KR101872264B1

KR101872264B1 - 신규한 유형의 시티딘 유도체 이량체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101872264B1
Application number: KR1020177015267A
Authority: KR
Inventors: 다리아 양; 하이동 왕; 후이쥐엔 왕
Original assignee: 창저우 팡위안 파마수티컬 코., 엘티디; 이너 몽골리아 푸인 파마수티컬 코., 엘티디.
Priority date: 2014-11-17
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2035-06-10
Also published as: CN107513089A; CN107513089B; US20180105550A1; EP3216799A1; RU2017120032A; WO2016078163A1; CN106146584A; CA2966709A1; EP3369740B1; US10351586B2; US20160137684A1; RU2017120032A3; EP3369740A1; AU2015349306A1; RU2687252C2; DE202015009594U1; AU2015349306B2; JP2017533940A; EP3216799A4; CN106146584B

Abstract

일반 화학식 I을 갖는 신규한 유형의 시티딘 유도체 이량체 및 그의 용도가 개시되어 있다. 시티딘 화합물의 최적화된 분자 설계에 의해, 본 발명의 시티딘 유도체 이량체는 인간 결장암 HCT-116 종양 세포에 대하여 유의한 억제 효과를 가짐과 동시에, 누드 마우스가 보유하고 있는 이식된 인간 결장암 HCT-116 종양에 대하여 강력한 성장 억제 효과를 가지며; 본 발명의 신규한 유형의 시티딘 유도체 이량체 화합물은 매우 높은 항종양 활성을 가지며, 반면에 화합물의 독성은 낮다.
<화학식 I>

Description

신규한 유형의 시티딘 유도체 이량체 및 그의 용도 {NEW TYPE OF CYTIDINE DERIVATIVE DIMER AND APPLICATION THEREOF}

본 발명은 항종양 화합물에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 신규한 시티딘 유도체 이량체 및 그의 용도에 관한 것이다.

암은 인간의 건강을 위협하는 흔한 질환 중 하나이다. 암의 사망률은 다른 질환들 중에서도 최상위를 차지한다. 화학요법에서 현재 이용가능한 임상용 항종양 약물은 현저한 독성 문제에 직면하였다. 최근에, 항종양 약물에 대한 중요한 연구 주제는 약물의 독성을 감소시킴과 동시에 치료 효과를 개선하는 것이다.

기존의 시티딘 화합물은 혈액 종양의 치료에 주로 사용된다. 특정 시티딘 화합물은 또한 고형 종양을 위해서도 사용된다. 그러나, 고 독성, 좁은 범주의 용도 및 미약한 치료 효과 때문에 문제가 발생한다. 게다가, 인체가 기존의 시티딘 화합물에 대하여 약물 내성을 유발하기 쉬워, 치료 실패 및 종양 재발을 초래한다.

본 발명이 해결하려는 기술적 과제는 고 효능, 고 항종양 활성 및 저 독성을 갖는 신규한 시티딘 유도체 이량체 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 기술적 해결책은 하기 화학식 I을 갖는 신규한 시티딘 유도체 이량체를 포함한다.

<화학식 I>

상기 식에서, R1은 C₁-C₁₀ 알킬, C₁-C₁₀ 치환된 알킬, -(CH₂)_n-Ph, 또는 치환된 -(CH₂)_n-Ph이다. -(CH₂)_n-Ph에서, n은 0, 1, 2, 3~10이고, Ph는 페닐이다. 치환된 알킬의 탄소 쇄는 1개, 2개, 또는 3개의 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기에 의해 독립적으로 치환된다. 치환된 -(CH₂)_n-Ph에서, n은 0, 1, 2, 3~10이고, 그의 탄소 쇄 또는 페닐 고리는 1개, 2개, 또는 3개의 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기에 의해 독립적으로 치환된다. R1은 바람직하게는 C₁-C₁₀ 알킬 또는 -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 3~10임)이고; 보다 바람직하게는 C₁-C₄ 알킬 또는 -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 3임)이며; 보다 더욱 바람직하게는 n-부틸 또는 벤질이다.

R2는 C₁-C₁₀ 알킬, C₁-C₁₀ 치환된 알킬, -(CH₂)_n-Ph, 또는 치환된 -(CH₂)_n-Ph이다. -(CH₂)_n-Ph에서, n은 0, 1, 2, 3~10이다. 치환된 알킬의 탄소 쇄는 1개, 2개, 또는 3개의 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기에 의해 독립적으로 치환된다. 치환된 -(CH₂)_n-Ph에서, n은 0, 1, 2, 3~10이고, 그의 탄소 쇄 또는 페닐 고리는 1개, 2개, 또는 3개의 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기에 의해 독립적으로 치환된다. R2는 바람직하게는 C₁-C₁₀ 알킬 또는 -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 3~10임)이고; 보다 바람직하게는 C₁-C₄ 알킬 또는 -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 3임)이며; 보다 더욱 바람직하게는 n-부틸 또는 벤질이다.

보다 바람직한 선택은 R1과 R2가 동일한 것이다.

R3은 수소, 알콕시카르보닐 또는 치환된 알콕시카르보닐이고, 여기서 치환된 알콕시카르보닐의 치환기는 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기이다. R3은 바람직하게는 H 또는 알콕시카르보닐이고; 보다 바람직하게는 H 또는 n-부톡시카르보닐이다.

R4는 수소, 알콕시카르보닐 또는 치환된 알콕시카르보닐이고, 여기서 치환된 알콕시카르보닐의 치환기는 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기이다. R4는 바람직하게는 H 또는 알콕시카르보닐이고; 보다 바람직하게는 H 또는 n-부톡시카르보닐이다.

보다 바람직한 선택은 R3과 R4가 둘 다 수소인 것이다.

R5는 -(CH₂)_n-이며, 여기서 n은 1 내지 15이거나; 또는 그의 탄소 쇄에 치환기를 갖는 치환된 -(CH₂)_n-이며, 여기서 치환기는 페닐 기, 치환된 페닐 기, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 카르복실 기이거나; 또는 -(CH₂)_n-X₁-X₂-이다. -(CH₂)_n-X₁-X₂-에서, n은 0, 1, 2, 또는 3이고, X₁은 O 또는 S이고, X₂는 -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 또는 3임)이거나; 또는 X₂는 피리미딜, 피라닐, 이미다졸릴, 피라지닐, 또는 피리딜이다. R5는 바람직하게는 -(CH₂)_n- (여기서 n은 1 내지 15임), 또는 -(CH₂)_n-X₁-X₂- (여기서 n은 0, 1, 2, 또는 3이고, X₁이 O 또는 S이고, X₂가 Ph임)이고; 보다 바람직하게는 -(CH₂)_n- (여기서 n은 1 내지 5임), 또는 -(CH₂)-O-Ph-이며; 보다 더욱 바람직하게는 -(CH₂)₂- 또는 -(CH₂)₃-이다.

상기에 언급된 신규한 시티딘 유도체 이량체 또는 그의 염 형태의 종양 억제 약물의 제조에 있어서의 용도가 제공된다.

종양은 혈액 종양 또는 악성 고형 종양이다.

제약 조성물은 활성 성분으로서의 화학식 I로 표시되는 시티딘 유도체 이량체 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 의약 담체 또는 부형제 중 1종 이상을 포함한다.

조성물의 형태는 주사 형태 또는 경구 투여 형태이다. 경구 투여 형태는 정제, 분말제, 과립제, 캡슐제, 펠렛 제제, 용액제, 현탁액제, 에멀젼제, 시럽제 또는 엘릭시르제를 포함하고; 주사 형태는 용액형 주사제, 현탁액형 주사제, 에멀젼형 주사제, 또는 주사용 멸균 분말제를 포함한다.

상기에 언급된 신규한 시티딘 유도체 이량체의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다.

(1) 일반 화학식 II를 갖는 화합물을 제조한다.

<화학식 II>

(2) 일반 화학식 III을 갖는 화합물을 제조한다.

