KR101961999B1 - 항분비 인자 복합체 분석 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제1 항체 및 제2 항체를 이용하여, 체액과 같은 샘플에서 프로테아좀-보체 복합체 형성의 존재 또는 부재, 및/또는 농도를 결정하기 위한 면역학적 분석 키트에 관한 것으로서, 제1 항체는 담체에 고정되고 제2 항체는 표지 물질로 수식되며, 제1 항체 및 제2 항체는 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 특이적인 항체, 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체, 또는 보체 인자 C4, 예컨대, C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로부터 선택된다. 상기 개시된 분석은 혈장 또는 다른 체액 중의 보체 인자 3 또는 4에 결합된 순환하는 26S 프로테아좀의 수준을 결정하기 위해, 예컨대 포유동물의 몸에서의 보체계 하향조절을 포함하는, 포유동물의 몸에서의 염증 및 바이러스 감염의 수준을 모니터링하기 위해 뿐만 아니라 가공 곡물(SPC) 및/또는 높은 수준의 천연 항분비 단백질(NASP)을 갖는 기능성 식품의 순응도를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
Description
항분비 인자(AF)는 염증을 억제하고 유체 수송을 조절하는 단백질 복합체이다. 본 발명은 AF 복합체가 수식된 프로테아좀 및 보체 C3 및/또는 C4에 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 또한, 처음으로, 프로테아좀 및 보체 인자 C3 및/또는 C4 사이의 바이러스 유도된 복합체가 기술된다. 프로테아좀-보체 C3 및/또는 C4 복합체는 본원에서 처음으로 인간 혈액으로부터 정제되고 웨스턴 블롯 및 질량 분광학에 의해 분석된다. 프로테아좀 서브유닛에 특이적인 항체 및 신규 면역분석에서 이들의 용도가 본원에 개시된다. 일 구현예에서, ELISA 테스트는 AF-노출시키는 프로테아좀이 보체 인자 C3c, C3b, iC3b, C4b, iC4b 또는 C4c에 결합하는 것을 개시하며, 또 다른 구현예에서, ELISA 테스트는 온전한 프로테아좀이 보체 인자 C3, C3c, C3b, iC3b, C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 결합하는 것을 개시한다. 본원에 기술된 분석은 AF를 측정하고, 이는 가공 곡물(processed cereal)(SPC; specially processed cereal)의 섭취 후 약 10배 증가한다. 보체 인자 H 및 I의 수준 차이가 관찰되지 않았다. 프로테아좀 서브유닛은 부분적으로 분열되어, 이전에 감춰진 항분비 펩타이드 서열을 노출시키는 것으로 나타난다. 또한 C3은 프로테아좀 결합시 그의 불활성 형태 C3c로 부분적으로 분열되어, AF 복합체 형성 동안 항염증 효과를 야기한다.
따라서, 제1 항체 및 제2 항체를 이용하여, 체액 중의 AF-C3 복합체 형성의 존재 또는 부재, 및/또는 농도를 결정하기 위한 면역학적 분석 키트로서, 제1 항체는 담체 상에 고정되고 제2 항체는 표지 물질로 수식된 면역학적 분석 키트가 개시된다.
AF를 측정하기 위해, 제1 항체 및 제2 항체는 AF1에 특이적인 항체 및 보체 인자 C3, 예컨대 C3c에 특이적인 항체로부터 선택된다.
프로테아좀 및 보체 인자 C3 또는 C4 간의 일반적인 복합체 형성을 측정하기 위해, 제1 항체 및 제2 항체는 프로테아좀에 대한 항체 및 보체 인자 C3 또는 C4에 대한 항체로부터 선택된다. 상기 개시된 분석은 포유동물의 몸에서의 보체계 하향조절을 측정하고/거나 모니터링하는 것을 포함하는 포유동물의 몸에서의 염증의 수준을 모니터링하기 위해서뿐만 아니라 가공 곡물(SPC) 및/또는 높은 수준의 천연 항분비 단백질(NASP)을 갖는 기능성 식품에 대한 인간 또는 동물의 순응도(compliance)를 확인하기 위해서, 뿐만 아니라 체액 중의 보체계 조절에 대한 바이러스의 영향을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
보체계
보체계는 병원균을 방어하는 주요 역할을 한다. 그것은 또한 죽어가는 세포, 면역 복합체 또는 미스폴딩된 분자를 확인하고 적응 면역을 이끈다. 보체의 생리학적 관련성은 재발성 감염, 자가면역 질환 및 신장 질환과 같은 보체 결핍 환자에 영향을 미치는 질병에 의해 입증된다.
침입성 병원균은 숙주 세포와 비교하여 표면 조성의 차이로 인해 자발적으로, 또는 항체 또는 펜트락신 결합을 통해, 보체를 활성화시킨다. 이는 단백질분해 보체 캐스캐이드의 신속한 개시, 혈관 투과성(C5a, C3a)에 영향을 미치고 백혈구(C5a)를 유인하는 전염증성 아나필라톡신의 방출, C3b을 이용한 표적의 옵소닌화 및 최종적으로 막 공격 복합체(MAC)의 형성을 야기한다.
보체는 보체-매개된 손상으로부터 자가-조직을 보호하기 위해 가용성 및 막 결합된 조절자 모두에 의해 강하게 조절되어야 한다. 많은 이들 억제제는 염색체 1q32에 위치하며 이들은 총괄적으로 보체 활성화의 조절자(RCA)로 불린다. RCA 단백질은 C3 및 C5 전환효소의 붕괴를 가속화함으로써 그리고/또는 C3b 및 C4b의 분해에서 세린 프로테아제 인자 I(Fl)에 대한 보조인자로서 작용함으로써 보체계를 억제한다. Fl은 활성화된 C3b 및 C4b 단백질을 절단함으로써 모든 보체 경로를 억제한다. 그러나, 이것은 보조인자의 존재시에만 일어날 수 있다.
보체계는 박테리아 감염에 대한 염증 반응과 주로 연관되며, 여기서 상이한 보체 인자가 차례차례 반응하여 최종적으로 박테리아 세포벽을 용해시킨다. 핵심 인자 C3 및 C3b가 C3c으로의 가수분해에 의해 불활성화될 수 있다는 것은 덜 알려져 있으며, 이는 단백질분해 인자 I(F1)에 의해 달성되는 것으로 알려져 있다. 이 하향조절은 염증 후 보체계를 회복하는데 필요하며, 그렇지 않으면 무한정 작동될 것이다.
프로테아좀
프로테아좀은 모든 세포에 존재하며, 상기 세포에서 이들은 단백질의 분해 및 조절에 필수적이다. 그의 촉매적 20S 서브유닛은 7개의 구조적 단백질 및 7개의 단백질분해 단백질로 구성되는 반면, 2개의 조절적 19S 서브유닛은 19개의 상이한 단백질로 구성된다. 모든 프로테아좀 단백질이 그런 것은 아니지만, 대부분은 HUPO 프로젝트 유전자 카드(https ://www.GeneCards.org)에서 기술된 바와 같이, 조직에서 발견되는 것과 유사한 농도로 혈장에서 확인되었다. 예컨대, 인간 혈청에서 검출된 20S 프로테아좀은 일반적으로 "순환하는 프로테아좀"(c-프로테아좀)으로 지정된다. 혈장 순환하는 프로테아좀의 수준은 특정 암 형태 및 자가면역 질환에서 상승되는 것으로 나타났다.
본 발명자들은 앞서 혈액으로부터 AF1(항분비 인자 1)로 명명된 단백질을 단리하였고, 그의 인코딩 유전자를 시퀀싱하였다. 이후, AF1은 19S 프로테아좀 서브유닛의 구성성분인 것으로 나타났고, PSMD4, RPN10 또는 S5a로 명명되었다. 추가로 박테리아 장독소 및 가공 곡물이 항분비 인자(AF)의 변이된 형태를 유도할 수 있고, 이는 장에서 염증 및 유체 분비를 억제한 것으로 나타났다. AF의 이러한 변형된 형태는 다당류 아가로스에 결합하는 것으로 나타났다. α-메틸글루코사이드로 용출 후, 그의 농도는 ELISA에 의해 결정될 수 있었다.
놀랍게도, 프로테아좀이 가공 곡물(SPC)의 섭취 후 보체 인자 C3과 반응한다는 것이 본원에서 처음으로 입증된다. 이 반응은 이전에 감춰진 항분비 에피토프를 노출시키며, 이는 AF-1 및 C3에 대한 항체를 이용한 이중 샌드위치 ELISA에서 분석될 수 있다. 더욱이, 프로테아좀/보체 복합체 형성이 C3을 그의 불활성 형태 C3c로 분열시킨다는 것이 본원에서 처음으로 보여질 수 있었다.
항분비
인자(
AF
)
항분비 인자(AF)는 설사증 및 장내 염증의 예방을 제공하는 것으로 본래 기술되었던 41 kDa 단백질이다(검토를 위해, The antisecretory factor: synthesis, anatomical and cellular distribution, and biological action in experimental and clinical studies. Int Rev Cytol, 2001. 210: p. 39-75. 참고). 항분비 인자(AF) 단백질은 시퀀싱되었고 그의 CDNA가 클로닝되었다. 항분비 활성은 항분비 인자(AF) 단백질 서열 상의 아미노산 위치 35 및 50 사이에 위치하고 공통 서열의 적어도 4-16, 예컨대 4, 6, 7, 8 또는 16 아미노산을 포함하는 펩타이드에 의해 주로 발휘되는 것으로 보인다. 면역화학적 및 면역조직화학적 조사는 항분비 인자(AF) 단백질이 존재하며 또한 몸에서 대부분의 조직 및 장기에 의해 합성될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 항설사 서열을 포함하는 합성 펩타이드들이 이전에 규명되었다(WO 97/08202; WO 05/030246). 항분비 인자(AF) 단백질 및 펩타이드는 이전에, 예컨대 콜레라 독소의 투여 후 장에서 그리고 중추신경계 내의 맥락막망에서 병리학적 유체 수송 및/또는 염증 반응을 정상화시키는 것으로 개시되어 왔다(WO 97/08202). 그러므로, AF의 내인성 합성 또는 부가된 AF의 흡수를 유도하는 능력을 갖는 식품 및 사료가, 예컨대 WO 97/08202호에서 부종, 설사, 탈수 및 염증의 치료에 유용한 것으로 제안되었다. WO 98/21978호는 항분비 인자(AF) 단백질의 형성을 유도하는 식품의 생산을 위한 효소 활성을 갖는 제품의 사용을 개시한다. WO 00/038535호는 그러한 (NASP)로서 천연 항분비 인자(AF) 단백질이 풍부한 식료품을 추가로 개시한다.
항분비 인자(AF) 단백질 및 이의 단편은 또한 세포의 손실 및/또는 획득과 연관된 병태의 치료에 있어서 신경 조직의 회복, 및 줄기 및 전구 세포 및 이의 유래된 세포의 증식, 세포자멸사, 분화, 및/또는 이동을 개선하고(WO 05/030246), 구획 증후군(compartment syndrome)의 치료 및/또는 예방을 위한 것으로서(WO 07/126363), 안구내 고혈압의 치료 및/또는 예방에서 동등하게 효과적인 것으로 나타났다(WO 07/126364).
더욱이, 본 발명자들은 최근에 AF가 막에서 지질 뗏목(lipid raft), 수용체 및/또는 포낭(caveolae)의 구조, 분포 및 다수의 기능을 모니터링하고/거나 유익하게 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 세포 막에서 지질 뗏목 및/또는 포낭의 구조적 해체 및 기능장애의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있음을 보여왔다(WO 07/126365).
본 발명자들은 동일한 항분비 인자(AF) 단백질, 뿐만 아니라 이의 펩타이드 및 단편이 FAK 및 CAP를 통해 막통과 단백질, 예컨대 NKCC1의 생물학적 활성화에 개입할 수 있다는 것과, 따라서 그것이 병리학적 및/또는 동요된 세포에서 이온 채널의 병리학적 활성을 직접 조절하여, 상기 세포에서 세포내 압력 및 막통과 단백질 기능을 효과적으로 정상화하고, 따라서 예컨대 암 요법에서 사용된 약물의 개선된 흡수를 가능하게 할 수 있다는 것을 추가적으로 입증할 수 있었다(WO 2010/093324).
본 출원은 처음으로 이전에 기록되지 않은 보체계 및 프로테아좀 사이의 상호작용 및 이 상호작용의 결과로서 AF의 항분비 서열이 노출되고 아마도 혈액 내로 방출된다는 사실을 밝힌다. 이들 상이한 화합물 간의 천연 상호작용 경로에서 이 새롭게 발견된 통찰력으로 인해, 본 발명자들은 처음으로 체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성을 검출하기 위한 신규하고 매우 효과적인 면역학적 분석을 개발할 수 있었다. 상기 새로운 분석은 처음으로 포유동물의 몸에서의 보체계 조절을 포함하는, 포유동물의 몸에서의 염증의 수준을 모니터링하기 위한 신속하고 효과적인 수단뿐만 아니라 가공 곡물(SPC) 및/또는 높은 수준의 천연 항분비 단백질(NASP)을 갖는 기능성 식품에 대한 인간 및/또는 동물의 순응도를 확인하기 위한 신속하고 효과적인 수단을 제공한다.
단순 포진 바이러스-1
단순 포진 뇌염(HSE)은 서양에서 바이러스 뇌염의 가장 흔한 원인이며, 상기 사례의 최대 20%의 원인이 된다. 매년 백만명 당 2-4명의 주민에게 영향을 미치는 HSE는 단순 포진 바이러스 유형 1(HSV - 1)의 1차 또는 재발성 감염에 의해 야기될 수 있다. HSE를 야기하는 뇌 감염은 삼차 신경, 후각로 또는 두 경로를 통한 바이러스 침입 후에 일어나는 것으로 제안되었다. HSE의 초기 단계에, 후 신경구(OB) 및 후각로에서 HSV -1 항원의 풍부(abundance)가 중추신경계(CNS)에서 염증 및 괴사의 최종 위치와 관련될 수 있다는 것이 보고되었다. 또한, 뇌 내부 및 2개의 뇌 반구 사이의 바이러스 확산은 덜 광범위하게 조사되었지만, 그것은 HSE의 임상 징후의 위치 및 발달에 아마 결정적이다.
설치류 모델에서, 마우스 및 랫트에서 후각로를 통한 HSE의 바이러스 확산이 비강으로부터 CNS로 확장하는 것으로 관찰되었다. 후각 수용기 뉴런은 후각 상피를 통과하여, 사상판(cribriform plate)을 관통하며, OB에 들어가 CNS에 도달한다. OB에서, 후각 수용기 뉴런은 사구체에서 승모 세포(2차 뉴런)에 연결되고, 이는 결국 후각계(olfactory system) 및 변연계(limbic system)로 돌출된다. 편도체, 해마 및 OB를 포함하는 변연계는 진화적으로 뇌의 가장 오래된 부분 중 하나이며, HSE가 전체 변연계의 회색질에 선택적 손상을 야기하므로, HSE의 임상 증상은 HSV-1을 위한 변연 피질에 대한 특별한 친화성 때문이라는 것이 제안되었다. 그러므로, HSV -1은 진화적 보존된 경로를 이용하여 뇌를 통해 OB로부터 자신의 길을 찾을 수 있다.
본 출원은 추가로 처음으로 보체 C3 및 C4가 각각 HSV-1 바이러스 감염 후 프로테아좀과 복합체를 형성한다는 것을 보여준다. 이 반응은 온전한 프로테아좀 및 C3 또는 C4에 대한 항체를 이용한 샌드위치 ELISA로 추정된다.
