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KR101859421B1 - 탈모방지 또는 발모촉진용 주사용 조성물 - Google Patents

탈모방지 또는 발모촉진용 주사용 조성물 Download PDF

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KR101859421B1
KR101859421B1 KR1020170142726A KR20170142726A KR101859421B1 KR 101859421 B1 KR101859421 B1 KR 101859421B1 KR 1020170142726 A KR1020170142726 A KR 1020170142726A KR 20170142726 A KR20170142726 A KR 20170142726A KR 101859421 B1 KR101859421 B1 KR 101859421B1
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KR
South Korea
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keratin
hair
cells
pharmaceutical composition
hair growth
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KR1020170142726A
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English (en)
Inventor
황유식
권일근
김소연
반세영
Original Assignee
주식회사 케라메딕스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 케라틴을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 주사용 약학 조성물에 대한 것으로, 상기 조성물은 모낭 발생 및 발모 성장 촉진 효과가 우수하여, 탈모의 예방 및 치료제 또는 발모 촉진제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

탈모방지 또는 발모촉진용 주사용 조성물{Injectable composition for prevention of depilation or improvement of hair growth}
본 발명은 케라틴을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 주사용 조성물에 대한 것이다.
탈모란 정상적으로 모발이 있어야 할 곳에 모발이 없는 상태를 말하며 유전적 요인이 가장 주요한 원인으로 알려져 있다. 최근 사회적 스트레스의 증가와 더불어 환경오염 및 인스턴트 식품 등 서구화된 식습관, 잦은 파마와 염색, 잘못된 두피관리들로 인하여 탈모 인구가 점차 증가하고 있는 추세이다. 그러나 아직까지 탈모에 대한 명확한 원인은 규명되고 있지 않았고, 최근 들어 오히려 탈모증으로 고민하는 사람이 점점 늘고 있으며 그 연령층도 낮아지고 있는 실정이다.
탈모증의 치료법에 관해서도 아직까지 뚜렷한 효과를 지닌 것은 없으며, 동의보감에서는 신응양진단 등 탈모에 관계되는 몇몇 복용하는 처방들이 있고, 호마유(참깨) 등을 탈모 부위에 마사지한다든지, 특정 한약처방을 주침해서 바르는 방법과 특정 혈위를 자극하는 방법 등이 있지만 효과에 있어서는 개인적 차이가 많다고 알려져 있다. 또한, 일반적으로 적용될 수 있는 신약 소재는 아직까지 보고되지 않고 있다.
종래의 탈모증 치료방법으로는, 호르몬설과 관련하여 여성 호르몬을 주재료한 제제가 있으나 피부 염증 발생, 호르몬 투여에 의한 부작용 발생 등의 보고가 있어 현재는 사용이 중단되고 있다. 최근 사용되고 있는 대표적인 발모제로는, 처음에는 혈액 순환 촉진을 위한 용도로 개발되어 사용되다가 이를 사용하는 환자들 사이에서 부작용으로 발모 효과를 나타내는 것으로 알려져, 이후, 발모용 원료로 미국식품의약품안전청(FDA)에서 승인받아 발모 치료제로 사용되고 있는 미국특허 제3,382,247호의 미녹시딜(6-Amino-1,2-dihydro-1-hydroxy-2-imino-4-phenoxypyrimidine)및 미국특허 제 5,215,894 호에서 언급된 머크사의 피나스테라이드(finasteride)가 있다.
그러나, 미녹시딜의 경우 끈적이는 사용감과 피부에 자극을 유발하는 부작용이 보고된 바 있으며, 피나스테라이드의 경우 현재 경구투여용 제제로 사용되고 있으나, 이의 섭취에 따라 성기능 장애 등의 부작용이 보고된 일도 있을 뿐 아니라, 탈모에 대해서도 꾸준한 복용이 이루어져야만 효과가 있다는 부작용이 있다.
이로써, 기존 발모제를 대체할 수 있으며, 탈모방지 및 발모 촉진 효과가 우수한 새로운 치료제 개발이 필요하다.
미국특허 제3,382,247호 미국특허 제5,215,894호
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 기존의 발모제를 대체할 수 있는 새로운 치료제에 관하여 연구를 계속하던 중, 케라틴이 발모를 촉진하고, 탈모를 방지할 수 있음을 확인하였고, 나아가 케라틴을 피부 조직에 주사할 경우 피부에 도포할 때보다 발모촉진 또는 탈모방지 효과가 뛰어나는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 케라틴을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 주사용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따르면 케라틴을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 주사용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 케라틴은 가수분해된 케라틴 또는 수용성 고분자에 결합된 케라틴일 수 있다.
상기 가수분해된 케라틴은 분자량이 500 내지 10,000달톤(Dalton)일 수 있다.
상기 수용성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 알긴산(alginic acid), 펙틴(pectin), 카라기난(carrageenan), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 키토산, 폴리리신(polylysine), 콜라겐, 젤라틴, 카르복시메틸 키틴, 피브린(fibrin), 덱스트란(dextran), 아가로스(agarose), 플루란(pullulan), 폴리아크릴아마이드(PAAm), 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드-co-아크릴산)(P(NIPAAm-co-AAc)), 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드-co-에틸메타크릴레이트)P(NIPAAm-co-EMA), 폴리비닐아세테이트/폴리비닐알콜(PVAc/PVA), 폴리(N-비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리(메틸메타크릴레이트-co-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(P(MMA-co-HEMA)), 폴리(폴리에틸렌글리콜-co-펩타이드(P(PEG-copeptide)), 알지네이트-g-(폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드)(alginate-g-(PEOPPO-PEO)), 폴리(폴리라틱산-co-글리콜릭산)-co-세린)(P(PLGA-co-serine)), 콜라겐-아크릴레이트(collagenacrylate), 알지네이트-아크릴레이트(alginate-acrylate), 폴리(하이드록시프로필 메타크릴아마이드-g-펩타이드)(P(HPMA-g-peptide)), 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트/메트리겔)(P(HEMA/Matrigel)), 히알루론산-g-N-이소프로필아크릴아마이드(HA-g-NIPAAm), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체(PEO-PPO, Pluronic series), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체(PEO-PLA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체(PEO-PLGA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체(PEO-PCL), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류 (polyoxyethylene alkyl ethers, Brij Series), 폴리옥시에틸렌 케스터 오일 유도체류(polyoxyethylene castor oil derivatives, Cremophores), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터류(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, Tween Series), 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류(polyoxyethylene stearates)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 케라틴은 모발재생을 촉진할 수 있다.
상기 약학 조성물은 베타 카테닌(beta catenin), Sox-9, Sox-2, Alkalkine phosphatase, CD133, FGF7, FGF10, BMP6, P-cadherin, E-cadherin, MSX2, FOXN1 및 CD10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 발현양을 증가시킬 수 있다.
상기 약학 조성물은 진피층 또는 피하조직에 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 경피흡수 촉진제(penetration enhancer)를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 경피흡수 촉진제는 술폭시드(sulphoxide), 아존(azone), 피롤리돈(pyrrolidone), 지방산, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 탄소수 6 이상의 고급 지방 알코올(fatty alcohol), 글리콜(glycol), 요소(urea), 테르펜(terpene), 테르페노이드(terpenoid), 및 인지질(phospholipid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 가수분해된 케라틴은 ⅰ) 가수분해효소와 케라틴을 반응시키는 단계; 및 ⅱ) 상기 가수분해효소를 제거하는 단계를 포함하는, 가수분해된 케라틴의 제조 방법을 통해 제조될 수 있다.
상기 가수분해효소는 프로테이나제-K일 수 있다.
상기 가수분해효소는 비드에 고정될 수 있다.
상기 가수분해된 케라틴의 제조 방법은 상기 제ⅱ) 단계 이후에, iii) 가수분해효소의 활성을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 케라틴을 포함하는 주사용 약학적 조성물은 모발의 성장과 모낭의 형성을 촉진한다.
또한, 본 발명에 따른 케라틴을 포함하는 주사용 약학적 조성물은 피부 조직에 주사할 경우 피부에 도포할 때보다 발모촉진 또는 탈모방지 효과가 뛰어나다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 탈모방지 또는 발모촉진용 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 페길화된 케라틴을 NMR 분석한 데이터이다.
도 2는 털을 제거한 쥐에 실시예 1 내지 6을 주사 한 다음, 2주 후의 발모효과를 나타낸 도이다.
도 3은 털을 제거한 쥐에 실시예 1 내지 6을 주사 한 다음, 2주 후 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 모낭 형성의 정도를 나타낸 사진이다.
도 4는 털을 제거한 쥐에 실시예 1 내지 6을 주사 한 다음, 2주 후 모발 성장의 각 단계에서의 모낭 형성의 수를 나타낸 그래프이다.
