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KR101849684B1 - 샤르코-마리-투스병 제2형의 원인 유전자로서 ｍｏｒｃ２ 및 이를 이용한 상기 질병의 진단방법 - Google Patents

샤르코-마리-투스병 제2형의 원인 유전자로서 ｍｏｒｃ２ 및 이를 이용한 상기 질병의 진단방법 Download PDF

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KR101849684B1
KR101849684B1 KR1020160143417A KR20160143417A KR101849684B1 KR 101849684 B1 KR101849684 B1 KR 101849684B1 KR 1020160143417 A KR1020160143417 A KR 1020160143417A KR 20160143417 A KR20160143417 A KR 20160143417A KR 101849684 B1 KR101849684 B1 KR 101849684B1
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KR
South Korea
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protein
morc2
polynucleotide
specifically detecting
agent capable
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KR1020160143417A
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Inventor
최병옥
홍영빈
정기화
최순성
Original Assignee
사회복지법인 삼성생명공익재단
공주대학교 산학협력단
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Publication date
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Abstract

MORC2 단백질 변이체 또는 MORC2 유전자 변이체, 이들을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 샤르코-마리-투스병 제1형을 진단하기 위한 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 상기 질병의 진단방법을 제공한다. 상기 변이체를 이용한 진단은 유전성이 강하면서도 단일 유전자 결함에 의해 발병하는 샤르코-마리-투스병에 대하여 유전자 검사를 통한 정확한 조기진단을 가능하게 하며, 그에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료효과를 극대화할 수 있다.

Description

샤르코-마리-투스병 제2형의 원인 유전자로서 ＭＯＲＣ２ 및 이를 이용한 상기 질병의 진단방법{MORC2 as a causative gene of Charcot-Marie-Tooth disease type 1 and method for diagnosing the disease using the same}
MORC2 단백질 변이체 또는 MORC2 유전자 변이체, 이들을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 샤르코-마리-투스병 제2형을 진단하기 위한 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 상기 질병의 진단방법에 관한 것이다.
샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease: CMT) 또는 유전운동감각신경병(hereditary motor and sensory neuropathy)은 유전적 및 임상적으로 이질적인 말초신경 시스템의 장애로서, 감각 기능의 손실을 동반한 원위성 근육 약화 등의 증상을 나타낸다 (Harding et al., Brain 103:259-280 (1980)). CMT는 가장 보편적인 종류의 유전 말초신경병증이다. 이는 80개 이상의 원인 유전자와 관련이 있다. 조직병리학적 및 전기생리학적 결과에 따르면, CMT는 (1) 38 m/s 이하의 정중 운동 신경 전도속도를 나타내는 탈수초성 CMT1; (2) 38 m/s 이상의 정중 운동 신경 전도속도를 나타내는 축삭형 CMT2; 및 (3) 25 내지 45 m/s 사이의 정중 운동 신경 전도속도를 나타내고, 축삭 및/또는 탈수초성 특징을 보이는 신경 병리를 나타내는 중간형 IntCMT로 분류할 수 있다.
상기 CMT의 발생빈도는 2500 명당 한 명으로 유전되는 희귀질환 가운데 높은 빈도를 보인다. CMT 환자들은 발과 손의 근육들이 점점 위축되어 힘이 약해지며, 발 모양과 손 모양이 변형되거나 안면 마비 및 청력장애 등이 발생한다. 발병은 주로 10 세 전후에 일어나나 드물게는 30 대 이후에도 일어난다. 환자들의 증상은 유전자 돌연변이의 종류에 따라 거의 정상에 가까운 가벼운 상태에서부터 아주 심하여 보행에 도움이 필요하거나 또는 휠체어에 의존해야 하는 정도까지 다양하다.
CMT 치료를 위한 약물들 가운데 프로게스테론 수용체의 길항제인 오나프리스톤(onapristone)을 투여한 형질전환마우스에서 PMP22 mRNA의 과발현을 감소시키고 부작용이 없이 유전 운동감각신경병의 표현형을 호전시킨 보고가 있었고, 말초신경에서 수초형성에 필수적인 물질인 아스코르빈산(ascorbic acid)은 CMT1A 형질전환 마우스에서 수초 재형성 및 유전 운동감각신경병의 표현형을 개선하였고, 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3)은 CMT1A 환자군에서 수초화된 신경섬유를 증가시켜 감각 증상 개선효과를 나타냈다고 보고되었다. 따라서, CMT의 정확한 유전적 진단에 따라 발병의 억제 및 유전적 원인에 적합한 맞춤 치료가 가능하게 되었으나, 아직까지 효율적인 유전성 신경 질환의 진단 방법 개발은 미흡한 실정이다. 유전적으로 매우 이질적인 특성을 가진 운동감각신경병의 맞춤 치료를 위하여 먼저 정확한 유전적 진단법의 확립이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 CMT2의 발병 원인을 규명하고자 예의 연구 노력한 결과, 기존에 보고되지 않은 신규한 돌연변이 유전자를 규명하였으며, 상기 돌연변이 유전자가 CMT2의 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Harding et al., Brain 103:259-280 (1980)
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 MORC2 단백질 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 샤르코-마리-투스병 제2형(CMT2)의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 CMT2의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 CMT2를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 MORC2 단백질 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 MORC2 단백질 변이체는 분리된 MORC2 단백질 변이체일 수 있다.
