KR101859696B1 - Gfra1을 유효성분으로 하는 골육종 항암제 시스플라틴 내성 진단 및 예후진단용 마커 개발과 시스플라틴 내성 치료제 및 조성물 개발을 위한 분자적 스크리닝 기법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GFRA1을 유효성분으로 하는 골육종 항암제 시스플라틴 내성 진단 및 예후진단용 마커 개발과 시스플라틴 내성 치료제 및 조성물 개발을 위한 분자적 스크리닝 기법에 관한 것이다. 본 발명은 암 환자의 시스플라틴 치료 예후를 판단할 수 있는 기준을 제시하며, 시스플라틴의 자식작용(autophagy)을 활성화시켜 항암 효과를 극대화 할 수 있는 시스플라틴 보조제를 스크리닝 할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

GFRA1을 유효성분으로 하는 골육종 항암제 시스플라틴 내성 진단 및 예후진단용 마커 개발과 시스플라틴 내성 치료제 및 조성물 개발을 위한 분자적 스크리닝 기법{Development of Dignosting Marker for Cisplatin-Resistant comprising GFRA1 as Active Ingredient and Method for Molecular Screening Cisplatin-Resistant Drug}

본 발명은 GFRA1을 유효성분으로 하는 골육종 항암제 시스플라틴 내성 진단 및 예후진단용 마커 개발과 시스플라틴 내성 치료제 및 조성물 개발을 위한 분자적 스크리닝 기법에 관한 것이다.

골육종(osteosarcoma)는 초기 골암의 주된 형태이다. 이러한 골육종은 대개 아동기 및 청소년기에 발생하는 악성종양이다.¹ 수술을 동반한 화학요법의 사용은 골육종 환자의 장기간 생존율을 약 70% 정도로 높이고 있다.^2,3 골육종에 대한 항암제로 흔히 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin) 및 메토트렉사트(methotrexate)가 이용되고 있다. 특히, 시스플라틴은 골육종을 포함하는 고형암에 대한 가장 널리 사용되는 백금계 항암제이다.⁴ 이는 DNA 내 퓨린 염기의 친핵성 N7 부위와 상호작용하고 DNA 손상을 유도하여 종양 세포 분열을 억제 및 아폽토시스 또는 예정세포사의 개시를 유도한다.⁵ 이러한 치료방법은 높은 효율을 갖지만, 항암제에 대한 암 세포의 후천적 또는 본질적 내성에 대해 제한적이다.⁶ 그러므로, 골육종에 대한 더 효과적인 치료를 개발하기 위해 항암제 내성을 유도하는 분자적 기작에 대한 이해가 필요하다.

자식작용(autophagy)은 대사 스트레스 하에 항상성을 유지하기 위한 세포의 자기소화(self digestion) 및 필요하지 않거나 비효과적인 세포 성분의 재활용에 중요한 과정이다.^7,8 자식작용의 초기단계 동안, 세포 단백질, 기관(organelles) 및 세포질이 격리되고 자식포(autophagosome)에 의해 에워싸지게 된다. 다음, 자식포는 리소좀(lysosome)과 융합하여 자가리소좀(autolysosome)을 형성하고, 격리된 단백질 및 기관은 리소좀의 가수분해 효소에 의해 분해된다.^9,10 자식작용은 예정세포사 Ⅱ형으로 알려진 대체 세포사멸 기작, 특히 아폽토시스-결핍 세포과 같은 세포사멸에 중요한 역할을 하며, 이러한 기작을 통해 종양 억제 기능을 할 수 있다.^11-13 역설적으로, 자식작용은 영양 결핍, 화학요법, 방사선 및 저산소증과 같은 환경적 스트레스에 의해 유도되는 세포 생존 기작에도 관여하는 것으로 알려져 있다.^11,12,14 몇몇 연구는 세포 생존을 위한 자식작용의 유도가 몇몇 암에서 항암제 요법에 대한 내성을 부여한다고 보고하였다.^15-19 그러나, 항암체치료에 대한 자식작용의 종양 억제 기작으로서의 아폽토시스성 세포 사멸 또는 생존-촉진 기작으로서의 세포 생존의 상대적인 기여도는 완전히 규명되지 않았다.

GNDF(Glycoslyphosphatidylinositol-linked glial cell line-derived neurotrophic factor) 수용체 α 또는 GFRα는 GDNF, 뉴투린(neurturin), 아르테민(artemin) 및 퍼세핀(persephin)을 포함하는 리간드의 GNDF 패밀리를 인식하는 공동 수용체(coreceptor)이다.^20,21 4종류의 GFRα이 규명되었다. 각 GFRα는 자신의 GDNF 리간드를 특이적으로 인식한다. GFRα와 리간드의 결합은 티로신 키나아제 RET를 활성화시키고, 그 다음, 세포질 티로신 키나아제의 Src 패밀리의 하나인 Src를 활성화시킨다.²⁰ GDNF/GFRα 신호전달은 도파민성 뉴런의 생존을 보호하고 촉진하여 신경계의 발생 및 유지를 조절하므로, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질병에 대한 치료 표적의 가능성을 갖는다.^22,23 GFRα1은 특이적으로 GDNF를 인지하고 이는 신경세포의 생존 및 분화의 조절에 관여되어 있다. 몇몇 연구는 정확한 종양형성 기작은 분명하지 않지만, GFRα1이 전이 및 침투를 촉진하여 유방암 및 췌장암과 같은 인간 암을 진행시키는 역할을 한다고 보고하였다.^24-27

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 희귀암인 골육종 환자의 항암제 내성을 유도하는 분자적 기작을 이해하고자 노력하였다. 그 결과, 골육종 환자의 GFRα1이 항암제 내성에 관여하며, 시스플라틴(cisplatin)에 의한 자식작용(autophagy)의 생존 기작을 촉진하는 것을 규명하여, 상기 GFRα1이 골육종 환자의 시스플라틴 치료에 대한 감수성 진단이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 시스플라틴에 대한 감수성(susceptibility) 결정 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 환자의 시스플라틴에 대한 감수성 예측용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 시스플라틴 보조제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시스플라틴(cisplatin)에 대한 감수성(susceptibility) 결정 방법을 제공한다.

(a) 암 환자로부터 생물학적 시료를 분리하는 단계;

(b) 상기 생물학적 시료의 GFRα1(Glial cell line-derived neurotrophic factor receptor α1) 유전자 또는 단백질의 발현 여부를 판단하는 단계로, 상기 GFRα1 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 정상 세포보다 하향-조절(down-regulated)되는 경우, 시스플라틴 감수성이 있는 것으로 판단하고, 상기 GFRα1 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 정상 세포보다 상향-조절(up-regulated)되는 경우, 시스플라틴 내성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.

본 발명자들은 희귀암인 골육종 환자의 항암제 내성을 유도하는 분자적 기작을 이해하고자 노력하였다. 그 결과, 골육종 환자의 GFRα1이 항암제 내성에 관여하며, 시스플라틴에 의한 자식작용(autophagy)의 생존 기작을 촉진하는 것을 규명하여, 상기 GFRα1이 골육종 환자의 시스플라틴 치료에 대한 감수성 진단이 가능함을 확인하였다.

암 치료의 방법은 크게 외과적 수술 치료(surgical resection), 화학적 치료(chemotherapy) 및 방사능치료(radioactivetherapy)로 구분된다. 항암 약물치료로 대표되는 화학적 치료(chemotherapy)는 수술과 더불어 종양 치료에 가장 중요한 역할을 하는 치료방법 중 하나로써, 그 동안 다양한 항암제들이 개발되어 치료 반응률은 향상 되고 부작용은 감소하고 있다. 항암제의 높은 치료 반응률에도 불구하고, 항암제에 대한 암 세포의 후천적/본질적 내성이 문제가 되어, 항암제 내성을 유도하는 분자적 기작을 이해가 중요한 과제로 대두되었다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 과제해결을 위해 시스플라틴에 대한 감수성을 예측할 수 있는 유전자인 GFRα1를 동정하였다.

본 발명의 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법을 단계별로 상세히 설명한다.

단계 (a): 생물학적 시료의 분리

먼저, 암 환자로부터 생물학적 시료를 분리한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암은 골육종, 자궁경부암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피 암종, 신경교종, 대장선암, 전립선암종, 대장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피세포암, 기저세포암, 선암종(adenocarcinoma), 신세포암종, 간세포암, 담도암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 척색종, 혈관육종, 내피세포육종(endotheliosarcoma), 림프관 육종, 림프관 혈관내피세포육종(lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종, 중피종, 유윙 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 횡문근종, 땀샘암종, 피지샘 암종, 유두상암종, 유두상 선암, 낭선암종, 연수갑상선암종, 기관지암종, 융모상피암, 고환종, 배아성암종(embryonal carcinoma), 윌름 종양, 성상세포종, 카포시육종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 회돌기세포교종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 골수종, 림프종 또는 백혈병이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암은 골육종이다.

본 발명은 골육종 환자로부터 생물학적 시료를 분리한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 균질액, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 및 세포 조직액으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물학적 시료이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직 또는 세포이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 골육종 조직 또는 골육종 세포이다.

단계 (b): GFRα1 유전자 또는 단백질의 발현 여부 판단

다음, 상기 생물학적 시료의 GFRα1(Glial cell line-derived neurotrophic factor receptor α1) 유전자 또는 단백질의 발현 여부를 판단한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 GFRα1 유전자 또는 단백질의 발현 여부는 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하여 실시하여 판단할 수 있다.

