KR101846732B1

KR101846732B1 - 신경세포 in vitro 배양방법

Info

Publication number: KR101846732B1
Application number: KR1020160146704A
Authority: KR
Inventors: 김종완; 이광호; 현정근; 김민수; 안홍선
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2018-04-06
Anticipated expiration: 2036-11-04

Abstract

본 발명은 in vitro에서 신경세포를 배양하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 장치는 신경재생과 관련된 인자나 약물들을 처리하여 신경성장이나 신경재생에 관련된 효과를 평가하기에 용이한 신경세포를 평면상이 아닌 수직상으로 배양하여 뉴런의 축삭들이 측정 가능한 방향으로 규칙적으로 성장하도록 함으로써, 신경재생 관련 인자 또는 약물의 효과 평가가 정확하게 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 신경도관의 길이는 다양한 크기로 제작이 가능하므로 이에 따른 다양한 길이의 PDMS 장치 및 신경세포 in vitro 배양장치를 준비할 수 있다.

Description

신경세포 in vitro 배양방법{In vitro cultivation method for growing neuron}

본 발명은 in vitro에서 신경세포를 배양하기 위한 방법에 관한 것이다.

말초 신경이 외상에 의해 손상을 입은 경우, 절단된 신경의 절단면을 서로 직접 문합하는 방법이 시행된다. 그러나 대부분의 신경을 정확하게 직접 문합하는 것은 거의 불가능 하며, 직접 문합이 불가능한 경우 그 기능의 회복을 위해서 자가 신경 이식술을 시행하고 있다. 그러나 자가 신경 이식술의 경우 손상부위의 신경 조직과 이식되어지는 신경조직의 굵기와 형태를 일치시키기 어렵다는 단점이 있고, 채취 가능한 신경에도 제한이 있으며, 이식 신경을 채취한 부위에서도 기능의 저하가 일어날 수 있다. 따라서 신경 결손 부위가 생길 경우 그것의 기능을 회복하기 위한 방법으로 신경도관이 사용되고 있다.

신경도관은 결손 된 신경의 양끝을 연결하고 신경 재생의 통로역할을 하는 것으로, 절단된 신경의 양쪽 끝을 신경도관 안에 고정하고 도관의 안으로 신경의 연결을 유도한다. 신경도관을 이용하게 되면 신경 재생에 방해되는 반흔 조직의 침투를 막을 수 있고, 올바른 방향으로 신경 재생의 방향을 유도할 수 있으며, 신경 자체에서 분비되는 신경 재생 촉진물질들이 도관 내에 유지시키고 재생에 방해되는 물질들은 외부로부터 차단될 수 있다는 이점을 가지고 있다.

한편, 배근신경절(dorsal root ganglion, DRG)은 300 내기 500μm의 직경을 갖는 신경세포의 덩어리로 신경재생과 관련된 인자나 약물들을 처리하여 신경성장이나 신경재생에 관련된 효과를 평가하기에 용이하다. 그러나, 도 1에서 보이는 바와 같이 세포 배양접시와 같은 평면상에서 배양할 경우 DRG 뉴런의 축삭들이 측정 불가능한 방향으로 불규칙하게 성장하는 형태를 보이므로 정확한 효과 평가가 어려운 문제점이 있다.

한국공개특허 제10-2014-0050900호

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미세채널과 함께 미세기공 구조를 함께 가지는 다공성 신경도관을 이용하여 in vitro에서 신경세포를 배양하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