상기 MORC2 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 따라서, 상기 MORC2 단백질 변이체는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되어 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 MORC2 단백질 변이체일 수 있다.
상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 MORC2 유전자 변이체일 수 있다.
MORC2(MORC family CW -type zinc finger 2) 유전자는 NCBI Accession number NM_014941.3으로 등록된 유전자일 수 있고, 예를 들어 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 유전자일 수 있다. MORC2는 DNA-의존적 ATPase를 암호화하는 것일 수 있고, 이는 DNA 복구, 전사 조절 및 크로마틴 리모델링과 같은 많은 생물학적 기능, 및 지질 항상성에 관련된 것일 수 있다.
MORC2 단백질은 상기 MORC2 유전자로부터 코딩되는 단백질로서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다.
용어, "MORC2 단백질 변이체"란 서열번호 1로 표시되는 MORC2 단백질의 아미노산 서열 일부에 변이가 일어난 것을 의미한다. 구체적으로, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 MORC2 유전자 변이체로부터 코딩되는 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 70번 위치인 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환(p.Arg70Leu 또는 p.R70L)된 MORC2 단백질 변이체일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치인 아르기닌(R)은 척추동물 사이에서 종간 보존이 매우 잘 되어 있는 서열 위치일 수 있다.
용어, "MORC2 유전자 변이체"란 서열번호 2로 표시되는 MORC2 유전자의 뉴클레오티드 서열 일부에 변이가 일어난 것을 의미한다. 구체적으로, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환(c.209G>T)된 MORC2 유전자 변이체일 수 있다.
상기 MORC2 유전자 변이체는 MORC2 유전자의 점 돌연변이(point mutation), 구체적으로 미스센스 돌연변이(missense mutation)에 의해 생성된 것일 수 있다.
상기 MORC2 유전자 변이체는 드 노보(de novo) 돌연변이에 의해 생성된 것일 수 있다.
용어, "드 노보 돌연변이"란 부모로부터 물려받지 않고 새롭게 발생된 돌연변이를 의미한다. 따라서, 상기 MORC2 유전자 변이체는 부모로부터 물려받은 것이 아니라 샤르코-마리-투스병 제2형 환자에게서 새롭게 발생된 돌연변이에 의해 생성된 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 MORC2 단백질 변이체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 MORC2 유전자 변이체는 샤르코-마리-투스병 제2형의 진단 마커일 수 있다.
따라서, 상기 MORC2 단백질 변이체의 R70L 변이 부위 또는 상기 MORC2 유전자 변이체의 209G>T 변이 부위는 샤르코-마리-투스병 제2형의 진단을 위한 돌연변이 마커일 수 있다.
샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease: CMT)은 손과 발의 말초신경 발달에 관여하는 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 유전성 질병으로서, 발병 유형에 따라 신경 수초 이상과 관련이 있는 제1형, 축삭돌기 이상과 관련이 있는 제2형, 그리고 제1형과 제2형이 복합적으로 나타나는 제3형과 제4형, X 염색체와 관련된 X형으로 분류될 수 있다.
샤르코-마리-투스병 제2형(Charcot-Marie-Tooth disease type 2: CMT2)은 상염색체 우성 질병이며, 신경전도속도는 정상에 가까우면서 운동감각신경의 활동전위가 많이 저하된 축삭형 신경병증(axonal neuropathy)이다. CMT2는 유전자 변이 등이 보고된 순서에 따라 2A, 2B, 2C 등 차례로 명명되었다. 구체적으로, 상기 MORC2 단백질 변이체 또는 MORC2 유전자 변이체는 CMT2Z의 진단 마커일 수 있다.
용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "CMT2의 진단"이란 CMT2의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병의 위험을 예측하는 것을 의미할 수 있다.
용어, "진단 마커(diagnosis marker)"는 상기 CMT2의 발병 여부 또는 발병 가능성을 진단할 수 있는 물질을 의미할 수 있다.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정할 수 있다. 유의성 있는 진단 마커란 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고, 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미할 수 있다. 상기 진단 마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 MORC2 단백질 변이체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 MORC2 유전자 변이체는 CMT2 환자에서만 검출이 되고, 정상인 대조군에서는 검출될 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커이다. 따라서 상기 변이체의 존재 여부를 검출하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는, CMT2의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 CMT2는 CMT2Z일 수 있다.
용어, "단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 단백질을 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.
상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 R70L 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제일 수 있다.
용어, "단백질의 R70L 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 단백질의 R70L 변이 부위를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.
상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 MORC2 단백질 변이체, 예를 들어 MORC2 변이체의 R70L 변이 부위를 타겟(target)으로 하는 특정 화합물 또는 합성 물질일 수 있고, 보다 구체적으로 MORC2 단백질 변이체에 특이적인 항체일 수 있고, 보다 더 구체적으로 서열번호 1의 단백질의 70번 위치인 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 MORC2 단백질 변이체에 특이적인 항체일 수 있으나, 그 종류가 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 상기 MORC2 단백질 변이체에 특이적인 항체는, MORC2 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 MORC2 단백질 변이체를 얻고, 얻어진 MORC2 단백질 변이체로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 MORC2 단백질 변이체에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함될 수 있고, 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 나아가, 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다.