상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 GFRα1의 존재를 확인한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법은 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 GFRα1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 서열목록 제5서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 GFRα1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 시스플라틴에 대한 감수성을 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 암 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 GFRα1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 시스플라틴 감수성 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 GFRα1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 세포)보다 하향-조절(down-regulated)되는 경우에는 시스플라틴 감수성이 있는 것으로 판단하고, 상기 혼성화 시그널이 정상 시료보다 상향-조절(up-regulated)되는 나오는 경우에는 시스플라틴 내성이 있는 것으로 판단한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 혼성화법으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상순한 본 발명의 GFRα1을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프로브를 이용하여 실시된다.

본 발명의 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법은 유전자 증폭법에 의해 실시될 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 암 세포)에서 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 체외로 분리된 동물의 암 세포에서 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 하향-조절되는 경우, 시스플라틴 감수성이 있는 것으로 판단하고, 상기 발현이 정상 세포보다 상향-조절되는 경우, 시스플라틴 내성이 있는 것으로 판단한다.

따라서 본 발명의 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법은 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 GFRα1의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법은 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제4서열을 프라이머로 이용하여 유전자 증폭하여 실시할 수 있다.

본 발명의 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법은 면역분석법에 의해 실시될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 시스플라틴에 대한 감수성을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 GFRα1를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 GFRα1에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 GFRα1에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, MLN 51 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 GFRα1의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 시스플라틴에 대한 감수성을 결정할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 GFRα1에 대한 시그널이 정상 시료 보다 하향-조절되는 경우, 시스플라틴 감수성이 있는 것으로 판단하고, 상기 시그널이 정상 세포보다 상향-조절되는 경우, 시스플라틴 내성이 있는 것으로 판단한다.

본 발명의 방법은 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 GFRα1는 시스플라틴에 대한 감수성이 있는 객체에서 저발현 되는 생체 분자이다. 이러한 GFRα1의 저발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “저발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 낮은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 적은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 GFRα1들이 정상세포와 비교하여 2-20 배 정도 저발현 되는 경우, 본 발명에서의 “저발현”으로 판정하고 시스플라틴 감수성이 있는 것으로 판정한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, GFRα1를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편 또는 GFRα1에 특이적인 항체를 포함하는 암 환자의 시스플라틴에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크 접근번호 NM_005264(서열목록 제5서열)로 표시되는 뉴클레오타이드 서열이다.

상기 암 환자의 시스플라틴에 대한 감수성 예측용 키트는 혼성화 키트, 유전자 증폭 키트 또는 면역분석 키트이다.

본 발명의 키트은 상기 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 세포의 시스플라틴에 대한 내성을 억제하는 시스플라틴 보조제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) GFRα1을 포함하는 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계;

(b) 상기 세포의 GFRα1 발현 정도를 측정하는 단계, 상기 GFRα1 발현이 대조군과 비교하여 하향-조절(down-regulated)되는 경우 시스플라틴 보조제로 판정된다.

본 발명은 GFRα1이 골육종 환자의 항암제 내성에 관여하며, 시스플라틴에 의한 자식작용의 생존 기작을 촉진하는 것을 규명한다. 상세하게는, 시스플라틴에 의해 과발현된 GFRα1 이 Src를 인산화시키고, 인산화된 Src가 AMPK를 인산화하여 자식작용이 개시된다.

상기 시스플라틴 보조제의 스크리닝 방법을 단계별로 상세히 설명한다.

단계 (a): 시스플라틴 및 후보물질의 접촉

먼저, 자식작용 신호전달 경로를 갖는 세포에 시스플라틴 및 후보물질을 접촉시킨다.

본 명세서에서 용어 “후보물질”은 자식작용 신호전달의 불활성화에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학 물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (b): GFRα1 발현 정도 측정

다음, 상기 세포의 GFRα1 발현 정도를 측정하는 단계, 상기 GFRα1 발현이 시스플라틴만 처리한 대조군과 비교하여 하향-조절(down-regulated)되는 경우 시스플라틴 보조제로 판정된다.

상기 GFRα1의 발현은 앞서 기재한 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 시스플라틴(cisplatin)에 대한 감수성(susceptibility) 결정 방법, 암 환자의 시스플라틴에 대한 감수성 예측용 키트 및 시스플라틴 보조제의 스크리닝 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 암 환자의 시스플라틴 치료 예후를 판단할 수 있는 기준을 제시한다.

(c) 본 발명은 시스플라틴의 자식작용(autophagy)을 활성화시켜 항암 효과를 극대화 할 수 있는 시스플라틴 보조제를 스크리닝 할 수 있는 방법을 제공한다.

(d) 본 발명은 항암제 내성 가능 여부를 사전에 판정하여 환자 맞춤형 치료를 가능하게 한다.