<화학식 III>

(3) 일반 화학식 II를 갖는 화합물을 탄산나트륨과 혼합하여 1,4-디옥산 및 물을 포함하는 시스템에 첨가한다. (Boc)₂O를 추가로 첨가하여 반응시킨다. TLC (박층 크로마토그래피) 측정에 따라 반응이 완료된 것으로 측정될 때, 반응 생성물을 추출하고 세척하여 건조시킨 다음, 감압 하에 농축 건조시킨다. 트리클로로메탄 (즉, 클로로포름)에 건조된 화합물을 첨가하고, 피리딘 및 이무수물 R₅(CO)₂O를 첨가하여 밤새 반응시키고; 반응 생성물을 농축시켜 점성 오일을 수득한다. 점성 오일을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 일반 화학식 IV를 갖는 화합물을 수득한다.

<화학식 IV>

(4) 일반 화학식 IV를 갖는 수득 화합물, 일반 화학식 III을 갖는 수득 화합물, 및 DCC를 혼합한 후에, 혼합물을 디클로로메탄에 첨가하고, DMAP를 첨가한다. TLC 측정에 따라 반응이 완료된 것으로 측정될 때, 반응 생성물을 세척하고 건조시키고 농축시켜 건조 화합물을 형성한다. 그 후에 TFA 및 DCM을 첨가하고, 실온에서 교반한다. 얼음조에서 냉각시킨 후에, 백색 고형물을 여과한다. 여과물을 농축시켜 점성 오일을 수득하고, 이것을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 수득한다.

본 발명은 또한 암의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포유동물, 특히 인간을 비롯한, 종양을 앓고 있는 대상체의 치료를 목표로 한다. 치료 유효 용량의 신규 화합물 I을 일정 기간에 걸쳐서 대상체에게 투여하면 항종양 효과가 발생한다.

가장 포괄적인 정의에 의하면, 암은 일반적으로 정상 조직과 상이한 속도로 성장하는 비정상 조직으로서, 자극의 유도가 중단된 후에도 동일한 방식으로 계속해서 과성장하는 악성 신생물을 말한다. 또한, 이러한 비정상 조직은 목적이 없으며, 숙주로부터 영양분을 흡수하고, 거의 자율성을 띤다. 암은 또한 악성 종양이라고도 지칭할 수 있다. 신생물에 대한 자세한 고찰은 문헌 [Robbins Pathologic Basis of Disease, sixth edition, by RS Cotran, V. Kumar, and T. Collins RS Cotran] (WB Saunders Company 발행)의 챕터 8에서 찾아볼 수 있다. 상기 문헌의 챕터 8의 정보는 본원에 참조로 포함된다. 암 유형의 예, 예컨대 악성 종양 또는 신생물이 개시된 화합물의 투여에 의해 치료가능하다.

개시된 신규 화합물은 백혈병 및 고형 종양을 비롯한 신생물의 치료에 효과적이다. 고형 종양은 대장, 결장, 직장, 난소, 유방, 전립선, 폐, 신장 종양 및 흑색종을 포함한다. 약물 투여량의 범위는 투여 경로, 및 환자의 연령, 체중 및 상태에 따라 달라진다. 화합물의 투여 경로는 근육내 주사, 정맥내 주사, 또는 정맥 주사를 비롯한 비경구 경로일 수 있다.

본원에 사용된 환자 또는 대상체는 암 또는 다른 질환을 갖는 척추동물이다. 바람직하게는, 대상체는 온혈 동물, 특히 인간 및 비-인간 포유동물을 둘 다 포함하는 포유동물이다. 비-인간 포유동물의 예는 가축, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소, 말 및 라마, 및 애완동물, 예컨대 개 및 고양이를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 보다 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 본 발명은 치료 유효 용량의 화합물을 일정 기간에 걸쳐서 대상체에게 투여함으로써 항종양 효과를 달성한다.

인간을 포함하는 포유동물의 경우, 유효 용량은 체표면적에 따라 결정될 수 있다. 문헌 [Cancer Chemother. Rep., 50 (4): 219 (1966), E. J. Freireich et al.]에 동물 및 인간의 사이즈 및 유형에 따라 용량이 달라지는 관계가 설명되어 있다 (체표면적 기준 mg/m²). 체표면적은 대략 개체의 키 및 체중에 따라 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scientific Tables, Geigy harmaceuticals, Ardsley, N.Y. pp. 537-538 (1970)] 참조). 적합한 투여량 범위는 제곱 미터의 체표면적 당 1 내지 1000 mg의 개시된 화합물일 수 있다. 즉, 용량은 50-500 mg/m²이다.

본 발명은 다수의 유리한 효과를 갖는다: (1) 시티딘계 화합물의 분자 설계 최적화에 의해 제조된 본 발명의 신규한 시티딘 유도체 이량체는 HCT-116 인간 결장 암 세포에 대하여 유의한 억제 효과를 나타내고, 또한 누드 마우스에서 성장하는 HCT-116 인간 결장 암 이종이식편에 대하여 강력한 성장 억제 효과를 나타내며; 개시된 신규한 시티딘 유도체 이량체는 저 독성으로 고 항종양 활성을 제공한다.

도 1은 실시예 1에서의 시티딘 유도체 이량체의 합성 경로를 도해하고, 도면에서 TBSCl은 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드이고, pyr은 피리딘이며, DCM은 디클로로메탄이며, rt는 실온이며, 부틸 카르보노클로리데이트는 부틸 클로로포르메이트이며, HF.Et₃N은 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드이며, overnight는 밤새이며, DCC는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드이며, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘이다.
도 2는 실시예 2에서의 시티딘 유도체 이량체의 합성 경로를 도해하고, 도면에서 HMDS는 헥사메틸디실라잔이고, reflux는 환류이며, chloridate는 클로리데이트이며, TEA는 트리에틸아민이며, (Boc)₂O는 디-tert-부틸 디카르보네이트이며, 디옥산은 1,4-디옥산이며, succinic anhydride는 숙신산 무수물이며, pyr은 피리딘이며, DCC는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드이며, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘이며, TFA는 트리플루오로아세트산이며, DCM은 디클로로메탄이다.
도 3은 실시예 3에서의 시티딘 유도체 이량체의 합성 경로를 도해하고, 도면에서 HMDS는 헥사메틸디실라잔이고, reflux는 환류이며, chloridate는 클로리데이트이며, TEA는 트리에틸아민이며, (Boc)₂O는 디-tert-부틸 디카르보네이트이며, 디옥산은 1,4-디옥산이며, Glutaric anhydride는 글루타르산 무수물이며, pyr은 피리딘이며, DCC는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드이며, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘이며, TFA는 트리플루오로아세트산이며, DCM은 디클로로메탄이다.
도 4는 실시예 4에서의 시티딘 유도체 이량체의 합성 경로를 도해하고, 도면에서 DCC는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드이고, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘이며, TFA는 트리플루오로아세트산이며, DCM은 디클로로메탄이다.
도 5는 적용예 1에서 50 nM, 150 nM, 및 450 nM의 농도로 4종의 화합물로 처리된 HCT-116 인간 결장 암 세포의 세포 클론 형성 억제율을 도해하는 막대 그래프이다.
도 6은 적용예 1에서 4종의 화합물로 처리된 HCT-116 인간 결장 암 세포에 대한 화합물 농도와 억제율 사이의 용량-반응 관계를 도해하는 곡선 그래프이다.

본 발명은 화학식 I의 구조식을 갖는 시티딘 유도체 이량체를 개시한다.

<화학식 I>

상기 식에서, R1은 C₁-C₁₀ 알킬, C₁-C₁₀ 치환된 알킬, -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 3~10임), 또는 치환된 -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 3~10이고 Ph는 페닐임)이다. 치환된 알킬의 탄소 쇄는 1개, 2개, 또는 3개의 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기에 의해 독립적으로 치환된다. 치환된 -(CH₂)_n-Ph의 탄소 쇄 또는 페닐 고리는 1개, 2개, 또는 3개의 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기에 의해 독립적으로 치환된다.

R2는 C₁-C₁₀ 알킬, C₁-C₁₀ 치환된 알킬, -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 3~10임), 또는 치환된 -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 3~10이고 Ph는 페닐임)이다. 치환된 알킬의 탄소 쇄는 1개, 2개, 또는 3개의 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기에 의해 독립적으로 치환된다. 치환된 -(CH₂)_n-Ph의 탄소 쇄 또는 페닐 고리는 1개, 2개, 또는 3개의 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기에 의해 독립적으로 치환된다.

