KR101855062B1 - 콘드로이틴의 생물공학적 생산 - Google Patents
콘드로이틴의 생물공학적 생산 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 콘드로이틴의 프럭토실화 유도체 생산 미생물에서 선형 콘드로이틴 폴리사카라이드에 대한 프럭토스 잔기 첨가를 담당하는 효소를 암호화하는 유전자의 불활성화에 의해 수득된 재조합 미생물을 배양하여 생산된 콘드로이틴에 관한 것이다.
Description
본 발명은 콘드로이틴 생산용 신규한 재조합 미생물 및 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 콘드로이틴이란 용어는 β1-3(GlcUA → GalNAc) 결합 및 β1-4(GalNAc → GlcUA) 결합에 의해 결합된 D-글루쿠론산(GlcUA) 잔기 및 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc) 잔기를 교대로 함으로써 구성된 선형 글리코사미노글리칸으로서 정의된 선형 폴리사카라이드를 나타낸다.
콘드로이틴 황산염은, 글루쿠론산(GlcUA) 및 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc)이 각각 β1-3 결합 및 β1-4 결합에 의해 선형으로 교대 결합되어, GalNAc 잔기에서 다양한 정도로 황산화되어 있는 선형 폴리사카라이드 쇄를 형성한 글리코사미노글리칸이다.
이는 동물에서, 세포 부착, 조직 재생, 신경 연장 등에서 중요한 역할을 하는 연골 및 결합 조직에 존재한다.
비-동물 근원으로부터의 콘드로이틴의 생산은 비동물-유도된 콘드로이틴 황산염의 생산을 위해 중요하고 바람직한 단계이다. 이용가능한 특허 문헌은 비동물-유도된 콘드로이틴의 생산을 위한 몇몇의 방법을 기술하고 있다.
추가로, 동물과 미생물 둘 다로부터 유도되는 몇몇의 콘드로이틴 합성효소 유전자가 클로닝되고 서열분석되었다.
콘드로이틴의 생산방법은 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida)로부터 유도된 콘드로이틴 합성효소 유전자가 도입된 재조합 그람-양성 바실러스 박테리아를 사용하여 제공되었다(US 2007/0281342 A1).
추가의 발명은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O5:K4:H4로부터 유도된 kfoC 유전자와 kfoA 유전자 둘 다를 UDP-글루쿠론산-생산 박테리아에 도입함으로써 콘드로이틴을 생산하는 방법을 기술하고 있다(WO 2008/133350).
또 다른 발명은 에스케리키아 콜라이 O5:K4:H4 콘드로이틴 합성효소와 반응의 전구물질 둘 다를 포함하는 효소 시스템에서의 시험관내 콘드로이틴 합성을 기술하고 있다(US 2009/0263867 A1).
에스케리키아 콜라이 O5:K4:H4는 프럭토스 잔기가 GlcUA 잔기에 결합되어 있는 콘드로이틴과 동일한 골격 구조를 갖는 협막 폴리사카라이드(K4 폴리사카라이드)를 생산할 수 있는 것으로 공지되어 있다[참조예: N. Volpi, Glycoconj. J., 25: 451-457 (2008)]. 따라서, 상기 K4 폴리사카라이드는 β1-3(GlcUA → GalNAc)에 의해 결합된 D-글루쿠론산(GlcUA) 잔기 및 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc) 잔기와 상기 GlcUA 잔기의 C3-하이드록실 그룹에 결합된 프럭토스 잔기를 포함하는 반복 트리사카라이드 단위로 이루어진다. 따라서, 프럭토스 잔기는 생성되는 선형 폴리사카라이드의 분지를 구성한다.
프럭토스 잔기의 제거는 산성 조건에서 가수분해 처리에 의해 달성되었다[참조: N. Volpi, Electrophoresis 25, 692-696 (2004)].
에스케리키아 콜라이 O5:K4:H4 협막 항원 유전자 클러스터와 K4 선형 폴리사카라이드를 구성하는 당을 생성하는 대사 경로 둘 다가 집중 연구되었지만, K4 폴리사카라이드를 제공하도록 선형 폴리사카라이드에 대한 프럭토스 잔기의 첨가를 담당하는 글리코실-트랜스퍼라제 활성은 지금까지 확인되지 않았다.
본 발명의 신규한 특징은 콘드로이틴 골격에 대한 프럭토스 잔기의 첨가를 담당하는 효소를 암호화하는 유전자를 불활성화시켜 수득된 재조합 미생물에 의해 고분자량 콘드로이틴을 직접 생산하는 것으로서, 콘드로이틴을 수득하기 위해, GlcUA 잔기에 결합된 프럭토스 잔기를 가수분해 제거하기 위해 K4 폴리사카라이드를 제공할 필요성을 없애준다.
본 발명의 목적은 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것으로, 상기 콘드로이틴은 각각 β1-3 결합 및 β1-4 결합에 의해 결합된 D-글루쿠론산(GlcUA) 및 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc)의 교대의 잔기로 이루어진 선형 글리코사미노글리칸으로 정의되며, 상기 미생물에서, 상기 콘드로이틴 골격에 대한 프럭토스 잔기의 첨가를 담당하는 효소를 암호화하는 유전자를 불활성화시키는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 양상에 따르면, 선형 콘드로이틴 골격에 대한 프럭토스 잔기의 첨가를 담당하는 단백질을 암호화하는 내부에 최초로 존재하는 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 미생물이 수득되는 것을 특징으로 하는 콘드로이틴 생산용 재조합 미생물이 제공되며, 상기 불활성화는 상기 유전자의 전부 또는 일부를 결실 또는 치환, 또는 추가의 뉴클레오타이드 서열의 삽입에 의한 파괴를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 불활성화시킴으로써 수득된 본 발명의 재조합 미생물은 에스케리키아 콜라이 종에 속하는 박테리아, 바람직하게는 널리 공지된 혈청형, 예를 들면, K1, K5, K7 및 K12를 포함하는 K 항원의 그룹 2에 속하는 박테리아로부터 유도된다.