본 발명은 체액 중의 상이한 프로테아좀-C3 및/또는 C4 복합체 형성(들)을 검출하기 위한 면역학적 분석 및 면역학적 분석 키트를 제공한다.
예를 들면, 비제한적으로 진행중인 바이러스 감염 후 및/또는 동안에, 포유동물의 몸에서의 염증(들)의 상태, 및 상기 포유동물의 몸에서의 보체계 (하향-)조절을 모니터링하고, 확인하고/거나 검출하기 위한 신속하고 효율적인 도구뿐만 아니라 가공 곡물(SPC) 및/또는 높은 수준의 천연 항분비 단백질(NASP), 예컨대 난황을 갖는 기능성 식품(살로붐(Salovum)®), 식품 보충물, 사료 또는 사료 보충물에 대한 인간 및/또는 동물의 순응도(compliance)를 확인하기 위한 신속하고 효율적인 도구를 제공하는 신규 면역학적 분석 및/또는 면역학적 분석 키트가 본원에 개시된다
본 발명의 면역학적 분석뿐만 아니라 본 발명의 면역학적 분석 키트는 AF-노출시키는 프로테아좀, 예컨대 AF1을 검출하기 위한, 또는 온전한 프로테아좀을 검출하기 위한 프로테아좀 단백질에 특이적인 항체, 및 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체, 또는, 및 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로부터 선택된, 제1 항체 및 제2 항체를 사용한다. 상기 제1 및 제2 항체는 동일한 항원에 특이적이지 않으며, 즉, 제1 항체가 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 특이적인 항체로부터 선택될 때, 제2 항체는 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로부터 선택되어야 하거나, 또는 그 반대이다. 만약 2개를 초과하는 상이한 항체가 선택되면, 선택된 이들 중 적어도 2개는 동일한 항원에 특이적이지 않은 항체로부터 선택될 필요가 있으며, 즉 하나의 항체가 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 특이적인 항체로부터 선택될 때, 적어도 하나의 다른 항체는 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로부터 선택되어야 한다.
항체는 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀, 또는 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 대한 상업적으로 이용가능한 항체 중에서, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체, 및/또는 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체(예컨대 기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb))로부터 선택될 수 있다. 제1 항체 및 제2 항체의 그러한 조합은 체액 중의 프로테아좀-C3 및/또는 프로테아좀-C4 복합체 형성의 신속한 측정뿐만 아니라 체액 중의 AF-노출시키는 프로테아좀의 신속한 측정을 가능하게 한다. 예를 들어, 제1 항체는 바람직하게는 프로테아좀 단백질 AF1 또는 임의의 다른 프로테아좀 에피토프에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 항체는 바람직하게는 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, 체액 중의 AF의 측정 시간은 몇 십분, 예컨대 1-30, 5-15, 10-20, 10-30, 10-60분, 또는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 또는 180분 이내로 단축되는 반면, 체액 중의 AF의 측정은 종래에 거의 하루를 필요로 하였다. 더욱이, 본 발명의 면역학적 분석 및/또는 본 발명의 면역학적 분석 키트는 숙련자가 이전에 요구되었던 것보다 훨씬 더 적은 샘플의 분취량에서 AF의 수준을 측정할 수 있게 한다.
또한, 한편으로는 프로테아좀 에피토프를 지향하는 항체 및 다른 한편으로는 보체 인자 3 또는 4 상의 에피토프를 지향하는 항체를 이용하여 프로테아좀 및 보체 C3 또는 C4 간의 일반 반응을 측정할 수 있다.
결과적으로, 3개의 특정 구현예에서, 본 발명은 1) AF-노출시키는 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF에 특이적인 항체, 및 보체 인자 C3, 또는 C3의 유도체에 특이적인 항체, 2) 온전한 프로테아좀의 프로테아좀 단백질에 특이적인 항체 및 보체 C3, 또는 C3의 유도체에 특이적인 항체, 및 3) 온전한 프로테아좀의 프로테아좀 단백질에 특이적인 항체 및 보체 C4, 또는 보체 C4의 유도체에 특이적인 항체를 포함하는, 체액 중의 1) AF1-C3 상호작용, 2) 온전한 프로테아좀-C3 복합체 형성 및/또는 3) 온전한 프로테아좀-C4 복합체 형성을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 제1 항체 및 제2 항체를 이용하여 체액 중의 프로테아좀-C3-복합체 형성 또는 프로테오좀-C4-복합체 형성의 존재 또는 부재, 및/또는 농도를 결정하기 위한 면역학적 분석 키트로서, 제1 항체는 담체 상에 고정되고 제2 항체는 표지 물질로 수식되며, 제1 항체 및 제2 항체는 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 특이적인 항체, 및 보체 인자 C3, 또는 C3의 유도체 또는 보체 인자 C4, 또는 C4의 유도체에 특이적인 항체로부터 선택되는 키트이다.
보체 인자 C3 또는 C4의 유도체는 본 맥락에서 C3c, C3b, iC3b, C4b, iC4b 및 C4c로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 면역학적 분석 키트는 ELISA 테스트 키트일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역학적 분석 키트는 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체를 포함하고, 이는 mAb 3H8로서 본원에 지칭된 단일클론 항체 3H8(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb))이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역학적 분석 키트는 보체 인자 C3c에 특이적인 항체를 포함하고, 이는 보체 인자 C3c에 특이적인 다클론 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체(예컨대, 기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)) 및 보체 인자 C3c에 특이적인 다클론 항체인 보체 인자 C3c에 특이적인 항체를 포함하는 본 발명에 따른 면역학적 분석 키트에 관한 것이다.
또한, 제1 항체 및 제2 항체를 이용하여 체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성 또는 프로테아좀-C4 복합체 형성의 존재 또는 부재, 및/또는 농도를 결정하기 위한 면역학적 분석으로서, 제1 항체는 담체 상에 고정되고 제2 항체는 표지 물질로 수식되며, 제1 항체 및 제2 항체는 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1(예컨대, 기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)) 또는 온전한 프로테아좀에 특이적인 항체 및 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로부터 선택되는 면역학적 분석이 본원에서 구상된다. 그러한 면역학적 분석은 ELISA 테스트일 수 있다. 제1 항체는 바람직하게는 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체(예컨대, LMP2에 특이적인 항체, 20Salfa6에 특이적인 항체, 20Salfa1, 2, 3 또는 4에 특이적인 항체 및 Rpt5에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 항체는 바람직하게는 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역학적 분석은 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체를 포함한다. 현재 바람직한 구현예에서, 선택된 항체는 기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역학적 분석은 보체 인자 C3에 특이적인 다클론 항체인 보체 인자 C3에 특이적인 항체를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역학적 분석은 보체 인자 C3c에 특이적인 다클론 항체인 보체 인자 C3c에 특이적인 항체를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 면역학적 분석은 보체 인자 C4에 특이적인 다클론 항체인 보체 인자 C4에 특이적인 항체를 포함한다.
체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성을 검출하기 위한 방법이 추가로 개시되며, 이는 체액에 대해 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 특이적인 항체 및 보체 인자 C3, 예컨대 C3c에 특이적인 항체를 포함하는 면역학적 분석을 실시하는 것을 포함한다. 항체는 바람직하게는 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체, LMP2에 특이적인 항체, 20Salfa6에 특이적인 항체, 20Salfa1, 2, 3 또는 4에 특이적인 항체 및 Rpt5에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 다른 항체는 바람직하게는 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
체액 중의 프로테아좀-C4 복합체 형성을 검출하기 위한 방법이 추가로 개시되며, 이는 체액에 대해 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 특이적인 항체 및 보체 인자 C4, 예컨대 C4c에 특이적인 항체를 포함하는 면역학적 분석을 실시하는 것을 포함한다. 항체는 바람직하게는 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체, LMP2에 특이적인 항체, 20Salfa6에 특이적인 항체, 20Salfa1, 2, 3 또는 4에 특이적인 항체 및 Rpt5에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 다른 항체는 바람직하게는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따라 체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성 및/또는 프로테아좀-C4 복합체 형성을 검출하는 방법은 ELISA 테스트로서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성을 검출하기 위한 상기 방법은 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체(예컨대, 기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb))의 사용을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성을 검출하는 상기 방법은 보체 인자 C3에 대해 특이적인 다클론 항체인 보체 인자 C3에 특이적인 항체의 사용을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성을 검출하는 상기 방법은 보체 인자 C3c에 특이적인 다클론 항체인 보체 인자 C3c에 특이적인 항체의 사용을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 체액 중의 프로테아좀-C4 복합체 형성을 검출하는 방법은 보체 인자 C4에 특이적인 항체에 특이적인 다클론 항체인 보체 인자 C4에 특이적인 항체의 사용을 포함한다.
본원에 개시된 키트, 분석 및/또는 방법은 혈액, 혈장, 소변, 젖, 타액, 난황, 누액, 정액, 질액, 객담, 활액, 위액, 뇌척수액, 안액, 고름 및 점액으로 이루어진 군으로부터 선택된 다양한 체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성 및/또는 프로테아좀-C4 복합체 형성을 측정하고, 결정하고, 모니터링하고/거나 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 추가로 포유동물의 몸에서의 염증의 수준을 검출하고, 측정하고, 결정하고/거나 모니터링하기 위한 것뿐만 아니라 포유동물의 몸에서의 보체계 조절, 예컨대 하향-조절을 검출하고, 측정하고, 결정하고/거나 모니터링하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 키트, 분석 및/또는 방법의 용도를 포함한다.
더욱이, 본 발명은 일 구현예에서 가공 곡물(SPC) 및/또는 높은 수준의 천연 항분비 단백질(NASP), 예컨대 난황을 갖는 기능성 식품의 효과, 및/또는 가공 곡물(SPC) 및/또는 높은 수준의 천연 항분비 단백질(NASP), 예컨대 난황을 갖는 기능성 식품에 대한 인간 및/또는 동물의 순응도를 확인하기 위한 본 발명에 따른 키트, 분석 및/또는 방법의 용도를 포함한다.
이하, 본 발명의 구현예가 상세히 기재될 것이다. 하기에 개별적으로 개시된 구현예들은 면역학적 분석 및 면역학적 분석 키트 및 본 발명의 방법 및 의도된 용도의 예임에 유념해야 한다. 본 발명은 이들 예에 제한되지 않는다.
도 1
2개의 상이한 방법에 의한 인간 혈장 중의 항분비 인자(AF)의 검출. 시험자 4-6은 특수 가공 곡물(SPC)을 섭취하였고, 시험자 1-3은 대조군이었다. 도 1a에서, 혈장을 아가로스 겔 상에서 정제한 후, 단백질 서브유닛 AF1(PSMD4)에 대한 단일클론 항체를 이용하여 면역 검출하였다. 도 1b에서, 혈장을 이중 ELISA에서 직접 현상하여, 표 1에 기술된 바와 같은 프로테아좀-보체 C3 복합체를 검출하였다. 포획 항체는 항-AF1(밝은 컬럼) 또는 항-LMP2(검은색 컬럼) 중 하나였고; 검출 항체는 항-C3c였다. Y-축 값은 역전된 역가(reversed titer)로서 제시된다.
도 2
C3c에 대한 항체를 이용한 건강한 사람으로부터의 혈장의 웨스턴 블롯. 시험자 1 및 2는 대조군이며; 시험자 3 및 4는 특수 가공 곡물(SPC)을 섭취하였다. 시험자에서, C3의 더 크고 더 작은 펩타이드로의 부분적 전환이 관찰되었다. 웰 5는 37℃에서 4시간 동안 아가로스 겔을 이용하여 시험관 내에서 배양한 후 시험자 1로부터의 혈장을 보여주며, 이는 α-펩타이드의 c-펩타이드로의 총 전환을 밝혀내었다. α-, β- 및 c-펩타이드의 분자량은 각각 115, 75 및 43 kDa이다.
도 3
프로테아좀-부착된 보체 3 단백질의 웨스턴 블롯.
혈장을 아가로스 겔과 함께 배양하여 응집된 프로테아좀 및 C3 단백질을 수득하였다. 이후, 상기 프로테아좀을 매트릭스-결합된 항-프로테아좀 항체에 의해 정제하였다. 상기 도는 프로테아좀과 함께 공동-정제된 C3의 α 및 β 서브유닛을 보여준다(2열; 참고는 1열에 있음).
도 4
표 1
샌드위치 ELISA에 의해 결정된 AF1/C3 응집에 대한 아가로스에 의한 자극의 효과.
시험자 1-3은 대조군이며; 시험자 4-6은 가공 곡물을 섭취하였다. 아가로스 겔과의 배양은 모든 샘플에서 프로테아좀의 C3에의 결합을 실질적으로 자극하였다. 데이터가 역전된 역가로서 제시되어 있다.
도 5
표 2
혈장 중의 보체 인자 I(CFI) 및 H(CFH)의 농도.
시험자 1-3은 대조군이며; 시험자 4-6은 가공 곡물을 섭취하였다. 대조군과 비교하여 시험군에서 인자 I 또는 인자 H 농도에서 유의미한 차이가 없다. 데이터가 역전된 역가로서 제시되어 있다.
도 6
SD 랫트에게 HSV1(HSV, N=6) 또는 대조군으로서 PBS(CTR, N=5)를 비강내로 4일간 투여하였다. 포획 항체로서 프로테아좀 서브유닛(20Sα4, 20Sα6, LMP2, LMP7, RPT5)에 대한 단일클론 항체 및 검출 항체로서 보체 C3에 대한 다클론 항체를 이용한 이중 ELISA. 혈장 및 혈액에서 20Sα6 서브유닛 및 C3의 복합체가 유의미하게 높았고(각각 p<0,05 및 p<0,01), LMP2 또는 20Sα4 및 보체 C3은 혈장에서 더 높았다.
도 7
SD 랫트에게 HSV1(HSV) 또는 대조군으로서 PBS(CTR)를 비강내로 4일간 투여하였다. 포획 항체로서 프로테아좀 서브유닛(20Sα6)에 대한 단일클론 항체 및 검출 항체로서 보체 C4에 대한 다클론 항체를 이용한 이중 ELISA. 혈장 및 혈액에서, 20Sα6 서브유닛 및 C4의 복합체가 유의미하게 더 높았다(p<0,05).
도 8
아가로스-정제된 혈장의 2D 분석. 샘플을 4주의 SPC-섭취 전(A)과 후(B)에 3명의 개인 1-3으로부터 수득하였다. 이모빌린 건조스트립(Immoboline drystrip) pH 3-10을 등전점 포커싱을 위해 사용하였고, 10% 트리스-글리신 겔을 2차원을 위해 사용하였다. 좌측에 분자량 표준이 적용되고, 40 kDa 밴드가 나타나 있다. 상기 단백질 함량을 은 염색에 의해 시각화하였다. 이후 분석을 위해 선택된 스팟이 화살표로 표시되어 있다.
도 9
표 3
AF의 SPC 유도 후 아가로스-정제된 혈장의 2D 분리 후 은 염색된 겔에서 픽킹된 스팟에 대한 LC-MS/MS 확인의 요약. 오염 단백질은 상기 결과로부터 제거하였다. * = 프로피온아마이드로 수식된 서열이 문자 c로서 삽입되어 있다.
