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KR101867428B1 - 경구 백신 투여용의 개선된 항원보강제 시스템 - Google Patents

경구 백신 투여용의 개선된 항원보강제 시스템 Download PDF

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KR101867428B1
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Abstract

본 발명은, 개선된 안정성과 증가된 효력을 가지며 증강된 Th1 반응을 제공하는 항원보강제 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 조성물은 경구로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명은, 이러한 조성물의 제조 방법 및 상기 개선된 항원보강제 조성물의 투여 방법을 제공한다.

Description

경구 백신 투여용의 개선된 항원보강제 시스템{IMPROVED ADJUVANT SYSTEM FOR ORAL VACCINE ADMINSTRATION}
관련 출원의 교차 참조
본원은 2012년 4월 4일에 출원된 미국 가출원 제61/686,372호의 출원일에 대해 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다.
패혈성 인두염, 성홍열, 괴사근막염, 연쇄구균독소쇼크증후군 및 농가진과 같은 질환은 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes)에 의한 감염으로 야기된다. 이러한 질환들은 총괄하여 그룹 A 연쇄상구균 질환(GAS)이라고 한다. 스트렙토코커스 파이오제네스에 의해 유발된 GAS 및 다른 감염증들은 사람의 발병율과 사망율에 중대한 원인이 된다. 전세계적으로 오십만명의 사람이 매년 GAS 질환으로 사망하는 것으로 추정된다. 스트렙토코커스 파이오제네스는 잠재적으로 치명적인 병원체인 것에 더하여 매년 추가의 6억명의 인두염 환자를 야기한다. 미국에서만도 대략 천만건의 비침습성 GAS 질환과 추가로 만천건의 침습성 질환이 있으며, 이들 건의 약 10% 정도가 사망에 이른다. 소아인두염 관리를 위해 미국 보건 시스템의 연간 비용은 2억2천만 달러 내지 5억4천만 달러로 추산된다. 스트렙토코커스 파이오제네스의 퇴치에 효과적인 백신은 GAS 질환으로부터 수천명의 생명을 구할 수 있고 수백만 달러의 의료비용을 절감할 수 있다. GAS 및 스트렙토코커스 파이오제네스에 대해 효과적인 백신을 개발하고자 다양한 시도들이 있어왔으나 어떠한 시도도 성공적인 것으로 입증되지 않았다.
백신 개발에 있어서, 방어면역반응을 유도할 의도로 투여되는 항원에 대하여 복용자의 반응을 면역학적으로 증강시키는(즉, 조절하는) 것이 종종 필요하다. 이러한 목적을 위해 백신 개발에서 사용되는 주요 기술들 중 하나는 해당 항원(들) 이외에 화학적 또는 생물학적 항원보강제(adjuvant)를 제공하는 것이다. 이와 관련하여 가장 잘 허용되고 있는 조성물은 다양한 금속(예: 알루미늄) 항원보강제 화합물이다. 전형적으로, 백신 조성물 중에서 해당 항원은 알루미늄-함유 항원보강제 화합물상에 흡착하거나 그렇지 않으면 알루미늄-함유 항원보강제 화합물과 회합한다.
알루미늄 항원보강제는 사람 백신에 사용함에 있어서 이의 안전성에 대해 오랜 역사를 갖고 있다. 알루미늄의 항원보강제 활성은, 항원 미립자를 만들고, 그로 인해 주사부위에 자극을 일으키며, 항원제시세포(APC)에 의한 내재화 이후의 NALP3 염증조절복합체의 활성화로부터 발생하는 것으로 여겨지고 있다. 그러나, 알루미늄 항원보강제들은 전형적으로 편향된 Th2형 면역반응을 자극하기 때문에 알루미늄 항원보강제 단독으로는 광범위한 다수의 항원 표적들에 대해 항상 적절한 것은 아니다. 다양한 항원들에 대해 문서에서, 알루미늄-함유 항원보강제를 함유하는 제형이, Th2 반응에 대해 전형적인, IgG1 항체의 생성은 자극하는 반면, Th1 반응에 대해 전형적인, IgG2a 항체는 거의 또는 전혀 자극하지 않는 것으로 보고되어 있다.
따라서, 개선된 안정성과 증가된 효력을 나타내고 증강되고 혼합된 Th1/Th2 반응을 제공할 수 있는 항원보강제 조성물을 제공하는 것이 필요하다. 게다가, 위장관에서 분해되지 않고 장연관림프조직을 표적으로 하는 경구 투여 백신/항원보강제 배합물이 필요하다. 경구 투여 백신은 또한, 이의 투여를 위한 전문의료인을 필요로 하지 않고 또한 백신주사제가 안고 있는 엄격한 무균 제조 요건을 필요로 하지 않는다는 이점이 있다.
발명의 요지
본 발명은, 광범위한 스펙트럼의 항원 표적들에 대해 복용자(예: 포유동물)의 면역반응을 증강시키는 신규한 항원보강제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 이들 조성물 일부에서, 알루미늄 항원보강제는 C형 렉틴(CTL) 수용체에 대한 리간드와 회합(예: 화학적으로 연결(linked))된다. 본 발명의 조성물 및 방법들은 CTL 수용체 리간드의 차별적 유도 면역반응의 발생 능력과 조합하여 항원제시세포의 내재화 효율과 알루미늄-함유 항원보강제 화합물의 입증된 안전성을 이용함으로써 백신 및 치료제 개발 분야에서 유용한 개선점을 제공한다고 판단할 수 있지만, 본 발명은, 임의의 특정 작용 방법으로 한정되는 것을 의도하지 않는다.
바람직한 양태에서, 본 발명은, 개선된 안정성 및/또는 증가된 효력을 나타내고/나타내거나 증강된 Th1 반응을 제공하는 경구 투여 가능한 항원보강제 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은, 이들 조성물의 제조 방법 및 개선된 항원보강제 조성물의 투여 방법을 제공한다.
본 발명은, 하나 이상의 CTL 수용체 리간드를 하나 이상의 항원 및 임의로 하나 이상의 알루미늄 항원보강제와 배합하여 포함하는 면역조성물을 제공한다. 바람직한 특정 양태에서, CTL 수용체 리간드(들)는 알루미늄 항원보강제(들)와 연결된다. CTL 수용체 리간드(들)는 배위결합(들), 공유결합(들), 친수성결합(들) 또는 소수성결합(들)에 의해 알루미늄 항원보강제(들)에 연결될 수 있다. 추가로, CTL 수용체 리간드(들)는 적어도 부분적으로 플루오라이드, 포스페이트, 설페이트 또는 카보네이트 그룹을 통해 알루미늄 항원보강제(들)에 연결될 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, CTL 수용체 리간드(들)는 단당류, 이당류 및/또는 다당류를 포함한다. 본 발명의 한 가지 측면에서, 이들 당류는 말단 포스페이트 그룹 또는 포스포디에스테르 주쇄(backbone)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 면역조성물은 추가로 알루미늄 옥시하이드록사이드, 알루미늄 하이드록시포스페이트, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트, 알루미늄 포스페이트 또는 이들의 배합물을 포함하는 알루미늄 항원보강제와 같은 하나 이상의 금속 항원보강제를 포함할 수 있다.
면역조성물과 항원보강제 시스템은 백신-예방가능한 또는 백신-치료가능한 질환에 대한 하나 이상의 적합한 백신과 배합되어 동물에 투여될 수 있다. 면역조성물과 항원보강제 시스템은 적합한 생물학적 생성물(예: 치료 단백질 및/또는 항체) 또는 소분자 약물 조성물과 배합되어 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항원보강제와 면역조성물의 투여에 적합한 동물은 포유류(예: 사람), 일반적으로 사육되는 반려동물(예: 개, 고양이, 말 등) 또는 생산/농업적으로 중요한 동물(예: 소, 돼지, 양 및 염소)을 포함한다.
추가로, 본 발명은, 항원과 CTL-작용제를 알루미늄 항원보강제에 흡착시키고, pH 의존 용해도를 갖는 중합체를 첨가하여 백신 제형을 형성하며, 상기 백신 제형을 낮은 pH 용액에 첨가하여 중합체를 침전시켜 경구 투여 면역조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 포스페이트 완충액 중에서 항원을 아크릴 수지, 만니톨 및 수크로스와 혼합하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 낮은 pH의 완충액 내에 분무하여 현탁액을 형성하며, 상기 현탁액을 분말로 되도록 건조시켜 경구 투여용 무수 분말 제형을 제형화하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 포스페이트 완충액 중에서 항원을 아크릴 수지, 만니톨 및 수크로스와 혼합하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 낮은 pH의 완충액 내에 분무하여 현탁액을 형성하여 경구 투여용 현탁액을 제형화하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 알루미늄 항원보강제에 C형 렉틴 수용체 리간드가 연결됨으로써 공동내재된(co-localized) 항원과 항원보강제의 수용체-매개된 내포작용(endocytosis)이 일어날 수 있음을 도해한 구성도이다. 바람직한 양태에서, 공동내재된 항원과 항원보강제의 내포작용은 Th1 및 Th2 사이토카인의 생성을 자극할 뿐만 아니라 항원을 엔도솜에 대해 표적화하며, 여기서 MCH I 및 II 분자에 항원의 교차 제시(cross presentation)가 일어날 수 있다.
