KR101867620B1

KR101867620B1 - 혈소판 유래 성장 인자-ｂｂ 생성 항진제, 및 그것을 포함하는 간엽계 줄기세포 생성 촉진제, 줄기세포 안정화제, 및 진피 재생화제

Info

Publication number: KR101867620B1
Application number: KR1020117018118A
Authority: KR
Inventors: 츠토무 소마; 마사토 이이노; 하루요 야마니시
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2011-07-01
Publication date: 2018-06-18
Anticipated expiration: 2031-07-01
Also published as: JP5905258B2; EP2620492A1; ES2604110T3; KR20170129281A; JPWO2013005281A1; CN102971415B; EP2620492A4; US10391137B2; BRPI1100062A2; EP2620492B1; RU2011134244A; KR20140030346A; US20130004533A1; HK1178571A1; CN102971415A; WO2013005281A1

Abstract

간엽계 줄기세포의 생성 촉진이나 줄기세포의 안정화에 기여하는 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB)의 생성을 유효하게 항진할 수 있는 신규의 제(劑)를 제공한다.
월귤 유래물, 망고스틴 유래물, 황금 유래물, 이노시톨 및 이노시톨인산에서 선택되는 1 또는 2 이상을 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는 PDGF-BB 생성 항진제.

Description

혈소판 유래 성장 인자-ＢＢ 생성 항진제, 및 그것을 포함하는 간엽계 줄기세포 생성 촉진제, 줄기세포 안정화제, 및 진피 재생화제{PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR-BB PRODUCTION PROMOTER, AND MESENCHYMAL STEM CELL PRODUCTION ACCELERATOR, STEM CELL STABILIZER AND DERMAL REGENERATOR COMPRISING THE SAME}

본 발명은, 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB) 생성 항진제, 및 상기 PDGF-BB 생성 항진제를 포함하여 이루어지는 간엽계 줄기세포 생성 촉진제, 줄기세포 안정화제, 및 진피 재생화제에 관한 것이다.

줄기세포는, 복수의 세포로 분화된 세포를 생성하는 다분화능과, 세포 분열에 의해 그 세포와 동일한 세포를 생성하는 자기 복제능이라고 하는 2가지 성질을 겸비하는 세포이다. 수정란의 초기의 발생 단계인 배아에서 유래하는 줄기세포는 배성(胚性) 줄기세포(ES 세포)라고 칭해진다. 인간 ES 세포는 재생 의료에 사용하는 것이 기대되고 있으나, 수정란을 이용한다고 하는 윤리상의 문제로부터, 새로운 인간 ES 세포의 작성은 보여지지 않고 있다.

최근, ES 세포 유사의 성질을 갖는 세포로서, 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포)에도 주목이 집중되고 있다. 그러나, iPS 세포의 작성에는 세포의 암화, 작성 효율 등의 관점에서 많은 문제가 있다. 한편, 특정한 조직으로 분화하는 능력을 갖는 체성 줄기세포는, 환자 자신의 신체의 조직, 예컨대 골수로부터 얻어지기 때문에, 배성 줄기세포와 같은 윤리상의 문제는 없다.

피부에서는 표피 기저층에 표피 줄기세포(비특허문헌 1)가 존재하는 것이 잘 알려져 있고, 또한 모낭의 벌지 영역이라고 불리는 영역에는, 모낭 상피 줄기세포(비특허문헌 2)나 피부 색소 줄기세포(비특허문헌 3)가 존재하는 것이 보고되어 있다. 한편, 진피에는 콜라겐을 주체로 하는 섬유 성분 중에, 가늘고 긴 방추형을 한 섬유아세포가 존재하고 있으나, 진피의 섬유아세포에 줄기세포가 존재하는지는 밝혀져 있지 않다. 또한, 진피에는 지방, 글리어, 연골, 근육 등 복수의 세포계열로 분화하는 피부 유래 전구세포(skin-derived precursors: SKP)가 존재하는 것(비특허문헌 4)은 알려져 있으나, 진피 섬유아세포와 SKP의 관련은 분명하지 않다.

섬유아세포의 전구세포로서 골수로부터 분리된 간엽계 줄기세포(비특허문헌 5)는, 간엽계에 속하는 여러 가지 세포(골세포, 근세포, 연골세포, 힘줄세포, 지방세포 등)로 분화하기 때문에, 뼈나 혈관, 근육의 재구축 등 재생 의료에의 응용이 기대되고 있다. 최근에는, 간엽계 조직을 갖는 조직의 대부분에 존재할 가능성이 밝혀지고 있고, 지방이나 제대혈, 태반 등으로부터도 간엽계 줄기세포가 단리되어 있다(비특허문헌 6∼8).

최근의 지견에 따르면, 간엽계 줄기세포는, 혈관 주피세포(페리사이트)로서 전신의 혈관에 존재하여, 혈관 안정화나 조직 항상성 유지에 작용하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 9 및 10).