다중클론 항체는 상기한 MORC2 단백질 변이체 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다중클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단일클론 항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6: 511-519, 1976), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature 352: 624-628, 1991; Marks et al, J Mol Biol 222(58): 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
상기 MORC2 단백질 변이체를 검출할 수 있는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
용어, "폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제일 수 있다.
용어, "폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 MORC2 유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있고, 구체적으로 MORC2 유전자 변이체의 209G>T 변이 부위에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있고, 보다 구체적으로 MORC2 유전자 변이체의 209G>T 변이 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있으나, 그 종류가 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 209번 위치인 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것일 수 있다.
상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 통상의 기술자가 MORC2 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인할 수 있다.
용어, "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, MORC2 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열 부위의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 CMT2를 진단할 수 있다.
용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, MORC2 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 CMT2를 진단할 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phospharamidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한하지 않는다.
용어, "안티센스 핵산"은 타겟으로 하는 MORC2 유전자 변이체에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 MORC2 유전자 변이체와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, MORC2 유전자 변이체를 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 안티센스 핵산은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 이들에 상보적인 것일 수 있다. 상기 단편은 5개 이상, 구체적으로 10개 이상, 보다 구체적으로 10개 내지 1000개, 보다 더 구체적으로 10개 내지 500개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 500개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 300개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 200개, 보다 더 구체적으로 15개 내지 150개의 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 CMT2의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 검사 대상에게서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출함으로써 CMT2의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단할 수 있다.
구체적으로, 상기 키트는 검사 대상에게서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 R70L 변이 부위, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출함으로써 CMT2의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단할 수 있다.
상기 키트에는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 특이적으로 인지하는 항체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산이 포함될 수 있고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적으로, 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
상기 RT-PCR 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출하기 위하여 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함할 수 있다. RT-PCR 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 마이크로어레이 칩은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위의 존재 여부를 검출하여 CMT2의 발병 가능성을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위에 대한 프로브를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, DNA 마이크로어레이는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법에 의해 상기 209G>T 변이 부위에 대한 프로브를 기판 상에 고정화시킬 수 있다. 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
상기 단백질 칩 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 발현수준을 측정할 수 있다. 단백질 칩 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
다른 양상은 CMT2를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다.
용어, "개체"는 CMT2의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병 위험도를 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 보다 구체적으로 포유동물일 수 있으며, 예를 들어 인간(Homo sapiens)일 수 있다.
용어, "생물학적 시료"는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질은 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 R70L 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것일 수 있다.
상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질을 검출하는 분석법은 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 효소면역흡착법(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역분석법(radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation Assay), 보체고정분석(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter: FACS), 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 분석법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에서, 개체로부터 분리한 생물학적 시료에 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 R70L 변이 부위, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위가 존재할 경우, CMT2가 발병되었거나 또는 발병 위험이 있는 것으로 진단할 수 있다.
일 양상에 따른 MORC2 단백질 변이체 또는 MORC2 유전자 변이체는 샤르코-마리-투스병 제2형을 진단하기 위한 마커로서 이용할 수 있다. 상기 MORC2 유전자 변이체를 이용한 진단은 유전성이 강하면서도 단일 유전자 결함에 의해 발병하는 샤르코-마리-투스병에 대하여 유전자 검사를 통한 정확한 조기진단을 가능하게 하며, 그에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 CMT2가 발병된 4명의 환자를 포함하는 한국인 4 가족 즉, FC171, FC288, FC456 및 FC664의 가계도이다.
도 2는 정상인(상단)과 CMT2 환자(하단)에서 세 가지 MORC2 변이 위치 즉, c.74C>T, c.209G>T 및 c.568C>T를 포함하는 염기서열 크로마토그램이다.
도 3은 척추동물 종인 인간(Homo sapiens; NP_055756.1), 집쥐(Rattus norvegicus; XP_006251260.1), 개(Canis lupus familiaris; XP_013963294.1) 소(Bos Taurus; NP_001193480.1), 닭(Gallus gallus; XP_015130866.1), 제노푸스(Xenopus tropicalis; NP_001076826.1), 제브라피쉬(Danio rerio; NP_001003994.1)에서 MORC2 돌연변이 부위와 주변 아미노산 서열의 보존 분석 결과이다.
도 4는 MORC2 돌연변이 부위 c.74C(p.25S), c.209G(p.70R) 및 c.568(p.190R)를 포함하는 주변 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다.