도 5는 털을 제거한 쥐에 실시예 1 내지 6을 주사 한 다음, 2주 후 형성된 모낭의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 6은 천연 케라틴과 분자량이 상이한 가수분해된 케라틴이 제조될 수 있음을 확인한 SDS-PAGE 분석 결과 사진이다.
도 7은 케라틴을 인간 모근 세포에 처리시, 세포의 증식이 억제됨을 확인한 도이다.
도 8은 케라틴을 인간 모근 세포에 처리시, 세포와의 상호작용을 분석하여 세포표면에 케라틴이 접착되는 것을 확인하였으며 이로써 케라틴에 의해 세포응집체 형성이 유도됨을 확인한 사진이다.
도 9는 케라틴을 인간 모근 세포에 처리시, 세포의 증식과 연관된 mRNA 발현은 억제하고 세포의 이동, 세포응집체의 유도 및 세포외기질의 합성과 연관된 mRNA 발현은 증가함을 나타낸 도이다.
도 10은 케라틴을 인간 모근 세포에 처리시, 발모를 유도하는 인자로 알려진 FGF7, FGF10 및 BMP6의 분자발현이 증가됨을 확인한 도이다.
도 11은 케라틴을 인간 외모근초 세포에 처리시, 세포의 이동 및 Matix cell로의 분화와 관련된 인자인 베타 카테닌(beta catenin) 및 P-cadherin의 발현이 증가되고 분화시 발현이 줄어드는 분자인 CD34의 발현이 감소됨을 확인한 사진이다.
도 12는 케라틴을 인간 외모근초 세포에 처리시, Matix cell로의 분화와 관련된 인자인 MSX2, FOXN1 및 CD10의 유전자 발현이 증가되고 분화시 발현이 줄어드는 분자인 KRT5 및 ITGA6의 유전자 발현이 감소됨을 확인한 그래프이다.
도 13은 가수분해된 케라틴을 외모근초 세포에 처리시 세포의 이동 및 클론의 활성과 관련된 인자인 베타 카테닌(beta catenin) 분자 및 줄기세포성(stemness)에 관여하는 Sox-9 분자의 발현이 증가함을 확인한 도이다.
도 14은 가수분해된 케라틴을 외모근초 세포에 처리시 줄기세포성에 관여하는 Sox-9 유전자 및 베타 카테닌 유전자의 발현이 증가함을 나타낸 그래프이다.
도 15는 가수분해된 케라틴을 외모근초 세포에 처리시 베타 카테닌 분자가 4배 이상 발현됨을 확인한 도이다.
도 16은 가수분해된 케라틴을 인간 모유두 세포에 처리시 모발재생과 줄기세포성에 연관된 세포응집체(cell aggregate)의 형성이 5배 이상 증가됨을 확인한 도이다.
도 17은 가수분해된 케라틴을 인간 모우듀 세포에 처리시 알칼리성 인산세포가 발현하는 가수분해효소(alkaline phosphatase)의 활성이 증가됨을 확인한 사진이다.
도 18는 가수분해된 케라틴을 인간 모우듀 세포에 처리시 모발재생과 줄기세포성 인자인 베타 카테닌, Sox-2, 가수분해효소(alkaline phosphatase, ALPase), CD133, FGF-7 및 FGF-10 분자의 발현이 증가함을 확인한 사진이다.
본 발명은 케라틴(keratin)을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 주사용 약학 조성물을 제공한다.
상기 케라틴은 머리털·양털·깃털·뿔·손톱·말굽 등을 구성하는 진성(眞性) 케라틴일 수 있으며, 피부·신경조직 등에 존재하는 케라틴일 수 있다.
또한, 상기 케라틴은 글루탐산·알기닌·시스틴 등의 아미노산을 포함하며, 특히 높은 함량의 시스틴을 함유할 수 있다.
상기 케라틴은 상업적으로 이용가능한 임의의 케라틴일 수 있고, 물이나 수용성 용매에 용해될 수 있도록 가공한 형태일 수 있으며, 바람직하게는 사람 머리카락 유래의 케라틴일 수 있으며, 분자량이 40,000 내지 70,000 달톤(Dalton)일 수 있다.
상기 케라틴은 가수분해된 케라틴 또는 수용성 고분자에 결합된 케라틴일 수 있다.
상기 가수분해된 케라틴은 케라틴의 성질을 유지하면서 불용성의 천연 케라틴이 분해되어 수용성을 나타내는 단백질로서, 케라틴 유래 펩티드와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 가수분해된 케라틴은 케라틴이 산, 알칼리, 산소 또는 가수분해효소에 의해 가수분해되어 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 천연 케라틴으로부터 분자량이 500 내지 10,000 달톤인 가수분해된 케라틴을 제조하는 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다.
상기 가수분해된 케라틴은 ⅰ) 가수분해효소와 케라틴을 반응시키는 단계; 및 ⅱ) 상기 가수분해효소를 제거하는 단계를 포함하는, 가수분해된 케라틴의 제조 방법을 통해 제조될 수 있다.
상기 제ⅰ) 단계는 가수분해효소를 이용하여 케라틴으로부터 가수분해된 케라틴을 제조하는 단계이다.
여기서, 가수분해효소는 효소를 계통적으로 분류하였을 때 가수분해반응을 촉매하는 효소로 분류된 한 집단으로서, 작용 대상에 따라 9개 군으로 분류되어 있다.
상기 가수분해효소는 케라틴이 단백질인 특성상, 천연 케라틴을 가수분해할 수 있는 효소로, 바람직하게는 펩티드결합에 작용하는 효소이다. 구체적으로, 상기 펩티드결합에 작용하는 효소는 로이실아미노펩티다아제, 카복시텝티다아제, 펩신, 트립신 및 키모트립신을 포함하는 단백질 분해효소 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 더욱 바람직하게는 프로테이나제-K(proteinase-K)이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 가수분해된 케라틴의 제조 방법에 있어서, 상기 제ⅰ) 단계가 결여되거나, 제대로 수행되지 않을 경우 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 나타내는 가수분해된 케라틴의 수득량이 미비할 수 있다.
다음으로, 상기 제ⅱ) 단계는 가수분해효소와 가수분해된 케라틴 혼합물에서 가수분해된 케라틴만을 수득하는 단계이다. 상기 가수분해효소는 비드에 고정될 수 있다. 상기 비드의 자성의 차이를 이용하거나, 중량의 차이를 이용하거나 또는 흡착 여부의 차이 등을 이용하여 비드의 물리적/화학적 성질에 따라 가수분해된 케라틴으로부터 가수분해효소를 분리할 수 있다.
상기 비드는 폴리-L-락트산(PLLA), 폴리-락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리글리코산(PGA), 폴리우레탄(PU), 폴리메틸메타크릴(PMMA), 폴리에틸렌(PE) 및 자철(Ferromagnetite)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 비드는 아가로즈비드일 수 있다.
상기 가수분해된 케라틴의 제조 방법에 있어서, 상기 제ⅱ) 단계가 결여되거나, 제대로 수행되지 않을 경우 발모촉진 또는 탈모방지 효과를 나타내는 가수분해된 케라틴만의 순도가 낮아질 수 있다.
또한, 상기 가수분해된 케라틴의 제조 방법은 상기 가수분해된 케라틴의 제조 방법은 상기 제ⅱ) 단계 이후에, iii) 가수분해효소의 활성을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제iii) 단계는 가수분해효소의 활성을 제거하여 케라틴의 가수분해 반응을 멈추기 위한 것으로, 가수분해효소가 케라틴과 반응하지 않도록 높은 온도에서 수시간 방치할 수 있다.
상기 가수분해된 케라틴의 제조 방법에 있어서, 상기 제iii) 단계를 포함할 경우 가수분해된 케라틴의 순도를 높일 수 있으며, 균일한 분자량을 갖는 가수분해된 케라틴을 얻을 수 있다.