R3은 수소, 알콕시카르보닐, 또는 치환된 알콕시카르보닐이다. 치환된 알콕시카르보닐의 치환기는 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기이다.

R4는 수소, 알콕시카르보닐, 또는 치환된 알콕시카르보닐이다. 치환된 알콕시카르보닐의 치환기는 할로겐, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기이다.

R5는 -(CH₂)_n-이며 n은 1 내지 15이다. 또는 R5는 치환된 -(CH₂)_n-이며, 그의 치환기는 페닐 기, 시아노 기, 니트로 기, 아미노 기, 히드록실 기, 또는 카르복실 기이다. 대안으로, R5는 -(CH₂)_n-X₁-X₂-이고, 여기서 n은 0, 1, 2, 또는 3이고, X₁은 O 또는 S이고, X₂는 -(CH₂)_n-Ph (여기서 n은 0, 1, 2, 또는 3임)이거나, 또는 X₂는 피리미딜, 피라닐, 또는 피리딜이다.

본 발명의 시티딘 유도체 이량체와 관련하여, 표 1에 하기 화합물이 나열되어 있다. 그러나, 본 발명의 시티딘 유도체 이량체가 이들 화합물로 제한되지는 않는다.

<표 1> 시티딘 유도체 이량체의 예시 화합물

상기 표의 화합물을 제조할 때, 합성 방법에 사용되는 고형 시약은 추가 처리 없이 그대로 사용되고, 액상 시약은 재증류 및 건조 후에 사용된다.

(실시예 1)

본 실시예의 시티딘 유도체 이량체는 하기 구조식을 갖는 1,5-디-[4-N-(n-부틸옥시카르보닐)-3'-O-(n-부톡시카르보닐)-2'-데옥시-2',2'-디플루오로-시티딘]글루타레이트 (코드명 D1, 표 1의 번호 101)이다.

D1의 합성 경로가 도 1에 도시되어 있으며, 상세한 제조 방법은 하기와 같다.

2'-데옥시-2',2'-디플루오로-시티딘 히드로클로라이드 (3 g, 10 mmol) 및 이미다졸 (0.875 g, 12.8 mmol)을 10 mL의 무수 피리딘에 첨가하고, 얼음조에서 냉각시키고, 0℃에서 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (3.3 g, 21 mmol, tert-부틸디메틸실릴 클로라이드는 하기에서 TBSCl이라 축약됨)를 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 실온으로 가온시키고, 12시간 동안 계속 반응시켰다. 혼합물을 메탄올 (8.0 mL)로 처리하였다. 60분 동안 교반한 후에, 용매를 감압 하에 제거하여 화합물 2를 수득하였다. 반응 시스템에 디클로로메탄 (DCM) (50 mL) 및 피리딘 (10 mL)을 추가로 첨가하고, 부틸 클로로포르메이트 (5.46 g, 40 mmol)를 얼음조에서 질소 보호 하에 추가로 첨가하였다. 반응을 위해 이 용액을 12시간 동안 실온에서 교반한 다음, 회전 건조시켜 침강된 고형물을 남겼다. 침강된 고형물을 에틸 아세테이트 (100 mL)에 용해시키고, 냉각된 포화 중탄산나트륨 용액 (30 mL x 2) 및 농축 염수 (30 mL)로 세척하였다. 생성 용액을 무수 황산나트륨 상에서 3시간 동안 건조시킨 다음 여과하였다. 여과물을 컬럼 크로마토그래피 (40:1의 디클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 중간체 화합물 3 (3.6 g, 2단계 수율: 62%)을 수득하였다.

화합물 3 (3.6 g, 6.23 mmol)을 40 mL의 테트라히드로푸란 (THF)에 첨가하고 얼음조에서 0℃로 냉각시켰다. 4 mL의 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (HF.Et₃N)를 서서히 첨가하였다. 24시간의 반응 후에, 용매를 진공에서 회전 건조시켜 오렌지색 고형물을 수득하고, 이것을 컬럼 크로마토그래피 (20:1의 디클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 중간체 화합물 4 (1.68 g, 수율: 58%)를 제공하였다.

30 mL의 클로로포름에 중간체 화합물 4 (1.68 g, 3.62 mmol)를 첨가하고, 피리딘 (30 mL)을 첨가하고, 추가로 글루타르산 무수물 (620 mg, 5.44 mmol)을 첨가하여 교반하면서 밤새 반응시켰다. 그 후에, 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 7 mg, 0.057 mmol)을 추가로 첨가하고 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음, 농축시켜 점성 오일 생성물을 제공하였고, 이것을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 5 (1.11 g, 수율: 53%)를 수득하였다.

화합물 5 (58 mg, 0.1 mmol), 화합물 4 (92 mg, 0.2 mmol), 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 42 mg, 0.2 mmol)를 혼합하고, 디클로로메탄 (15 mL)에 첨가하고, DMAP (6 mg, 0.049 mmol)를 추가로 첨가하여, 24시간 동안 교반하면서 24℃에서 반응시켰다. TLC 측정에 따라 반응이 완료된 것으로 측정될 때, 혼합물에 디클로로메탄 (50 mL)을 첨가하고, 물 (10 mL) 및 포화 염수 (20 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (20:1의 디클로로메탄/메탄올)를 수행하여 화합물 6 (49 mg, 수율: 48%)을 제공하였다.

¹H-NMR(MeOD-d4, 400MHz) δ: 7.97(d, 2H, J=7.68Hz, H6-1, H6-2), 7.40(d, 2H, J=7.68Hz, H5-1, H5-2), 6.35(t, 2H, J=7.24Hz, H1'-1, H1'-2), 4.47(m, 6H, H5a'-1, H5a'-2, H5b'-1, H5b'-2, H4'-1, H4'-2), 4.21(m, 8H, O-CH2x4), 2.53(t, 4H, J=7.16Hz, CH2-CH2-CH2), 1.97(m, 2H, CH2-CH2-CH2), 1.64(m, 8H, O-CH2-CH2x4), 1.42(m, 8H, O-CH2-CH2-CH2x4), 0.98(m, 12H, CH2-CH3x4).

¹³C NMR(MeOD-d4, 100MHz) δ: 172.83, 164.51, 153.87, 144.53, 96.26, 77.52, 69.13, 65.89, 61.94, 32.42, 30.66, 30.47, 18.83, 18.67, 12.79, 12.74, 8.48.

ESIMS: C43H58F4N6O18에 대한 계산치 m/z 1023.37 (M+H)+, 실측치 1023.66.

글루타르산 무수물을 또 다른 무수물로 대체함으로써 상기에 언급된 합성 경로를 조정하여, 표 1에 나타나 있는 화합물 번호 102 내지 105를 제조할 수 있었다. 부틸 클로로포르메이트를 tert-부틸 클로로포르메이트로 대체하여, 표 1의 화합물 번호 106을 제조할 수 있었다.

(실시예 2)

본 실시예의 시티딘 유도체 이량체는 하기 구조식을 갖는 1,5-디-[4-N-(n-부톡시카르보닐)-2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘]글루타레이트 (코드명 D2, 표 1의 번호 107)이다.

중간체 화합물 8이 먼저 제조되는데, 반응 방법이 도 2에 도시되어 있으며, 제조 방법은 하기와 같다.

2'-데옥시-2',2'-디플루오로-시티딘 히드로클로라이드 (구조식 1, 300 mg, 1 mmol), 비스(트리메틸실릴)아민 HMDS (5 mL, 0.023 mmol), 및 촉매량 5 mg의 황산암모늄을 1,4-디옥산 (5 mL)에 용해시켰다. 반응물을 환류 하에 2시간 동안 가열하였고 반응 생성물이 화학 구조식 19를 가졌다. 환류 하에 반응이 완료된 후에, 반응 용액을 농축시키고, 톨루엔을 첨가하고, 2회 농축 건조시켰다. 농축 후에 그에 따른 생성물을 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시켰다.

