링크 (cross-link)하고, 그리고 나서 얼음에서 10 분 동안 용해 버퍼 (50mM Tris-HCl [pH 8.1], 1% (w/v) SDS, 10mM EDTA, 및 protease inhibitor cocktail)상에서 배양하였다. 초음파 (Sonics vibra-cell, VCS X 130) 처리 후에, 샘플들을 항-LSF1 항체 또는 정상 항-마우스 IgG (N103; Oncogene)로 면역침강하였다. 면역 침강된 DNA는 PCR purification kit를 사용하여 분리하고 정제하였다. 또한, 줄기성 프로모터 프라이머 서열중에서 LSF-1이 결합하는 부위를 증폭하기 위해서 하기의 서열번호 23에서 서열번호 28까지의 특이적인 프라이머 를 사용하여 PCR을 수행하였다.
Oct-4_F : ATT CTG TGT GAG GGG ATT GG (서열번호 23)
Oct-4_R : GAC ATC TAA TAC CAC GGT AGG (서열번호 24)
SOX2_F : GGA TAA CAT TGT ACT GGG AAG GGA CA (서열번호 25)
SOX2_R : CAA AGT TTC TTT TAT TCG TAT GTG TGA GCA (서열번호 26)
c-Myc_F : GCC TGC GAT GAT TTA TAC TCA C (서열번호 27)
c-Myc_R : AAA CAG AGT AAG AGA GCC G (서열번호 28)
상기와 같은 방법으로 크로마틴 면역침강을 수행하여, 도 35에서 확인 할 수 있는 바와 같이 LSF-1이 Oct4, Sox2, 및 c-Myc 유전자의 프로모터와 상호작용함을 알아 냈다.
상기의 결과를 종합하여 LSF-1이 직접적으로 줄기성 인자와 결합하여 그 전사를 조절함을 알 수 있었다.
또한, 실시예 3에서와 같은 방법을 사용하여 제작된 SNU449와 Huh7 세포에 기초한 안정적으로 LSF-1을 발현하는 세포 주를 이용하여, 도 36에서 볼 수 있는 바와 같이 세포 내부에서 안정적으로 LSF-1을 발현하는 세포의 경우 줄기성 인자의 발현이 증가됨을 확인하였고, 도 37에서 볼 수 있는 바와 같이 세포 내부에서 안정적으로 LSF-1을 발현하는 세포에서 종양구 형성이 증가하였다 (도 37의 하단은 상단의 종양구 형성을 수량화 하여 그래프로 나타낸 것임).
마지막으로 in vivo에서 LSF-1이 종양을 성장시키는 영향을 미치는지 확인하기 위해서 다음과 같은 방법으로 마우스 이종이식 종양 모델 분석을 수행하였다. 구형으로 배양된 4 종류의 모든 세포들은 6주에서 8주 사이의 NOD/SCID 마우스 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)에 이식하였다. 구체적으로, 환자에서 유래한 3 X 103개의 구형 암 세포들은 100 uL의 Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA)상에서 부유시키고, 이것을 NOD/SCID 마우스 등의 피하지방층을 통해 주입하였다. 암 세포들을 주입한 후 3-4 개월 후에, 종양의 크기가 1 cm3 이상이 되었을 때, 마우스들은 40 mg/kg Zoletil (Virbac Laboratories, BP 27-06511 Carros, France) 및 5 mg/kg Rum pun (Bayer Korea, South Korea) 혼합물을 복강내 주사하여 마취시키고, 그 종양을 외과적으로 제거하여 수집하였다.
도 38에서 볼 수 있는 바와 같이, 위와 같은 방법으로 안정적으로 LSF-1를 발현하는 세포 주를 마우스에 이종이식 (xenografted)했을 때, 대조구 세포를 마우스에 이종이식 했을 때와 비교하여 종양의 크기가 상당히 증가했다 (도 38 오른쪽은 왼쪽 결과를 수량화하여 그래프화한 것임).
위와 같은 결과들을 종합하여 판단하건대, LSF-1은 간암 세포의 줄기성을 증가시킴으로써 종양유전자 (oncogene)로 작용한다.