일 예로써, 상기 가수분해된 케라틴은 사람 머리카락을 클로로포름과 메탄올을 2:1의 비율로 섞은 혼합액에 넣어 지질을 제거하고, 2 % 과산화아세트산 용액에서 12시간 교반한 후, 5 % 2-머캅토에탄올, 5 M 우레아, 2.6 M 티오우레아 및 25 mM Tris-HCl(pH 8.5)에 넣고, 50 에서 72시간동안 반응시켜 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 수용성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 알긴산(alginic acid), 펙틴(pectin), 카라기난(carrageenan), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 키토산, 폴리리신(polylysine), 콜라겐, 젤라틴, 카르복시메틸 키틴, 피브린(fibrin), 덱스트란(dextran), 아가로스(agarose), 플루란(pullulan), 폴리아크릴아마이드(PAAm), 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드-co-아크릴산)(P(NIPAAm-co-AAc)), 폴리(N-이소프로필 아크릴아마이드-co-에틸메타크릴레이트)P(NIPAAm-co-EMA), 폴리비닐아세테이트/폴리비닐알콜(PVAc/PVA), 폴리(N-비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리(메틸메타크릴레이트-co-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(P(MMA-co-HEMA)), 폴리(폴리에틸렌글리콜-co-펩타이드(P(PEG-copeptide)), 알지네이트-g-(폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드)(alginate-g-(PEOPPO-PEO)), 폴리(폴리라틱산-co-글리콜릭산)-co-세린)(P(PLGA-co-serine)), 콜라겐-아크릴레이트(collagenacrylate), 알지네이트-아크릴레이트(alginate-acrylate), 폴리(하이드록시프로필 메타크릴아마이드-g-펩타이드)(P(HPMA-g-peptide)), 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트/메트리겔)(P(HEMA/Matrigel)), 히알루론산-g-N-이소프로필아크릴아마이드(HA-g-NIPAAm), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체(PEO-PPO, Pluronic series), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체(PEO-PLA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체(PEO-PLGA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체(PEO-PCL), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르류 (polyoxyethylene alkyl ethers, Brij Series), 폴리옥시에틸렌 케스터 오일 유도체류(polyoxyethylene castor oil derivatives, Cremophores), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터류(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, Tween Series), 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류(polyoxyethylene stearates)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 또는 히알루론산이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 예를 들어, O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜, 2염기산 폴리에틸렌글리콜, α,ω-비스(2-카르복시에틸-폴리에틸렌글리콜, O,O`-비스(2-브로모에틸)폴리에틸렌글리콜, O,O`-비스(2-클로로에틸)폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 디메실산, 메톡시폴리에틸렌글리콜 아세트산, O-[2-(3-숙시닐아미노)에틸]-O`-메틸-폴리에틸렌글리콜, O-(2-브로모에틸)-O`-메틸폴리에틸렌글리콜, O-(2-클로로에틸)-O`-메틸폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 모노메틸 에테르 메실산(mesylate), 알데히드 기능화 폴리에틸렌글리콜, 글리시딜이써 기능화 폴리에틸렌글리콜, 나이트로페틸 카보네이트 기능화 폴리에틸렌글리콜, 메실(Mesyl) 기능화 폴리에틸렌글리콜 또는 토실(Tosyl) 기능화 폴리에틸렌글리콜일 수 있으며, 바람직하게는 O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.
상기 수용성 고분자의 분자량은 1000 Da 내지 4000 kDa일 수 있으며, 바람직하게는 2000 Da 내지 3000 kDa 일 수 있다. 바람직한 예로써, 1000 kDa 내지 4000 kDa의 히알루론산 또는 1000 Da 내지 20000 Da의 폴리에틸렌글리콜 일 수 있다.
상기 케라틴은 모발재생을 촉진할 수 있다.
구체적으로, 상기 케라틴은 인간 외모근초 세포 또는 모근 세포의 성장 및 세포의 응집(aggregation)을 유도하여 모발 재생을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 언급하는 "발모촉진"은 "모발의 성장" 및/또는 "모발의 재생"을 촉진한다는 의미이고, "모발 재생"이란, 인간 외모근초 세포 또는 모근 세포의 성장 혹은 세포의 응집을 유도하여 궁극적으로 모발이 쉽게 빠지지 않도록 하는 것을 의미하며, 모발 성장의 초기 단계인 성장기(anagen stage)에서 모낭의 형성을 촉진하여 새로운 모낭의 형성을 유도함으로써 모발이 재생되도록 하는 것을 의미한다. 더불어, 인간 외모근초 세포의 이동 및 클론의 활성 또는 줄기세포성에 관여하는 발현인자들이 증가하는 것을 내포한다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 인간 외모근초 세포 또는 모근 세포 내 포함된 모발재생 및 모발성장을 유도하는 유전자의 발현양을 증가시킬 수 있다.
상기 유전자는 베타 카테닌(beta catenin), Sox-9, Sox-2, Alkalkine phosphatase, CD133, FGF7, FGF10, BMP6, P-cadherin, E-cadherin, MSX2, FOXN1 및 CD10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 베타 카테닌은 윈트(Wnt) 단백질의 신호를 받아 세포 핵 안으로 이동, 세포의 증식과 분화에 관련된 표적유전자의 발현을 조절하는 신호전달 물질이며, 모발로 성장할 줄기세포에 함유되어 있는 물질이며, 세포의 이동 및 클론활성과 관련된 물질인 것을 의미한다.
상기 Sox-9는 줄기세포성(stemmess)에 관여하는 물질이며, 모발의 외모근초(outer root sheath, ORS)와 피지선(sebaceous gland) 세포의 핵 내에서 발현되는 유전자인 것을 의미한다.
상기 Sox-2는 배아줄기세포에서 많이 발현하며, 배아줄기세포의 전분화능을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것뿐만 아니라 유도만능줄기세포를 만드는 인자 가운데 하나이며 줄기세포로서의 성질을 유지하는데 중요한 기능을 하는 물질인 것을 의미한다.
상기 Alkalkine phosphatase는 효소의 일종으로, 여러가지 동종효소로 신체의 여러 부위 존재하는 물질이며, 모발 생성 과정 중 hair matrix 내 혈관 신생에 관여하는 물질이며, 발모가 일어날 때 활성이 증가하는 물질인 것을 의미한다.
상기 CD133는 세포 외막에 존재하며, 세포가 성장해 나갈 때 발현이 유도되는 단백질로 알려져 있으며, CD (Cluster of Differentiation)계열의 단백질이며, 모낭 줄기세포의 면역학적 특성을 나타낼 수 있는 물질인 것을 의미한다.
상기 FGF7는 각질세포 성장인자이며, 표피 아래에 있는 진피에 침투하여 각질세포의 성장과 증식을 강력하게 촉진하는 물질인 것을 의미한다.
상기 FGF10는 섬유아세포 성장인자이며, 표피 아래에 있는 진피에 침투하여 섬유아세포의 성장과 증식을 강력하게 촉진하는 물질인 것을 의미한다.
상기 BMP6는 신경세포를 포함한 여러 종류의 세포들에서 생물학적인 활성을 조절하는 단백질로 인간 모근 세포의 응집체 형성을 유도하여 발모를 유도하는 인자인 것을 의미한다.
상기 P-cadherin 및 E-cadherin은 cadgerin계 단백질로써, 세포들을 부착시키는데 이용되며, 액틴 세포골격에 연결하여 이들의 조립을 돕는 기능을 가지고 있으며, 세포의 유전자 발현을 변화시키는 신호전달 분자로 작용하는 단백질이며, 인간 외모근초 세포의 이동 및 Matrix cell로 분화에 연관된 인자인 것을 의미한다.
상기 MSX2, FOXN1 및 CD10는 인간 외모근초 세포를 Matrix cell로 분화에 연관된 인자인 것을 의미한다.
상기 약학 조성물은 인간 외모근초 세포 내 베타 카테닌 또는 Sox-9를 증가시켜, 인간 외모근초 세포의 이동 및 클론의 활성을 유도할 수 있다.
상기 약학 조성물은 인간 모근 세포의 세포응집체(cell aggregate) 형성을 촉진시킬 수 있으며, 세포응집체 형성이 높아짐으로써, 모발성장을 유도하고 모발재생 효과가 향상될 수 있다.
상기 약학 조성물은 인간 모근 세포 내 베타 카테닌, Sox-2, Alkalkine phosphatase, CD133, FGF7 및 FGF10의 발현을 증가시켜, 인간 모근 세포의 줄기세포성을 증가 시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 신체 기능이 떨어진 노령쥐의 등 부분의 털을 깎은 후, 케라틴 용액을 주사하여 털이 자란 밀도와 모낭의 형성을 분석하였다. 그 결과, 케라틴이 모낭의 형성 및 모발의 재생을 촉진함을 확인하였다. 따라서, 케라틴이 탈모방지 또는 발모촉진용 주사용 약학 조성물에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에 있어서, 용어 "주사"는 주사기를 사용하여 약액을 피내, 피하, 근육 내 정맥 내 또는 동맥 내 등에 주입하는 것이다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물이 탈모방지 또는 발모촉진 효능을 나타내는 특성상 상기 주사는 피하 주사일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 주사기는 바늘을 통해 약액의 투여가 가능한 일반적인 주사기뿐만 아니라 본 발명의 약학적 조성물을 피하로 투여하기 위해 사용되는 주사기라면 제한없이 사용 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 주사용 약학 조성물은 액제 또는 건조분말의 형태일 수 있다. 상기 주사용 건조분말은 환자에게 투여시 주사용수, 생리식염수, 포도당액, 및 아미노산액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상과 재구성하여 개체에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함된 활성성분의 양은 투여 대상 개체의 상태, 목적하는 치료 정도 등에 따라서 달라진다. 구체적으로, 본 발명의 케라틴은 주사용 약학 조성물 대비 0.001 내지 10(w/v)%, 구체적으로는 0.01(w/v)% 내지 5(w/v)%, 더욱 구체적으로는 0.05 내지 2(w/v)% 농도로 포함될 수 있다.