도 1a 내지 1e는 골육종 세포 내 시스플라틴에 의한 GFRα1 발현 유도에 관한 것으로, 도 1a 내지 1c는 GFRα1 및 β-액틴에 특이적인 항체를 이용한 골육종 세포 용해물의 면역블럿 분석을 나타낸다. 도 1a는 독소루비신(5 μM), 시스플라틴(20 μM) 또는 메토트렉사트(1 mM)을 24시간 동안 처리한 MG-63 및 U-2 OS 세포를 나타낸다. 화학치료제의 처리 후 GFRα1의 면역블랏 분석(왼쪽) 및 GFRα1 발현의 정량(오른쪽) 결과를 나타낸다. 도 5b는 다양한 농도의 시스플라틴이 24시간 동안 처리된 MG-63 및 U-2 OS 세포를 나타낸다. 도 1c는 20 μM 시스플라틴을 처리하고 지정된 시간에 수집한 MG-63 및 U-2 OS 세포를 나타낸다. 도 1d 및 1e는 시스플라틴 처리 후 GFRα1 mRNA 발현의 정량적 실시간 PCR 결과로, GFRα1 mRNA 발현의 대표 이미지(위) 및 정량적 분석(아래)를 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 1d는 다양한 농도의 시스플라틴이 24시간 동안 처리된 MG-63 및 U-2 OS 세포를 나타낸다. 도 1e는 20 μM 시스플라틴을 처리하고 지정된 시간에 수집한 MG-63 및 U-2 OS 세포를 나타낸다.
도 2a 내지 2h는 GFRα1에 의한 시스플라틴에 의해 유도된 골육종 세포의 화학민감성의 억제를 나타내는 결과이다. 도 2a는 GFRα1 shRNA를 이용한 GFRα1-결핍 골육종 세포주의 제조를 나타낸다. MG-63 및 U-2 OS 세포를 대조군 또는 GFRα1 shRNA로 트랜스펙션하였다. 대조군 및 GFRα1-결핍 안정된 골육종 세포 용해물을 GFRα1 및 β-액틴에 특이적인 항체를 이용하여 면역블랏 분석하였다. 도 2b는 시스플라틴 처리 후 GFRα1-결핍 골육종 세포의 세포 생존능을 나타낸다. 대조군 또는 GFRα1-결핍 세포를 배양하고 다양한 농도의 시스플라틴을 24시간 동안 처리하였다. 세포생존능은 WST-1 분석을 사용하여 측정하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 2c는 시스플라틴 처리 후 GFRα1-결핍 골육종 세포의 아폽토시스 반응을 나타낸다. 대조군 및 GFRα1-결핍 세포를 배양하고 다양한 농도의 시스플라틴을 24시간 동안 처리하였다. FITC-Annexin V 염색으로 아폽토세스 세포(위)를, PI 염색으로 생존 세포(아래)를 유세포 분석을 통해 분석하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 2d는 대조군 및 GFRα1-결핍 세포 용해물의 아폽토시스 단백질인 절단형 PARP 및 절단형 카스페이즈-3에 특이적인 항체를 이용한 면역 블럿분석을 나타낸다. 대조군 및 GFRα1-결핍 MG-63 세포를 20 μM 시스플라틴을 24시간 동안 처리하고 세포를 수확하였다. 도 2e는 시스플라틴 처리 후 대조군 및 GFRα1-결핍 MG-63 세포의 상대적 카스페이즈-3 활성을 나타낸다. 대조군 및 GFRα1-결핍 세포를 배양하고 50 μM ZVAD-FMK의 처리 또는 무처리 하에 다양한 농도의 시스플라틴을 24시간 동안 처리하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 2f는 GFRα1 발현 벡터를 이용한 GFRα1-과발현 골육종 세포의 제조를 나타낸다. MG-63 및 U-2 OS 세포를 대조군 또는 인간 GFRα1 발현 벡터로 트랜스펙션하였다. GFRα1 및 β-액틴에 특이적인 항체를 이용한 대조군 및 GFRα1-과발현 안정적 골육종 세포 용해물의 면역분석 결과를 나타낸다. 도 2g는 시스플라틴 처리 후 GFRα1-과발현 골육종 세포의 세포 생존능을 나타낸다. 대조군 및 GFRα1-결핍 세포를 배양하고 다양한 농도의 시스플라틴을 24시간 동안 처리하였다. 세포생존능은 WST-1 분석을 사용하여 측정하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 2h는 시스플라틴 처리 후 GFRα1-과발현 골육종 세포의 아폽토시스 반응을 나타낸다. 대조군 및 GFRα1-결핍 세포를 배양하고 다양한 농도의 시스플라틴을 24시간 동안 처리하였다. 세포생존능은 WST-1 분석을 사용하여 측정하였다. FITC-Annexin V 염색으로 아폽토세스 세포(위)를, PI 염색으로 생존 세포(아래)를 유세포 분석을 통해 분석하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다.
도 3은 GFRα1-유도 자식작용에 의한 시스플라틴-유도 골육종세포의 항암제내성 향상을 나타낸다. 도 3a는 대조군 및 GFRα1-결핍 MG-63 세포를 mRFP-GFP 텐덤 형광-태깅 LC3(mRFP-GFP-LC3) 벡터로 일시적으로 트랜스펙션하고 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 왼쪽, RFP-LC3 및 GFP-LC3 점의 대표이미지로, 스케일바는 20 ㎛이다. 오른쪽, 조합된 이미지의 노란색 점의 수 및 RFP-LC3의 수의 정량적 분석을 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 3b는 대조군 및 GFRα1-결핍 MG-63 세포를 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하고 아크리딘 오렌지로 염색하였다. 위, 아크리딘 오렌지로 염색한 세포의 대표이미지로 스케일바는 20 ㎛이다. 아래, AVO의 수를 정량 분석한 결과를 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 3c는 대조군 및 GFRα1-결핍 MG-63 세포에 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하고 TEM으로 분석하였다. 위, 대조군 MG-63 세포에 시스플라틴 처리 후 검출한 자식작용 액포(노란색 화살표)의 대표 이미지로, 스케일바는 100 ㎛이다. 아래, 자식작용 액포의 수를 정량 분석한 결과를 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 3d는 대조군 및 GFRα1-과발현 골육종 세포 용해물의 GFRα1, LC3 및 β-액틴에 특이적인 항체를 이용한 면역블럿 분석을 나타낸다. GFRα1-과발현 MG-63 세포에 DMSO, 3-MA(10 μM) 또는 Baf(100 nM)을 처리하였다. 도 3e는 대조군 및 GFRα1-과발현 MG-63 세포 내 노란색 점의 수 및 RFP-LC3 점의 수의 정량적 분석을 나타낸다. 대조군 및 GFRα1-과발현 MG-63 세포를 mRFP-GFP 텐덤 형광-태깅 LC3(mRFP-GFP-LC3) 벡터로 일시적으로 트랜스펙션하고 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 도 3f는 mRPF-GFR-LC3 트랜스펙션 전에 대조군 및 GFRα1-과발현 MG-63를 3-MA(10 μM)를 2시간 동안 전처리하여 24시간동안 반응시켰다. 도 3g는 대조군 및 GFRα1-과발현 MG-63 세포를 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하고 아크리딘 오렌지로 염색하였다. 위, 아크리딘 오렌지로 염색한 세포의 대표이미지로 스케일바는 20 ㎛이다. 아래, AVO의 수를 정량 분석한 결과를 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 3h는 대조군 및 GFPα1-과발현 MG-63 세포에 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하고 TEM으로 분석하였다. 위, 대조군 및 GFRα1-과발현 MG-63 세포에 시스플라틴 처리 후 검출한 자식작용 액포의 대표 이미지로, 스케일바는 100 ㎛이다. 아래, 자식작용 액포의 수를 정량 분석한 결과를 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 3i는 자식작용 억제제의 존재 하에 시스플라틴 퍼리 후 GFRα1-과발현 골육종 세포의 세포생존능을 나타낸다. 대조군 또는 GFRα1-과발현 MG-63 세포를 DMSO, 3-MA 또는 Baf와 배양하고 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 3j는 Beclin1(20 nM) 또는 HMGB1(20 nM) siRNA의 존재 하에 시스플라틴 처리 후 GFRα1-과발현 골육종 세포의 세포 생존능을 나타낸다. 대조군 또는 GFRα1-과발현 MG-63 세포를 Beclin1 또는 HMGB1 siRNA와 48시간 동안 배양한 다음 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 세포생존능은 WST-1 분석을 사용하여 측정하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 3k는 콜로니 형성에 있어서 시스플라틴(20 μM) 존재 하에 GFRα1 결핍 또는 과발현의 영향을 나타낸다. 대조군(대조군 shRNA), GFRα1-결핍(GFRα1 shRNA), 대조군(엠티 벡터) 및 GFRα1-과발현(GFRα1 발현 벡터) MG-63 세포를 동일한 수(1×10⁴ 세포)로 플레이팅하였다. 모든 세포주에 시스플라틴(20 μM)을 10일 동안 처리하였다. 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 가시화하였다. 왼쪽은 콜로니 형성의 대표이미지이고, 오른쪽은 콜로니의 수 및 플레이팅 효율의 정량적 관계를 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 3l은 시스플라틴(20 μM) 존재 하에 GFRα1-과발현 세포의 콜로니 형성에 대한 자식작용 억제제의 영향을 나타낸다. 대조군 및 GFRα1-과발현 클론 #4를 플레이팅하고 3-MA(10 μM), Baf(100 nM) 또는 CQ(30 ㎍/㎖)를 각각 처리하였다. 모든 세포주는 시스플라틴을 처리하여 10일동안 반응시켰다. 모든 플레이트를 스캐너로 스캔하고 콜로니의 수를 이미지-J 소프트웨어를 이용하여 정량하였다. 왼쪽, 콜로니 형성의 대표이미지이다. 오른쪽, 콜로니의 수 및 생존 분획의 정량적 분석을 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다.
도 4a 내지 4g는 GFRα1의 골육종 세포 내 Src/AMPK 신호전달에 의한 자식작용 조절을 나타낸다. 도 4a 내지 4b는 GFRα1, p-Src, Src, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-p70 S6Kinase, Beclin 1, HMGB1, LC3 및 β-액틴에 특이적인 항체를 이용한 골육종 세포 용해물의 면역블럿 분석을 나타낸다. 도 4a는 MG-63 및 세포에 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 도 4b는 대조군 및 GFRα1-결핍 MG-63 세포에 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 도 4c 내지 4e는 GFRα1, p-Src, Src, p-AMPK, AMPK, LC3 및 β-액틴에 특이적인 항체를 이용한 골육종 세포 용해물의 면역블럿 분석을 나타낸다. 도 4c는 대조군 및 Src-결핍 MG-63 세포에 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 도 4d는 MG-63 세포를 PP1(5 μM) 처리 또는 무처리 하에 배양하고, 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 도 4e는 MG-63 세포를 컴파운드 C 처리 또는 무처리 하에 배양하고, 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 도 4f는 PP1 존재 하에 시스플라틴 처리 후 MG-63 세포의 세포 생존능을 나타낸다. MG-63 세포를 DMSO 또는 PP1(2, 5 μM) 하에 배양하고 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 세포생존능은 WST-1 분석으로 측정하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 4g는 컴파운드 C의 존재 하에 시스플라틴 처리 후 MG-63 세포의 세포생존능을 나타낸다. MG-63 세포를 DMSO 또는 컴파운드 C(5, 10 μM) 하에 배양하고 시스플라틴(20 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 세포생존능은 WST-1 분석으로 측정하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다.
도 5a 내지 5f는 GFRα1-매개 자식작용이 인비보 항암제내성 및 종양 성장을 촉진시킴을 나타낸다. 도 5a는 BALb/c 누드 마우스(n=40)에 대조군 또는 GFRα1 발현 벡터로 트랜스펙션한 MG-63을 투여하였다. 종양 부피는 3-4일마다 측정하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었다. 도 5b는 BALb/c 누드 마우스(n=20)에 대조군 또는 GFRα1 shRNA를 트랜스펙션한 MG-63을 투여하였다. 종양 부피는 3-4일마다 측정하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었다. 도 5c는 GFRα1 발현 벡터를 트랜스펙션한 MG-63 세포를 투여한 마우스의 종양에 PBS, CQ, 시스플라틴 또는 시스플라틴+CQ를 직접 투여하였다. 종양 부피는 3-4일마다 측정하였다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었다. **p<0.05 vs PBS, CQ 또는 시스플라틴-처리 종양. 도 5d의 왼쪽은 GFRα1 발현 벡터를 트랜스펙션한 MG-63 세포를 투여한 마우스 종양에 PBS, CQ, 시스플라틴 또는 시스플라틴+CQ를 직접 투여한 종양 절편의 HMGB1 면역형광 염색의 대표이미지를 나타낸다. 오른쪽은 HMGB1-양성 종양 내 세포질 HMGB1-양성 세포의 백분율의 정량적 분석을 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 5e의 왼쪽은 GFRα1 발현 벡터를 트랜스펙션한 MG-63 세포를 투여한 마우스 종양에 PBS, CQ, 시스플라틴 또는 시스플라틴+CQ를 직접 투여한 종양 절편의 TUNEL-양성 세포의 대표이미지이다. 오른쪽은 HMGB1-양성 종양 내 세포질 TUNEL-양성 세포의 백분율의 정량적 분석을 나타낸다. 값은 평균±표준편차(n=3)으로 나타내었고, **는 t-테스트에 의한 p<0.05을 의미한다. 도 5f는 GFRα1 발현 벡터를 트랜스펙션한 MG-63 세포를 투여한 마우스 종양에 시스플라틴 또는 시스플라틴+CQ를 직접 투여한 마우스의 생존율을 나타낸다. 도 5g는 시스플라틴 처리 전/후 인간 골육종 환자 절편의 GFRα1 면역조직화학법 염색의 대표 이미지를 나타낸다. 도 5h는 시스플라틴 처리 전/후 인간 골육종 환자 절편의 GFRα1 및 HMGB1의 면역형광염색의 대표 이미지를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

인간 조직

본 연구의 시료는 보건복지부 지원 하의 국립중앙인체자원은행(http://koreabiobank.re.kr)인 전남대학교 화순 병원(광주, 전남, 대한민국)으로부터 지원받았다. 모든 시료는 전남대학교 임상시험심사위원회의 승인된 피험자동의서와 함께 구하였다.