삭제

본 발명은 (A) 소수성 용매인 테트라글리콜(TG) 1L에 녹는 소수성 고분자인 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(PLGA)의 중량(g)을 의미하는 PLGA와 TG의 중량/부피 % (w/v %)가 10 내지 40 %인 PLGA-TG 용액을 준비하고, 모세 유리관의 중앙 부위를 가열하여 병목 지점을 만들어 불연속적인 각도로 경사진 상부 채널 및 하부 채널을 형성하되, 하부 채널의 직경은 상부 채널보다 작게 형성하며, 직경이 10 내지 20 ㎛ 인 복수의 수용성 유리섬유를 상기 유리관의 상부 채널 내에 축방향으로 빽빽하게 삽입하고, 상기 유리관의 하부 채널이 상기 PLGA-TG 용액에 잠기도록 한 다음 상기 유리관 내부에 진공을 인가하여 상기 PLGA-TG 용액이 상기 유리섬유 사이의 빈틈에 침투하도록 하며, 상기 PLGA-TG 용액이 침투된 유리섬유를 상기 유리관으로부터 분리하여 초순수수(DW)에 완전히 침지시켜 상기 유리섬유를 용해하여 상기 유리섬유가 용해된 공간에 PLGA가 경화되어 직경이 10 내지 20 ㎛ 인 미세채널이 복수로 형성되도록 하고, 상기 PLGA-TG 용액이 침투된 유리섬유를 DW에 침지하는 과정에서 TG가 DW와 반응하여 상기 미세채널로부터 빠져나오면서 미세채널 내부에 미세기공이 형성되도록 하며, 상기 미세기공이 형성된 미세채널을 액체 질소로 얼린 다음 절단 성형하여 지름이 1.6 내지 1.7 ㎜인 신경도관을 제조하는 신경도관의 제조단계; (B) 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어지는 PDMS 챔버에 상기 신경도관을 삽입하고, 물에 완전히 녹인 아가로스를 냉각시킨 후 상기 PDMS 챔버와 신경도관 사이의 공간에 침투시켜 상기 아가로스가 경화되도록 하여 PDMS 장치를 형성하고, 상기 PDMS 장치의 상부에 멀티채널 연동펌프를 마련한 다음 튜브로 상기 PDMS 장치와 연동펌프를 연결하며, 상기 PDMS 장치의 하부에 배지 공급용기를 연결하는 배양장치 준비단계; (C) 상기 배지 공급용기 내의 배양배지에 신경세포를 투입하는 신경세포 투입단계; (D) 상기 연동펌프를 이용하여 상기 배지 공급용기 내의 배양배지를 상기 신경도관이 삽입된 PDMS 장치로 30 내지 60 ㎕/min의 유속으로 공급하여 직경이 300 내지 500 ㎛ 인 신경세포를 상기 신경도관 상단에 시딩하는 신경세포 시딩단계; 및 (E) 상기 연동펌프를 이용하여 상기 배지 공급용기 내의 배양배지에 신경재생과 관련된 인자 또는 약물을 혼합한 다음 상기 혼합된 배양배지를 상기 신경세포가 시딩된 PDMS 장치로 5 내지 20 ㎕/min의 유속으로 공급하되, 상기 배양배지는 중력에 의해 상기 신경도관의 상단에서 하단으로 흐르게 하여 신경세포의 축삭이 하방으로 자라도록 상기 신경세포를 배양하는 신경세포 배양단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경세포 in vitro 배양방법을 제공한다.
이때, 상기 (B) 단계에서, 상기 배지 공급용기는 필터 캡이 마련된 T-플라스크를 사용함으로써, 공기의 순환은 유지하되 외부로부터 오염되는 것을 방지할 수 있도록 한 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 신경재생과 관련된 인자는, 신경생장인자(nerve growth factor, NGF), 신경영양인자(neurotrophic factor, NTF)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 신경세포 in vitro 배양방법은 상기 신경도관이 삽입되어 있는 장치에 신경세포를 시딩(seeding)하여 배양함으로써 신경세포의 축삭이 신경도관 내부의 미세채널을 따라 성장하는 것일 수 있다.

본 발명은 신경재생과 관련된 인자나 약물들을 처리하여 신경성장이나 신경재생에 관련된 효과를 평가하기에 용이한 신경세포를 평면상이 아닌 수직상으로 배양하여 뉴런의 축삭들이 측정 가능한 방향으로 규칙적으로 성장하도록 함으로써, 신경재생 관련 인자 또는 약물의 효과 평가가 정확하게 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 신경도관의 길이는 다양한 크기로 제작이 가능하므로 이에 따른 다양한 길이의 PDMS 장치 및 신경세포 in vitro 배양장치를 준비할 수 있다.

