KR101885238B1 - 스펙신 기반 갈라닌 ２형 수용체의 효현제 및 이의 용도 - Google Patents
스펙신 기반 갈라닌 ２형 수용체의 효현제 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 스펙신 기반 갈라닌 2형 수용체의 효현제 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 갈라닌 수용체 2형에 대한 특이성과 안정성을 개선한 펩타이드계 효현제를 제공하며, 상기 펩타이드계 효현제는 갈라닌 수용체 2형이 담당하는 체내의 생리적 기능인 섭식, 불안, 감정, 중독 등의 조절에 관여하여 식욕을 억제하고 불안장애를 회복하며, 쾌락중독성을 감소시킬 수 있는 효과가 있어 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 스펙신(Spexin) 단백질을 기반으로 개발한 갈라닌 수용체 2형(GALR2) 특이적인 효현제 및 상기 효현제의 GALR2에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료적 용도에 관한 것이다.
C12orf39(chromosome 12 open reading frame 39) 유전자에 의해 암호화되는 신규 신경 펩타이드 스펙신(Spexin/NQ/NPQ/SPX)은 인간 유전체 정보를 이용한 생물정보학법(bioinfomatics)을 이용해 최초로 발견되었다. 성숙한 스펙신은 전단백질분해효소(proprotein convertase)에 의해 이중염기 쌍(dibasic amino acid)이 절단되어 생성되는 14개의 아미노산 서열을 가지고 있으며 인간뿐만 아니라 대표적인 척추동물 내에서 매우 잘 보존되어있다[Mirabeau et al., Genome Res, 2007, 17:320-327]. 스펙신의 mRNA와 단백질은 인간, 생쥐, 금붕어 등 여러 종의 다양한 뇌 영역 및 말초기관에서 발현하고 있으며 이는 스펙신이 척추동물에서 다양한 생리적 기능을 담당하고 있음을 시사한다. 최근, 섭식 행동 및 물질대사 과정에 관여하는 스펙신의 기능이 밝혀졌다. 비만인 사람의 지방에서 스펙신의 mRNA가 상당히 감소해 있었고, 식이 기반 비만 유도 생쥐에서 스펙신 주입은 체중 감소를 유도하였으며, 금붕어에서 스펙신의 주입은 식욕을 억제하는 것으로 나타났다. 스펙신은 장 근육 수축을 촉진시켜 배변활동을 유도하며, 인간의 내분비 조직 및 상피조직에서 발현하고, 제2형 당뇨병환자에서 스펙신의 수치가 감소하는 것을 통해 당대사 및 지방대사와 관련이 있다는 연구가 발표되었다. 또한, 스펙신은 생식(reproduction), 심혈관(cardiovascular), 콩팥기능(renal function) 및 통각조절(nociceptin)에도 관여한다고 알려져 있다[Waleski et al., Obesity 2014, 22:1643-1652; Wong et al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305:E348-366; Liu et al., Mol Cel Endocrinol, 2013, 374:65-72; Toll et al., FASEB J, 2012, 26:947-954; Lin et al., Sci Rep, 2015, 5:12095; Gu et al., Peptides, 2015, 71:232-239]. 그러나 스펙신이 결합하여 작용하는 수용체에 대한 정보 부족으로 인해 이러한 기능 조절 메커니즘이 잘 연구되지 않았다. 최근, 본 발명자들은 스펙신이 갈라닌 수용체(galanin receptor, 이하, GALR이라 함) 1, 2, 3형 모두를 활성화 시키는 갈라닌(galanin)과는 달리 GALR 1형을 활성화 시키지 않으며 GALR 2, 3형에 대한 내재적 리간드로서의 스펙신의 기능을 밝혔다. 실제로, 갈라닌은 GALR 3형에 아주 약한 활성도를 보이기 때문에 갈라닌과 스펙신은 GALR 2형을 공유하여 작용한다고 할 수 있다[Kim et al., Endocrinology, 2014, 155:1864-1873].
스펙신과 갈라닌은 진화적으로 유전자 복제에 의해 같은 조상유전자에서 유래되었으며 성숙한 아미노산 내에 Trp2, Thr3, Tyr9, Gly12의 보존된 서열을 공유하고 있다[Kim et al., Endocrinology, 2014, 155:1864-1873]. 갈라닌은 스펙신과 마찬가지로 중추신경계와 말초조직에서 광범위하게 발현하고 있다. 그러나 식욕 및 생식에 관련된 스펙신과 갈라닌은 상반된 기능을 갖는 것으로 생각된다. 예를 들어, 비만 여성에서 갈라닌 수치가 증가해 있으며, 갈라닌의 주입 및 갈라닌을 과발현하는 유전자변형 생쥐에서 섭식행동이 증가함이 관찰되었다. 결과적으로 갈라닌은 식욕 유발성(orexigenic) 펩타이드이나, 스펙신은 무식욕 유발성(anorexic) 펩타이드라고 할 수 있다. 또한, 갈라닌 유사 펩타이드(galanin-like peptide)의 주입은 황체형성호르몬의 분비를 촉진시킨다는 점에서 스펙신의 금붕어에의 주입이 황체형성호르몬의 분비를 저해시킨다는 결과와 상반된다[Barnowska et al., Metabolism, 1997, 46:1384-1389; Rada et al., Alcohol, 2004, 33:91-97; Castellano et al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006, 291:E1281-1289; Liu et al., Mol Cel Endocrinol, 2013, 374:65-72]. 이러한 반대작용은 GALR 1, 3형이 억제성 Gi 신호전달체계를 유도하는 반면, GALR 2형은 흥분성 Gq 신호전달체계를 유도하기 때문에 일어나는 GALR 아형 특이적인 신호전달체계에 의한 것으로 생각된다[Webling et al., Front Endocrinol, 2012, 3:146].
GALR 2형에 의한 표현형 연구는 수용체의 유전자 적중(knock-out, KO) 생쥐 및 수용체에 선택적으로 작용하는 효현제(agonist) 또는 억제제(antagonist)의 개발 시도를 통해 이루어졌다. GALR 2형 KO는 감각기능(sensory function), 섭식행동(feeding behavior), 생식(reproduction), 정서(mood), 학습과 기억(learning and memory) 등 특이적인 이상이 없다고 보고되었으나 이후에 GALR 2형 KO에서 불안(anxiety), 우울행동(depression-related behavior)이 관찰되었다. 이러한 행동 변화는 GALR 1형 KO와 유사하지만 GALR 3형에 의한 효과와 반대되는 것으로, GALR 3형 특이적 길항제 투여에 의한 불안과 우울행동의 감소가 보고되어있다[Gottsch et al., Mol Cell Biol, 2005, 25:4804-4811; Bailey et al., Pharmacol Biochem Behav, 2007, 86:8-20; Lu et al., Neuropeptides, 2008, 42:387-397; Holmes et al., Neuropsychopharmacology, 2003, 28:1031-1044; Swanson et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102:17489-17494]. 또한, GALR 2형 결손은 뒷뿌리신경절(dorsal root ganglion)발달의 손실을 가져온다는 점과 GALR 2형 효현제의 척추 내 주입이 이질통(allodynia)을 유발한다는 점에서 통증조절에의 역할을 예상할 수 있다. GALR 2형이 중간변연계 보상회로에 관여한다는 것은 배측선조체(dorsal striatum)와 측좌핵(nucleus accumbens)에서 갈라닌이 흥분성 후시냅스의 진폭을 감소시키며 GALR 2형 KO에서는 이러한 효과가 없다고 알려져 있다. 중심편도(central amygdala)에서 갈라닌은 GALR 2형을 통해 GABA성 억제 후시냅스의 전위의 진폭을 감소시킨다고 보고되어있다. 또한, GALR 2형의 활성화는 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase)인 Akt 등의 인산화를 통해 해마를 신경세포 손상으로부터 보호한다고 알려져 있다[Shi et al., Eur J Neurosci, 2006, 23:627-636; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:9960-9964; Einstein et al., Eur J Neurosci 2013, 37:1541-1549; Bajo et al., Addict Biol, 2012, 17:694-705; Elliotte-Hunt et al., J Neurochem, 2007, 100:780-789]. 이러한 GALR 2형에 의한 현상들은 GALR 1형 또는 3형과 함께, 반대로 또는 독립적으로 작용할 것으로 생각되지만 학습과 기억, 통증, 불안, 정서조절과 연관된 GALR 2형의 역할을 시사하고 있다.