N-메틸이미다졸 (0.24 mL, 3 mmol) 및 부틸 클로로포르메이트 (0.32 mL, 3 mmol)를 상기에 언급된 디클로로메탄 용액에 첨가하여, 4시간 동안 교반하면서 실온에서 반응시켰다. 그 후에 반응 용액을 농축시켜 점성 오일 생성물을 제공하였다.

상기에 언급된 점성 오일 생성물을 트리에틸아민 (3 mL)과 메탄올 (20 mL)의 혼합 용액에 용해시키고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증류하여 제거하고, 조 생성물을 디클로로메탄/메탄올 (20:1)을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 230 mg의 화합물 7을 제공하였다. 3단계 수율은 55.5%였다.

화합물 7의 핵자기공명 특징화:

¹H-NMR (MeOD-d₄, 400MHz) δ: 8.30(d, 1H, J=7.68Hz, H6), 7.34(d, 1H, J=7.68Hz, H5), 6.28(t, 1H, J=7.08Hz, H1'), 4.33(m, 1H, H5a'), 4.0(m, 2H, O-CH₂-CH₂-), 3.81(m, 1H, H5b'), 3.79(m, 1H, H4'), 1.68(m, 2H, O-CH₂-CH₂-), 1.45(m, 2H, O-CH₂-CH₂-CH₂), 0.98(t, 3H, J=7.4Hz, -CH₂-CH₃).

¹³C-NMR(MeOD-d₄, 100MHz) δ 164.28, 156.27, 153.50, 144.39, 128.33, 122.72, 95.81, 84.90, 81.71, 74.87, 68.88, 63.69, 59.15, 30.66, 32.40, 18.81, 11.23, 8.06.

화합물 7 (60 mg, 0.16 mmol)과 탄산나트륨 (106 mg, 1 mmol)을 혼합하여, 1,4-디옥산과 물의 용액 (4:1의 부피비) 5 mL에 첨가하였다. 디-tert-부틸 디카르보네이트 (Boc)₂O (44 mg, 0.2 mmol)를 용액에 첨가한 다음, 24℃에서 교반하여 반응시켰다. 반응 동안에, TLC를 사용하여 화합물 7이 완전히 반응하였는지를 측정하였다. 반응이 완료된 후에, 반응 후의 시스템을 물 (2 mL)로 희석시키고, 각각 30 mL 부피의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 추출로부터 수득된 유기 상을 물 (5 mL) 및 포화 염수 (5 mL)로 순차적으로 세척하고, 세척이 완료된 후에 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 이어서 감압 하에 농축 건조시켰다. 농축 후에 생성된 생성물을 디클로로메탄/아세톤/메탄올 (1:1:0.02)을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 51 mg의 화합물 8을 제공하였다. 상기 반응의 수율은 76%였다.

D2의 합성 경로가 도 2에 도시되어 있으며, 제조 방법은 하기와 같다.

수득된 화합물 8 (223 mg, 0.25 mmol)을 클로로포름 (6 mL)에 용해시키고, 피리딘 (5 mL)을 첨가하고, 숙신산 무수물 (100 mg, 1 mmol)을 추가로 첨가하였다. 반응물을 밤새 45℃에서 유지하였다. 그 후에 반응 혼합물을 점성 오일로 농축시키고 컬럼 크로마토그래피 (20:1 → 10:1의 DCM-MeOH)에 의해 정제하여, 화합물 9 (211 mg, 수율: 75%)를 제공하였다.

화합물 9 (56 mg, 0.1 mmol), 화합물 8 (92 mg, 0.2 mmol), 및 DCC (42 mg, 0.2 mmol)를 혼합하여 디클로로메탄 (15 mL)에 첨가하고, DMAP (6 mg, 0.049 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 24시간 동안 교반하면서 24℃에서 유지하였다. TLC 측정에 따라 반응이 완료된 것으로 측정될 때, 혼합물에 디클로로메탄 (50 mL)을 첨가하고, 물 (10 mL) 및 포화 염수 (20 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 생성 물질에 트리플루오로아세트산 (TFA, 5 mL) 및 디클로로메탄 (DCM, 10 mL)을 추가로 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 얼음조에서 냉각시킨 후에, 백색 고형물을 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 농축시켜 점성 오일을 수득하였고, 이것을 컬럼 크로마토그래피 (20:1 → 10:1의 DCM-MeOH)에 의해 정제하여 D2 (30 mg, 수율: 35%)를 제공하였다.

¹H-NMR(MeOD-d₄, 400MHz) δ 7.85(d, 2H, J=7.68Hz, H6-1, H6-2), 7.37(d, 2H, J=7.68Hz, H5-1, H5-2), 6.26(t, 2H, J=7.24Hz, H1'-1, H1'-2), 4.53(m, 2H, H5a'-1, H5a'-2), 4.40(m, 4H, H5b'-1, H5b'-2, H4'-1, H4'-2), 4.20(m, 2H, H3-1, H3-2), 2.73(m, 4H, -CH2-CH2-), 1.64(m, 4H, O-CH2-CH2), 1.37(m, 4H, O-CH2-CH2-CH₂), 0.93(m, 6H, CH2-CH3).

¹³C-NMR(MeOD-d₄, 100MHz) δ 172.41, 164.01, 155.95, 153.52, 144.36, 96.56, 70.53, 66.29, 62.49, 30.74, 28.76, 19.01, 13.49.

ESIMS: C₃₂H₄₀F₄N₆O₁₄에 대한 계산치 m/z 809.25 (M+H)⁺, 실측치 809.34.

화합물 8을 다른 이무수물(들), 예컨대 글루타르산 무수물과 반응시킴으로써 상기에 언급된 제조 방법을 조정하여, 표 1에 나타나 있는 화합물 번호 108 내지 110을 제조할 수 있었다. 부틸 클로로포르메이트를 tert-부틸 클로로포르메이트로 대체함으로써, 표 1에 나타나 있는 화합물 번호 111을 제조할 수 있었다.

(실시예 3)

본 실시예의 시티딘 유도체 이량체는 1,5-디-[4-N-(벤질옥시카르보닐)-2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘]글루타레이트 (코드명 D3)이다.

D3의 합성 경로가 도 3에 도시되어 있으며, 제조 방법은 하기와 같다.

화합물 13이 먼저 제조되었다: 2'-데옥시-2',2'-디플루오로-시티딘 히드로클로라이드 (300 mg, 1 mmol), 비스(트리메틸실릴)아민 (5 mL, 0.023 mmol), 및 촉매량 5 mg의 황산암모늄을 1,4-디옥산 (5 mL)에 용해시켰다. 반응물을 환류 하에 2시간 동안 가열하였다. 환류 하에 반응이 완료된 후에, 반응 용액을 농축시키고, 톨루엔을 첨가하고, 2회 농축 건조시켰다. 그에 따른 생성물을 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시켰다.

N-메틸이미다졸 (0.24 mL, 3 mmol) 및 벤질 클로로포르메이트 (340 mg, 3 mmol)를 상기에 언급된 디클로로메탄 용액에 첨가하여, 4시간 동안 교반하면서 실온에서 반응시켰다. 반응 생성물은 화학 구조식 20을 가졌다. 반응 용액을 농축시켜 점성 오일 생성물을 제공하였다.

상기에 언급된 점성 오일 생성물을 트리에틸아민 (3 mL)과 메탄올 (20 mL)의 혼합 용액에 용해시키고, 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후에 용매를 감압 하에 증류하여 제거하였다. 조 생성물을 디클로로메탄/메탄올 (20:1)을 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 162 mg의 화합물 12를 제공하였다. 3단계 수율은 41%였다.

화합물 12의 NMR 특징화:

¹H-NMR (MeOD-d₄, 400MHz) δ: 8.31(d, 1H, J=7.64Hz, H6), 7.39(m, 5H, J=7.68Hz, Ph), 6.25(t, 1H, J=7.12Hz, H1'), 5.21(s, 2H. CH₂-Ph), 4.31(m, 1H, H5a'), 3.82(m, 2H, H5b, H4'), 3.79(m, 1H, H3').

¹³C-NMR (MeOD-d₄, 100MHz) δ: 164.22, 156.22, 153.27, 144.48, 135.87, 128.42, 128.10, 125.31, 122.74, 120.16, 95.89, 85.35, 84.91, 81.7, 81.66, 68.87, 67.54, 58.31.