도 1은 평면상에서 배양한 배근신경절(dorsal root ganglion, DRG)를 나타낸 도이다.
도 2는 PDMS 챔버의 규격(A, B) 및 커버글라스로 덮어 밀폐한 PDMS 장치(C)를 나타낸 도이다.
도 3은 다양한 길이의 신경도관 및 이에 따라 제작된 다양한 길이의 PDMS 챔버를 나타낸 도이다.
도 4는 신경세포 in vitro 배양장치의 모식도(A) 및 배지 공급용기(B)의 사진을 나타낸 도이다.
도 5는 배지 공급용기의 구성을 나타낸 도이다.
도 6은 흰쥐의 척수 절단면과 DRG의 위치 및 형태를 나타낸 도이다.
도 7은 흰쥐의 15일째 배아의 척수로부터 분리한 배근신경절을 나타낸 도이다.
도 8은 DRG 외식편을 시딩(seeding)하는 사진을 나타낸 도이다.
도 9는 펌프를 이용한 DRG 외식편의 시딩 과정을 나타낸 사진 및 모식도이다.
도 10은 DRG 외식편을 신경도관에 시딩하기 위한 장치의 실제 사용예를 나타낸 도이다.
도 11은 3일간의 DRG 외식편 배양 후 SMI-312 항체를 이용하여 축삭을 염색한 사진이다. 스케일바 = (A) 100μm, (B, C) 20μm.

본 발명은 ⅰ) 직경이 10 내지 20 μm인 미세채널을 포함하는 신경도관이 삽입되어 있는 장치; ⅱ) 펌프; 및 ⅲ) 배양배지를 포함하는 배지 공급용기로 구성되는 신경세포 in vitro 배양장치를 제공한다.

상기 신경세포 in vitro 배양장치는 상기 미세채널을 포함하는 신경도관이 삽입되어 있는 장치의 상부에 상기 펌프를 튜브로 연결하고 하부에 상기 배양배지를 포함하는 배지 공급용기를 튜브로 연결하여 상기 펌프를 이용하여 상기 미세채널을 포함하는 신경도관으로 배양배지가 공급되고, 상기 미세채널을 포함하는 신경도관은 수직으로 배치되어 배양배지가 중력에 의해 신경도관의 상단에서 하단으로 흐르는 것일 수 있다.

상기 배양배지는 신경재생 관련 인자 또는 약물을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 신경도관은 ⅰ) 소수성 고분자를 소수성 용매에 용해시켜 신경도관용 고분자 재료를 제조하는 단계; 및 ⅱ) 상기 고분자 재료를 친수성 용액에 침지시켜 상기 소수성 용매를 상기 소수성 고분자 재료로부터 분리시킴으로써 다공성 고분자로 이루어진 신경도관을 제조하는 단계;를 포함하여 제조하며, 상기 고분자 재료는 중량/부피%(w/v%)가 10 내지 40%인 PLGA와 TG로 이루어지고, 상기 PLGA와 TG의 중량/부피%(w/v%)는 TG 1L에 녹는 PLGA의 무게(g)을 의미한다.
또한, 상기 TG는 물에 침지시키는 단계에서 물과 상분리되어 PLGA로부터 분리됨으로써 상기 PLGA에 다공이 형성되는 다공성 신경도관일 수 있다.

용어 "고분자 재료"란, 소수성 고분자를 소수성 용매에 용해시켜 제조하는 것으로, 본 발명에서는 소수성 고분자로 PLGA, 소수성 용매로 TG를 사용하여 제조한 PLGA-TG 용액을 의미한다.

상기 소수성 고분자는 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(polylactic acid-co-glycolic acid, PLGA)이고, 상기 소수성 용매는 테트라글리콜(tetraglycol, TG)일 수 있다. 본 발명에 따라 PLGA와 TG의 혼합 시 PLGA를 TG로 한번 녹인 이후에는 상온에서 용액 상태를 유지하므로 고분자 재료를 다시 녹이는 과정 없이 사용할 수 있는 장점이 있다.

상기 PLGA와 TG의 중량/부피%(w/v%)는 TG 1L에 녹는 PLGA의 무게(g)을 의미하며, 중량/부피%(w/v%)는 10 내지 40%, 보다 바람직하게는 15 내지 25%, 가장 최적으로는 20%일 수 있다. 만약 상기 범위보다 적은 경우, 과도한 TG 사용으로 인하여 기공도가 크게 증가하는 문제가 있고, 그 반대인 경우 충분한 기공 형성이 어려울 수 있다.