< 실시예 6> 간 세포암 조직에서 C7, CFH , 및 LSF -1의 높은 발현
앞서 확인한 유전자 발현 증가의 결과를 다음과 같은 방법으로 임상 샘플에서 확인하였다. 20 종류의 간 세포암 (대응되는 비종양 조직쌍은 아산병원의 생명-자원 센터에서 검색되었음)에서 C7, CFH 및 LSF-1의 발현을 분석하였다. 본 분석에 사용된 비종양 간 실질 (parenchyma)은 각각 간경변 (cirrhosis) (n = 11), 만성 간염 (chronic hepatitis) (n = 3), 또는 최소한의 조직학적인 변화 (n = 6)를 나타냈다. 데이터의 출처는 익명이며, 20 명 환자의 임상병리적인 특징들은 표 4 및 표 5에 나타내었다.
Figure 112016076021399-pat00004
(N, no; Y, yes; ND, not detected; E-S grade, Edmondson-Steiner grade)
Figure 112016076021399-pat00005
(N, no; Y, yes; ND, not detected; HBV, hepatitis B virus; HCV, hepatitis C virus; NBNC, non-B non-C virus.)
정상 간은 보체 단백질의 주요한 출처이므로, 종양 조직에서의 보체 단백질의 발현과 주위의 비종양성 간 조직에서의 보체 단백질 발현을 참고예 5과 같은 방법으로 면역블롯을 수행하여 비교하였다. 도 39에서 볼 수 있는 바와 같이 대응되는 정상 조직과 대비할 때 16 (80%)개의 종양 샘플들에서 LSF-1이 높게 발현되었고, 이는 CFH 및/또는 C7의 높은 발현과 연관되어 있었다.
실시예 5에서와 같은 방식으로 마우스에 이종이식하여 종양의 크기를 비교해 본 결과, LSF-1의 양이 높은 세포를 마우스에 이종이식한 경우 대조구 세포를 마우스에 이종이식 했을 경우에 비하여 더 큰 종양이 발생했다 (7.3 cm vs 4.3 cm).
세포 주를 이용한 실시예 5 및 6의 결과를 바탕으로 판단하건대, LSF-1 발현이 C7과 CFH의 발현과 기능적으로 연결되어 있기 때문에, 임상수준에서도 위와 같은 기능적 연결이 존재하는지 확인해 보았다. 상기의 20 종류의 간 세포암에 대하여 주위의 비종양성 간 조직에 비하여 C7/CFH/LSF-1이 높게 발현하는 그룹 (n = 8)과 낮게 발현하는 그룹 (n = 12)으로 나누어 할당하여 실시예 5와 같은 방법을 사용하여 마우스 이종이식 종양 모델 분석을 수행하여 그들의 임상병리적인 특징을 분석했다. 그 결과, 도 40에서 볼 수 있는 바와 같이C7/CFH/LSF-1-이 높게 발현되는 그룹의 경우 종양의 크기가 더 컸다 (9.35 cm vs 4.6 cm, p = 0.01827).
<110> THE ASAN FOUNDATION <120> Composition for liver cancer diagnosis comprising of interacting molecules with complement proteins <130> dpp20160222 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7_F <400> 1 gagatcctgc gttggagaaa c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH_R <400> 2 tctttcaagg caggaggtga t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_F <400> 3 tgcactgaat ctggatggcg t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_R <400> 4 tctcggagca ggtatccagc c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_F <400> 5 acctcagcct ccagcagatg ca 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_R <400> 6 ggtgctgagg ccttctgcgt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4_F <400> 7 gaaggatgtg gtccgagtgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4_R <400> 8 gcctcaaaat cctctcgttg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2_F <400> 9 aaaacagccc ggaccgcgtc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2_R <400> 10 ctcgtcgatg aacggccgct 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSF-1_F <400> 11 acagtggagt tcctgtggga c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSF-1_R <400> 12 acagtggagt tcctgtggga c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7_#1_F <400> 13 acauagaacu uacuggaaau u 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7_#1_R <400> 14 uuuccaguaa guucuauguu u 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7_#2_F <400> 15 cauagaacuu acuggaaauu u 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7_#2_R <400> 16 auuuccagua aguucuaugu u 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH_#1_F <400> 17 gcaaagaagu gaaaguggau u 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH_#1_R <400> 18 uccacuuuca cuucuuugcu u 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH_#2_F <400> 19 acacagaacu ggagaugaau u 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFH_#2_R <400> 20 uucaucucca guucuguguu u 21 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled_siRNA_F <400> 21 ccucgugccg uuccaucagg uaguu 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled_siRNA_R <400> 22 cuaccugaug gaacggcacg agguu 25 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4_F <400> 23 attctgtgtg aggggattgg 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4_R <400> 24 gacatctaat accacggtag g 21 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2_F <400> 25 ggataacatt gtactgggaa gggaca 26 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2_R <400> 26 caaagtttct tttattcgta tgtgtgagca 30 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc_F <400> 27 