화합물 12 (80 mg, 0.2 mmol)와 탄산나트륨 (106 mg, 1 mmol)을 혼합하여, 1,4-디옥산과 물의 시스템 (4:1의 부피비, 5 mL)에 첨가하였다. (Boc)₂O (44 mg, 0.2 mmol)를 그 후에 첨가하여, 48시간 동안 교반하면서 24℃에서 반응시켰다. TLC 측정에 따라 반응이 완료된 것으로 측정될 때, 반응 혼합물을 물 (2 mL)로 희석시키고 30 mL의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 추출로부터의 유기 상을 물 (5 mL) 및 포화 염수 (5 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 다음, 감압 하에 농축 건조시켰다. 남아 있는 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (1:1:0.02의 디클로로메탄/아세톤/에탄올)에 의해 정제하여 화합물 13 (64 mg, 수율: 64%)을 제공하였다.

수득된 화합물 13 (248 mg, 0.5 mmol)을 클로로포름 (15 mL)에 첨가하고, 피리딘 (5 mL)을 첨가하고, 글루타르산 무수물 (100 mg, 1 mmol)을 추가로 첨가하였다. 반응물을 45℃에서 밤새 유지하였다. 그 후에 반응 혼합물을 점성 오일로 농축시키고 컬럼 크로마토그래피 (20:1 → 10:1의 DCM-MeOH)에 의해 정제하여, 화합물 14 (223 mg, 수율: 73%)를 제공하였다.

수득된 화합물 14 (61 mg, 0.1 mmol), 화합물 13 (99 mg, 0.2 mmol), 및 DCC (42 mg, 0.2 mmol)를 혼합하여, 디클로로메탄 (15 mL)에 첨가하고, DMAP (6 mg, 0.049 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 24시간 동안 교반하면서 24℃에서 유지하였다. TLC 측정에 따라 반응이 완료된 것으로 측정될 때, 혼합물에 디클로로메탄 (50 mL)을 첨가하고, 물 (10 mL) 및 포화 염수 (20 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. TFA (5 mL) 및 DCM (10 mL)을 추가로 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 얼음조에서 냉각시킨 후에, 백색 고형물을 여과에 의해 제거하였다. 그 후에 여과물을 농축시켜 점성 오일을 제공하였고, 이것을 컬럼 크로마토그래피 (20:1 → 10:1의 DCM-MeOH)에 의해 정제하여 D3 (30 mg, 수율: 35%)을 제공하였다.

¹H-NMR (MeOD-d₄, 400MHz) δ: 8.31(d, 1H, J=7.64Hz, H6), 7.39(m, 5H, J=7.68Hz, Ph), 6.27(t, 2H, J=7.8Hz, H1'-1, H1'-2), 5.17(s, 4H, CH₂-Phx2), 4.46(m, 4H, H5a'-1, H5a'-2, H5b'-1, H5b'-2), 4.21(m, 2H, H4'-1, H4'-2), 4.10(m, 2H, H3'-1, H3'-2), 2.53(t, 4H, J=7.16Hz, -CH2-CH2-CH2-), 1.99(q, 2H, J=7.2Hz, -CH2-CH2-CH2-).

¹³C NMR(MeOD-d₄, 100MHz) δ 172.90, 164.21, 155.90, 153.31, 144.25, 141.03, 135.86, 128.41, 128.28, 128.10, 124.85, 123.25, 122.26, 96.14, 79.17, 74.97, 67.59, 62.06, 33.19, 32.51, 19.96.

ESIMS: C₃₉H₃₈F₄N₆O₁₄에 대한 계산치 m/z 891.24 (M+H)⁺, 실측치 891.31.

화합물 14를 다른 이무수물(들), 예컨대 COOHCHBr(CH₂)₂COOH, COOHCHPh(CH₂)₂COOH, 및 COOHCHCNCH₂COOH와 반응시킴으로써 상기에 언급된 제조 방법을 조정하여, 표 1에 나타나 있는 화합물 번호 113 내지 116을 제조할 수 있었다.

(실시예 4)

본 실시예의 시티딘 유도체 이량체는 하기 구조식을 갖는 1-O-(4-N-(벤질옥시카르보닐)-겜시타빈)-4-O-(4-N-(n-부톡시카르보닐)-겜시타빈)-숙시네이트 (코드명 D4)이다.

D4의 합성 경로가 도 4에 도시되어 있으며, 구체적인 제조 방법은 하기와 같다.

화합물 9 (56 mg, 0.1 mmol), 화합물 13 (99 mg, 0.2 mmol), 및 DCC (42 mg, 0.2 mmol)를 혼합하여 디클로로메탄 (15 mL)에 첨가하고, DMAP (6 mg, 0.049 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 24시간 동안 교반하면서 24℃에서 유지하였다. TLC 측정에 따라 반응이 완료된 것으로 측정될 때, 반응 혼합물에 디클로로메탄 (50 mL)을 첨가하고, 물 (10 mL) 및 포화 염수 (20 mL)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. TFA (5 mL) 및 DCM (10 mL)을 추가로 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 얼음조에서 냉각시킨 후에, 백색 고형물을 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 농축시켜 점성 오일을 제공하고 컬럼 크로마토그래피 (20:1 → 10:1의 DCM-MeOH)에 의해 정제하여, D4 (30 mg, 수율: 36%)를 제공하였다.

¹H-NMR(MeOD-d₄, 400MHz) δ 7.98(m, 2H, H6-1, H6-2), 7.40(d, 2H, J=7.68Hz, H5-1, H5-2), 7.38(m, 6H, Ph), 6.26(t, 2H, J=8Hz, H1'-1, H1'-2), 5.21(s, 2H, CH₂-Ph), 4.43(m, 2H, H5a'-1, H5a'-2), 4.29(m, 2H, H5b'-1, H5b'-2), 4.21(m, 6H, H4'-1, H4'-2, H3'-1, H3'-2), 2.74(m, 4H, -CH₂-CH₂-), 1.43(m, 2H, O-CH₂-CH₂-), 1.28(m, 2H, O-CH₂-CH₂-CH₂-), 0.97(t, 3H, J=7.4Hz, -CH₂-CH₃).

¹³C NMR(MeOD-d₄, 100MHz) δ 172.56, 164.19, 155.89, 153.52, 144.61, 135.86, 128.09, 122.22, 96.21, 79.38, 78.91, 70.83, 67.60, 65.92, 62.11, 56.72, 30.64, 28.66, 28.51, 25.93, 18.82, 14.26, 12.77.

ESIMS: C₃₅H₃₈F₄N₆O₁₄에 대한 계산치 m/z 843.24 (M+H)⁺, 실측치 843.33.

숙신산 무수물을 다른 무수물(들)로 대체하여 화합물 8과 반응시킴으로써 상기에 언급된 제조 방법을 조정하여 중간체 화합물을 제조할 수 있었다. 중간체 화합물을 화합물 13과 반응시켜 표 1에 나타나 있는 화합물 번호 118 내지 120을 제조할 수 있었다.

(실시예 5: 시티딘 유도체 이량체의 히드로클로라이드)

본 실시예는 실시예 1의 시티딘 유도체 이량체의 히드로클로라이드의 제조를 포함한다.

1,5-디-[4-N-(n-부틸옥시카르보닐)-3'-O-(n-부톡시카르보닐)-2'-데옥시-2',2'-디플루오로-시티딘]글루타레이트 (0.50 g)를 에틸 아세테이트 (60 mL)에 용해시켜 얼음조에 넣고, 건조 염산 기체로 처리하였다. 15분 동안 교반한 후에, 용매를 제거하여 백색 고형 생성물을 수득하였다.

유사한 절차를 사용하여 다른 시티딘 유도체 이량체(들)의 히드로클로라이드 염을 제조할 수 있었다.

상기에 언급된 히드로클로라이드 염 이외에도, 포스페이트, 술페이트, 카르보네이트, 니트레이트, 시트레이트, 타르트레이트, 말레에이트, 숙시네이트, 술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 메탄술포네이트, 벤조에이트 또는 푸마레이트를 비롯한, 시티딘 유도체 이량체의 다른 염이 제조될 수 있다.