또한, 조직 손상 부위 또는 그 근방에 있어서 혈관이 파괴되면, 혈관 주피세포(페리사이트)인 간엽계 줄기세포는 혈관으로부터 떨어져 증식하여, 상실된 세포를 공급함과 아울러(비특허문헌 11∼14), 생물 활성을 갖는 인자를 방출해서 조직을 보호하여(비특허문헌 15∼19), 손상된 조직의 수복·재생에 작용한다. 이들의 분비 인자는, 혈관 형성이나 항아포토시스의 작용 외에, 면역을 강력하게 억제하는 작용도 가지며(비특허문헌 21 및 22), T세포나 B세포를 통한 손상 조직의 파괴를 억제하는(비특허문헌 9 및 22) 것도 보고되어 있다.

또한, 간엽계 줄기세포는, 항섬유화의 작용(비특허문헌 23 및 24)이나, 다발성 경화증이나 당뇨병에 대한 효과(비특허문헌 9)도 나타내는 것이 알려져 있다.

한편, 만성 염증이, 각종 질환(예컨대 대사 증후군, 동맥 경화성 질환, 암, 신경 변성 질환, 자가 면역 질환 등)에 공통되는 기반 병태인 것이 밝혀지고 있다(비특허문헌 25). 예컨대, 만성 염증에 의해 내피세포 기능 장애나 인슐린 저항성이 유도되어, 당뇨병이나 동맥 경화성 질환 등의 여러 가지 질환의 원인이 되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 26). 또한, 비만의 지방 조직 그자체가, 염증성으로 변화를 일으키는 것도 밝혀져 왔다(비특허문헌 27∼29). 만성 염증은 혈관 주위에 발생하기 때문에, 만성 염증에 있어서도, 혈관 주피세포(페리사이트)인 간엽계 줄기세포와 혈관의 상호 작용의 파탄이 발생하고 있다고 생각된다.

이상의 지견으로부터, 간엽계 줄기세포의 생성 촉진이나 안정화를 도모할 수 있다면, 혈관 안정화, 조직 항상성 유지, 손상 조직의 수복·재생, 항섬유화, 다발성 경화증이나 당뇨병 등의 각종 질환의 예방·치유, 대사 증후군 등의 만성 염증에 기초한 각종 상태의 예방·개선 등, 각종의 용도에 매우 유효하다고 생각된다.

본 발명자들은, 진피에도 간엽계 줄기세포가 존재하는 것을 보고하고, 진피로부터 효율적으로 간엽계 줄기세포를 단리하는 방법을 확립하였다(일본 특허 출원 제2009-213291). 전술한 간엽계 줄기세포의 작용을 고려하면, 진피에서의 간엽계 줄기세포의 안정화나 생성 항진을 도모함으로써, 진피의 상태 개선이나 재생 등에도 유효하다고 생각된다.

또한, 본 발명자들은, 진피나 피하 지방에 있어서 간엽계 줄기세포가 존재하는 부위를 보다 상세히 밝힘과 아울러, 간엽계 줄기세포의 국재화(局在化)에 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB)가 관여하고 있는 것을 발견하고, 또한, 혈관 내피세포에서의 PDGF-BB의 생성 항진이 간엽계 줄기세포의 생성 항진 및 안정화에 기여하는 것을 밝혔다(일본 특허 출원 제2010-209705).

혈소판 유래 성장 인자(PDGF)는, 섬유아세포, 평활근세포, 글리어세포 등과 같은 간엽계 줄기세포의 유주(遊走) 및 증식 등의 조절에 관여하는 증식 인자이고, 상피세포나 내피세포 등의 여러 가지 세포에 의해 생성된다. PDGF에는 PDGF-A, B, C 및 D의 적어도 4종류가 존재하지만, A쇄 및 B쇄는 디술피드 결합을 형성함으로써 호모 또는 헤테로 2량체 구조를 취하여 3종류의 아이소폼(PDGF-AA, AB, BB)을 갖고 있다. PDGF는 티로신 키나아제 관련형인 PDGF 수용체(PDGFR)를 통해 그 생리 작용을 발현하는 것이 알려져 있다. PDGF-B의 유전자는 공지이며, 유전자 클로닝되어 있다(비특허문헌 30).

이러한 PDGF-BB의 생성 항진에 유효한 성분을 발견할 수 있다면, 이것을 이용하여 간엽계 줄기세포의 생성 촉진이나 줄기세포의 안정화를 도모할 수 있고, 나아가서는 상기한 각종 용도 등에 유효하게 사용할 수 있을 것으로 생각된다.

[비특허문헌]

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비특허문헌 2: Cotsareirs G et al., Cell, 57:201-209, 1989