도 5는 MORC2 변이를 갖는 CMT2 환자에서 허벅지 및 종아리의 축면 MRI 촬영 결과를 나타낸 도이다: (A) p.S25L 변이를 갖는 환자 FC288이 3세일 때, 허벅지의 MRI 촬영 결과; (B) p.S25L 변이를 갖는 환자 FC288이 3세일 때, 종아리의 MRI 촬영 결과; (C) p.S25L 변이를 갖는 환자 FC288이 10세일 때, 허벅지의 MRI 촬영 결과; (D) p.S25L 변이를 갖는 환자 FC288이 10세일 때, 종아리의 MRI 촬영 결과; (E) p.R190W 변이를 갖는 환자 FC456이 19세일 때, 허벅지의 MRI 촬영 결과; 및 (F) p.R190W 변이를 갖는 환자 FC456이 19세일 때, 종아리의 MRI 촬영 결과.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1 . CMT2의 원인 돌연변이의 동정
1. 환자의 선별
PMP22 유전자 17p12 중복/결실이 동정되지 않았으며 서로 혈연관계가 없는 한국인 CMT2 152가족을 선별하여, 각 가족의 발단자(proband)를 대상으로 전체 엑솜 시퀀싱(whole exome sequencing: WES)을 수행하였다. 그 중, MORC2 유전자의 돌연변이가 유전적 원인으로 예상되는 4명의 환자를 포함하는 한국인 4가족 총 29명을 선별하였다. 또한, 300명의 건강한 개인을 대조군으로 모집하였다.
2. 전체 엑솜 시퀀싱 및 CMT2 원인 돌연변이의 동정
CMT2 환자에서 CMT2의 원인 돌연변이를 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, QIAamp 혈액 DNA 정제 키트 (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 실험 개체로부터 말초 혈액 DNA를 분리하였다. 전체 엑솜 시퀀싱(Whole exome sequencing: WES)은 효율적인 분자 진단 도구로서 최근에 유전말초신경병증에 도입되었다. WES는 SeqCap EZ 인간 엑솜 라이브러리 버전 3.0 (Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI, USA) 및 HiSeq 2000 게놈 분석기 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 Choi BO 등의 논문(Hum. Mutat. 33: 1610-1615, 2012)에서 설명된 방법에 따라 실시예 1의 1절에서 선별된 환자에 대해 수행하였다. UCSC 어셈블리 hg19 (NCBI build 37.1)을 레퍼런스(reference) 서열로서 사용하였다. 그리고, 기능적으로 유의미한 변이체 즉, 미스센스, 넌센스, 엑손의 삽입-결실 및 스플라이싱 부위 변이체를 선별하였고, 선별된 변이체를 dbSNP142 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), 1,000 게놈 프로젝트 데이터베이스(http://www.1000genomes.org/) 및 엑솜 변이체 프로젝트(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)와 비교하였다.
후보 원인 변이체는 ABI3130XL 유전 분석기(Applied Biosystem; Termo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 확인하였다. 유전자형-표현형 상관관계도 후보 변이체를 판단하기 위해 고려되었다. 유전자 진화율 프로파일링(genomic evolutionary rate profiling: GERP) 점수는 GERP++ 프로그램 (http://mendel.stanford.edu/SidowLab/down-loads/gerp/index.html)에 의해 결정되었다. 인 실리코(in silico) 분석은 SIFT(http://sift.jcvi.org), MUpro(http://www.ics.uci.edu/~baldig/mutation), 및 PolyPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)의 예측 알고리즘을 사용하여 수행하였다.
전체 엑솜 시퀀싱 결과로부터 4가족에서 3개의 MORC2 유전자 돌연변이를 근본 원인으로서 확인하였다. 즉, FC171 및 FC288 가계에서 p.S25L (c.74C>T) 변이를 확인하였고, FC456 가계에서 p.R70L (c.209G>T) 변이를 확인하였으며, FC664 가계에서 p.R190W (c.568C>T) 변이를 확인하였다. 또한, 상기 돌연변이는 한국인 대조군 300명과 글로벌 데이터베이스, 예를 들어 dbSNP146, 1000 게놈 프로젝트, 엑솜 시퀀싱 프로젝트 및 Exome Aggregation Consortium (ExAC)에 알려지지 않은 신규한 것임을 확인하였다. 상기 세 돌연변이 중 p.R70L은 기존에 보고되지 않은 돌연변이인 반면, p.S25L 및 p.R190W는 Sevilla 등의 논문에 보고된 것과 동일하였다.
표 1은 CMT2의 원인 돌연변이로서 MORC2 유전자 돌연변이 세 종류의 분석 결과를 나타낸 표이다.
가족 변이 한국인 대조군
(n=300)		 dbSNP146 1000G ExAC ESP 인 실리코 분석 GERP
뉴클레오티드 아미노산 PP2 Mu
FC171, FC288 c.74C>T p.S25L 0.00000 0.00000 0.000000 0.000000 0.00000 1 0.7891 5.62
FC664 c.209G>T p.R70L 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.975 0.1938 4.13
FC456 c.568C>T p.R190W 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 1 -0.9109 2.13
* 한국인 대조군, dbSNP146, 1000G, ExAC, ESP의 경우, 돌연변이 발생 빈도를 나타냄
* 인 실리코 분석의 경우, PP2: Polyphen2 (신뢰 점수 0>1); Mu: MUpro (-, 단백질 안정성의 감소; +, 단백질 안정성의 증가)
* GERP: 유전자 진화율 프로파일링 점수(Genomic evolutionary rate profiling scores)
이 세 개의 병원성 돌연변이에 더하여, 전체-엑솜 시퀀싱 결과로부터 MORC2 유전자에서 몇 개의 비유사 변이체 (p.E101D, p.N147S, p.K172N 및 p.R831H)를 확인하였다. 그러나, 이들은 다형성이거나 드문 개인 변이체로 판단되어 제외하였다.