세포 배양

인간 골육종 세포주 MG-63 및 U-2 OS, 인간 배아 신장 세포주 293T, 인간 섬유육종 세포주 HT-1080, 인간 췌장암 세포주 MIA PaCa-2 및 아무스 배아 섬유아세포주 NIH/3T3는 ATCC(American Type Cultue Collection, Rockville, MD)로부터 구매하였다. 세포주는 10% 열-불활성화 우태아혈청(Feal Bovine Serum; FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; MG-63, 293T, MIA PaCa-2 및 NIH/3T3), EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium; HT-1080) 또는 McCoy's 5a 배지(modified; U-2 OS)로 배양하였다. 세포는 37℃의 5% CO₂-가습 대기조건 하에 배양하였다.

안정적 세포주(stable cell line)의 제조

인간 pLenti/GFRα1 발현 벡터 및 대조군 벡터를 GeneCopoeia(Rockville, MD)로부터 구매하였다. 293T 세포를 이용하여 바이러스 패키징(viral packaging)하고 Invitrogen Gateway Sytem 및 ViraPower Lentiviral Expression System을 이용하여 전체 렌티바이러스 벡터의 적정(titration)을 실시하였다. PCR을 통해 GFRα1의 존재를 확인하고, 시퀀싱을 통해 클론의 정확한 삽입을 확인하였다. HT-1080 세포를 이용하여 렌티바이러스의 형질도입, 발현 및 적정을 실시하였다. 패킹된 바이러스를 센트리콘 필터(Millipore, Billerica, MA)를 이용한 초원심분리(20,000×g, 2시간, 4℃)를 실시하여 농축하였다. 제조된 GFRα1 과발현 MG-63, U-2 OS 또는 NIG/3T3를 pLenti/cotrol 또는 pLenti/GFRα1 벡터를 포함하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 다음, 세포를 400 ㎍/㎖ G418을 포함하는 배양 배지로 4-5주 동안 배양하였다. GFRα1-특이적 shRNA 및 대조군 shRNA를 산타크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz, CA)로부터 구매하였다. 리포펙타민2000(Life Technologies, Grand Island, NY)를 이용하여 GFRα1-특이적 shRNA 또는 대조군 shRNA를 MG-63 및 U-2 OS 세포에 트랜스펙션하고 100 ㎍/㎖ 퓨로마이신(puromycin)을 포함하는 선별 배지에서 4-5주 동안 배양하여 안정적인 GFRα1 녹다운(knockdown) 세포주를 제조하였다.

시스플라틴-내성 세포주의 제조

시스플라틴-내성(Cisplatin-resistant; CIS^R) 세포주(subline)은 MG-63 부모 세포주에 시스플라틴의 초기 용량-반응 연구에 따라 IC50값을 갖는 1 μM 내지 1 mM 시스플라틴을 24시간동안 지속적으로 노출시켜 제조하였다. 초기, 1 μM 시스플라틴을 72시간 동안 CIS^R 세포주에 처리하였다. 배지를 제거하고 72시간동안 세포가 회복하도록 하였다. 그 다음, 저농도에서 고농도로 시스플라틴(1 내지 50 μM)을 점진적으로 노출하여 내성 세포주를 제조하였다. 이러한 발생기를 약 6개월 동안 수행하였고, 제조된 세포는 새로운 IC50 농도의 시스플라틴의 존재에도 2개월 동안 계속 유지되었다.

시약 및 항체

DMSO(Dimethyl sulfoxide), DMF(N,N-Dimethylformamide), 시스플라틴(Cis-Diamineplatinum(Ⅱ) dichloride), 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1), 3-MA(3-methyladenine) 및 CQ(Chloroquine diphosphate salt)는 시그마-알드리치(St.Louis, MO)로부터 구매하였다. 메토트렉사트(Methotrexate) 및 독소루비신은 산타크루즈 바이오테크놀러지로부터 구매하였다. 항-GFRα1, 항-포스포-mTOR, 항-mTOR, 항-c-Src, 항-케스페이즈-3 및 항-β-액틴은 산타크루즈 테크놀러지로부터 구매하였고, 항-HMGB1은 Abcam(Cambridge, MA)로부터 구매하였으며, 항-포스포-Src, 항-Beclin 1, 항-포스포-AMPK, 항-AMPK, 항-LC3B 및 항-포스포-p70 S6 키나아제는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA)로부터 구매하였다.

정량적 실시간(quantitative real-time)-PCR(qPCR)

RNeasy 시스템(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA(3 ㎍), 역전사효소 및 올리고 dT 프라이머(Promega, Madison, WI)를 포함하는 30 ㎕ 반응물로부터 cDNA를 제조하였다. LightCycler 96 Instrument(Roche, Indianapolis, IN)으로 SYBR 마스터믹스 FastStart Essential DNA Green Master(Roche)를 사용하여 GFRα1 및 NFκB p50 cDNA의 실시간 증폭을 실시하였다. 18S rRNA, GFRα1 및 NFκB p50의 유전자-특이적 인간 프라이머 세트를 Primer Express 소프트웨어 v3.0.1(Applied Biosystems, Grand Island, NY)을 사용하여 디자인하였다. 합성되어 qPCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다:

p18S rRNA 센스 프라이머 5'-GAGGATGAGGTGGAACGTGT-3' 및 안티센스 프라이머 5'-TCTTCAGTCGCTCCAGGTCT-3'(166 bp 부위 증폭); qGFRα1 센스 프라이머(서열목록 제1서열) 5'-TCCAATGTGTCGGGCAATAC-3' 및 안티센스 프라이머(서열목록 제2서열) 5'-GGAGGAGCAGCCATTGATTT-3'(106 bp 부위 증폭); qNFκB p50 센스 프라이머 5'-AAGCACAAAAAGGCAGCACT-3' 및 안티센스 프라이머 5'-TGCCAATGAGATGTTGTCGT-3'(197 bp 부위 증폭). 95℃-10초 1 사이클 후, 95℃-5초 및 어닐링 단계 60℃-20초의 조건으로 48 사이클 증폭하였다. 증폭물(amplicon)의 정확한 크기를 확인하기 위해 멜팅(melting) 곡선 분석을 실시하였다. cDNA가 없는 음성 대조군을 매 PCR마다 진행하여 반응의 특이성을 평가하였다. 결과의 분석은 LightCycler 96 소프트웨어 1.1(Roche)를 사용하여 실시하였다.

반정량적 RT-PCR

GFRα1, GDNF 및 GAPDH의 유전자-특이적 인간 프라이머 세트를 Primer Express 소프트웨어 v3.0.1(Applied Biosystems, Grand Island, NY)을 사용하여 디자인하였다. 합성되어 qPCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다:

GFRα1 센스 프라이머(서열목록 제3서열) 5'-TGTCAGCAGCTGTCTAAAGG-3' 및 안티센스 프라이머(서열목록 제4서열) 5'-CTTCTGTGCCTGTAAATTTGCA-3'(387 bp 부위 증폭); GDNF 센스 프라이머 5'-CCAACCCAGAGAATTCCAGA-3' 및 안티센스 프라이머 5'-AGCCGCTGCAGTACCTAAAA-3'(150 bp 부위 증폭); GAPDH 센스 프라이머 5'-TGACCACAGTCCATGCCATC-3' 및 안티센스 프라이머 5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'(494 bp 부위 증폭). 변성 단계; 94℃-3분, 증폭단계; (94℃-30초)-(58℃-30초)-(72℃-30초)의 28 증폭 사이클 및 신장 단계; 72℃-10분로 PCR 반응을 최적화하였다. 증폭 산물을 1.5% 아가로즈 겔에 전기영동하고 EtBr(Ethidium bromide) 염색으로 가시화하였다.

siRNA(small interfering RNA)-기반 실험

인간 GFRα1 siRNA, Beclin 1 siRNA, HMGB1 siRNA, AMPK siRNA, c-Src siRNA, NFκB p50 siRNA, APE siRNA 및 음성 대조군 siRNA를 산타크루즈 바이오테크놀러지로부터 구매하였다. 세포주는 제조사의 매뉴얼에 따라 Lipofectamine RNAiMAX(Life Technologies)를 사용하여 siRNA를 일시적으로 트랜스펙션하였다.

세포 생존능 분석

WST-1 세포 생존능분석 시약은 로쉐(Roche)로부터 구매하였다. 48-웰 플레이트에 동일한 수의 세포를 3중으로 씨딩하고, 10% FBS를 포함하는 성장 배지로 배양하였다. 혈청 존재 하에 PBS, GDNF(50 ng/㎖), GDNF(50 ng/㎖)+시스플라틴(20 μM) 또는 시스플라틴(20 μM)을 처리하여 24시간 동안 세포 배양하였다. PBS, GDNF, GDNF+시스플라틴 또는 시스플라틴을 처리하기 전에, 세포에 미리 억제제(3-MA, PP1, 컴파운드 C, Baf 및 CQ)를 처리하고 1시간 동안 배양하였다. 다음, WST-1 시약을 정해진 시간에 세포에 처리하고 37℃에서 2시간동안 배양하였다. WST-1 처리 후 흡광도를 측정하여 세포 생존능을 결정하였다. 시료의 분광광도계 흡광도를 Ultra Multifunctional Microplate Reader(Tecan, Durham, NC)를 이용하여 450 ㎚에서 측정하였다. 실험은 최소 3회 독립 배양으로 실시하였다.