도 2는 단당류가 리간드 교환 결합이 가능한 그룹을 함유하도록 변형되지 않거나 중합되지 않는다면 알루미늄 항원보강제에 대한 흡착성이 낮음을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 알루미늄 입자에 적절히 연결된 당류가 항원의 부재하에 생리적 수준의 포스페이트에 노출되더라도 알루미늄 입자로의 부착을 유지하고 있음을 보여주는 그래프이다.
도 3b는 알루미늄 입자에 적절히 연결된 당류가 항원의 존재하에 생리적 수준의 포스페이트에 노출되더라도 알루미늄 입자로의 부착을 상당히 유지하고 있음을 보여주는 그래프이다.
도 4는 스트렙토코커스 파이오제네스를 표적으로 하는 항원과 함께 제형화된 면역조성물이 전체 IgG의 생성을 증강시켰음을 보여주는 그래프이고, 이는 용량 절감 가능성(potential for dose sparing)을 나타낸다.
도 5는 스트렙토코커스 파이오제네스를 표적으로 하는 항원과 함께 제형화된 면역조성물이 랫트에서의 Th2 반응을 가리키는 IgG2a의 생성을 유도하였음을 보여주는 그래프이다.
도 6은 스트렙토코커스 파이오제네스를 표적으로 하는 항원과 함께 제형화된 면역조성물이 랫트에서의 Th1 반응을 가리키는 IgG2b의 생성을 유도하였음을 보여주는 그래프이다.
도 7은 BSA와 유드라지트(Eudragit)의 코아세르베이션(coacervation) 이후의 각 단계에서의 BSA 그래프이다.
도 8a 및 8b는 각각, 흡착된 BSA의 코아세르베이션 이후의 BSA 흡착 그래프 및 만난 흡착 그래프이다.
도 9a 및 9b는 각각, 유드라지트의 백분율을 줄인 이후에 흡착된 BSA의 코아세르베이션 이후의 BSA 흡착 그래프 및 만난 흡착 그래프이다.
도 10은 흡착된 SpeA/B의 코아세르베이션 후의 SpeA/B 흡착 그래프이다.
도 11은 유드라지트 L100-55로 코아세르베이션한 이후의 SpeA/B 흡착 그래프이다.
도 12는 0일, 14일 및 35일에 항원 특이적 혈청 중의 전체 IgG의 그래프이다.
도 13은 백신접종된 동물의 혈청에 의한 야생형 SpeA 독소의 중화 그래프이다.
도 14는 25℃(A) 및 37℃(B)에서의 보관 후의 CRM의 분해 그래프이다.
도 15는 25℃(A) 및 37℃(B)에서 현탁액 및 용액의 보관 후의 CRM의 잔류율 그래프이다.
도 16은 25℃(A) 및 37℃(B)에서 무수 분말 및 용액의 보관 후의 CRM의 잔류율 그래프이다.
본 발명은, 개선된 안정성 및/또는 증가된 효력을 나타내고/나타내거나 증강된 Th1 반응을 제공하는 항원보강제 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은, 이들 조성물의 제조 방법 및 상기 개선된 항원보강제 조성물의 투여 방법을 제공한다.
C형 렉틴(CTL) 수용체는 대식세포, 단세포, 수지상세포 및 B-세포를 포함하여 면역계의 많은 세포상에 위치한다. CTL 수용체는 병원체에 의해 생성될 수 있는 다양한 당류를 인식한다. CTL 수용체를 통한 신호전달은 CD4+ T-세포를 Th1, Th2 또는 Th17 세포로 분화시키는 사이토카인의 생성을 유도할 수 있다. 또한, CTL 수용체의 표적화는, MHC I 분자 상의 외인성 항원의 교차 제시 및 CD8+ T-세포의 활성화를 유도하여 세포면역반응을 초래할 수 있다. 용해성 상태로 있는 CTL 수용체 작용제는 면역반응을 약화시킬 수 있는 한편, 입자 상태로 있는 CTL 수용체 작용제는 면역반응의 증강에 더 적합한 것으로 관찰되었다. 알루미늄 항원보강제에 CTL 수용체 리간드를 연결시킴으로써 이들 두 화합물의 작용 기전을 이용하여 강건한 면역반응을 얻을 수 있는 것으로 판단된다. 알루미늄-함유 항원보강제는 APC를 표적으로 삼고 항원과 CTL 작용제가 반드시 포식소체(phagosome)에 공동내재하도록 하는 전달 입자로 작용한다. 알루미늄 항원보강제와 CTL 작용제는, 공동내재된 항원의 Th1과 Th2 사이토카인 및 MHC I 및 II 교차 제시를 유도하여 강력한 면역반응을 일으킨다(도 1).
획득된 많은 사례에서, 혼합된 Th1/Th2 면역반응은 알루미늄 옥시하이드록사이드와 같은 종래 백신 항원보강제의 편향된 Th2 반응에 비하여 질환에 대하여 보다 강건한 보호를 제공한다. 본 발명의 이점은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 안전성을 유지하면서 종래 알루미늄 항원보강제보다 증강된 면역원성, 비축능력, 제조 용이성 및 항원보강제 시스템 제품의 낮은 비용을 포함한다. 다수의 신호전달 경로를 통한 항원제시세포의 활성화는 증강된 면역반응과 항원 용량 절감 가능성을 제공한다. 항원보강제 시스템의 성분들은 본질적으로 안정하여 전형적인 백신 저장 조건하에서 비축이 가능하다. 항원보강제 시스템 원료의 성질, 구입성 및 낮은 비용은 특화된 장비없이도 항원보강제의 신속한 제조를 가능하게 한다. 따라서, 비축된 항원보강제를 보충해야 하는 비상시에, 제때에 추가의 항원보강제를 공급할 수 있다. 이와 같은 신규한 항원보강제 시스템은 생물학적 공격이나 감염원의 대유행에 대하여 백신의 방어 효력을 증강시키는데 필수적인 역할을 할 수 있다.
본 발명은, 종래의 알루미늄 항원보강제에 비하여 증강된 Th1 반응을 제공하는 항원보강제 조성물을 제공한다. 하나 이상의 알루미늄 항원보강제와 하나 이상의 CTL 수용체 작용제의 조합(바람직하게는 알루미늄 항원보강제에 CTL 수용체 작용제가 결합됨)은 단독 알루미늄 항원보강제에 비하여 Th1 반응을 증가시킨다. 도 6은 만난 결합된 알루미늄 옥시하이드록사이드와 Spe A/B 항원, 만노스-1-포스페이트 결합된 알루미늄 옥시하이드록사이드와 Spe A/B 항원 및 CTL 수용체 작용제 없는 알루미늄 옥시하이드록사이드와 Spe A/B 항원을 랫트에 주사하여 생성된 IgG2b 항체의 비교 결과를 보여준다. 랫트에서 알루미늄 옥시하이드록사이드에 결합된 CTL 수용체에 대한 IgG2b 반응의 증가는 단독 알루미늄 옥시하이드록사이드에 대한 Th1 반응과 비교했을 때 Th1 반응 증가에 해당한다. 도 5는 또한 랫트에서 알루미늄 옥시하이드록사이드에 결합된 CTL 수용체에 대한 IgG2a 반응의 증가를 보여준다. 이 결과는 단독 알루미늄 옥시하이드록사이드에 대한 Th2 반응에 비하여 알루미늄 옥시하이드록사이드에 결합된 CTL 수용체에 대한 Th2 반응의 증가에 해당한다. 따라서, 본 발명의 항원보강제 조성물은 CTL 수용체 작용제에 결합되지 않은 알루미늄 항원보강제와 비교했을 때 증가된 항체 반응 뿐만 아니라 증가된 Th2 반응을 제공한다. 본 발명의 알루미늄 화합물 결합된 CTL 수용체 작용제 항원보강제는 단독 알루미늄 항원보강제보다 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 75% 이상 또는 100% 이상 증강된 항체 역가 및/또는 증강된 Th2 반응을 제공할 수 있다. 본 발명의 알루미늄 화합물 결합된 CTL 수용체 작용제 항원보강제는 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 25% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 75% 또는 약 25% 내지 약 50% 증강된 항체 역가 및/또는 증강된 Th2 반응을 제공할 수 있다.
전형적으로, 단당류와 같은 소분자 CTL 수용체 작용제는 알루미늄-함유 항원보강제의 표면에 흡착되지 않는다. 그러나, 단당류는, 알루미늄-함유 항원보강제에 단당류 분자의 리간드 교환 연결(linkage)을 허용하는 플루오라이드, 포스페이트, 설페이트 또는 카보네이트 그룹을 비롯한, 이에 국한되지 않는 화학적 그룹에 의해 변형될 수 있다. 플루오라이드, 포스페이트, 설페이트 또는 카보네이트 그룹의 부가에 의한 당류의 변형 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다[참조: Cantos, et al. Biochem. J. (1993) 288: 155-160; Carbohydrate Chemistry, Royal Society of Chemistry, Ed. RD Guthrie (1968)]. 이는 CTL 수용체 작용제로서의 만노스와 알루미늄 옥시하이드록사이드를 이용하여 방법을 도 2에 나타낸다. 미변형된 만노스는 알루미늄과 거의 연결되어 있지 않다. 그러나, 만노스의 1번 위치(M1P)에 포스페이트의 부가로 알루미늄 항원보강제에 대해 CTL 작용제가 거의 100% 연결된다.