상기 케라틴의 농도가 0.001(w/v)% 미만인 경우, 탈모방지 또는 발모촉진 효과가 미비할 수 있고, 10(w/v)% 초과인 경우, 체내 부작용을 나타낼 수 있는 문제가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 경피흡수 촉진제(penetration enhancer)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 탈모 부위 또는 모발 성장을 촉진하고자 하는 부위에 국소 투여할 수 있으며, 바람직하게는 진피층 또는 피하조직에 투여될 수 있다. 이때, 진피층은 표피밑에 가장 두꺼운 층으로, 혈관계, 신경계, 림프계 등이 복잡하게 얽혀 있으며, 모낭이 발생하고 성장하는 층이며 모근을 포함하고 있는 것을 의미한다.
상기 피하조직은 진피층 아래쪽에 근육과 뼈사이에 있는 부분으로, 다량의 지방을 포함한 지방세포가 있어 인체에 부드러움을 주고, 윤곽을 갖게 해주며, 에너지로 사용할 수 있다. 또한, 동맥과 림프액이 순환되고 있는 것을 의미한다.
상기 경피흡수 촉진제는 술폭시드(sulphoxide), 아존(azone), 피롤리돈(pyrrolidone), 지방산, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 탄소수 6 이상의 고급 지방 알코올(fatty alcohol), 글리콜(glycol), 요소(urea), 테르펜(terpene), 테르페노이드(terpenoid), 및 인지질(phospholipid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니며, 주사용 약학 조성물에 사용되어 활성성분의 경피 흡수를 촉진시키는 통상적인 촉진제를 포함할 수 있다.
상기 술폭시드는 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸아세트 아마이드(dimethyl acetamide, DMAC), 디메틸포름아마이드(dimethyl formamide, DMF), 및 데실메틸설폭시드(decylmethyl sulfoxide, DCMS)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 피롤리돈(pyrrolidione)은 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 및 2-피롤리돈(2P)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아존(azone)은 2-도데실아자사이클로헵탄-2-온(1-dodecylazacycloheptan-2-one) 또는 라우로카프람(laurocapram)일 수 있다.
상기 경피흡수 촉진제는 사용되는 종류에 따라 주사용 조성물에 통상적으로 허용되는 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 탈모방지 또는 발모촉진을 위하여 단독으로, 또는 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 케라틴을 포함하는 주사용 약학 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 주사용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진 방법을 제공한다.
상기 "투여"란 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 개체에 주사하여 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 나타내는 특성상, 상기 투여는 진피층 또는 피하조직의 투여일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 100mg/kg 또는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 사람의 발모면적에 따라 투여용량 및 농도가 달라질 수 있으며, 바람직한 조성물의 농도는 0.1 내지 100mg/ml이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "개체"란 탈모 증상이 발생하였거나 발생할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적으로는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 케라틴의 수득
사람 머리카락을 약한 세제를 이용해서 깨끗하게 세척한 후 증류수로 여러번 씻어주었다. 지질제거를 위해 머리카락을 비이커에 담고, 클로로포름과 메탄올을 2:1의 비율로 섞은 혼합액에 머리카락이 잠길 때까지 넣어주었다. 24시간 후 지질 제거에 사용한 용액이 머리카락에 남아있지 않을 때까지 증류수로 여러 번 세척한 후 머리카락을 기건(air-dry)시켰다. 2 % 과산화아세트산(Sigma aldrich) 800mL에 기건시킨 머리카락 20 g을 넣고 37℃ 에서 12시간동안 300 rpm의 속도로 교반하였다. 12시간 후, 머리카락을 체에 거르고 증류수로 세척하여 남아있는 산화물을 제거하였다. 머리카락을 400 mL 신다이(Shindai) 용액(5 % 2-머캅토에탄올, 5 M 우레아, 2.6 M 티오우레아(이상 Sigma aldrich) 및 25mM Tris-HCl(pH 8.5))에 넣고, 50℃, 400 rpm의 조건에서 72시간동안 반응시켰다. 그 후, 머리카락 용액을 50 mL 튜브에 넣고 3500 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 모아 12-14 kDa 컷오프 Spectra/Por®4 투석막(Spectrum)을 이용해서 투석하였다. 투석이 끝난 케라틴 액체샘플을 동결 건조하여 케라틴 파우더를 제조하였다.
제조예 2: 가수분해된 케라틴의 제조
먼저, 스크류 캡을 갖는 폴리에틸렌 테레프타레이트(polyethylene terephthalate) 재질의 갈색 바이알(10ml, 22*48)에 dH2O를 넣고, pH 9.0, 30℃에서 Tritirachium album 유래 프로테이나제-K(Proteinase-K, Eupergit® C에 고정, Sigma-Aldrich)를 2 mg/ml의 농도로 20 mg만큼 첨가하여 녹였다. 상기 프로테이나제-K가 모두 녹은 후, 상기 제조예 1에 따라 제조된 케라틴 파우더 400 mg을 미세부품 단위계수 측정 전자저울(0.001 g ~ 620 g, AJ-620E)로 달아 상기 바이알에 넣었다. 상기 바이알을 디지털 건조 오븐(Digital drying oven)에 넣은 후, 계란 모양의 흰색의 5x2 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 이동식 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 37℃에서 300 rpm의 속도로 1시간 동안 교반하였다. 완전히 가수분해된 케라틴(hydrolyzed keratin) 용액을 원심분리기에 넣어 250 g에서 10분 동안 작동시켜 프로테이나제-K가 고정된 Eupergit® C를 침전시킨 후 제거하였다. 상층액만을 수득한 뒤, 각각 Eppendorf® PCR 튜브에 10 ㎕씩 담았다. 상기 튜브를 CFX96 Touch™ Real-Time PCR 검출 시스템 장비에서 99℃에서 1시간동안 끓여 프로테이나제-K의 활성을 제거하였다. 가수분해된 케라틴 액체 샘플을 동결건조하여 가수분해된 케라틴 파우더를 제조하였다.
제조예 3: 페길화된 케라틴( PEGylated Keratin)의 제조
제조예 3-1: 페길화된 케라틴의 합성
먼저, 상기 제조예 1로부터 얻은 케라틴 파우더 0.5 g을 미세부품 단위계수 측정 전자저울(0.001 g ~620 g, AJ-620E)로 달아 500 mL 파이렉스 비이커(ISOLAB, YLS, 독일)에 넣었다. 비이커에 삼차수 100 mL를 넣고, 40×8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 300 rpm의 속도로 24시간 동안 교반하였다.
메톡시폴리에틸렌글리콜을 변형시킨 O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜 5000(mPEG, 17929-5G-F, Lot#R063737/2V Sigma aldrich) 300 mg을 삼차수 20 mL에 1시간 동안 녹였다. mPEG 용액에 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메톡시 몰폴리늄 클로라이드(DMTMM) n-수화물(327-53752, wako chemical) 16 mg을 넣고 1 시간동안 교반하였다. 케라틴 용액과 mPEG 및 DMTMM의 결합 용액을 500 mL 비커에 넣어, 40×8mm 마그네틱 교반봉(1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 500 rpm의 속도로 실온에서 3일 동안 교반하여 PEG와 케라틴을 반응시켰다.
제조예 3-2: 페길화된 케라틴의 정제
제조예 3-1의 반응이 끝난 후, Spectra/Por 투과막 튜브(직경 16 mm, 평폭 25 mm, MW10000, Spectrum)에 페길화된 케라틴 용액을 한 튜브당 100 mL씩 넣고, Spectra/Por RC 투석 튜빙 클로져(최대 폭 55 mm, Orange, Spectrum)를 양쪽 튜브에 패킹하였다. 5 L의 플라스틱 비이커(지름 197 mm, 높이 265 mm)에 삼차수 4 L를 채워 페길화된 케라틴 용액이 담긴 튜브를 넣고 마그네틱 바를 넣고 교반하면서 투석하였다. 이때, 12시간마다 새로운 삼차수로 갈아주었으며, 실온에서 3일동안 삼차수로 총 6번을 갈아주면서 투석하였다. 최종 페길화된 케라틴 용액을 50 mL 원심관(17×120 mm, BD Falcon)에 40 mL씩 나눠 담은 후, 초저온냉장고(Nihon freezer, Upright type, Single cooling type, 542l)에서 -70℃로 24시간 동안 완전히 동결시켰다. 원심관 뚜껑을 열고, 동결건조기(ALPHA 2-4 LSC PLUS, Laboratory freeze dryers, Christ)에 넣고 -85℃의 진공상태에서 완전히 파우더 형태가 되도록 3일동안 건조시켰다. 그 다음, 페길화된 케라틴을 NMR을 통해 분석하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 페길화된 케라틴에서 각각 케라틴 및 PEG에서 특이적으로 나타나는 피크가 동시에 존재하고 있음을 확인하였다.