기존에도 GALR 아형 특이적인 효현제 개발의 시도는 수차례 있었다. 갈라닌 펩타이드의 2~11번째 아미노산 서열은 GALR 2형의 선택적 효현제로서 처음 개발되었으나 이후에 GALR 3형에도 유사한 활성도를 보인다는 것이 밝혀졌다. 이후에도 갈라닌 펩타이드의 N-말단, C-말단의 변형을 통한 GALR 2형 선택적 효현제 개발의 시도가 보고되었다. M1145와 M1153은 GALR 1형과 3형에 비해 2형에 대해 50~100배 정도 더 잘 반응하지만, 농도가 높아질 경우 1형, 3형에 대한 상당한 친화도를 보인다는 것이 알려졌다[Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:9960-9964; Lu et al., Neuropeptides, 2005, 39:165-167; Webling et al., Front Endocrinol, 2012, 3:146; Runesson et al., Neuropeptides, 2009, 43:187-192; Saar et al., Neurochrm Int, 2011, 6:714-720].
이렇듯 과거의 선행연구에서 여러 종의 갈라닌 수용체 아형에 특이적인 효현제 개발의 노력에도 불구하고 고농도의 효현제 처리에 의한 특이성에 문제점이 발견되었다는 점에서, 수용체 아형 특이적인 효현제의 개발에 따른 GALR 아형에 의한 생리학적 기능의 연구의 필요성이 대두되었다.
이에 본 발명자들은 갈라닌과 스펙신을 구성하고 있는 아미노산 서열분석 및 치환을 통해 GALR 2형을 대상으로 스펙신-수용체의 반응성을 확인하고 안정성을 높임으로써 개선된 효현제를 개발하고, 이를 동물에 주입하여 생리학적 기능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Kim et al., Endocrinology, 2014, 155:1864-1873
Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:9960-9964
본 발명의 목적은 갈라닌 수용체 2형에 대한 선택성을 높이고 혈액 내 안정성을 증가시킨 펩타이드계 갈라닌 수용체 2형의 효현제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드계 갈라닌 수용체 2형의 효현제를 갈라닌 수용체 2형에 의해 유도된 질환의 예방 또는 치료에 사용하는 약제학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 식 1로 표시되는 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제를 제공한다:
[식 1]
[dN]1[W]2[T]3[P]4[N]5[A]6[A]7[L]8[Y]9[L]10[F]11[G]12[P]13[Q]14-NH2
상기 식에서,
[dN]1은 D형 아스파라긴을 나타내고, 피로글루타메이트(pQ), 시트룰린(Cit), L형 아스파라긴(N), 또는 글리신(G) 중 어느 하나로 치환되거나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아세틸기(Ac), 또는 Fmoc 중 어느 하나가 결합된 아스파라긴으로 치환될 수 있으며,
[W]2는 D형 트립토판(dW) 또는 2-나프틸(2-Naphtyl)기로 치환될 수 있고,
[T]3는 A(알라닌), 또는 K(리신)로 치환될 수 있으며,
[P]4는 D형 알라닌(dA), 또는 D형 발린(dV)으로 치환될 수 있고,
[N]5은 Q(글루타민)로 치환될 수 있으며,
[A]6는 D형 알라닌(dA)로 치환될 수 있고,
[A]7는 M(메티오닌)으로 치환될 수 있으며,
[F]11는 리신(K), L(류신), 또는 Y(타이로신)으로 치환될 수 있고,
[P]13는 D형 알라닌(dA), 또는 A(알라닌)로 치환될 수 있으며,
[Q]14는 D형 글루타민(dQ), 또는 H(히스티딘)로 치환될 수 있고,
상기 식에서,
[dN]1은 D형 아스파라긴을 나타내고, 피로글루타메이트(pQ), 시트룰린(Cit), L형 아스파라긴(N), 또는 글리신(G) 중 어느 하나로 치환되거나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아세틸기(Ac), 또는 Fmoc 중 어느 하나가 결합된 아스파라긴으로 치환될 수 있으며,
[W]2는 D형 트립토판(dW) 또는 2-나프틸(2-Naphtyl)기로 치환될 수 있고,
[T]3는 A(알라닌), 또는 K(리신)로 치환될 수 있으며,
[P]4는 D형 알라닌(dA), 또는 D형 발린(dV)으로 치환될 수 있고,
[N]5은 Q(글루타민)로 치환될 수 있으며,
[A]6는 D형 알라닌(dA)로 치환될 수 있고,
[A]7는 M(메티오닌)으로 치환될 수 있으며,
[F]11는 리신(K), L(류신), 또는 Y(타이로신)으로 치환될 수 있고,
[P]13는 D형 알라닌(dA), 또는 A(알라닌)로 치환될 수 있으며,
[Q]14는 D형 글루타민(dQ), 또는 H(히스티딘)로 치환될 수 있고,
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상기 식에서 아미노산의 치환은 단일 또는 복수 개로 치환될 수 있고, 이때, [dN]1, [N]5, [A]7, [F]11 및 [P]13이 각각 L형 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 리신 및 알라닌으로 치환된 경우는 제외한다.
바람직하게는, 상기 효현제는 하기 식 2로 표시될 수 있다:
바람직하게는, 상기 효현제는 하기 식 2로 표시될 수 있다:
[식 2]
dNWTPNAALYLFGPQ-NH2
본 발명은 또한 상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제를 포함하는 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조를 위한 상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 갈라닌 수용체 2형에 대한 특이성과 안정성을 개선한 펩타이드계 효현제를 제공하며, 상기 펩타이드계 효현제는 갈라닌 수용체 2형이 담당하는 체내의 생리적 기능인 섭식, 불안, 감정, 중독 등의 조절에 관여하여 식욕을 억제하고 불안장애를 회복하며, 쾌락중독성을 감소시킬 수 있는 효과가 있어 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
도 1은 스펙신과 갈라닌의 아미노산 서열 비교, 및 상기 서열 내 아미노산의 돌연변이 위치 및 변형을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 사용된 아미노산의 돌연변이, 치환 및 변형이 이루어진 스펙신 기반 돌연변이 펩타이드들의 목록을 나열한 것이다.
도 3은 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이드 중 단일 돌연변이가 있는 펩타이드들의 GALR2 및 GALR3에 대한 활성도 측정 결과(A)와, 이중 돌연변이(A7F11), 삼중 돌연변이(N5A7F11), 사중 돌연변이(N5A7F11H14 및 N5A7F11P13) 펩타이드들의 GALR1(B), GALR2(C), GALR3(D)에 대한 활성도 측정 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이드들의 GALR2 및 GALR3에 대한 활성도 측정 결과를 수치화한 값을 도시한 것이다.
도 5는 D-형 아미노산으로의 치환 및 다양한 변형이 이루어진 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이들의 GALR2 및 GALR3에 대한 활성도 측정 결과를 도시한 것이다.
도 6은 D-형 아미노산으로의 치환 및 다양한 변형이 이루어진 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이들의 GALR2 및 GALR3에 대한 활성도 측정 결과를 수치화한 값을 도시한 것이다.
도 7은 100% 태아혈청에서 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이들의 안정성 검증 결과를 도시한 것이다.
도 8은 100% 태아혈청에서 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이들의 안정성 검증 결과를 수치화한 값을 도시한 것이다.