아폽토시스 분석

부유 또는 트립신-분리 세포를 수집하고 아이스 콜드 PBS로 1회 세척한 다음, FITC Annexin V 아폽토시스 검출 키트(BD Biosciences, San Diego, CA)로 분석하였다. 아폽토시스 세포를 Cell Quest 소프트웨어(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 및 FACS Calibur 유세포 분석기로 분석하였다. 결과는 회당 최소 10,000 세포를 분석한 3회 측정의 평균값으로 나타내었다. sub-G1 파퓰레이션을 아폽토시스 세포로 계수하였다. Colorimetric CaspACETM 분석 시스템(Promega, Madison, WI)로 제조자의 설명서에 따라 카스페이즈 3 활성을 분석하였다. 조직의 아폽토시스 정도를 ApopTag Plus Peroxidase In Situ(Millipore, Billerica, MA)의 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick end labeling) 분석으로 평가하였다.

FACS 분석

트립신 처리하여 세포를 수확하고 PBS로 세척한 후 70% 에탄올로 고정하고 PBS로 세척한 다음 RNase를 포함하는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 0.02 ㎎/㎖로 반응시켰다. FACS Calibur 유세포 분석기 및 Cell Quest 소프트웨어를 사용하여 세포를 분석하였다.

TUNEL 분석

조직 내 아폽토시스 지표를 TUNEL 분석으로 결정하였다. 절편을 ApopTag Plus Peroxidase In Situ로 염색하였다. 절편을 60℃에서 밤새 항온반응하였다. 절편을 자일렌으로 한시간 동안 탈파라핀한 후 연속 환원 알코올(100, 95, 90, 70 및 50%)로 재수화하였다. 슬라이드에 20 ㎍/㎖ 프로테이나아제 K(Invitrogen, Camarillo, CA)를 처리하여 15분 동안 반응시켰다. 매 단계에서 PBS로 세척하였다. 3% H₂O₂를 처리하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 억제하였다. PBS로 세척한 후, 절편을 평형 완충액으로 10-15분, TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) 효소[77 ㎕ 반응 완충액 + 33 ㎕ TdT 효소 혼합물(1 ㎕ Td 효소)]로 37℃에서 1시간 동안 항온반응시켰다. 정지/세척 완충액(1:10)을 상온에서 10분 동안 처리한 슬라이드를 항-디곡시제닌 컨쥬게이트(anti digoxigenin conjugate)로 30분 동안 항온반응시켰다. PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, 절편을 DAB로 염색하여 TUNEL-양성 세포를 검출하였다. 다음, 메틸 그린으로 대비염색하였다. 결과는 이미지-J 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD)로 분석하여 정량화하였다.

자식작용(autophagy) 분석

세포 내 내인성 또는 외인성 LC3-Ⅱ을 LC3B 항체 또는 mRFP-GFP-LC3 플라스미드(삼성서울병원, 성균관대학교 의대, 이명식 교수 제공)로 자식작용 소낭의 형성을 모니터링하였다. 세포주에 mRFP-GFP-LC3을 트랜스펙션한 후 웨스턴블럿을 통해 LC3-Ⅱ의 단백질 발현정도를 검출하였다. 공지된 방법에 따라 아크리딘오렌지(acridine orange)로 AVO(Acidic Vesicular Organelles)의 염색하였다.⁴⁹ 아크리딘 오렌지(Polysciences, Warrington, PA)을 최종 농도 0.5 ㎎/㎖로 15분 동안 첨가하였다. AVO 및 LC3 점(puncta)을 포함하는 모든 형광 이미지는 LSM510 레이저 주사 현미경(Carl Zeiss, Germany)를 이용한 공촛점 이미지이다. 결과는 이미지-J 소프트웨어를 이용하여 정량화 및 분석하였다. LC3-표지 점을 평균 세포질 형광 이상 >1.5 SD 밝은 점으로 명확히하였다. 최소 3회 독립 실험을 실시하여 최소 40(AVO) 또는 20(LC3 점) 절편을 분석하였다.₁₅

투과 전자 현미경

2% 파라포름알데하이드 및 2% 글루타르알데하이드를 포함하는 0.1 M 인산 완충액(pH 7.4)로 세포를 고정하고 1% OsO₄로 2시간 동안 후고정(postfix)하였다. 알코올 농도를 증가하여(30, 50, 70, 90 및 100%) 세포를 수화하고, LR 화이트 레진으로 침투시키고 LR 화이트 레진을 임베딩하였다. 굳힌 블럭을 60-㎚ 두께로 절단하고 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 및 리드 시트레이트(lead citrate)로 염색하였다. 투과 전자 현미경(Hitachi H-7600; Hitachi, Tokyo, Japan)로 시료를 관찰하였다. 이미지의 10 군데를 선별하고 자식작용 소낭을 앞서 기재한대로 정량화하였다.

콜로니-형성 분석 및 크리스탈 바이올렛 염색

MG-63 및 MG-63 내성(MG-63-CIS^R) 세포, pLenti/GFRα1-, pLenti/empty 벡터-, shGFRα1- 및 대조군 shRNA-트랜스펙션 MG-63 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 콜로니-형성 분석을 위해, 각 개별 클론의 동일한 수의 세포를 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후, 세포를 시스플라틴 및 시스플라틴+식균작용 억제제로 각각 반응시켰다. 동일한 조건 하에 3일마다 배지를 교체하였다. 10일 후, 콜로니를 가시화 하였다. 세포를 PBS로 세척하고 4% PFA로 5분 동안 고정하고 다시 PBS로 세척하였다. 고정된 세포를 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 염색한 다음 증류수로 세척하였다. 염색된 콜로니를 앱손 스캐너(GT9700F, Tokyo, Japan)으로 스캔하고 이미지-프로 플러스 5.1 소프트웨어(Media Cybernetics, Bethesda, MD)로 계수하였다. 실험은 3회 실시하였다.

포커스 형성 분석

NIH/3T3 세포(1×10⁶)를 60-㎜ 디쉬에 플레이팅하고 단일층을 형성하도록 밤새 배양하였다. 다음날, GFRα1을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션한 NIH/3T3 세포(1×10³)를 대조군 NIH/3T3 세포 위에 플레이팅하였다. 2일마다 배지를 교체하고 7-10일 후에 포커스를 정량하였다. 엠티(empty) 벡터로 트랜스펙션된 세포를 음성 대조군으로 하였다. 모든 세포는 크리스탈 바이올렛(0.5% in 20% 에탄올)로 포커스를 염색하였다.

면역블로팅

세포를 PBS로 세척하고 RIPA 완충액(Pierce, Rockford, IL)으로 용해하였다. 다이-결합 마이크로어세이(dye-binding microassay, Bio-Rad, Hercules, CA)로 단백질 함량을 결정하고, 열(lane)당 10-50 ㎍ 단백질을 4-12% SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하였다. 단백질을 하이본드 ECL 막(Hybond ECL membrane, Amersham Pharmacia Bioech, Piscataway, NJ)에 블로팅하였다. 단백질의 분자량 결정을 위해 두 종류의 단백질 래더(GenDEPOT, Barker, TX)를 사용하였다. 화학발광 검출 시스템(enhanced ehdmiluminescence detection system, iNtRON, Seoul, 대한민국)을 사용하여 블로팅된 단백질을 검출하였다. 결과는 이미지-J 소프트웨어로 정량 및 분석하였다.

면역세포화학법

골육종 세포(2×10⁴)를 60μ-디쉬^{35 ㎜,하이}(ibidi, GmbH, Am Klopferspitz, 독일)에 씨딩하였다. 다음날, 세포를 4% PFA(paraformaldehyde)로 20분 동안 고정하였다. PBS로 세척한 다음, 0.04% 트리톤 X-100으로 반응시켰다. PBS로 세척한 후, 0.03% BSA로 10분 동안 실온에서 반응시켰다. 다음, 항체를 4℃에서 밤새 반응시키고 PBS로 1시간 동안 세척하였다. Alexa Fluor 488- 또는 647- 컨쥬게이션된 2차 항체를 1시간 동안 4℃에서 반응시키고 PBS로 1시간 동안 세척하였다. PBS 세척한 다음, VECTASHIELD(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 마운팅하고 투명 매니큐어로 봉인하였다. 공촛점 현미경으로 이미지를 관찰하였다. 이미지-J를 이용하여 LC3 점 또는 APE를 정량 및 분석하였다. 이전 분석에서처럼, 바이오마커 발현 패턴 및 평가 점수에 따른 두가지 관찰 사이의 차이는 없었다.

면역조직화학법

각 기증자의 조직 파라핀 블럭을 1 ㎜의 조직생검 3 개로 절단하고 배열하였다. 절편(5 ㎛ 두께)을 탈파라핀화하고 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색하였다. 10 mM 구연산나트륨(pH 6.0)으로 항원 회수(antigen retrieval)한 후, 절편을 래빗 항-HMGB1 및 마우스 항-GFRα1 항체로 24시간 동안 반응시켰다. 절편을 비오틴이 부착된 2차 항체로 반응 시키고, VECTASTAIN ABC 시스템(Vector Laboratories)를 이용하여 항체 표지를 가시화하였다. 면역형광법을 위해, 환자 조직 및 마우스 종양을 Alexa Fluor 488- 및 647-컨쥬게이션된 2차 항체(Invitrogen)과 반응시키고 DAPI(Sigma-Aldrich)로 핵을 대비염색하였다. 공촛점 현미경으로 면역형광을 검출하였다. 환자 조직 연구에서, 시스플라틴을 포함하는 화학요법 후 4주 내지 10주 사이에 모든 전이암 환자의 조직은 GFRα1 또는 HMGB1의 강한 면역반응성을 나타내는 반면, (화학요법을 실시/비실시 후 4주 이내 또는 10주 이상 경과한) 다른 환자의 조직은 이의 면역반응성을 나타내지 않으므로, 면역반응성은 면역 표지의 염색 세기(0, non; 1, weak; 2, moderate; 3, strong) 및 양성 세포의 백분율(0, <5%; 1, 6-25%; 2, 26-50%; 3, 50-75%; 4, >76%)에 따라 점수화하여 결정하지 않았다. 따라서, 표시된 플러스(+)는 양성 면역반응성을 나타내며, 마이너스(-)는 음성 면역반응성을 나타낸다(검출 안됨). 앞선 분석에서, 바이오마커 발현 패턴 및 분석 절편에 평가된 점수에 따른 두가지 관찰 사이의 차이는 없었다. 결과는 이미지-J를 이용하여 정량 및 분석하였다.

