KR101904795B1 - 기분 장애 정신 질환의 진단 또는 예후 분석을 위한 miRNA-206을 검출하는 방법, 진단을 위한 정보 제공 방법 및 miRNA-206을 표적으로 하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기분 장애 정신 질환의 진단 또는 예후 분석을 위한 miRNA-206을 검출하는 방법, 진단을 위한 정보 제공 방법 및 miRNA-206을 표적으로 하는 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 상기 기분 장애 정신 질환의 진단 또는 예후 분석 마커를 검출할 수 있고, 환자의 조직 시료로부터 miR-206의 발현 수준을 측정함으로써 기분 장애 정신 질환의 보다 정확한 진단이 가능하고, 상기 miR-206의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 진단용 조성물로 제공할 수 있으며, 나아가 microRNA-206과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 이용함으로써, 기분 장애 정신 질환을 치료 및 예방할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다.

Description

기분 장애 정신 질환의 진단 또는 예후 분석을 위한 miRNA-206을 검출하는 방법, 진단을 위한 정보 제공 방법 및 miRNA-206을 표적으로 하는 조성물 {The detection method of miRNA-206, the method of providing information for diagnosis and prognostic analysis of mood disorders, the composition targeting miRNA-206}

본 발명은 특정 질환의 진단 또는 예후 분석을 위한 방법, 특정 miRNA를 표적으로 하는 그 질환의 진단 및 약학용 조성물에 관한 것이다.

기분장애 질환들 중 우울증은 일평생 유병률이 남자 7~12%, 여자 20~35%로 가장 높은 유병률의 정신질환이다. 우울증은 슬픔, 무기력, 불행, 그리고 다른 뇌 기능장애를 수반하는 등 다양한 증상으로 특징되며, 20~50%가 2년 이내에, 50~70%가 5년 이내에 재발할 수 있는 질환이다. 또한, 우울증은 장애로 인한 질병부담(Years of Life Lived with Disability, YLDs)이 모든 질환들 중 1위이며, WHO는 우울증을 향후 수십년간 전 세계 건강문제의 가장 중요한 질환으로 추정하고 있다.

우울증 환자의 자살 위험도는 10배 이상 상승 되어있고, 자살의 80%가 우울증 관련, 혹은 33%는 직접적인 우울증 증상 때문이라고 알려져있다. 우울증의 진단은 현상학적 증상에 근거하고, 미국 정신의학회에서 제시한 정신질환진단통계 편람(DSM-IV-TR) 또는 WHO의 국제질병분류(ICD-10)의 기준을 따르고 있으며 현재까지 실용화된 우울증의 생물학적 진단 도구는 없다.

지난 수십년간 다양한 치료법의 개발에도 불구하고, 우울증 환자 중 50% 이상이 치료반응이 불량하고, 35% 이상이 치료 저항성을 나타내었다. 유전체 변이를 이용한 동물 연구에서 항우울제 치료와 brain-derived neurotrophic factor(BDNF) 등 신경생성 관련 생체지표들의 변화간 상관성은 지속적으로 보고되고 있으나, 유전연구는 대부분 후보유전자의 유의성 도출에 실패하고 있다. 따라서 유전체적 접근방법으로 보다 근본적 치료를 위한 치료제의 개발 및 진단 도구의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위한 것으로, 기분 장애 정신 질환의 진단 또는 예후 분석을 위하여 특정 miRNA를 검출하는 방법, 기분 장애 정신 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법, 기분 장애 정신 질환의 진단용 조성물 및 약학 조성물의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기분 장애 정신 질환의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miR-206의 발현을 검출하는 방법을 이용하는 기분 장애 정신 질환의 진단 또는 예후 분석 마커의 검출 방법인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 환자의 조직 시료로부터 miR-206의 발현 수준을 측정하는 단계 및 상기 miR-206의 발현 수준을 기준 수준과 비교하는 단계를 포함하는 기분 장애 정신 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 miR-206의 발현 수준을 측정하는 제제로써, 상기 miR-206과 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 포함하는 기분 장애 정신 질환 진단용 조성물인 것을 특징으로 한다.