표 2는 MORC2 유전자에서 비유사 변이체 p.E101D, p.N147S, p.K172N 및 p.R831H에 대한 분석 결과를 나타낸 표이다.
분류 변이 AA 변이 dsSNP146 1000G ESP ExAC 비고
Likely benign c.303G>T p.E101D rs186458188 0.0014 0.0000 0.0006 드문 다형성 변이체
Likely benign c.440A>G p.N147S rs76273991 0.0088 0.0000 0.0025 드문 다형성 변이체
Likely benign c.516G>T p.K172N 보고되지 않음 0.0000 0.0000 0.0000 발병 구성원과 함께 분리되지 않음
Likely benign c.2492G>A p.R831H rs202243108 0.0002 0.0000 0.0001 드문 다형성 변이체
* dbSNP146, 1000G, ExAC, ESP의 경우, 돌연변이 발생 빈도를 나타냄
도 1은 CMT2가 발병된 4명의 환자를 포함하는 한국인 4 가족 즉, FC171, FC288, FC456 및 FC664의 가계도이다.
도 2는 정상인(상단)과 CMT2 환자(하단)에서 세 가지 MORC2 변이 위치 즉, c.74C>T, c.209G>T 및 c.568C>T를 포함하는 염기서열 크로마토그램이다.
도 3은 척추동물 종인 인간(Homo sapiens; NP_055756.1), 집쥐(Rattus norvegicus; XP_006251260.1), 개(Canis lupus familiaris; XP_013963294.1) 소(Bos Taurus; NP_001193480.1), 닭(Gallus gallus; XP_015130866.1), 제노푸스(Xenopus tropicalis; NP_001076826.1), 제브라피쉬(Danio rerio; NP_001003994.1)에서 MORC2 돌연변이 부위와 주변 아미노산 서열의 보존 분석 결과이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 돌연변이 부위 주변의 아미노산 서열은 서로 다른 척추동물 종 간에 매우 잘 보존되어 있었다. 또한, 상기 세 돌연변이는 매우 보존된 히스티딘 키나아제-유사 ATPase(histidine kinase-like ATPase: HATPase) 도메인 또는 이 영역 가까이에 위치하였다.
한편, MORC2 돌연변이는 높은 비율의 드 노보(de novo) 발생을 나타내었다. 즉, CMT2를 앓고 있지 않은 부모 또는 다른 가족 구성원에서는 돌연변이가 발견되지 않으나, CMT2를 앓고 있는 환자에게서만 돌연변이가 발생하였음을 나타낸다. CMT2 4가족에 대하여 부모를 테스트 해본 결과, FC171, FC288 및 FC456 3가족에서 드 노보(de novo) 발생을 확인하였고, 또한 나머지 1가족인 FC664에서 부모에게 컨디션을 질문하는 것에 의하여 드 노보(de novo) 발생이 추정적으로 암시되었다.
유사하게, 기존 연구는 CMT2Z 3가족 중 2가족을 드 노보(de novo) 사례로 보고하였다 (Sevila et al., Brain 139: 62-72, 2016). 또한, 호주인 CMT2Z 가족에 대한 최근 보고는 5가족으로부터 3가족이 드 노보(de novo)로 여겨졌음을 제안하였다 (Albulym et al., Ann. Neurol. 79: 419-27, 2016). 종합하면, CMT2Z 원인 돌연변이의 드 노보(de novo) 비율은 75%까지 도달할 수 있다. 이는 다른 CMT 유전자의 드 노보(de novo) 비율과 비교하여 특별히 높은 비율인데, 예를 들어 GJB1에서 10% 이하, MFN2에서 20-30%로 보고되어있다 (Choi et al., Clin. Genet. 87: 594-8, 2015).
도 4는 MORC2 돌연변이 부위 c.74C(p.25S), c.209G(p.70R) 및 c.568(p.190R)를 포함하는 주변 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 세 돌연변이는 CpG 디뉴클레오티드 서열 내 시토신 잔기에서 정방향 (c.74C 및 c.568C) 또는 역방향 (c.209G) 상보 가닥에서 일어났다. 드 노보(De novo) 발생은 반복되는 돌연변이와 관련이 있는데, 그 이유는 CpG 시토신의 상당 부분이 메틸화되어 5-메틸시토신 (5mC)를 형성하고, 자발적인 아미노기 이탈 때문에 변이하기 쉽기 때문이다 (Cooper and Youssoufian, Hum. Genet. 78:151-5, 1988; Kennerson et al., J. Peripher. Nerv. Syst. 21: 45-51, 2016).