비특허문헌 3: Nishimura EK et al., Nature, 416:854-860, 2002

비특허문헌 4: Wong CE al., J Cell Biol, 175:1005-1015, 2006

비특허문헌 5: Pittenger MF et al., Science, 284:143-147, 1999

비특허문헌 6: Park KW et al., Cell Metab, 8:454-457, 2008

비특허문헌 7: Flynn A et al., Cytotherapy, 9:717-726, 2007

비특허문헌 8: Igura K et al., Cytotherapy, 6:543-553, 2004

비특허문헌 9: da Silva Meirelles L et al., Stem Cells, 2008 Sep;26(9):2287-2299

비특허문헌 10: da Silva Meirelles L et al., J Cell Sci, 2006;119:2204-2213

비특허문헌 11: Dai WD et al., Circulation, 2005;112:214-223

비특허문헌 12: Fazel S et al., J Thorac Cardiovasc Surg, 2005;130:1310-1318

비특허문헌 13: Noiseux N et al., Mol Ther, 2006;14:840-850

비특허문헌 14: Zhao LR et al., Exp Neurol, 2002;174:11-20

비특허문헌 15: Gnecchi M et al., Nat Med, 2005;11:367-368

비특허문헌 16: Kinnaird T et al., Circ Res, 2004;94:678-685

비특허문헌 17: Kinnaird T et al., Circulation, 2004;109:1543-1549

비특허문헌 18: Tang YL et al., Ann Thorac Surg, 2005;80:229-237

비특허문헌 19: Zhang M et al., FASEB J, 2007;21:3197-3207

비특허문헌 20: Le Blanc K et al., J Intern Med, 2007;262:509-525

비특허문헌 21: Uccelli A et al., Trends Immunol, 2007;28:219-226

비특허문헌 22: Caplan AI et al., J Cell Biochem, 2006;98:1076-1084

비특허문헌 23: Fang BJ et al., Transplantation, 2004;78:83-88

비특허문헌 24: 0rtiz LA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2003;100:8407-841

비특허문헌 25: 오가와 요시히로, 실험 의학, 28:1680-1687, 2010

비특허문헌 26: Medzhitov R, Nature, 454:428-35, 2008

비특허문헌 27: Hotamisligil GS, Nature, 444(7121):860-7, 2006

비특허문헌 28: Wellen KE et al., J Clin Invest, 115(5):1111-9, 2005

비특허문헌 29: 스가나미 타카요시 외, 실험 의학, 28:1717-1723, 2010

비특허문헌 30: Dalla-Favera R et al., Nature, 292:31-35, 1981

본 발명은, 상기 배경을 감안하여 이루어진 것으로, 그 과제는, PDGF-BB의 생성 항진에 유효한 제(劑)를 제공함과 아울러, 이것을 이용하여, 간엽계 줄기세포의 생성 촉진 및/또는 그 안정화에 유효한 제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 다종 다양한 소재에 대해서 검토를 거듭하여, PDGF-BB의 생성을 항진시키는 약제를 스크리닝한 결과, 월귤, 망고스틴, 및 황금의 각 식물 유래물, 및 이노시톨 및 이노시톨인산이, 각각 현저한 PDGF-BB 생성 항진 작용을 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 이루기에 이르렀다.

따라서, 본원은 하기의 발명을 포함한다:

[1] 월귤 유래물, 망고스틴 유래물, 황금 유래물, 이노시톨 및 이노시톨인산에서 선택되는 1 또는 2 이상의 성분을 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB) 생성 항진제.

[2] 이노시톨을 포함함과 아울러, 효모 엑기스를 더 포함하여 이루어지는 [1]에 기재된 PDGF-BB 생성 항진제.

[3] 이노시톨이 쌀겨 유래의 이노시톨인산인 [1] 또는 [2]에 기재된 PDGF-BB 생성 항진제.

[4] [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 PDGF-BB 생성 항진제를 포함하여 이루어지는 간엽계 줄기세포 생성 촉진제.

[5] [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 PDGF-BB 생성 항진제를 포함하여 이루어지는 줄기세포 안정화제.

[6] [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 PDGF-BB 생성 항진제를 포함하여 이루어지는 진피 재생화제.

본 발명에 따르면, PDGF-BB의 생성 항진에 유효한 제(劑)가 제공됨과 아울러, 이것을 이용함으로써, 간엽계 줄기세포의 생성 촉진이나 안정화 등에 유효한 제도 제공된다.

[월귤 유래물]

월귤(학명: Vaccinium vitis-idaea L.)은 진달래과 산앵도나무속의 식물이다. 본 발명에서는 월귤 유래물로서, 월귤의 꽃, 화수(花穗), 과수(果穗), 과피, 과실, 대, 잎, 가지, 지엽, 줄기, 수피, 근경, 근피, 뿌리, 종자 또는 전초(全草)를 분쇄 후 착취한 것, 또는 분쇄 후에 용매 등으로 추출한 것, 또는 분쇄 후에 효소 처리나 기계적 처리 등의 처리에 의해 분해한 것을 이용할 수 있다.

월귤을 추출하는 경우, 추출 용매로서는 추출에 이용되는 용매이면 임의로 이용할 수 있고, 예컨대, 물, 메탄올, 에탄올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린 등의 알코올류, 클로로포름, 디클로로에탄, 사염화탄소, 아세톤, 아세트산에틸 등의 유기 용매를, 각각 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다.

추출은 상온에서 행해도 되지만, 가열하에서(예컨대 온수나 열수 등의 가열한 용매를 이용하여) 행해도 된다.

상기 용매로 추출하여 얻은 추출액을 그대로, 또는 농축한 엑기스를 이용하거나, 또는 이들 엑기스를 흡착법, 예컨대 이온 교환 수지를 이용하여 불순물을 제거한 것이나, 다공성 폴리머(예컨대 앰버라이트 XAD-2)의 칼럼으로 흡착시킨 후, 메탄올 또는 에탄올로 용출하고, 농축한 것도 사용할 수 있다. 또한, 공지된 분배법(예컨대 물/아세트산에틸 등을 이용한 분배법)에 의해 추출한 추출물 등도 이용된다.

