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KR101968779B1 - 진단용 펩티드의 검출 - Google Patents

진단용 펩티드의 검출 Download PDF

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KR101968779B1
KR101968779B1 KR1020137034027A KR20137034027A KR101968779B1 KR 101968779 B1 KR101968779 B1 KR 101968779B1 KR 1020137034027 A KR1020137034027 A KR 1020137034027A KR 20137034027 A KR20137034027 A KR 20137034027A KR 101968779 B1 KR101968779 B1 KR 101968779B1
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Abstract

혈액 유래 샘플 내에서 시트룰린을 포함하는 말단 항체 결합 부위를 갖는 SOCS-2, 알파 1 항 트립신, 베르시칸, 비글리칸, 라미닌, 또는 다른 단백질의 시트룰린화 절편에 대한 분석은 류마티스성 관절염 또는 섬유증 질환에 대한 진단적 타당성을 보여준다.

Description

진단용 펩티드의 검출{DETECTION OF DIAGNOSTIC PEPTIDES}
본 발명은 혈액순환(circulation) 내의 시트룰린화(citrullinated) 펩티드에 대한 분석에 관한 것이며, 복수의 생리학적 증상 및 질환에 대해 진단적으로 유의미한 정보를 생성하는 것과 관련이 있다.
아미노산 아르기닌을 시트룰린으로 변형하는 것은 PAD 효소(Peptidyl arginine deiminase)의 존재에 의해 촉진되는 번역후 변형(posttranslational modification)이다. 시트룰린(citrulline)의 존재와 아르기닌으로부터의 변형은 RA 환자에서 특히 중요한데, 그 이유는 다수의 자가항체(autoantibody)가 시트룰린에 특이적인 것으로 나타났기 때문이다. 상기 자가항체는 류마티스성 인자(Rheumatoid Factor)와 같은 종래의 RA의 마커 비교하여 증가된 특이성 및 민감성을 갖는다.
충분한 증거가 있는 것은 아니지만, 콜라겐 및 다른 단백질에 대한 자가면역이 RA의 경우에 발병과정(pathogenesis)과 관련이 있을 수 있고, 따라서 자가면역(자가항체)의 경로를 따라가면 상기 질환의 발병과정의 더 많은 증거를 발견하게 될 수 있음이 제시된다.
시트룰린화는 보통 아폽토시스체(apoptotic body)에서 발견되기 때문에 분해(degradation)에 대한 마커로 작용할 수 있다.
시트룰린화 펩티드, 특히 고리형(cyclic) 시트룰린화 펩티드에 대한 인간 항체(항-CCP 항체)의 검출이 류마티스성 관절염의 실험실 진단 및 모니터링에서는 표준이지만, 인간 혈청 또는 혈장 내의 시트룰린화 단백질을 정량화하는 것의 임상적 이용성에 대해서는 상대적으로 적은 연구가 보고되었다.
타키자와 및 동료들(Takizawa et al., 2006)은 인간 체액에서 시트룰린화 자가항원의 존재를 조사하였다. 각각 피브리노겐으로부터 기원하는 합성 펩티드인 R16Cit(EGGGVR*GPRVV) 및 R252Cit(GNEITR*GGSTS)에 대해 유발된 2가지 단일클론 항체, 즉 cF16.1 및 cF252.1을 시트룰린화 피브리노겐을 검출하기 위한 ELISA에서 코팅 항체로 사용하였다(R*은 아르기닌으로부터 치환된 시트룰린을 나타낸다). 상기 2가지 단일클론 항체의 정확한 에피토프(epitope)-특이성은 보고되지 않았다. 류마티스성 관절염을 갖는 환자로부터 기원하는 활액에 대해 ELISA에서 양성 신호가 검출되었지만, 모든 RA (및 대조군) 혈장 샘플은 음성으로 남아 있었고, 타키자와는 피브리노겐은 혈액에서 시트룰린화 되지 않는다고 결론내렸다.
혈액순환에서 시트룰린화 피브리노겐이 없는 것은 단지 비-시트룰린화된 형태로만 피브리노겐-β 및 피브로넥틴을 함유하는 순환하는 면역 복합체를 보고한 RA 환자의 다른 연구(Van Steendam et al., 2010)에서 나중에 확인되었다. 이와 대조적으로, 시트룰린화 비멘틴(vimentin) 및 소량의 피브리노겐-β가 RA를 갖는 환자의 활액 유래의 면역 복합체에서 검출되었다.