그리고, 본 발명은 miR-206의 활성을 억제할 수 있는 기분 장애 정신 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 기분 장애 정신 질환의 진단 방법은 miR-206의 상대적인 발현 수준을 비교함으로써, 보다 정확하게 진단할 수 있고, 나아가 miR-206을 타겟으로 하는 물질을 마커로 사용함으로써, 기분 장애 정신 질환의 예후 분석을 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 기분 장애 정신 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 통하여 보다 효율적으로 할 수 있다.

그리고, 본 발명에 따른 miR-206을 표적으로 하는 기분 장애 정신 질환의 진단용 조성물을 통하여 기분 장애 정신 질환의 오진율을 감소시킬 수 있으며, miR-206을 표적으로 하는 약학 조성물을 통하여 기분 장애 정신 질환의 근본적인 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공함으로써, 치료 효과를 높이고 치료의 부작용을 최소화 할 수 있다.

도 1은 우울증 모델과 정상 쥐의 뇌에서 miRNA-206의 발현을 정량적 실시간 PCR (Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)로 비교한 막대 그래프이다.
도 2는 elevated plus maze 실험을 통하여 불안감을 측정하는 행동 실험의 결과를 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 elevated plus maze 실험에서 쥐들이 각 arm으로 들어가는 활동성을 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 절망감을 측정하는 Tail suspension test(TST)를 수행한 결과를 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 장기간 전기자극으로 (chronic foot-shock stress, CFS) 유도된 우울증모델에서의 TST 실험 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시를 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고, 기술된 실시 예에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 하기에 설명되는 본 발명의 실시 예는 당업자에게 본 발명의 사상을 충분하게 전달하기 위한 것임에 유의하여야 한다.

본 발명의 miR-206의 서열은 인간 유래의 서열이며, 성숙 서열은 5'-UGGAAUGUAA GGAAGUGUGU GG-3'이다. 본 발명에 따른 기분 장애 정신 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물은 상기 miR-206을 표적으로 결합할 수 있으며, 상기 약학 조성물의 유효 성분으로 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-206의 성숙 서열 중에서 1-8번째나 2-8번째, 또는 2-7번째 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 서열을 가질 수 있다. 본 발명에서 유효 성분으로 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 가장 바람직한 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열(즉, miR-206의 성숙 서열) 전체와 상보적인 서열을 가지나, 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 miR-206의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스(http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다.

일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80nt(nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. miRNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오 복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적으로 결합하여 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단 과정을 거쳐 성숙 miRNA가 최종적으로 형성된다.

본원에 사용된 용어 "miRNA" 또는 "마이크로 RNA" 또는 "마이크로 알엔에이"는 표적 RNA의 분해(degradation)를 촉진하거나 또는 그들의 번역을 억제함으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다.

본원에서 용어 "miRNA의 활성을 억제할 수 물질"은 이의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 상기 임의의 물질은 예를 들면 antagomir, 안티센스 분자, 소 헤어핀 RNA 분자(shRNA), 소 방해 RNA 분자(siRNA), 씨드 표적 LNA(Locked Nucleic Acid) 올리고뉴클레오타이드, 데코이 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, 리보자임, 또는 DNA:RNA 하이브리드를 인지하는 항체 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 일 구현예에서, "miRNA의 활성을 억제할 수 있는 물질"은 본원에 따른 miRNA의 전구 및/또는 성숙 서열의 전부 또는 일부, 특히 씨드 서열에 상보적으로 결합하여, 이의 활성을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 활성의 억제는 본원에 따른 miRNA의 전사 및/또는 이의 표적 mRNA와의 결합을 억제하는 것이다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드를 연결하는 백본(골격)이 하나 이상의 변형을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 상기 변형은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 적어도 하나 이상의 2'-O-메틸화 된 당을 가지는 뉴클레오타이드, 또는 하나 이상의 포스포티오에이트를 백본에 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 씨드 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄하는 것이다. 따라서 본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 "상보적 핵산-기반 억제제"로 나타낼 수 있다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에는 다양한 분자가 포함될 수 있으며, 예를 들면 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), antagomir, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, PNA(Peptide Nucleic Acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(Locked Nucleic Acid) 올리고뉴클레오타이드 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는 상기 리보핵산(RNA)을 사용할 수 있으며, 상기 리보핵산(RNA)은 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 라이보자임(Ribozyme)을 포함할 수 있다.

상기 LNA(Locked Nucleic Acid)는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2' 탄소와 4' 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다.