도 10
AF의 SPC 유도 후 분리된 아가로스-정제된 혈장을 이용한 2D 겔 상에서 웨스턴 블롯팅. 1차원 전기영동 등전점 포커싱을 7 cm 스트립 겔, pH 3-10 상에서 진행한 반면, 10% 트리스-글리신 겔을 2차원을 위해 사용하였다. PVDF 막을 항-C3c와 함께 배양하였다. 좌측에 분자량 표준이 적용되며 40 및 80 kDa 밴드를 보여준다.
도 11
항-C3c를 이용하여 ELISA에 의해 시험된 아가로스-정제된 혈장(n=4)에서 C3c의 수준. 6주의 SPC-섭취 전과 후의 샘플을 분석하였고, 순 흡광도 수준(net absorbance level)을 결정하였다. 데이터가 평균 ± SEM으로 나타나 있다. **SPC 식이 전과 후에 수득된 샘플 간의 유의차(p=0.0039).
도 12
AF-활성 및 보체 인자의 ELISA 결정. SPC의 섭취 전, 동안 및 섭취 후 1주에 3명의 개인으로부터 수득한 아가로스-정제된 혈장 중의 (A) 단일클론 항체 AF 3H8(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)) 및 C3c, C4c 또는 인자 H에 대해 반응하는 항체(B, C, D)를 이용하여 결정된 AF-활성 및 보체 인자의 수준. 데이터가 평균 ± SEM으로 표시되어 있다. 샘플 간의 유의차가 * = p<0.05 및 ** = p<0.01에 의해 시각화되어 있다.
도 13
인간 혈장 중의 항-C3c 검출을 이용한 웨스턴 블롯. 레인 1 : SPC-섭취 전 직접 혈장. 레인 2: SPC-섭취 후 직접 혈장. 레인 3: SPC-섭취 전 아가로스-정제된 혈장 레인 4: SPC-섭취 후 아가로스-정제된 혈장. 중앙에, 적용된 분자량 표준이 있고, 43 및 75 kDa 밴드가 표시되어 있다.
도 14
DSM ACC3271에 대한 기탁 및 생존력 확인
도 15
DSM ACC3271에 대한 기탁자 진술
2개의 상이한 방법에 의한 인간 혈장 중의 항분비 인자(AF)의 검출. 시험자 4-6은 특수 가공 곡물(SPC)을 섭취하였고, 시험자 1-3은 대조군이었다. 도 1a에서, 혈장을 아가로스 겔 상에서 정제한 후, 단백질 서브유닛 AF1(PSMD4)에 대한 단일클론 항체를 이용하여 면역 검출하였다. 도 1b에서, 혈장을 이중 ELISA에서 직접 현상하여, 표 1에 기술된 바와 같은 프로테아좀-보체 C3 복합체를 검출하였다. 포획 항체는 항-AF1(밝은 컬럼) 또는 항-LMP2(검은색 컬럼) 중 하나였고; 검출 항체는 항-C3c였다. Y-축 값은 역전된 역가(reversed titer)로서 제시된다.
도 2
C3c에 대한 항체를 이용한 건강한 사람으로부터의 혈장의 웨스턴 블롯. 시험자 1 및 2는 대조군이며; 시험자 3 및 4는 특수 가공 곡물(SPC)을 섭취하였다. 시험자에서, C3의 더 크고 더 작은 펩타이드로의 부분적 전환이 관찰되었다. 웰 5는 37℃에서 4시간 동안 아가로스 겔을 이용하여 시험관 내에서 배양한 후 시험자 1로부터의 혈장을 보여주며, 이는 α-펩타이드의 c-펩타이드로의 총 전환을 밝혀내었다. α-, β- 및 c-펩타이드의 분자량은 각각 115, 75 및 43 kDa이다.
도 3
프로테아좀-부착된 보체 3 단백질의 웨스턴 블롯.
혈장을 아가로스 겔과 함께 배양하여 응집된 프로테아좀 및 C3 단백질을 수득하였다. 이후, 상기 프로테아좀을 매트릭스-결합된 항-프로테아좀 항체에 의해 정제하였다. 상기 도는 프로테아좀과 함께 공동-정제된 C3의 α 및 β 서브유닛을 보여준다(2열; 참고는 1열에 있음).
도 4
표 1
샌드위치 ELISA에 의해 결정된 AF1/C3 응집에 대한 아가로스에 의한 자극의 효과.
시험자 1-3은 대조군이며; 시험자 4-6은 가공 곡물을 섭취하였다. 아가로스 겔과의 배양은 모든 샘플에서 프로테아좀의 C3에의 결합을 실질적으로 자극하였다. 데이터가 역전된 역가로서 제시되어 있다.
도 5
표 2
혈장 중의 보체 인자 I(CFI) 및 H(CFH)의 농도.
시험자 1-3은 대조군이며; 시험자 4-6은 가공 곡물을 섭취하였다. 대조군과 비교하여 시험군에서 인자 I 또는 인자 H 농도에서 유의미한 차이가 없다. 데이터가 역전된 역가로서 제시되어 있다.
도 6
SD 랫트에게 HSV1(HSV, N=6) 또는 대조군으로서 PBS(CTR, N=5)를 비강내로 4일간 투여하였다. 포획 항체로서 프로테아좀 서브유닛(20Sα4, 20Sα6, LMP2, LMP7, RPT5)에 대한 단일클론 항체 및 검출 항체로서 보체 C3에 대한 다클론 항체를 이용한 이중 ELISA. 혈장 및 혈액에서 20Sα6 서브유닛 및 C3의 복합체가 유의미하게 높았고(각각 p<0,05 및 p<0,01), LMP2 또는 20Sα4 및 보체 C3은 혈장에서 더 높았다.
도 7
SD 랫트에게 HSV1(HSV) 또는 대조군으로서 PBS(CTR)를 비강내로 4일간 투여하였다. 포획 항체로서 프로테아좀 서브유닛(20Sα6)에 대한 단일클론 항체 및 검출 항체로서 보체 C4에 대한 다클론 항체를 이용한 이중 ELISA. 혈장 및 혈액에서, 20Sα6 서브유닛 및 C4의 복합체가 유의미하게 더 높았다(p<0,05).
도 8
아가로스-정제된 혈장의 2D 분석. 샘플을 4주의 SPC-섭취 전(A)과 후(B)에 3명의 개인 1-3으로부터 수득하였다. 이모빌린 건조스트립(Immoboline drystrip) pH 3-10을 등전점 포커싱을 위해 사용하였고, 10% 트리스-글리신 겔을 2차원을 위해 사용하였다. 좌측에 분자량 표준이 적용되고, 40 kDa 밴드가 나타나 있다. 상기 단백질 함량을 은 염색에 의해 시각화하였다. 이후 분석을 위해 선택된 스팟이 화살표로 표시되어 있다.
도 9
표 3
AF의 SPC 유도 후 아가로스-정제된 혈장의 2D 분리 후 은 염색된 겔에서 픽킹된 스팟에 대한 LC-MS/MS 확인의 요약. 오염 단백질은 상기 결과로부터 제거하였다. * = 프로피온아마이드로 수식된 서열이 문자 c로서 삽입되어 있다.
도 10
AF의 SPC 유도 후 분리된 아가로스-정제된 혈장을 이용한 2D 겔 상에서 웨스턴 블롯팅. 1차원 전기영동 등전점 포커싱을 7 cm 스트립 겔, pH 3-10 상에서 진행한 반면, 10% 트리스-글리신 겔을 2차원을 위해 사용하였다. PVDF 막을 항-C3c와 함께 배양하였다. 좌측에 분자량 표준이 적용되며 40 및 80 kDa 밴드를 보여준다.
도 11
항-C3c를 이용하여 ELISA에 의해 시험된 아가로스-정제된 혈장(n=4)에서 C3c의 수준. 6주의 SPC-섭취 전과 후의 샘플을 분석하였고, 순 흡광도 수준(net absorbance level)을 결정하였다. 데이터가 평균 ± SEM으로 나타나 있다. **SPC 식이 전과 후에 수득된 샘플 간의 유의차(p=0.0039).
도 12
AF-활성 및 보체 인자의 ELISA 결정. SPC의 섭취 전, 동안 및 섭취 후 1주에 3명의 개인으로부터 수득한 아가로스-정제된 혈장 중의 (A) 단일클론 항체 AF 3H8(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)) 및 C3c, C4c 또는 인자 H에 대해 반응하는 항체(B, C, D)를 이용하여 결정된 AF-활성 및 보체 인자의 수준. 데이터가 평균 ± SEM으로 표시되어 있다. 샘플 간의 유의차가 * = p<0.05 및 ** = p<0.01에 의해 시각화되어 있다.
도 13
인간 혈장 중의 항-C3c 검출을 이용한 웨스턴 블롯. 레인 1 : SPC-섭취 전 직접 혈장. 레인 2: SPC-섭취 후 직접 혈장. 레인 3: SPC-섭취 전 아가로스-정제된 혈장 레인 4: SPC-섭취 후 아가로스-정제된 혈장. 중앙에, 적용된 분자량 표준이 있고, 43 및 75 kDa 밴드가 표시되어 있다.
도 14
DSM ACC3271에 대한 기탁 및 생존력 확인
도 15
DSM ACC3271에 대한 기탁자 진술
정의 및 약어
약어
IFP: 간질액 압력;
PBS: 인산 완충 염수;
AF: 항분비 인자, 전장 AF 단백질(서열번호: 1에 표시된 바와 같음)
AF-6: 헥사 펩타이드 CHSKTR(서열번호: 2에 표시된 바와 같음);
AF-16: 아미노산 VCHSKTRSNPENNVGL으로 구성된 펩타이드(서열번호: 3에 표시된 바와 같음);
AF-8: 셉타 펩타이드 VCHSKTR(서열번호: 4에 표시된 바와 같음);
옥타 펩타이드 IVCHSKTR(서열번호: 5에 표시된 바와 같음);
펜타 펩타이드 HSKTR(서열번호: 6에 표시된 바와 같음);
SPC: 특수 가공 곡물;
RTT: AF(ASP)의 함량을 측정하기 위한 SE 9000028-2(공개 번호 466331)에 공개된 바와 같은, 랫트 소장에서 표준화된 분비 반응을 측정하는 방법;
AF: 항분비 인자;
ELISA: 효소-결합 면역흡착 분석;
PBS: 인산 완충 염수;
AP: 알칼라인 포스파타아제;
BSA: 소 혈청 알부민;
mAb: 단일클론 항체;
LC-MS/MS: 나노유속 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법;
PAGE: 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동.
HSV1: 단순 포진 바이러스-1
정의
단백질은 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기에 의해 구성된 생물학적 거대분자이다. 아미노산의 선형 폴리머로서 단백질은 폴리펩타이드로도 불린다. 전형적으로, 단백질은 50-800 아미노산 잔기를 가지며 따라서 약 6,000 내지 약 수십만 달톤 또는 그 이상의 범위의 분자량을 갖는다. 작은 단백질은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 올리고펩타이드로 불린다. 용어 "단백질", "폴리펩타이드", "올리고펩타이드" 및 "펩타이드"는 본 맥락에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 펩타이드는 매우 적은 아미노산 잔기, 예컨대 2-50 아미노산 잔기(aa)를 가질 수 있다.
용어 "항분비"는 본 맥락에서 분비 및/또는 유체 전달을 억제하거나 줄이는 것을 지칭한다. 본 맥락에서, 용어 "항분비 인자 단백질", "항분비 인자(AF) 단백질", "AF-단백질", AF, 또는 이의 동족체, 유도체 또는 단편은 WO 97/08202호에서 정의된 바와 같은 용어 "항분비 인자" 또는 "항분비 인자 단백질"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이는 항분비 인자(AF) 단백질 또는 펩타이드 또는 항분비 및/또는 동등한 기능적 및/또는 유사한 활성을 갖는 이의 동족체, 유도체 및/또는 단편, 또는 상기 폴리펩타이드의 기능을 변화시키지 않은 이의 변형을 지칭한다. 그러므로, 본 맥락에서 "항분비 인자", "항분비 인자 단백질", "항분비 펩타이드", "항분비 단편", 또는 "항분비 인자(AF) 단백질"은 또한 이의 유도체, 동족체 또는 단편을 지칭할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이들 용어는 본 발명의 맥락에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 더욱이, 본 맥락에서, 용어 "항분비 인자"는 "AF"로 약칭될 수 있다. 항분비 인자(AF) 단백질은 본 맥락에서 또한 WO97/08202호 및 WO 00/38535호에서 이전에 정의된 바와 같은 항분비 특성을 갖는 단백질을 지칭한다. 항분비 인자는 또한 예컨대, WO05/030246호에 개시되었다.
SPC ®는 특수 가공 곡물(SPC)을 포함하는 의료용 식품이다.
본 맥락에서, "의료용 식품"은 항분비 인자(AF) 단백질을 이용하여 제조되거나, 또는 대안적으로, 내인성 AF의 합성 및/또는 활성화를 유도하는 능력을 갖는, 식품, 사료 또는 식품 보충물, 또는 특별 식이 용도 식품을 지칭한다. 상기 식품은 유체 또는 고체 형태, 예컨대 액체 또는 분말의 임의의 적합한 식품, 또는 임의의 다른 적합한 식료품일 수 있다. 그러한 물질의 예는 WO 0038535호 또는 WO 91/09536호에서 발견될 수 있다.
또한 용어 항분비 인자에 의해 의도된 살로붐 ( Salovum ) ®은 예컨대, SE 900028-2호 및 WO 00/38535호에서 개시되고 하기에 추가로 설명된 바와 같은, 높은 함량의 항분비 인자(NASP)를 갖는 난황으로 제공될 수 있는 천연 항분비 인자(NASP)이다.
순응도(compliance)는 본 맥락에서 고수(adherence) 또는 유지(maintenance)와 구별되는 것으로서, 환자가 처방받은 요법을 따르는 불변성(constancy) 및 정확성(accuracy)의 정도를 기술하기 위해 사용된다. 그것은 환자가 그 또는 그녀의 건강관리에 활발히 참여하는 것; 진찰을 받는 것, 약속을 지키는 것, 생활방식에 관한 권고를 따르는 것뿐만 아니라 의학적 요법을 따르는 것을 포함한다.
발명의 상세한 설명
임상 연구들은 염증 및/또는 분비 장애를 수반하는 만성 질환을 갖는 환자가 낮은 혈장 AF-활성을 갖는다는 것을 보여왔다(Lange et al., 2003; Laurenius et al.,2003). 따라서, 만성 질환에서, 상기 질환 과정은 AF-활성의 내인성 증가를 위한 충분한 자극이 되지 않는 것으로 보인다. 여전히, 이 환자들은 식이-유도된 AF-활성 증가로부터 이익을 얻을 수 있다.
다클론 항체를 이용한 본 발명자들에 의한 이전 연구들은, 조직에 AF의 많은 형태적 변이체가 존재한다는 것을 보여주며(Jennische et al., 2006), AF-활성의 조절이 AF 단백질의 활성 서열(들)을 노출시키거나 감추는 형태적 변화를 수반한다는 것이 제안되었다. 혈장에 존재하는 대부분의 AF는 항분비 불활성 상태에 있으며, AF의 분획의 활성화는 박테리아 독소의 장내 공격, 또는 특정 식이 화합물에 대한 반응으로서 일어난다. 본 개시내용은 활성화 단계가 프로테아좀에서 AF1 단백질의 항분비 부위의 노출에 관여한다는 것을 입증한다.