창 및 동료들(Chang et al., 2005)은 RA 환자의 혈장에서 시트룰린화 피브로넥틴의 존재를 보고하였다. 비록 그 레벨(level)이 정량화되지는 않았지만, 이들은 건강한 대조군 및 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosis, SLE)을 갖는 환자와 비교하여 RA 혈장에서 더 높은 것으로 보고되었다. 이들은 코터(coater)로서 인간 피브로넥틴에 결합하는 단일클론 항체(Abcam)를 도입하는 샌드위치 ELISA를 사용하였고, 검출자(detector)로는 항-시트룰린 토끼 항체(Biogenesis)를 사용하였다. 상기 샌드위치 분석에 의해 검출된 피브로넥틴 분자의 특성분석은 제공되지 않았다. 그러나, 상기 분석에 포함되는 항체는 특정 단백질분해성 시트룰린화 피브로넥틴 네오에피토프를 정량화하는 역할은 하지 않을 것인데, 그 이유는 이들은 온전한(intact) 시트룰린화 피브로넥틴뿐만 아니라 상기 코팅 항체에 의해 인식되는 헤파린-결합 도메인 내의 에피토프를 공유하는 시트룰린화 피브로넥틴 절편과도 구분될 수 없기 때문이다.
또한, 자오 및 동료들(Zhao et al., 2008)은 RA 혈장으로부터 기원하는 높은 분자량의 면역 복합체 내의 시트룰린화 피브리노겐의 존재를 보고하였다. 간략하게, RA 혈장 샘플로부터 얻어진 면역 복합체를 분획화한 후, 시트룰린화 피브리노겐의 존재를 면역블롯(immunoblot)에 대한 항-시트룰린 검출 키트(Upstate, Chicago, IL, USA)를 이용하여 결정하였다. 이러한 밴드는 건강한 대조군 혈장의 대응하는 면역블롯에서는 부재하였다.
틸레만 등(Tilleman et al., 2008)은 염증성 관절염, 주로 류마티스성 관절염을 갖는 환자로부터 얻어진 활액 세포질성 단백질 추출물 내의 시트룰린화 비멘틴의 절편의 존재를 보고하였다. 질량 분광분석법에 의해, 시트룰린화 피브리노겐, 시트룰린화 피브로넥틴 및 시트룰린화 비멘틴은 RA를 갖는 환자의 활액 내에서 검출되었다(Tabushi et al., 2008).
또한, RA에서의 대부분의 자가항체는 다른 질환을 갖는 환자에서도 발견되며, 따라서 제한된 진단적 이용성을 갖는다. 그러나, 일부 (상대적으로) 특이적인 자가항체가 특히 시트룰린화 잔기를 운반하는 것들에서 개시되어 있으며, 이들은 시트룰린화 필라그린(filaggrin), 시트룰린화 비멘틴 및 고리형 시트룰린화 펩티드를 포함한다(van Galen et al., 2005; Schellekenes et al., 1998).
룬드그렌 등(Lundgren et al., 2005)은 시트룰린화 타입 Ⅱ 콜라겐이 유의미한 관절염유발성(arthritogenic) 잠재력을 가질 수 있음을 제시한다. 이후의 보고는 RA 환자의 활액에서 시트룰린화 3중 나선형 타입 Ⅱ 콜라겐 에피토프가 존재함을 확인하였고(Uysal et al., 2009), 타입 Ⅱ 콜라겐(자연형 및 시트룰린화된 형 모두)에 대한 자가면역은 RA 병원성에서 중요한 인자인 것으로 제시되었다. 활액 내의 시트룰린화 타입 Ⅱ 콜라겐을 검출은 포획자(capture)로서 자연형 타입 Ⅱ 콜라겐에 대한 단일클론 항체 및 검출자 항체로서 시트룰린화 타입 Ⅱ 콜라겐에 결합하는 단일클론 ACC2를 이용함으로써 달성되었다. 후자의 항체는 시트룰린화 피브리노겐과 교차-반응성이 있었다(Uysal et al., 2009).