알루미늄 항원보강제 입자에 대한 당류의 결합능(avidity)을 높일 수 있는 다른 방법은 중합이다. 예를 들어, 알루미늄 항원보강제 입자에 대한 당류의 결합능은 중합에 의해 당류의 크기를 증가시켜 다당류를 생성함으로써 높일 수 있다. 알루미늄 항원보강제에 대한 결합능 증가는 단당류에 비하여 다당류의 다수의 상호작용에 기인하며, 이로 인해 다당류 작용제가 알루미늄 항원보강제 입자에 대해 안정하게 연결될 수 있다. 한 가지 양태에서, 항원보강제 시스템의 물리적 확인은 알루미늄 항원보강제에 CTL 수용체 리간드의 연결 뿐만 아니라 이러한 연결의 안정성에 중점을 둔다. 도 2에서 보는 바와 같이, 만노스의 다당류 만난으로의 중합은 CTL 작용제가 알루미늄 항원보강제에 대해 거의 100% 연결되도록 한다.
투여 후 체액에 노출되었을 때 알루미늄 입자와 CTL 작용제의 연결이 안정성을 유지하는 것은 중요하다. 포스페이트, 시트레이트 및 단백질과 같은 세포간질액 성분은 알루미늄-함유 항원보강제와 CTL 작용제의 연결을 제거할 수 있는 가능성이 있다. 생성된 용해성 CTL 작용제는 면역반응에 나쁜 영향을 미칠 수 있다. 도 3A는 M1P 뿐만 아니라 만난이 항원의 부재하에서 30분간 50mM 포스페이트 pH 7.4에 노출되었을 때 알루미늄 옥시하이드록사이드와 거의 100% 연결을 유지하고 있음을 보여준다. 도 3b는 M1P 뿐만 아니라 만난이 항원의 존재하에서 30분간 50mM 포스페이트 pH 7.4에 노출되었을 때 알루미늄 옥시하이드록사이드와 100%보다 약간 적은 연결을 유지하고 있음을 보여준다. 이는 배위결합, 공유결합, 친수성결합 또는 소수성결합을 통한 알루미늄 입자에 대한 CTL 작용제의 연결이 투여 후에도 회합을 유지하는데 적합하다는 것을 증명한다.
본 발명의 조성물에 사용된 항원은 인플루엔자 바이러스 항원(예: 헤마글루티닌(HA) 단백질, 매트릭스 2(M2) 단백질, 뉴라미니다제), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원(예: 융합단백질, 부착 당단백질), 폴리오, 유두종 바이러스(예: E6 단백질, E7 단백질, L1 단백질 및 L2 단백질과 같은 사람 유두종 바이러스(HPV)), 단순 헤르페스, 광견병 바이러스 및 플라비바이러스 바이러스 항원(예: 뎅기열 바이러스 항원, 웨스트나일 바이러스 항원), HBV 및 HC로부터의 항원을 포함한 간염 바이러스 항원과 같은 바이러스 항원을 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용된 항원은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 및 그램-음성 장내 병원균(예: 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬젤라(Shigella), 예르시니아(Yersinia), 크렙시엘라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia), 프로테우스(Proteus), 바실러스 안트라시스(B. anthracis), 클로스트리듐 테타니(C. tetani), 바실러스 퍼투시스(B. pertussis), 스트렙토코커스 파이오제네스(S. pyogenes), 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 나이세리아 메닌지티디스(N. meningitidis) 및 해모필러스 인플루엔자 b형(Haemophilus influenza type b)으로부터의 항원을 포함하는 세균 항원을 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용되는 항원은 캔디다 종(Candida spp.), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 크리토코커스 네오포만스(Crytococcus neoformans), 코시디오데스 종(Coccidiodes spp.), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 파라코시디오데스 브라실리엔시스(Paracoccidiodes brasiliensis), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비백스(Pasmodium vivax), 플라스모듐 오발(Plasmodium ovale) 및 플라스모듐 말라리애(Plasmodium malariae)로부터의 항원을 포함한 진균 항원을 포함한다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 그램-양성 세포외 세균 병원체의 중요한 종인 스트렙토코커스 파이오제네스(그룹 A 스트렙토코커스, GAS)의 항원이 백신중에서 본 발명의 항원보강제와 조합된다. 스트렙토코커스 파이오제네스 내독소 A(SpeA) 및 다른 분비된 초항원 독소는 이들 단백질이 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군의 많은 발생과 연관이 있고 침습성 감염증의 독성 인자이기 때문에 스트렙토코커스 파이오제네스 감염증의 예방 백신을 위한 잠재적인 후보물질이다. 특히, 세포외 발열성 외독소 A, B 및 C로부터의 항원이 그러한 후보물질이다. 대부분의 스트렙토코커스 파이오제네스 M 단백질 혈청형은 세포외 시스테인 프로테아제(스트렙토패인)을 발현하는데, 이 프로테아제는 구조 또는 기능이 SpeA 또는 어떠한 다른 초항원과도 상동성은 없지만 역사상 스트렙토코커스 파이오제네스 외독소 B(SpeB)라는 용어로 쓰여왔다. 이들 두 항원은 하나의 단일 융합단백질로 조합되어 독소 중화와 세균 옵소닌화 둘 다를 통해 면역계가 감염을 제거할 수 있도록 한다. 본 발명의 한 가지 양태에서, Spe A/B가 항원으로서 사용된다(미국특허 제7,750,132호). 이러한 SpeA/B는 부분적으로 유전적으로 약독화된 초항원 독소 단백질로 구성될 수 있다. 이러한 정제된 단백질 생성물은 DNA 방법에 의해 초항원 성질이 없지만 초항원이 면역계에 의해 효과적으로 인식되고 적절한 항체 반응이 생성되도록 변형될 수 있다.
또다른 양태에서, 디프테리아 독소의 해독 변이체이고 많은 백신 제형에서 항원 및 담체 단백질로서 사용되는 CRM197이 종래의 액체로 제형되어 현탁액 형태 또는 무수 분말 형태의 경구 백신 제형으로 사용될 수 있다. 무수 분말 제형은 상압 분무 동결건조(atmospheric spray freeze drying)에 의해 제조될 수 있다. CRM197은 피포성 세균에 대한 접합 백신에서 담체 단백질이고 전세계적으로 해모필러스 인플루엔자, 뉴모코커스 및 메닌고코커스에 대해 어린이의 면역화를 위해 현재 사용되고 있다. 경구 현탁액 또는 무수 분말 제형은 CRM197의 안정성을 증가시킨다(도 14). pH 4 및 상승 온도의 강제 분해 조건하에서 경구 제형이 기존 액체 제형 대비 CRM197의 안정성을 증가시킬 수 있었음이 측정되었다. 두 온도에서 둘 다의 상태의 일차 분해율 상수가 측정되었다. 둘 다의 경우에서 경구 백신 상태의 분해율이 감소되었다. 이 결과는 경구 백신 제형의 안정화 효과를 증명한다. 경구 제형이 무수 분말로 전환된 경우 안정성이 또한 증가된다. 실온에서 2개월 저장 후 에피토프 이용가능성(availability)은 거의 저하되지 않는다. 두 온도에서 각 제형에 대한 일차 분해율 상수가 측정되었다(표 10). 이들 결과는 CRM이 경구 현탁액으로 제형화되고 25℃에서 저장된 경우 68%의 안정성 증가 및 37℃에서 저장된 경우 54%의 안정성 증가를 증명한다. 데이터를 시간에 따라 손실된 항원의 누적백분율로서 도시하면 경구 현탁액에서 CRM의 안정성이 얼마나 개선되었는지를 알 수 있다(도 15). 25℃ 또는 37℃에서 저장하여 용액 제형 중 에피토프의 손실이 50%가 되기까지는 1일보다 적게 걸린다. 그러나, 경구 현탁액의 경우는 그 시간이 증가하여, 25℃에서 50% 손실율이 될 때까지 12일이 걸리고, 37℃에서는 7일이 걸린다. 이 데이터는 종래의 액체 제형에 비해 경구 현탁액으로 제형화했을 때의 CRM197의 안정성이 유의적으로 증가한다는 것을 증명한다.
또 다른 양태에서, 면역조성물은 추가로 알루미늄 옥시하이드록사이드, 알루미늄 하이드록시포스페이트, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트, 알루미늄 포스페이트, 알룸(칼륨 알루미늄 포스페이트) 또는 이의 배합물을 포함하여 알루미늄 항원보강제와 같은 하나 이상의 금속 항원보강제를 포함할 수 있다. 알루미늄 이외에, 항원을 흡착하기 위해 아연, 칼슘, 세륨, 크롬, 철 및 베릴륨의 염을 포함한 다른 금속염이 사용되었다. 가장 보편적인 것은 알루미늄의 하이드레이트와 포스페이트 염이다.
다른 바람직한 양태에서, CTL 수용체 리간드(들)는 단당류, 이당류 또는 다당류를 포함한다. 본 발명의 CTL 수용체 리간드에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 아라비노스, 리보스, 리불로스, 크실로스, 크실룰로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 굴로스(Gulose), 이도스, 만노스, 소르보스, 탈로스, 타가토스, 세도헵툴로스, 만노헵툴로스, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 락토스, 멜리비오스, 아밀라오스 및 만난을 포함한 당류가 포함된다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 이들 당류는 말단 포스페이트 그룹 또는 포스포디에스테르 주쇄를 포함한다.