본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면, 비록 콘드로이틴의 생산 능력을 갖는 재조합 미생물이 에스케리키아 콜라이 O5:K4:H4로부터 유도되지만, K 항원 그룹에 속하는 모든 미생물은 에스케리키아 콜라이 O5:K4:H4와 임의의 유전자 상동성을 공유하는지에 관계없이 이용될 수 있다. 상기 미생물의 예로는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)와 같은 헤모필러스 속[참조: Branefors-Helander P., Carbohydr. Res., Vol. 88, Jan. 15, 1981], 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)와 같은 캄필로박터 속[참조: McNally DJ, Jarrell HC, Li J, Khieu NH, Vinogradov E, Szymanski CM, Brisson JR, FEBS J., Vol. 272, No 17, 4407-4422, Sept. 2005], 글로에오캅사 젤라티노사(Gloeocapsa gelatinosa)와 같은 글로에오캅사 속[참조: Raungsomboon S, Chidthaisong A, Bunnag B, Inthorn D, Harvey NW, Water Res., Vol. 40, No 20, 3759-3766, Dec. 2006] 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)와 같은 비브리오 속[참조: Knirel YA, Widmalm G, Senchenkova SN, Jansson PE, Weintraub A, Eur. J. Biochem., Vol. 247, 402-410, July, 1997]에 속하는 박테리아가 포함된다. 보다 구체적으로, 콘드로이틴 생산용 본 발명의 재조합 미생물이 유도되는 박테리아는 에스케리키아 콜라이 혈청형 05:K4:H4이며, 이는 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 kfoE 유전자를 함유한다.
상기 kfoE 유전자는 박테리아 협막 생산에 관여할 가능성이 있는 다른 미생물로부터의 유전자와 유의한 상동성을 갖는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀진 유전자를 함유하는 에스케리키아 콜라이 K4 항원 유전자 클러스터(GenBank AB079602) 내에 위치하는 것으로 공지되어 있다[참조: T. Ninomiya, N.Sugiura, A. Tawada, K.Sugimoto, H. Watanabe and K. Kimata, J. Biol. Chem., Vol. 277, No 24, 21567-75, June 14, 2002].
본 발명의 재조합 미생물을 수득하기 위해 가장 바람직하게 사용되는 박테리아는 수탁번호 ATCC23502 하에, ATCC[미국 버지니아주 마나사스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)]으로부터 입수 가능한 에스케리키아 콜라이 05:K4:H4 균주 U1-41이다.
본 발명의 대표적인 실시형태에 따르면, 재조합 미생물은 불활성화되는 유전자가 다음 (A), (B), 및 (C)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 유전자인 콘드로이틴 생산용 미생물이다:
(A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(B) 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형된 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질; 및
(C) 서열번호 2의 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
본 발명에 따른 미생물은 불활성화되는 유전자가 다음 (a), (b), 및 (c)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 kfoE 유전자 또는 DNA인 미생물이다:
(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA;
(b) 서열번호 1에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA와 혼성화하는 DNA로서, 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA; 및
(c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA로서, 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
본 발명의 목적은 상기 (a), (b) 또는 (c)에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 전부 또는 일부 결실시키거나 치환하는 것과 같은 이의 뉴클레오타이드 서열의 변형에 의해 kfoE 불활성화가 수득되는, 콘드로이틴 생산용 미생물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 (a), (b) 또는 (c)에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삽입하여 kfoE 불활성화가 수득되는, 미생물이다.
본 발명의 가장 바람직한 양상에 따르면, 에스케리키아 콜라이 05:K4:H4 균주 U1-41(이하, 에스케리키아 콜라이 K4로서 언급된다)의 재조합 유도체는 뉴클레오타이드 결실에 의해 추정상의 프럭토실 트랜스퍼라제를 암호화하는 kfoE 유전자를 불활성화시켜 수득된다.
본 발명은 kfoE 유전자의 파괴가 프럭토스 잔기 결핍 K4 폴리사카라이드, 즉, 콘드로이틴의 직접적 생산을 야기하는 방법을 개시한다.
본 발명의 보다 바람직한 양상에 따르면, 본 발명의 재조합 에스케리키아 콜라이 K4는, PCR 프라이머가 표적화 유전자에 상동성을 제공하는 염색체 유전자를 파괴하는 방법을 사용하여 수득된다[참조: Datsenko and Wanner, PNAS, Vol. 97, No 12, 6640-6645, June 6, 2000).
본 발명의 재조합 에스케리키아 콜라이 K4 균주에 대하여, 우선, 이의 뉴클레오타이드 서열의 대부분을 외인성 카나마이신 내성 유전자로 치환하고("제1 유전자 변형"), 이어서 FLP 재조합효소 발현 벡터를 사용하여 삽입된 유전자를 결실시킴("제2 유전자 변형")으로써 염색체 kfoE 유전자를 불활성화시킨다.
에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE/kan R )로서 언급되는 제1 유전자 변형 후 수득된 재조합 에스케리키아 콜라이 K4 균주는 수탁번호 DSM23578 하에, 부다페스트 조약에 따라 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7베 소재의 도이체 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 2010년 4월 30일자로 기탁되었다.
에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE)로서 언급되는 제2 유전자 변형 후 수득된 재조합 에스케리키아 콜라이 K4 균주는 수탁번호 DSM23644 하에, 부다페스트 조약에 따라 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7베 소재의 도이체 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하에 2010년 5월 26일자로 기탁되었다.
kfoE 유전자의 불활성화는 첫번째로 레드 재조합효소(Red Recombinase) 발현 플라스미드(pKD46), 두번째로 kfoE 유전자와의 상동성을 제공하기에 적합하게 발현된 주형 플라스미드(pDK4)로부터 유도된 DNA 단편, 및 세번째로 효소인 FLP 재조합효소(pCP20)를 발현하는 보조 플라스미드를 이용하여, 3연속의 박테리아 형질전환에 의해 달성되었다.
에스케리키아 콜라이 K4의 제1 유전자 변형을 수득하기 위해, pKD46 플라스미드(GenBank: AY048746)와 선형 DNA 단편 둘 다를 사용하였다. 에스케리키아 콜라이 K4 형질전환의 제1 단계에 사용된 pKD46 플라스미드는 파지 λ로부터의 2154개의 뉴클레오타이드 및 암피실린에 대한 내성을 암호화하는 유전자로 이루어진다. 이 플라스미드는 선형 DNA 단편을 사용할 때 재조합 속도의 증가를 촉진시킨다.
에스케리키아 콜라이 K4의 후속적인 형질전환에 사용된 선형 DNA 단편은 kfoE 유전자와 카나마이신 내성 카세트를 갖는 주형 플라스미드 pDK4(GenBank: AY 048743) 둘 다에 대한 상동성 연장부를 포함하는 몇몇 쌍의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 수득되었다.