gcctgcgatg atttatactc ac 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7_F <400> 28 gcctcaaaat cctctcgttg 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSF-1_#1 F <400> 29 gcagauuuau ugaaauuaau u 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSF-1_#1 R <400> 30 uuaauuucaa uaaaucugcu u 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSF-1_#2 F <400> 31 guagaaacuc uacauaauuu u 21 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSF-1_#2 R <400> 32 aauuauguag aguuucuacu uu 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSF-1_#3 F <400> 33 ggaauugugu gauguuuaau u 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSF-1_#3 R <400> 34 uuaaacauca cacaauuccu u 21

Claims (20)

  1. C7 단백질 및 C7 단백질을 암호화 하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 포함하는 간암 세포 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, CFH 단백질 및 CFH 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 추가로 포함하는, 간암 세포 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, LSF-1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 상호작용하는 물질을 추가로 포함하는, 간암 세포 검출용 조성물.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상호작용하는 물질은 상기 단백질 또는 유전자와 결합하는 소분자 화학물질, 단백질, 펩타이드, 및 핵산 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 간암 세포 검출용 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간암 세포는 간암 줄기세포를 포함하는 것인, 간암 세포 검출용 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 간암 세포 검출용 조성물을 포함하는 간암 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 간암 세포는 간암 줄기세포를 포함하는 것인, 간암 진단용 조성물.
  8. 환자로부터 분리된 생물 시료 내의 C7 단백질 및 C7 단백질을 암호화 하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단에 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, CFH 단백질 및 CFH 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 간암 진단에 정보를 제공하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, LSF-1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 간암 진단에 정보를 제공하는 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간암은 간암 줄기세포를 포함하는 것인, 간암 진단에 정보를 제공하는 방법.
  12. C7 단백질 및 C7 단백질을 암호화 하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, CFH 단백질 및 CFH 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 추가로 포함하는, 간암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  14. 제12항에 있어서, LSF-1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 추가로 포함하는, 간암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 상기 단백질 또는 유전자에 대한 소분자 화학물질, siRNA, shRNA, 압타머, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 간암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간암은 간 암줄기세포를 포함하는 것인, 간암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  17. 세포 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
    상기 세포 시료에서의 C7 단백질 및 C7 단백질을 암호화 하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표적물질의 수준을 측정하는 단계;
    상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료에서의 표적 물질의 수준을 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료에서의 표적 물질의 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료에서의 표적 물질의 수준이 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료에서의 표적 물질의 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 화합물을 간암의 예방 또는 치료 약물의 후보 화합물로 결정하는 단계
    를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료 약물의 스크리닝 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 간암은 간암 줄기세포를 포함하는 것인, 간암의 예방 또는 치료 약물의 스크리닝 방법.
  19. 세포 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
    상기 세포 시료에서의 C7 단백질 및 C7 단백질을 암호화 하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표적물질의 수준을 측정하는 단계;
    상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료에서의 표적 물질의 수준을 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료에서의 표적 물질의 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 후보 화합물을 접촉시킨 세포 시료에서의 표적 물질의 수준이 후보 화합물을 접촉시키지 않은 세포 시료에서의 표적 물질의 수준보다 낮은 경우, 상기 후보 화합물을 간암 줄기세포 억제제의 후보 화합물로 결정하는 단계
    를 포함하는, 간암의 줄기세포 억제제의 스크리닝 방법.
  20. C7 단백질 및 C7 단백질을 암호화 하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 포함하는, 간암 줄기세포 저해용 조성물.
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