삭제

상기 신경도관은 상부 및 하부 채널을 갖는 용기 내에 복수 개의 유리섬유를 삽입하는 단계; 상기 복수 개의 유리섬유가 삽입된 용기 내로 고분자 재료를 주입하는 단계; 상기 채널로부터 진공을 인가하여 상기 유리섬유 사이로 상기 고분자 재료를 침투시키는 단계; 상기 용기로부터 상기 유리섬유를 분리시키는 단계; 및 상기 분리된 유리섬유를 물에 침지시켜 상기 유리섬유를 용해하는 단계;를 포함하여 제조하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 하부 채널은 상부 채널보다 작은 직경을 가지며, 이로써 용기에 주입되는 유리섬유가 용기 내에서 흘러나가지 않고 채워진 상태를 유지할 수 있다.

상기 용기는 불연속적인 각도로 경사진 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 용기는 불연속적인 각도로 경사진 상부 및 하부 채널을 형성한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 불연속적인 각도로 경사진 용기 및 이의 상하부 채널에 의하여, 삽입되는 유리섬유의 간격이 일정하므로 유리섬유가 녹은 공간에 형성되는 미세채널의 간격 또한 일정하다. 즉, 본 발명에 따라 제조되는 신경도관은 일정한 간격의 미세채널을 형성하여, 동일한 방향으로의 신경 재생을 유도할 수 있다.

상기 고분자 재료는 상온에서 용액 상태인 것일 수 있다.

상기 유리섬유를 이용한 신경도관 제조방법은, 상기 유리섬유를 용해하는 단계 후 형성된 신경도관을 액체질소로 냉각시키는 단계; 및 상기 냉각된 신경도관을 절단하여 성형하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 용기는 상기 고분자 용액의 침투가 육안으로 확인될 수 있는 투명 재질로 이루어진 것일 수 있으며, 바람직하게는 유리로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 진공의 인가는 복수 회 반복하여 진행되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 진공은 주사기를 이용하여 유리관 내부에 반복적으로 인가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 신경도관은 유리섬유가 용기의 축방향으로 삽입됨에 따라 신경도관의 축방향으로 미세채널이 형성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 유리섬유를 용기(유리관)의 상부 채널 내에 축방향으로 삽입한 후, 용기 내로 고분자 재료(PLGA-TG 용액)를 주입하고 진공을 인가하여 유리섬유 내로 침투시키고, 용기로부터 분리한 뒤 물(DW)에 침지시킴으로써 유리섬유를 모두 녹여내어, 유리섬유가 녹은 공간에 소수성 고분자(PLGA)로 이루어지는 미세채널을 형성하였다. 즉, 유리섬유를 용기의 축방향으로 삽입한 후 유리섬유를 녹임으로써, 유리섬유가 녹은 공간에 축방향으로 미세채널이 형성된 신경도관을 제조하였다.

용어 "미세채널"이란, 유리섬유가 녹은 공간에 형성되는 10~20μm 크기의 빈 공간을 의미한다.

상기 신경도관은 TG가 물에 용해됨에 따라 신경도관에 미세기공이 형성된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 고분자 재료(PLGA-TG 용액)가 침투된 유리섬유를 물(DW)에 침지하는 과정에서 TG가 물(DW)과 반응(용해)하여 신경도관으로부터 빠져나오면서 미세채널 내부에 미세기공을 형성하였다.

용어 "미세기공"이란, TG가 DW에 용해하여 신경도관으로부터 빠져나오면서 미세채널에 형성하는 미세한 공극을 의미한다. 본 발명에 따라 제조된 신경도관은 생체 내 적용 시 미세채널에 의해 체액 교환이 용이하다. 신경도관으로부터 빠져나온 TG는 DW보다 밀도가 높아(1.09g/ml) DW 아래쪽에 아지랑이 모양으로 가라앉았다.

본 발명의 일실시예에서, 실리콘 튜브를 이용하여 신경도관이 삽입되어 있는 PDMS 장치의 상부 쪽으로 멀티채널 연동펌프(multichannel peristaltic pump)를 연결하고 하부 쪽에는 T-플라스크(T-flask)를 변형하여 만든 배지 공급용기(media reservoir)를 연결하여, 신경세포 in vitro 배양장치를 제작하였다.