이러한 절차는 말단에서 kfoE 5' 및 3' 상동성 말단을 갖는 카나마이신 내성 카세트를 갖는 선형 DNA 단편을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 한 실시형태에서, 박테리아 형질전환은 암피실린과 카나마이신 둘 다를 함유하는 플레이트로부터 회수될 수 있는 이중 형질전환체를 용이하게 생성하는 능력으로 인하여 선택된 전기천공법에 의해 실시된다.
그러나, 전기천공법은 바람직한 기술이지만, 이러한 결과는 염화칼슘 형질전환 또는 덱스트란-DEAE 형질전환과 같은 임의의 공지의 형질전환 방법에 의해 달성될 수 있다.
에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE/kan R )의 형질전환체에서 본래의 DNA 서열을 카나마이신 내성 카세트로 치환하는 정확한 위치를 확인하기 위한 목적으로, 2개의 인접한 유전자좌-특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 몇몇의 PCR 증폭을 수행하였다: 제1 프라이머 쌍은 kfoE 잔여 5' 말단과 삽입된 kan 유전자 사이의 신규한 접합부의 형성을 입증할 수 있고, 한편, 제2 프라이머 쌍은 삽입된 kan 유전자와 kfoE 잔여 3' 말단 사이의 신규한 접합부의 형성을 입증할 수 있었다.
카나마이신 내성 카세트를 제거하기 위해 사용된 보조 플라스미드("제2 유전자 변형")는 효모 FLP 재조합효소 유전자 및 암피실린 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pCP20이었다. pKD46 플라스미드와 pCP20 플라스미드 둘 다는 43℃에서 성장한 후 에스케리키아 콜라이 K4의 형질전환체 균주로부터 후속적으로 제거된 온도-민감성 벡터이다.
카나마이신 내성 카세트를 이용하여, kfoE 유전자의 전부 또는 일부 치환을 확인하기 위해 에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE/kan R )에 대하여 서열 분석을 수행하였다. 마찬가지로, kfoE-파괴된 박테리아 균주를 최종 생산하게 하는, 카나마이신 내성 카세트의 후속적 결실을 확인하기 위해 에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE)에 대하여 서열 분석을 수행하였다.
천연 글리코사미노글리칸의 비-글리코실화 변이체를 생성할 수 있는 재조합 에스케리키아 콜라이 K4의 성공적인 작제에 사용된 방법이 일반적으로 적용가능하고, 이러한 글리코실화를 방지하는 것이 바람직한 다른 글리코실화 생성물에 유리하게 적용될 수 있다. 결론적으로, 천연 글리코사미노글리칸의 비-글리코실화 변이체를 생산할 수 있는 미생물을 수득하기 위한 일반적인 방법이 개발되었다.
본 발명의 다른 목적은 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법을 제공하는 것이고, 상기 방법은 (1) 재조합 미생물을 적합한 배지에서 배양하는 단계, 및 (2) 배지 배양액으로부터 생산된 콘드로이틴을 회수하는 단계를 포함한다.
상기에 기재된 방법에 따라 수득된 콘드로이틴을 생산할 수 있는 임의의 재조합 미생물을 배양 단계에서 사용하여, 콘드로이틴에 대한 프럭토스 잔기의 첨가를 담당하는 효소를 암호화하는 유전자를 불활성화킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 에스케리키아 콜라이 DSM23644와 같은 에스케리키아 콜라이 K4로부터 수득된 재조합 미생물은 콘드로이틴을 직접 생산하는 능력을 갖는 재조합 미생물로서 사용된다.
에스케리키아 콜라이 DSM23644 박테리아의 배양에 채택된 방법은 에스케리키아 속 구성원의 배양에 적용가능한 일반적인 방법이다. 상기 방법은 1리터당 함유하는 배양 배지의 배타적인 사용이 아니라 바람직한 사용에 근거한다: K2HP04·3H20 9.7g, KH2P04 8g, 시트르산 나트륨·5H2O 0.5g, MgCl2·7H20 0.2g, 카스아미노산 20g, (NH4)2S04 20g, 글루코스 2g 및 효모 추출물 10g. 고수준의 콘드로이틴 생산은 기본 배지의 조성을 적합하게 변형시키고/시키거나 기질 공급물에 의해 배양액에 영양분을 추가로 제공함으로써 달성될 수 있다.
배양 조건은 박테리아 성장 및 콘드로이틴 생산을 최대화하기 위해 정의된다. 통상적으로, 배양은 25 내지 40℃의 온도에서 8 내지 72시간 동안 수행된다.
상청액을 바람직하게는 원심분리에 의해 수거하고, 생산된 콘드로이틴의 후속적인 정제 및 특성화를 위해 사용한다.
콘드로이틴 정제는 로드리게스 및 잔(Rodriguez and Jann)에 의해 기술된 문헌[참조: Eur.J.Biochem., Vol. 177, 117-124, October 1988]에 기재된 방법을 조정하여 달성되었다.
간단히 말하자면, 콘드로이틴을 정제하기 위해 채택된 방법은 배양 상청액으로부터 시작된 침전 및 진공 하의 최종 건조의 몇몇 단계에 근거한다.
회수된 생성물의 동정은 다수의 방법에 의해, 바람직하게는 폴리사카라이드 쇄의 구조와 프럭토스 잔기의 부재의 증거를 제공하는 방법의 조합에 의해 확인될 수 있다.
정제된 생성물로부터의 프럭토스의 부재는 유리하게는 본래의 K4 폴리사카라이드로부터 프럭토스를 방출하는 것으로 공지된 조건에서 생성물의 산 가수분해 후 그 결과로서 방출된 임의의 프럭토스에 대한 특정 검정에 의해 확인될 수 있다. 이러한 시험은, 에스케리키아 콜라이 DSM23644 박테리아의 배양액으로부터 회수된 폴리사카라이드는, 본래의 K4 폴리사카라이드의 구조식으로부터 예상되는 양으로 프럭토스를 함유하는 폴리사카라이드를 일관되게 생산하는 에스케리키아 콜라이 O5:K4:H4 균주 U1-41로부터 수득된 본래의 K4 폴리사카라이드와는 대조적으로 프럭토스를 함유하지 않는 것으로 일관되게 나타난다.
에스케리키아 콜라이 DSM23644 박테리아의 배양액으로부터 회수된 생성물의 동정의 추가 확인은 생성물을 콘드로이티나제 ABC 효소로 소화시켜 수득되었고, 이 효소는 본래의 K4 폴리사카라이드가 아니라 프럭토스-비함유 콘드로이틴 폴리사카라이드를 디사카라이드로 완전히 분해하는 것으로 공지되어 있다.