혈액순환 내의 시트룰린 레벨의 정량화 후, 탈단백질화(deproteinisation) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 정량화는 소장 상피 방사선 손상의 생리학적 마커인 것으로 보고되었다(Lutgens et al., 2003).
이제 본 발명자들은 시트룰린의 존재와 상기 펩티드의 말단 아미노산 서열을 결합시키는 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체를 이용하여 혈액 또는 혈장과 같은 그의 유체 성분에서 시트룰린화 펩티드가 검출될 수 있음을 확립하였다. 본 발명자들은 단백질 절편은 상기 절편의 말단 또는 그 근방에 시트룰린이 존재할 때 혈액순환 내에서 우선적으로 생존한다는 가설을 세운다. 특정 아미노산 서열의 문맥(context)에서 시트룰린에 대해 특이성을 갖는 항체를 사용하면 상기 아미노산 서열이 유래하는 특정 단백질의 절편으로서 기원하는 펩티드를 검출하도록 한다. 이것은 상기 시트룰린화가 다양한 프로티나아제에 의한 분해에 대해 변경된 저항성을 부여하기 때문일 수 있다. 이러한 펩티드의 정량화는 해당 단백질의 생산 및/또는 분해가 변경되는 다양한 질환 상태에 대한 진단 정보가 얻어지도록 한다.
따라서, 본 발명은 이제 혈액 또는 그의 유체 성분을 포함하는 샘플에서 단백질의 시트룰린화 절편을 분석하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 샘플을 시트룰린을 포함하는 말단 항체 결합 부위를 갖는 상기 단백질의 시트룰린화 절편에 대해 특이적인 결합 친화성을 갖는 항체 또는 그의 절편과 접촉시키는 단계, 및 상기 단백질 절편에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 항체 절편의 항체의 결합은 특이적인 말단 아미노산 서열 및 상기 시트룰린 모두가 상기 결합 부위에 존재하는 것을 필요로 한다. 상기 시트룰린은 상기 서열에서 완전히 말단 위치일 수 있으며, 이것은 항체 결합을 위해 필요할 수 있다. 상기 에피토프의 위치는 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체에 의해 요구되는 아미노산 서열은 상기 단백질에 대해 특이적이다.
바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 절편은 시트룰린을 포함하는 말단 항체 결합 부위를 갖는 비멘틴의 시트룰린화 절편에 대한 특이적인 결합 친화성을 가져서, 상기 항체 절편의 항체의 결합에는 시트룰린을 함유하는 말단 비멘틴 아미노산 서열의 존재를 필요로 하고, 상기 비멘틴 절편에 대한 상기 항체의 결합을 검출한다.
바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 절편은 시트룰린을 포함하는 말단 항체 결합 부위를 갖는 SOCS-2, 알파 1 항 트립신, 베르시칸(versican), 비글리칸(biglycan) 또는 라미닌의 시트룰린화 절편에 대한 특이적인 결합 친화성을 가져서, 상기 항체 절편의 항체의 결합에는 시트룰린을 함유하는 상기 단백질에 대해 특이적인 말단 아미노산 서열의 존재를 필요로 하고, 상기 절편에 대한 상기 항체의 결합을 검출한다.
다른 한편으로, 상기 항체 또는 그의 절편은 시트룰린을 포함하는 말단 항체 결합 부위를 갖는 엘라스틴 또는 콜라겐 타입 Ⅴ 및 Ⅵ의 시트룰린화 절편에 대한 특이적인 결합 친화성을 가져서, 상기 항체 절편의 항체의 결합에는 시트룰린을 함유하는 상기 단백질에 대해 특이적인 말단 아미노산 서열의 존재를 필요로 하고, 상기 절편에 대한 상기 항체의 결합을 검출한다.
상기 결합의 검출은 바람직하게는 정량적이다. 전형적으로, 결합의 양은 건강한 개인 및 섬유성 질환 또는 류마티스성 관절염에 의해 특정되는 개인의 집단(populations)에 대해 확립된 대조군 값과 비교된다.
상기 방법은 상기 샘플 내의 펩티드가 상기 항체 또는 항체 절편에 대한 결합에 대하여 상기 항체 또는 항체 절편에 결합하는 알려진 농도의 결합제와 경쟁하는 경쟁 분석으로 수행될 수 있다.