제조예 3-3: 과산화수소를 함유한 페길화된 케라틴 용액의 제조
제조예 3-2에서 얻은 페길화된 케라틴 20mg을 미세부품 단위계수 측정 전자 저울((0.001g ~ 620g) AJ-620E)을 이용하여 측정하였다. 그리고 H2O2 (과산화수소 30%, 분자량 34.01, JUNSEI CHEMICAL, 7722-84-1) 102㎕를 3차증류수 898㎕에 넣어 농도 1M의 1mL를 만든 후, 증류수로 100배와 20배로 연속 희석(serial dilution)을 하여 최종 500uM의 H2O2 용액을 만들었다. 제조된 500uM의 H2O2 용액 1mL에 20mg의 페길화된 케라틴(PEGylated Keratin)을 넣고 5분간 볼텍싱하여 500uM 의 H2O2이 함유된 페길화된 케라틴 용액을 제조하였다. 제조된 용액이 들어가 있는 유리병을 공압식 진공포장기를 사용하여 나일론 진공포장기150×200mm(NY/PELLDPE)(80um)로 밀봉하여 보관하였다.
실험예 1: 동물실험에서 모발 성장 효과
실험예 1-1: 동물모델의 준비
케라틴의 모발 성장 효과를 검증하기 위한 동물실험 모델로 12주령된 20-25g 무게의 C57BL/6J 노령쥐(Charles River Corp. Inc., Barcelona, 스페인) 24 마리를 사용하였다. 상기 쥐를 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취시킨 후, 쥐의 등 부분을 클리퍼(cliper)로 찝고 휴지기(telogen stage)모근을 남겨두고, 머리카락 및 모근을 깎았다. 포비돈-요오드(povidone-iodine) 용액으로 피부를 소독한 후 60% 알코올로 닦았다.
실험예 1-2: 케라틴의 모발 성장 효과
상기 실험예 1-1에 따라 준비된 쥐의 등 부분에 하기 표 1과 같이 투여하여 준비하였다. 정상 대조군은 털을 깍은 후 어떠한 처리도 하지 않은 쥐를 사용하였다. 모든 쥐를 2주간 사육한 후, 2주째에 털을 깍은 부위를 실체 현미경 (SZX16, Olympus)으로 관찰하였다. 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
구분 성분 투여방법
정상 대조군 - -
양성 대조군 3%의 미녹시딜(minoxidil) 피부 위에 매일 2주간 도포(도포량 100㎕/cm2)
실시예 1 0.5w/v%의 제조예 1로부터 얻은 케라틴을 포함하는 용액 피하 단일 주사(300㎕)
실시예 2 1w/v%의 제조예 1로부터 얻은 케라틴을 포함하는 용액 피하 단일 주사(300㎕)
실시예 3 0.5w/v%의 제조예 2로부터 얻은 가수분해된 케라틴을 포함하는 용액 피하 단일 주사(300㎕)
실시예 4 1w/v%의 제조예 2로부터 얻은 가수분해된 케라틴을 포함하는 용액 피하 단일 주사(300㎕)
실시예 5 0.5w/v%의 제조예 3-2로부터 얻은 페길화된 케라틴을 포함하는 용액 피하 단일 주사(300㎕)
실시예 6 0.5w/v%의 제조예 3-2로부터 얻은 페길화된 케라틴을 포함하는 용액 피하 단일 주사(300㎕)
비교예 1 1w/v%의 제조예 1로부터 얻은 케라틴을 포함하는 용액 피부 위에 도포(도포량 100㎕/cm2)
그 결과, 상기 실시예 1 내지 6은 정상 대조군에 비해 모두 발모효과가 매우 탁월함을 나타냈으며, 상기 실시예 1 내지 6은 균일하게 모발이 성장했으며, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 4는 밀도가 매우 촘촘하게 모발이 성장한 것을 나타냈다. 이에 따라, 케라틴을 피하 내 주사할 경우 피부도포시 보다 더욱 발모효과가 뛰어남을 확인했으며, 본 발명에 따른 케라틴을 포함하는 주사용 약학 조성물은 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 가지는 것을 확인했으며, 탈모 방지 및 발모 촉진 효과가 빠르게 나타냄을 확인했다.
또한, 본 발명의 케라틴을 포함하는 주사용 약학 조성물은 통상적인 피부 외용제로의 제형으로 피부에 도포한 것 보다 탈모방지 및 발모촉진 효과가 현저히 높았으며, 제형을 주사제로 하여 피하 주사한 것이 생체이용률이 높았다.
한편, 일반적으로 피부 외용제가 아닌 주사제로 제형을 전환함에 있어, 주사제로 사용할 경우 피부 외용제로 사용할때 보다 생체이용률이 증가함에 따른 독성 등의 부작용(side effect)도 같이 높아지므로 이러한 부작용을 해결하는 것 또한 중요하다. 따라서, 본 발명의 케라틴을 포함하는 주사용 약학 조성물은 상기 도 2를 통하여, 케라틴을 포함하는 주사용 약학 조성물을 피하 주사할 시에 독성이 전혀 없는 것을 확인하였으며, 피하 주사 후 신체 내 혈액 또는 수분과 반응하여 일어나는 부작용 역시 발견되지 않았다.
실험예 1-3: 케라틴의 모발 성장효과에 대한 조직학적 분석
실험예 1-2를 마친 다음 실시예 1 내지 6의 용액을 투여한 쥐, 정상 대조군 및 양성 대조군을 각각 희생하여 조직시편을 취득하였다. 이를 헤마톡실린-에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하여 관찰하여 분석한 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
그 결과, 상기 실시예 1 내지 실시예 6의 케라틴 용액을 투여한 쥐는 모낭(hair follicle)의 형성이 정상 대조군에 비해 매우 높은 빈도로 발생하였음을 확인하였다(도 3). 특히 실시예 1 내지 실시예 4의 케라틴 및 가수분해된 케라틴 용액을 투여한 쥐는 실시예 5 내지 6의 페길화 케라틴 용액을 투여한 쥐에 비하여 모낭의 크기가 증가됨을 확인하였다. 구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이 모발 성장의 단계별로 분석한 결과로 모발 성장의 초기 단계인 성장기(anagen stage)에서 모낭의 형성이 촉진된 현상이 나타나고, 이로부터 새로운 모낭의 형성이 유도되었음을 확인하였다(도 4). 또한, 쥐에 투여한 케라틴 용액의 농도가 높아짐에 따라 모낭의 직경크기가 커지는 경향을 나타냈다(도 5).
실험예 2: 가수분해된 케라틴의 확인
제조예 2에 따라 가수분해된 케라틴이 제조되었는지 여부를 SDS-PAGE를 통해 확인하여 도 6에 나타내었다.
구체적으로, SeeBlue® plus2 Pre-Stained Standard(novex) 사이즈 마커를 실온에 꺼내놓고 용액이 완전히 섞이도록 볼텍싱하였다. 10㎕의 Bolt™ LDS Sample Buffer (4×), 4ul의 Bolt™ LDS Reducing Agent(10×) 및 26ul의 4% 가수분해된 케라틴을 혼합한 총 40㎕의 샘플을 볼텍싱하였다. 가열 블록(HYSC_Introduction_Heating Block_2014)의 온도를 100℃로 설정하고 10분간 열을 가하여 가수분해된 케라틴 샘플을 준비하였다. Bolt Bis-Tris 4-12% gradient mini gel(Invitrogen)의 comb 부분을 제거 후 웰을 1×MES 러닝 버퍼로 세척하고 카세트 마지막 부분의 커버 테잎을 제거하였다. 샘플을 로딩 전 상기 카세트의 챔버를 1×MES 러닝 버퍼로 채우고 카세트 클램프를 이용해 버퍼가 빠져나가지 않게 잠궜다. 샘플을 로딩할 웰에 1×MES 러닝 버퍼를 채웠다. 30㎕의 4% 가수분해된 케라틴 샘플과 10㎕의 SeeBlue® plus2 Pre-Stained Standard(novex) 사이즈마커를 각각 로딩하였다. 0.012,0.015,0.020mg/600㎕ PAA 케라틴 샘플을 대조군로 사용하였다. 카세트 바깥쪽 눈금까지 1×MES 러닝 버퍼로 채우고, 사이즈마커와 4% 가수분해된 케라틴 샘플을 로딩한 후 165V, 40분 동안 PowerPac™ Basic Power Supply(Bio-rad)로 러닝하였다. 러닝 후 카세트 클램프를 풀고 로딩 된 젤만 얻어 Comassie brilliant blue G-250(Sigma)으로 24시간동안 염색하였다. 탈색 용액(Destain solution; 10%(v/v) 아세트산, 40%(v/v) 메탄올)으로 밴드가 보일 때까지 워싱해준 후, 사이즈마커와 단백질을 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 보이듯이, SDS-PAGE 분석 결과 추출된 천연 케라틴의 경우 약 50k 달톤(dalton)의 분자량 수준에서 단백질 밴드를 나타내었으나, 가수분해된 케라틴의 경우 3-6k 달톤의 분자량 수준에서 smear하게 밴드가 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 가수분해된 케라틴이 다양한 분자량의 분해된 펩티드로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
실험예 3: 실험실 단계(in vitro)에서 인간 모근 세포( Demal Papilla Cell)에 대한 케라틴의 세포응집체 유도 및 모발성장 관여 인자의 발현 유도
케라틴의 모발재생 효과를 확인하기 위해, 모발의 성장 및 응집과 발모유도와 관련이 있는 인자들의 발현을 확인하였다.