즉, 콘드로이티나제 ABC는 본래의 K4 폴리사카라이드를 소화시킬 수 없다. 에스케리키아 콜라이 DSM23644 박테리아의 배양액으로부터 회수된 생성물의 콘드로이티나제 ABC 소화 실험은 완전한 소화로부터 예상되는 디사카라이드 생성물의 양을 산출하여 폴리사카라이드 골격의 성질 및 특히 프럭토스 잔기의 부재를 확인시켜준다.
본 발명의 한 실시형태에 따르면, K4 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 유전자로서 kfoE의 기능을 확인하기 위해, 야생형 kfoE 뉴클레오타이드 서열을 갖는 재조합 플라스미드를 작제하고 에스케리키아 콜라이 K4 균주(ΔkfoE)에 도입하여 소실 기능의 보완을 매개한다.
간단히 말하자면, kfoE 유전자를 증폭시켜 NcoI 및 BamHI 제한 부위 내에서 pTrcHis 플라스미드(미국 캘리포니아주 PO 박스 6482 칼스바드 반 앨런 웨이 5791 소재의 Invitrogen Corporation)에 클로닝하였다. pTrcHis-kfoE 작제물을 사용하여 재조합 에스케리키아 콜라이(ΔkfoE)를 전기천공법에 의해 형질전환시키고 100μg/mL의 암피실린을 함유하는 플레이트 상에서 37℃에서 형질전환체를 선별하였다.
pTrcHis-kfoE 작제물을 갖는 에스케리키아 콜라이(ΔkfoE) 형질전환체를 배양하고 로드리게스 및 잔(Rodriguez and Jann)의 문헌[참조: Eur.J.Biochem., Vol. 177, 117-124, October 1988]에 따라 K4 폴리사카라이드를 정제하고, 회수된 생성물에 존재하는 프럭토스를 정량화하기 위해, 99℃에서 1시간 동안 0.2M 트리플루오로아세트산에 의한 가수분해 전 및 후 둘 다에 유리 프럭토스를 측정하였다. 가수분해 전후에 검정된 유리 프럭토스는 출발 K4 분자에 결합된 프럭토스로 간주되었다.
pTrcHis-kfoE로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 DSM23644의 배양액으로부터 회수된 생성물은 결합된 프럭토스의 존재를 나타내는데, 이는 이 균주에서 프럭토실-트랜스퍼라제 활성의 소실이 플라스미드에 의해 보완됨을 확인시켜준다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 에스케리키아 콜라이 05:K4:H4 균주 U1-41을 처리하여 에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE/kan R ) 및 에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE)를 작제하는 유전자 변형을 도식적으로 나타낸다.
a) 2개의 FRT(Flippase Recognition Targets) 재조합 서열에 인접한 카나마이신 내성 카세트(카나마이신)를 갖는 DNA 단편(카나마이신 내성 유전자는 P1 및 P2 프라이밍 부위(priming site)를 이용하여 pKD4 플라스미드 주형으로부터 유도된다);
b) 에스케리키아 콜라이 O5:K4:H4 균주 U1-41의 K 항원 유전자 클러스터의 상세 구조(kfoD 및 kfoF는 kfoE의 인접 유전자이다);
c) 본래의 DNA 단편을 카나마이신 내성 유전자(카나마이신)로 치환함으로써 kfoE 유전자의 파괴를 나타내는 에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE/kan R ) 염색체 DNA;
d) kfoE 유전자 대부분의 최종 결실을 나타내는 에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE) 염색체 DNA.
도 2는 3개의 에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE/kan R ) 형질전환체에 대해 PCR 증폭을 수행하여 3' 및 5' kfoE 잔여 인접 영역의 서열을 입증하는 결과를 나타낸다:
레인 1 및 10은 분자량 마커(1Kb 래더)를 나타내고;
레인 2 내지 4는 3개의 형질전환체의 잔여 kfoE 3' 말단의 PCR 생성물을 나타내고;
레인 6 내지 8은 3개의 형질전환체의 잔여 kfoE 5' 말단의 PCR 생성물을 나타내고;
레인 5 및 9는 각각 프라이머의 3' 및 5' 쌍을 이용하여 수득된 에스케리키아 콜라이 05:K4:H4 균주 U1-41의 PCR 생성물을 나타낸다.
도 3은 콘드로이티나제 ABC를 이용한 소화 후 모세관 전기영동에 의해 분석된 에스케리키아 콜라이 DSM23644에 의해 생산된 폴리사카라이드의 크로마토그램을 도시하고, 여기서 콘드로이티나제 ABC를 이용한 콘드로이틴 소화를 대표하는 불포화된 Δ-디사카라이드(Δdi-0S)를 나타낸다(피크 8).
도 4는 실시예 3에 따라 수득된 에스케리키아 콜라이 DSM23644에 의해 생산된 콘드로이틴의 13C-NMR 스펙트럼을 도시한다.
실시예
실시예
1:
에스케리키아
콜라이
K4
(Δ
kfoE
/
kan
R
) 균주의
작제
주형으로서의 pKD4 벡터 및 다음의 PCR 프라이머를 사용한 PCR에 의해 kan R 유전자와 kfoE 상동성 말단을 갖는 선형 DNA 단편(도 1a)의 작제를 달성하였다:
OL151: atgcttctaataatgtctggttcctatgttcaacaagaatgtgtaggctggagctgcttc (서열번호 3); 및
OL152: tcatactgcagcctccttaaaaatttcatataatctaaatgcacatatgaatatcctcct ta (서열번호 4).
각각의 올리고뉴클레오타이드 서열에서, 최초 40개의 뉴클레오타이드는 kfoE 유전자 상동성을 제공하고, 잔여 20개의 뉴클레오타이드는 pKD4 플라스미드 주형 상동성(P1 및 P2 프라이밍 부위)을 제공한다.
다음의 조건에 따라 주형 DNA 120ng에 대해 PCR을 수행하였다:
94℃×3분, (94℃×1분, 40℃×1분, 68℃×2분)×5 사이클, (94℃×1분, 59℃×1분, 68℃×2분)×30 사이클, 68℃×10분, 4℃×10분.
PCR 생성물을 겔-정제하고 박테리아를 형질전환시켰다.