누드 마우스 내 종양 형성

본 연구에 사용된 마우스는 6주령 자성 BALb/c 누드 마우스로 오리엔트 바이오(성남, 대한민국)로부터 구매하였다. 상기 마우스는 동물복지규정 및 표준 프로토콜에 따라 병원체-프리 기관에서 사육되었다. 본 연구의 모든 프로토콜은 전남대학교 실험동물위원회의 승인되었다. 대조군 shRNA, GFRα1 shRNA, plenti/GFRα1 발현 바이러스 벡터, 또는 plenti/control 바이러스 벡터를 트랜스펙션한 MG-63 세포를 수확하여 PBS에 현탁하였다. 다음, MG-63 세포(1×10⁶)을 BALb/c 누드 마우스의 오른쪽 측면에 피하투여하였다. 종양 크기는 3-4일 마다 칼리퍼(caliper)로 측정하였다. 피하 투여 31일 후, GFRα1 발현 종양 세포를 갖는 마우스에 일주일에 1회씩 PBS, CQ(60 ㎎/㎏), 시스플라틴(3 ㎎/㎏) 및 시스플라틴+CQ를 복막 투여하였다. 종양 크기는 4일 마다 칼리퍼로 측정하였다. 종양 무게는 칼리퍼로 ㎜의 종양 크기를 측정하고 장형 타원체[(L×W²)/2](L은 긴 측정치) 공식을 이용하여 산출하였다.

통계 분석

생존율 결과는 GraphPad Prism v5.04(GraphPad Software, La Jolla CA)의 Kaplan-Meier 및 로그-랭크 시험으로 분석하였다. 콜로니 형성율(Plating Efficiency; PE, %)=(계수된 콜로니의 수/플레이팅된 세포의 수)×100. 생존 분획(Survival Fraction; SF, %)=(시스플라틴-처리 클론의 PE/비처리 대조 클론의 PE). 모든 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 양방적 스튜던트's t-테스트를 이용한 통계학적 분석을 실시하였다. **p<0.05는 통계적 유의성을 의미한다.

실험 결과

시스플라틴에 의한 골육종 세포 내 GFRα1의 발현 유도

악성 인간 암에서 GFRα1의 이상(異狀) 발현이 관찰되었고, GFRα1이 종양 세포의 전이 및 침투를 조절하는 역할을 하는 것은, GFRα1이 암의 진행 및 전이에 관련된다는 것을 의미한다.^25-27 골육종의 항암제 내성에 GFRα1이 관여하는지 조사하기 위해, 잘 알려진 골육종 세포인 MG-63 및 U-2 OS 내 GFRα1의 발현에 대한 독소루비신, 시스플라틴 및 메토트렉사트의 영향을 조사하였다. 시스플라틴은 두 종류의 세포에서 GFRα1의 발현 정도를 유의하게 증가시킨 반면, 독소루비신 및 메토트렉사트는 GFRα1의 발현에 미미한 영향을 나타내었다(도 1a). GFRα1의 발현에 대한 시스플라틴의 영향은 농도 및 시간 의존적이었다.(도 1b 및 1c). 시스플라틴은 또한 두 종류의 세포에서 농도 및 시간 의존적으로 GFRα1 mRNA 발현를 증가시켰으며(도 1b 및 1c), 이는 시스플라틴에 의해 골육종 세포의 전사 단계 및 번역 단계에서 GFRα1 발현이 유도됨을 의미한다. 화학요법제의 효능에 대한 GFRα1 발현의 영향을 조사하기 위해, MG-63 및 U-2 OS 세포에서 GFRα1-특이적 siRNA로 GFRα1을 녹다운(knockdown)하고 3종류의 약물을 각각 처리하였다. 시스플라틴의 처리는 대조군과 비교하여 GFRα1-결핍 MG-63 및 U-2 OS 세포에서 세포 증식을 유의하게 감소시켰으나, 독소루비신 및 메토트렉사트는 GFRα1-결핍 세포의 세포 증식에 영향의 거의 나타내지 않았다. GDNF가 GFRα1의 주요 리간드인 것을 고려하여, GDNF의 발현에 대한 시스플라틴의 영향도 조사하였다. 골육종 세포에서 10 및 20 μM 시스플라틴 처리는 GDNF mRNA 발현을 증가시킴을 확인하였다. 그러나, GNDF는 MG-63 세포의 증식에 영향을 주지 않았다. 이러한 결과는 GFRα1가 시스플라틴-유도 아폽토시스를 억제하고 이러한 영향은 GFRα1 리간드 GDNF와 독립적임을 암시한다.

골육종 세포 내 GFRα1 발현에 의한 시스플라틴의 효능 감소

시스플라틴-유도 아폽토시스에서 GFRα1의 역할을 조사하기 위해, GFRα1-특이적 shRNA를 이용하여 안정적 GFRα1-결핍 MG-63 및 U-2 OS 세포주를 제조하였다. 골육종 세포주에서 GFRα1 발현의 녹다운은 GFRα1 단백질을 감소시켰다(도 2a). GFRα1의 siRNA-매개 녹다운과 같이, 대조군과 비교하여, GFRα1의 안정적 녹다운은 시스플라틴-처리 골육종 세포의 증식을 농도 의존적으로 유의하게 감소시켰다(도 2b). 또한, GFRα1의 녹다운은 세포 생존능을 유의하게 감소시켜 시스플라틴-유도 아폽토시스를 유의하게 증가시켰다. 이는 GFRα1-결핍 세포가 시스플라틴 처리에 더 민감하다는 것을 의미한다(도 2c). 절단형 PARP 및 절단형 카스페이즈-3의 아폽토시스 마커를 이용한 웨스턴 블럿 결과는 GFRα1-결핍 MG-63 세포에서 시스플라틴 처리 후에 절단형 PARP 및 절단형 카스페이즈-3이 유의하게 증가를 나타내었다(도 2d). 일관적으로, GFRα1-결핍 MG-63 세포에서 카스페이즈-3 활성이 유의하게 증가하였고, 이는 시스플라틴 처리된 대조군 세포와 비교하여 GFRα1-결핍 MG-63 세포에서 더 극적으로 증가하였다(도 2e). 판 카스페이즈 억제제인 ZVAD-FMK의 첨가는 이러한 영향을 반전시켰고 이는 시스플라틴이 존재할때 GFRα1의 결핍은 아폽토시스를 더욱 자극시키는 것을 의미한다. 추가적으로, 인간 GFRα1 발현 벡터를 트랜스펙션하여 안정적으로 인간 GFRα1을 과발현하는 MG-63 및 U-2 OS 세포주를 제조하였다(도 2f). GFRα1의 과발현은 농도 반응 실험의 대조군과 비교하여 시스플라틴-처리 골육종 세포주의 세포 증식을 증가시키지 않았다(도 2g). 그러나, FACS를 이용한 추가적인 분석은 GFRα1의 과발현이 시스플라틴-유도 아폽토시스를 유의하게 감소시킴을 나타내어 두종류 세포주에서 세포 생존능을 증가시킨 것과 일치하였다(도 2h). 종합적으로, 이러한 결과는 GFRα1이 시스플라틴-유도 아폽토시스에 대하여 골육종 세포의 민감성을 감소시킴을 나타낸다.

시스플라틴에 의한 GFR α1의 자식작용 개시

자식작용은 아폽토시스 및 세포 사멸을 유도하는 항암제 요법에 대한 내성을 촉진시킬 수 있는 기작이다. 그러므로, 골육종 세포의 시스플라틴-유도 아폽토시스에서 GFRα1 발현과 관련하여 자식작용이 어떠한 역할을 하는지 조사하였다. GFRα1 결핍이 자식작용에 대한 표지로 사용되는 자식포 내 존재하는 미소관-관련 단백질 LC3(Light Chain 3) 점 형성을 조절하는지 조사하였다.²⁸ mRFP-GFP-LC3 리포터(a RFP-GFP 탠덤 형광-태깅 LC3 벡터)를 이용한 LC3 점 형성의 형광 이미지 분석은 시스플라틴 처리가 대조군 shRNA로 트랜스펙션된 MG-63 세포 내 LC3 점 형성을 유의하게 증가시키나, GFRα1-결핍 세포 내 점 형성에는 변화가 없음을 나타낸다(도 3a). 특히, 시스플라틴 처리는 대조군 세포 내 RFP/GFP-양성 노란색 점(자식포) 및 RFP-양성 빨간색 점(자가용해소체, autolysosome)의 형성을 증가시켰고, RFP/GFP-양성 노란색 점의 수는 RFP-양성 빨간색 점의 수보다 컸다(도 3a). GFRα1-결핍 MG-63 세포의 아크리딘 오렌지 염색은 GFRα1의 녹다운이 시스플라틴 처리에 의해 AVO(Acidic Vesicular Organelle)-양성 세포의 축적을 증가시키지 않는 반면, 대조군 세포에의 시스플라틴 처리는 AVO-양성 세포를 유의하게 증가시킴을 나타내었다(도 3b). 이러한 결과는 GFRα1-결핍 U-2 OS 세포에서도 관찰되었다. 또한, TEM을 이용한 초미세구조 분석은 시스플라틴 처리한 후에 대조군 세포 내 세포당 자식 작용 액포의 수가 현저하게 증가되나, GFRα1 결핍은 동일한 처리 후에 세포 내 자식작용 액포에 영향을 주지 않음을 나타낸다(도 3c). 이는 시스플라틴이 골육종 내 자식작용을 유도하고 GFRα1가 이러한 자식작용 반응에 요구됨을 의미한다.