본 발명자들은 앞서 아가로스에 대한 AF1의 결합 증가가 그의 항분비 및 항염증 활성과 연관된다는 것을 보여왔다. 놀랍게도, SPC의 섭취가 아가로스에 대한 AF1의 결합 뿐만 아니라, 보체 인자 C3에 대한 AF1의 결합을 야기한다는 것이 본원에 개시되어 있다. AF1 및 C3 간의 결합은 최소량의 혈장만을 필요로 하는 민감성 ELISA 테스트에 의해 입증될 수 있다. 이전에 사용된 시험은 아가로스 컬럼 상에서 일차 정제가 수행되어야 하므로, 10배 더 많은 혈장을 필요로 하고 더 많은 시간이 소요된다. 상기 결과는 조절성 19S 서브유닛 뿐만 아니라 촉매성 20S 서브유닛이 C3과 결합한다는 것을 추가로 보여준다.
본원에 처음으로 개시된 단일클론 AF1 항체(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb))는 온전한 프로테아좀과 반응하지 않았고, 이는 단백질 구조의 개방(opening)이 SPC의 섭취 후 C3의 결합시 일어난다는 것을 가리킨다. 따라서, 정상적으로는, AF1은 19S 및 20S 프로테아좀 서브유닛 사이에 감춰져 있지만, C3c와의 반응이 AF 복합체의 항분비 활성을 담당하는 펩타이드 서열을 개방시키는 것으로 보인다는 것을 가리킨다.
프로테아좀에의 결합은 C3을 그의 불활성 형태인 C3c로 전환시킬 수 있다. C3의 C3c로의 분열은 이전에 보조인자로서 인자 H와 함께, 항상 단백질분해 보체 인자 I에 관여하는 것으로 나타났다. 순환하는 프로테아좀이 또한 보조인자로서 작용하는지 여부, 또는 오히려 단백질분해 분열에 직접 관여하는지 여부는 지켜봐야 한다. C3의 전체 α-사슬을 C3c로 전환하는 아가로스의 능력은 주목할 만하다. 본 개시내용 이전에는, 혈장이 상이한 표면 활성 물질에 노출됨에 따라 단지 C3c로의 부분적인 전환이 기술되어 왔다.
더욱이, 처음으로, 바이러스 감염이 프로테아좀 및 보체 인자 C3 및/또는 C4 사이에 복합체 형성을 유도하는 것으로 나타난다. 세포내 프로테아좀은 염증의 개시 동안, 예컨대 NFκB의 활성화 동안 중요한 역할을 한다. 지질다당류에 의한 인플라마좀 프라이밍(Inflammasome priming)은 프로테아좀 기능에 의존적이다. 본 발명을 과학적 가설에 한정하고자 하는 것은 아니지만, 아마도, 혈액 내의 프로테아좀은 보체 작용을 향상시킴으로써 염증을 촉발할지 모른다. 반면 SPC는 프로테아좀 뿐만 아니라 보체의 분열을 야기하여 프로테아좀 및 C3 보체 인자의 하향-조절을 야기함으로써 이를 방지한다. 이 가설은 환자에서 항염증성으로 작용하는 프로테아좀 억제성 식품 성분을 이용한 최근 실험에 의해 강화된다. 더욱이, 어떤 식품 성분들은 혈액에서 C3 수준을 감소시키는 능력을 가지며, 이는 프로테아좀-C3 응집 때문일지도 모른다.
체액 내의 온전한 프로테아좀에 관한 연구는 종래에 없다. 그러나, GeneCards에 따르면, AF1과 같은 구별되는 프로테아좀 단백질이 조직에서 동일한 농도로, 예컨대 1 ppm으로 혈장에 존재하는 것으로 추정된다(http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=PSMD4). 이 농도는 현재 제시된 추정뿐만 아니라 순환하는 20S 프로테아좀 서브유닛의 보고된 수준보다 더 높다. 상기 차이는 혈액 내의 프로테아좀이 상기 개시된 분석에서 표준으로서 사용된 조직에서의 프로테아좀과 상이하다는 것을 제안할 수 있다. 흥미롭게도, 순환하는 20S 프로테아좀의 농도는 자가면역 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창 및 쇼그렌 질환과 상관관계가 있었다. 이들 20S 서브유닛 역시 19S 조절성 서브유닛과 연관될 수 있는지 여부는 미해결 문제이다.
결론적으로, 처음으로, 프로테아좀 및 보체 인자 3의 복합체 및 프로테아좀 및 보체 인자 C4의 복합체의 존재가 각각 개시되어 있다. 이 형성은 본원에서 단순 포진 바이러스 1에 의해 유도되지만 다른 염증제에 의해 유도될 수 있다. 이 반응은 프로테아좀-보체 복합체의 분해를 야기하는 SPC의 섭취에 의해 방지되며, 여기서 두 성분들이 부분적으로 분열되어: 프로테아좀이 감춰진 항분비 펩타이드 서열을 노출시키고, C3는 C3c로 전환된다.
이 통찰력은 항원-항체 반응을 이용하여 샘플 내에 함유된 프로테아좀-C3 복합체 형성을 측정하기 위한 새로운 면역학적 분석의 개발을 야기하며, 여기서 제1 항체 및 제2 항체의 전술한 조합은 체액 중의 프로테아좀-C3 복합체 형성 및/또는 프로테아좀-C4 복합체 형성의 신속한 측정을 가능하게 하는 그러한 조합이다. 특히, 체액 중의 1) 프로테아좀-C3 형성, 2) 프로테아좀 C4 형성 및 3) AF-노출시키는프로테아좀뿐만 아니라 혈장 중의 순환하는 26S 프로테아좀을 결정할 수 있는 몇 가지 새로운 ELISA 방법들이 기재되어 있다.
면역학적 분석
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 면역학적 분석은 항원-항체 반응을 이용하여 샘플 내에 함유된 프로테아좀-C3 복합체 형성을 측정하는 면역학적 분석으로서, 제1 항체 및 제2 항체의 전술한 조합은 프로테아좀-C3 복합체 형성의 신속한 측정을 가능하게 하는 그러한 조합인 면역학적 분석이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 면역학적 분석은 항원-항체 반응을 이용하여 샘플 내에 함유된 프로테아좀-C4 복합체 형성을 측정하는 면역학적 분석으로서, 제1 항체 및 제2 항체의 전술한 조합은 프로테아좀-C4 복합체 형성의 신속한 측정을 가능하게 하는 그러한 조합인 면역학적 분석이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 면역학적 분석은 항원-항체 반응을 이용하여 샘플 내에 함유된 AF1-노출된 프로테아좀-C3 복합체 형성을 측정하는 면역학적 분석으로서, 제1 항체 및 제2 항체의 전술한 조합은 AF1-노출된 프로테아좀-C3 복합체 형성의 신속한 측정을 가능하게 하는 그러한 조합인 면역학적 분석이다.
즉, 본 발명의 면역학적 분석은 측정될 물질인 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 결합하는 제1 항체, 및 보체 인자 C3, 또는 C4, 또는 C3 또는 C4의 유도체에 결합하는 제2 항체의 조합으로서, 가능한 조합들 중 어느 하나를 이용하여 프로테아좀-보체 복합체 형성을 측정하는 면역학적 분석이다. 상기에 따르면, 본 발명의 면역학적 분석은 샘플 내에 함유된 프로테아좀-보체 복합체 형성의 신속한 측정을 가능하게 한다.
면역학적 분석의 예는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA, EIA), 형광 면역분석(FIA), 방사선면역분석(RIA), 발광 면역분석(LIA), 효소 항체 기술, 형광 항체 분석, 면역크로마토그래피, 면역비탁법(immunonephelometry), 라텍스 비탁법(latex turbidimetry), 및 라텍스 응집분석을 포함한다.
또한, 본 발명의 면역학적 분석에서의 측정은 수동으로 또는 분석 장치와 같은 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 면역학적 분석은 공중에게 알려진 방법에 따라 작동될 수 있다. 예를 들어, 담체 상에 고정된 제1 항체, 샘플, 및 표지 물질로 수식된 제2 항체는 동시에 또는 순차적으로 반응된다. "담체 상에 고정된 제1항체-및-표지 물질로 수식된 제2 항체"의 복합체가 상기 반응에 의해 형성되고, 샘플 내에 함유된 프로테아좀-보체 복합체 형성의 양(농도)은 복합체 내에 함유된 표지 물질로 수식된 제2 항체의 양에 기초하여 측정될 수 있다.
예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석은 제1 항체가 고정된 마이크로플레이트, 검체의 희석액, HRP와 같은 효소로 수식된 제2 항체, 세척 완충제, 및 기질액을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 측정은 제2 항체를 수식하는 효소를 상기 효소를 위한 최적 조건하에 그의 기질과 반응시키고, 광학적 방법 등에 의해 상기 효소 반응의 생성물의 양을 측정함으로써 수행될 수 있다.
또한, 형광 면역분석은 제1 항체가 고정된 광도파로(optical waveguide), 검체의 희석액, 형광 기질로 수식된 제2 항체, 및 세척 완충제를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 측정은 제2 항체를 수식하는 형광 기질에 여기 광을 조사하고, 상기 형광 기질에 의해 방출된 형광의 강도를 측정함으로써 수행될 수 있다.
또한, 방사선면역분석이 수행되는 경우, 방사선 물질에 의해 방출된 방사선의 양이 측정된다. 또한, 발광 면역분석이 수행되는 경우, 발광 반응 시스템으로부터 방출된 광의 양이 측정된다.
또한, 면역비탁법, 라텍스 비탁법, 라텍스 응집분석 등이 수행되는 경우, 투과광 및 산란광이 종료점 측정 또는 속도 방법에 의해 측정된다. 또한, 면역크로마토그래피 등이 시각적으로 수행되는 경우, 시험선에 나타나는 표지 물질의 색상이 시각적으로 측정된다. 분석 장치와 같은 기기가 시각적 측정 대신에 사용될 수 있음에 유념해야 한다.
본 발명의 면역학적 분석 또는 방법에서 사용되는 샘플은 아마도 프로테아좀-보체 복합체를 함유하는 모든 생물학적 샘플, 예컨대 포유동물의 혈액, 혈청, 혈장, 젖, 누액, 눈물, 정액, 정장액, 질액, 타액, 객담, 땀, 복수, 양수, 활액, 위액, 뇌척수액, 척수액, 안액, 고름 및/또는 점액을 포함하는 체액을 포함한다.
본 발명의 면역학적 분석 또는 방법에서 사용되는 샘플은 임의의 포유동물로부터 채취될 수 있다. 일 구현예에서, 포유동물은 인간, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 설치류, 개, 고양이 또는 낙타로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 면역학적 분석 또는 방법에서 사용되는 샘플은 조류, 예컨대 암탉으로부터 수득될 수 있다. 본 기술분야의 숙련가는 이 특정 구현예에서, 조류 항원에 대한 항체가 선택될 필요가 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 상기 선택된 항체는 측정될 물질인 조류 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 결합하는 제1 항체, 및 조류 보체 인자 C3 또는 이의 유도체에 결합하거나, 또는 보체 인자 C4 또는 이의 유도체에 결합하는 제2 항체이다. 본 발명의 면역학적 분석 또는 방법의 이 특정 구현예에서 사용될 샘플은 아마도 프로테아좀-보체 복합체를 함유하는 모든 생물학적 샘플, 예컨대 특히 조류, 예컨대 비제한적으로 암탉의 혈액, 혈청, 혈장, 및 난황을 포함하는 체액을 포함한다.
면역학적 분석
키트
본 발명의 면역학적 분석 키트는 항원-항체 반응을 이용하여 샘플 내에 함유된 프로테아좀-C3 복합체 형성, 프로테아좀-C4 복합체 형성 및 AF1-노출된 프로테아좀-C3c 복합체 형성을 측정하기 위한 면역학적 분석 키트로서, 제1 항체 및 제2 항체의 전술한 조합은 프로테아좀-보체 복합체 형성의 신속한 측정을 가능하게 하는 그러한 조합인 면역학적 분석 키트이다.
본 발명에 따른 면역학적 분석 키트는 본 발명의 전술한 면역학적 분석을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 전술한 면역학적 분석에 유사한 측정 원리 등이 본 발명의 면역학적 분석 키트에 적용된다.
면역학적 분석
키트
내의 다른 시약 성분
본 발명의 면역학적 분석 키트에서, 다양한 수성 용매가 용매로서 사용될 수 있다. 수성 용매의 예는 정제수, 생리학적 염수, 또는 다양한 완충제, 예컨대 트리스 완충제, 인산염 완충제, 또는 인산염-완충된 생리학적 염수를 포함할 수 있다. 이들 완충제의 pH는 특별히 제한되지 않으며, 적합한 pH가 적절하게 선택될 수 있지만; 상기 pH는 일반적으로 pH 3 내지 12의 범위 내에서 선택된다.
또한, 본 발명의 면역학적 분석 키트는, 담체 상에 고정된 전술한 제1 항체 및 표지 물질로 수식된 제2 항체 외에도, 하나 이상의 종류의 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 카세인, 또는 이의 염, 다양한 염, 다양한 당, 탈지분말, 다양한 동물의 혈청, 예컨대 일반 토끼 혈청, 다양한 보존제, 예컨대 소디움 아자이드 및 항생제, 활성제, 반응 촉진제, 민감도 강화제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 비-특이적 반응 억제제, 다양한 계면활성제, 예컨대 비-이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 또는 음이온 계면활성제 등을 적절하게 포함할 수 있다. 분석 시약에서 이들 물질의 농도는 특별히 제한되지 않지만, 상기 농도는 0.001 내지 10%(W/V)일 수 있고, 0.01 내지 5%(W/V)일 수 있다.
면역학적 분석
키트의
조성
전술한 제1 및 제2 항체가, 측정될 물질인 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀에 결합하는 제1 항체, 및 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 결합하는 제2 항체, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체 중 적어도 하나를 포함하는 한, 본 발명의 면역학적 분석 키트는 특별히 제한이 없다. 전형적으로, 적어도 제1 및 제2 항체는 별개의 용기에서 제공된다.
또한, 판매를 위한 본 발명의 면역학적 분석 키트는, 전술한 2개의 항체를 함유하는 시약 외에도, 조합되고 분리된 다른 시약을 포함한다.
전술한 다른 시약의 예는 완충제, 샘플의 희석액, 시약의 희석액, 표지 물질을 함유하는 시약, 발색과 같이 신호를 생성하는 물질을 함유하는 시약, 발색과 같이 신호의 생성에 관여하는 물질을 함유하는 시약, 보정을 위한 물질을 함유하는 시약, 정확성 조절을 위해 사용되는 물질을 함유하는 시약을 포함한다.
게다가, 전술한 다른 시약 및 본 발명의 면역학적 분석 시약은 적절하게 사용될 수 있고 다양한 조합으로 판매될 수 있으며, 예를 들어, 상기 다른 시약은 제1 시약으로서 제공될 수 있고, 본 발명의 면역학적 분석 시약은 제2 시약으로서 제공될 수 있거나, 또는 본 발명의 면역학적 분석 시약은 제1 시약으로서 제공될 수 있고, 전술한 다른 시약은 제2 시약으로서 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 면역학적 분석 키트의 구성은 특별히 제한되지 않지만, 간단한 방식으로 신속한 측정을 수행하기 위하여, 본 발명의 면역학적 분석 키트는 본 발명의 면역학적 분석 키트의 성분들이 통합된 일체형(all-in-one) 진단 키트로서 제공될 수 있다. 전술한 일체형 키트는 특별히 제한되지 않지만, 이의 예는 ELISA 키트, 형광 면역분석 키트, 및 면역크로마토그래피 키트를 포함한다.