에스케리키아 콜라이 05:K4:H4 균주 U1-41(도 1b)을 제조하였고, 닷센코 및 워너(Datsenko and Wanner)의 문헌[참조: PNAS, Vol. 97, No 12, 6640-6645, June 6, 2000]에 따라 pKD46 플라스미드를 이용한 전기천공법에 의해 형질전환시킨 후, 암피실린-함유 배지에 플레이팅(plating)한다.
암피실린-내성 형질전환체를 확인하고 분리하였다.
플라스미드 추출 및 다음 프라이머 조건을 사용한 PCR에 의해 2개의 형질전환체를 확인하였다:
OL149: ccactcataaatcctcatagag (서열번호 5);
OL150: ccaacttacttctgacaacgat (서열번호 6); 및
94℃×3분, (94℃×1분, 43℃×1분, 68℃×2.5분)×30 사이클, 68℃×10분, 4℃×10분.
0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 PCR 생성물을 분석하여 1799개의 염기쌍의 크기를 갖는 생성물을 확인하였으며, 이는 생성물 크기 예상치와 완전히 일치한다.
카나마이신 내성 카세트와 kfoE 상동 말단 둘 다를 갖는 DNA 단편을 사용하여 2개의 pKD46 형질전환체 중 1개를 후속적으로 전기천공하였다.
암피실린과 카나마이신 둘 다를 함유하는 배지 상에서의 플레이트 선별을 사용하여 kfoE 뉴클레오타이드 서열 대분분을 카나마이신 내성 유전자로 치환시킨 재조합체를 분리하였다.
적절한 다음의 프라이머를 사용하는 kfoE의 3' 인접 영역과 5' 인접 영역 둘 다의 PCR 증폭에 의해 3개의 이중 형질전환체를 확인하였다:
OL153: aatccgacggggactgtagatt (서열번호 7);
OL142: aactgttcgccaggctcaag (서열번호 8);
OL143: gcgttttcccttgtccagat (서열번호 9);
OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (서열번호 10); 및
95℃×5분, (94℃×1분, 47℃×1분, 68℃×2분)×30 사이클, 68℃×10분, 4℃×10분.
0.8% 아가로스 겔 전기영동에 의해 PCR 생성물을 분석하여 kfoE의 3' 말단 증폭에 대하여 1773개의 염기쌍의 크기를 갖고 5' 말단 증폭에 대하여 769개의 염기쌍의 크기를 갖는 2개의 생성물을 확인하였으며, 이는 생성물 크기 예상치와 완전히 일치한다(도 2).
카나마이신 내성 유전자의 배향을 확인하고 유전자 전사의 정확한 방향을 보장하기 위해, 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 에스케리키아 콜라이 K4(ΔkfoE/kanR)의 서열분석(도 1c)에 의해 형질전환체를 추가로 분석하였다:
OL153: aatccgacggggactgtagatt (서열번호 7); 및
OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (서열번호 10).
생성되는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 14에 의해 확인된다.
실시예
2:
에스케리키아
콜라이
K4
(Δ
kfoE
) 균주의
작제
카나마이신 내성 카세트가 결핍되고 기능 소실을 수반하는 kfoE 유전자 대부분이 결실된 에스케리키아 콜라이 K4 균주(ΔkfoE)를 수득하기 위해, pCP20 플라스미드를 이용하여 에스케리키아 콜라이 K4 균주(ΔkfoE/kanR)를 추가로 형질전환시켰다.
전기천공 단계 후, 암피실린 함유 배지 상에서 30℃에서 형질전환체를 선별한 후, 콜로니를 정제하였다.
비-선별 플레이트 상에서 43℃에서 추정상의 형질전환체를 성장시킨 후, 모든 항생제 내성의 소실에 대하여 시험하였다.
다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 kfoE 인접 3'과 5' 잔여 말단의 서열분석(도 1d)에 의해 에스케리키아 콜라이 K4 균주(ΔkfoE) 형질전환체를 확인하였다:
OL169: tgaggtgattgttggtaaaccttggtg (서열번호 11); 및
OL166: tactgtttctgcttgcccccgagtt (서열번호 12).
생성되는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13으로 동정된다.
실시예
3:
에스케리키아
콜라이
DSM23644
의 배양 및 콘드로이틴 분석
로드리게스 및 잔(Rodriguez and Jann)문헌[참조: Eur.J.Biochem., Vol. 177, 117-124, October 1988]에 따라 에스케리키아 콜라이 DSM23644를 배양하였다.
간단히 말하자면, 해동된 배양액 스톡 0.5ml로 개시하고, 1L당 K2HP04·3H20 9.7g, KH2P04 8g, 시트르산 나트륨·5H20 0.5g, MgCl2·7H20 0.2g, 카스아미노산 20g, 황산암모늄 20g, 글루코스 2g 및 효모 추출물 10g으로 이루어진 브로쓰 배양액 20ml를 함유하는 플라스크에 접종하고, 180rpm 및 변위 2.5cm로 진탕시키면서 37℃에서 16시간 동안 항온처리하여, 배양의 영양생장 단계를 실현한다.
상기 브로쓰 배양액 85ml를 함유하는 500ml 배플드 플라스크(baffled flask)에 상기 기재된 바와 같이 제조된 영양생장 배양액 0.05%를 접종하고, 180rmp 및 변위 25cm로 진탕시키면서 37℃에서 48시간 동안 항온처리하여, 회분 배양으로 후속적인 배양 단계를 수행하였다.
항온처리의 종료시점에서 배양액을 원심분리에 의해 수거하고 생산된 콘드로이틴을 분리하고 특성화하기 위해 상청액을 정제하였다.
로드리게스 및 잔(Rodriguez and Jann)의 문헌[참조: Eur.J.Biochem., Vol. 177, 117-124, October 1988]에 기재된 방법을 조정하여 콘드로이틴을 정제하였다.
간단히 말하자면, 세타블론(Cetavlon; 알킬-트리메틸암모늄 브로마이드, CAS No 7192-88-3)에 의해 배양액 상청으로부터 폴리사카라이드를 침전시키고, 3℃에서 0.5M NaOH로 추출하고, 중화시키고, 후속적으로 80% 에탄올로 3회 침전시켜 정제하였다.
90% 냉 페놀(pH 6.8)을 사용하여 오염 단백질을 침전시켜 원심분리에 의해 수성 상을 회수하는 정제의 최종 단계를 수행하였다. 80% 에탄올을 이용한 침전 및 진공 하의 건조에 의해 수성 상으로부터 정제된 콘드로이틴을 회수하였다.