월귤을 분해하는 경우, 세포간질이 선택적으로 분해되고, 또한 세포 형태는 유지되는 「단세포화 처리」를 행해도 된다. 예컨대 일본 특허 공개 제2002-193734에 기재된 방법을 참고로 할 수 있다. 구체적으로는, 식물을, 효소 분해나 기계적 분해 등에 의해, 세포벽을 거의 분해하지 않고 세포간질을 선택적으로 분해 또는 파괴하고, 대상물을, 세포 형태가 유지된 채의 상태로 세포 단위로 분해하여, 죽형, 액체 조성물 또는 동결 건조품으로 하는 처리를 말한다. 이러한 선택적인 분해를 행하기 위해서, 효소 처리를 이용할 수 있다. 예컨대, Rizopus속이나 Aspergillus속 등의 효소 원료로부터, 통상 공지된 방법에 의해 단리 또는 단리·정제한 것을 이용할 수 있고, 또한 시판품을 이용할 수도 있다. 이들 단세포화 효소를, 월귤에 작용시키는 경우에는, 이용하는 효소의 최적 온도 및 최적 pH 등의 최적 조건에서 작용시키고, 또한 필요 최소량을 이용하는 것이 바람직하다. 여기서, 단세포화 효소의 최적 온도는 30℃∼45℃이고, 최적 pH는 4∼6이다. 또한, 효소 반응 후에 잔사가 되는 부분은, 예컨대, 20 메시 정도의 체를 이용하여 제거함으로써, 본 외용 조성물에 함유시킬 수 있는 월귤 유래물로 할 수 있다.

또한, 상기한 단세포화 식물의 현탁액 외에, 이 현탁액을, 원심 분리 등의 방법에 의해 탈수하여 얻어지는 단세포 페이스트 또는 그 건조품을 본 발명에 이용할 수 있다.

월귤은, 지금까지, 단세포화 처리한 월귤을 함유하는 외용제(일본 특허 공개 제2002-193734), 살균, 항균 및 비듬 방지용 화장료(일본 특허 공개 소화 제61-238719), 엘라스타제 활성 저해제(일본 특허 공개 제2002-363088), 활성 효소 소거제(일본 특허 공개 제2002-363027), 멜라닌 생성 억제제(일본 특허 공개 제2002-363057), 과산화지질 생성 억제제(일본 특허 공개 제2002-363089), 콜라게나아제 활성 저해제(일본 특허 공개 제2003-12531), 히알루로니다아제 활성 저해제(일본 특허 공개 제2003-73287), 메탈로프로테아제 발현 저해제(일본 특허 공개 제2002-193738), 항글리게이션제(일본 특허 공표 제2004-505007), 및 피부 비후(肥厚), 피부 경화 등의 피부 장애에 대한 항피부 장애제(일본 특허 공개 제2005-306850)로서 이용된 예가 있으나, 월귤 유래물에 PDGF-BB 생성 촉진 작용, 간엽계 줄기세포 생성 촉진 작용, 줄기세포 안정화 작용, 및 진피 안정화 작용이 있는 것은 지금까지 전혀 알려져 있지 않고, 이들 작용은 본 발명자들에 의해 이번에 처음으로 발견되었다.

[망고스틴 유래물]

망고스틴(학명: Garcinia mangostana)은 고추나물과 가르시니아속의 식물이다. 본 발명에서는 망고스틴 유래물로서, 망고스틴의 과수(果穗), 과피, 과실, 대, 잎, 가지, 지엽, 줄기, 수피, 근경, 근피, 뿌리, 종자 또는 전초를 분쇄 후 착취한 것, 또는 분쇄 후에 용매 등으로 추출한 것을 이용할 수 있다.

망고스틴을 추출하는 경우, 추출 용매로서는 추출에 이용되는 용매이면 임의로 이용할 수 있고, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로필 알코올, 이소프로필 알코올, 부탄올, 이소부탄올 등의 저급 알코올 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등의 다가 알코올 또는 함수 다가 알코올, 아세톤, 아세트산에틸에스테르 등의 각종 유기 용매에 의해 추출하고, 용매를 증류 제거함으로써 얻을 수 있다.

또한, 용매에 효소를 첨가하여 추출 처리를 행해도 된다. 효소를 첨가함으로써, 과실의 세포 조직을 붕괴시킬 수 있고, 이에 따라 추출 효율을 보다 높일 수 있다. 효소로서는, 세포 조직 붕괴 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 효소로서는, 예컨대, 펙티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, α-아밀라아제, 피타아제를 들 수 있다. 이들 효소는 1종류를 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 혼합하여 이용해도 된다.

상기 추출 용매를 이용하여 얻어지는 추출액을 그대로 사용할 수 있으나, 추출 용매를 증류 제거하고, 필요에 따라 건조한 후에 함유시켜도 된다.

망고스틴은, 지금까지, 자외선 흡수제(일본 특허 공개 평성 제9-87155), MMP 저해제(일본 특허 공개 제2003-252745), 섬유아세포 부활제(일본 특허 공개 제2006-249051)로서 이용된 예가 있고, 또한 크산톤 유도체의 제조 및 콜라겐 생성 작용을 갖는(일본 특허 공개 제2009-84169) 것이 알려져 있으나, 망고스틴 유래물에 PDGF-BB 생성 촉진 작용, 간엽계 줄기세포 생성 촉진 작용, 줄기세포 안정화 작용, 및 진피 안정화 작용이 있는 것은 지금까지 전혀 알려져 있지 않고, 이들 작용은 본 발명자들에 의해 이번에 처음으로 발견되었다.