시스플라틴-유도 자식작용 내 GFRα1의 관련 및 시스플라틴 내성 발달에 대한 이의 영향을 조사하기 위해, 자식포 형성 동안 일어나는 LC3-Ⅰ의 LC3-Ⅱ로의 전환을 조사하였다.^9,11,12,29 웨스턴 블랏 분석은 대조군과 비교하여 GFRα1-과발현 MG-63 세포 내 LC3-Ⅱ 단백질 발현의 증가를 나타내었고(도 3d), 이는 GFRα1의 과발현이 자식작용을 개시함을 의미한다. 자식작용 초기단계의 억제제인 3-MA(3-methyladenine)의 첨가는 LC3-Ⅱ 발현을 감소시킨 반면, 자식작용 후기단계 억제제인 Baf(bafilomycin 1)은 LC3-Ⅱ 발현을 증가시켰다(도 3d). 이러한 결과와 일관되게, 시스플라틴 처리 후의 LC3 점 형성은 대조군과 비교하여 GFRα1-과발현 MG-63 및 U-2 OS 세포에서 유의하게 증가하였다(도 3e). 시스플라틴-처리 대조군 세포에서 RFP/GFP-양성 노란색 점의 수는 및 RFP-양성 빨간색 점의 수보다 컸으나, GFRα1-과발현 세포에서는 RFP-양성 빨간색 점의 수가 RFP/GFP-양성 노란색 점의 수보다 훨씬 크므로(도 3e), GFRα1이 자식작용을 유의하게 증가시킴을 의미한다. 이는 시스플라틴을 처리하지 않은 기저 LC3 점 형성이 대조군 세포와 비교하여 GFRα1-과발현 세포에서 높다는 것에 주목해야한다(도 3e). 3-MA의 처리는 대조군 세포 및 GFRα1-과발현 세포에서 점 형성을 억제하였다(도 3f). GDNF의 추가는 대조군 세포 및 GFRα1-과발현 세포에 유의한 영향을 주지 않았다. 이러한 결과와 유사하게, 시스플라틴을 처리 또는 무처리 골육종 세포 내 GFRα1-과발현은 대조군과 비교하여 AVO-양성 세포를 증가시켰다(도 3g). GFRα1-과발현 세포는 대조군 세포와 비교하여 시스플라틴을 처리 또는 무처리 세포 당 자식작용 액포의 수가 증가하였다(도 3h). 공지된 연구에서 췌장암 세포에서 APE1(apurine and apyrimidine endonuclese 1)이 GFRα1 발현을 상향조절하여 GDNF 반응성을 증가시킨다고 보고하여₂₇, APE1이 골육종 세포의 시스플라틴 처리 후 GFRα1-매개 자식작용에 관련이 있는지 조사하였다. 또한, APE1의 녹다운이 시스플라틴 처리 후에 LC3 점 형성을 감소시키지 않는 것은 APE1이 이러한 기작에 관련이 없음을 의미한다. GDNF/GFRα1 복합체의 다운스트림(downstream) 기질인 RET가 골육종 세포의 시스플라틴 처리 후 GFRα1-매개 자식작용에 관련이 있는지 조사하였고, MG-63 골육종 세포에서 RET 발현이 검출되지 않음을 웨스턴 블럿으로 확인하였다.

GFRα1 과발현 세포의 세포 증식은 대조군 세포와 비교하여 시스플라틴의 처리/무처리에서 유의하게 높았다. 이는 GFRα1-과발현 세포에서 관찰된 자식작용의 증가 및 3-MA의 첨가에 의한 영향의 억제와 관련이 있다(도 3i). GFRα1-과발현 세포에서 관찰된 세포 증식의 증가는 siRNA에 의한 자가포식 단백질인 Beclin1 또는 HMGB1의 사일런싱(silencing)에 의해 억제되는 것은 시스플라틴 처리 후 GFRα1-매개 자식작용은 세포 증식을 증가시키는데 기여한다는 것을 뒷받침한다. 시스플라틴-매개 자식작용 및 세포 증식에 있어서 GFRα1의 역할을 더 입증하기 위해, 대조군 세포, GFRα1-결핍 세포주 또는 GFRα1-과발현 세포주를 시스플라틴 처리 하에 배양하고 콜로니를 계수하였다. GFRα1 과발현 세포주는 반응 7일 동안 콜로니의 수가 증가하였고, 높은 플레이팅 효율을 나타낸 반면, 대조군 및 GFRα1 결핍 세포주는 콜로니가 나타나지 않았다(도 3k). 시스플라틴에 대한 높은 내성을 나타내는 GFRα1-과발현 MG-63 클론 #4 및 3-MA, Baf 또는 클로로퀴논(chloroquine; CQ)의 처리는 콜로니의 수 및 GFRα1 매개에 의한 생존능 형성을 효과적으로 감소시켜 자식작용의 억제를 나타내었다(도 3i). MG-63 세포에 시스플라틴을 10일 동안 처리하여 3 개의 시스플라틴-내성 MG 63 클론을 제조하였다. 모든 시스플라틴-내성 세포주는 대조군 MG-63 세포와 비교하여 많은 수의 콜로니를 나타내었다. 또한, GFRα1 mRNA 발현은 대조군과 비교하여 3 세포주에서 모두 유의하게 증가하였다.

전사요소 NFκB p50은 GFRα1 유전자의 프로모터에 결합할 수 있고, 그렇게 함으로써 GFRα1 mRNA 발현을 상향조절한다.²⁷ 이 결과와 상응되게, NFκB p50 mRNA 발현도 대조군과 비교하여 시스플라틴-내성 세포주에서 유의하게 증가하였다. siRNA를 이용한 NFκB p50 녹다운은 MG-63 세포에서 GFRα1 mRNA 발현을 감소시킨 결과는 GFRα1의 발현을 자극하기 위한 시스플라틴의 NFκB p50 활성화 가능성을 암시한다. NIH3T3 세포를 이용한 연구는 GFRα1이 형질전환능을 갖는 것을 나타낸다. NIH3T3 세포 내 GFRα1 과발현은 포커스 형성을 나타냄으로써 세포 형질전환을 유도하였다. 대조군 벡터로 트랜스펙션된 NIH3T3는 형질전환이 유도되지 않았다. 종합해서, 이러한 발견은 골육종 세포 생존 및 항암제내성을 촉진하는 시스플라틴에 의한 자식작용의 조절에 있어서 GFRα1의 중요한 역할을 뒷받침한다.

Src / AMPK 신호전달을 통한 GFR α1의 자식작용 조절

Src는 GFRα1/RET 신호전달에 의해 활성화된다.²⁰ RET-결핍 세포에서 GFRα1에 의해 Src가 활성화되는 것은 RET-독립적 방법으로 GFRα1가 Src 신호전달을 활성화 시킬 수 있음을 의미한다.^20,30 다양한 암에서 이의 종양형성 기능 뿐 아니라, Src가 정확한 기능은 규명되지 않았지만 자식작용, 특히 화학적 내성을 획득하는데 관련이 있다.^31,32 Src 매개 AMPK 활성화는 자식작용의 조절과 관련이 있다.^33,34 AMPK-매개 자식작용은 시스플라틴-유도 화학적 내성과 관련이 있다.³⁵

시스플라틴 처리 후, MG-63 세포 내 시스플라틴-유도 GFRα1 발현은 인산화된 Src 및 인산화된 AMPK을 증가시키고, AMPK가 활성화되면, AMPK 신호전달과 관련된 다운스트림 키나아제인 인산화된 mTOR 및 인산화된 S6K를 감소시켰다(도 4a). GFRα1에 의한 Src/AMPK 신호전달의 상향조절은 Beclin 1, HMGB1 및 LC3-Ⅱ의 발현을 증가시켰다(도 4a). 대조적으로, GFRα1-결핍 세포에서는 대조군과 비교하여, 인산화된 Src 및 인산화된 AMPK가 감소되고 인산화된 mTOR 및 인산화된 S6K가 증가하였다. GFRα1-결핍 세포는 대조군과 비교하여 자식작용-관련 단백질의 발현이 감소하였다(도 4b). siRNA 또는 선별억제제 PP1에 의한 Src 인산화의 억제는 AMPK 인산화 및 LC3-Ⅱ 발현을 감소시켰다(도 4c 및 4d). 선별억제제 컴파운드 C에 의한 AMPK 인산화의 억제도 Src 인산화에 영향 없이 LC3-Ⅱ 발현을 감소시켜(도 4e), AMPK가 Src의 다운스트림 키나아제임을 확인하였다. MG-63 세포의 시스플라틴 처리 후 선별억제제에 의한 Src 또는 AMPK 활성화의 억제는 대조군과 비교하여 세포 생존능을 감소시킨다(도 4f 및 4g). 이러한 결과는 골육종의 시스플라틴 처리 후, GFRα1의 유도가 Src 활성화를 개시하여 AMPK 신호전달을 활성화키시고 자식작용의 개시를 유도한다는 것을 의미한다.