도 9는 GALR 2형, 3형을 발현하는 HEK293-Gqi 안정 세포주에 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이들의 갈라닌 수용체에 대한 활성도 측정 결과를 도시한 것이다.
도 10은 비강흡수 전달방식을 통해 마우스 모델의 뇌 조직에 전달된 FITC-스펙신의 면역조직화학법 측정 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이드의 섭식행동 및 체중변화 효과의 검증 결과를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이드의 불안장애에 대한 치료 효과를 EPM 검사법을 이용하여 검증한 결과를 도시한 것이다.
도 13은 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이드의 활동성 및 불안에 대한 치료 효과를 OFT 검사법을 이용하여 검증한 결과를 도시한 것이다.
도 14는 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이드의 중독성 감소 효과를 SPT 검사법을 이용하여 검증한 결과를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 사용된 아미노산의 돌연변이, 치환 및 변형이 이루어진 스펙신 기반 돌연변이 펩타이드들의 목록을 나열한 것이다.
도 3은 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이드 중 단일 돌연변이가 있는 펩타이드들의 GALR2 및 GALR3에 대한 활성도 측정 결과(A)와, 이중 돌연변이(A7F11), 삼중 돌연변이(N5A7F11), 사중 돌연변이(N5A7F11H14 및 N5A7F11P13) 펩타이드들의 GALR1(B), GALR2(C), GALR3(D)에 대한 활성도 측정 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이드들의 GALR2 및 GALR3에 대한 활성도 측정 결과를 수치화한 값을 도시한 것이다.
도 5는 D-형 아미노산으로의 치환 및 다양한 변형이 이루어진 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이들의 GALR2 및 GALR3에 대한 활성도 측정 결과를 도시한 것이다.
도 6은 D-형 아미노산으로의 치환 및 다양한 변형이 이루어진 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이들의 GALR2 및 GALR3에 대한 활성도 측정 결과를 수치화한 값을 도시한 것이다.
도 7은 100% 태아혈청에서 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이들의 안정성 검증 결과를 도시한 것이다.
도 8은 100% 태아혈청에서 본 발명의 스펙신 기반 돌연변이 펩타이들의 안정성 검증 결과를 수치화한 값을 도시한 것이다.
도 9는 GALR 2형, 3형을 발현하는 HEK293-Gqi 안정 세포주에 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이들의 갈라닌 수용체에 대한 활성도 측정 결과를 도시한 것이다.
도 10은 비강흡수 전달방식을 통해 마우스 모델의 뇌 조직에 전달된 FITC-스펙신의 면역조직화학법 측정 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이드의 섭식행동 및 체중변화 효과의 검증 결과를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이드의 불안장애에 대한 치료 효과를 EPM 검사법을 이용하여 검증한 결과를 도시한 것이다.
도 13은 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이드의 활동성 및 불안에 대한 치료 효과를 OFT 검사법을 이용하여 검증한 결과를 도시한 것이다.
도 14는 본 발명의 스펙신 기반 사중 돌연변이 펩타이드의 중독성 감소 효과를 SPT 검사법을 이용하여 검증한 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 식 1로 표시되는 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제에 관한 것이다:
[식 1]
[dN]1[W]2[T]3[P]4[N]5[A]6[A]7[L]8[Y]9[L]10[F]11[G]12[P]13[Q]14-NH2
상기 식에서,
[dN]1은 D형 아스파라긴을 나타내고, 피로글루타메이트(pQ), 시트룰린(Cit), L형 아스파라긴(N), 또는 글리신(G) 중 어느 하나로 치환되거나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아세틸기(Ac), 또는 Fmoc 중 어느 하나가 결합된 아스파라긴으로 치환될 수 있으며,
[W]2는 D형 트립토판(dW) 또는 2-나프틸(2-Naphtyl)기로 치환될 수 있고,
[T]3는 A(알라닌), 또는 K(리신)로 치환될 수 있으며,
[P]4는 D형 알라닌(dA), 또는 D형 발린(dV)으로 치환될 수 있고,
[N]5은 Q(글루타민)로 치환될 수 있으며,
[A]6는 D형 알라닌(dA)로 치환될 수 있고,
[A]7는 M(메티오닌)으로 치환될 수 있으며,
[F]11는 리신(K), L(류신), 또는 Y(타이로신)으로 치환될 수 있고,
[P]13는 D형 알라닌(dA), 또는 A(알라닌)로 치환될 수 있으며,
[Q]14는 D형 글루타민(dQ), 또는 H(히스티딘)로 치환될 수 있고,
상기 식에서,
[dN]1은 D형 아스파라긴을 나타내고, 피로글루타메이트(pQ), 시트룰린(Cit), L형 아스파라긴(N), 또는 글리신(G) 중 어느 하나로 치환되거나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아세틸기(Ac), 또는 Fmoc 중 어느 하나가 결합된 아스파라긴으로 치환될 수 있으며,
[W]2는 D형 트립토판(dW) 또는 2-나프틸(2-Naphtyl)기로 치환될 수 있고,
[T]3는 A(알라닌), 또는 K(리신)로 치환될 수 있으며,
[P]4는 D형 알라닌(dA), 또는 D형 발린(dV)으로 치환될 수 있고,
[N]5은 Q(글루타민)로 치환될 수 있으며,
[A]6는 D형 알라닌(dA)로 치환될 수 있고,
[A]7는 M(메티오닌)으로 치환될 수 있으며,
[F]11는 리신(K), L(류신), 또는 Y(타이로신)으로 치환될 수 있고,
[P]13는 D형 알라닌(dA), 또는 A(알라닌)로 치환될 수 있으며,
[Q]14는 D형 글루타민(dQ), 또는 H(히스티딘)로 치환될 수 있고,
상기 식에서 아미노산의 치환은 단일 또는 복수 개로 치환될 수 있고, 이때, [dN]1, [N]5, [A]7, [F]11 및 [P]13이 각각 L형 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 리신 및 알라닌으로 치환된 경우는 제외한다.
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바람직하게는, 상기 효현제는 하기 식 2로 표시될 수 있다:
[식 2]
dNWTPNAALYLFGPQ-NH2
본 발명의 갈라닌 2형 수용체의 효현제는 갈라닌 2형 수용체(이하, 'GALR2' 라 함)에만 선택적으로 작용하면서 오래 작용할 수 있는 펩타이드계 효현제인 것을 특징으로 한다.
일 구체예에 따르면, 척추동물 내 다양한 종에 존재하는 갈라닌과 스펙신의 아미노산 서열을 비교한 결과 대부분을 다른 아미노산 서열을 갖지만 갈라닌과 스펙신은 트립토판[Trp2], 9번째 티로신[Tyr9], 10번째 류신[Leu10]과 12번째 글리신[Gly12]을 공통적으로 지님을 확인하고, 스펙신의 아미노산 서열과 갈라닌의 서열이 같은 경우 D-형 아미노산으로 치환하고, 스펙신 특이적으로 갈라닌과 서열이 다른 경우 해당 스펙신의 아미노산 서열을 갈라닌의 아미노산으로 치환할뿐만 아니라, 14개의 스펙신 아미노산 서열 각각을 다른 아미노산 또는 D-형 아미노산으로 치환하여 각 돌연변이 펩타이드의 갈라닌 수용체에 대한 활성 변화를 관찰하였다.