[황금 유래물]

황금(학명: Scutellaria baicalensis Georgi, Labiatae)은 차조기과 골무꽃속의 식물이다. 본 발명에서는 황금 유래물로서, 황금의 과수, 과피, 과실, 대, 잎, 가지, 지엽, 줄기, 수피, 근경, 근피, 뿌리, 종자 또는 전초를 분쇄 후 착취한 것, 또는 분쇄 후에 용매 등으로 추출한 것을 이용할 수 있다.

황금을 추출하는 경우, 추출 용매로서는, 통상 식물 추출 등에 이용되는 용매이면 임의로 이용할 수 있고, 예컨대 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-부탄올 등의 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등의 다가 알코올, 또는 이들 알코올류의 함수물, n-헥산, 톨루엔 등의 탄화수소계 용매 등을 들 수 있다. 이들은 각각 단독으로 이용해도 되고, 또는 임의의 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다. 그 중에서도 메탄올이나 에탄올 등의 저급 알코올이 바람직하게 이용된다.

황금은, 지금까지, 모유두 활성화제(일본 특허 공개 평성 제11-240823), 히알루론산 생성능 증강제(일본 특허 공개 평성 제10-95735), 자외선 피부 면역 기능 저하 방지용 면역 부활제(일본 특허 공개 평성 제11-71295), 항염증제(일본 특허 공개 제2006-8536), 및 항산화제(일본 특허 공개 평성 제5-238925)로서 이용된 예가 있으나, 황금 유래물에 PDGF-BB 생성 촉진 작용, 간엽계 줄기세포 생성 촉진 작용, 줄기세포 안정화 작용, 및 진피 안정화 작용이 있는 것은 지금까지 전혀 알려져 있지 않고, 이들 작용은 본 발명자들에 의해 이번에 처음으로 발견되었다.

[이노시톨·이노시톨인산]

이노시톨은 비타민 B의 일종이라고 말해지며, 생체 내에서도 글루코오스로부터 생합성되는 것이 알려져 있다. 이노시톨은 곡물, 겨, 콩, 과일 등의 식물에도 함유되어 있다. 이노시톨은 자주 그 히드록시기가 인산화된 형태(이노시톨인산)로 존재한다. 본 발명에서는 이러한 이노시톨인산도 사용할 수 있다. 본 발명에 이용되는 이노시톨에는, 이노시톨의 각종 입체 이성체가 포함된다. 이노시톨의 입체 이성체로서는, cis-이노시톨(1,2,3,4,5,6/0-이노시톨), epi-이노시톨(1,2,3,4,5/6-이노시톨), allo-이노시톨(1,2,3,4/5,6-이노시톨), myo-이노시톨(1,2,3,5/4,6-이노시톨), muco-이노시톨(1,2,4,5/3,6-이노시톨), neo-이노시톨(1,2,3/4,5,6-이노시톨), chiro-이노시톨(1,2,4/3,5,6-이노시톨), 및 scyllo-이노시톨(1,3,5/2,4,6-이노시톨)이 있다. 이노시톨인산으로서는, 이노시톨의 6개의 히드록시기 중 임의의 1 또는 2 이상이 인산화된 화합물을 들 수 있다. 그 중에서도, 이노시톨의 6개의 히드록시기가 모두 인산화된 화합물인 피트산이 바람직하다. 본 발명에서 이용되는 이노시톨 또는 이노시톨인산은, 쌀겨 유래인 것이 바람직하다. 또한, 이노시톨인산의 임의의 염도, 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명의 어느 실시형태에 따르면, 이노시톨 및 이노시톨인산은, 단체의 분말을 배지에 용해해서 적절하게 희석하여 사용할 수 있다.

이노시톨 및 이노시톨인산은, 다른 물질과의 조합에 의해 PDGF-BB 생성 항진 작용을 향상시킬 수도 있다. 이러한 다른 물질로서는, 효모 엑기스를 들 수 있고, 예컨대, 바이오다인(등록상표) EMPP(Arch Personal Care Products L.P.사 제조)를 사용할 수 있다. 상기 엑기스를 이용하는 경우에는, 엑기스의 건조 잔분으로부터 농도 변환함으로써, 배지에 0.1% 전후가 되도록 엑기스를 첨가하여 사용할 수 있다.

이노시톨 및 이노시톨인산은 지금까지, 이노시톨을 함유하는 노화 피부 및/또는 스트레스를 받은 피부용의 미용 조성물(일본 특허 공표 제2004-501069), 이노시톨인산(특히 피트산과 그의 염)을 함유하는 지방성 부종의 징후를 저감 또는 예방하기 위한 화장품 조성물(일본 특허 공개 평성 제8-253406), 및 피부 보습 및/또는 피부 보호 및/또는 피부 항노화용의 조성물(일본 특허 공개 제2010-150258)로서 이용된 예가 있다. 또한, 비타민 B류로서는, 비타민 B2 및 B6 함유의 세포 부활용 피부 외용제(일본 특허 공개 평성 제9-241146), 비타민 B 함유의 항산화제(일본 특허 공개 평성 제7-277939 및 일본 특허 공개 제205306831 등)로서 이용된 예가 있다. 그러나, 비타민 B류 또는 이노시톨 또는 이노시톨인산이, PDGF-BB 생성 촉진 작용, 간엽계 줄기세포 생성 촉진 작용, 줄기세포 안정화 작용, 및 진피 안정화 작용을 갖는 것은 지금까지 전혀 알려져 있지 않고, 이들 작용은 본 발명자들에 의해 이번에 처음으로 발견되었다.