GFRα1-유도 자식작용의 인비보 종양 성장 촉진

마우스 이종이식 모델을 이용하여 인비보 종양 형성에 대한 GFRα1의 영향을 조사하였다. 우선, MG-63 세포 또는 GFRα1-과발현 MG-63 세포(MG-63/GFRα1)를 누드 마오스의 오른쪽 측면에 피하 이식하였다. 투여 5일 후, MG-63/GFRα1 이식 마우스의 종양이 발생하였고, 31일 후에는 -90 ㎣ 사이즈가 된 반면, MG-63 이식 마우스는 투여 17일 후에 종양이 발생하여 종양 크기가 -10 ㎣로 작았다(도 5a). 다음, 종양 형성에 대한 GFRα1 결핍의 영향을 조사하기 위해 GFRα1-결핍 MG-63(MG-63/GFRα1 shRNA)를 이식하였다. MG-63를 이식한 마우스는 종양이 형성되었지만, MG-63/GFRα1 shRNA을 이식한 마우스는 투여 31일 후에도 종양이 형성되지 않았다(도 5b).

다음, GFRα1-매개 자식작용에 의해 MG-63/GFRα1를 투여한 마우스의 종양 형성을 개선하는지 조사하기 위해, MG-63/GFRα1 투여 세포의 종양에 PBS(대조군), CQ, 시스플라틴 또는 시스플라틴+CQ를 처리하였다. PBS-처리 종양과 비교하여, CQ 또는 시스플라틴을 처리한 종양은 크기가 감소하였고, 시스플라틴 및 CQ를 처리한 종양은 크기가 더 감소하였다(도 5c). 이러한 결과는 시스플라틴 및 CQ의 처리는 종양의 진행을 감소시키는 반면, 시스플라틴 또는 CQ의 단독처리는 종양이 생존하도록 한다(도 5c). MG-63/GFRα1 이식 마우스에서 발생한 시스플라틴-처리 종양 세포는 자식작용의 증가를 나타내는 세포질내 위치한 HMGB1 발현의 유의한 증가를 나타내었다. 시스플라틴과 CQ의 동시처리는 세포질내 위치한 HMGB1을 감소시켰다(도 5d). 시스플라틴을 처리하면서 CQ로 자식작용을 억제한 경우, CQ- 또는 시스플라틴-처리 GFRα1-발현 종양과 비교하여, GFRα1-발현 종양 내 시스플라틴-유도 아폽토시스가 유의하게 증가하였다(도 5e). 더욱이, CQ 및 시스플라틴을 처리한 MG-63/GFRα1 이식 마우스의 생존율은 시스플라틴만 처리한 마우스와 비교하여 유의하게 증가하였고(도 5f), 이는 자식작용의 억제가 시스플라틴-유도 아폽토시스의 GFRα1-매개 보호를 뒤바꾸는 것을 나타낸다. 종합적으로, 이러한 결과는 GFRα1는 인비보 시스플라틴에 대한 반응으로 자식작용을 가능하게 하고 이러한 자식작용 반응은 골육종 종양의 생존을 촉진하여 GFRα1-매개 자식작용이 골육종의 시스플라틴 내성 발달에 중요하다는 것을 나타낸다.

시스플라틴-내성 골육종 환자의 임상병리적 GFRα1-매개 자식작용의 기여

완전한 수술적 절제와 함께 전보조 및/또는 보조치료를 받은 27명 골육종 환자로부터 구한 조직 시료를 시험하여 인비보 GFRα1-매개 자식작용을 조사하였다. 사례 중, 9명 환자 조직 시료는 DAPI 핵 염색하여 골육족의 생존을 나타내었다. GFRα1 및 HMGB1 면역염색을 위해, 항암제내성을 나타내는 9개 시료로부터 골육종 조직을 시스플라틴 처리 전/후에 가공하고 분석하였다. 4개 시료는 GFRα1 양성 발현을 나타냈고, 4개 GFRα1-양성 시료만 HMGB1 발현 양성을 나타내었다(도 5g, 5h 및 표 1). 시스플라틴을 포함하는 화학요법을 4 내지 15주 동안 받은 환자로부터 4개 조직 시료를 수득하였다. 또한, 상기 4명의 골육종 환자로부터 수득한 종양은 폐까지 전이되었다(표 1). 4주 이내로 처리한 환자의 조직은 GFRα1 및 HMGB1을 발현하지 않았다(표 1). 종합적으로, 이러한 연구는 시스플라틴-매개 항암제내성 및 전이에 GFRα1가 중요한 역할을 함을 제시한다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Development of Dignosting Marker for Cisplatin-Resistant comprising GFRA1 as Active Ingredient and Method for Molecular Screening Cisplatin-Resistant Drug <130> PN130555 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> qGFRa1 sense primer <400> 1 tccaatgtgt cgggcaatac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> qGFRa1 antisense primer <400> 2 ggaggagcag ccattgattt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> GFRa1 sense primer <400> 3 tgtcagcagc tgtctaaagg 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> GFRa1 antisense primer <400> 4 cttctgtgcc tgtaaatttg ca 22 <210> 5 <211> 1398 <212> RNA <213> Homo sapiens GDNF family receptor alpha 1 (GFRA1), transcript variant 1 mRNA <400> 5 atgttcctgg cgaccctgta cttcgcgctg ccgctcttgg acttgctcct gtcggccgaa 60 gtgagcggcg gagaccgcct ggattgcgtg aaagccagtg atcagtgcct gaaggagcag 120 agctgcagca ccaagtaccg cacgctaagg cagtgcgtgg cgggcaagga gaccaacttc 180 agcctggcat ccggcctgga ggccaaggat gagtgccgca gcgccatgga ggccctgaag 240 cagaagtcgc tctacaactg ccgctgcaag cggggtatga agaaggagaa gaactgcctg 300 cgcatttact ggagcatgta ccagagcctg cagggaaatg atctgctgga ggattcccca 360 tatgaaccag ttaacagcag attgtcagat atattccggg tggtcccatt catatcagat 420 gtttttcagc aagtggagca cattcccaaa gggaacaact gcctggatgc agcgaaggcc 480 tgcaacctcg acgacatttg caagaagtac aggtcggcgt acatcacccc gtgcaccacc 540 agcgtgtcca acgatgtctg caaccgccgc aagtgccaca aggccctccg gcagttcttt 600 gacaaggtcc cggccaagca cagctacgga atgctcttct gctcctgccg ggacatcgcc 660 tgcacagagc ggaggcgaca gaccatcgtg cctgtgtgct cctatgaaga gagggagaag 720 cccaactgtt tgaatttgca ggactcctgc aagacgaatt acatctgcag atctcgcctt 780 gcggattttt ttaccaactg ccagccagag tcaaggtctg tcagcagctg tctaaaggaa 840 aactacgctg actgcctcct cgcctactcg gggcttattg gcacagtcat gacccccaac 900 tacatagact ccagtagcct cagtgtggcc ccatggtgtg actgcagcaa cagtgggaac 960 gacctagaag agtgcttgaa atttttgaat ttcttcaagg acaatacatg tcttaaaaat 1020 gcaattcaag cctttggcaa tggctccgat gtgaccgtgt ggcagccagc cttcccagta 1080 cagaccacca ctgccactac caccactgcc ctccgggtta agaacaagcc cctggggcca 1140 gcagggtctg agaatgaaat tcccactcat gttttgccac cgtgtgcaaa tttacaggca 1200 cagaagctga aatccaatgt gtcgggcaat acacacctct gtatttccaa tggtaattat 1260 gaaaaagaag gtctcggtgc ttccagccac ataaccacaa aatcaatggc tgctcctcca 1320 agctgtggtc tgagcccact gctggtcctg gtggtaaccg ctctgtccac cctattatct 1380 ttaacagaaa catcatag 1398

Claims (11)

1. 골육종 환자로부터 분리된 생물학적 시료의 GFRα1(Glial cell line-derived neurotrophic factor receptor α1) 유전자 또는 단백질의 발현 여부를 판단하는 단계를 포함하는 시스플라틴(cisplatin)에 대한 감수성(susceptibility) 결정 방법으로, 상기 GFRα1 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 정상 세포보다 하향-조절(down-regulated)되는 경우, 시스플라틴 감수성이 있는 것으로 판단하고, 상기 GFRα1 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 정상 세포보다 상향-조절(up-regulated)되는 경우, 시스플라틴 내성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 시스플라틴에 대한 감수성 결정 방법.
   
5. GFRα1를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드, 상기 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드, 상기 올리고뉴클레오타이드의 단편 또는 GFRα1에 특이적인 항체를 포함하는 골육종 환자의 시스플라틴에 대한 감수성 예측용 키트.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 GFRα1를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드는 진뱅크 접근번호 NM_5264로 표시되는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 골육종 환자의 시스플라틴에 대한 감수성 예측용 키트.
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 키트는 혼성화 키트, 유전자 증폭 키트 또는 면역분석 키트인 것을 특징으로 하는 골육종 환자의 시스플라틴에 대한 감수성 예측용 키트.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 5 항에 있어서, 상기 GFRα1를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드는 시스플라틴 내성 환자로부터 고발현되는 것을 특징으로 하는 골육종 환자의 시스플라틴에 대한 감수성 예측용 키트.
    
11. 다음의 단계를 포함하는 골육종 세포의 시스플라틴에 대한 내성을 억제하는 시스플라틴 보조제의 스크리닝 방법:
    (a) GFRα1을 포함하는 분리된 골육종 세포에 시스플라틴 및 후보물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 골육종 세포의 GFRα1 발현 정도를 측정하는 단계, 상기 GFRα1 발현이 대조군과 비교하여 하향-조절(down-regulated)되는 경우 시스플라틴 보조제로 판정된다.

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