이때, 갈라닌 수용체에 대한 활성 변화를 관찰하기 위해 HEK293-Gqi 안정 세포주가 사용되었다. 상기 HEK293-Gqi 안정 세포주는 Gq의 C-말단을 Gi의 아미노산 3개로 치환하여 Gi의 신호를 Gq 신호전달 경로로 전환한 것으로, 알파(a), 베타(b), 그리고 감마(g)의 세 가지 서브유닛(subunit)으로 이루어진 이종 삼중체(hetero trimer)인 G 단백질은 알파 서브유닛이 세포 내로의 신호전달에 관여하는데, 알파 서브유닛이 s 형인 경우(Gas)는 세포 내 효소의 하나인 아데닐 사이클라아제(adenyl cyclase)를 활성화 시킴으로써 ATP로부터 대표적인 이차전달자인 cAMP를 생산하며, protein kinase A(PKA)를 활성화 시키나, i 형인 경우(Gai)는 전술한 아데닐 사이클라아제의 활성을 억제하는 신호를 보내며, 또 다른 알파 서브유닛인 q/11형의 경우는 세포 내에서 칼슘의 양을 증가시키거나, protein kinase C(PKC)를 활성화 시키는데, GALR 아형들은 GALR 1, 3형이 억제성 Gi 신호전달체계를 유도하는 반면, GALR 2형은 흥분성 Gq 신호전달체계를 유도한다는 점에서 서로 다르기 때문에 Gq의 C-말단을 Gi의 아미노산 3개로 치환하여 Gi의 신호를 Gq 신호전달 경로로 전환한 HEK293-Gqi 안정 세포주를 사용하여야 한다.
상기 돌연변이 펩타이드의 갈라닌 수용체에 대한 활성 변화를 측정한 결과, 사중 돌연변이, 즉, 5번째 아미노산을 아스파라긴[Asn5]으로, 7번째 아미노산을 알라닌[Ala7]으로, 11번째 아미노산을 페닐알라닌[Phe11]으로, 13번째 알라닌을 프롤린[Pro13]으로 치환(N5A7F11P13 또는 Qu)한 경우, 스펙신 수준으로 GALR 2형에 대한 활성도는 남아있으나 3형에 대한 활성도가 완벽하게 사라졌다(도 3, 도 4 참조). 또한, 이러한 갈라닌 아미노산 서열의 스펙신에의 도입은 GALR 1형에 대한 활성도를 유도하지 않는다는 점에서 해당 아미노산들은 GALR 2형을 활성화시키는데 특이적이라고 할 수 있다.
또한, D형 아미노산의 치환은 수용체 활성화에 대한 중요한 서열을 규명하고, 혈청에 존재하는 다양한 펩타이드 분해효소로부터 펩타이드를 보호하기 위함이다. 스펙신의 1번째 아미노산을 제외하고 다른 위치에 있는 아미노산의 D형 아미노산으로의 치환은 갈라닌 수용체 활성도를 상실하는 결과를 얻었다. 그러나, 스펙신의 1번째 아스파라긴[Asn1]의 D-형 치환[dN1]은 GALR 2형, 3형 모두에 대한 활성도가 오히려 약간 증가하는 것으로 보였다(도 5 및 도 6). 이러한 변화는 스펙신의 1번째 아미노산 서열을 치환함으로써 혈청 내 펩타이드 분해효소에 안정적인 효현제를 개발할 수 있다는 가능성을 보여준다.
이에, 스펙신의 1번째 아스파라긴[Asn1]을 피로글루타메이트(pyroglutamate, pQ), 시트룰린(citrulline, Cit), Fmoc 등으로 치환하거나 스펙신의 N-말단을 폴리에틸렌 글리콜화(polyethylene glycolylated, PEG) 또는 아세틸화(acetylated)시킨 결과, D형 치환과 유사하게 이러한 변형들은 GALR 2형, 3형에 대한 활성도에 영향을 주지 않았다(도 5 및 도 6). 이는 스펙신의 1번째 아미노산 서열의 치환이 GALR의 활성도에는 영향을 주지 않으면서 혈청 내 펩타이드 분해효소에 대한 안정성을 증가시킴을 강력히 시사하고 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 펩타이드계 GALR2 효현제의 안정성을 검증하기 위해, 혈청 내에서 GALR2에 대한 활성도를 측정하고, 수용체에 대한 활성도는 GALR2를 발현하는 세포에서 IP3 생성 정도를 통해 측정하였다.
그 결과, 스펙신의 활성도는 12시간 이내에 80% 이하로 매우 빠르게 감소하나, 돌연변이 펩타이드는 스펙신보다 IP3 생성의 감소가 적었고(도 7 및 도 8), 혈청 내 분해 속도가 스펙신보다 느리게 일어나 혈청 내 안정성이 높음을 알 수 있다.
또한, 펩타이드성 약물이 체내에 전달되어 뇌에 작용하기 위해서는 혈액 뇌 장벽(Blood brain barrier, BBB)을 통과할 수 있는 약물 전달 시스템을 도입해야한다. 비강흡수기법을 통하면 혈액 뇌 장벽을 통과하는 소형분자의 개발을 거치지 않고도 약물의 뇌 내 전달이 가능하다.
따라서, 스펙신의 뇌 내 전달을 검증하기 위해 비강흡수 전달방식을 위해 프로필렌 글리콜과 조합하여 동물 모델의 코에 주입한 결과 식욕을 조절하는 것으로 알려진 상핵(arcuate nucleus, ARC) 영역과 정서조절에 관여하는 것으로 알려진 흑질-복측피개영역(substantia nigra-ventral tegmental area, SN-VTA)에서 반점(punctate) 형태로 발견되었다(도 10). 이는 비강흡수방식을 이용한 방법이 펩타이드성 약물의 뇌 내 전달에 이용될 수 있으며 스펙신의 아미노산 서열 치환을 통해 개발한 GALR2 효현제가 섭식 및 정서관련 질환 치료제로써 개발될 수 있다는 가능성을 시사한다.
이를 검증하기 위해, 동물 모델의 제3뇌실에 도관을 삽입한 후 GALR2 효현제를 주입하고 체중과 식이량 변화를 비교한 결과, GALR2 효현제를 주입한 동물 모델이 스펙신을 주입한 동물 모델보다 식이 섭취가 유의하게 감소하고, 이는 체중의 감소를 유도하였다(도 11). 따라서, GALR2 효현제가 섭식 행동을 억제하여 비만을 치료하기 위한 약물로 사용할 수 있음을 시사한다.
다음으로, 불안장애 극복에 대한 GALR2 효현제의 효과를 검증하기 위해, 동물 모델의 측뇌실에 도관을 삽입하고 EPM 검사법을 통해 불안/강박도를 측정한 결과, GALR2 효현제의 주입에 의해 전체 움직임에는 차이가 없으나 불안도가 감소함을 나타냈고(도 12), 이는 OFT 검사법에서도 확인되었다(도 13). 따라서, GALR2 효현제는 불안장애 치료를 위한 약물로 사용할 수 있음을 시사한다.
마지막으로, GALR2 효현제의 중독성 감소 효과를 검증하기 위해 동물 모델의 측뇌실에 도관을 삽입하고 SPT 검사법을 통해 중독성을 측정한 결과, 설탕물의 소비량이 현저히 감소하여 단성분에 대한 중독성이 감소하였음을 알 수 있었다(도 14). 또한, 설탕물을 에너지원으로 인식한다고 보았을 때, 설탕물 소비량의 감소는 식욕 또는 섭식행동의 감소를 의미한다고 볼 수 있어 중독에 대한 치료제 및 섭식장애 치료제로 GALR2 효현제를 사용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 GALR2 효현제는 당업계의 통상적인 펩타이드의 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)으로 합성할 수 있다. 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(Solution Phase Peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide syntheses), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성하는 것이 좋으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 GALR2 효현제는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예를 들면, Biosearch 또는 Applied iosystems사의 제품)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 상기 DNA 서열은 이에 작동가능하게 연결되어 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입하고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환한 다음, 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 회수한다. 상기 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., MolecularCloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
본 발명은 또한 상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제를 포함하는 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조를 위한 상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제의 용도를 제공한다.