몇몇의 분석 접근법을 사용하여 생산된 콘드로이틴의 성질을 확인하였다.
제1 접근법은 99℃에서 1시간 동안 0.2M 트리플루오로아세트산을 이용하여 산 가수분해를 수행한 후 배양액으로부터 회수된 생성물 중에 프럭토스의 존재 또는 부재에 근거한다.
회수된 생성물 중에 존재하는 프럭토스를 정량화하기 위해, 가수분해 전 및 후 둘 다에 유리 프럭토스를 측정하였다. 바이오컨트롤(BIOCONTROL; 미국 워싱턴주 WA 98005 벨뷰 SE 32번가 12822 소재의 BioControl Systems Inc.)로부터 공급된 EnzyPlus 슈크로스/D-글루코스/D-프럭토스 키트를 사용하여 프럭토스를 효소적으로 검정하였다.
가수분해 후에 존재하는 유리 프럭토스와 가수분해 전에 존재하는 유리 프럭토스의 차이는 출발 K4 분자에 결합된 프럭토스로서 간주되었다.
에스케리키아 콜라이 DSM23644의 배양액으로부터 회수된 생성물은 결합된 프럭토스가 존재하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 이 균주가 프럭토스 비-함유 폴리사카라이드를 생산한다는 것을 확인해 준다.
상기한 바와 같은 에스케리키아 콜라이 DSM23644의 배양액으로부터 회수된 폴리사카라이드로부터의 결합된 프럭토스의 부재는 콘드로이티나제 ABC에 의한 효소 소화에 의해 확인되었다. 정제된 콘드로이틴은 콘드로이티나제 ABC를 이용하여 소화될 때 모세관 전기영동(CE)에 의해 확인된 바와 같이 콘드로이틴 소화를 대표하는 불포화된 Δ-디사카라이드(Δdi-0S)를 생성하는 것으로, 미셀 계면동전 크로마토그래피(Micellar Electrokinetic Chromatography; MECK) 기술을 사용하여 추가로 확인되었다(도 3). Δdi-0S 구조의 확인은 적절한 Δ-디사카라이드 대비 표준(상응하는 전기영동 용출액)을 사용하여 수득되었다. 수득된 Δdi-0S의 정량적 측정은 외부 검량선 방법에 의해 달성되었다.
마지막으로, 에스케리키아 콜라이 DSM23644에 의해 생산된 정제된 콘드로이틴 폴리사카라이드를 C13 NMR로 특성화하였다(도 4).
이 기술은, 목적하는 생성물은 산 가수분해에 의한 본래의 K4 폴리사카라이드로부터의 프럭토스 제거 후 수득된 생성물과 스펙트럼이 동일하다는 것을 나타냈다.
실시예
4:
kfoE
기능의 플라스미드-
매개된
보완
K4 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 유전자로서 kfoE의 기능을 확인하기 위해, 야생형 kfoE 뉴클레오타이드 서열을 갖는 재조합 플라스미드를 작제하고 에스케리키아 콜라이 K4 균주(ΔkfoE)에 도입하여 소실 기능의 보완을 매개하였다.
다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 kfoE 유전자를 증폭시켰다:
OL172: acaacatgttactaataatgtctggttcctatgttc (서열번호 15); 및
OL173: actggatccttatcatactgcagcctcctta (서열번호 16).
pTrcHis 플라스미드(4400bp - 미국 캘리포니아주 PO 박스 6482 칼스바드 반 앨런 웨이 5791 소재의 Invitrogen Corporation)를 사용하여, 증폭되고 겔-정제된 kfoE 유전자(1569bp)를 적합한 클로닝 부위에 도입하였다.
NcoI 및 BamHI 제한 효소로 소화된 pTrcHis 벡터 70ng 및 Pcil/BamHI로 소화된 말단을 갖는 양립가능한 kfoE 유전자 75ng에 대해 25℃에서 15분 동안 라이게이션(ligation) 반응을 수행한다.
이어서, 에스케리키아 콜라이 DH5α 적격 세포(competent cell)(미국 캘리포니아주 PO 박스 6482 칼스바드 반 앨런 웨이 5791 소재의 Invitrogen Corporation) 50μL를 라이게이션 혼합물 5μL를 이용하여 전기천공하고 100μg/mL의 암피실린을 함유하는 플레이트 상에서 37℃에서 5개의 형질전환체를 선별하였다.
콜로니 정제 후, 작제된 플라스미드 pTrcHis-kfoE를 추출하고 Mfe I 제한 효소로 소화시키는데, 이 효소는 삽입된 kfoE 서열 내의 DNA 작제물을 절단할 수 있었다.
겔 전기영동 분석에 의해, Mfe I 소화 후, 5개의 형질전환체 중 3개는 길이 예상치가 5887bp인 것으로 나타났으며, 서열분석에 의해 kfoE 유전자의 정확한 삽입을 확인하였다.
확인된 pTrcHis-kfoE 작제물을 사용하여 전기천공법에 의해 재조합 에스케리키아 콜라이 DSM23644를 형질전환시키고, 100μg/mL의 암피실린을 함유하는 플레이트 상에서 형질전환체를 선별하였다.
선별된 형질전환체를 실시예 3에 기재된 조건에 따라 배양하고, K4 폴리사카라이드를 로드리게스 및 잔(Rodriguez and Jann)의 문헌[참조: Eur.J.Biochem., Vol. 177, 117-124, October 1988]에 따라 정제하였다.
회수된 생성물 중에 존재하는 프럭토스를 정량화하기 위해, 99℃에서 1시간 동안 0.2M 트리플루오로아세트산을 이용한 가수분해 전 및 후 둘 다에 유리 프럭토스를 측정하였다. EnzyPlus 슈크로스/D-글루코스/D-프럭토스 키트를 사용하여 프럭토스를 효소적으로 검정하였다.
가수분해 후에 존재하는 유리 프럭토스와 가수분해 전에 존재하는 유리 프럭토스의 차이는 출발 K4 분자에 결합된 프럭토스로서 간주되었다.
pTrcHis-ΔkfoE로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 DSM23644의 배양액으로부터 회수된 생성물은 결합된 프럭토스가 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 이 균주에서 프럭토실-트랜스퍼라제 활성의 소실이 플라스미드에 의해 보완되었다는 것을 확인해준다.