실시예 2. CMT2 환자의 임상 징후 및 전기생리학적 평가
CMT2 환자가 가지는 임상 징후 및 전기생리학적 특징을 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, 실시예 1의 1절에서 선별된 4명의 CMT2 환자, FC171, FC288, FC456 및 FC664에 대해 운동 및 감각 장애, 심부 반사(deep tendon reflexes) 및 근위축을 확인하였다. 의학연구심의회(medical research council: MRC)의 등급으로 굴근(flexor)과 신근(extensor)의 강도를 수동으로 측정하였다(Paternostro-Sluga et al., J. Rehabil. Med. 40:665-671, 2008). 지체 장애는 기능 장애 등급법(functional disability scale: FDS) 및 CMT 신경병증 점수(CMT neuropathy score; CMTNS)를 사용하여 평가하였다. 감각 장애는 통증, 온도, 진동 및 위치의 수준 및 심각도의 측면에서 측정하였다.
또한, 신경 전도 검사는 환자의 모든 사지에 대해 수행하였다(메드트로닉 키포인트 4; Medtronic Inc., Minneapolis, MN, USA). 정중신경 및 척골신경의 운동신경 전도속도(motor nerve conduction velocities: MNCVs)는 팔꿈치 또는 손목에서의 자극에 의해 측정하면서, 단무지외전근(abductor pollicis brevis) 및 소지내전근(adductor digiti quinti) 각각에 대한 복합근 활동전위 (compound muscle action potentials: CMAPs)를 기록하였다. 유사하게, 비골신경 및 경골신경의 MNCVs는 무릎 및 발목의 자극에 의해 측정하면서, 짧은발가락폄근(extensor digitorum brevis) 및 엄지발가락 내전근(adductor hallucis) 각각에 대한 CMAPs를 기록하였다. CMAP 진폭은 기준선부터 음성 피크 값까지를 측정하였다. 감각신경 전도속도는 순방향 스코어링(orthodromic scoring)에 의해 정중신경 및 척골신경으로부터 손가락-손목 부분에 대해 측정하였고, 또한 비복신경에 대해 기록하였다. 감각신경 활동전위(sensory nerve action potential: SNAP) 진폭은 양성 피크로부터 음성 피크까지를 측정하였다.
표 3은 CMT2 환자인 FC171, FC288, FC456 및 FC664의 임상적 특징 및 전기생리학적 평과 결과를 나타낸 표이다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 환자들의 전체적인 임상 징후는 보고된 스페인 환자의 임상 징후와 유사하였다.
p.R190W 돌연변이를 갖는 한국인 및 스페인 환자 사이의 임상적 특징은 발병 연령, 하지에서 경련과 같이 가장 빈번한 초기 증상, 초기 평가 동안 말단 하지 약화 및 감각 손실, 및 경부 굴곡 약화, 무반사증 및 요족을 포함하는 근위 관여의 표현형에서 거의 동일하게 나타났다.
p.R70L 돌연변이를 갖는 환자는 p.R190W 돌연변이를 갖는 환자와 유사한 임상 징후를 가졌다. 발병 연령은 20년 내였고, 그리고 경련, 취수(claw hands), 청력 상실 및 경부 굴곡 약화는 두 환자들에서 모두 관찰되었다. 진동각(vibration sense)은 통각(pain sense)보다 심각하게 불안정하였고, 무반사증이 이 질병의 매우 초기 단계에서 관찰되었다.
또한, p.S25L 돌연변이를 갖는 모든 세 환자들은 (한 환자는 스페인, 두 환자는 한국인) 매우 유사한 임상적 특징을 가졌다. 그들은 모두 정상 임신과 출산 후 출생 시 근긴장 저하 및 근육 약화를 가지는 것으로 나타났다. 모든 세 명의 산발적인 환자는 선천적 또는 소아 발병 발달된 근긴장 저하, 전반적인 약화 및 발달 지연을 나타내었다. 그들은 소모성의 상지 및 하지를 가졌고, 삼각근(deltoid) 및 엉덩이 굴근(hip flexors)의 근위부 약화가 있었다. 초기에, 척수성근위축(spinal muscular atrophy)이 있는 것으로 진단되었으나, 신경 전도 시험에서 명백히 수반되는 감각 장애를 나타내었다. 감각신경활성전위(sensory nerve action potentials: SNAPs)는 진폭이 낮거나 얻을 수 없었고, 비복신경(sural nerves)의 SNAPs는 질병의 초기 단계에 손실되었다.