상기 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환은 주의력결핍 과다행동장애(attention deficit hyperactivity disorder, ADHD), 조울증(bipolar disorder), 신체기형성 장애(body dysmorphic disorder), 신경성 폭식증(bulmia nervosa)을 비롯한 섭식장애, 탈력 발작(cataplexy), 기분부전증(dysthymia), 범불안 장애(general anxiety disorder), 과도한 성생활(hypersexuality), 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome), 충동조절장애(impulse-control disorder, MDD), 병적 도벽(kleptomania), 편두통(magraine), 주요 우울장애(major depressive disorder), 기면증(narcolepsy), 강박장애(obsessive-compulsive disorder), 반항장애(oppositional-defiant disorder), 공황장애(panic disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder, PTSD), 월경 전 불쾌 기분장애(premenstrual dysphoric disorder, PMDD), 사회공포증(social anxiety disorder), 만성통증(chronic pain), 간헐적 폭발성 장애(intermittent explosive disorder), 병적도박(pathological gambling), 성격이상(personality disorder), 병적방화(pyromania), 약물남용, 중독(substance abuse and addiction), 발모벽(trichotillomania) 또는 알츠하이머병 중 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 GALR2 효현제는 신경성 폭식증, 섭식장애, 비만 장애, 범불안 장애, 외상후 스트레스 장애, 강박장애, 공황장애, 사회공포증, 약물남용 및 중독, 또는 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 치료 방법을 제공한다.
상기 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 하기에서 후술할 것이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제를 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. GALR2 효현제는 식염수 또는 완충액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 GALR2 효현제를 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물은 뇌 전달을 위한 비강 투여용 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.
따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> 스펙신의 아미노산 서열 치환에 따른 GALR 2형 특이적, 안정적 효현제 개발
GALR 2형에 선택적으로 작용하면서 오래 작용할 수 있는 효현제를 개발하기 위해서 스펙신1, 스펙신2, 갈라닌과 갈라닌 유사 펩타이드의 아미노산 서열을 비교하였다. 아미노산 서열은 Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)에서 내려 받았으며, 이들 아미노산 서열 중 성숙한 서열을 비교하였다. 척추동물내의 다양한 종에 존재하는 갈라닌과 스펙신의 아미노산 서열을 비교하였을 때 대부분 다른 아미노산을 갖고 있지만 갈라닌과 스펙신 모두 2번째 트립토판[Trp2], 9번째 티로신[Tyr9], 10번째 류신[Leu10]과 12번째 글리신[Gly12]을 공통적으로 지님을 확인하였다. 스펙신의 아미노산 서열과 갈라닌의 서열이 같은 경우 D-형 아미노산으로 치환하였고, 스펙신 특이적으로 갈라닌과 서열이 다른 경우 해당 스펙신의 아미노산 서열을 갈라닌의 아미노산으로 바꾸었다. 또한 스펙신의 아미노산 서열을 갈라닌으로 바꾸는 것 이외에도 14개의 스펙신 아미노산 서열 각각을 다른 아미노산 또는 D-형 아미노산으로 치환하였으며 각각의 돌연변이 펩타이드들의 갈라닌 수용체에 대한 활성의 변화를 관찰하였다(도 1 및 도 2).
기존의 문헌들에 따르면 G 단백질-연결 수용체들은 작용제와 결합한 후, 세포 내로 신호전달을 야기하기 위해 기존의 G 단백질의 알파 서브유닛(subunit)에 연결된 GDP(guanosine diphosphate) 형을 GTP(guanosine triphosphate)형으로 치환하는 것으로 알려져 있다. G 단백질은 알파(a), 베타(b), 그리고 감마(g)의 세 가지 서브유닛(subunit)으로 이루어진 이종 삼중체(hetero trimer)이다. 이중 세포 내로의 신호전달에 있어서 가장 주요한 신호는 알파 서브유닛으로부터 발생한다. 예컨대, 알파 서브유닛이 s 형인 경우(Gas)는 세포 내 효소의 하나인 아데닐 사이클라아제(adenyl cyclase)를 활성화 시킴으로써 ATP(adenosine triphosphate)로부터 대표적인 이차전달자(second messenger)인 cyclic AMP(cAMP)를 생산하며, protein kinase A(PKA)를 활성화 시킨다. 반면, i 형인 경우(Gai)는 전술한 아데닐 사이클라아제의 활성을 억제하는 신호를 보낸다. 또 다른 알파 서브유닛인 q/11형의 경우는 세포 내에서 칼슘의 양을 증가시키거나, protein kinase C(PKC)를 활성화 시킨다. 이와 같이, G 단백질-연결 수용체와 G 단백질간의 결합은 수용체 유형에 의존적인 고유한 특성이다. GALR 아형들은 GALR 1, 3형이 억제성 Gi 신호전달체계를 유도하는 반면, GALR 2형은 흥분성 Gq 신호전달체계를 유도한다는 점에서 서로 다르기 때문에 Gq의 C-말단을 Gi의 아미노산 3개로 치환하여 Gi의 신호를 Gq 신호전달 경로로 전환한 HEK293-Gqi 안정 세포주가 사용되었으며 serum responsive element(SRE) 프로모터에 의해 루시퍼레이즈(luciferase, luc)이 발현하도록 하는 SRE-luc 분석 시스템이 수용체의 활성도를 측정하기 위해 사용되었다. luminometor를 사용하면 발현하는 루시퍼레이즈와 기질(substrate)인 루시페린(luciferin)의 반응으로 초래되는 빛을 감지함으로써 수용체 아형 특이적 또는 리간드특이적인 세포활성을 관찰할 수 있다. HEK293-Gqi 세포를 48 well-plate에 계대(2 x 104cells/well)한지 하루 후 GALR 2형 또는 3형을 각각 암호화하는 플라스미드 DNA와 SRE-luc 플라스미드 DNA를 1:1로 섞고{(75 ng + 75 ng)/well} effectene 시약을 혼합(2 ㎕/well)한 용액을 처리하였다. 세 시간 후, 10% FBS가 포함된 DMEM으로 교체해 주었다. 24시간 후 FBS가 없는 DMEM 배지로 교체해 주고, 이로부터 16시간 후 제작한 스펙신 기반 돌연변이 펩타이드를 6시간 동안 37℃에서 추가 배양하였으며, 이 단계가 끝난 세포들은 PBS로 세척한 후 lysis buffer(0.1% triton X-100, 0.2M Tris, pH8.0) 100㎕로 20분간 상온에서 용해되었다. 루시퍼라아제의 활성은 루시페린 용액(0.5M MgCl2, 0.1M ATP, 0.05M D-luciferin, 1M KH2PO4, pH7.8)이 자동적으로 투입되는 synergy 2 Multi-mode microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)로 측정되었다.