상기 PNA(Peptide Nucleic Acids)는 폴리뉴클레오타이드에서 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2'-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2'-O-C_1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드이다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, antagomir 및 억제 RNA 분자를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "antagomir"는 단일 가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 miRNA의 차단(silence)에 사용된다. 상기 antagomir는 Arganoute 2(Ago 2) 절단 부위에서 상보적이지 않은 서열을 포함하거나, 예를 들면 2' 메톡시기, 3' 콜레스테롤기, 포스포로씨오에이트로 염기가 변형되어 Ago2의 절단을 억제할 수 있다. 표적서열에 상보적 서열을 가진다.

본원에 따른 상기 antagomir는 본원에 따른 miRNA에 적어도 부분적으로 또는 완전하게 상보적인 서열을 가질 수 있으며, 일 구현예에서 antagomir는 하나 이상의 변형(예를 들어, 2'-O-메틸-당 변형, 또는 3' 콜레스테롤 변형)을 포함한다. 다른 구현예에서 antagomir는 하나 이상의 포스포로씨오에이트 결합을 포함할 수 있으며, 또한, 부분적으로 포스포로티오에이트 백본을 가질 수도 있다.

본원에 따른 miRNA의 활성을 억제하기 위하여 적합한 antagomir의 길이는 7~50nt, 특히 10~40nt, 더욱 특히 15~30nt, 더더욱 특히 15~25nt, 특히 16~19nt이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 miR-206 씨드 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 가지는 miRNA 조절 물질을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 본원에 따른 miRNA의 표적에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적이지만 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 것 및 완벽하게 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 실질적으로 상보적(substantially complementary)이란, 완벽하게 상보적(perfectly complementary)인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본원에 따른 효과, 즉 miRNA의 활성을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 가지는 것을 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함할 수 있으며, 예를 들면 펩타이드 핵산(PNA) 또는 그 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, miRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본원의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 분자는 본원에 따른 miRNA 씨드 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 씨드 서열은 miRNA의 표적분자의 인지에 매우 중요한 다양한 종에서 보존된 서열이다. miRNA는 씨드 서열을 통해 표적과 결합하기 때문에, 씨드 서열과 표적과의 상호작용을 억제하는 경우, 표적 mRNA의 번역 등을 효과적으로 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 기분 장애 정신 질환의 치료 또는 예방을 위해 제공되며, 궁극적으로 상기 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 상기 약학 조성물을 유효한 양만큼 투여하여 상기 질환에 대한 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료", "완화" 또는 "개선"이란 상기 약학 조성물의 투여로 관련 정신 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

또한, 본원에 사용된 용어 "예방"은 관련 정신 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상을 나타낼 때 또는 초기 증상을 나타내기 전에 투여할 경우, 관련 정신 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