상기 신경도관이 삽입되어 있는 장치는 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어지는 챔버(chamber)에 신경도관을 삽입한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어지는 챔버(chamber)를 제작한 후 신경도관을 삽입하고 아가로스를 이용하여 PDMS 챔버와 신경도관 사이의 공간을 메운 뒤 커버글라스로 덮어 밀폐함으로써 신경도관이 삽입되어 있는 장치를 제작하였다. 본 발명에 따른 신경도관의 길이는 다양한 크기로 제작이 가능하고 이에 따른 다양한 길이의 PDMS 장치를 준비할 수 있다.

상기 신경세포는 배근신경절(dorsal root ganglion, DRG), 유해 감수 신경세포(nociceptive-specific neuron, NS), 광작동역 신경세포(wide dynamic range neuron, WDR)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 신경세포는 직경이 미세채널의 직경인 10~20μm보다 큰 것이 바람직하며, 직경이 300 내지 500 μm일 수 있다. 신경세포의 직경이 미세채널의 직경보다 작은 경우, 신경세포가 유입되는 배양배지를 따라 신경도관 내 미세채널의 내부로 들어가게되어 향후 신경세포 배양 시 축삭의 성장 정도를 정확하게 확인하기 어렵다.

용어 "신경재생 관련 인자"란 신경세포의 축삭(axon) 등의 성장에 관련된 인자를 의미하며, 상기 신경재생 관련 인자는 신경생장인자(nerve growth factor, NGF), 신경영양인자(neurotrophic factor, NTF)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "약물"이란 신경세포의 축삭(axon) 등의 성장에 영향을 미칠 가능성이 있다고 판단되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 약물은 화학적으로 합성된 물질, 천연물 추출물, 뉴클레오타이드(nucleotide)를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 본 발명에 따른 신경세포 in vitro 배양장치를 이용하여 신경세포를 in vitro에서 배양하는 방법으로, ⅰ) 미세채널을 포함하는 신경도관이 삽입되어 있는 장치의 상부에 펌프를 튜브로 연결하고, 하부에 배양배지를 포함하는 배지 공급용기를 튜브로 연결하는 단계; ⅱ) 상기 배지 공급용기 내 배양배지에 신경세포를 투입하는 단계; ⅲ) 상기 펌프를 이용하여 배지 공급용기 내 배양배지를 신경도관이 삽입되어 있는 장치로 공급함으로써 신경세포를 시딩(seeding)하는 단계; ⅳ) 상기 펌프를 이용하여 배지 공급용기 내 배양배지를 상기 신경세포가 시딩(seeding)된, 신경도관이 삽입되어 있는 장치로 공급하여 신경세포를 배양하는 단계를 포함하는 신경세포 in vitro 배양방법을 제공한다.

상기 단계 ⅲ)에서 배양배지의 유속은 30 내지 60 μl/min인 것일 수 있다. 상기 유속의 수치 범위를 벗어나 높은 경우에는 신경세포가 빠른 속도로 유입되는 배양배지를 따라 신경도관 내 미세채널의 내부로 들어가게되어 향후 신경세포 배양 시 축삭의 성장 정도를 정확하게 확인하기 어려울 수 있으며, 낮은 경우에는 신경세포가 튜브를 따라 신경도관에 도달하기 어려울 수 있다.

상기 단계 ⅳ)에서 배양배지의 유속은 5 내지 20 μl/min인 것일 수 있다. 상기 유속의 수치 범위를 벗어나 높은 경우에는 신경세포가 빠른 속도로 유입되는 배양배지를 따라 신경도관 내 미세채널의 내부로 들어가게되어 향후 신경세포 배양 시 축삭의 성장 정도를 정확하게 확인하기 어려울 수 있으며, 낮은 경우에는 신경세포의 축삭들이 평면에서 배양 시와 마찬가지로 불특정한 방향으로 자라 축삭의 성장 정도를 측정하는 것이 불가능할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 흰쥐의 15일차 배아로부터 분리한 배근신경절(dorsal root ganglion, DRG)의 외식편(explant)을 배양배지에 혼합한 후, 연동펌프를 이용하여 분당 50 μl(μl/min)의 속도로 신경도관의 상부에 DRG 외식편을 시딩하였다. 신경도관은 지름이 1.6~1.7mm 이고 내부의 미세채널의 직경은 10~20 μm 이므로 직경이 약 300~500 μm 인 DRG 외식편은 신경도관 내부로 들어가지 않고 신경도관 상단에 위치하였다. DRG 외식편을 신경도관 상단에 시딩한 후, 신경재생과 관련된 인자 또는 약물을 혼합한 배양배지를 배지 공급용기에 투입하고 배양배지가 신경도관 상부에서 하부로 흐르되, 유입 속도는 분당 10 μl 이하로 유지하도록 연동펌프를 작동시켜 DRG 외식편이 신경도관의 내부로 들어가지 않도록 하였다.