도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 스펙신 돌연변이 펩타이드들 중에서 스펙신의 8번째 류신을 글리신[Gly8]으로 치환하였을 때 GALR 2형과 3형 모두에 대한 활성도가 감소하였다. 1번째 아르파라긴을 글리신[Gly1]으로, 4번째 프롤린을 류신[Leu4]으로, 14번째 글루타민을 히스티딘[His14]으로 치환하였을 때 두 수용체에 대한 활성도는 스펙신과 차이 없이 유지되었다. 5번째 글루타민을 아스파라긴[Asn5]으로, 7번째 메티오닌을 알라닌[Ala7]으로, 11번째 리신을 류신[Leu11] 또는 페닐알라닌[Phe11]으로, 13번째 알라닌을 프롤린[Pro13]으로 치환하였을 때 GALR 2형에 대한 활성도에는 변화가 없었으나 GALR 3형에 대한 활성도가 감소하는 것을 볼 수 있었다. 이는 스펙신 아미노산 서열의 5번째 글루타민[Gln5], 7번째 메티오닌[Met7], 11번째 리신[Lys11]과 13번째 알라닌[Ala13]이 GALR 2형을 활성화시키는 것보다는 GALR 3형의 활성화에 중요한 서열이라는 것을 시사한다. 추가적인 검증을 위해서 스펙신 펩타이드의 5, 7, 11, 13번째 서열을 갈라닌의 서열로 치환시킨 다중 돌연변이를 만들었다. 이중 돌연변이(A7F11, 7번째 아미노산을 알라닌[Ala7]으로, 11번째 아미노산을 페닐알라닌[Phe11]으로 치환)와 삼중 돌연변이(N5A7F11, 5번째 아미노산을 아스파라긴[Asn5]으로, 7번째 아미노산을 알라닌[Ala7]으로, 11번째 아미노산을 페닐알라닌[Phe11]으로 치환)의 GALR 3형에 대한 활성도가 매우 감소하였음을 보였으며 이중, 삼중 돌연변이는 10uM의 고농도에서만 GALR 3형을 최대로 활성화시킬 수 있었다. 사중 돌연변이(N5A7F11P13 또는 Qu, 5번째 아미노산을 아스파라긴[Asn5]으로, 7번째 아미노산을 알라닌[Ala7]으로, 11번째 아미노산을 페닐알라닌[Phe11]으로, 13번째 알라닌을 프롤린[Pro13]으로 치환)는 스펙신 수준으로 GALR 2형에 대한 활성도는 남아있으나 3형에 대한 활성도가 완벽하게 사라졌다(도 3, 도 4). 또한, 이러한 갈라닌 아미노산 서열의 스펙신에의 도입은 GALR 1형에 대한 활성도를 유도하지 않는다는 점에서 해당 아미노산들은 GALR 2형을 활성화시키는데 특이적이라고 할 수 있다.
D-형 아미노산서열 치환의 목적은 수용체 활성화에 대해 중요한 서열을 규명하기 위함과 D-형 아미노산이 혈청에 존재하는 다양한 펩타이드 분해효소로부터 펩타이드를 보호하는 역할을 한다는 점에서 D-형 아미노산으로의 변화에 영향을 받지 않는 부분을 규명하기 위함이다. 스펙신의 아미노산 서열 각각이 D-형 아미노산으로 치환된 돌연변이들을 GALR 2형 또는 3형을 발현하는 세포에 처리한 후 활성도를 측정하였다(도 5, 도 6). 돌연변이 중에서 3, 9, 10번째 아미노산이 D-형으로 치환된 경우 GALR 2형, 3형 모두에 대한 활성도를 잃는 것을 보였다. 이는 스펙신의 3, 9, 10번째 아미노산이 갈라닌 수용체 활성화에 중요한 서열이라는 것을 의미한다. 또한 6, 12, 14번째 아미노산의 D-형 치환은 수용체에 대한 활성도가 약간 감소하였다. 2, 4번째 아미노산의 D-형 치환은 수용체에 대한 활성도변화를 아주 조금 보이는데, 이는 스펙신의 두 번째 트립토판[Trp2]과 4번째 알라닌[Ala4]은 GALR 2형과 3형의 활성화에 중요하지 않다는 것을 의미한다. 스펙신의 1번째 아스파라긴[Asn1]의 D-형 치환[dN1]은 GALR 2형, 3형 모두에 대한 활성도가 오히려 약간 증가하는 것으로 보였다(도 5, 도 6). 이러한 변화는 스펙신의 1번째 아미노산 서열을 치환함으로써 혈청 내 펩타이드 분해효소에 안정적인 효현제를 개발할 수 있다는 가능성을 보여준다. 이에 스펙신의 1번째 아스파라긴[Asn1]을 피로글루타메이트(pyroglutamate, pQ), 시트룰린(citrulline, Cit), Fmoc으로 치환하거나 스펙신의 N-말단을 폴리에틸렌 글리콜화(polyethylene glycolylated, PEG) 또는 아세틸화(acetylated) 시켰다. D-형 치환과 유사하게 이러한 변형들은 GALR 2형, 3형에 대한 활성도에 영향을 주지 않았다 (도 5 및 도 6). 이는 스펙신의 1번째 아미노산 서열의 치환이 GALR의 활성도에는 영향을 주지 않으면서 혈청 내 펩타이드 분해효소에 대한 안정성을 증가시킴을 강력히 시사하고 있다.
<실시예 2> 100% 태아혈청에서 GALR 2형 효현제의 안정성 검증
스펙신 기반 돌연변이 펩타이드의 안정성을 조사하기 위해서 변형된 돌연변이 펩타이드들을 초기 농도 10μM로 하여 100% 태아혈청(fetal bovine serum, FBS)내 37℃에서 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72시간 반응시킨 후 GALR 2형에 대한 활성도를 측정하였다. 수용체에 대한 활성도는 GALR 2형을 발현하는 세포에서 IP3 생성정도를 통해 측정되었다. IP3 생성을 확인하기 위해서 세포를 12 well-plate에 계대(2.5×105 cells/well)한지 하루 후 GALR 2형을 암호화하는 플라스미드 DNA 1㎍과 lipofectamine 2000(invitrogen)을 혼합한 용액을 처리하였다. 하루 후 1% FBS, 1% L-글루타민, 1% 항생제와 myo-3H inositol(1uCi/wll)이 포함된 M199 배지에서 20시간 동안 추가 배양하여 이노시톨 인산염(inositol phosphate)를 방사선 표지하였다. 이 단계가 끝난 세포들은 buffer A(140mM NaCl, 20mM Hepes, 4mM KCl, 8mM D-glucose, 1mM MgCl, 1mM CaCl2, 1mg/ml의 유리지방산 함유 우태아 혈청 알부민, 10mM LiCl. pH7.2)에서 30분간 반응시킨 후 100% FBS에서 반응시킨 돌연변이 펩타이드들을 처리하고 37℃에서 40분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 배지를 제거하고, 10mM의 포름산(formic acid)를 1ml 넣어 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 30분간 4℃에 둔 후, 포름산에 의해 추출된 용액을 500㎕의 AG1-8X 음이온 교환 칼럼이 들어있는 6ml 플라스틱 튜브에 옮기고 가볍게 볼텍싱(vortexing)을 하면 상층액과 표지된 혼합물이 분리되는데, 여기에서 상층액을 제거하였다. 1ml의 3차 증류수로 2번씩 씻어낸 후 60mM의 ammonium formate/5mM sodium tetraborate로 두번씩 씻어냈다. 방사선 표지된 혼합물을 1M ammonium formate/0.1M 포름산 1ml로 용출하였다. 이 중 800㎕를 scintillation 튜브에 옮긴 후 2ml의 scintillation 용액(Ultima GoldTM, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)과 섞었다. 방사선 표지된 혼합물과 scintillation 용액이 섞인 혼합용액을 TRI carb 2100TR liquid scintillation analyzer(Packard)로 측정하였다.
그 결과 스펙신의 활성도는 12시간 이내에 80% 이하로 매우 빠르게 감소하였다. 반면, 스펙신의 N-말단을 치환한 펩타이드와 4번째 알라닌의 D-형 치환(dAla4) 돌연변이 펩타이드는 스펙신보다 IP3생성의 감소가 적었다(도 7 및 도 8). 이는 스펙신의 N-말단을 PEG 또는 Fmoc 같은 소수성 분자들로 치환하거나 스펙신의 4번째 알라닌과 14번째 글루타민을 D-형으로 바꾸었을 때 펩타이드의 혈청 내 안정성이 증가한다는 것을 의미한다. 또한, 사중 돌연변이와 사중돌연변이의 N-말단 치환 및 4, 14번째 아미노산을 D-형으로 치환하였을 때 펩타이드의 혈청 내 분해정도를 측정하였다. 사중 돌연변이는 스펙신보다 분해가 빨리 일어났으나 사중 돌연변이의 N-말단의 Fmoc치환, 4, 14번째 아미노산의 D-형 이중치환은 혈청 내에서 펩타이드의 안정성을 높여주는 것으로 나타났다.