한편, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 상기 miRNA의 활성을 억제할 수 있는 물질 이외에 기분 장애 정신 질환의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효 성분을 1종 이상 더 포함하거나 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 더 포함할 수 있다. 또한, 화학 치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 선택적으로 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 상기 언급한 유효 성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 및/또는 아주번트(adjuvant)를 1종 이상 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용하는 것을 포함할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화 할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 용액, 에멀젼 및 리포좀 제형 등과 같은 다양한 제형 및 투약 형태로 제조될 수 있고, 활성 성분을 약학적으로 허용 가능한 액체 및/또는 미세분말의 고형 담체 또는 부형제와 혼합하여, 정제, 캡슐, 젤, 시럽 또는 좌제로 제조될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질을 이용한 현탁액으로 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 높이는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여 방법을 적용할 수 있다. 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 비강 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 신속한 치료 효과를 얻기 위해서는 비강 내 주입에 의한 투여가 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 다양한 경로로 전달될 수 있으며, 예를 들어 인퓨전 또는 볼러스 주사, 표피 또는 점막(경구 점막, 항문 점막, 장 점막 등)을 통해 투여될 수 있고, 전신 또는 국소 투여될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 적절한 경로를 통해 중추신경 또는 말초신경으로 도입하는 것이 바람직하다. 적절한 경로는 뇌실 내(intraventricular) 또는 수막 내(intrathecal) 투여를 포함할 수 있다. 이러한 투여는 저장고에 연결된 카테터를 이용하여 달성될 수 있다. 또한, 에어로졸로 제형화되어 흡입기 또는 분무기를 통해 폐를 통한 투여가 이루어질 수 있으며, 정맥 내 투여, 피하 주사, 뇌척수강 내 주사, 흡입 투여, 또는 경구 투여용 제형을 제외하는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서 약학 조성물은 비강 내로 투여되는 것이 바람직하다. 비강 내로 상기 약학 조성물을 투여할 시, 후각 신경 경로를 따라 뇌로 전달됨으로써 상기 약학 조성물의 효과를 높일 수 있다. 상기 약학 조성물의 비강 내 투여를 위해 허용 가능한 담체를 포함할 수 있는데, 상기 담체는 포유 동물, 바람직하게는 인간의 비강 상피의 어느 부분에 투여하기에 적당한 1종 이상의 적절한 고상, 필러 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함할 수 있다. 대표적으로, 상기 담체는 액체, 용액, 현탁액, 겔, 연고, 로션, 또는 이들의 조합일 수 있고, 바람직하게는 수성 담체일 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 여러 가지 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 이러한 형태로는 점비액(nasal drop), 비강용 스프레이, 비강용 겔, 비강용 연고, 및 비강용 분말이 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 담체에는 전달 강화제를 포함할 수 있는데, 비강 내 전달 강화제에는, 응집 저해제, 투여량 변경제, pH 제어제, 분해 효소 저해제, 점액질 용해 또는 점액 제거제, 섬모 안정 시약들, 막 투과 촉진제(예를 들어 계면 활성제, 담즙산염, 인지질 또는 지방산 첨가제, 혼합 미셀(micelle), 리포솜, 또는 담체, 알콜, 에나민(enamine), 산화질소 공여체 혼합물, 긴 사슬(long-chain) 양친매성 분자, 소형 소수성 침투 강화제, 나트륨 또는 살리실산 유도체, 아세토아세트산의 글리세롤 에스테르, 시클로덱스트린 또는 베타-시클로덱스트린 유도체, 중간 사슬 지방산, 킬레이트 시약, 아미노산 또는 그의 염, N-아세틸아미노산 또는 그의 염, 선택된 막 성분에 대한 분해 효소, 지방산 합성 저해제, 콜레스테롤 합성 저해제 또는 산화질소 자극 물질, 키토산, 그리고 키토산 유도체와 같은 상피 접합 생리학의 조절 약제, 혈관 확장제, 선택적 운반 촉진제 그리고 비강 내 점막 전달을 강화하기 위해, 상기 약학 조성물이 효과적으로 조합, 결합, 보관 또는 캡슐화되거나 활성 약제를 안정시킬 수 있게 해주는, 안정적 운송체, 담체, 지지 물질 또는 착물 생성종(complex-forming species) 등이 포함될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중으로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 상기 제시된 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대의 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 가장 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

한편, 상기 약학 조성물의 투여량 범위는 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 매우 다양하며, 적정 투여량은 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 폴리뉴클레오타이드의 구체적 효능 정도에 따라서도 달라질 수 있다. 일반적으로 in-vivo 동물 모델 및 in-vitro 조건에서 효과적인 것으로 측정된 EC₅₀(half maximal effective concentration)을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들어 체중 1kg당 0.01㎍ 내지 1g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 1회 내지 수 회 나누어 투여될 수 있다. 또한, 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있으며, 반복 투여 횟수는 약물이 체내에 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정될 수 있다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 질환의 재발 방지를 위하여 상기 약학 조성물이 지속적으로 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물에 더 포함될 수 있는 기분 장애 정신 질환과 관련된 유효 성분으로 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 그 자체로 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 상기 약학 조성물에 더 포함될 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 염이란 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 활성은 유지하면서 독성은 최소화시킨 것을 뜻한다. 이러한 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 아연, 칼슘, 비스부스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 코퍼, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소듐, 포타슘 등과 같은 금속 양이온과 형성된 염기 부가 염, 유기 아미노산과 형성된 염, 암모니아, N,N-디벤질에틸렌디아민(dibenzylethylene-diamine), D-클루코사민(D-glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium) 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine) 유래의 양이온과 형성된 염을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