인간 모근 세포를 사용하여 제조된 케라틴 용액이 세포증식에 효능을 나타내는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 인간 모근 세포를 24 웰 플레이트에 2×104 개씩 접종하고, 24시간 후에 배지를 고농도의 DMEM 일반배지, 또는 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 고농도의 DMEM 일반 배지로 교체하였다. 다시 1일, 3일, 5일 동안 배양한 후 세포 증식 분석을 수행하였다. DPBS로 웰을 세척한 후, 각각의 웰에 고농도의 DMEM 일반배지로 10배 희석된 Cell Counting Kit-8 용액(Dojindo laboratory)을 넣고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각각의 웰에서 100㎕씩을 96웰 플레이트에 옮기고, 96웰 포맷 플레이트 리더(format plate reader, ELX 800 universal microplate Reader, Bio Tek, Inc.) 기기를 이용하여 450nm 파장(O.D 450nm)에서 흡광도를 측정하였다. 이의 결과를 도 7에 나타냈다.
그 결과, 케라틴의 처리시 인간 모근 세포의 증식이 억제됨을 알 수 있었다(도 7). 또한 형광물질이 복합화된 케라틴의 처리 후, 세포와의 상호작용을 분석한 결과 세포 표면에 케라틴이 접착되어 있음을 확인하였으며, 시간이 지날수록 세포의 이동에 따른 세포응집체 형성이 케라틴에 의해 유도됨을 확인하였다(도 8).
이러한 결과를 mRNA 발현 분석을 통해 추가 확인하기 위하여, 먼저 인간 모근 세포를 6웰 플레이트에 2×105개씩 접종하고, 24시간 후에 고농도의 DMEM 일반배지, 또는 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 고농도의 DMEM 일반 배지로 교체하였다. 케라틴을 24시간 처리한 후, RNA sequencing 분석을 위해 6웰 플레이트에서 배양한 세포들의 배양배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다. RNA의 추출시 Hybrid-R 키트(Gene All)를 사용하였고, 나노드롭(MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600)을 사용하여 추출된 RNA를 정량하였다. 1㎍의 RNA를 마크로젠에 의뢰하여 RNA sequencing 분석을 수행하였다.
그 결과 케라틴을 처리한 인간모근세포에서 세포의 이동 및 세포응집체의 유도와 연관된 세포외기질의 합성과 세포간의 상호작용에 관한 mRNA 발현이 크게 증가되었으며, 세포의 증식과 연관된 mRNA 발현이 억제됨을 확인하였다(도 9).
또한 인간 모근 세포를 6웰 플레이트에 2×105개씩 접종하고, 24시간 후에 고농도의 DMEM 일반배지, 또는 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 고농도의 DMEM 일반 배지로 교체하였다. 3일 및 5일동안 배양한 후 면역화학적 염색을 통해 발모을 유도하는 인자들의 발현 정도를 측정하였다.
상기와 같이 인간 모근 세포를 배양한 후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다. 4% 파라포름알데하이드를 10분간 처리하여 고정시킨 후 다시 DPBS로 세척해 주었다. 고정 후 0.1% triton X-100를 30분간 처리하여 투과성화(permeabilization) 시킨 후, 10% (w/v)의 정상염소혈청(normal goat serum, NGS)을 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 1:200으로 희석된 토끼의 항-인간 베타-카테닌 항체(rabbit anti-human beta-catenin antibody), 쥐의 항-인간 FGF7 항체(mouse anti-human FGF7 antibody), 토끼의 항-인간 FGF10 항체(rabbit anti-human FGF10 antibody) 및 토끼의 항-인간 BMP6 항체(rabbit anti-human BMP6 antibody)를 처리하여 24시간동안 4℃에서 반응시켰다. 24 시간 반응 후, DPBS로 세 번 세척하였으며, secondary Alexa Fluor 546 conjugated antibody 와 secondary Alexa Fluor 488-conjugated antibody를 상온에서 1시간동안 처리하였다. 그 후, DPBS로 세 번 세척하였고, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 처리하였다. 그 후, 염색된 세포들을 형광현미경(OlympusI×71)으로 관찰하였다. 그 결과 케라틴을 처리한 인간모근세포에서 세포응집체 형성이 유도되며, 발모를 유도하는 인자로 알려진 FGF7, FGF10 및 BMP6의 분자발현이 크게 증가되었음을 확인하였다 (도 10)
실험예 4: 실험실 단계(in vitro)에서 인간 외모근초 (outer root sheath, ORS)에 대한 케라틴의 모발성장 관여 인자의 발현 유도
케라틴의 모발재생 효과를 확인하기 위해, 모발의 성장과 발모유도와 관련이 있는 인자들의 발현을 확인하였다.
인간 외모근초 세포를 사용하여 제조된 케라틴 용액이 모발의 성장과 발모유도와 관련이 있는 인자들의 발현을 나타내는지 여부를 확인하였다.
구체적으로 인간 외모근초 세포를 6웰 플레이트에 5×104개씩 접종하고, 24시간 후에 ORS 배지 또는 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 ORS배지로 교체하였다. 3일동안 배양한 후 면역화학적 염색과 RT-PCR 분석을 통해 베타 카테닌(beta catenin), CD34, P-cadherin 및 E-cadherin의 발현 정도 및 전사인자들에 대한 발현정도를 측정하였다.
상기와 같이 인간 외모근초(outer root sheath, ORS) 세포를 배양한 후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다. 4% 파라포름알데하이드를 10분간 처리하여 고정시킨 후 다시 DPBS로 세척해 주었다. 고정 후 0.1% triton X-100를 30분간 처리하여 투과성화(permeabilization) 시킨 후, 10% (w/v)의 정상염소혈청(normal goat serum, NGS)을 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 1:200으로 희석된 토끼의 항-인간 베타-카테닌 항체(rabbit anti-human beta-catenin antibody), 토끼의 항-인간 CD34항체(rabbit anti-human CD34 antibody), 토끼의 항-인간 P-cadherin 항체(rabbit anti-human P-cadherin antibody), 토끼의 항-인간 E-cadherin 항체(rabbit anti-human E-cadherinantibody) 및 쥐의 항-인간 integrin beta1 항체 (mouse anti-human integrin beta1 antibody)를 처리하여 24시간동안 4℃에서 반응시켰다. 24시간 반응 후, DPBS로 세 번 세척하였으며, secondary Alexa Fluor 546 conjugated antibody, secondary Alexa Fluor 488-conjugated antibody 및 PE-conjugated Palloidin antibody를 상온에서 1시간동안 처리하였다. 그 후, DPBS로 세 번 세척하였고, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 처리하였다. 그 후, 염색된 세포들을 형광현미경(OlympusI ×71)으로 관찰하였다. RT-PCR분석을 위해 6웰 플레이트에서 배양한 세포들의 배양배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다. RNA의 추출시 Hybrid-R 키트(Gene All)를 사용하였고, 나노드롭(MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600)을 사용하여 추출된 RNA를 정량하였다. 1㎍의 RNA를 AccuPower Cycle Script RT Premix (Bioneer, 대전, 한국)에 첨가하고, 열 순환기(T106, Bio-Rad)를 이용해 cDNA를 만들었다. 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.