환자 (성별) FC171 (M) FC288 (F) FC456 (M) FC664 (M)
아미노산 변경 p.S25L p.S25L p.R190W p.R70L
시험 연령 13세 10세 19세 30세
발병 연령 9개월 6개월 11세 14세
발병 증상 전반적인 근육긴장저하 전반적인 근육긴장저하 원위근육 약화 원위근육 약화
근육 약화 (U/L)a +++/+++ +++/+++ +/++ +/++
감각 손실 Yes Yes Yes Yes
심부반사소실 없음 없음 없음 없음
다른 특징 발달 지연, 척추측만증 발달 지연, 백내장, 척추측만증, 이형증의 얼굴 청력 손실, 목 약화, 척추측만증, VEP 비정상 청력 손실, 목 약화
기능적 상태 전동 휠체어, 취수 전동 휠체어, 취수 경련, 취수, 발뒤꿈치로 설 수 없음 경련, 취수, 발뒤꿈치로 설 수 없음
FDS 7 7 3 3
CMTNS 28 32 15 14
뇌 MRI 정상 정상 정상 ND
아랫다리 MRI ND 두드러진 가자미근(soleus muscle) 관여 두드러진 전경골근(tibialis anterior) 및 비골근(peronei muscles) 관여 ND
운동신경전도시험 (CMAP/MNCV)
정중신경 (mV/m/s) 0.4/38.5 1.6/40.6 1.9/46.5 7.5/48.7
척골신경 (mV/m/s) 0.2/38.5 0.8/44.8 5.6/53.7 6.2/46.3
비골신경 (mV/m/s) 0.6/24.9 0.3/31.0 1.1/36.3 1.1/36.4
감각신경전도시험 (SNAP/SNCV)
정중신경 (μV/m/s) 5.6/32.4 A/A A/A 10.1/27.9
척골신경 (μV/m/s) 10.8/24.5 A/A A/A 12.4/25.3
비복신경 (μV/m/s) A/A A/A A/A A/A
A, 없음(absent);
CMAP, 복합근 활동전위(compound muscle action potential);
CMTNS, 샤르코-마리-투스 신경병증 점수(CMT neuropathy score);
F, 여성(female);
FDS, 기능 장애 등급법(functional disability scale);
M, 남성(male);
MNCV, 운동신경전도속도(motor nerve conduction velocity);
ND, 수행하지 않음(not done);
SNAP, 감각신경활동전위(sensory nerve action potential);
SNCV, 감각신경전도속도(sensory nerve conduction velocity);
VEP, 시각 유발 전위(visual evoked potential);
a 하지의 근육 약화 (L): ++ = MRC 등급에서 발목 배굴(ankle dorsiflexion) <4/5, +++ = 근위부 약화 및 휠체어 의존 / 상지의 근육 약화 (U): + = MRC 등급에서 본질적인 손의 약화 4/5, ++ = MRC 등급에서 본질적인 손의 약화 <4/5, +++ = 근위부 약화;
정상 NCV 값 (m/s)= 운동 정중신경 > 50.5, 척골신경 > 51.1, 비골신경 > 41.3, 감각 정중신경 > 39.3, 척골신경 > 37.5, 비골신경 > 32.1;
정상 진폭 값 (mV)= 운동 정중신경 > 6, 척골신경 > 8, 비골신경 > 1.6, 감각 정중신경(μV) > 8.8, 척골신경 > 7.9, 비복신경 > 6.0.
실시예 3. CMT2 환자 다리 근육의 지방 대체(fatty replacement)의 확인
CMT2 환자의 근육이 지방으로 대체되는 소견을 확인하기 위하여, CMT2 환자의 허벅지(thigh) 및 종아리(calf)의 자기공명영상(magnetic resonance imaging: MRI) 촬영을 수행하였다.
구체적으로, 위상-배열 멀티-코일(phase-array multi-coil)이 구비된 1.5-T 시스템 (Siemens Vision, Siemens, Germany)을 사용하여 두 명의 발병된 개인(FC416 II-2 및 FC829 II-1)의 허벅지 및 종아리를 MRI 촬영하였다. 다리 MRI는 축면 [시야(field of view: FOV), 24-32 cm; 단면 두께, 10 mm; 단면 간격, 0.5-1.0 mm] 및 관상면 [FOV, 38-40 cm; 단면 두께, 4-5 mm; 단면 간격, 0.5-1.0 mm]에서 수행하였다. T1-강조 스핀-에코(spin-echo: SE) (TR/TE 570-650/14-20, 512 매트릭스), T2-강조 SE (TR/TE 2800-4000/96-99, 512 매트릭스) 및 지방-억제(fat-suppressed) T2-강조 SE (TR/TE 3090-4900/85-99, 512 매트릭스)의 프로토콜을 사용하였다.
도 5는 MORC2 변이를 갖는 CMT2 환자에서 허벅지 및 종아리의 축면 MRI 촬영 결과를 나타낸 도이다: (A) p.S25L 변이를 갖는 환자 FC288이 3세일 때, 허벅지의 MRI 촬영 결과; (B) p.S25L 변이를 갖는 환자 FC288이 3세일 때, 종아리의 MRI 촬영 결과; (C) p.S25L 변이를 갖는 환자 FC288이 10세일 때, 허벅지의 MRI 촬영 결과; (D) p.S25L 변이를 갖는 환자 FC288이 10세일 때, 종아리의 MRI 촬영 결과; (E) p.R190W 변이를 갖는 환자 FC456이 19세일 때, 허벅지의 MRI 촬영 결과; 및 (F) p.R190W 변이를 갖는 환자 FC456이 19세일 때, 종아리의 MRI 촬영 결과.
도 5에 나타낸 바와 같이, 환자 FC288/II-1 및 FC464/II-2에 대해 하지 MRI를 수행한 결과, 허벅지 근육과 비교하여 종아리 근육에서 심각한 초강력성 신호(hyperintense signal) 변화를 볼 수 있었는데, 이는 길이-의존적 축삭변성 이론과 일치하였다.