예를 들어, ELISA 키트의 구성은 제1 항체가 고정된 마이크로플레이트, 검체의 희석액, HRP와 같은 효소로 수식된 제2 항체, 세척 완충제, 기질액 등을 포함한다.
또한, 형광 면역분석 키트가 제공되는 경우, 상기 키트는 제1 항체가 고정된 광도파로(optical waveguide), 검체의 희석액, 형광 기질로 수식된 제2 항체, 세척 완충제 등을 포함한다.
또한, 면역크로마토그래피 키트가 제공되는 경우, 하기 구현예가 예로서 제공될 수 있다. 하나의 말단(다운스트림 쪽)에 고정된 전술한 제1 항체를 갖는 막이 반응 카세트 내에 보관된다. 한편, 발색액이 상기 막의 다른 말단(업스트림 쪽)에 설정되고, 부가된 전술한 표지 물질을 위한 기질을 갖는 패드가 발색액이 설정되는 곳에 가까운 다운스트림 쪽에 배열되고, 전술한 표지 물질로 표지된 제2 항체를 갖는 패드가 상기 막의 중간부에 배열된다.
항체
본 발명의 면역학적 분석 및 면역학적 분석 키트에서 제1 항체는 담체 상에 고정된다. 즉, 제1 항체는 항체 중 하나를 물리흡착, 화학적 결합, 또는 이들의 조합과 같은 방법을 통해 담체에 흡착시키거나 고정시킴으로써 제조된다.
물리흡착에 의해 고정된 항체는 공중에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 그러한 방법의 예는 항체 및 담체가 혼합되고 완충제와 같은 용액에서 서로 접촉되는 방법 및 완충제 등에 용해된 항체가 담체에 접촉되는 방법을 포함한다.
전형적으로, 제1 항체 및 제2 항체는 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1(예컨대(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)) 또는 온전한 프로테아좀 및 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로부터 선택된다.
제1 항체는 바람직하게는 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체(예컨대, 기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)), LMP2에 특이적인 항체, 20Salfa6에 특이적인 항체, 20Salfa1, 2, 3 또는 4에 특이적인 항체 및 Rpt5에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 항체는 바람직하게는 보체 인자 C3, 예컨대 C3, C3c, C3b, iC3b에 특이적인 항체, 또는 보체 인자 C4, 예컨대 C4, C4b, iC4b 또는 C4c에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Anders Oldfors, Dept. Pathology, Institute of Biomedicine, University of Goteborg, P.O.B. 420, S-40530 Goteborg, Sweden이 부다페스트 조약에서 정해진 것과 동일한 조건으로, 수탁 번호 DSM ACC3271 생물학적 물질하에, Department of Infectious Diseases, Institute of Biomedicine, Goteborg University, Guldhedsgatan 10, 41346 Goteborg, Sweden의 이름으로, 2015년 5월 12일에, Leibniz-Institute DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7 B, D-38124 Braunschweig, Germany에 기탁하였음을 증언하는 허가 및 동의의 기탁자의 진술이 본원에 포함되어 있다. 기탁자는 본원에서 Lantmannen AS-Faktor AB, BOX 30192, 104 25 Stockholm이 국제 및 유럽 및 미국 특허 출원[대표자의 참고 번호 PS54728PC00/ PS54728EP00/ PS54728US00] 내에 전술한 기탁된 생물학적 물질을 참고하도록 권한을 부여하였고 전술한 특허 출원의 출원일자 이래로 규칙 33 EPC에 따라 공중이 이용가능하게 되는 기탁된 물질에 대해 전적인 그리고 변경할 수 없는 동의를 하였다.
또한, 화학적 결합에 의해 고정된 항체는 또한 공중에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 그러한 방법의 예는 항체 및 담체가 2가 가교 시약, 예컨대 글루타르알데하이드, 카보디이미드, 이미드 에스테르, 또는 말레이미드와 혼합되고 상기 항체 및 담체의 모두의 아미노기, 카복실기, 티올기, 알데하이드기, 하이드록실기 등이 반응하도록 서로 접촉되는 방법을 포함한다.
또한, 필요한 경우, 비-특이적 반응, 항체가 고정된 담체의 자발적 응집 등을 억제하기 위한 처리가 공중에게 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러한 방법의 예는 항체가 고정된 담체의 표면 또는 내부 표면이 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 젤라틴, 달걀 알부민, 또는 이의 염, 계면활성제, 탈지 분유 등으로 덮이도록 상기 담체의 표면 또는 내부 표면을 이들 물질과 접촉시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 면역학적 분석 및 면역학적 분석 키트에서 제2 항체는 표지 물질로 수식된다. 제2 항체는 상기 항체 중 하나를 물리흡착, 화학적 결합, 또는 이들의 조합과 같은 방법을 통해 표지 물질에 흡착시키거나 결합시킴으로써 제조된다. 물리흡착에 의해 표지 물질이 결합된 항체는 공중에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 그러한 방법의 예는 항체 및 표지 물질이 혼합되고 완충제와 같은 용액에서 서로 접촉되는 방법 및 완충제 등에 용해된 항체가 표지 물질과 접촉되는 방법을 포함한다.
예를 들어, 표지 물질이 금 콜로이드 또는 라텍스인 경우, 물리흡착이 효과적이다. 금 콜로이드로 표지된 항체는 항체 및 금 콜로이드를 완충제에서 혼합하고 이들을 서로 접촉시킴으로써 수득될 수 있다.
또한, 화학적 결합에 의해 표지 물질로 수식된 항체는 또한 공중에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 그러한 방법의 예는 항체 및 표지 물질이 2가 가교 시약, 예컨대 글루타르알데하이드, 카보디이미드, 이미드 에스테르, 또는 말레이미드와 혼합되고, 상기 항체 및 표지 물질 모두의 아미노기, 카복실기, 티올기, 알데하이드기, 하이드록실기 등이 반응하도록 서로 접촉되는 방법을 포함한다. 예를 들어, 표지 물질이 형광 물질, 효소, 또는 발광 물질인 경우, 화학적 결합이 효과적이다.
또한, 필요한 경우, 비-특이적 반응, 표지 물질로 수식된 항체의 자발적 응집 등을 억제하기 위한 처리가 공중에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러한 방법의 예는 표지 물질이 결합된 항체가 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 젤라틴, 달걀 알부민, 또는 이의 염, 계면활성제, 탈지 분유 등에 덮이도록 이들 물질과 접촉되는 방법을 포함한다.
또한, 효소-결합 면역흡착 분석이 수행되는 경우, 퍼옥시다아제(POD), 알칼라인 포스파타아제(ALP), β-갈락토시다아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스 옥시다제, 락테이트 데하이드로게나아제, 아밀라아제 등이 표지 물질로서 사용될 수 있다.
또한, 형광 면역분석이 수행되는 경우, 플루레세인 이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트, 치환된 로다민 이소티오시아네이트, 디클로로트리아진 이소티오시아네이트, 시아닌, 메로시아닌 등이 사용될 수 있다. 또한, 방사선면역분석이 수행되는 경우, 트리튬, 요오드-125, 요오드-131 등이 사용될 수 있다.
또한, 발광 면역분석이 수행되는 경우, 루미놀 화합물, 루시퍼라아제 화합물, 아크리디늄 에스테르, 디옥세탄 화합물 등이 사용될 수 있다.
또한, 면역크로마토그래피, 면역비탁법, 라텍스 비탁법, 및 라텍스 응집분석이 수행되는 경우, 폴리스티렌, 스티렌-스티렌 설포네이트 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 비닐 클로라이드-아크릴산 에스테르 공중합체, 비닐 아세테이트-아크릴산 공중합체, 폴리아크롤레인, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 스티렌-글리시딜(메트)아크릴산 공중합체, 스티렌-부타디엔 공중합체, (메트)아크릴산 중합체, 아크릴산 중합체, 라텍스, 젤라틴, 리포좀, 마이크로캡슐, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 금속 콜로이드, 세라믹, 또는 자성 물질과 같은 물질로 만들어진 입자가 사용될 수 있다.
본 발명의 면역학적 분석에서 담체로서, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐 톨루엔, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 나일론, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아마이드, 라텍스, 리포좀, 젤라틴, 아가로스, 셀룰로오스, 세파로스, 유리, 금속, 세라믹, 또는 자성 물질과 같은 물질로 만들어진 비드 형태의 고체 담체, 마이크로플레이트, 시험 튜브, 스틱, 막, 검체 조각 등이 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 담체로서, 광도파로(optical waveguide)로서 구성된 도파로가 사용될 수 있다.
항분비
인자
항분비 인자는 체내에서 천연적으로 존재하는 단백질의 부류이다. 인간 항분비 인자 AF 단백질은 뇌하수체로부터 단리될 때 382-288 아미노산을 포함하는 41 kDa 단백질이다. 활성 부위는 상기 단백질의 N-말단에 가까운 영역의 단백질에 국한될 수 있고, 특히 서열번호 1의 아미노산 1-163, 보다 구체적으로 항분비 인자(AF) 단백질 서열 상의 아미노산 위치 35-50에 국한될 수 있다. AF의 생물학적 효과는 상기 공통 서열의 적어도 6개의 아미노산, 서열번호: 2(AF-6)를 포함하는 단편 및/또는 동족체, 또는 상기 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드의 기능을 변화시키지 않는 이의 변형에 의해 발휘된다.
본 발명자들은 항분비 인자가 모든 세포에서, 특히 19 S/PA 700 캡에서 만연한 구성 성분인 26 S 프로테아좀의 서브유닛을 구성하는 단백질 S5a, 및 Rpn10과 상동성이라는 것을 보여왔다. 본 발명에서, 항분비 인자(AF) 단백질은 동일한 기능적 특성을 갖는 동족체 단백질의 부류로서 정의된다. 항분비 인자는 또한 트롬보스폰딘-1에 결합하고 암 진행과 연관된 것으로 알려진 또 다른 단백질 아형(isoform)인 안지오시딘과 매우 유사하다.
본 발명의 면역학적 분석 키트 및 본원에 기재된 방법뿐만 아니라, 본 발명의 면역학적 분석은 적어도 제1 항체 및 제2 항체를 이용하며, 이들 중 하나는 프로테아좀 단백질, 예컨대 AF1 또는 온전한 프로테아좀, AF에 대한 동족체, 유도체, 펩타이드, 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 항분비 인자(AF)의 단편에 특이적인 항체로부터 선택된다. 본 맥락에서, 동족체, 유도체 또는 단편은 자연적으로 존재하는 항분비 인자(AF) 단백질의 것에 상응하는 적어도 6개의 아미노산(서열번호: 2에 나타난 바와 같음)을 포함하며, 이는 상기 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드의 필수적 기능을 변화시키지 않으면서 항분비 인자의 생물학적 활성을 최적화하기 위해 하나 이상의 아미노산을 변화시킴으로써 추가로 변형될 수 있다.
WO 00/038535호는 그와 같은 항분비 인자(AF) 단백질이 풍부한 식료품을 개시하며, 이는 본 맥락에서 적합한 식품, 식료품 및/또는 식품 보충물에 대한 예이다.
본 발명은 처음으로 제1 항체 및 제2 항체를 이용하여 체액 중의 AF1-노출된 프로테아좀-C3 복합체 형성의 존재 또는 부재, 및/또는 농도를 결정하기 위한 면역학적 분석, 방법 및 키트를 개시하며, 여기서 제1 항체 또는 제2 항체 중 어느 하나는 AF1, AF에 대한 동족체, 유도체, 펩타이드, 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 항분비 인자(AF)의 단편에 특이적인 항체로부터 선택된다.
상기 개시된 분석 또는 방법은 혈장 또는 다른 체액에서 순환하는 26S 프로테아좀의 수준을 측정하는데, 예컨대 포유동물의 몸에서의 보체계 (하향-)조절을 포함하는, 포유동물의 몸에서의 염증의 수준을 모니터링하는데 뿐만 아니라 가공 곡물(SPC) 및/또는 높은 수준의 천연 항분비 단백질(NASP)을 갖는 기능성 식품의 순응도(compliance)를 확인하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 개시된 면역학적 분석 또는 방법은 바람직하게는 천연적으로 존재하는 항분비 인자가 풍부한 난황으로서 제공되는, 매우 높은 수준의 천연 항분비 인자(AF) 단백질을 갖는, 살로붐(Salovum)®(NASP), 식품, 사료 및/또는 식품 보충물의 순응도를 확인하는데 이용된다. 예컨대, 상기 식품, 사료 및/또는 식품 보충물을 섭취한 대상으로부터 채취된 샘플을 시험하여 상기 식품, 사료 및/또는 식품 보충물의 섭취 후 상기 대상에서 프로테아좀-보체 복합체 형성을 측정하는 것이 예상된다.
또 다른 대등하게 바람직한 구현예에서, 상기 개시된 면역학적 분석 또는 방법은, 항분비 인자(AF) 단백질의 흡수, 형성 및/또는 방출을 유도하는 식품 및/또는 특수 식이용 식품의 섭취 후 대상에 의해, 서열번호: 1(AF)에 나타난 바와 같은 항분비 인자(AF) 단백질, 및/또는 동등한 활성을 가지며 서열번호: 2(AF-6)에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 이의 동족체 및/또는 단편의 내인성 생산을 자극하는 가공 곡물, 예컨대 SPC®, 및/또는 이의 약제학적으로 활성인 염의 순응도를 확인하는데 이용된다. 또한, 상기 식품, 사료 및/또는 식품 보충물을 섭취한 대상으로부터 채취된 샘플을 시험하여 상기 식품, 사료 및/또는 식품 보충물의 섭취 후 상기 대상에서 프로테아좀-보체 복합체 형성을 측정하는 것이 예상된다.
실험 부분
본 연구에서, AF 복합체는 프로테아좀 및 보체 C3으로 이루어진 것으로 나타난다. 프로테아좀 및 프로테아좀-보체 C3 복합체는 인간 혈액으로부터 정제되고 웨스턴 블롯 및 질량 분광학에 의해 분석된다. 프로테아좀 서브유닛에 특이적인 항체가 생산되고 2가지 새로운 면역분석(ELISA)이 개발된다. 첫 번째 ELISA 테스트는 정상 혈장에서 0.41±0.03 μg의 26S 프로테아좀 농도를 확립하고, 두 번째 ELISA는 프로테아좀이 보체 인자 C3에 결합한다는 것을 개시한다. 후자 시험은 AF를 측정하며, 이는 가공 곡물의 섭취 후 약 10배 증가된다. 보체 인자 H 및 I의 수준 간에 차이가 관찰되지 않았다. AF의 유도는 혈장을 시험관 내에서 아가로스 겔과 함께 배양함으로써 모사될 수 있으며, 이는 형성된 단백질 펩타이드 서열을 단리하고 규명하는 것을 가능하게 한다. C3은 프로테아좀 결합시 부분적으로 그의 불활성 형태 C3c로 분열되며, 이는 AF 복합체 형성 동안 항염증 효과를 설명한다. 결론적으로, 26S 프로테아좀은 정상 혈액에 존재하고 보체 C3과 상호작용하여, AF 복합체를 형성한다.