한편, 본 발명에 따른 기분 장애 정신 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법은 시료에서 miR-206의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, miR-206의 양을 측정함으로써 그 발현 수준의 증가 유무를 알 수 있다. 본 발명에 있어서, 발현 수준의 측정은 miRNA-206 발현량의 측정을 포함한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 진단 방법은 miR-206의 발현 수준의 증가 유무와 함께 검사 대상자의 임상 정보를 더 포함하여, 기분 장애 정신 질환의 발병 유무를 판단할 수 있다. 이러한 검사 대상자의 임상 정보는 상기 검사 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 혈액 검사 결과, 뇌 MRI 결과, 뇌 CT 결과, 또는 뇌 척수액 검사 결과 중 적어도 하나 이상을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 기분 장애 정신 질환은 우울증, 기분 부전 장애, 우울 장애, 단기 우울 장애, 월경 전기 우울 장애 및 양극성 장애를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

그리고, 본 발명에 있어서, 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 발명의 실시예를 위해 사용된 실험 단계는 하기와 같이 설명될 수 있다.

1. 우울증 동물 모델 제작

동물은 B6 생쥐의 한 종인 C57BL/6을 사용하였고, 정상군, 실험군들의 나이와 성별들을 모두 매치시켰다. 우울증 모델은 다음과 같이 2가지 방법에 의해 제작되었다.

1)코르티코스테론(Corticosterone, CORT)주입에 의한 우울증 모델

35㎍/mL의 CORT(equivalent to 5mg/kg/day, Sigma;St. Louis, MO, USA)을 0.45% β-cyclodextrin(β-CD;Sigma)이 포함된 물에 처리하여 정상 마우스에게 42일 동안 먹였으며, CORT가 처리된 물은 3일마다 교체해주었다. 또한, 빛이 차단되는 물병을 사용하였다.

2)장기적 전기 자극에 의한 스트레스 유도(chronic foot-shock stress, CFS) 우울증 모델

정상 마우스에게 0.3mA의 foot-shocks을 2초 동안 주는 것을 4주 동안 1시간씩 실시하였다. foot-shocks은 예측할 수 없도록 2초에서 15초 간격으로 무작위로 주었다.

2. miRNA의 실시간 정량 PCR(qRT-PCR)

miR-206의 발현량을 qRT-PCR(역전사 정량 PCR)을 이용하여 조사하였다. 대조군(정상 마우스)과 실험군(CORT 유도 우울증 모델 및 CFS 유도 우울증 모델)의 뇌에서 miRNA를 Ambion mirVana isolation kit를 사용하여 분리하였으며, 실시간 PCR은 TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA)에 포함된 프로브 및 프라이머를 제조자의 방법대로 사용하여 수행하였다. 그 후, ABI PRISM 7000 sequence detection system(Ambion-Applied Biosystems, USA)을 이용하여 분석하였다. 조건은 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분간 열처리하고, 95℃에서 15초 및 60℃에서 60초간 수행하는 것으로 구성된 열처리를 40회(cycle) 반복 수행하였으며, 모든 반응은 삼중으로 실시되었다. 상대적 발현 정도는 비교 역치 사이클(comparative threshold cycle, Ct) 2^{- ΔCt} 식을 이용하여 계산하였고, miRNA의 농도는 내인성 snoRNA detection kit(Ambion-Applied Biosystems)를 이용하여 측정된 snoRNA-202 농도에 노말라이즈 하였다.

바람직하게는 miR-206의 정량 검출을 위하여 상기 miR-206과 상보적으로 결합할 수 있는 1종 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이들의 일부 서열에 대응하는 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머 및 dNTP를 포함할 수 있다.

3. miR-206의 억제

miRNA-206의 억제는 miRNA-206에 대한 서열-특이적인 antagomir(AM-206, 2'-O-메틸화 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 서열:5'-cca cac acu ucc uua cau ucc a-3', ㈜바이오니어, 대한민국)을 사용하여 이루어졌다. 마우스를 마취시킨 후 AM206(24㎕의 0.1% v/v 디에틸피로카르보네이트가 처리된 증류수 5nmol)을 2분마다 각 콧구멍을 바꿔가며, 4㎕씩 파이펫을 이용하여 비강 내로 투여하였다(총 6 분획). 대조군의 마우스에게는 디에틸피로카르보네이트가 처리된 증류수(비히클)를 동등한 부피만큼 투여하였다. AM-206은 3일 동안 하루에 한 번씩 투여하였다.