면역조성물과 항원보강제 시스템을 투여하고 충분히 투약하는 방법 및 계획은 당해 기술분야에 알려져 있는 것들이다. 대상자에게 투여되는 용량 및 빈도(단일 용량 또는 다중 용량)는, 예를 들어, 대상자의 감염 노출에 이은 항원 노출의 전력, 대상자의 건강 상태, 체중, 체질량지수 및 식이 또는 건강-관련 문제들을 포함한 다양한 요인에 좌우되어 달라질 수 있다. 다른 치료 용법 및 치료제들이 본 발명의 방법 및 조성물, 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 면역조성물은 0.5㎖ 표준 주사 용량으로 전달될 수 있고, 약 0.1㎍ 내지 약 50㎍의 항원을 함유한다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 면역조성물은 0.5㎖ 표준 주사용량이고, 약 3㎍ 내지 약 20㎍의 항원을 함유한다. 백신 용량은 0.25 내지 1.0㎖, 적합하게는 0.5㎖ 내지 1.0㎖, 특히 표준 0.5㎖일 수 있다. 본 발명에 따른 백신 용량은 통상적인 용량보다 적은 양으로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 저용량은 적합하게는 0.5㎖ 이하, 전형적으로는 0.3㎖ 이하이고, 보통은 0.1㎖보다 적지는 않다.
현재, 대부분의 백신들은 비경구 투여로 이용가능하며, 이러한 비경구 투여는 특히 개발도상국에서의 면역화에서 더 많은 비용지출과 보다 떨어지는 안전성을 야기한다. 백신은 주사 시점에 일반적으로 건강한 상태로 있는 유아, 아동 및 성인에 투여되기 때문에, 주사 제품의 제조시 높은 수준의 무균성이 보장되어야 하고 이는 백신에 추가 비용을 부과한다. 경구 백신 제형의 개발은 비경구 주사제에 비하여 이상반응 위험을 줄이고, 투여를 위해 의료 전문인을 필요로 하지 않으며, 제조 비용을 절감하는(무균 공정의 필요성이 줄어들기 때문) 다수의 이점을 갖는다.
경구 투여는 위장관이 면역계를 자극하는 장연관 림프조직(GALT)과 같은 점막림프 유도부위를 함유하고 있기 때문에 면역학적 시각에서 매력적이다. 위장관은 페이에르판과 같은 면역 유도 조직이 풍부하게 존재하는 300 m2 이상의 점막 표면을 갖는다. 또한, 점막 백신접종은 모든 점막 표면이 항원 유입의 관문 부위로서 작용하기 때문에 전신 백신접종과 같이 국소적 점막 면역반응을 유도하는 능력이 우월하다. 가장 중요한 것은 한 점막 부위에서의 면역화가 항체 분비를 전신적으로 일으킬 수 있을 뿐만 아니라 다른 선택된 점막 부위에서도 마찬가지이다[16].
점막 표면의 물리적 구조는 병원체에 대하여 일정한 방어를 유지하도록 설계된다. 마이크로폴드(microfold: M) 세포는 점막 표면의 구성원이고, 이의 기능은 상피 표면을 따라 물질을 이송하는 것으로 이송된 물질들은 수지상 세포(DC)에 의해 흡수되고 프로세싱되어 면역반응이 개시된다. 이들 DC는 T 림프구를 프라이밍시킴으로써 T 림프구는 클론 확장에 의해 T-세포 아형(Th1, Th2, Th17 또는 T 조절세포)으로 분화한다. 동시에, T 세포들은 점막귀환마커로 표지되고 이들 마커에 의해 점막하층 영역으로 유도되어 이곳에서 세포-매개된 면역 기능을 수행한다. 이어서, DC와 동족 T-세포는 B-세포와 상호작용하여 다수의 점막 부위에서 B-세포의 분화와 항체 생성을 촉진한다. 본 발명자들의 경구 백신 제형은 일차로 위에서 SpeAB가 분해되는 것을 방지하고, 이후에 항원을 페이에르판의 M 세포에 대해 표적화하여 GALT에 의한 면역반응을 자극함으로써 점막 면역계를 이용한다. 이 접근법은 선진국 및 개발도상국 모두에서 GAS 연관 질환에 대해 보호하기 위한 안전하고, 효과적이며, 안정하고, 경제적으로 실행가능한 백신을 제공한다.
본 발명에 따라 사용되는 면역조성물은 경구 용량으로서 전달될 수 있다. 본 발명의 항원보강제를 사용하는 경구 백신접종은 CTL 작용제에 대한 수용체를 발현하고 알루미늄 항원보강제 크기의 입자를 내재화하는데 가장 효율적인, 일명 페이에르판이라 불리는 장내의 면역조직을 이용한다. CTL 작용제에 결합된 알루미늄 항원보강제의 조합은 놀라운 이점을 제공한다. CTL 작용제는 백신 입자를 페이에르판의 M 세포에 대해 표적화한다. 알루미늄 입자는 효율적인 내재화에 적합한 크기의 항원을 만든다. 본 발명의 경구 항원보강제는 항원과 항원보강제에 대한 결합을 유지하고 항원이 위 및 장내에서 분해되는 것을 보호한다. 위내에서의 분해로부터 백신의 보호는 백신 입자를 백신 보호 중합체로 코아세르베이션함으로써 제공할 수 있다. 다양한 pH에서 코아세르베이션될 수 있는 중합체들이 수득될 수 있고 이에 따라 적합한 중합체들이 적절한 단백질 항원과 쌍을 이룰 수 있다. 한 가지 양태에서, 유드라지트가 코아세르베이션을 위해 사용될 수 있다. 유드라지트는 pH 5.5 이하에서 침전하며, 실시예에서 유드라지트 함유 경구 제형은 IM 제형보다 더 낮은 pH를 갖는다. 침전된 유드라지트는 백신 입자를 코팅하고 백신 입자가 분해되는 것을 보호한다. 항원과 항원보강제의 직접적인 코아세르베이션도 항원이 열안정성을 갖도록 할 수 있다. 이 방법은 치료 단백질, 항원 원료 뿐만 아니라 최종 백신 제형의 저온 저장에 대한 의존을 줄여줄 수 있다.
코아세르베이션에 적합한 중합체에는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 메타크릴 중합체, 아크릴산과 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 메타크릴산 알킬아미드 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 공중합체, 폴리아크릴아미드, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(메타크릴산 무수물), 글리시딜 메타크릴레이트 공중합체 및 이의 조합물이 포함된다. 본 발명의 결합성 아단위를 제조하는데 유용한 아크릴 중합체로는, 사용된 아크릴 단량체와 메타크릴 단량체 1mol당 약 0.02 내지 약 0.03 몰의 트리(저급 알킬) 암모늄 그룹을 함유하는 아크릴산 에스테르와 메타크릴산 에스테르로부터 합성된 공중합체(예: 아크릴산 저급 알킬 에스테르와 메타크릴산 저급 알킬 에스테르의 공중합체)를 포함하는 아크릴 수지가 포함된다. 적합한 아크릴 수지의 예는 Rohm Pharma GmbH(Darmstadt, Germany)에서 제조되어 유드라지트® 상표로 판매되고 있는 중합체로서 암모니오 메타크릴레이트 공중합체 NF21이다. 유드라지트®는 에틸 아크릴레이트(EA), 메틸 메타크릴레이트(MM) 및 트리메틸암모늄에틸 메타크릴레이트 클로라이드(TAM)의 수불용성 공중합체이고, 여기서, TAM 대 나머지 성분(EA와mM)의 몰비는 1:40이다. 유드라지트®와 같은 아크릴 수지는 수성 분산액의 형태로 사용되거나 적합한 용매중의 용액으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 제형에 바람직한 유드라지트는 유드라지트 L100-55이다. 다른 아크릴 중합체로는 4급 암모늄 그룹을 소량 함유하는 아크릴산 에스테르와 메타크릴산 에스테르의 공중합체가 포함되며, 예를 들면 유드라지트® RL PO(A형) 및 유드라지트® RS PO(B형; 본원에서 "유드라지트® RS"로 표기) L30D55, L100, (L12,5), S100, (S12,5) 및 FS30D[참조: the monographs Ammonio Methacrylate Copolymer Type A Ph. Eur., Ammonio Methacrylate Copolymer Type B Ph. Eur., Ammonio Methacrylate Copolymer, Type A and B USP/NF, and Aminoalkylmethacrylate Copolymer RS JPE]이다. 적절한 유드라지트의 선택은 코팅입자로부터 방출되는 물질의 위장관내 위치에 의해 좌우된다.
본 발명은, 항원과 CTL-작용제를 알루미늄 항원보강제에 흡착시키고, pH 의존 용해도를 갖는 중합체를 첨가하여 백신 제형을 형성하며, 백신 제형을 낮은 pH 용액에 첨가하여 중합체를 침전시킴으로써 경구 투여가능한 면역조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, 포스페이트 완충액 중의 아크릴 수지, 만니톨 및 수크로스와 항원을 혼합하여 혼합물을 생성하고, 상기 혼합물을 낮은 pH의 용액에 분무하여 현탁액을 형성하며; 상기 현탁액을 분말로 되도록 건조시킴으로써 경구 투여 무수 분말 제형을 제형화하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 포스페이트 완충액 중의 아크릴 수지, 만니톨 및 수크로스와 항원을 혼합하여 혼합물을 생성하고, 이 혼합물을 낮은 pH의 용액에 분무하여 현탁액을 형성함으로써 경구 투여 현탁액을 제형화하는 방법에 관한 것이다. 낮은 pH 용액은 pH를 5.5 이하로 낮추고 그 pH를 유지할 수 있는 용액이라면 어떠한 것도 사용가능하다. 특정 양태에서, 아세테이트는 투여되었을 때 위장관에 해로운 영향을 주지 않으며 포스페이트 또는 시트레이트와 같은 다른 완충제가 알루미늄과 상호작용하는 것과는 달리 알루미늄과 상호작용하지 않기 때문에 아세트산염이 바람직하다. 이 용액의 pH는 7.0 이하, 약 6.0 이하, 약 5.5 이하, 약 5.0 이하, 약 4.5 이하, 약 4.0 이하, 약 3.5 이하 또는 3.0 이하일 수 있다. 용액의 pH는 약 7.0 내지 약 3.0, 약 6.5 내지 약 3.0, 약 6.0 내지 약 3.0, 약 5.5 내지 약 3.0, 약 5.0 내지 약 3.0, 약 4.5 내지 약 3.0, 약 4.0 내지 약 3.0 또는 약 3.5 내지 약 3.0일 수 있다.