SEQUENCE LISTING
<110> GNOSIS S.P.A.
<120> BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF CHONDROITIN
<130> G71589
<150> IT MI2010A001264
<151> 2010-07-09
<150> IT MI2010A001300
<151> 2010-07-15
<160> 16
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1566)
<400> 1
atgcttctaa taatgtctgg ttcctatgtt caacaagaat taggggccga atttggttct 60
attcctccaa gctttcttcc tttagctaat aaacgattat ttaagcatca agtatcttta 120
gggcatgatg gtcatgcaat atatctggtt ttaccggaag attttgtgtt tgacaaacat 180
gattatgaat ggttgcttcg taataaagta acaatgatcc ctgtcgatag taacttgaca 240
ttagggcaag cgatagttac cgcatggaat ttaataggag ataaagatga caaaggctta 300
caattattgt ttggcgatac actctttaaa aaaattcctg caggggagga attagtagca 360
aaaagtcatc ctgatgaaaa ttatcaatgg gccatttttt acgaaacaga gttaagagcc 420
gtcagtagag aagataataa aaatgtaatt tgtgggtatt tttcttttag aaaaccgaat 480
ttttttatta gggaattagt tacttcaaaa tttgatttta cggcggcact taaaaagtat 540
cacgacagct atagtttagc ctctatatac gtgtctgatt ggcttgattt tggacatatt 600
aatacatact ataagtcaaa agtacaatac acaacccagc gtgcatttaa tgaattatgc 660
attacaacaa aatccgttat caaatcaagt tcaaatgaaa gtaaaattga agctgaatca 720
aaatggtttg aaactattcc cggagaatta aagatctata ctccaatgtt attggaaccg 780
tttgatcata tcagaaagag ttataagctt gaatatttat ataatacgac gttaaatgaa 840
ttatttgttt tttctcgcct accaaataat attttaacaa atatattaat aagttgttta 900
gacttcatcg atctgtgcaa agaatatcat tcaattgata ctgacaaaaa tatactgcaa 960
gatttatttt atgaaaaaac gattgagcgg gttagcaagt acataacaga tttaaatatt 1020
gatccaaatg caaaatggaa ttttaataat aatataagcg tttcaattaa tgatattctt 1080
tatgatacta ataaatttat cccaagtgaa ctgcaatata aaactattat gcatggcgat 1140
ttatgcttta gtaatataat ttttaacttt agaactggta gaatacaagt ttttgatccc 1200
agaggattga accactctgg agaaataagt atttatggtg attttcgtta tgatatagct 1260
aaattatcac attcaatact agggctctat gattggataa ttgcaggata ttatataata 1320
aataaaaaaa ataaaactca tagtattgaa ttcaaaatta atattgataa taaattgttt 1380
gaaattcaat caacatttgt ttctataata aaagagaaat attcaatctc cgaaaaatca 1440
ttgtatgcga tgcaaataca tttattttta tcaatgcttc cccttcattc cgatgacaaa 1500
aaaaggcaag atgcactatt tgctaatgca tttagattat atgaaatttt taaggaggct 1560
gcagta 1566
<210> 2
<211> 522
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> protein
<222> (1)..(522)
<400> 2
Met Leu Leu Ile Met Ser Gly Ser Tyr Val Gln Gln Glu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Glu Phe Gly Ser Ile Pro Pro Ser Phe Leu Pro Leu Ala Asn Lys Arg
20 25 30
Leu Phe Lys His Gln Val Ser Leu Gly His Asp Gly His Ala Ile Tyr
35 40 45
Leu Val Leu Pro Glu Asp Phe Val Phe Asp Lys His Asp Tyr Glu Trp
50 55 60
Leu Leu Arg Asn Lys Val Thr Met Ile Pro Val Asp Ser Asn Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Gln Ala Ile Val Thr Ala Trp Asn Leu Ile Gly Asp Lys Asp
85 90 95
Asp Lys Gly Leu Gln Leu Leu Phe Gly Asp Thr Leu Phe Lys Lys Ile
100 105 110
Pro Ala Gly Glu Glu Leu Val Ala Lys Ser His Pro Asp Glu Asn Tyr
115 120 125
Gln Trp Ala Ile Phe Tyr Glu Thr Glu Leu Arg Ala Val Ser Arg Glu
130 135 140
Asp Asn Lys Asn Val Ile Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Lys Pro Asn
145 150 155 160
Phe Phe Ile Arg Glu Leu Val Thr Ser Lys Phe Asp Phe Thr Ala Ala
165 170 175
Leu Lys Lys Tyr His Asp Ser Tyr Ser Leu Ala Ser Ile Tyr Val Ser
180 185 190
Asp Trp Leu Asp Phe Gly His Ile Asn Thr Tyr Tyr Lys Ser Lys Val
195 200 205
Gln Tyr Thr Thr Gln Arg Ala Phe Asn Glu Leu Cys Ile Thr Thr Lys
210 215 220
Ser Val Ile Lys Ser Ser Ser Asn Glu Ser Lys Ile Glu Ala Glu Ser
225 230 235 240
Lys Trp Phe Glu Thr Ile Pro Gly Glu Leu Lys Ile Tyr Thr Pro Met
245 250 255
Leu Leu Glu Pro Phe Asp His Ile Arg Lys Ser Tyr Lys Leu Glu Tyr
260 265 270
Leu Tyr Asn Thr Thr Leu Asn Glu Leu Phe Val Phe Ser Arg Leu Pro
275 280 285
Asn Asn Ile Leu Thr Asn Ile Leu Ile Ser Cys Leu Asp Phe Ile Asp
290 295 300
Leu Cys Lys Glu Tyr His Ser Ile Asp Thr Asp Lys Asn Ile Leu Gln
305 310 315 320
Asp Leu Phe Tyr Glu Lys Thr Ile Glu Arg Val Ser Lys Tyr Ile Thr
325 330 335
Asp Leu Asn Ile Asp Pro Asn Ala Lys Trp Asn Phe Asn Asn Asn Ile
340 345 350
Ser Val Ser Ile Asn Asp Ile Leu Tyr Asp Thr Asn Lys Phe Ile Pro
355 360 365
Ser Glu Leu Gln Tyr Lys Thr Ile Met His Gly Asp Leu Cys Phe Ser
370 375 380
Asn Ile Ile Phe Asn Phe Arg Thr Gly Arg Ile Gln Val Phe Asp Pro
385 390 395 400
Arg Gly Leu Asn His Ser Gly Glu Ile Ser Ile Tyr Gly Asp Phe Arg
405 410 415
Tyr Asp Ile Ala Lys Leu Ser His Ser Ile Leu Gly Leu Tyr Asp Trp
420 425 430
Ile Ile Ala Gly Tyr Tyr Ile Ile Asn Lys Lys Asn Lys Thr His Ser
435 440 445
Ile Glu Phe Lys Ile Asn Ile Asp Asn Lys Leu Phe Glu Ile Gln Ser
450 455 460
Thr Phe Val Ser Ile Ile Lys Glu Lys Tyr Ser Ile Ser Glu Lys Ser
465 470 475 480
Leu Tyr Ala Met Gln Ile His Leu Phe Leu Ser Met Leu Pro Leu His
485 490 495
Ser Asp Asp Lys Lys Arg Gln Asp Ala Leu Phe Ala Asn Ala Phe Arg
500 505 510
Leu Tyr Glu Ile Phe Lys Glu Ala Ala Val
515 520
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL151
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(60)
<400> 3
atgcttctaa taatgtctgg ttcctatgtt caacaagaat gtgtaggctg gagctgcttc 60
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL152
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(62)
<400> 4
tcatactgca gcctccttaa aaatttcata taatctaaat gcacatatga atatcctcct 60
ta 62
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL149
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(22)
<400> 5
ccactcataa atcctcatag ag 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL150
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(22)
<400> 6
ccaacttact tctgacaacg at 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL153
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(22)
<400> 7