변경된 레벨의 시트룰린화 펩티드가 혈액 또는 그 성분들 내에서 검출될 수 있는 질환은 류마티스성 관절염 및 간 섬유증, 피부 섬유증 및 폐 섬유증과 같은 섬유증을 포함하는 다양한 질환을 포함할 것이다. 특정 예시적인 펩티드 말단 서열의 생성에 관여하는 관련 단백질, 질환 상태 및 프로티나아제는 하기 표에 나열되어 있다:
단백질 프로테아제 질환 서열 서열번호
비멘틴 MMP2, 8 RA, 섬유증 69'RLRSSVPGVCit↓
69'RLCitSSVPGVCit↓
69'CitLCitSSVPGVCit↓		 1
2
3
비멘틴 MMP; 특정되지 않음 섬유증, RA 36'RTYSLGSALCit↓ 4
비멘틴 MMP; 특정되지 않음 섬유증, RA 41'GSALCitPSTSCit↓ 5
SOCS-2(Suppressor of cytokine signalling 2) MMP(타입은 특정되지 않음) 섬유증, RA 8'PSGNGGEGTCit↓ 6
A1AT(Alpha 1 Anti trypsin) MMP; 특정되지 않음 섬유증, RA 54'LAEFAFSLYCit↓ 7
베르시칸 MMP; 특정되지 않음 섬유증, RA 315'CGGGLLGVCit↓ 8
본 발명에 따라 검출될 수 있는 다른 시트룰린화 펩티드는 다음의 말단 서열을 함유하는 것들을 포함한다:
서열번호
비멘틴 37'TYSLGSAL-CIT-P↓ 9
A1AT 195'DLVKELD-CIT-DT↓ 10
비글리칸 129'IHEKAFSPL-CIT↓ 11
비글리칸 174'VPKGVFSGL-CIT↓ 12
표적화될 수 있는 다른 서열들은 하기 표에 개시되어 있다:
서열번호
라미닌 2059' NERALGAIQ-Cit↓ 2068' 인간 섬유증 13
비글리칸 97' LQNNDISEL-Cit↓ 106' 인간, 래트, 마우스 섬유증 14
비글리칸 242' QAIELEDLL-Cit↓ 251' 인간, 마우스 섬유증 15
비멘틴 295' FADLSEAANR-Cit↓ 304' 인간, 마우스, 래트 섬유증, RA, 동맥경화증, 암 16
비멘틴 146' LGDLYEEEM-Cit↓ 155' 인간, 마우스, 래트 섬유증, RA, 동맥경화증, 암 17
표적화될 수 있는 또 다른 서열들은 하기 표에 개시되어 있다:
단백질 프로테아제 질환(들) 서열
엘라스틴 MMP9 CVD, 섬유증 …VLPGA-CIT↓
(159 위치에서 CIT)		 18
엘라스틴 MMP9 CVD, 섬유증 …GGVAA-CIT↓
(762 위치에서 CIT)		 19
CO4a1 FAP ↓IDGY-CIT-GPPGP….
(476 위치에서 CIT)		 20
CO5a1 MMP2/MMP9 CVD, 섬유증 ↓CIT-RNIDAS….
(1584 위치에서 CIT)		 21
CO5a2 MMP2/MMP9 CVD, 섬유증 ↓Q-CIT-GAHGMP….
(356 위치에서 CIT)		 22
CO5a3 MMP9 CVD, 섬유증 ↓CIT-VGKMGR….
(525 위치에서 CIT)		 23
CO6a1 MMP2 CVD, 섬유증 ↓Y-CIT-GPEGPQ….
(573 위치에서 CIT)		 24
상기 분석은 ELISA 포맷(format) 또는 RIA 포맷을 포함하는 임의의 알려진 타입의 경쟁 분석 포맷을 이용하여 수행될 수 있다.
항체 및 전체 항체 대신에 도입될 수 있는 항체 절편은 단일클론 또는 다클론 항체 또는 Fab, Fab' 및 F(ab')2 절편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 그의 면역반응성(즉, 동일한 항원성 결정체(antigenic determinant)에 결합할 수 있는) 절편을 포함한다.