본 발명의 한 가지 양태에서, SpeA/B를 위한 경구 백신 제형은 알루미늄 옥시하이드록사이드(AlOOH)를 포함한 전달 입자를 사용하여 설계되었다. SpeA/B는 제형화 공정에서 AlOOH에 결합되었고, 이어서, 표적 분자가 또한 AlOOH 입자에 결합된다. 만노스 수용체와 같은 C형 렉틴 수용체는 이들이 세균을 탐지하고, 상호작용하며, 이송할 수 있기 때문에 M 세포 상에 존재할 가능성이 있다. M 세포를 표적으로 하여 장내 흡수를 촉진시키고 AlOOH와의 다양한 결합 방식을 이용하는 C형 렉틴 수용체 작용제, 즉 만노스-1-포스페이트(M1P) 및/또는 중합된 만노스(만난)가 제형에 사용될 수 있다. 마지막으로, 위에서 분해되는 것을 방지하기 위하여 장용 중합체가 첨가된다. 유드라지트®는 폴리(메타크릴레이트)를 기본으로 하는 pH-민감성 중합체이고; 경구용 약제학적 부형제로서 허용되어 왔으며; 일반적으로 생체분해성 무독성 물질로 간주되고; 약제학적 활성 성분을 효소 및 위액에 의한 분해로부터 보호할 수 있다. 유드라지트® L100-55는 pH 5.5 이하의 용액에서 침전된다. 따라서, 백신은 위의 낮은 pH로부터 보호되지만 십이지장에서 방출되어 장내 M세포와 상호작용이 이루어진다. 위액으로부터 항원(들)을 보호하는 부형제가 첨가되는 것에 더하여, 본 발명의 조성물은 또한 캡슐화 공정을 포함하여 SpeA/B와 같은 항원(들)을 보호할 수 있다. 만일 항원이 페이에르판에 방출되기 전에 항원의 원형(integrity)이 GI에서 유지된다면 면역반응이 증강될 것이다. 백신 입자들의 코아세르베이션은, 저장과 수송의 효율 뿐만 아니라 무침 백신의 안전성을 제시할 수 있는 백신의 경구 투여를 위한 새로운 제형 기술의 이용가능성에 더하여, 면역원성 단백질에 보다 정교한 방어막을 보장할 것이다. 이러한 제형화 기술 중 하나는 백신 조성물을 효과적으로 코팅하는 분무동결건조 공정을 포함한다. 분무 동결건조(SFD)는 저밀도, 고표면적, 정확한 입도 분포 및 잠재적으로 매우 신속한 용해성을 포함하여 잘 규명된 물리적 특성을 갖는 분말 입자의 제조를 가능하게 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은, 상압 분무 동결건조 방법(ASFD)에 의해 코팅된 백신 입자에 관한 것이며, 이 방법은 열과 압력 차에 의한 민감한 항원구조의 손상 위험을 감소시켜 주면서도 목적하는 입자에 물리적 특성을 제공할 수 있다. 또한, ASFD는 대규모 연속공정으로 진행할 수 있다는 장점을 갖고 있다.
ASFD 동안, 조심스럽게 제형화된 액체 용액은 특정 크기의 구형 액적으로 분사되고 그 즉시 동결되어 개개 입자의 크기와 모양이 고정된다. 그런 후 입자 베드에 초저온 가스를 통과시켜 입자를 건조시킨다. 유동 및 온도 프로필은 맞춤에 따라 설정하여 입자의 최종 용도에 맞게 원하는 형상을 입자에 부여할 수 있다. 이 공정은 대류열 전달을 이용하기 때문에 대개 동결건조보다 훨씬 더 신속하며, 고 진공의 필요성을 없앰으로 인하여 비용이 감소되고 제조 규모로의 전환을 가능하게 한다. 지금까지는 치료제의 경구 전달을 위한 제어-방출 고체-용량을 제조하기 위하여 동결건조, 분무건조 및 분무 동결건조 프로토콜이 사용된 불과 소수의 예시만 문헌에 있으며, 백신의 경우는 그 사례가 더 적다. 분무 건조는 잘 규명된 입자를 제조하는데 성공적이었지만, 이 기술은 열의 적용이 요구되며 열은 면역원성 단백질에 변성을 일으켜 효력에 영향을 미칠 수 있다. 동결건조 및 분무 동결건조 방법은 건조 과정 동안 동해방지제(cryoprotectant)를 사용하여 단백질의 3D 구조를 안정화시킨다. 그러나, 동결건조는 불규칙한 모양을 갖는 입자를 형성하며 비균질한 약물-대-중합체 분포를 나타내고, 이는 원하지 않는 방출 프로필을 야기할 수 있다. 분무 동결건조(SFD) 방법은 단백질-계 무수 입자를 생성하는데 유용하지만, ASFD 방법은 공정중에 민감한 단백질이 주요 압력차의 스트레스에 노출되지 않기 때문에 보다 우수하다. 사용할 수 있는 가능한 동해방지제는 다양한 것들이 있으며, 이들로 한정하는 것은 아니지만, 만니톨, 락토스, 소르비톨 및 수크로스 및 이의 배합물이 포함된다. ASFD는 제형의 균일한 코아세르베이션과 같은 이상적인 물리학적 입자 특성을 부여하기 위해 사용되는 분무노즐을 이용한다.
본 발명의 조성물은 단독으로 투여되거나 통상적인 부형제, 예를 들어, 조성물과 유해하게 반응하지 않는 장내 또는 비경구 적용에 적합한 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 유기 또는 무기 담체 물질과의 혼합물로서 투여될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체에는 물, 염 용액(예: 링거액), 알코올, 오일, 젤라틴 및 탄수화물(예: 락토스, 아밀로스 또는 전분), 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐 피롤리딘이 포함된다. 이러한 제형은 멸균될 수 있고, 필요한 경우, 사람에 투여된 조성물과 유해하게 반응하지 않는 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 완충제, 착색제 및/또는 방향족 물질 등과 같은 항원보강제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 백신을 희석하기 위한 바람직한 희석제에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 히스티딘 및 트레할로스를 포함하는 150mM NaCl을 포함한다.
CTL 수용체 리간드와 배합되는 항원보강제의 적절한 양을 결정하는 것은 제형 중의 항원보강제, CTL 수용체 리간드 뿐만 아니라 항원의 유형을 포함한 다양한 요소에 의해 좌우될 것이다. 실제로, 사용된 CTL 수용체 리간드의 흡착능은 항원보강제의 흡착가능 양의 상한값을 규정할 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법에서, 항원보강제에 대한 당류의 양은 약 1.5mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.05mg의 당류/1mg의 항원보강제의 범위일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법의 다른 양태에서, 항원보강제에 대한 당류의 양은 약 1.25mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.05mg의 당류/1mg의 항원보강제, 약 1.0mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.05mg의 당류/1mg의 항원보강제, 약 1.0mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.05mg의 당류/1mg의 항원보강제, 약 0.5mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.05mg의 당류/1mg의 항원보강제, 약 1.5mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.10mg의 당류/1mg의 항원보강제, 약 1.5mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.25mg의 당류/1mg의 항원보강제, 약 1.5mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.50mg의 당류/1mg의 항원보강제 또는 약 1.5mg의 당류/1mg의 항원보강제 내지 약 0.75mg의 당류/1mg의 항원보강제의 범위일 수 있다.
항원보강제/CTL 수용체 리간드와 조합되는 항원의 적절한 양을 결정하는 것은 제형 중의 항원보강제, CTL 수용체 리간드 뿐만 아니라 항원의 유형을 포함한 다양한 요소에 의해 좌우될 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법에서, 항원에 대한 당류/항원보강제의 양은 1mg의 항원당 약 1.5mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원당 약 0.05mg의 당류/항원보강제의 범위일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법의 다른 양태에서, 항원에 대한 당류의 양은 1mg의 항원당 약 1.25mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원 당 약 0.05mg의 당류/항원보강제, 1mg의 항원당 약 1.0mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원 당 약 0.05mg의 당류/항원보강제, 1mg의 항원당 약 1.0mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원 당 약 0.05mg의 당류/항원보강제, 1mg의 항원당 약 0.5mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원 당 약 0.05mg의 당류/항원보강제, 1mg의 항원당 약 1.5mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원 당 약 0.10mg의 당류/항원보강제, 1mg의 항원당 약 1.5mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원 당 약 0.25mg의 당류/항원보강제, 1mg의 항원당 약 1.5mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원 당 약 0.50mg의 당류/항원보강제 또는 1mg의 항원당 약 1.5mg의 당류/항원보강제 내지 1mg의 항원 당 약 0.75mg의 당류/항원보강제의 범위일 수 있다.