[PDGF-BB 생성 항진제, 간엽계 줄기세포 생성 촉진제, 줄기세포 안정화제 및 진피 재생화제]

본 발명의 PDGF-BB 생성 항진제는, 월귤 유래물, 망고스틴 유래물, 황금 유래물, 이노시톨 및 이노시톨인산에서 선택되는 1 또는 2 이상을 유효 성분으로서 함유한다. 또한, 본 발명의 간엽계 줄기세포 생성 촉진제, 줄기세포 안정화제 및 진피 재생화제는, 상기한 유효 성분을 포함하는 본 발명의 PDGF-BB 생성 항진제를 함유한다. 본 발명의 PDGF-BB 생성 항진제, 간엽계 줄기세포 생성 촉진제, 줄기세포 안정화제 및 진피 재생화제(이후 이들을 총칭하여 「본 발명의 제」라고 하는 경우가 있음)는, 상기한 유효 성분 중 어느 1종을 단독으로 함유해도 되고, 2종류 이상을 임의의 조합 및 비율로 함유해도 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명자들의 지견에 따르면, PDGF-BB는 간엽계 줄기세포의 국재화에 관여하고 있으며, 혈관 내피세포에서의 PDGF-BB의 생성을 항진함으로써, 간엽계 줄기세포의 생성 항진 및 안정화를 도모할 수 있다(일본 특허 출원 제2010-209705). 즉, 본 발명의 PDGF-BB 생성 항진제는, 간엽계 줄기세포의 생성 항진 및 안정화의 목적으로 매우 유효하게 이용하는 것이 가능하다.

또한, 전술한 바와 같이, 간엽계 줄기세포의 생성 항진 및 안정화가, 혈관의 안정화, 조직 항상성의 유지, 손상 조직의 수복·재생(특히 진피의 재생), 항섬유화, 다발성 경화증이나 당뇨병 등의 각종 질환의 예방·치유, 대사 증후군 등의 만성 염증에 기초한 각종 상태의 예방·개선 등의 용도에 매우 유효한 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 PDGF-BB 생성 항진제를 이용한 본 발명의 간엽계 줄기세포 생성 촉진제 및 줄기세포 안정화제는, 이들 용도에 매우 유효하게 이용하는 것이 가능하다.

본 발명의 제는, 상기한 유효 성분을, 1종 또는 2종 이상의 다른 성분, 예컨대 부형제, 담체 및/또는 희석제 등과 조합한 조성물로 할 수도 있다. 조성물의 조성이나 형태는 임의이고, 유효 성분이나 용도 등의 조건에 따라 적절하게 선택하면 된다. 상기 조성물은, 그 제형에 따라, 부형제, 담체 및/또는 희석제 등 및 다른 성분과 적절하게 조합한 처방으로, 통상적인 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 제는, 각종의 음식품, 사료(애완동물 사료 등)에 배합하여 인간 및 동물에게 섭취시킬 수 있다. 또한, 화장품 등에 배합하여 인간 및 동물에게 사용하거나, 또는 의약 제제로서 인간 및 동물에게 투여해도 된다.

구체적으로, 본 발명의 제를 음식품이나 사료 등에 배합하는 경우, 식물체 또는 그 추출물의 배합량(건조 질량)은, 이들의 종류, 목적, 형태, 이용 방법 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 예컨대, 성인 1일당 식물 또는 그 추출물의 섭취량이, 암라 추출물에서는 0.5 ㎎∼1 g(건조 잔분), 링곤베리(lingonberry) 추출물에서는 0.5 ㎎∼3 g 정도가 되도록 배합할 수 있다. 특히, 보건용 음식품 등으로서 이용하는 경우에는, 본 발명의 유효 성분에 의한 소정의 효과가 충분히 발휘되도록, 성인 1일당, 암라 추출물에서는 10 ㎎∼500 ㎎(건조 잔분), 린곤베리 추출물에서는 10 ㎎∼1.5 g(건조 잔분)이 되도록 함유시키는 것이 바람직하다.

음식품이나 사료의 형태로서는, 임의의 형태로 하는 것이 가능하고, 예컨대, 과립형, 분말형, 페이스트형, 겔형, 고형형, 또는, 액체형으로 성형할 수 있다. 이들 형태에는, 음식품 등에 함유하는 것이 인정되고 있는 공지의 각종 물질, 예컨대, 결합제, 붕괴제, 증점제, 분산제, 재흡수 촉진제, 교미제(矯味劑), 완충제, 계면 활성제, 용해 보조제, 보존제, 유화제, 등장화제, 안정화제나 pH 조정제 등의 부형제를 적절하게 함유시킬 수 있다.