실시예
1
재료 및 방법
일반 시약
AF1에 특이적인 단일클론 항체를 생산하였고, 이는 기탁 번호 XY 하에 기탁되어 있다. 프로테아좀 LMP2(20Sβ1i) 및 20Sα6에 특이적인 단일클론 마우스 IgG 항체를 Enzo Life Science(www.enzolifesciences.com)로부터 수득하였다. 보체 인자 C3c에 특이적인 다클론 항체는 Dako(www.dako.com)로부터 구입하였다. 세파로스 6B 및 세파크릴 S300은 Amersham(GE healthcare)으로부터 수득하였다. 미리 팽윤된 DE52 셀룰로오스는 Whatman no 4057050 Schleicher & Schuell(GE healthcare)로부터 수득하였다. 특수 가공 곡물(SPC)은 AS-Faktor AB, Stockholm, Sweden(www.as-faktor.se)으로부터 수득하였다.
인간 혈액 샘플
6명의 건강한 시험자를 예테보리 대학의 생의학과로부터 모집하였다. 예테보리 대학의 윤리 의원회가 연구 프로토콜을 승인하였다(Dnr. 037-14, Exp. 2014-02-19). 시험자 중 3명은 1개월 동안 매일 1 g/kg 체중의 SPC를 섭취한 반면, 나머지 3명은 대조군으로서 제공되었다. 각각의 사람으로부터, 15-20 ml 정맥혈을 EDTA 진공채혈기(gbo.com/preanalytics) 내로 채혈하였다. 원심분리에 의해 분리 후, 혈장을 동등한 부피의 시트레이트 완충제(글루코스 0.11 M, 트리-소디움-시트레이트 0.03 M 및 염화나트륨 0.07 M, pH 6.1)와 혼합하였다. 이후 각각의 샘플을 2 ml 분취량으로 나누고 사용할 때까지 -20℃에 유지시켰다. 어떤 샘플도 4주 넘게 냉동 보관하지 않았다.
아가로스
여과 후 AF1 분석.
이전에 기재된 바와 같이, AF1을 작은 아가로스 컬럼 상에서 혈장으로부터 친화성 정제하고, 농도를 면역분석에 의해 결정하였다(Johansson, E., I. Lonnroth, I. Jonson, S. Lange, and E. Jennische, Development of monoclonal antibodies for detection of Antisecretory Factor activity in human plasma. J Immunol Methods, 2009. 342(1 -2): p. 64-70.). 요약하면, 1:1 희석된 혈장 샘플(상기 기술됨) 6 ml을 3 ml 세파로스 6B 컬럼을 통과시키고, PBS로 2회 세척한 후, 1 M α-메틸-글리코사이드로 용출시켰다. 정제된 샘플을 96-웰 플레이트에서 적정하고, 밤새 코팅하고, 3H8 단일클론 마우스 AF1에 특이적인 항체(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)) 또는 대조군으로서 PBS에 의해 검출하고, 최종적으로 알칼라인 포스파타아제(AP)에 결합된 제2 항체로 현상하였다. 405 nm에서 흡광도 판독 후, 결과를 역전된 역가로서 제시하였다. 3H8 항체(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb))는 항분비 활성을 담당하는 AF 서열을 인식한다(Nicolas, V. and V. Lievin-Le Moal, Antisecretory peptide AF-16 inhibits the Sat toxin-stimulated transcellular and paracellular passages of fluid in cultured human enterocyte-like cells. Infect Immun, 2014. Matson Dzebo, M., A. Reymer, K. Fant, P. Lincoln, B. Norden, and S. Rocha, Enhanced cellular uptake of antisecretory peptide AF-16 through proteoglycan binding. Biochemistry, 2014. 53(41 ): p. 6566-73.).
프로테아좀
/C3 ELISA
혈장 중의 프로테아좀/C3 복합체의 검출을 위해 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 1:200으로 희석된 단일클론 3H8 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)) 또는 1:2000으로 희석된 LMP2를 96-웰 역가 플레이트 상에 밤새 코팅하였다. 37℃에서 45분 동안 0.2% BSA로 차단한 후, 혈장 샘플을 0.2% BSA, 0.05% 트윈 20, PBS에서 적정하고, 1시간 동안 교반하였다. 1:2000으로 희석된 다클론 토끼 항체를 검출 항체로서 적용하였다. 30분간 배양 후, 항-토끼-AP 2차 항체를 적용하고, 부가적으로 30분 후, AP 기질을 부가하였다. 흡광도를 광도계에서 405 nm에서 판독하였다.
순환하는
프로테아좀
19S 프로테아좀 서브유닛을 DeMartino(DeMartino, G.N., Purification of PA700, the 19S regulatory complex of the 26S proteasome. Methods Enzymol, 2005. 398: p. 295-306.)에 의해 기재된 바와 같이 인간 적혈구로부터 제조하였다. 요약하면, 인간 혈액으로부터의 세척된 적혈구를 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올에서 용해시키고, 10000 x g에서 2시간 동안 원심분리하였다. 상기 용해물에, ¼ 부피의 DE52 셀룰로오스를 부가하고, 실온에서 30분간 서서히 혼합하였다. 상기 셀룰로오스를 여과하여 제거하고, 여과물을 40% 포화된 암모늄 설페이트에서 침전시켰다. 상기 침전물을 완충제 X(20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM DTT-20% 글리세롤, pH 7.6)에서 용해시킨 후, 용액을 완충제 X로 평형화된 세파크릴 S-300 컬럼 상에서 겔 여과하였다. 상기 기재된 단일 ELISA에서 최대 반응성에 의해 밝혀진(아가로스 여과 후 AF1 분석), 19S를 함유하는 단백질 피크를 비-변성 겔 전기영동에 의해 확인하였다.
토끼를 1개월 동안 투여된 100 μg의 4개의 용량에 의해 상기 정제된 서브유닛으로 면역화시켜 19S 프로테아좀 서브유닛에 특이적인 항혈청을 야기하였다. 1:1000으로 희석된 20Sα6에 특이적인 포획 항체(Enzo Life science)를 Nunc 96-웰 맥시소르프폴리비닐(Maxisorppolyvinyl) 플레이트(Sigma-Aldrich) 상에 코팅하고, 1:400으로 희석된 다클론 항-19S를 검출 항체로서 사용하였다. 26S 프로테아좀(Enzo life science)을 참조로서 사용하였고, 토끼 전-면역 혈청을 대조군으로서 사용하였다. 상업적인 키트(Enzo life science)를 혈장 내의 20S 서브유닛의 검출을 위해 사용하였다. 이 키트는 또한 포획 항체로서 20Sα6 단일클론 및 검출 항체로서 다클론 20S를 사용한다.
웨스턴
블롯
SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Johansson, E., I. Lonnroth, S. Lange, I. Jonson, E. Jennische, and C. Lonnroth, Molecular cloning and expression of a pituitary gland protein modulating intestinal fluid secretion. J Biol Chem, 1995. 270(35): p. 20615-20.).
1:25000으로 희석된 보체 C3c에 특이적인 다클론 토끼 항체를 검출 항체로서 사용하였다. 혈장 샘플을 1:10으로 희석하였다.
아가로스
배양.
GE Healthcare Biosciences사로부터의 아가로스 세파로스 6B를 시험관내 프로테아좀-C3 복합체 형성을 달성하기 위해 사용하였다. 아가로스의 소형 겔에, 동일한 부피의 시트레이트 완충제(글루코스 0.11 M, 트리-소디움-시트레이트 0.03 M, 염화나트륨 0.07 M, pH 6.1)를 부가하였다. 일정 부피의 상기 겔 현탁액을 시험 튜브에 부가하고, 1500xg에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 버리고, 2 부피의 혈장을 부가하여 1:3의 혈장-겔 비율을 야기하였다. 상기 혈장-아가로스 혼합물을 4시간 동안 37℃에서 혈액 로커(rocker)에 두었다. 상기 아가로스를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 혈장을 추가 시험 때까지 -20℃에 유지시켰다.
프로테아좀
-C3 복합체의 정제
혈장을 상기 기재된 바와 같이 아가로스와 배양한 후, 동일한 부피의 포화된 암모늄 설페이트로 침전시켰다. 원심분리 후, 침전물을 4 부피의 결합 완충제(25 mM HEPES, 10% 글리세롤, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.4)에서 용해시켜 1 mg/ml의 단백질 농도를 생성하였다. 프로테아좀-C3 복합체의 부분적 정제를 Enzo Life Sciences사로부터의 프로테아좀 정제 키트 BML-PW1075A를 이용하여 달성하였다. 요약하면, 100 μg의 상기 용해된 단백질을 아가로스-결합된 항 20Sβ5로 이루어진 프로테아좀 결합 매트릭스와 함께 5℃에서 밤새 배양하였다. 상기 결합된 프로테아좀 물질을 결합 완충제로 3회 세척한 후, 25 μl SDS-PAGE 겔 로딩 완충제를 상기 매트릭스에 부가하고, 결합된 단백질을 95℃에서 10분간 용출시켰다. 9 μl를 웨스턴 블롯 겔에 적용하고, 남아있는 샘플을 하기에 기술된 바와 같이 질량 분광(MS) 분석을 위해 SDS-PAGE에 적용하였다.
LC-MS/MS 및 단백질 확인
쿠마시 염색된 겔 조각을 잘라내고, 단백질을 트립신으로 소화시켰다. 요약하면, 겔 조각을 50% CH3CN 중의 25 mM NH4HC03에서 3회 및 50% CH3OH 중의 25 mM NH4HC03에서 1회 세척하였다. 겔 조각을 진공 원심분리에서 건조시키고, 37℃에서 밤새 25 mM NH4HC03 중의 10 ng/μl의 트립신(Promega, Madison, Wl, USA)과 함께 배양하였다. 먼저 75% CH3CN/2% TFA를 부가하여 펩타이드를 추출한 후, 50% CH3CN/0.2% TFA로 추출하였다. 모은 추출물을 진공 원심분리기에서 증발시켜 건조시키고, MS 분석 전에 18 μl의 0.2% HCOOH에서 재구성하였다. 나노유속 LC-MS/MS를 7T ICR 자석(LTQ-FT, Thermo Electron, Bremen, Germany)이 장착된 하이브리드 선형 이온 트랩-FT-ICR 질량 분광계 상에서 수행하였다. 단백질 확인을 위해, 최소 기준을 MASCOT에 의해 제시된 95% 신뢰 수준 이상에서 매치된 적어도 2개의 트립신분해 펩타이드(tryptic peptide)로 설정하였다.
보체
I 및 H의 검출
혈장 중의 보체 I 및 H 농도의 결정을 위한 상업적 ELISA 키트를 사용하였다. AssayPro, USA(www.assaypro.com)로부터의 보체 I 키트는 0.4-20 μg/ml 범위로 보체 I 농도를 결정할 수 있게 해 주었고; Blue Gene(www.bluegene.ee)로부터의 보체 H 키트는 5-100 ng/ml 범위로 H 농도를 결정하였다.
바이러스
이후에 치명적인 것으로 판명된 국소 뇌염을 겪은 58세 남성 환자의 뇌 생검으로부터의 임상 단리물인 HSV -1 2762(Bergstrom et al. 1990 )를 랫트의 감염을 위해 사용하였다. 상기 바이러스는 동물 모델에서 매우 신경발병성(neurovirulent)인 것으로 나타났다(Bergstrom et al. 1990 ). 뇌 생검으로부터의 바이러스의 단리는 헬싱키 선언에서 표명된 원칙에 따라 수행된 HSE에서의 항바이러스 치료에 대한 스웨덴 멀티센터 연구를 위해(Skoldenberg et al. 1984), 예테보리 대학, 린셰핑 대학, 룬드 대학, 우메오 대학 및 카롤린스카 연구에 있는 웁살라 대학교의 윤리 위원회에 의해 1981년에 승인되었다. HSV -1 균주 2762의 바이러스 스톡을 낮은 계대로부터 제조하였다.
동물
수컷 스프라구에-다울리(SD) 랫트, 체중 250 ± 20 g(Harlan Laboratories, Boxmeer, The Netherlands)를 사용하였다(감염된 랫트 n = 49, 대조군 랫트 n = 11). 동물 실험에 대한 지역 윤리 위원회가 시험 프로토콜을 승인하였고, 모든 실험은 동물 실험에 대한 EC 지침 86/609/EEC 가이드라인에 따라 수행하였다. 랫트에게 실험의 시작 전에 일반 적응을 위해 1주일을 허용하였고, 랫트는 펠렛화된 식품 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 동물 구역의 온도 및 공기 환기를 표준 절차에 따라 모니터링하였고; 12시간 광 주기를 사용하였으며, 공기를 시간당 17회 교환하였다.
비강내
주사
랫트에서의 뇌염유발성 감염은, 이전에 기재된 바와 같이, 25 μl의 부피(제공된 총 용량 = 1.1×104 플라크 형성 단위(pfu))로, HSV -1을 우측 콧구멍에 비강내 주입 후 달성되었다(Jennische et al. 2008). 이 주입은 RT Johnson(Johnson 1964)에 의해 기재된 접종 방법으로부터 조정되었다. 랫트가 강한 이소플루란(Forane, Baxter, Deerfield, IL) 마취하에 있는 동안, 상기 감염 용량을 항상 우측 콧구멍에 두었다. 랫트를 감염 후 4일에 희생시켰다. 모든 동물이 6일까지 증상을 보였기 때문에, 윤리적 이유로, 실험의 범위는 6일 p.i.를 초과할 수 없었다.
결과
혈장 중의
프로테아좀
농도
2가지 상이한 면역분석을 사용하여 혈장 중의 프로테아좀 농도를 결정하였다. 20S 서브유닛에 특이적인 항체에 기초한 상업적 키트는 표준으로서 20S 프로테아좀을 사용하여, 정상 혈장에서 0.60 ± 0.07 μg ml의 농도를 야기하였다. 조합된 단일클론 20S 및 19S 항체를 사용하는 본원에 개시된 시험에서, 상응하는 값은 0.41 ± 0.03 μg ml이었다. 이 두 가지 시험에서, 단일클론 항-20Sα6이 포획 항체로서 사용되었다. 항분비 펩타이드 서열을 인식하는, 항-AF1(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb))이 포획을 위해 사용된 경우, 온전한 26S 프로테아좀에 대한 결합이 수득되지 않았다.
가공 곡물의 섭취 후
아가로스
-분리된 AF1 농도의 상승
이전 연구들은 C3c 뿐만 아니라 AF1이 특수 가공 곡물(SPC)의 섭취 후에 아가로스 겔에 결합한다는 것을 보여왔다. 이것은 6명의 지원자로부터의 아가로스-여과된 혈장의 본 연구에서 확인되었다. 도 1a는 대조군 시험자 1-3에서 분명한 AF1 값을 나타내지 않는 반면, 시험자 4-6은 2개월 넘게 SPC를 먹은 후에 유의미하게 더 높은 AF1 역가를 가지고 있었다.
가공 곡물에 의한 AF1-반응성
프로테아좀
/
보체
C3 복합체의 유도
혈액에서 프로테아좀 및 보체 인자 C3 사이에 반응이 있었는지 시험하기 위해, 2가지 새로운 ELISA 분석을 개발하였다: 프로테아좀 성분 AF1에 특이적인 단일클론 항체(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb))를 포획 항체로서 이용한 반면, C3c에 특이적인 다클론 항체를 검출 항체로서 사용하였다. 이것은 혈장에서 직접 프로테아좀 및 C3의 부착을 검출할 수 있게 해주었다. 도 1b에서 관찰된 바와 같이, 시험자 4, 5 및 6으로부터의 3개의 샘플은 대조군 시험자 1, 2 및 3보다 8-11배 더 높은 역가를 가지고 있었다. 그의 높은 민감성으로 인해, 단지 100 μl의 혈액의 작은 샘플이 시험을 수행하는데 충분하다.