본 발명의 제형 및 방법은 통상적인 수단에 의해 제조된 백신 제형보다 더 안정한 백신 제형을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 경구 현탁액 제형은 유사한 성분을 갖는 용액보다 적어도 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 더 안정하다. 본 발명의 경구 현탁액 제형은 유사한 성분을 갖는 용액보다 약 5% 내지 500%, 약 5% 내지 100%, 약 5% 내지 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 70%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 10%, 약 10% 내지 약 500%, 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 25% 내지 약 500%, 약 25% 내지 약 100%, 약 25% 내지 90%, 약 25% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 60%, 약 25% 내지 50%, 약 25% 내지 약 40%, 약 50% 내지 500%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 70%, 약 50% 내지 약 60%, 약 75% 내지 500%, 약 75% 내지 약 250% 또는 약 75% 내지 100% 더 안정하다.
예를 들어, 본 발명의 무수 분말 제형은 유사한 성분을 갖는 용액보다 적어도 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 더 안정하다. 본 발명의 경구 현탁액 제형은 유사한 성분을 갖는 용액보다 약 5% 내지 500%, 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 70%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 30%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 10%, 약 10% 내지 약 500%, 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 25% 내지 약 500%, 약 25% 내지 약 100%, 약 25% 내지 90%, 약 25% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 60%, 약 25% 내지 50%, 약 25% 내지 약 40%, 약 50% 내지 500%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 70%, 약 50% 내지 약 60%, 약 75% 내지 500%, 약 75% 내지 약 250% 또는 약 75% 내지 100% 더 안정하다. 제형의 안정성은 25℃ 및 37℃를 포함한 다양한 온도에서 측정될 수 있다. 제형의 안정성은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 에피토프 이용가능성을 포함한 다양한 방법으로 측정될 수 있다.
실시예 1
백신 제형
표 1에 기술된 바와 같이 백신 조성물을 제형화하였다.
Figure 112014105778153-pct00001
Figure 112014105778153-pct00002
물, 트리스 및 알하이드로겔을 15㎖ 튜브에 넣고 와류 믹서로 혼합하였다. 15㎖ 튜브에 SpeA/B를 첨가하고 와류에 의해 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 만노스-1-포스페이트를 첨가하고, 이어서, 1 M NaCl을 첨가하였다. 전체 혼합물을 와류에 의해 혼합하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다.
Figure 112014105778153-pct00003
물, 트리스 및 알하이드로겔을 15㎖ 튜브에 넣고 와류 믹서로 혼합하였다. 15㎖ 튜브에 SpeA/B를 첨가하고 와류에 의해 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 만난을 첨가하고, 이어서, 1 M NaCl을 첨가하였다. 전체 혼합물을 와류에 의해 혼합하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다.
실시예 2
백신 제형의 안정성
Figure 112014105778153-pct00004
아래에 기술된 바와 같이 시료 중의 탄수화물 양을 결정하였다. 50㎕의 블랭크, 표준물 및 시료를 96-웰 마이크로플레이트의 적당한 웰에 피펫팅하였다. 150㎕의 진한 황산을 각 웰에 피펫팅하고, 이어서, 30㎕의 5% 페놀을 각 웰에 피펫팅하였다. 상기 플레이트를 90℃에서 5분 동안 항온처리한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료가 최고의 표준물보다 더 높은 탄수화물 농도를 가진 경우 결과가 검정의 선형 범위에 들어오도록 시료의 희석액을 준비하였다.
항원보강제 제형에서의 항원 흡착율을 다음과 같이 결정하였다. 시료를 10,000 rcf에서 5분간 원심분리하였다. BCA 시약을 준비하고, 시약 A:B의 비율을 50:1로 하여 혼합하였다. 25㎕의 표준물과 시료를 96-웰 플레이트의 적당한 웰에 삼중으로 피펫팅하고, 각 웰에 200㎕의 BCA 시약을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 실온으로 냉각하였다. 플레이트의 웰 흡광도를 570 nm에서 마이크로플레이트 리더로 판독하였다. 각 시료 중의 항원 농도를 표준 곡선을 사용하여 산출하였다.
항원보강제 제형 중에서의 항원 탈착율을 다음과 같이 결정하였다. 시료를 10,000 rcf에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 마이크로원심분리관에 보관하였다. 펠렛을 제거된 상청액 양과 등량인 탈착 완충액 중에 재현탁시키고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. BCA 시약을 준비하고, 시약 A:B의 비율을 3:1로 하여 혼합하였다. 시료를 10,000 rcf에서 5분간 원심분리하였다. 50㎕의 표준물 및 시료를 96-웰 플레이트의 적당한 웰에 삼중으로 피펫팅하고, 각 웰에 150㎕의 BCA 시약을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 실온으로 냉각하였다. 플레이트의 웰 흡광도를 570 nm에서 마이크로플레이트 리더로 판독하고, 각 시료 중의 항원 농도를 표준 곡선을 사용하여 산출하였다.
실시예 3
생체내 항원보강제 시스템 활성
사람 병원체에 대한 항원보강제 시스템의 효력을 기존의 동물 모델에서 생체내 평가하였다.
Figure 112014105778153-pct00005
표 4에 기술된 바와 같이 랫트에서 제형 11VF001-008을 근육내 또는 경구로 0일 및 21일에 면역화하여 검정하였다. -7일, 14일 및 35일에 랫트로부터 혈청을 채취하고, 항원 특이적 총 IgG 뿐만 아니라 IgG2a와 IgG2b를 검정하였다.
Figure 112014105778153-pct00006
Figure 112014105778153-pct00007
Figure 112014105778153-pct00008
항체 역가를 결정하기 위하여 다음의 절차를 수행하였다. 코팅 완충액 중의 코팅 항원 용액 2㎍/ml을 준비하였다. 100㎖의 2㎍/ml 항원을 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 100㎕/웰의 세정 완충액으로 1회 세척한 후, 각 웰에 100㎕의 블로킹 완충액을 피펫팅하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세정 완충액 중의 미지 혈청의 2배 연속 희석액을 준비하였다. 초기 시점에서 희석액은 전형적으로 1:50 희석액이었다. 후기 시점에서는 희석액이 1:10,000 또는 그 이상의 희석액이었다. 플레이트를 100㎕/웰의 세정 완충액으로 2회 세척하였다. 100㎕의 각 혈청 희석액을 적당한 플레이트 웰에 이중으로 피펫팅하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 블로킹 완충액 중의 검출 항체의 적당한 희석액을 준비하였다. 플레이트를 100㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세척한 후 100㎕의 검출 항체를 각 웰에 피펫팅하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 100㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세척하였다. 1부 용액 A를 1부 용액 B와 혼합하여 적당한 용적의 TMB 수행 시약을 준비하였다. 100㎕의 TMB를 각 웰에 피펫팅하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 플레이트에 발색이 나타나지 않은 경우 발색시까지 항온처리 시간을 5분 더 늘렸다. 100㎕의 3 M 황산을 각 웰에 피펫팅하여 반응을 정지시키고, 각 웰의 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. 역가는 배경흡광도의 2배에 해당하는 4-매개변수 최적 맞춤 곡선의 지점으로서 측정되었다.
도 4는 이들 항원보강제 시스템의 양태가 항원보강제-미처리 항원에 비하여 총 혈청 IgG를 1 log 이상 증가시킬 수 있었음을 보여준다. 이 데이터는 항원보강제 시스템의 이용에 의한 잠재적인 항원 용량 절감 가능성을 나타낸다. 도 5는 이들 항원보강제 시스템의 양태가 IgG2a 항체의 생성을 증강시켰음을 보여준다. 전체 IgG와 IgG2a 역가가 균등하지 않음에 따라 사실상 면역반응은 혼합 Th1/Th2이다. 도 6은 이들 항원보강제 시스템의 양태가 IgG2b 항체의 생성을 증강시켰음을 보여준다. 총 IgG와 IgG2b 역가가 균등하지 않음에 따라 사실상 면역반응은 혼합 Th1/Th2이다.
실시예 4
BSA 용액의 코아세르베이션
0.5, 0.1 및 0.02%의 유드라지트를 800㎍/ml 만난, pH 7.4의 20mM 트리스 중의 소혈청 알부민(BSA)의 200㎍/ml 용액에 첨가하였다. 용액을 pH 4의 150mM 아세테이트 완충액에 적가하여 유드라지트를 침전시켰다. 침전된 입자를 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 50mM 포스페이트 완충액 중에 재구성시켜 유드라지트를 용해시켰다. 공정의 각 단계에서 용액 중의 BSA의 양을 모니터링하여 BSA가 유드라지트 내로 캡슐화되었는지를 결정하였다. 도 7은 검정 결과를 보여준다.
실시예 5
흡착된 BSA1의 코아세르베이션
BSA를 만난-알하이드로겔에 흡착시킨 것을 제외하고 실시예 4를 반복하였다. 0.5, 0.1 및 0.02%의 유드라지트를 800㎍/ml 만난, 3.4mg/ml 알하이드로겔중의 소혈청 알부민(BSA) 200㎍/ml 용액에 첨가하였다. 도 8a 및 8b는 시험 결과를 보여준다.
실시예 6
흡착된 BSA2의 코아세르베이션
유드라지트의 양을 줄인 것을 제외하고 실시예 5를 반복하였다. 0.1, 0.05, 0.025, 0.13%의 유드라지트를 800㎍/ml 만난, 3,4mg/ml 알하이드로겔중의 소혈청 알부민(BSA) 200㎍/ml 용액에 첨가하였다. 도 9a 및 9b는 검정 결과를 보여준다.