aatccgacgg ggactgtaga tt 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL142
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(20)
<400> 8
aactgttcgc caggctcaag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL143
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(20)
<400> 9
gcgttttccc ttgtccagat 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL154
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(23)
<400> 10
gctaatgtat atgattgcca ggt 23
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL169
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(27)
<400> 11
tgaggtgatt gttggtaaac cttggtg 27
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL166
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(25)
<400> 12
tactgtttct gcttgccccc gagtt 25
<210> 13
<211> 167
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> gene
<222> (1)..(167)
<223> rearranged
<400> 13
atgcttctaa taatgtctgg ttcctatgtt caacaagaat gtgtaggctg gagctgcttc 60
gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaactaagg aggatattca 120
tatgtgcatt tagattatat gaaattttta aggaggctgc agtatga 167
<210> 14
<211> 1559
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1559)
<223> rearranged
<400> 14
atgcttctaa taatgtctgg ttcctatgtt caacaagaat gtgtaggctg gagctgcttc 60
gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccccac 120
gctgccgcaa gcactcaggg cgcaagggct gctaaaggaa gcggaacacg tagaaagcca 180
gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg 240
aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag 300
actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta 360
aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc 420
gcaggggatc aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 480
atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 540
cacaacagac aatcggctgc tctaatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 600
cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag 660
cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 720
ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 780
ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 840
cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 900
gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 960
tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg 1020
tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 1080
gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 1140
cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 1200
gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 1260
gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 1320
tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 1380
cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccagctt 1440
caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaactaa 1500
ggaggatatt catatgtgca tttagattat atgaaatttt taaggaggct gcagtatga 1559
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL172
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(36)
<400> 15
acaacatgtt actaataatg tctggttcct atgttc 36
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> OL173
<220>
<221> oligonucleotide
<222> (1)..(31)
<400> 16
actggatcct tatcatactg cagcctcctt a 31
Claims (16)
- 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물로서,
상기 콘드로이틴이, β1-3(GlcUA → GalNAc) 결합 및 β1-4(GalNAc → GlcUA) 결합에 의해 결합된 D-글루쿠론산(GlcUA) 잔기 및 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc) 잔기를 교대로 함으로써 구성된 선형 글리코사미노글리칸으로 정의되며,
상기 미생물은 K 항원 그룹에 속하는 미생물로부터 유래되고, 상기 미생물에서, 선형 콘드로이틴 골격에 대한 프럭토스 잔기의 첨가를 담당하는 효소를 암호화하는 원래 존재하는 kfoE 유전자가, 상기 유전자의 전부 또는 일부의 결실 또는 치환, 또는 추가의 뉴클레오타이드 서열의 삽입에 의한 파괴에 의해 불활성화되고,
상기 kfoE 유전자가
(A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(B) 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형된 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고 프럭토실-트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물. - 제1항에 있어서, 상기 불활성화된 kfoE 유전자가,
(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA인, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 kfoE 유전자가 이의 전부 또는 일부를 카나마이신 내성 카세트로 치환하고 이를 후속적으로 제거하여 kfoE 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 불활성화되는, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물이, 에스케리키아(Escherichia), 헤모필러스(Haemophilus), 캄필로박터(Campylobacter), 글로에오캅사(Gloeocapsa) 및 비브리오(Vibrio)로부터 선택된 속에 속하는 박테리아로부터 유래되는, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물.
- 제4항에 있어서, 상기 미생물이, 에스케리키아 콜라이 종에 속하는 박테리아로부터 유래되는, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물.
- 제5항에 있어서, 상기 미생물이, K 항원의 그룹 2에 속하는 에스케리키아 콜라이 종의 혈청형으로부터 유래되는, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물.
- 제6항에 있어서, 상기 미생물이 에스케리키아 콜라이 05:K4:H4U1-41 균주로부터 유래되는, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물이 에스케리키아 콜라이 DSM23578 또는 에스케리키아 콜라이 DSM23644인, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물.
- 제8항에 있어서, 상기 미생물이 에스케리키아 콜라이 DSM23644인, 콘드로이틴을 생산하는 재조합 미생물.
- 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법으로서,
에스케리키아 콜라이 DSM23578 및 에스케리키아 콜라이 DSM23644로부터 선택된 재조합 미생물이 사용되는, 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법. - 제10항에 있어서,
상기 재조합 미생물이 에스케리키아 콜라이 DSM23644인, 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법. - 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법으로서,
(a) 제1항 또는 제2항의 재조합 미생물을 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 배양액에 존재하는 콘드로이틴을 회수하고 정제하는 단계를 포함하는, 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법. - 제12항에 있어서, 상기 재조합 미생물이 에스케리키아 콜라이 DSM23578 또는 에스케리키아 콜라이 DSM23644인, 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법.
- 제13항에 있어서, 상기 재조합 미생물이 에스케리키아 콜라이 DSM23644인, 콘드로이틴의 생물공학적 생산방법.
- 삭제
- 삭제
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