아가로스
겔에
의한 AF1-노출된
프로테아좀
/
보체
C3 복합체의 유도
혈장 프로테아좀 및 인자 C3에 대한 아가로스의 영향을 시험하기 위해, 혈장을 37℃에서 4시간 동안 아가로스 겔과 함께 배양하였다. 아가로스에 의한 AF1-노출된 프로테아좀 및 C3의 응집의 상당한 증가가 6명의 시험자 모두에서 관찰되었다(표 1). 웨스턴 블롯에 의해 분석될 때, 수반되는 C3의 분열이 분명하였다(도 2, 5열). α 밴드는 c 밴드로 가수분해되었고, 이는 C3의 C3c로의 전환에 대해 전형적이다. 또한, 대조군 혈장 중 2개를 SPC 시험 혈장과 비교하였을 때(도 2, 1-4열), 펩타이드 패턴의 차이가 또한 관찰되었다. SPC 혈장은 c 영역 및 C3을 초과하는 분자량의 영역 모두에서 추가 밴드를 가지고 있었다.
AF1-노출된
프로테아좀
/C3 복합체의 부분적 정제
프로테아좀-C3 복합체의 부분적 정제를 매트릭스-결합된 프로테아좀 항체에 대한 친화성에 의해 달성하였다. 아가로스 자극되고 암모늄 설페이트 침전된 혈장을 매트릭스에 부착시켰고, 이는 세척 후 웨스턴 블롯에 의해 프로테아좀 뿐만 아니라 C3을 함유하는 것으로 나타났다(도 3). 쿠마시-염색된 겔 밴드를 절개하고, MS/MS에서 트립신-소화된 밴드를 진행시킴으로써 C3의 함량을 확인하였고; C3의 α- 및 β-밴드가 웨스턴 블롯에서의 것과 상응하는 위치에서 주요 밴드로서 나타났다.
보체
H 및 I의 혈액 수준
C3c의 형성은 보체 인자 I 및 H에 의해 달성된다. 그러므로, 6개의 혈장 샘플에서 이들 보체 인자에 대해 시험하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 대조군 대 시험 혈장 중의 이들 성분의 수준은 차이가 없었다.
랫트에서
단순 포진 바이러스 2에 의한
프로테아좀
/
보체
복합체의 유도
프로테아좀/보체 인자 복합체 형성에 대한 단순 포진 바이러스 1(HSV1)의 영향을 랫트 모델에서 시험하였다. 랫트가 신경학적 기능장애의 증상, 즉 반복적인, 정형적 움직임 및 운동 불안정성을 나타내기 시작했을 때 비강내로 4일 투여 후 랫트를 시험하였다. 많은 프로테아좀 단일클론 항체를 포획 항체로서 시험하였고 보체 인자 3 및 4에 대한 항체를 검출 항체로서 시험하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 감염 후 혈액에서 프로테아좀/C3 복합체의 유의미한 상승이 나타났다. 또한 HSV1 감염 후 프로테아좀/C4 복합체의 유의미한 상승이 나타났다(도 7).
그러나, AF1 항체(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb))는 온전한 26S 프로테아좀에서와 마찬가지로 AF1 에피토프가 감춰진 상태를 유지한 HSV1 유도된 복합체와 반응하지 않았다(나타나 있지 않음).
실시예
2
SPC 식이 후 혈장의 단백질체(
proteome
) 변화의 조사
목적: 항분비 인자(AF)는 병리학적 유체 분비 및 염증을 억제한다. 박테리아 장독소 투여 후, 증가된 AF-활성을 갖는 변이된 형태의 유도가 뒤따른다. 이러한 형태의 AF는 "활성 AF"로 지정되며, 이는 또한 특수 가공 곡물, SPC의 섭취 후에 증가한다. 불활성으로부터 활성 형태로의 전이에 영향을 미치는 분자 사건은 모호한 상태로 남아있다. 이 연구의 목적은 SPC 식이 후 혈장의 단백질체 변화를 조사하는 것이었다.
조사 방법 및 절차:
적어도 4주간 SPC의 섭취 전과 후에 인간 지원자로부터 혈장 샘플을 얻었다. 아가로스-정제 후 혈장의 변화를 2D DIGE 및 LC-MS/MS를 이용하여 분석 후 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의해 분석하였다. 이후, 상향조절된 단백질의 시간 경로를 4-, 7-일의 SPC 식이 후 그리고 종료 후 1주에 혈장에서 연구하였다.
결과. 보체 인자 C3c의 수준은 SPC 식이 6주 후에 아가로스-정제된 인간 혈장에서 유의미하게 상향조절되었다(p=0.0039). 상기 증가된 C3c 수준은 AF-활성의 상승된 수준과 연관되었다. 조절자 인자 H 및 C4 역시 SPC-섭취 후 아가로스-정제된 혈장에서 상향조절되었다. AF 유도는, 4일에 AF-활성에 대한 유의미한 증가가 아닌(p=0.31) C3의 유의미한 증가(p=0.0077)에 대한 4일의 SPC-섭취와 비교하여, 7일 후 처음으로 유의성(p=0.0011)에 도달하였다. 상기 상향조절된 C3c는 아가로스-정제 후 혈액에서만 검출되었다.
결론: 보체계에서의 특정한 형태 변화는 자극에 대한 반응으로 혈장에서 증가된 AF-활성의 배후에 있는 기전과 관련된 것으로 보인다.
본 연구는 SPC 자극에 대한 반응으로서 인간 아가로스-정제된 혈장에서 증가된 AF-활성의 배후에 있는 기전에서 보체계의 관여를 제시하는 상향-조절된 발현된 단백질을 확인하기 위해, 단백질체 분석, 2차원 형광차 겔 전기영동 및 나노유속 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)을 포함한다.
재료 및 방법
연구의 첫 번째 부분: 단백질체 분석
혈장-
AF의
제조
AF를 친화성-크로마토그래피를 이용하여 혈장으로부터 정제하였다(10). 요약하면, 혈장을 0.9 cm 
아가로스 컬럼(Sepharose 6B, GE Healthcare Biosciences AB)을 통과시키고 인산 완충 염수(PBS)에서 세척한 후, 아가로스 흡착된 AF를 1 M 메틸-α-D-글루코사이드로 용출시키고 분석 때까지 -20℃에서 보관하였다.
2D 겔 전기영동
3명의 개인으로부터 아가로스-정제된 혈장 샘플을 채취하고, 상기 샘플을 4주의 SPC-섭취 전과 후에 수집하였다. 이후, 등전점 포커싱(IEF) 및 2차원(2D) 전기영동 분석을 수행하였다. 상기 샘플을 2D 샘플액에 현탁하기 전에 2D 클린업 키트(Amersham Biosciences)로 정제하였다. IEF를 제조사의 지침에 따라 IPGphor system(Amersham Biosciences)을 이용하여 수행하였다. 이모빌린 건조 스트립겔(7 cm pH 3-10)을 2% CHAPS(w/v), 0.3% DTT(w/v), 8 M 우레아, 0.5% 담체 양쪽성 용액(v/v), 및 2D 샘플액 중의 100 μl의 샘플 혈장을 함유하는 125 μl의 용액에서 밤새 수화하였다. IEF를 500 V에서 30분, 1000 V에서 30분, 및 5000 V에서 1.5시간 동안 수행하였다. 2D 분리에 앞서, 이모빌린 건조 스트립 겔을 2.5 ml 평형 완충제(1.5 M 트리스-HCL 완충제, pH 8.8 중의 6 M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 1 % DTT, 및 0.001 % 브로모페놀 블루)에서 15분간 침지시켰다. 이모빌린 건조 스트립 겔 스트립을 10% 트리스-글리신 겔(Invitrogen)에서 2D 웰에 두고, 제조사의 지침에 따라 작동시켰다. 상기 겔을 실버퀘스트(SilverQuest)™ 염색 키트(Invitrogen)로 염색하거나 또는 PVDF 막 상으로 블롯팅하였다. 상기 막을 4℃에서 16시간 동안 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단시켰다. 그리고 나서, Dako(Glostrup, Denmark)로부터의 일차 다클론 항-C3c(1/25000으로 희석됨)를 상기 막에 부가하고, 1.5시간 동안 배양하였다. 알칼라인 포스파타아제(AP)-접합된 염소 항-토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.) 후, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스파타테이트 및 4-니트로 블루 테트라졸륨(Roche Diagnostics)을 이용하여 블롯을 현상하였다.
단백질 소화 및
펩타이드
추출
은(silver) 염색된 겔 조각을 절개하고, 제조사의 프로토콜(SilverQuest™ 은 염색 키트, Invitrogen)에 따라 탈색하였다. 은 탈색 후, Shevchenko et al(20)에 의해 기술된 트립신을 이용한 인-겔(in-gel) 단백질 소화를 위한 방법을 약간 변형하여 적용하였다. 요약하면, 상기 겔 조각을 50% CH3CN 중의 25 mM NH4HCO3에서 3회 및 50% CH3OH 중의 25 mM NH4HCO3에서 1회 세척하였다. 상기 겔 조각을 진공 원심분리기에서 건조시키고, 37℃에서 밤새 25 mM NH4HCO3 중의 10 ng/μl의 트립신(Promega, Madison, Wl, USA)과 함께 배양하였다. 75% CH3CN/2% zTFA를 부가하여 펩타이드를 먼저 추출한 후, 50% CH3CN/0.2% TFA에서 더 추출하였다. 모은 추출물을 진공 원심분리기에서 증발시켜 건조시키고, MS 분석 전에 18 μl의 0.2% HCOOH에서 재구성하였다.
나노유속
LC-MS/MS 및 단백질 확인
Agilent 1100 바이너리 펌프(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)에 연결된 HTC-PAL 오토샘플러(CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland)를 이용하여 3-마이크로리터 샘플을 주입하였다. 상기 펩타이드를 프리컬럼(45 x 0.075 mm ID) 상에 포획하고, 역상 컬럼(200 x 0.050 mm ID) 상에서 분리하였다. 두 컬럼을 3 μm Reprosil-Pur d8-AQ 입자로 자체 충전하였다. 분석 컬럼을 통과한 유속을 분열에 의해 약 100 nl/분으로 감소시켰다. 0.2% COOH 중의 10-50% CH3CN의 37분 구배를 펩타이드의 분리를 위해 사용하였고, 또 다른 5분 동안 80% B에서 유지하였다.
나노유속 LC-MS/MS를 7T ICR 자석(LTQ-FT, Thermo Electron, Bremen, Germany)이 장착된 하이브리드 선형 이온 트랩-FT-ICR 질량 분광계 상에서 수행하였다. 상기 분광계를 MS/MS 모드로 자동적으로 전환되는, 데이터-의존적 모드로 작동시켰다. MS-스펙트럼을 FT-ICR에서 획득하였고, 반면 MS/MS-스펙트럼은 LTQ-트랩에서 수득하였다. FT-ICR의 각 스캔에 대해, 6개의 가장 강한 이중 또는 삼중 전하를 띠는 이온을 충돌 유도된 해리에 의해 선형 이온 트랩에서 순차적으로 단편화하였다. MS 원시 데이터 파일을 Proteome Discoverer version 1.4(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 확인하는데 사용하였다. 2014년 7월에 다운로드한(분류 후 20265개의 서열을 함유함) 스위스프로트(Swissprot) 데이터베이스(Swiss Institute of Bioinformatics, Switzerland)를 이용한 MASCOT 서치 엔진, 버전 2.3(Matrix Science LTD., London, United Kingdom)으로 하나의 데이터베이스 서치를 수행하였다. 서치 파라미터를 하기로 설정하였다: 분류(Taxonomy) 인간, MS 정확도 5 ppm, MS/MS 정확도 0.5 Da, 트립신에 의해 하나의 미절단(missed cleavage)이 허용됨, 시스테인의 고정된 프로피온아마이드 수식 및 가변 수식으로서 메티오닌의 산화.
단백질 확인을 위해, 최소 기준을 MASCOT에 의해 제공된 95% 신뢰 수준 이상으로 매칭된 적어도 2개의 트립신분해 펩타이드로 설정하였다.
연구의 두 번째 부분:
보체의
형태
대상 및 연구 설계
3명의 건강한 지원자가 본 연구의 두 번째 부분에 참여하였다. 에테보리 대학의 인간 윤리 위원회가 상기 실험 절차를 승인하였다(Dnr. 037-14). 모든 지원자들은 kg 체중 및 일 당 1g의 용량으로 SPC(AS-Faktor AB, Stockholm, Sweden)를 섭취하였다. SPC 섭취를 3주의 기간 동안 12시간당 2개의 서빙(serving)으로 나누었다. 시작 전 및 4- 및 7-일 후 각 지원자로부터 혈장 샘플을 채혈하였다. SPC 식이의 종료 후 1주일에 마지막 샘플을 채혈하였다. 1000 x g에서 5분간 원심분리 후, 혈장 샘플을 알세버 시트레이트 완충제(Alsevers citrate buffer)(1/2)와 혼합하였다. 이후, 섹션 "혈장-AF의 제조"에서 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
면역원성
AF
활성의 ELISA 테스트
혈장 내의 AF의 함량을 이전에 기술한 바와 같이 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에서 분석하였다. 맥시소르프(Maxisorp) 마이크로타이터 플레이트(Nunc)를 1/2로 희석한 후 1/3으로 연속희석한 친화성 정제된 혈장으로 코팅한 다음, 4℃에서 밤새 배양하였다. 37℃에서 45분 동안 PBS 중의 0.2% BSA로 차단한 후, 플레이트를 PBS+0.05% 트윈 20(PBS-T)으로 세척하였다. AF 단일클론 항체(mAb), 3H8(기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb)),(PBS+0.05% Tween 20+ 0.2% BSA에서 1/100으로 희석됨)를 부가하고, 플레이트를 실온(RT)에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 후, AP-접합된 염소 항-마우스 면역글로불린 IgM(Jackson immunoResearch Europe Ltd.)를 RT에서 1시간 동안 부가하였다. 세척 후, 1 mM MgCl2를 갖는 디에탄올아민 완충제(pH 9.8) 중의 기질 4-니트로페닐 포스페이트(Sigma-Aldrich Sweden AB)를 상기 플레이트에 부가하였고, 결합된 효소를 405 nm에서 흡광도를 판독함으로써 밝혀내었다. 단일클론 배양 배지를 백그라운드로서 사용하였고, 상기 값을 공제하여 순 흡광도(net absorbance)를 생성하였다.
보체
인자의 ELISA 검출
SPC-섭취 후 보체계에 대한 효과를 연구하기 위해, 섹션 "면역원성 AF 활성의 ELISA 테스트"에 기재된 바와 동일한 절차로 ELISA에 의해 친화성 정제된 인간 혈장 샘플에서 7개 보체 인자의 수준을 결정하였다. 검출 항체로서, Dako(Glostrup, Denmark)로부터의 토끼 항-C3c(1/2000 희석됨) 및 항-C4c(1/1000 희석됨)를 이용하였다. 마우스 항-C2 및 항-C5(1/200 희석됨), 염소 항-C1q 및 항-C6(1/200 희석됨) 및 토끼 항-인자 H(1/200 희석됨)를 Santa Cruz Biotechnology(Heidelberg, Germany)로부터 구입하였다. 그리고 나서, 염소 항-토끼 IgG, 염소 항-마우스 IgG 또는 당나귀 항-염소의 AP-접합된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)를 적용하였다(1/10000 희석됨). 전-면역 혈청을 백그라운드로서 사용하였고, 상기 값을 공제하여 순 흡광도를 수득하였다.