4. 행동 실험

AM-206 및 비히클을 투여하고 일주일 후, 우울증 동물 모델들에게 행동 실험을 실시하였다. 행동 실험은 불안감 측정을 위한 EPM(Elevated plus maze) 실험과 절망감을 측정하기 위한 TST(Tail suspension test) 실험을 실시하였으며, 모든 행동 실험은 비디오로 기록하였다.

1)Elevated plus maze(EPM, 십자형 높은 미로)

EPM은 아크릴로 제작되었으며, 바닥에서 40cm 위에 십자형(+)의 미로로 구성 된다. 미로의 통로 4개 중 마주보는 2개의 통로는 개방되어있고(open arm), 또 다른 마주보는 2개의 통로는 높이 20cm의 벽으로 둘러싸여 있다(closed arm). 중앙 플랫폼은 가로, 세로가 각각 8cm이며, 실험 시작시 마우스를 중앙 플랫폼에 두고 5분 동안 미로를 자유롭게 탐색하도록 하였다. 그 후, 마우스가 개방된 통로(open arm)와 폐쇄된 통로(closed arm)에 머문 시간과 각 통로(arm)의 출입 횟수를 분석하였다.

2)Tail suspension test(TST, 꼬리 매달기 실험)

높이 50㎝에 위치한 수평 막대의 중간에 마우스의 꼬리 끝 1㎝ 정도를 테이프로 붙인 후, 6분 동안 움직이지 않는 시간(immobility duration)을 측정하였다.

5. 통계 분석

대조군(정상 마우스)과 실험군(CORT 우울증 유도 모델군 및 CFS 우울증 유도 모델군)의 결과 비교는 스튜던트의 T 검정을, 그리고 대조군(정상 마우스), 실험군 1(CORT 우울증 유도 모델군) 및 실험군 2(CFS 우울증 유도 모델군)간의 결과 비교는 일원배치분산분석(one-way ANOVA) 방법을 사용하여 수행하였다. 모든 결과는 평균±표준 에러로 나타내었고, 통계 분석을 위하여 SPSS 21.0(SPSS Inc, Chicago, Ill)을 사용하였고, P-수치는 0.05보다 작은 값을 유의한 것으로 하였다.

<실시예 1> 우울증 유도 마우스 모델의 뇌 조직에서 miR-206의 상향 발현

상기의 실험 방법을 실질적으로 동일하게 수행하여 실험군(CORT 우울증 유도 모델(n=3) 및 CFS 우울증 유도 마우스 모델(n=5))와 대조군(정상 마우스)(n=5)의 뇌 조직에서 miRNA-206의 발현량을 qRT-PCR(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction)로 비교 분석한 결과를 도 1에 막대 그래프로 나타내었다. 도 1의 막대 그래프의 가로축은 대조군과 실험군을 뜻하며, 세로축은 snoRNA-202에 miR-206의 발현량을 정상 평준화시킨 값을 뜻한다.

도 1의 막대 그래프를 참조하면, 실험군(CORT 유도 우울증 모델 및 CFS 우울증 유도 모델)의 마우스들에게서 miRNA-206이 대조군(정상 마우스)보다 상향 발현됨을 확인할 수 있었다. snoRNA-202를 내부 대조군으로 사용하였고, 막대 그래프의 수치는 snoRNA-202에 miRNA-206의 발현을 정상 평준화시킨 값들이다(control, 1.38±0.01; Depression, 1.42±0.01, *P < 0.01, 바(Bar)는 ±표준 오차를 뜻함).

<실시예 2> AM-206의 투여로 인한 CORT 유도 우울증 모델의 불안감 회복

상기의 실험 방법을 실질적으로 동일하게 수행하여 EPM 실험을 통하여 대조군 및 실험군 1(CORT 유도 우울증 모델군)의 우울감 정도를 측정하고, 그 결과를 도 2에 막대 그래프로 나타내었다. 도 2의 막대 그래프의 가로축은 개방된 통로(open arm), 폐쇄된 통로(closed arm) 및 중앙 플랫폼(center)을 뜻하고, 세로축은 각 통로에 머무른 시간(sec)을 뜻한다.