Sense(5'-3') Antisense(5'-3')
beta-catenin TGCAGTTCGCCTTCACTATG CTGCACAAACAATGGAATGG
KRT5 ACCAGTACCCGCATCTGCA TGTTCCGTGGCCTCTTCG
MSX2 CCGCCAAGACATATGAGCCC ACCTGGGTCTCTGTGAGGTT
ITGA6 AGCTGTGCTTGCTCTACCTG CCGGGGTCTCCATATTTCCG
FOXN1 AGTGGTGCTGGGATGTTCTG ATAGTGTGAGGAGCCCAGGT
CD10 CTTTAGTGCCCAGCAGTCCA GAGTCCACCAGTCAACGAGG
beta-actin GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT TCGTGCGTGACATTAAGGAG
각각의 반응에 SYBR Green PCR Mix 10㎕, 0.5pm의 프라이머(sense와 antisense)와 50nm의 주형(template)을 넣어주었다. RT-PCR은 RG6000 5plex HRM(Corbett Research)기기를 사용하였으며, 95℃에서 15초, 어닐링(annealing) 온도 57℃에서 45초로, 40 사이클을 설정하였다. 역치주기(Threshold cycle, Ct) 값을 측정하기 위해, 상대정량(comparative Ct (2-ΔΔCt))법을 사용하였다.
그 결과, 인간 외모근초(outer root sheath, ORS) 세포의 경우 케라틴의 처리시 모발재생과 관련하여 외모근초 세포의 이동 및 Matrix cell로의 분화와 관련된 인자인 베타 카테닌(beta catenin) 및 P-cadherin의 발현이 증가됨을 확인하였으며, 분화시 발현이 줄어드는 분자로 알려진 CD34의 발현이 감소됨을 확임하였다 (도 11).
또한, 케라틴의 처리시 인간 외모근초(outer root sheath, ORS) 세포의 Matrix cell로의 분화와 관련된 MSX2, FOXN1 및 CD10 유전자의 발현이 증가됨을 확인 하였으며 (도 12), 분화시 발현이 줄어드는 것으로 알려진 KRT5 및 ITGA6 유전자 발현은 감소하는 것을 확인하였다 (도 12).
실험예 5: 실험실 단계(in vitro)에서 인간 외모근초 세포에 대한 가수분해된 케라틴의 모발성장 관여 인자의 발현 유도
가수분해된 케라틴의 모발재생 효과를 확인하기 위해, 모발의 성장과 줄기세포성에 관련이 있는 인자들의 발현을 확인하였다.
인간 외모근초(outer root sheath, ORS) 세포를 6웰 플레이트에 5×104개씩 접종하고, 24시간 후에 ORS 배지 또는 1%(w/v)의 가수분해된 케라틴이 포함된 ORS배지로 교체하였다. 1일, 3일 및 5일동안 배양한 후 면역화학적 염색과 RT-PCR 분석을 통해 베타 카테닌(beta catenin), Sox-9 및 CD44의 발현 정도를 측정하였다.
상기와 같이 인간 외모근초(outer root sheath, ORS) 세포를 배양한 후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다. 4% 파라포름알데하이드를 10분간 처리하여 고정시킨 후 다시 DPBS로 세척해 주었다. 고정 후 0.1% triton X-100를 30분간 처리하여 투과성화(permeabilization) 시킨 후, 10% (w/v)의 정상염소혈청(normal goat serum, NGS)을 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 1:200으로 희석된 토끼의 항-인간 베타-카테닌 항체(rabbit anti-human beta-catenin antibody), 토끼의 항-인간 Sox-9 항체(rabbit anti-human Sox-9 antibody) 및 토끼의 항-인간 CD44 항체(mouse anti-human integrin beta1 antibody)를 처리하여 24시간동안 4℃에서 반응시켰다. 24 시간 반응 후, DPBS로 세 번 세척하였으며, secondary Alexa Fluor 546 conjugated antibody 와 secondary Alexa Fluor 488-conjugated antibody를 상온에서 1시간동안 처리하였다. 그 후, DPBS로 세 번 세척하였고, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 처리하였다. 그 후, 염색된 세포들을 형광현미경(OlympusI × 71)으로 관찰하였다. RT-PCR분석을 위해 6웰 플레이트에서 배양한 세포들의 배양배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다. RNA의 추출시 Hybrid-R 키트(Gene All)를 사용하였고, 나노드롭(MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600)을 사용하여 추출된 RNA를 정량하였다. 1㎍의 RNA를 AccuPower Cycle Script RT Premix (Bioneer, 대전, 한국)에 첨가하고, 열 순환기(T106, Bio-Rad)를 이용해 cDNA를 만들었다. 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 3과 같다.
Sense(5’-3’) Antisense(5’-3’)
beta-catenin TGCAGTTCGCCTTCACTATG CTGCACAAACAATGGAATGG
Sox-9 ACCAGTACCCGCATCTGCA TGTTCCGTGGCCTCTTCG
beta-actin GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT TCGTGCGTGACATTAAGGAG
각각의 반응에 SYBR Green PCR Mix 10㎕, 0.5pm의 프라이머(sense와 antisense)와 50nm의 주형(template)을 넣어주었다. RT-PCR은 RG6000 5plex HRM
(Corbett Research)기기를 사용하였으며, 95℃에서 15초, 어닐링(annealing) 온도 57℃에서 45초로, 40 사이클을 설정하였다. 역치주기(Threshold cycle, Ct) 값을 측정하기 위해, 상대정량(comparative Ct (2-ΔΔCt))법을 사용하였다.
상기와 같이 인간 외모근초(outer root sheath, ORS) 세포를 배양한 후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다. 단백질 용해 버퍼(Cell Lysis Buffer (10X): RiPA buffer(biorad-89901) & Phosphatase Inhibitor Cocktail (thermofisher(100X), 78440))를 0.3-1ml 넣고 스크래퍼로 세포를 모은 후 e-tube에 옮겼다. 원심분리기(Centrifuge 5427 R, effendorf 10,000xg)를 이용하여 4℃, 30분간 분리하여 단백질이 포함된 상층액을 얻었다. 단백질정량은 Bio Rad Protein Assay 시약을 이용하여 수행하였다. 30㎍의 단백질 샘플에 6×sample dye(DTT, sigma 43815, bromophenol blue sigma, BR0222, Glycerl, bioshop, GLY001)를 넣어 1×가 되게 혼합하고, 가열 블록(HYSC_Introduction_Heating Block_2014)에 샘플을 넣고, 95℃에서 10분간 가열하였다. 가볍게 스핀 다운(spin down)하고 볼텍싱(Stuart Scientific SA8 vortex mixer AC input 90 / 230 V, 50-60 Hz) 한 후, 얼음에 꽂아 두고, PROTEAN® Tetra Handcast Systems (Bio-rad)을 준비하였다. 젤을 만들기 위해 수동 주조용 플레이트(Plates for Hand Casting)에 short glass와 long glass를 조립하고, 유리판을 70% 에탄올(merk)과 증류수로 세척한 후 틀에 넣고 젤을 굳히는 판의 바닥에 그리스(grease)를 발라서 젤이 새지 않도록 하였다. 최종 22ml의 분리 젤(seperating gel)(30% 아크릴아마이드(30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 #1610154) 6ml, dH2O 5ml, 1.5M Tris-HCl(sigma, T1503) 3.75ml, 10% SDS(sigma, sodium dodecyl sulfite, L3771) 150㎕, TEMED(USB, 76230) 7.5㎕, 및 10% 과황산 암모늄(sigma, 215589) 75㎕ 포함) 만들어 유리판에 넣은 후 70% 에탄올을 넣어 수평을 맞추었다. 30분 정도 지난 후 유리판을 기울여서 에탄올을 제거한 후, 분리 젤 위에 최종 10 ml의 스태킹 젤(stacking gel)(30% 아크릴아마이드(30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 #1610154) 1.3ml, dH2O 6.1ml, 1.0M Tris-HCl(sigma, T1503) 2.5ml,Tris-HCl(sigma, T1503) 100㎕, TEMED(USB, 76230) 10㎕ 및 10% 과황산 암모늄 (sigma,215589) 60㎕ 포함(을 만들었다. 스태킹 젤을 넣고, 1.0mm comb를 꽂은 후 젤 판을 영동조에 세팅하였다. 샘플을 각 웰에 로딩하고, 5㎕의 사이즈마커(ladder)(단백질 분자량 마커 10 -245 kDa ab116028 - Abcam)도 넣었다. Mini gel을 50V로 20분 반응 후 스태킹 젤을 지날 때 100V로 올리면서 1시간 - 1.5시간동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 젤을 젤 판에서 분리하여트랜스퍼 버퍼(transfer buffer)에 두었다. 한편, 상기 트랜스퍼 버퍼는 글라이신(Glycine, sigma) 14.4g, Trizma base(sigma, T1503) 3g, 메탄올(merk) 200mL 및 d2OH 800ml을 사용하여 제조하였다. PVDF 트랜스퍼 멤브레인(transfer membrane)(millipore cat No ISEQ 10100 10cm×10cm PVDF)을 메탄올에서 5분, 3차 H2O에서 3분 및 트랜스퍼 버퍼에서 3분동안 담가 흔든 후 아래와 같은 순으로 카세트 샌드위치를 제조하였다: (-)검은판 - 스폰지 - 3M 페이퍼 - 투명판 프랜스퍼 장치(Bio-rad). 상기 카세트를 수조 안에 넣고, 교반기(stirrer) 위에서 200V로 90분간 트랜스퍼 하였다. 트랜스퍼 종료 후 젤과 멤브레인을 염색하여 밴드를 확인하였다. 폰소 S(ponceau S) 2.5g 과 아세트 산 5ml를 dH2O에 첨가하여 500ml가 되도록 시약액을 제조한 후, 상기 멤브레인 전체를 시약액에서 약 5분간 흔든다음 H2O로 2-3회 세척하여 밴드를 확인하고, 래더 사이즈를 표시해두었다. 10g의 탈지유(skim milk)(BD, 2322100)와 200ml의 TBS(Tris 12g, Nacl9g in d2OH)로 차단용액(blocking solution)을 만들고 멤브레인을 플라스틱 그릇에 담은 후, 10ml의 차단 용액에서 1시간동안 인큐베이션(incubation)하였다. 상기 10ml의 차단 용액에 1:1000으로 희석한 B-카테닌 1차 항체(Anti-beta Catenin antibody [E247] (ab32572))와 B-액틴 1차 항체(β-Actin Antibody (C4))를 추가한 후, Santa Cruz 인큐베이터에서 4℃에서 24시간동안 인큐베이션하였다. TBST(Tris 12g, Nacl 9g in d2OH, 1% tween 20)를 넣어 5분씩 3회 세척하고 10ml의 차단 용액에 1:10000으로 희석한 B-카테닌 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP: sc-2004)와 B-액틴 2차 항체(mouse anti-rabbit IgG-HRP)를 2시간동안 인큐베이션하였다. TBST(Tris 12g, Nacl9g in d2OH, 1%tween 20)를 넣어 5분씩 3회 세척한 후, ECL Substrate(대명사이언스)를 넣고 5분간 인큐베이션하였다. 암실에서 현상용 카세트(대명사이언스, 고감도스크린)에 멤브레인을 올리고 X-ray 필름(대명사이언스 8×10 inch)을 5분정도 인큐베이션하고, 필름을 꺼낸 후 자동현상기(SAEKI,P&C, ATL-1500)에서 현상하였다.