또한, 본 발명은 단백질의 펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 절편을 제공하며, 특이적인 결합을 위하여 상기 절편은 적어도 하나의 시트룰린을 포함하는 항체 특이적 N-말단 또는 C-말단 아미노산 서열을 갖는 것을 필요로 한다. 이러한 항체 또는 항체 절편은 전술한 말단 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 특이적일 수 있다.
도 1은 섬유성 간, 피부 및 폐의 추출물의 웨스턴 블롯(Western Blot)에서 밀리포어(Millipore) 항-시트룰린 키트 내의 항체에 의해 검출된 시트룰린화 단백질을 보여준다.
도 2는 도 1의 3가지 상이한 섬유성 조직에서 시트룰린 특이적 반응성으로부터 얻은 데이터의 개략적이고 단순화된 요약을 보여준다. 점선인 밴드는 건강한 및 질환이 있는 조직 모두에서 검출된 분자의 존재를 나타내고, 실선인 밴드는 시트룰린 잔기를 운반하는 질환-특이적(섬유성) 절편을 나타낸다.
도 3은 시트룰린화 비멘틴 펩티드 서열 RLRSSVPGV-Cit에 대해 유발된 2개의 단일클론 항체의 선별 펩티드(selection peptide)에 대한 특이적인 반응성 및 연장된(elongated) 펩티드에 대한 일부 교차-반응성을 보여주는 실시예 2에서 얻어진 결과를 보여준다.
도 4는 비멘틴으로부터 기원하고 NB212 ELISA에서 검출된 시트룰린화 펩티드 절편의 증가된 농도를 보여준다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시 및 설명될 것이다.
실시예 1
섬유성 조직에서 시트룰린화 단백질의 존재를 조사하기 위하여, 항-변형된 시트룰린 항체를 이용하는 Upstate 사의 시트룰린 검출 키트를 이용하여 다수의 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. 상기 항체는 시트룰린이 존재하는 아미노산 서열과 무관하게 시트룰린을 포함하는 펩티드와 반응할 것이다.
3가지 상이한 카테고리의 섬유성 샘플을 분석하였다. CCl4 처리된 래트 유래의 간 조직, 블레오마이신 처리된 마우스 유래의 피부 및 섬유성 폐 조직을 다음의 프로토콜(protocol)을 이용하여 각각 추출하였다. 조직을 액체 질소로 꽁꽁 얼렸고, 강철 모르타르 내에서 분쇄하였다. 이후, ROCHE 사의 프로테아제 억제제가 있는 0.5 M 아세트산 용액 내에 희석하였고, 부드럽게 교반하면서 4℃에서 밤새 방치하였다. 이후, 용액을 각각 3초의 5 펄스(pulse)로 60% 진폭에서 초음파 처리하였다. 농도를 계산하였고, 용액을 -80℃에서 보관하였다. 반응성 밴드는 다양한 상이한 분자량에서의 시트룰린 특이적 반응성을 나타낸다. 다수의 반응하는 밴드들은 상이한 조직 간에 공통이지만, 다른 밴드들은 질환 조직에 유일하다(unique). 각각의 조직의 15개의 질환 샘플 및 5개의 대조군 샘플을 사용하였다. 대표적인 결과는 도 1에 나타나 있다.
도 1에서의 데이터의 개략적이고 단순화된 설명은 모든 질환 특이적 시트룰린화 단백질(실선) 및 대조군에서도 발견되는 단백질(점선)이 도 1의 집단적(collective) 결과를 분석하기 위해 고안되었음을 보여주는 도 2에 개시되어 있다.
상기 집단적 예비 결과는 건강한 조직에서는 존재하지 않는 질환 조직에서의 시트룰린화 단백질의 존재를 강하게 나타낸다. 이러한 시트룰린화 단백질/절편은 잠재적으로 선택된 질환에 대한 생체마커(biomarker)로서 작용할 수 있다.
실시예 2
종래의 기술을 이용하여 KLH-CGG-RLRSSVPGV-Cit를 이용한 면역화에 의해 시트룰린화 비멘틴 서열 RLRSSVPGV-Cit에 대한 단일클론 항체를 유발시켰고, 바이오틴-RLRSSVPGV-Cit를 이용하여 반응성에 대해 스크리닝하였다. 이어서, 후술하는 것과 같이 상기 항체의 특이성을 경쟁 ELISA에서 평가하였다.