<실시예 3> 사중 돌연변이의 갈라닌 수용체에 대한 활성도 측정
실시 예 1의 방법으로 사중 돌연변이 펩타이드를 GALR 2형, 3형을 발현하는 HEK293-Gqi 안정 세포주에 처리하여 SRE-luc 분석 시스템을 통해 수용체의 활성도를 측정하였다.
사중 돌연변이의 N-말단 변형 펩타이드들은 GALR 2형, 3형에 대하여 사중 돌연변이만큼의 활성도를 나타내었다(도 9). 사중돌연변이 변형 펩타이드들의 GALR 3형에 대한 활성도는 10uM의 고농도에서만 나타났다. 결과적으로, 도 8에서 제시한 돌연변이 펩타이드들은 스펙신, 사중 돌연변이만큼 GALR 2형에 특이적으로 작용하며, 혈청 내에서 더욱 안정적으로 유지되는 개선된 GALR 2형의 효현제라고 할 수 있다.
<실시예 4> 비강흡수방식을 통한 뇌 내 전달방법 검증
펩타이드성 약물이 체내에 전달되어 뇌에 작용하기 위해서는 혈액 뇌 장벽(Blood brain barrier, BBB)을 통과할 수 있는 약물 전달 시스템을 도입해야한다. 비강흡수기법을 통하면 혈액 뇌 장벽을 통과하는 소형분자의 개발을 거치지 않고도 약물의 뇌 내 전달이 가능하다. 실제로 비강흡수방식은 옥시토신(oxytocin)의 약물전달방식으로 검증된 바 있으며 옥시토신 주입 후 인간의 뇌 활성에 변화가 유도되었다는 fMRI 결과를 통해 펩타이드성 약물이 뇌에 작용하는 효과를 보다 효율적으로 높일 수 있는 방법으로 기대된다.
스펙신의 뇌 내 전달을 검증하기 위해 스펙신에 형광물질인 FITC를 표지(FITC-스펙신)하여 비강흡수 전달방식 연구에 사용되는 프로필렌 글리콜(propylene glycol)과 조합하여 소듐 펩토바비탈(sodium pentobarbital)(50mg/kg, i.p.)로 마취된 생쥐의 코에 100nM의 농도로 10㎕ 주입하고 3시간 후에 면역조직화학법(immunohistochemistry, IHC)을 통해 FITC 형광신호를 보이는 뇌 영역을 조사하였다. 성체 생쥐에 복강 마취를 실시하고 흉부 가죽을 절개하여 좌심방(left cardiac ventricle)에 링거 바늘을 꽂아 0.9% 생리식염수 50ml로 혈액을 빼낸 후, 50ml의 4% 파라포름알데하이드가 함유된 0.9% 인산완충식염수로 24시간 고정하였고, 30%의 설탕이 함유된 인산완충식염수로 24시간가량 처리하였다. 이후 뇌 조직용 주형(mold)에 놓고 30%의 설탕용액을 포함한 OCT 합성물을 담아 드라이아이스 위에서 차갑게 유지시킨 이소펜탄(isopentane) 용액에 옮겨 얼리고 이용되기 전까지 80℃에서 보관하였다. 보관된 생쥐의 뇌 조직을 냉동미세절단기(crystat microtome)을 이용하여 40㎛로 얇게 절단한 후 면역조직화학법을 실시하였다.
그 결과 FITC-스펙신의 비강흡수방식을 통한 FITC 형광 신호는 식욕을 조절하는 것으로 알려진 궁상핵(arcuate nucleus, ARC) 영역과 정서조절에 관여하는 것으로 알려진 흑질-복측피개영역(substantia nigra-ventral tegmental area, SN-VTA)에서 반점(punctate) 형태로 발견되었다(도 10). 이는 비강흡수방식을 이용한 방법이 펩타이드성 약물의 뇌 내 전달에 이용될 수 있으며 스펙신의 아미노산 서열 치환을 통해 개발한 GALR 2형 효현제가 섭식 및 정서관련 질환 치료제로써 개발될 수 있다는 가능성을 시사하고 있다.
<실시예 5> 개선된 GALR 2형 효현제의 섭식 억제 효과 검증
9주령의 검은 수컷 생쥐(C57BL/6, mouse)는 오리엔트바이오(www.orient.co.kr)로부터 구입하였다. 구입한 생쥐는 사료와 물이 적절히 주어지고 20~24℃로 온도가 유지되며, 40~70%의 습도가 있는 쥐 우리(cage)에서 사육되었다. 또한 이 야생형 생쥐는 빛 개시가 8:00 am이고 빛 꺼짐이 8:00 pm인 12/12 light/dark cycle에서 보관되었다. 모든 실험은 가장 적은 수의 생쥐를 사용하도록 설계되었으며 실험동물윤리에 따라 마취법을 실시하여 실험에 사용된 생쥐의 고통을 최소화하였고, 이는 고려대학교 동물 관리 및 이용 위원회에 의해 증명되었다. 생쥐의 뇌에 도관을 삽입하기 위해서 생쥐를 소듐 펩토바비탈(sodium pentobarbital)(50mg/kg, i.p.)로 마취한 후 스테레오탁식(stereotaxic) 장치에서 26-게이지 케뉼라를 우측 뇌실(ventricle)에 삽입하였다. 작은 나사 두 개를 이용하여 뇌의 두개골에 단단히 고정한 후 치과용 시멘트로 봉합하였다. 2주간의 회복기를 거친 생쥐에 해밀턴 주사기(hamilton syringe)를 이용하여 분당 0.5㎕의 속도로 주입하였다. 식이량의 섭취량과 체중변화는 효현제를 주입하기 전 사료와 생쥐의 무게를 측정하고, 1, 2, 4, 12, 24시간에 걸쳐 사료의 무게를 측정하고 24시간 후의 생쥐의 무게를 측정하여 기존의 무게와의 차이를 비교하였다.
GALR 2형 효현제의 섭식행동 및 체중변화 효과를 검증하기 위해서 제3 뇌실에 도관을 삽입한 후 대조군인 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, acsf) 또는 실험군인 스펙신 3㎍, 그리고 사중 돌연변이의 첫 번째 아미노산을 D-형으로 치환하여 안정성을 높인 펩타이드(dN1-Qu) 3㎍을 주입한 후 24시간 동안의 체중과 식이량의 변화를 비교하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 GALR 2형의 효현제를 주입한 쥐가 스펙신을 주입한 쥐보다 시간이 지남에 따라 식이섭취가 유의하게 감소함을 보였고 체중의 감소효과를 유도한다는 것을 알 수 있었다(도 11). 이는 개선된 GALR 2형 효현제가 섭식 행동을 억제하여 비만을 치료할 수 있는 약물로써 사용될 수 있음을 시사하고 있다.
<실시예 6> 불안장애 극복을 위한 효현제의 효능 측정
불안장애 극복에 대한 GALR 2형 효현제의 효과를 검증하기 위해서 실시예 5의 방법으로 생쥐의 측뇌실에 도관을 삽입하고 대조군인 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO)또는 실험군인 1mM의 dN1-Qu 0.5ul를 주입한 후 불안/강박도를 측정하는 EPM 검사법(elevated plus maze test)을 시행하였다. EPM 검사법은 닫힌 부분(closed arm)과 열린 부분(open arm)으로 구성된 십자형 높은 미로를 사용하여 닫힌 부분을 선호하는 쥐의 성질을 이용한 방법으로 열린 부분에 많이 나갈수록 불안도가 낮음을 이용한 검사법이다. 쥐를 plus maze에 올려놓은 후 15분 동안 열린 부분에 있는 시간(time in open arm), 횟수(number of open arm entry)와 전체 움직임(number of center crossing)을 측정하고, 후반의 10분을 결과 분석에 사용하였다.
그 결과 dN1-Qu의 주입에 의해 전체 움직임에는 차이가 없으나 열린 부분에 머무는 시간과 열린 부분에 들어가는 횟수가 증가함을 통해 불안도가 감소함을 보였다(도 12).