실시예 7
흡착된 SpeA/B의 코아세르베이션
100mg/ml SpeA/B, 0.1% 유드라지트, 3.4mg/ml 알하이드로겔, 20mM 트리스 및 600mg/ml M1P 또는 만난을 함께 첨가한 것을 제외하고 실시예 6을 반복하였다. SpeA/B가 총 알루미늄의 절반에 흡착되었다. 잔여 알루미늄을 아세테이트에 첨가하였다. 이러한 첨가는 장내에서의 효소 분해로부터 보호를 제공하기 위해 실시되었다. 트립신 및 키모트립신은 알루미늄에 흡착하고 보다 낮은 활성을 나타내야 한다. 도 10의 데이터는 거의 모든 SpeA/B가 항원보강제에 흡착된 상태로 있음을 증명하였다.
실시예 8
유드라지트 L100-55에 의한 Spe A/B의 코아세르베이션
0.1% 유드라지트® L100-55의 존재 또는 부재하에, 200㎍/ml의 단백질, pH 7.5의 20mM 트리스를 등량의 150mM 아세트산나트륨(pH 4)에 적가하였다. 시료를 37℃에서 24시간 동안 보관하였다. 시료를 50mM 포스페이트 완충액에 용해시켰다. 10mM PO4, 150mM NaCl 중의 시료 연속 희석액 및 표준물 100㎕를 96-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 10mM PO4, 150mM NaCl, 0.05% 트윈 20으로 세척하였다. 100㎕의 10mM PO4, 150mM NaCl, 1% BSA를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. 항-SpeAB 랫트 혈청의 1:25,000 희석액 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. 항-랫트 IgG-HRP 1:75,000 희석액 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. 100㎕의 TMB를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 15분간 항온처리하였다. 100㎕의 3 M H2SO4로 반응을 정지시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 농도를 표준곡선을 사용하여 산출하였다.
실시예 9
항체 시험
연구 0일, 14일 및 35일에 각 그룹의 개별적인 랫트로부터 항원 특이적 혈청 중의 전체 IgG를 결정하였다. 10mM PO4, 150mM NaCl 중의 2㎍/ml SpeAB 100㎕를 96-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 10mM PO4, 150mM NaCl, 0.05% 트윈 20으로 세척하였다. 100㎕의 10mM PO4, 150mM NaCl, 1% BSA를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. 플레이트에서 혈청을 1:50에서 시작하여 2배로 단계적으로 희석하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. 항-랫트 IgG-HRP의 1:75,000 희석액 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. 100㎕의 TMB를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 100㎕의 3 M H2SO4로 반응을 정지시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 농도를 표준곡선으로부터 산출하였다. 도 12는 결과를 보여준다.
백신접종된 동물의 혈청에 의한 야생형 SpeA 독소의 중화. 혈청을 1:500으로 희석하고, 400 ng/ml의 SpeA 독소와 배합하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 50㎕의 혈청/독소 혼합물을 웰당 2.5 x 106 사람 PBMC 세포에 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 상청액을 수거하여 INF-γ 생성을 형광 마이크로어레이로 검정하였다. 중앙값 형광 강도를 대조군 랫트 혈청에 대해 표준화하였다. 도 13은 결과를 보여준다.
실시예 10
AFSD 코팅
다양한 미립화 노즐로 SpeA/B를 포함한 다양한 항원, 알하이드로겔, 만난 및 유드라지트 L100-55 중합체를 다양한 동해방지제와 함께 액체 질소 욕(bath) 내로 분무하고, 형성된 액적을 보존하였다. ASFD 공정으로 액적을 승화 건조시켰다. 건조된 고체 입자들의 물리적 특성을 입도 분포(레이저 회절), 단백질 함량 및 균일성(UV 분광법, IR, HPLC) 및 모폴로지(헬륨 이온 현미경 및 SEM)로 확인하였다.
실시예 11
AFSD 코팅 2
장용(유드라지트 L100-55) 중합체를 완충액(pH 4.0)에서 다양한 면역원(SpeA/B를 포함) 주위에 침전시키고, 침전된 면역원 콜로이드 용액에 다양한 동해방지제를 첨가한 다음, 이 용액을 실시예 10에서와 같이 미립화, 건조 및 확인하였다.
실시예 12
AFSD 코팅 3
본 실시예는 연장된 GI 방출 기전을 시험하기 위하여 2종의 pH 민감성 장용 중합체에 면역원의 캡슐화를 조합한다. 항원(SpeA/B 포함), 알하이드로겔®, 만난 및 pH<7.0에서 침전하는 장용 중합체, 유드라지트 L100-55를 미립화하고 pH 6.0의 액체 완충액 내로 분무하였다. 이 콜로이드 현탁액에 유드라지트 L100을 첨가한 후, 생성된 현탁액을 미립화하고 pH 4.0의 액체 완충액 내로 분무하였다. 이 시점에서 콜로이드 현탁액을 동해방지제와 배합하고, ASFD 공정에 의해 승화 건조시켜 생성된 입자들을 실시예 10에서와 같이 확인하였다.
실시예 13
GI 분해 평가
실시예 10 내지 12에서 생성된 제형을 인공 위액 및 장액에 노출시켜 분해로부터의 면역원 보호를 평가하였다. 다양한 GI 성분들의 단계별 평가로 전달 입자들의 안정성을 확인할 수 있도록 적합한 pH 이외에, 적절한 효소를 인공 용액에 첨가하였다(위액 효소: 펩신; 장액 효소: 리파제, 프로테아제 및 판크레아제). ELISA, 웨스턴블롯, SDS-PAGE, 외부형광 및 BCA 검정에 의해 항원 안정성을 모니터링하였다. 또한, 전달 입자들은 37℃에서 보관하고, 항원(SpeA/B)의 안정성을 ELISA, 웨스턴블롯, SDS-PAGE, 외부형광 및 BCA 검정에 의해 모니터링하였다.
실시예 14
면역세포 자극
증강된 열안정성 및 위액분해로부터의 보호를 나타내는 실시예 12의 백신 제형이 면역세포를 자극하여 증식시키는 능력에 대해 평가하였다. 백신을 사람 PBMC와 배합하고, 가공, 저장 및 인공 위액으로의 노출 후에 백신이 면역자극 기능을 유지하는지를 결정하였다.
실시예 15
CRM 경구 현탁액의 안정성 연구
이러한 안정성 연구에 사용된 용액 및 경구 현탁액 제형은 표 8에 제시되어 있다. 용액 제형의 경우, 1.143㎖의 3.5mg/ml CRM(pH 7.5의 20mM 트리스 중), 1.6 g의 만니톨, 0.4 g의 수크로스 및 18.8㎖의 20mM 트리스(pH 7.5)를 제형화 용기에 넣고, 30분 동안 혼합하였다. 이어서, 용액을 20㎖의 150mM 아세트산나트륨 용액(pH 4) 내로 분무하였다. 그런 다음, 생성된 용액을 1㎖ 분취량으로 나누고, 절반은 25℃에서 보관하고 나머지 절반은 37℃에서 보관하였다.
경구 현탁액 제형의 경우, 1,143㎖의 3.5mg/ml CRM(pH 7.5의 20mM 트리스 중), 1㎖의 1% 유드라지트 용액(pH 7.5의 20mM 트리스 중), 1.6 g의 만니톨, 0.4 g의 수크로스 및 17.8㎖의 20mM 트리스(pH 7.5)를 제형화 용기에 넣고, 30분 동안 혼합하였다. 이어서, 용액을 20㎖의 150mM 아세트산나트륨 용액(pH 4) 내로 분무하였다. 그런 다음, 생성된 현탁액을 1㎖ 분취량으로 나누고, 절반은 25℃에서 보관하고 나머지 절반은 37℃에서, pH 4에서 보관하였다.
Figure 112014105778153-pct00009
용액과 경구 현탁액 둘 다의 시료를 25℃에서 보관된 경우에는 0일, 1일, 14일, 28일, 42일 및 56일에, 37℃에서 보관된 경우에는 0일, 1일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 꺼냈다. 시료는 보관 온도에서 꺼내는 즉시 -20℃에서 동결시켰다. 이어서, 각 시료에서 CRM의 에피토프 이용가능성을 결정하였다.
에피토프 이용가능성은 항원 특이적 ELISA 검정으로부터의 반응을 BCA 검정에 의해 결정된 시료 중의 총 단백질로 표준화함으로써 결정하였다. 검정 이전에 경구 현탁액 시료를 3㎖의 20mM 트리스(pH 9)로 희석시킴으로써 용해시켰다. -20℃에서 보관된 CRM 원료가 ELISA 및 BCA 검정에서 표준물로서 사용되었고, 20mM 트리스, 8% 만니톨 및 2% 수크로스 중에 적당한 농도로 희석되었다. BCA 검정의 경우, 25㎕의 각 표준물 및 각 시료는 96-웰 플레이트에 삼중으로 넣었다. 이어서, 각 웰에 200㎖의 BCA 시약을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 45분 항원반응시켰다. 플레이트를 실온으로 냉각한 후, 각 웰의 흡광도를 570 nm에서 측정하였다. 그런 다음, 단백질 농도를 표준곡선으로부터 산출하여 결정하였다.