스트렙트아비딘-코팅된 미세적정(microtitre) 플레이트(Roche)를 5 ng/㎖의 Bio-RLRSSVPGV-Cit를 함유하는 100 ㎕/웰의 버퍼 25 mM Tris-BTB(BSA, Tween 20 및 Bronidox) 코팅 버퍼로 인큐베이션하였다. 20℃에서 30분 동안 교반하면서 인큐베이션한 후, 5회 세척하였고, 20 ㎕/웰의 표준물(합성 펩티드 RLRSSVPGV-Cit), QC 샘플 및 희석된 알려지지 않은 샘플을 첨가하였다. 이어서, 각각의 웰에 인큐베이션 버퍼 내에 120 ng/㎖로 희석된 100 ㎕의 단일클론 항체를 첨가하였고, 상기 플레이트를 20℃에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 세척 후, 100 ㎕의 HRP-표지된 염소 항-마우스 면역글로불린을 각각의 웰에 첨가하였고, 상기 플레이트를 20℃에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 이후, 5회의 세척 단계 후, 100 ㎕/웰의 TMB(TMB: Kem-En-Tec cat. 4380-100-125)를 첨가하였고, 어둠 속에서 20℃에서 15분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 100 ㎕/웰의 중단 용액을 각각의 웰에 첨가하였고, 상기 샘플을 650 ㎚를 참조로 하여 450 ㎚ ELISA 판독기에서 판독하였다.
선택된 펩티드에 대한 선별된 단일클론 항체 NB212의 반응성을 미세적정 플레이트에 결합된 서열 RLRSSVPGV-Cit의 펩티드 및 상기 단일클론 항체에 대한 결합을 위해 경쟁하는 용액 내의 선택된 펩티드를 도입하는 경쟁 분석에서 평가하였다. 결과는 도 3에 나타나 있다. 상기 항체는 말단 시트룰린 잔기를 갖는 무작위 서열의 펩티드(DGVPGKDGP-Cit)에는 결합하지 않고, 말단 시트룰린이 없는 표적 아미노산 서열 RLRSSVPGV에도 결합하지 않으며, 단지 연장된 버전(version)의 표적 펩티드 RLRSSVPGV-Cit-L에만 약하게 결합함을 볼 수 있다. 따라서, 상기 항체는 시트룰린(이 경우에는 말단 위치에서) 및 비멘틴 아미노산 서열 모두를 함유하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
실시예 3
도 3을 참조하여 본질적으로 전술한 것과 같이 ELISA를 수행하였지만, 웰에 중복하여(duplicate) 첨가하기 전에 인간 혈청 샘플을 10 mM PBS-BTB 버퍼 내에 1:8로 미리 희석하였다.
간 섬유증으로 진단된 대상으로부터 8개의 혈청 샘플을 얻었고, 이들을 건강한 자원자 유래의 6개의 샘플을 대조군으로 하여 ELISA에서 테스트하였다. 두 번째 실험에서, 류마티스성 관절염(RA)을 갖는 환자 유래의 7개의 혈청 샘플을 5개의 대조군과 비교하였다. 결과는 도 4에 나타나 있다.
비멘틴으로부터 기원하는 순환하는 시트룰린화 펩티드 절편의 급격한 증가가 (단일클론 항체 NB212에 의해 검출될 때) 간 섬유증을 갖는 대상 및 류마티스성 관절염을 갖는 환자 모두에서 관찰된다. 반대로, 건강한 대조군 대상의 혈액에서는 상대적으로 낮은 레벨의 상기 시트룰린화 분자가 발견된다.
본 명세서에서, 달리 구체적으로 특정하지 않는 한, '또는'이란 용어는 개시된 조건들 중 하나 또는 모두가 충족될 때 참값을 되돌리는 연산자의 의미로 사용되며, 조건들 중 하나만이 충족되는 것을 필요로 하는 '배제하는(exclusive or)'의 연산자와 반대이다. '포함하는'이란 용어는 '이루어지는'의 의미라기 보다는 '함유하는'의 의미로 사용된다. 상기에서 확인된 모든 선행 시사점들(teachings)은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에서 공개된 임의의 선행 문헌은 그 시사점이 현재까지 호주 또는 다른 국가에서 보통의 일반적인 지식임을 승인 또는 나타내는 것으로 인정되어서는 안된다.