본 발명의 제를 화장품에 적용하는 경우, 식물체 또는 그 추출물의 배합량(건조 질량)은, 이들의 종류, 목적, 형태, 이용 방법 등에 따라, 적절하게 결정할 수 있다. 예컨대, 화장료 전량 중에, 암라 추출물, 링곤베리 추출물 각각 0.00001%∼50%(건조 질량 환산)를 배합할 수 있고, 그 중에서도 0.0001%∼5%(건조 질량 환산)가 바람직하다.

상기 성분에 더하여, 또한 필요에 따라, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 통상 화장품이나 의약품 등의 피부 외용제에 이용되는 성분, 예컨대 산화 방지제, 유분, 자외선 방어제, 계면 활성제, 증점제, 알코올류, 분말 성분, 색재, 수성 성분, 물, 각종 피부 영양제 등을 필요에 따라 적절하게 배합할 수 있다.

또한, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속 이온 봉쇄제, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 부틸파라벤 등의 방부제, 카페인, 타닌, 베라파밀, 트라넥삼산 및 그 유도체, 감초 추출물, 글라브리딘, 모과나무의 과실의 열수 추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리시리진산 및 그 유도체 또는 그의 염 등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코직산 등의 미백제, 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 자당, 트레할로오스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.

또한, 이 피부 외용제는, 외피에 적용되는 화장료, 의약부외품 등, 특히 적합하게는 화장료에 널리 적용하는 것이 가능하다. 그 제형도, 피부에 적용할 수 있는 것이면 어느 것이나 되고, 용액계, 가용화계, 유화계, 분말 분산계, 물-오일 이층계, 물-오일-분말 삼층계, 연고, 화장수, 겔, 에어졸 등, 임의의 제형이 적용된다.

본 발명의 제를 화장품으로서 이용하는 경우에는, 화장수, 유액, 파운데이션, 립스틱, 립크림, 클렌징 크림, 마사지 크림, 팩, 핸드 크림, 핸드 파우더, 보디 샴푸, 보디 로션, 보디 크림, 목욕용 화장품 등의 형태로서 이용하는 것이 바람직하며, 이때, 이들 형태로 할 때에 통상 첨가·배합되는 성분, 예컨대 보습제, 향료, 가용화제, 안정화제, 자외선 흡수제, 자외선 산란제 등의 성분도 적절하게 배합할 수 있다.

본 발명의 제를 외용제로서 적용하는 경우, 식물체 또는 그 추출물의 배합량(건조 질량)은, 이들의 종류, 목적, 형태, 이용 방법 등에 따라, 적절하게 결정할 수 있다. 예컨대, 화장료 전량 중에 0.00001%∼50%(건조 질량 환산)가 바람직하고, 그 외의 음식품에서는 0.0001%∼5%(건조 질량 환산)가 바람직하다.

본 발명의 제를 의약부외품으로서 이용하는 경우이면, 상기 제제는 경구적으로 또는 비경구적(정맥 투여, 복강내 투여 등)으로 적절하게 사용된다. 제형도 임의이며, 예컨대 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등의 경구용 고형 제제나, 내복액제, 시럽제 등의 경구용 액체 제제, 또는, 주사제 등의 비경구용 액체 제제 등, 어떠한 형태로도 공지된 방법에 의해 적절하게 조제할 수 있다. 이들 의약 제제에는, 통상 이용되는 결합제, 붕괴제, 증점제, 분산제, 재흡수 촉진제, 교미제, 완충제, 계면 활성제, 용해 보조제, 보존제, 유화제, 등장화제, 안정화제나 pH 조정제 등의 부형제를 적절하게 사용해도 된다.

외용제이면, 각종의 연고제 등의 형태로 널리 적용하는 것이 가능한데, 로션제, 현탁제·유제, 액제, 연고제, 첩부제 등의 형태로서 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 제가 취할 수 있는 형태가, 이들 제형 및 형태에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제를 투여했을 때의 간엽계 줄기세포 중의 PDGF-BB 유전자의 발현은, 예컨대 PDGF-BB의 양을 측정함으로써 발현량을 결정하여, 평가할 수 있다. 바람직하게는, 이 측정은, PDGF-BB에 특이적인 항체를 이용하여, 당업계에 있어서 주지의 방법, 예컨대 형광 물질, 색소, 효소 등을 이용하는 면역 염색법, 웨스턴 블롯법, 면역 측정 방법, 예컨대 ELISA법, RIA법 등, 여러 가지 방법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 예컨대, 간엽계 줄기세포 중의 총 RNA를 추출하고, PDGF-B를 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정하여 평가할 수도 있다. mRNA의 추출, 그 양의 측정도 당업계에 있어서 주지이며, 예컨대 RNA의 정량은 정량 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)법, 예컨대 리얼타임 폴리메라아제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 행해진다. RT-PCR에 적절한 프라이머의 선정은, 당업자에게 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다.

실시예

다음으로 실시예에 의해 본 발명을 더 상세히 설명한다. 또한, 본 발명은 이것에 의해 한정되는 것은 아니다.

[평가 대상 샘플]

PDGF-BB의 생성 항진 작용의 평가 대상 샘플로서 이하를 이용하였다.