그 결과, 인간 외모근초(outer root sheath, ORS) 세포의 경우 가수분해된 케라틴의 처리시 모발재생과 관련하여 외모근초 세포의 이동 및 클론의 활성과 관련된 인자인 베타 카테닌(beta catenin) 분자 및 줄기세포성(stemness)에 관여하는 Sox-9분자의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 13). 또한, 줄기세포성(stemness)에 관여하는 Sox-9 유전자 및 베타 카테닌(beta catenin) 유전자의 발현이 증가됨을 확인 하였다(도 14). 특히, 베타 카테닌은 가수분해된 케라틴의 처리시 4배 이상 발현됨을 확인하였다(도 15).
실험예 6: 실험실 단계(in vitro)에서 인간 모근 세포에 대한 가수분해된 케라틴의 모발성장 관여 인자의 발현 유도
인간 모근(dermal papilla, DP) 세포를 아무것도 처리하지 않은 6 웰 플레이트에 2x105 개씩 접종하고. 24시간 후에 DP 배지 또는 1%(w/v)의 가수분해된 케라틴이 포함된 DP 배지로 교체하였다. 1일, 2일, 및 3일동안 배양한 후 세포응집체(Cell aggregate) 형성 정도와 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline Phosphatase)의 활성 정도를 분석하였고 면역화학적 염색을 통해 베타 카테닌(beta catenin), Sox-2, CD133, 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline Phosphatase), FGF7 및 FGF10 의 발현정도를 측정하였다.
상기와 같이 인간 모근(dermal papilla, DP) 세포의 배양 동안 광학현미경을 이용하여 가수분해된 케라틴의 처리시 생성되는 세포응집체 (Cell aggregate)의 수를 측정하였다.
또한 상기와 같이 인간 모근(dermal papilla, DP) 세포의 배양 후, 4% 파라포름알데하이드를 1분에서 2분간 처리하여 고정시킨 후, 알칼리성 인산가수분해효소 검출 키트(Alkaline phosphatase detection kit, Merk Millipore SCR004)에 있는 린스 버퍼(Rinse buffer)로 세척하고, Naphthol AS-BI phosphate solution: Fast Red Violet solution: 증류수(distilled water)가 2:1:1로 혼합된 반응용액을 1ml 첨가하여 15분간 어두운 조건과 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 알칼리성 인산 세포가 발현하는 가수분해효소(Alkaline Phosphatase)의 활성에 의해 염색된 세포들을 형광현미경(Olympus I×71)으로 관찰하였다.
또한 상기와 같이 인간 모근(dermal papilla, DP) 세포의 배양 후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척하였다. 4% 파라포름알데하이드를 10분간 처리하여 고정시킨 후 다시 DPBS로 세척하였다. 고정 후 0.1% triton X-100를 30분간 처리하여 투과성화(permeabilization) 시킨 후, 10% (w/v)의 정상염소혈청(normal goat serum)을 1 시간 동안 처리하였다. 그 후, 1:200으로 희석된 토끼의 항-인간 베타-카테닌 항체(rabbit anti-human beta-catenin antibody), 쥐의 항-인간 Sox-2 항체(mouse anti-human Sox-2 antibody), 쥐의 항-인간 ALPase 항체(rabbit anti-human ALPase antibody), 토끼의 항-인간 CD133 항체(rabbit anti-human CD133 antibody), 쥐의 항-인간 FGF-7 항체(mouse anti-human FGF-7 antibody) 및 토끼의 항-인간 FGF-10 항체(rabbit anti-human FGF-7 antibody)를 처리하여 24시간동안 4℃에서 반응시켰다. 24 시간 반응 후, DPBS로 세 번 세척하였으며, secondary Alexa Fluor 546 conjugated antibody 와 secondary Alexa Fluor 488-conjugated antibody를 상온에 서 1시간동안 처리하였다. 그 후 DPBS로 세 번 세척하였고, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 처리하였다. 염색된 세포들을 형광현미경(Olympus I×71)으로 관찰하였다.
그 결과, 인간 모근(dermal papilla, DP) 세포의 경우 가수분해된 케라틴의 처리시 모근 세포의 모발재생과 줄기세포성(stemmess)에 연관된 세포응집체(cell aggregate)의 형성이 5배 이상 증가되고(도 16), 알칼리성 인산세포가 발현하는 가수분해효소의 활성이 증가됨을 확인하였다(도 17). 나아가, 모근 세포의 모발재생과 줄기세포성(stemness)인자인 베타 카테닌(beta catenin), Sox-2, Alkalkine phosphatase, CD133, FGF-7 및 FGF-10 분자의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 18).
상기 실험예 1 및 6을 통해 케라틴은 모발재생에 관여하는 줄기세포들의 줄기세포성을 증가시키고, 세포의 이동 및 분화를 유도하여 세포응집체를 발생하게함으로써 모발의 재생을 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (13)

  1. 이중 황 결합분해 또는 펩타이드 분해에 의한 분자량 500 내지 7만 달톤의 케라틴을 포함하는 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 베타 카테닌(beta catenin), Sox-9, Sox-2, Alkalkine phosphatase, CD133, FGF7, FGF10, BMP6, P-cadherin, E-cadherin, MSX2, FOXN1 및 CD10 으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 발현양을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 진피층 또는 피하조직에 투여되는 것을 특징으로 하는, 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 경피흡수 촉진제(penetration enhancer)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 경피흡수 촉진제는 술폭시드(sulphoxide), 아존(azone), 피롤리돈(pyrrolidone), 지방산, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 탄소수 6 이상의 고급 지방 알코올(fatty alcohol), 글리콜(glycol), 요소(urea), 테르펜(terpene), 테르페노이드(terpenoid), 및 인지질(phospholipid)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드 분해에 의한 케라틴은 ⅰ) 가수분해효소와 케라틴을 반응시키는 단계; 및 ⅱ) 상기 가수분해효소를 제거하는 단계를 포함하는 제조 방법을 통해 제조된 것을 특징으로 하는, 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 가수분해효소는 프로테이나제-K, 로이실아미노펩티다아제, 카복시텝티다아제, 펩신, 트립신 및 키모트립신로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 가수분해효소는 비드에 고정된 것을 특징으로 하는, 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 펩타이드 분해에 의한 케라틴은 상기 제ⅱ) 단계 이후에, iii) 가수분해효소의 활성을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법을 통해 제조된 것을 특징으로 하는, 발모촉진 및 모근재생용 주사용 약학 조성물.

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