(실시예 6: 시티딘 유도체 이량체의 주사용 동결건조 분말제)

본 실시예는 실시예 3의 화합물 D3의 주사용 동결건조 분말제의 제조를 포함한다.

D3의 주사용 동결건조 분말제는 화합물 D3 (30 g), 만니톨 (20% (w/v), 300 g), 완충제 인산이수소나트륨 이수화물 (7 g), 및 계면활성제 폴록사머 188 (F68) (4.0 g)을 포함한다.

인산이수소나트륨 이수화물, 폴록사머 188 (F68) (CAS No.: 9003-11-6), 및 만니톨 (20% (w/v))을 상기에 제시된 규정 양에 따라 정확하게 칭량하여, 10℃ 미만의 온도로 예비냉각된 주사용수 (300 g)에 용해시켰다. NaOH (0.1 mol/L)를 사용하여 용액의 pH 값을 7.3-7.5로 조정하였다. 그 후에 규정 용량의 D3을 용액에 첨가하여 잘 혼합하였다. NaOH 용액 (0.1 mol/L) 또는 HCl (0.1 mol/L)을 사용하여 pH 값을 7.3±0.2 (본 실시예에서는 7.5)로 조정할 수 있었다. 용액에 물을 2000 g이 될 때까지 첨가하고, 0.22 ㎛ 미세다공성 막으로 멸균 여과하였다. 여과물을 바이알에 분배하는데, 각 바이알에서 2.0 그램이었다. 바이알을 부분적으로 마개를 닫고, 동결 건조기에 넣어 동결건조하였다. 건조 후에, 바이알을 진공 팩킹하고, 캡핑하고, 라벨링하여, 동결건조 분말 주사제의 1000개 바이알을 제조하였다. 저장 온도는 2℃ - 8℃였다.

동결건조 분말 주사제 (즉, 주사용 멸균 분말제) 이외에도, 본 발명의 시티딘 유도체 이량체(들)는 주사에 적합한 다른 형태, 예컨대 용액형 주사제, 현탁액형 주사제, 에멀젼형 주사제로 제제화될 수 있다.

(실시예 7: 시티딘 유도체 이량체의 제약 조성물)

본 실시예의 시티딘 유도체 이량체의 제약 조성물은 제약 활성 성분 및 부형제를 포함한다. 제약 활성 성분은 상기 실시예에서 제조된 시티딘 유도체 이량체 또는 그의 상응하는 염일 수 있다. 조성물 중 제약 활성 성분의 중량 백분율은 1% 내지 95% (본 실시예에서는 30%)일 수 있다. 부형제는 물, 락토스, 옥수수 전분, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 및 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 본 실시예에서 제약 조성물의 형태는 정제이다.

상기 정제 형태 이외에도, 제약 조성물은 다른 적합한 형태를 취할 수 있다. 제약 활성 성분은 경구 투여용으로, 분말제, 과립제, 캡슐제, 펠렛 제제, 용액제, 현탁액제, 에멀젼제, 시럽제 또는 엘릭시르제, 또는 서방성 방출 제제 및 제어 방출 제제, 또는 경구 투여를 위한 다른 적합한 형태로서 제조될 수 있다. 이러한 경구 투여되는 유형의 제약 조성물은 통상 사용되는 상응하는 부형제 (그의 기능에 따라 첨가제, 아주반트 등으로서 분류됨)를 함유할 수 있다. 첨가제는 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 당, 염, 셀룰로스, 황산마그네슘 등을 포함할 수 있다.

상기에 언급된 경구 투여되는 유형의 제약 조성물을 제조할 때, 약리학에서의 아주반트는 제약 활성 성분을 담지시키는 의약 담체로서 사용될 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 물질, 예컨대 비활성 고형 희석제, 수성 용매, 리포좀, 미소구체 및/또는 비독성 유기 용매를 포함한다. 바람직한 아주반트는 습윤제, 유화제, pH 완충제, 인간 혈청 알부민, 항산화제, 보존제, 정균제, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 말토스, 레시틴, 글리신, 소르브산, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 프로타민, 붕산, 염화나트륨, 염화칼륨, 광유, 식물유 등을 포함한다. 1종 이상의 유형이 선택되어 의약 담체로서 조합될 수 있다.

개시된 제약 조성물의 표적 종양은 혈액 종양 또는 악성 고형 종양을 포함한다. 구체적으로, 표적 종양은 폐암, 전립선암, 유방암, 결장암, 위암, 췌장암, 간암, 식도암, 뇌 종양, 난소암, 자궁암, 신장암, 두경부암, 피부암, 방광암, 외음부암, 고환 종양, 결장직장암, 융모막 암종, 생식 세포 종양, 악성 림프종, 백혈병 및 다발성 골수종을 포함한다. 추가로, 바람직한 표적 종양은 췌장암 (1차 또는 2차 치료), 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 유방암, 난소암 및 두경부 편평 세포 암종, 및/또는 결장암을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이들로 제한되지는 않는다.

(적용예 1: HCT-116 인간 결장 암 세포 콜로니 형성에 대한 일련의 화합물의 억제 시험)

1. 콜로니 형성 억제 시험을 이용하여, HCT-116 인간 결장 암 세포주의 세포 증식 억제에 대한 50 nM, 150 nM 및 450 nM의 농도를 갖는 4종의 후보 화합물 (D1, D2, D3 및 D4)의 효과를 평가하였다.

2. 실험 물질: 세포주: 중국 과학원 상하이 세포 자원 센터(Chinese Academy of Sciences Shanghai Cell Resource Center)로부터 구입한 HCT-116 인간 결장 암 세포주, Cat # TCHu 99.

3. 시약 준비

HCT-116 인간 결장 암 세포 배양 배지: DMEM + 10% FBS.

화합물 제조: DMSO를 사용하여, 100 μM의 최종 농도에 도달할 때까지 화합물을 희석시켰다.

세포 염색액 제조: 무수 에탄올을 사용하여 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액을 제조하고 암실에 저장하였다. 염색 전에, 세포 염색액으로서 용액을 PBS 완충액과 1:4의 부피비로 혼합하였다.

4. 세포 배양: 대수 성장기의 세포를 수집하고, 카운팅하고, 완전 배양 배지에 재현탁시켰다. 세포 농도를 적절한 농도로 조정하여, 6-웰 배양 플레이트에 시딩하는데, 각각의 웰은 약 300개의 세포 및 1.8 mL의 배양 배지를 가졌다. 세포를 37℃, 100%의 상대 습도, 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 5시간 동안 인큐베이션하였다.

5. 세포 클론 형성 억제 시험 및 데이터 프로세싱

(1) 대수 성장기의 세포를 수집하여 카운팅하였다. 세포를 5% FBS를 함유하는 배양 배지에 재현탁시키고 카운팅하였다. 6-웰 플레이트에 웰 당 300개 세포의 비율로 시딩하였다. 세포를 37℃, 100%의 상대 습도, 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 5시간 동안 인큐베이션하였다.

(2) 화합물을 0.5 μM, 1.5 μM 및 4.5 μM의 농도가 되도록 배양 배지 (5% FBS 함유)로 희석시키고, 웰 당 200 μL씩 세포에 첨가하여, 50 nM, 150 nM 및 450 nM의 최종 농도가 되도록 하였다. 각각의 농도 포인트를 3회 반복 시험하였다.

(3) 세포를 37℃, 100%의 상대 습도, 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.

(4) 플레이트의 배양 배지 (화합물을 함유하는 배양 배지)를 흡인시켰다. 플레이트를 HBSS(Hank's Balance Salt Solution)로 2회 세정하고, 새로운 배양 배지 (15% FBS가 함유된 DMEM 배지)로 교체하였다.

(5) 세포를 37℃, 100%의 상대 습도, 및 5% CO₂의 인큐베이터에서, 가시적인 클론 플라크가 형성될 때까지 7 내지 10일 동안 인큐베이션하였다.

(6) 배양 배지를 플레이트로부터 흡인시켰다. 플레이트를 PBS 용액으로 2회 세정하였다.

(7) 잔류하는 PBS를 흡수시켜 제거하고, 에탄올을 플레이트 당 1 mL씩 첨가하고, 30분 동안 고정시켰다.