도 2의 막대 그래프를 참조하면, 실험군 1(CORT 유도 우울증 모델군)은 대조군(control)보다 폐쇄된 통로(closed arm)에서 더 많은 시간을 보냈으며(control, 233.93±9.12; CORT, 278.76±3.85; CORT-AM206, 229.20±25.16 sec), 개방된 통로(open arm)에서는 적은 시간을 보낸 것(control, 25.65±6.25; CORT, 1.98±0.96; CORT-AM206, 43.61±23.56 sec)을 확인할 수 있다. 이러한 결과로부터 CORT 유도 우울증 모델의 마우스들이 높은 불안감을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

그러나 miRNA-206에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 AM-206(antagomir for miR-206)이 투여된 CORT 유도 우울증 모델(CORT-AM206)의 마우스들은 폐쇄된 통로(closed arm) 및 개방된 통로(open arm)에서 대조군(정상 마우스)와 비교하여 비슷한 시간을 보내는 것을 확인할 수 있다.

한편, 도 3은 각각의 통로(arm)로 들어가는 횟수(활동성)를 막대 그래프로 나타낸 것이다. 도 3의 막대 그래프의 가로축은 모든 통로 방향(total) 및 개방된 통로 방향(to open arm)을 뜻하고, 세로축은 통로로 들어간 횟수를 뜻한다.

도 3의 막대 그래프를 참조하면, 대조군(control)과 비교하여 실험군 1(CORT 유도 우울증 모델)에서 줄어든 총 횟수(control, 15.80±1.34; CORT, 6.18±1.49; CORT-AM206, 11.90±2.09) 및 개방된 통로(open-arm)로 들어가는 횟수(활동성)(control, 2.10±0.35; CORT, 0.29±0.14; CORT-AM206, 1.4±0.43)가 CORT-AM206 그룹에서 회복된 것을 확인할 수 있다(대조군 n=10, CORT 유도 우울증 모델 그룹 n=17, CORT-AM206 그룹 n=10, *P<0.05, one-way ANOVA, 바(Bar)는 ±표준 오차를 뜻함).

따라서, 도 2와 도 3에서 AM-206은 우울증모델의 높은 불안감을 회복시켜주는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 3> AM206 으로 인한 CORT 우울증 모델의 절망감 회복

상기 실험 방법을 실질적으로 동일하게 수행하여 대조군(정상 마우스) 및 실험군 1(CORT 유도 우울증 모델)의 절망감 정도를 TST 실험을 통하여 측정하고, 그 결과를 도 4에 막대 그래프로 나타내었다. 도 4의 막대 그래프의 가로축은 대조군(control), 실험군 1(CORT 유도 우울증 모델), CORT-AM206 그룹을 뜻하고, 세로축은 움직이니 않는 시간(sec)을 뜻한다.

도 4의 막대 그래프를 통해 실험군 1(CORT 유도 우울증 모델)은 대조군(control)보다 많은 시간 동안 움직이지 않은 것(immobility)을 통하여 대조군보다 절망감이 높은 것을 확인할 수 있다. 하지만, CORT-AM206 그룹은 대조군(정상 마우스)과 비슷한 수치를 보이는 것을 확인할 수 있다(control, 85.30±15.46; CORT, 138.60±9.74; CORT-AM206, 104.33±7.53 sec). 이러한 결과로부터 AM-206이 CORT 유도 우울증 모델의 높은 절망감을 회복시키는 것을 확인할 수 있다(대조군(control) n=14, CORT 유도 우울증 모델 그룹 n=12, CORT-AM206 그룹 n=9, *P<0.05, one-way ANOVA, 바(Bar)는 ±표준오차를 뜻함).

<실시예 4> AM206으로 인한 CFS 유도 우울증 모델의 절망감 회복

상기 실험 방법을 실질적으로 수행하여 실험군 2(CFS 유도 우울증 모델)에서의 절망감 정도를 TST 실험을 통하여 측정하고, 그 결과를 도 5에 막대 그래프로 나타내었다. 도 5의 막대 그래프의 가로축은 대조군(control), 실험군 2(CFS 유도 우울증 모델) 및 CFS-AM206 그룹을 뜻하고, 세로축은 움직이지 않은 시간(sec)을 뜻한다.