또한, 이러한 불안도 감소 효과를 활동성 및 불안효과를 동시에 측정하는 OFT 검사법(open field test)을 통해 검증하였다. OFT는 네모난 영역에서 생쥐가 중앙보다 주변부에 머무르는 행동을 이용한 검사법이다. 생쥐를 네모난 영역의 중앙에 내려놓고, 주변부로 이동한 순간부터 10분 동안 중앙부에 들어간 비율 (%time in center), 전체 움직임 중 중앙에서 움직인 거리의 비율(% distance in center)과 전체 움직임(total distance)을 측정하여 초반과 후반의 5분을 나누어 분석에 사용하였다. 대조군과 반복된 전기충격을 통해 불안도 증가를 유도한 쥐의 측뇌실에 DMSO 또는 dN1-Qu를 주입한 후 불안도와 활동성을 측정하였다. 초반 5분 구간에서 불안이 유도된 쥐에서 대조군인 DMSO에 비해 전체 움직임에는 차이가 없으나 dN1-Qu 주입에 의한 중앙으로의 움직임이 증가하는 것을 통해 불안도가 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한, 후반 5분 구간에서 불안이 유도한 후 DMSO를 주입한 쥐에서 불안도가 증가하는 것과는 대조적으로 dN1-Qu주입에 의한 중앙에서의 움직임이 증가함을 통해 불안도 감소 효과를 검증할 수 있었다(도 13). 이는 GALR 2형 효현제의 불안장애 치료를 위한 약물로써의 사용 가능성을 시사한다.
<실시예 7> GALR 2형 효현제의 중독성감소 효능 검증
GALR 2형 효현제의 중독성 감소 효과를 검증하기 위하여 실시 예 5의 방법으로 생쥐의 측뇌실에 도관을 삽입하고 DMSO와 1mM의 dN1-Qu 0.5ul를 주사한 후 중독성을 측정할 수 있는 SPT 검사법(sucrose preference test)을 통해 2일 동안의 물소비량과 1% 설탕물 소비량을 측정하였다. 물통에 물과 설탕물을 각각 담고 효현제 주사전의 무게를 측정한 뒤, 2일간 자유롭게 액체를 소비할 수 있도록 한 후 2일 후 물통의 무게를 측정하여 전체 액체 소비량과 전체 액체 중 설탕물 소비의 비율을 비교하는 방법을 이용하였다.
그 결과 2일간의 측정 결과 전체 액체 소비량에는 차이가 없으나 대조군의 경우에는 전체 액체 소비량 중 70%정도를 설탕물로 소비하는 반면, dN1-Qu를 주입하였을 때는 전체 액체소비량 대비 설탕물의 소비량이 60%이하로 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 설탕물의 소비량만을 비교하였을 때 dN1-Qu를 주입하면 설탕물의 소비량이 현저히 감소해있는 것을 알 수 있었다(도 14). 이는 단성분에 대한 중독성이 dN1-Qu 주입에 의해 감소해있는 것을 의미한다. 한편으로 설탕물을 에너지원으로 인식한다고 보았을 때, 설탕물 소비량의 감소는 식욕 또는 섭식 행동의 감소를 의미한다고 볼 수도 있다. 따라서, 중독에 대한 치료제 및 섭식장애 치료제로써의 GALR 2형 효현제의 용도를 시사하고 있다.
<110> Korea University Research and Business Foundation
<120> Spexin-based GALR2 agonists and use thereof
<130> P15U15C1070
<140> 10-2015-0168555
<141> 2015-11-30
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GALR2 agonists
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(14)
<223> 1st N is dN. 2nd W may be substitutued with dW or 2-naphtyl. 3rd
T may be substitutued with A or K. 4th P may be substitutued with
dA or dV. 5th N may be substitutued with Q. 6th A may be
substitutued with dA. 7th A may be substitutued with M. 11th F
may be substitutued with K, L or Y. 03th P may be substitutued
with dA or A. 14th Q may be substitutued with dQ or H.
<400> 1
Asn Trp Thr Pro Asn Ala Ala Leu Tyr Leu Phe Gly Pro Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GALR2 agonist
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(14)
<223> 1st N is dN.
<400> 2
Asn Trp Thr Pro Asn Ala Ala Leu Tyr Leu Phe Gly Pro Gln
1 5 10
Claims (6)
- 하기 식 1로 표시되는 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체(GALR2)의 효현제로서 상기 갈라닌 2형 수용체(GALR2)의 효현제는 갈라닌 1형 수용체(GALR1) 및 갈라닌 3형 수용체(GALR3)는 활성화하지 않고, 갈라닌 2형 수용체(GALR2)를 특이적으로 활성화하는 것인, 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체(GALR2)의 효현제:
[식 1]
[dN]1[W]2[T]3[P]4[N]5[A]6[A]7[L]8[Y]9[L]10[F]11[G]12[P]13[Q]14-NH2
상기 식 1에서,
[dN]1은 D형 아스파라긴을 나타내고, 피로글루타메이트(pQ), 시트룰린(Cit), L형 아스파라긴(N), 또는 글리신(G) 중 어느 하나로 치환되거나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아세틸기(Ac), 또는 Fmoc 중 어느 하나가 결합된 아스파라긴으로 치환될 수 있으며,
[W]2는 D형 트립토판(dW) 또는 2-나프틸(2-Naphtyl)기로 치환될 수 있고,
[T]3는 A(알라닌), 또는 K(리신)로 치환될 수 있으며,
[P]4는 D형 알라닌(dA), 또는 D형 발린(dV)으로 치환될 수 있고,
[N]5은 Q(글루타민)로 치환될 수 있으며,
[A]6는 D형 알라닌(dA)로 치환될 수 있고,
[P]13는 D형 알라닌(dA), 또는 A(알라닌)로 치환될 수 있으며,
[Q]14는 D형 글루타민(dQ), 또는 H(히스티딘)로 치환될 수 있고,
상기 식 1에서 아미노산의 치환은 단일 또는 복수 개로 치환될 수 있고, 이때, [A]7 및 [F]11은 치환되지 않는다.
- 제1항에 있어서,
상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체(GALR2)의 효현제는 [N]5가 치환되지 않은 것인, 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체(GALR2)의 효현제.
- 제2항에 있어서,
상기 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체(GALR2)의 효현제는 [P]13이 치환되지 않은 것인, 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체(GALR2)의 효현제.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드계 갈라닌 2형 수용체의 효현제를 포함하는, 주의력결핍 과다행동장애(attention deficit hyperactivity disorder, ADHD), 조울증(bipolar disorder), 신체기형성 장애(body dysmorphic disorder), 신경성 폭식증(bulmia nervosa)을 비롯한 섭식장애, 탈력 발작(cataplexy), 기분부전증(dysthymia), 범불안 장애(general anxiety disorder), 과도한 성생활(hypersexuality), 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome), 충동조절장애(impulse-control disorder, MDD), 병적 도벽(kleptomania), 편두통(magraine), 주요 우울장애(major depressive disorder), 기면증(narcolepsy), 강박장애(obsessive-compulsive disorder), 반항장애(oppositional-defiant disorder), 공황장애(panic disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder, PTSD), 월경 전 불쾌 기분장애(premenstrual dysphoric disorder, PMDD), 사회공포증(social anxiety disorder), 만성통증(chronic pain), 간헐적 폭발성 장애(intermittent explosive disorder), 병적도박(pathological gambling), 성격이상(personality disorder), 병적방화(pyromania), 약물남용, 중독(substance abuse and addiction), 발모벽(trichotillomania) 및 알츠하이머병 중 어느 하나의 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 제4항에 있어서,
조성물은 뇌 전달을 위한 비강 투여용 제형으로 제조되는, 갈라닌 2형 수용체에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
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