(8) 에탄올을 흡수시켜 제거하고, 세포 염색액을 첨가하여 3분 동안 염색시켰다.

(9) 염색액을 흡인시켰다. PBS로 3회 세정한 후에, 세포를 카운팅하였다.

데이터 프로세싱:

클론 형성 효율 = [As / Ac] x 100%; 클론 형성 억제율 = 1 - 클론 형성 효율, 여기서 As는 처리 샘플 (세포 + 시험 화합물) 중의 세포 콜로니 수를 나타내고, Ac는 음성 대조군 (비처리 샘플) (세포 + 1% DMSO) 중의 세포 콜로니 수를 나타낸다.

6. 결과 및 고찰

표 2는 4종의 화합물로 처리된 HCT-116 인간 결장 암 세포의 클로닝된 세포 수를 나열한다.

<표 2>

% 억제: 억제율

도 5는 50 nM, 150 nM 및 450 nM의 농도로 4종의 화합물로 처리된 HCT-116 인간 결장 암 세포의 세포 클론 형성 억제율을 도해한다.

표 2 및 도 5는 개시된 화합물이 종양 세포의 억제에 유의한 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

도 6은 HCT-116 인간 결장 암 세포가 4종의 화합물로 처리되었을 때의 억제율과 화합물 농도 사이의 용량-반응 관계 곡선을 도해한다. 도 6에 도시된 바와 같이, D1의 IC50 값은 245.3 nM이고, D2의 IC50 값은 226.6 nM이며, D3의 IC50 값은 99.80 nM이며, D4의 IC50 값은 111.7 nM이었다.

(적용예 2: 종양 성장 억제에 대한 일련의 화합물의 효과)

접종 부위에서의 종양 형성 및 성장과 시험 동물의 체중 변화를 관찰함으로써, 본 적용예에서는 HCT-116 결장 종양-보유 누드 마우스에의 화합물 D1 내지 D4의 단일 복강내 주사에 의한 독성 및 HCT-116 결장 암 이종이식편의 종양 성장 억제를 평가하였다.

1. 실험 목적은 HCT-116 결장 종양-보유 누드 마우스에의 개시된 시티딘 유도체 이량체 화합물의 단일 복강내 주사에 의한 독성 및 HCT-116 인간 결장 암 이종이식편의 종양 성장 억제를 평가하는 것이었다.

2. 시험 물질의 제조

시험 물질을 용해시키기 위해 사용되는 용매의 공급원은 하기와 같다.

상응하는 시험 물질을 칭량하여 5 mL 유리관에 넣고, 5 mm 자기 교반기의 교반 하에 에탄올에 용해시켰다. 완전히 용해된 후에, 크레모포어 EL을 계속해서 교반하면서 첨가하였다. 시험 물질을 사용하기 직전에, 표시된 양의 생리 염수를 첨가하고 교반하였다. 제조된 에탄올, 크레모포어 EL, 생리 염수는 5:5:90의 부피비를 가졌다.

3. 실험 동물

품종 및 계통: Balb/c 누드 마우스; 등급: 특정 병원체 부재 (SPF); 성별: 암컷.

공급원: 상하이 Sippr/BK 랩 애니멀 리미티드(Shanghai Sippr/BK Lab Animal Ltd.).

동물 수: 40마리의 동물을 주문하여, 그 중 실험용으로 바람직한 건강 상태의 동물을 선택하였다.

동물 적합성 인증서 번호: 0123627.

실험을 시작할 때의 동물 연령: 7주 내지 9주.

실험을 시작할 때의 동물 체중: 18 그램 내지 22 그램.

적응 기간: 5일 내지 7일.

동물 번호: 꼬리 번호.

동물 사육실은 12시간마다 명 주기와 암 주기를 바꿔주면서, 23 ± 2℃, 40% - 70%의 습도가 유지되었다.

동물 사료 (SLAC-M01)는 베이징 크아오 치에리 코포레이션 리미티드(Beijing Ke Ao Xie Li Cooperation Limited)로부터 구입하였다. 멸균 여과수를 실험 동물을 위해 사용하였다. 실험 기간 동안에, 동물의 사료와 음수는 자유 급여 방식일 수 있었다.

4. 실험 방법이 제공되었다.

4.1 종양 세포: HCT-116 결장 암 세포는 중국 과학원 세포 생물학 연구소(Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences)로부터 구입하였다. F-12 배지 (10% FBS 함유)를 사용하여, 5% CO₂ 및 95% 공기의 부피 분율을 함유하는 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃ 및 포화 습도 하에 세포를 배양하였다. 접종 전에, 대수 성장기의 세포를 수집하였다. 0.25% 트립신에 의한 소화 후에, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 세포를 재현탁시키고 카운팅하였다. 세포 재현탁을 위해서는 무혈청 배지를 사용하였고, 세포 농도는 3x10^7개 세포/mL로 조정되었다.

4.2 동물 접종 및 그룹화: 무균 조건 하에, 각각의 누드 마우스의 우측 뒷다리에 0.1 mL의 세포 현탁액을 피하 주사하였다 (3x10^6개 세포/마우스). 종양 크기가 약 60-150 mm³의 부피가 되도록 성장하였을 때, 유사한 종양 크기 및 원하는 형상 (불규칙한 형상이나 함께 모인 다발 종양 없이, 실질적으로 단일 구체 형상)을 갖는 누드 마우스를 선택하여 그룹화하는데, 각각의 그룹에 마우스가 포함되었다. 그룹화 상황은 하기와 같이 나열되었다.

<표 3>

IP: 복강내 주사, QD x 1: 1회 주사.

대조군 그룹의 마우스에는 5:5:90의 비율로 에탄올, 크레모포어 EL 및 생리 염수를 포함하는 혼합 용액을 주사하였다.

4.3 약물 투여 및 동물의 관찰

각각의 그룹에서 누드 마우스의 접종 부위에서의 종양 형성 및 성장을 관찰하였다. 종양 결절의 직경 (D)을 원형 눈금자로 주 3회 측정하였다. 또한, 하기 수학식을 적용하여 종양 결절의 부피 (V)를 계산하였다: V=3/4π(D/2)³.

항종양 활성의 평가 지표는 종양 성장 억제율 TGI (%) 및 상대 종양 증식률 T/C (%)였다.

TGI의 계산 수학식은 하기와 같았다: TGI (%) = (V_대조군 - V_처리군) / V_대조군 x 100%. 상대 종양 부피 (RTV)는 하기와 같이 계산하였다: RTV = Vt/V0, 여기서 V0은 그룹 투여 시의 종양 부피이고, Vt는 측정 시의 종양 부피이다.

상대 종양 증식률 T/C (%)의 계산 수학식은 하기와 같았다: T/C (%) = T_RTV / C_RTV x 100%. T_RTV는 처리군의 RTV를 나타내고; C_RTV는 음성 대조군 그룹의 RTV를 나타낸다. 마우스의 체중은 매주 3회 측정하였다.

4.4 임상 증상

각 동물의 모든 임상 증상을 실험을 시작할 때와 실험 중에 기록하였다. 매일 동일한 시간에 관찰을 수행하였다.

시험 물질의 투여 후에, 체중 감소가 >20%일 때, 동물이 죽어가고 있을 때, 또는 종양 부피가 2800 mm³를 초과할 때면 CO₂를 가하여 동물을 안락사시켰다. 종양을 분리하여 칭량하고, 부검을 수행하고, 육안 검사를 실시하여, 장기에 병리학적 변화가 있었는지를 기록하였다.

4.5 데이터 및 통계 분석

달리 지시되지 않는 한, 실험 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내고; 두 그룹 사이의 비교를 위해 독립표본 T-검정법이 이용되는데, 결과는 P<0.05이면 유의한 차이가 있는 것으로 간주되었다.

5. 실험 결과

(1) 인간 결장 암 HCT-116을 갖는 종양-보유 마우스의 체중에 대한 시험 화합물의 효과

<표 4> 다양한 날의 마우스 체중 (g, 평균 ± SEM)

표에서, 제~일은 일을 나타내고; "*"는 대조군 그룹과 비교한 p<0.05를 나타내고; "**"는 대조군 그룹과 비교한 p<0.01을 나타낸다.