ELISA의 경우, 시료를 20mM 트리스(pH 9)로 1㎍/ml CRM으로 희석시키고 100㎕를 96-웰 플레이트에 이중으로 넣었다. 표준물도 pH 9의 20mM 트리스로 희석하고, 100㎕를 96-웰 플레이트에 이중으로 넣었다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 다음, 100㎕/웰의 20mM PO4, 150mM NaCl 및 0.05% 트윈 20 세정 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트에 100㎕/웰의 BSA 블로킹 완충액을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 100㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 항-CRM-비오틴 항체의 1:250 희석액 100㎕/웰을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 100㎕/웰의 세정 완충액으로 재차 3회 세척하였다. 그런 다음, 스트렙타비딘-HRP의 1:3,000 희석액 100㎕/웰을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 100㎕/웰의 세정 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 100㎕/웰의 TMB 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 100㎕/웰의 3 M H2SO4를 각 플레이트에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. 각 시료의 농도를 표준곡선으로부터 결정하였다.
BCA에 의해 결정된 단백질 농도를 ELISA에 의해 결정된 에피토프 농도로 나누어 각 제형의 에피토프 이용가능성을 결정하였다(표 9). 이 데이터는 경구 현탁액으로서의 제형이 CRM의 안정성을 증가시킴을 증명한다(도 14). 두 온도에서 각 제형에 대한 일차 분해율 상수를 결정하였다(표 10). 이들 결과는 CRM이 경구 현탁액으로서 제형화되고 25℃에서 보관되었을 때 68%의 안정성 증가를, 37℃에서 보관되었을 때 54%의 안정성 증가를 증명한다. 시간에 따른 손실 항원의 누적 백분율을 데이터로 하여 그래프를 도시하였을 때, 경구 현탁액이 CRM의 안정성을 얼마나 증강시켰는지를 알 수 있다(도 15). 25℃ 또는 37℃에서 보관시 용액 제형 중의 에피토프의 50%가 손실되는데는 1일이 걸리지 않는다. 그러나, 경구 현탁액의 경우에는 이 시간이 길어져서 25℃에서는 50% 손실까지 12일이 걸리고, 37℃에서 7일이 걸렸다. 이러한 모든 데이터는 CRM이 경구 현탁액으로서 제형화될 때 종래의 액체 제형에 비하여 유의한 안정성 증가를 증명한다.
Figure 112014105778153-pct00010
Figure 112014105778153-pct00011
실시예 16
CRM 무수 분말의 안정성 연구
이러한 안정성 연구를 위해 사용된 용액 및 무수 분말 제형은 표 11에 제시되어 있다. 용액 제형의 경우, 1.143㎖의 3.5mg/ml CRM(pH 7.5의 20mM PO4 중), 1% 유드라지트 용액(pH 7.5의 20mM PO4 중), 1.6 g의 만니톨, 0.4 g의 수크로스 및 17.8㎖의 20mM PO4(pH 7.5)를 제형화 용기에서 배합하고, 30분 동안 혼합하였다. 이어서, 생성된 용액을 1㎖ 분취량으로 나누고, 절반은 25℃에, 나머지 절반은 37℃에서 보관하였다.
무수 분말 제형의 경우, 1.143㎖의 3.5mg/ml CRM(pH 7.5의 20mM 트리스 중), 1㎖의 1% 유드라지트 용액(pH 7.5의 20mM PO4 중), 1.6 g의 만니톨, 0.4 g의 수크로스 및 17.8㎖의 20mM PO4(pH 7.5)를 제형화 용기에서 배합하고, 30분 동안 혼합하였다. 이어서, 용액을 pH 4의 150mM 아세트산나트륨 용액 20㎖ 내로 분무하였다. 그런 다음, 생성된 현탁액을 상압 분무 동결건조에 의해 분말로 되도록 건조시켰다. 분말을 100mg 시료로 나누고, 절반은 25℃에, 나머지 절반은 37℃에서 보관하였다.
Figure 112014105778153-pct00012
안정성 연구를 위해, 25℃에서 보관된 경우에는 0일, 1일, 14일, 28일, 42일 및 56일에, 37℃에서 보관된 경우에는 0일, 1일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 시료를 꺼냈다. 시료는 보관 온도에서 꺼내는 즉시 -20℃에서 동결시켰다. 이어서, 각 시료에서 CRM의 에피토프 이용가능성을 실시예 15에 기술된 바와 같이 결정하였다. 무수 분말은 가공 후 초기에 에피토프 이용가능성에서 약간의 손실을 나타낸 한편, 남은 CRM 에피토프는 37℃에서도 극히 안정적이었다(표 12)(도 16). 무수 분말로서의 제형은 CRM의 안정성을 추가로 증강시킨다.
Figure 112014105778153-pct00013
본원에서 범위가 제공된 경우 종점이 포함된다. 게다가, 달리 언급되지 않거나 전후 맥락 및 당해 기술분야의 통상적인 숙련가의 이해 측면에서 달리 분명하지 않다면, 범위로 표시된 수치들은 본 발명의 다른 양태들에서 설정된 범위내에서 임의의 특정 값 또는 하위범위를, 문맥에서 정확하게 달리 지시하지 않은 경우, 상기 범위의 하한값 단위의 10분의 1까지로 가정할 수 있을 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별적인 공보 또는 특허를 인용에 의해 포함하였음을 구체적으로 및 개별적으로 표시한 바와 같이 본원에 인용에 의해 포함된다. 임의의 공보를 인용하는 것은 출원일 이전에 발표되었기 때문이고, 이전 발명에 의해서 본 발명이 이러한 공보를 선행할 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석해서는 안된다.
본 발명은, 이의 실시 양태를 참고로 하여 특정적으로 제시되고 기술되었으나, 당해 기술분야의 숙련가는 본원에 첨부된 특허청구범위에 속하는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부항목에서 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 면역조성물 및 항원보강제의 추가적인 이점들은 본원에 기술된 양태를 기반으로 당해 기술분야의 숙련가에 의해 달성될 수 있으며, 이에 따라, 상기 이점들은 구체적으로 본 발명의 범위내에 있는 것이다.

Claims (30)

  1. 하나 이상의 C형 렉틴(CTL) 수용체 리간드, 하나 이상의 알루미늄 항원보강제(adjuvant), 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 아크릴 수지 중합체를 포함하고, 상기 CTL 수용체 리간드가 만난 및 만노스 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 경구 투여용 면역조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아크릴 수지 중합체가 에틸 아크릴레이트(EA), 메틸 메타크릴레이트(MM) 및 트리메틸암모늄에틸 메타크릴레이트 클로라이드의 수불용성 공중합체인, 면역조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역 조성물이 추가로 동해방지제(cryoprotectant)를 포함하고, 상기 동해방지제는 트레할로스, 만니톨, 락토스, 소르비톨, 수크로스 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역조성물.
  4. 항원과 하나 이상의 C형 렉틴(CTL) 수용체 리간드를 하나 이상의 알루미늄 항원보강제에 흡착시켜 백신 제형을 형성하는 단계로서, 상기 CTL 수용체 리간드가 만난 및 만노스 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단계;
    상기 백신 제형을 포스페이트 완충액 중에서 하나 이상의 아크릴 수지 중합체, 만니톨 및 수크로스와 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
    상기 혼합물을 낮은 pH의 완충액 내에 분무하여 현탁액을 형성하는 단계; 및
    상기 현탁액을 분말로 되도록 건조시키는 단계를 포함하는,
    경구 투여용 무수 분말 제형의 제형화 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아크릴 수지 중합체가 에틸 아크릴레이트(EA), 메틸 메타크릴레이트(MM) 및 트리메틸암모늄에틸 메타크릴레이트 클로라이드의 수불용성 공중합체인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 건조가 상압 분무 동결건조에 의해 수행되는, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 완충액이 아세트산나트륨 용액인, 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 pH가 3.0 내지 7.0인, 방법.
  9. 제4항에 있어서,
    a) 두 가지의 아크릴 수지가 존재하거나;
    b) 세 가지의 아크릴 수지가 존재하고;
    c) 상기 하나 이상의 아크릴 수지 중합체는 상기 무수 분말 제형이 투여될 때 상기 제형이 위장관을 따라 상기 항원을 방출하도록 선택됨을 포함하는, 경구 투여용 무수 분말 제형의 제형화 방법.
  10. 항원과 CTL-작용제를 알루미늄 항원보강제에 흡착시키는 단계로서, 상기 CTL-작용제가 만난 및 만노스 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단계;
    pH 의존 용해도를 갖는 아크릴 수지 중합체를 첨가하여 백신 제형을 형성하는 단계; 및
    상기 백신 제형을 낮은 pH 용액에 첨가하여 상기 중합체를 침전시켜 경구 투여용 백신을 제조하는 단계를 포함하는, 경구 투여용 백신의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 알루미늄 항원보강제가 알루미늄 옥시하이드록사이드인, 방법.
  12. 삭제
  13. 제10항에 있어서, 상기 아크릴 수지가 에틸 아크릴레이트(EA), 메틸 메타크릴레이트(MM) 및 트리메틸암모늄에틸 메타크릴레이트 클로라이드의 수불용성 공중합체인, 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 경구 투여용 백신을 상압 분무 동결건조(atmospheric spray freeze drying)하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 아크릴 수지 중합체들이 유드라지트 L100-55, 유드라지트® RL PO(A형) 및 유드라지트® RS PO, L30D55, L100, L12,5, S100, S12,5 및 FS30D 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 면역조성물.
  16. 제4항 내지 제11항, 제13항 및 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 아크릴 수지 중합체들이 유드라지트 L100-55, 유드라지트® RL PO(A형) 및 유드라지트® RS PO, L30D55, L100, L12,5, S100, S12,5 및 FS30D 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
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  25. 삭제
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