SDS-
폴리아크릴아마이드
겔 전기영동(SDS-PAGE) 및
웨스턴
블롯
C3c의 함량을 SPC-섭취 전과 후에 채혈된 혈장 샘플에서 결정하고, C3c를 또한 SDS-PAGE 후 니트로셀룰로오스 막으로의 면역블롯팅에 의해, 아가로스-정제 전과 후에 분석하였다. 이후 배양은 섹션 "2D 겔 전기영동"에서, 상기 기재된 웨스턴 블롯과 동일하였다.
통계학적 분석
데이터는 평균±평균의 표준편차(SEM)로서 제시되어 있다. 그래프패드 프리즘 5.0 소프트웨어(Graphpad Software, Inc., San Diago, CA)를 사용하여 SPC-섭취 전과 후의 샘플을 비교하였다. 통계학적 유의성을 일원 ANOVA 및 t-검정에 의해 결정하였다. p-값 <0.05은 유의한 것으로 간주하였다.
결과
AF
의 유도 후
아가로스
-정제된 혈장 중의 단백질의 2D 분석
혈장 샘플에서 증가된 AF 활성을 야기하였던 4주의 SPC의 섭취 전과 후에 3명의 개인으로부터 얻은 정제된 혈장 샘플에 대해 3-10의 pH 범위에서 2D 분리를 수행하였다. 샘플의 두 그룹 사이의 단백질 발현 수준을 비교함으로써, AF의 유도 후 4.8의 등전점 및 약 43 kDa의 분자량에 대한 영역에서 은 염색된 겔 상에 구별되는 스팟이 분명하게 보였다(도 8).
MS 분석
상기 겔로부터의 선택된 혈장 단백질을 2D DIGE 후 LC-MS/MS에 의해 확인하였고, 그 결과가 표 3에 요약되어 있다(도 9). 케라틴 및 트립신과 같은 분명한 오염 단백질의 제거 후, 2개의 단백질은 정체성 목록(identity list)에 남아있었다. 이들은 보체 C3 전구체(스코어 1581.20) 및 열 충격 단백질 HSP 90-베타(스코어 103.18)를 포함하였다. HSP는 단지 2개의 지정된 펩타이드를 갖는 소 유래였으므로, 인간 보체 C3 전구체가 아가로스-정제된 혈장에서 가장 관련된 정체성이었고, 14개의 독특한 펩타이드는 >95% 신뢰수준을 입증하였다. 상기 펩타이들은 모두 1663 전장 단백질의 aa 1331 내지 aa 1599로부터 시작하는, C3 전구체 서열의 C-말단에서 매칭하는 aa이었다. 선택된 단백질 스팟이 대략 43 kDa 및 4.8의 pI의 영역에 있었기 때문에, 상기 분석된 단백질은 아마도 C3의 C3c α 사슬 단편 2로의 분열 생성물이다.
단백질체의 평가는
웨스턴
블롯
분석 및 ELISA에 의해
C3c를
확인한다
은 염색된 2D 겔로부터 확인된 스팟을 확정하기 위해, C3c의 발현을 C3c 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, 상기 항체는 SPC 식이 후 채혈된 아가로스-정제된 혈장에 반응하였고, 4.8의 등전점 및 43 kDa의 분자량에서 점(dot)은 예상된 C3c α 사슬이 C3으로부터 절단되었음을 나타낸다. 상기 항체는 도말(smear) 염색과 함께 6.8의 등전점에서 C3의 75 kDa β 밴드를 검출하였고, 이는 상기 단백질의 화학적 수식을 나타낸다. 인간 아가로스-정제된 혈장 샘플에서 C3c의 상향조절을 또한 ELISA 결정에 의해 확인하였다. 도 11에서 보는 바와 같이, 6주의 SPC-섭취 후 AF-유도된 샘플에서 C3c의 유의미한 증가가 검출되었다(p=0.0039).
SPC의 섭취 후 혈장 중의
AF
-활성
연구의 두 번째 부분에서, 본 발명자들은 SPC-식이 후 결과를 계속 분석하였다. SPC 자극의 효과를 평가하기 위해, 아가로스-정제된 혈장 중의 AF 활성의 수준을 AF mAb 3H8(세포 배양물 2341로부터 유래된 3H8(=3H8B3)인 AF 단일클론 항체(mAb) = DSM ACC3271)을 이용하여 결정하였다. 도 12A에 나타난 바와 같이, 대조군 혈장과 비교하여, SPC 섭취 후 흡광도는 상기 분석에서 연속적으로 증가하였다. 활성 AF의 혈장 수준의 유의미한 증가가 7일의 SPC 후에 유도되었다(p=0.0011). AF 활성은 식이의 종료 후 1주일에도 유의미하게 계속 증가하였다(p=0.0023)
C3c
및 다른
보체
인자의 ELISA 결정
C3c 외에 부가적인 보체 인자를 조사하기 위해, 아가로스-정제된 혈장에 대해 ELISA를 수행하였다. C3c와 함께, 7개의 보체 인자를 시험하여 SPC의 섭취 후 보체계에 대한 영향을 결정하였다. 3개의 인자, C3c, C4c 및 인자 H는 AF 유도 후 아가로스-정제된 혈장에서 증가된 수준을 나타내었다(도 12B, C, D). AF 유도가 7일의 SPC 식이 후 유의성에 도달한 반면(도 12A), 보체 인자의 혈장 수준의 유의미한 증가는 이미 4일 후에 유도되었다(AF의 경우 p=0.31과 비교하여, C3c의 경우 p=0.0077, C4c의 경우 p=0.011 및 인자 H의 경우 p=0.0042). C3c의 평균값은 SPC 종료 후 1주에도 계속 유의미하게 증가하였다(p=0.0475).
어느 샘플에서 C1q, C2, C5 또는 C6를 시험하는 ELISA에서 차이가 관찰되지 않았다.
직접 혈장 및
아가로스
-정제된 혈장에 대한
웨스턴
블롯
분석
아가로스-정제 전과 후에, 연구로부터의 혈장 샘플을 보체 인자 C3c에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다. 상기 샘플은 또한 결정된 AF-활성 증가를 갖는 SPC-섭취 전과 후에 얻은 혈장을 포함하였다. 도 13, 레인 1 및 2에서 보는 바와 같이, 분리된 직접 혈장 샘플에 대한 항-C3c 반응에서 시각적인 차이가 없었다. 알려진 AF 유도에도 불구하고, 항체는 동일한 방식으로 보체 C3 전구체로부터 유래된 몇 가지 단백질-밴드를 검출하였다. 그에 반해, SPC 식이 후 수득된 샘플에서만, C3c에 대한 항체가 아가로스-정제된 혈장 상에서 반응하여 2개의 사슬, C3의 C3c α 및 β 밴드를 검출하였다(도 13, 레인 4).
논의
내인성 AF의 활성화는 장독소의 장내 노출에 대해 자연적 반응으로서 일어나거나 또는 어떤 식품 성분, 즉 SPC의 섭취에 의해 모사될 수 있다. AF의 활성화 단계의 배후에 있는 분자 사건을 찾아서, 단백질체 접근법; 상향조절된 단백질 발현을 LC-MS/MS에 의해 이후에 확인하는 2D DIGE를 이용하여 SPC-섭취 후 아가로스-정제된 혈장을 조사하였다. SPC 식이의 섭취 전과 후에, 아가로스-정제된 혈장 단백질의 분석은 보체 인자 C3c α 사슬 단편 2로서 확인된 AF 유도된 샘플에서 스팟을 밝혀내었다. 상기 제시된 SPC 후 증가된 C3c의 결과는 ELISA 및 웨스턴 블롯에서 특이적 항체-반응을 나타냄으로써 혈장 샘플에서 확인되었다. 본 발명자들은 유도된 AF 수준이 SPC의 투여량 뿐만 아니라 섭취 시기와 관련되다는 것을 앞서 보인 바 있다. 이 연구에서, 7개의 보체계 단백질에 대한 SPC의 영향을 조사하였다. 보체 단백질 C3c, 인자 H 및 C4c의 아가로스에 대한 유의미한 증가된 결합이 4일의 SPC-섭취 후에 이미 관찰되었다. AF의 활성화의 경향은 4일 후에 결정될 수 있었지만, 유의미한 증가된 수준은 SPC 식이 후 7일에 검출되었다. 이전 연구들은 AF가 식이 후 2주에 증가한다는 것을 입증해왔다. 상기 차이는 SPC-섭취의 시작 후 며칠에 얻은 샘플이 부족한 상이한 연구 설계 때문일지 모른다.
상기 결과는 SPC의 섭취가 보체계의 인자 C3 및 C4를 불활성화시킨다는 것을 보여준다. 이 시스템 내의 몇 가지 인자는 선천 및 적응 면역의 매우 중요한 성분이며, 결과적으로 AF 활성화 동안 현저한 항염증 반응을 설명할 수 있다. 보체계는 또한 대체 기능과 연관되는 것으로 제안되어 왔으며, 이는 그것이 그의 염증 역할에서 벗어난 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 가리킨다. 예를 들어 정상적인 임신은 증가된 혈장 보체 성분과 연관된다.
C3은 연속적인 단백질 분해에 의해 결국 C3의 생리학적 하향조절 생성물인 C3c로의 불활성화를 형성하는 활성화된 단편을 형성하는 거대한 형태적 변화를 겪음으로써, 그의 활성화를 통해 보체계에서 중요한 역할을 한다(23).
C3의 C3c로의 분열은 이전에 단백질분해 보체 인자 I를 보조인자로서 인자 H와 관련시키는 것으로 나타났다. 이 연구에서 입증된 인자 H의 초기 증가는 보체계의 하향조절로 볼 수 있다. 이 반응은 궁극적으로 억제되지 않은 보체 활성화로부터 비롯되는 손상으로부터 숙주 세포를 보호할 것이다. 부수적으로, C4는 인자 I 및 H에 의해 C4c로 하향조절된다.
이 연구에서, AF와 함께 보체 C3c는 아가로스 상에서 처음으로 친화성 정제되고 α-메틸글루코사이드로 용출된 혈장을 분석할 때 확인되었다. 본 발명자들은 SPC-섭취 후 직접 혈장에서 웨스턴 블롯에 의해 어떤 C3c 증가를 검출할 수 없었다.
결론
본 연구는 AF의 활성화의 배후에 있는 기전을 설명하는 새로운 원리를 제공한다. SPC 식이 후 2D 분리된 혈장은 활성화된 AF의 증가에 선행하는, 보체 C3c의 조기 상향조절을 입증하였다. 그러므로, 결론적으로, 보체계에서 특정 형태 변화는 AF 활성화 동안의 첫 번째 단계일 수 있다.
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<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Asn Glu Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys
1 5 10
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<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val Gly Gln Gln Arg
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<210> 4
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Glu Asp Gln Thr Glu Tyr Leu Glu Glu Arg
1 5 10
Claims (30)
- 체액에 대해
a. 프로테아좀 서브유닛에 특이적인 항체인 제1 항체, 및
b. 보체 인자 C3 또는 보체 인자 C4에 특이적인 항체인 제2 항체
를 포함하는 면역학적 분석을 실시하는 것을 포함하는, 체액 중의 프로테아좀-보체 복합체 형성의 검출 방법. - 제1항에 있어서, 제1 항체는 프로테아좀 단백질 AF1, LMP2, 20Salfa6, 20Salfa1,2,3,4 및 Rpt5에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 항체는 보체 인자 C3 또는 보체 인자 C4에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 검출 방법.
- 제2항에 있어서, 보체 인자 C3은 C3, C3c, C3b 또는 iC3b이고, 보체 인자 C4는 C4, C4b, iC4b 또는 C4c인 것인 검출 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 체액에 대해
a. 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체 및
b. 보체 인자 C3c에 특이적인 항체
를 포함하는 면역학적 분석을 실시하는 것을 포함하는 것인 검출 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역학적 분석은 ELISA 테스트로서 수행되는 것인 검출 방법.
- 제3항에 있어서, 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체는 기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 단일클론 3H8 항체인 것인 검출 방법.
- 제3항 또는 제6항에 있어서, 보체 인자 C3c에 특이적인 항체는 보체 인자 C3c에 특이적인 다클론 항체인 것인 검출 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 젖, 누액, 눈물, 정액, 정장액, 질액, 타액, 객담, 땀, 복수, 양수, 활액, 위액, 뇌척수액, 척수액, 안액, 고름 및/또는 점액으로부터 선택되는 것인 검출 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 체액은 인간, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 및 낙타로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물로부터 채취되는 것인 검출 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 체액은 조류로부터 채취되는 것인 검출 방법.
- 제1 항체 및 제2 항체를 이용하여 체액 중의 프로테아좀-보체 복합체 형성의 존재 또는 부재, 및/또는 농도를 결정하기 위한 면역학적 분석 방법으로서, 제1 항체는 담체 상에 고정되고 제2 항체는 표지 물질로 수식되며, 제1 항체 및 제2 항체는
a. 프로테아좀 서브유닛에 특이적인 항체 및
b. 보체 인자 C3 또는 보체 인자 C4에 특이적인 항체
로부터 선택되는 것인 면역학적 분석 방법. - 제11항에 있어서, 제1 항체는 프로테아좀 단백질 AF1, LMP2, 20Salfa6, 20Salfa1,2,3,4 및 Rpt5에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 항체는 보체 인자 C3 또는 보체 인자 C4에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역학적 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 보체 인자 C3은 C3, C3c, C3b 또는 iC3b이고, 보체 인자 C4는 C4, C4b, iC4b 또는 C4c인 것인 면역학적 분석 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항체 및 제2 항체는
a. 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체 및
b. 보체 인자 C3c에 특이적인 항체
로부터 선택되는 것인 면역학적 분석 방법. - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ELISA 테스트인 면역학적 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 프로테아좀 단백질 AF1에 특이적인 항체는 기탁 번호 DSM ACC3271 하에 DSMZ에 기탁된, 하이브리도마 세포 배양물 2341로부터 유래된 단일클론 3H8 항체인 면역학적 분석 방법.
- 제13항에 있어서, 보체 인자 C3c에 특이적인 항체는 보체 인자 C3c에 특이적인 다클론 항체인 면역학적 분석 방법.
- 제11항 내지 제13항, 제16항 및 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혈장 중의 순환하는 26S 프로테아좀의 수준을 검출하고/결정하고/모니터링하기 위한 것인 면역학적 분석 방법.
- 제11항 내지 제13항, 제16항 및 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 체액 중의 온전한 프로테아좀의 수준을 검출하고/결정하고/모니터링하기 위한 것인 면역학적 분석 방법.
- 제11항 내지 제13항, 제16항 및 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 포유동물의 몸에서의 염증의 수준을 검출하고/결정하고/모니터링하기 위한 것인 면역학적 분석 방법.
- 제11항 내지 제13항, 제16항 및 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 포유동물의 몸에서의 보체계 하향조절을 검출하기 위한 것인 면역학적 분석 방법.
- 제11항 내지 제13항, 제16항 및 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 특수 가공 곡물(SPC) 및/또는 항분비 인자(NASP)를 갖는 난황으로 제공되는 천연 항분비 인자(NASP)를 포함하는 의료용 식품을 섭취하는 환자의 순응도(compliance)를 확인하기 위한 것인 면역학적 분석 방법.
- 제11항 내지 제13항, 제16항 및 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 의료용으로 사용하기 위한 것인 면역학적 분석 방법.
- 삭제
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