·이노시톨:

시판의 이노시톨 분말(와코 쥰야쿠 고교사 제조: 미오이노시톨)을 PBS에 용해한 후, 후술하는 배지에 대하여 10 ppm이 되도록 사용하였다.

·피트산:

시판의 피트산(나카라이테스크사 제조: 50% 수용액)을, 후술하는 배지에 대하여 10 ppm이 되도록 사용하였다.

·황금 엑기스:

황금의 주피(周皮)를 제외한 뿌리를, 70 체적% 에탄올(물과 에탄올의 체적 비율 3:7의 혼합액)로 추출하여 얻어진 추출물을 이용하였다. 추출물은 건조하여 보존하고, 사용 직전에 70 체적% 에탄올을 첨가하여 용해시킨 후에, 후술하는 배지에 대하여(추출물의 건조 중량 환산으로) 15 ppm이 되도록 사용하였다.

·월귤 CRS(cell release system):

월귤의 잎을 세포 분해 효소(마세로자임(macerozyme) A)로 처리한 세포 현탁액에, 1,3-BG를 40 체적%가 되도록 첨가한 현탁액을 이용하였다. 현탁액은 액체로서 보존하고, 후술하는 배지에 대하여(추출물의 건조 중량 환산으로) 30 ppm이 되도록 사용하였다.

·망고스틴 수피 엑기스:

망고스틴의 수피을, 70 체적% 1,3-BG(물과 1,3-BG의 체적 비율 3:7의 혼합액)로 추출하여 얻어진 추출물을 이용하였다. 추출물은 건조하여 보존하고, 사용 직전에 70 체적% 1,3-BG를 첨가하여 용해시킨 후에, 후술하는 배지에 대하여(추출물의 건조 중량 환산으로) 10 ppm이 되도록 사용하였다.

[혈관 내피세포에서의 PDGF-BB의 생성 항진 작용의 평가]

인간 혈관 내피세포 HUVEC를 EGM-2 배지(산코 쥰야쿠)에서 계대배양하고, 계대 4대째의 세포를, VEGF-A를 포함하지 않는 Humedia-EG2 배지(쿠라보)에 현탁하며, 콜라겐 코팅된 24구멍 멀티 플레이트(아사히 가라스)에 20,000개의 비율로 파종하고, 5% CO₂ 존재하, 37℃에서 세포가 집밀(集密)에 이를 때까지 3일∼5일간의 배양을 행하였다. 상기한 각 샘플을 상기 농도가 되도록 첨가, 또는 각 평가 대상 샘플이 용해되어 있는 용매를 첨가한 Humedia-EG2 배지(쿠라보)로 교환한 후, 2일간 더 배양을 행하였다. 배양 후의 세포로부터 RNA 추출 시약 MagNA Pure LC mRNA HS 키트(Roche)와 자동 핵산 추출 장치 MagNA Pure LC 1.0 인스트루먼트(Roche)를 이용하여, 제공된 프로토콜에 따라 mRNA의 추출·정제를 행하였다. 각 샘플에 대해서, 동용량의 mRNA를 주형으로, 후술하는 서열 번호 1 및 2의 프라이머쌍, 반응 시약 QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen)와 반응 장치 LightCycler(Roche)를 이용하여, PDGF-B 유전자의 원스텝 정량 리얼타임(RT)-PCR을 행하였다. 조성 조건은 Qiagen의 프로토콜에 따랐다. 또한, RT-PCR의 조건은, RT 반응 50℃에서 20분, 초기 변성 95℃에서 15분, 변성 94℃에서 15초, 어닐링 60℃에서 20초, 신장 72℃에서 30초로 하였다. 또한, G3PDH는 내부 표준으로서 이용하고(서열 번호 3 및 4의 프라이머쌍), 이것을 이용하여 대조군의 mRNA량을 보정하였다.

[평가 결과]

상기 평가 순서에 따라, 상기 각 샘플에 대해서 얻어진 PDGF-BB의 mRNA의 발현량의, 대조(각 평가 대상 샘플이 용해되어 있는 용매)에 대해서 얻어진 발현량에 대한 비를, 이하의 표에 나타낸다. 이하의 결과로부터, 이들 성분은 PDGF-BB 발현을 항진시키는 활성을 갖는 것을 알 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> SHISEIDO COMPANY, LTD. <120> PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR-BB PRODUCTION PROMOTER, AND MESENCHYMAL STEM CELL PRODUCTION ACCELERATOR, STEM CELL STABILIZER AND DERMAL REGENERATOR COMPRISING THE SAME <130> SSD-Z669-PCT <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGF-B Forward Primer <400> 1 cctggcatgc aagtgtga 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGF-B Reverse Primer <400> 2 ccaatggtca cccgattt 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G3PDH Forward Primer <400> 3 gcaccgtcaa ggctgagaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G3PDH Reverse Primer <400> 4 atggtggtga agacgccagt 20

Claims

월귤 추출물, 망고스틴 추출물, 황금 추출물, 이노시톨 및 이노시톨인산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상을 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB) 생성 항진제.
제1항에 있어서, 이노시톨 또는 이노시톨인산을 포함함과 아울러, 효모 엑기스를 더 포함하여 이루어지는 PDGF-BB 생성 항진제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 이노시톨 또는 이노시톨인산이 쌀겨 유래인 PDGF-BB 생성 항진제.
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