<표 5> 체중 변화율

표에서, 제~일은 일을 나타내고; "*"는 대조군 그룹과 비교한 p<0.05를 나타내고;"**"는 대조군 그룹과 비교한 p<0.01을 나타낸다.

상기 표의 데이터가 나타내는 바와 같이, 각 화합물을 HCT-116 결장 암 종양-보유 누드 마우스에 복강내 주사한 후에, 용량 400 mg/kg의 D1 그룹 동물의 체중은 약물을 투여한지 제4일째에 유의하게 감소하였고, 그 이후에는 체중이 꾸준히 증가하였다. 제14일 내지 제30일 동안에는, 체중이 대조군 그룹과 비교하여 유의하게 증가하였다. 다른 약물-처리 그룹과 대조군 그룹 사이에는 유의한 차이가 없었다.

(2) 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 이종이식편의 종양 부피에 대한 시험 화합물의 효과

<표 6> 각 그룹의 종양 부피에 대한 자세한 데이터 (mm³, 평균±SEM)

"*"는 대조군 그룹과 비교한 p<0.05를 나타내고; "**"는 대조군 그룹과 비교한 p<0.01을 나타낸다.

각 그룹의 상기 종양 부피 데이터가 나타내는 바와 같이, 개시된 시티딘 유도체 이량체는 종양 성장을 유의하게 억제하였다.

(3) 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양에 대한 시험 화합물의 종양 성장 억제율 (TGI%)

종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양에 대한 시험 화합물의 종양 성장 억제율 (TGI%)이 하기와 같이 표 7에 나타나 있다.

<표 7> 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양에 대한 D1-D4의 종양 성장 억제율 (TGI%)

용량 400 mg/kg의 화합물 D1 그룹의 종양 억제율은 제7일에 최대값인 91.49%를 달성하였고, 제16일에는 72.62%, 제30일에는 43.36%였다. 용량 400 mg/kg의 화합물 D2 그룹의 종양 억제율은 제9일에 최대값인 94.79%를 달성하였고, 제16일에는 90.63%, 제30일에는 67.91%였다. 용량 350 mg/kg의 화합물 D3 그룹의 종양 억제율은 제11일에 최대값인 98.54%를 달성하였고, 제16일에는 95.58%, 제30일에는 82.93%였다. 용량 300 mg/kg의 화합물 D4 그룹의 종양 억제율은 제11일에 최대값인 97.32%를 달성하였고, 제16일에는 92.12%, 제30일에는 72.14%였다.

(4) 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양의 상대 종양 부피 (RTV)에 대한 시험 화합물의 효과

표 8은 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양의 상대 종양 부피 (RTV)에 대한 D1-D4 시험 화합물의 유의한 효과를 보여주고, 여기서 "*"는 대조군 그룹과 비교한 p-값<0.05를 나타내고, "**"는 대조군 그룹과 비교한 p-값<0.01을 나타낸다.

<표 8> 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양의 RTV에 대한 시험 화합물의 효과 (평균±SEM)

(5) 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양의 상대 종양 증식률 (T/C %)에 대한 4종의 시험 화합물의 효과

표 9는 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양의 상대 종양 증식률에 대한 시험 화합물의 효과를 보여준다.

<표 9> 종양-보유 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 종양의 상대 종양 증식률에 대한 시험 화합물의 효과

투여량 400 mg/kg의 화합물 D1 그룹의 상대 종양 증식률은 제7일에 최소값인 28.36%를 달성하였고, 제16일에는 89.47%였다. 투여량 400 mg/kg의 화합물 D2 그룹의 상대 종양 증식률은 제9일에 최소값인 14.41%를 달성하였고, 제16일에는 21.64%였다. 투여량 350 mg/kg의 화합물 D3 그룹의 상대 종양 증식률은 제11일에 최소값인 3.41%를 달성하였고, 제16일에는 10.49%였다. 투여량 300 mg/kg의 화합물 D4 그룹의 상대 종양 증식률은 제11일에 최소값인 25.94%를 달성하였고, 제16일에는 37.96%였다.

종양-보유 누드 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 이종이식편에 대한 일련의 화합물의 종양 억제 실험에서, 종양-보유 누드 마우스의 HCT-116 인간 결장 암 이종이식편에 대하여 화합물 D2, D3, D4는 보다 높은 종양 억제율을 나타냈다. 1회 복강내 약물 투여 후 제16일째까지는, 동물의 체중에 대한 뚜렷한 영향 없이 유의한 종양 억제 효과가 있었고, 이는 개시된 시티딘 유도체 이량체의 매우 낮은 독성 부작용과 함께 고 항종양 활성을 나타낸다.

Claims

하기 일반 화학식 I을 갖는 시티딘 유도체 이량체.
<화학식 I>

상기 식에서,
R1은 C₄ 알킬 또는 -(CH₂)-Ph이며, Ph는 페닐이고;
R2는 C₄ 알킬 또는 -(CH₂)-Ph이며, Ph는 페닐이고;
R3은 수소 또는 C₄ 알콕시카르보닐이고;
R4는 수소 또는 C₄ 알콕시카르보닐이고;
R5는 -(CH₂)_n-이며, n은 2 또는 3이다.
제1항에 있어서, R3이 수소이고 R4가 수소인 것을 특징으로 하는 시티딘 유도체 이량체.
제2항에 있어서, R1과 R2가 동일한 것을 특징으로 하는 시티딘 유도체 이량체.
삭제
삭제
활성 성분으로서의 제1항에 따른 일반 화학식 I로 표시되는 시티딘 유도체 이량체 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 의약 담체 또는 부형제 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 억제를 위한 제약 조성물.
제6항에 있어서, 제약 조성물의 형태가 주사 형태 또는 경구 투여 형태이고, 여기서:
경구 투여 형태는 정제, 분말제, 과립제, 캡슐제, 펠렛 제제, 용액제, 현탁액제, 에멀젼제, 시럽제, 또는 엘릭시르제를 포함하고;
주사 형태는 용액형 주사제, 현탁액형 주사제, 에멀젼 주사제, 또는 멸균 분말형 주사제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 시티딘 유도체 이량체의 제조 방법.
1) 일반 화학식 II를 갖는 화합물을 제조하는 단계:
<화학식 II>

2) 일반 화학식 III을 갖는 화합물을 제조하는 단계:
<화학식 III>

3) 일반 화학식 II를 갖는 화합물을 탄산나트륨과 혼합하여 1,4-디옥산 및 물을 포함하는 시스템에 첨가한 다음, (Boc)₂O(디-tert-부틸 디카르보네이트)를 첨가하여 반응시키고, TLC 측정에 따라 반응이 완료되어 반응 생성물을 제공하는 것으로 측정될 때, 반응 생성물을 추출하고 세척하여 건조시킨 다음, 감압 하에 농축 건조시키고; 건조된 화합물을 클로로포름에 첨가하고, 피리딘 및 이무수물 R5(CO)₂O (여기서, R5는 제1항에 정의된 바와 같음)를 첨가하여 밤새 반응시키고, 농축시켜 점성 오일을 수득하고, 점성 오일을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 일반 화학식 IV를 갖는 화합물을 수득하는 단계:
<화학식 IV>

(4) 일반 화학식 IV를 갖는 화합물, 일반 화학식 III을 갖는 화합물, 및 DCC(N,N'-디시클로헥실카르보디이미드)를 혼합한 후에, 혼합물을 디클로로메탄에 첨가하고, DMAP(4-디메틸아미노피리딘)를 첨가하여 반응시키고; TLC 측정에 따라 반응이 완료되어 반응 생성물을 제공하는 것으로 측정될 때, 반응 생성물을 세척하고 건조시킨 다음 농축 건조시키고; TFA(트리플루오로아세트산) 및 DCM(디클로로메탄)을 추가로 첨가하고, 실온에서 교반하고; 얼음조에서 냉각시킨 후에, 백색 고형물을 여과하고, 여과물을 농축시켜 점성 오일을 수득하고, 이것을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 시티딘 유도체 이량체를 제조하는 단계.
삭제
제6항에 있어서, 종양이 혈액 종양 또는 악성 고형 종양인 것을 특징으로 하는 제약 조성물.