또한, 환자 FC288의 3세 및 10세 때 수행한 추적 MRI 시험에서, 질병 기간과 연관된 순차적인 패턴의 근육 관여(muscle involvement)를 관찰할 수 있었다. 가자미근에서 관여가 처음으로 나타냈으나, 전경골근 및 비골근은 상대적으로 남아있었다. 허벅지 수준에서, 대퇴사두근의 경도와 중등도 사이(mild-to-moderate)의 관여가 있었으나, 내전근 그룹에서는 후기 단계까지 보존되었다.
p.R190W 돌연변이를 갖는 FC456 환자에서, 양측 심부 후방 구획 근육의 보존이 있었고, 이는 보고된 스페인 환자와 일치하였다(Sevilla et al., 2016). 이 FC456 환자는 전경골근 및 비골근이 현저하게 지방으로 대체되었으나, 가자미근은 경도와 중등도 사이의 지방 대체를 보여주었다.
본 실시예에 따른 환자와 기존에 보고된 스페인 환자의 하지 MRI 시험 결과를 종합하면, p.S25L 돌연변이를 갖는 환자는 가자미근에서 처음에 지방 관여를 보여주는 반면, p.R190W 돌연변이를 갖는 환자는 전경골근에서 두드러진 지방 대체를 보여주었다. 근육 관여의 순서 패턴은 p.S256L 및 p.R190W 돌연변이 사이에 구별되었는데, 이는 비대립유전자간 임상적 이질성을 나타내는 것이다.
<110> Samsung Life Public Welfare Foundation KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> MORC2 as a causative gene of Charcot-Marie-Tooth disease type 1 and method for diagnosing the disease using the same <130> PN115306KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 970 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Cys Phe Leu Asp Asp Gly Ala Gly Met Asp Pro Ser Asp Ala 1 5 10 15 Ala Ser Val Ile Gln Phe Gly Lys Ser Ala Lys Arg Thr Pro Glu Ser 20 25 30 Thr Gln Ile Gly Gln Tyr Gly Asn Gly Leu Lys Ser Gly Ser Met Arg 35 40 45 Ile Gly Lys Asp Phe Ile Leu Phe Thr Lys Lys Glu Asp Thr Met Thr 50 55 60 Cys Leu Phe Leu Ser Arg Thr Phe His Glu Glu Glu Gly Ile Asp Glu 65 70 75 80 Val Ile Val Pro Leu Pro Thr Trp Asn Ala Arg Thr Arg Glu Pro Val 85 90 95 Thr Asp Asn Val Glu Lys Phe Ala Ile Glu Thr Glu Leu Ile Tyr Lys 100 105 110 Tyr Ser Pro Phe Arg Thr Glu Glu Glu Val Met Thr Gln Phe Met Lys 115 120 125 Ile Pro Gly Asp Ser Gly Thr Leu Val Ile Ile Phe Asn Leu Lys Leu 130 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DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgctttgct ttttggatga tggagcagga atggatccaa gtgatgctgc cagtgtgatc 60 cagtttggga agtcggccaa gcgaacacct gagtctactc agattgggca gtacgggaat 120 gggttaaaat cgggctcaat gcgcattggg aaggatttta tcctgttcac caagaaggaa 180 gacaccatga cctgcctctt cctgtctcgc acgtttcatg aggaagaagg cattgatgaa 240 gtgatagtcc cactgcccac ctggaatgct cggacccggg aacctgtcac agacaatgta 300 gagaaatttg ccattgagac agaactcatc tataagtact ctccattccg cactgaggag 360 gaagtgatga cccagtttat gaagattcct ggggacagcg gaacattggt gatcatcttc 420 aatctcaaac tcatggataa tggagagcca gaactagaca taatctcaaa tccaagagat 480 atccagatgg cagagacgtc cccagagggc acgaagccag agcggcgctc gttccgtgcc 540 tatgccgctg tgctctatat tgatccccgg atgaggatct tcatccatgg gcacaaggtg 600 cagaccaaga ggctctcctg ctgcctgtac aagcccagga tgtacaagta cacgtcaagc 660 cgtttcaaga cccgtgcgga gcaggaggtg aagaaagcag agcacgtagc aaggattgct 720 gaagagaagg cgcgggaggc agagagcaaa gctcggacat tagaagtacg cctaggtgga 780 gacctcacgc gggactccag ggtgatgttg cgacaggtcc agaacagagc 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Claims (20)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 MORC2 단백질 변이체.
  2. 청구항 1에 따른 MORC2 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 청구항 2에 있어서, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는,
    샤르코-마리-투스병 제2형(Charcot-Marie-Tooth disease type 2: CMT2)의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 R70L 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것인 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체인 것인 조성물.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것인 조성물.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산인 것인 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 안티센스 핵산은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 이들에 상보적인 것인 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 단편은 10개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 것인 조성물.
  11. 청구항 4 내지 10 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 CMT2의 발병 여부 또는 그 발병의 위험을 진단하기 위한 키트.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 키트.
  13. CMT2를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 70번 위치의 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 209번 위치의 구아닌(G)이 티민(T)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 R70L 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것인 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체인 것인 방법.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 단백질을 검출하는 분석법은 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선 면역분석법, 방사선 면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 또는 단백질 칩인 것인 방법.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것인 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 209G>T 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산인 것인 방법.
  20. 청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 분석법은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩인 것인 방법.
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