도 5의 막대 그래프를 통해 실험군 2(CFS 유도 우울증 모델)는 대조군(control)보다 많은 시간 동안 움직이지 않은 것(immobility)을 통하여 대조군보다 절망감이 높은 것을 확인할 수 있으나, AM-206을 투여한 CFS-AM206 그룹은 대조군(control)과 비슷한 수치를 나타내는 것을 확인할 수 있다(control, 85.30±15.46; CFS, 132.14±14.42; CFS-AM206, 73.61±10.55 sec). 이로부터 AM-206이 CFS 유도 우울증 모델의 높은 절망감을 회복시키는 것을 확인할 수 있다(대조군(control) n=14, CFS 유도 우울증 모델 n=20, CFS-AM206 그룹 n=12, *P<0.05, one-way ANOVA, 바(Bar)는 ±표준 오차).

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리 범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.

<110> Advanced NT <120> The detection method of miRNA-206, the method of providing information for diagnosis and prognostic analysis of mood disorders, the composition targeting miRNA-206 <130> DHPSY15-127 <140> 10-2015-0180919 <141> 2015-12-17 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uggaauguaa ggaagugugu gg 22

Claims (17)

1. 코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 miR-206의 발현을 검출하는 단계를 포함하고,
   상기 검출하는 단계는,
   일정 농도로 처리된 AM-206을 투여한 대상의 조직 시료로부터 miR-206의 발현 수준을 측정하는 단계;
   상기 AM-206의 투여 후 측정된 miR-206의 발현 수준을 정상 수준과 비교하는 단계; 및
   상기 비교 결과에 따라, 상기 대상의 코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 진단 정보를 제공하는 단계;를 포함하며,
   상기 AM-206은 상기 miR-206의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자를 포함하며, 2’-O-메틸화 되어있는 것을 특징으로 하는
   코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 진단 마커 또는 예후 분석 마커의 검출에 따른 진단 정보 제공 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 miR-206의 발현 수준은 miR-206과 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는
   코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 진단 마커 또는 예후 분석 마커의 검출에 따른 진단 정보 제공 방법..
3. 제1항에 있어서,
   상기 miR-206의 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 측정되는
   코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 진단 마커 또는 예후 분석 마커의 검출에 따른 진단 정보 제공 방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 진단 정보를 제공하는 단계는, 상기 AM-206의 투여 후 측정된 miR-206의 발현 수준을 정상 수준과 비교하여, 상기 발현 수준이 상기 정상 수준보다 큰 경우, 코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증이라고 결정하는 단계를 포함하는
   코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 진단 마커 또는 예후 분석 마커의 검출에 따른 진단 정보 제공 방법.
6. 삭제
7. 제5항에 있어서,
   상기 결정하는 단계는, 대상의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 혈액 검사 결과, 뇌 MRI 결과, 뇌 CT 결과 또는 뇌 척수액 검사 결과 중 적어도 하나 이상의 임상 정보를 상기 결정에 이용하는 단계를 더 포함하는
   코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 진단 마커 또는 예후 분석 마커의 검출에 따른 진단 정보 제공 방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. miR-206을 표적으로 하는 AM-206을 유효성분으로 포함하고,
    상기 AM-206은 일정 농도로 처리되어 대상에게 투여되며, 상기 투여된 대상의 조직 시료로부터 miR-206의 발현 수준이 측정되면, 상기 AM-206의 투여 후 측정된 miR-206의 발현 수준이 정상 수준과 비교되어, 상기 비교 결과에 따라, 상기 대상의 코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 진단 정보를 제공하는 데 이용되며,
    상기 AM-206은 상기 miR-206의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자를 포함하며, 2’-O-메틸화 되어있는 것을 특징으로 하는
    코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
13. 삭제
14. 삭제
15. 제12항에 있어서,
    상기 AM-206은 불안감 회복 작용을 통하여 코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증을 치료 또는 예방할 수 있는 제제를 생산하는데 사용되는 것을 특징으로 하는
    코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
16. 제12항에 있어서,
    상기 AM-206은 절망감 회복 작용을 통하여 코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증을 치료 또는 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는
    코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
17. 제12항에 있어서,
    상기 AM-206은 miR-206의 발현 또는 활성을 억제하는 작용을 통하여 코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 치료 또는 예방용 제제를 생산하는데 이용되는 것을 특징으로 하는
    코르티코스테론(Corticosterone)에 의한 우울증의 치료 또는 예방용 약학 조성물.

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