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<220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citrullination <400> 4 Arg Thr Tyr Ser Leu Gly Ser Ala Leu Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(10) <223> citrullination <400> 5 Gly Ser Ala Leu Xaa Pro Ser Thr Ser Xaa 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citrullination <400> 6 Pro Ser Gly Asn Gly Gly Glu Gly Thr Xaa 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citrullination <400> 7 Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Xaa 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> citrullination <400> 8 Cys Gly Gly Gly Leu Leu Gly Val Xaa 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> citrullination <400> 9 Thr Tyr Ser Leu Gly Ser Ala Leu Xaa Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> citrullination <400> 10 Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Xaa Asp Thr 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citurllination <400> 11 Ile His Glu Lys Ala Phe Ser Pro Leu Xaa 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citrullination <400> 12 Val Pro Lys Gly Val Phe Ser Gly Leu Xaa 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citrullination <400> 13 Asn Glu Arg Ala Leu Gly Ala Ile Gln Xaa 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citrullination <400> 14 Leu Gln Asn Asn Asp Ile Ser Glu Leu Xaa 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citrullination <400> 15 Gln Ala Ile Glu Leu Glu Asp Leu Leu Xaa 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(11) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> citrullination <400> 16 Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg Xaa 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> citrullination <400> 17 Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Xaa 1 5 10 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(6) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> citrullination <400> 18 Val Leu Pro Gly Ala Xaa 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(6) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> citrullination <400> 19 Gly Gly Val Ala Ala Xaa 1 5 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(5) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> citrullination <400> 20 Ile Asp Gly Tyr Xaa 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(7) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> citrullination <400> 21 Xaa Arg Asn Ile Asp Ala Ser 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(8) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> citrullination <400> 22 Gln Xaa Gly Ala His Gly Met Pro 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(7) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> citrullination <400> 23 Xaa Val Gly Lys Met Gly Arg 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(8) <223> /mol_type="protein" /organism="Homo sapiens" <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> citrullination <400> 24 Tyr Xaa Gly Pro Glu Gly Pro Gln 1 5

Claims (10)

  1. 샘플을 시트룰린을 포함하는 말단 항체 결합 부위를 갖는 단백질의 시트룰린화 절편에 대해 특이적인 결합 친화성을 갖는 항체 또는 그의 절편과 접촉시키는 단계, 및 상기 단백질 절편에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 항체 절편의 결합은 특이적인 말단 아미노산 서열 및 상기 시트룰린 모두가 상기 결합 부위에 존재하는 것을 필요로 하는, 혈액 또는 그의 유체 성분을 포함하는 샘플에서 단백질의 시트룰린화 절편을 분석하는 방법으로서,
    상기 항체 또는 결합 절편은 다음의 C-말단 아미노산 서열 중 어느 하나:
    Figure 112018127463297-pct00007

    또는 다음의 N-말단 서열 중 어느 하나를 포함하는 결합 부위에 대해 특이적인 결합 친화성을 갖는 방법:
    Figure 112018127463297-pct00008
    .
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 결합의 검출은 정량적인 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 결합의 양은 건강한 개인 및 섬유성 질환 또는 류마티스성 관절염에 의해 특정되는 개인의 집단(populations)에 대해 확립된 대조군 값과 비교되는 방법.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 방법은 상기 샘플 내의 펩티드가 상기 항체 또는 항체 절편에 대한 결합에 대하여 상기 항체 또는 항체 절편에 결합하는 알려진 농도의 결합제와 경쟁하는 경쟁 분석으로 수행되는 방법.
  5. 단백질의 펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 절편으로서, 특이적인 결합을 위하여 상기 절편은 적어도 하나의 시트룰린을 포함하는 항체 특이적 N-말단 또는 C-말단 아미노산 서열을 갖는 것을 필요로 하고, 상기 항체 또는 결합 절편은 다음의 C-말단 아미노산 서열 중 어느 하나:
    Figure 112018127463297-pct00009

    또는 다음의 N-말단 서열 중 어느 하나를 포함하는 결합 부위에 대해 특이적인 결합 친화성을 갖는 항체 또는 항체 절편:
    Figure 112018127463297-pct00010
    .
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  9. 삭제
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