상기 배양배지는 중력에 의해 신경도관의 상단에서 하단으로 흐름으로써, DRG의 축삭이 아래쪽으로 자랄 수 있으며, 배양배지에 흐름을 주지 않고 DRG 배양 시 축삭이 불특정한 방향으로 자랄 수 있다.

상기 배양배지는 신경재생 관련 인자를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 신경재생 관련 인자는 신경생장인자(nerve growth factor, NGF), 신경영양인자(neurotrophic factor, NTF)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 배양배지는 약물을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 배양배지는 신경세포의 축삭 성장에 관련된 인자들의 혼합물 또는 이와 유사한 효과를 나타내는 약물들을 포함함으로써 신경세포에 지속적으로 쉽게 전달할 수 있다.

본 발명에 따른 신경세포 in vitro 배양장치 또는 배양방법은 상기 신경도관이 삽입되어 있는 장치에 신경세포를 시딩(seeding)하여 배양함으로써 신경세포의 축삭이 신경도관 내부의 미세채널을 따라 성장하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명에 따른 신경세포 in vitro 배양장치를 이용하여 3일간 배양한 DRG는 DRG의 외식편은 신경도관의 상단에 남아 있고 DRG로부터 성장한 축삭들은 신경도관 내부의 축방향 미세채널을 따라 방향성을 가지고 자라고 있는 것을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 유리섬유를 이용한 신경도관의 제조

소수성 고분자인 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(PLGA)(락틱산 대 글리콜산의 mol %, 85:15)와 소수성 용매인 테트라글리콜(TG)(밀도: 1.09g/ml, Sigma-Aldrich, 미국)을 중량 대 용량(w/v) 비율이 20%(w/v)가 되도록 혼합한 후 60℃에서 18시간 동안 녹여 20%(w/v) PLGA-TG 용액(고분자 재료)을 준비하였다.

내경 1.6mm, 길이 13cm인 모세 유리관의 중앙 부위를 가열하여 병목 지점을 만들어, 불연속적인 각도로 경사진 상부 및 하부 채널을 형성하였다. 이때, 하부 채널은 상부 채널보다 작은 직경을 형성하도록 제작하였다. 이후, 직경이 10~20 μm인 수용성 유리섬유(50P₂O₅-20CaO-30Na₂O in mol % (1100℃, 800rpm)) 7000~8500 가닥을 5~6cm 단위로 잘라 유리관의 상부 채널 내에 축방향으로 빽빽하게 삽입하였다.

유리섬유가 삽입된 유리관의 상부 채널에, 내경 0.8mm, 길이 15cm인 실리콘 튜브에 2-방향 밸브가 부착된 루어락(Luer lock) 주사기를 연결하여 제조한 압력 장치를 끼워 준비하였다.

상온에서 유리관의 하부 채널이 20%(w/v) PLGA-TG 용액에 잠기도록 한 후, 주사기를 이용하여 유리관 내부에 반복적으로 진공을 가해 20%(w/v) PLGA-TG 용액이 유리섬유 사이의 빈틈에 완전히 침투하도록 빨아들였다.

본 실시예에서는 상술한 바와 같이 불연속적인 각도로 상부채널 대비 하부채널의 너비를 좁혔다. 각도가 연속적일 경우, 유리섬유 사이의 간격이 점차 좁아지게 되어 유리섬유 간에 일정한 간격을 유지하기 어려워지는 문제가 있다. 유리섬유의 간격이 일정하지 않은 경우, 유리섬유에 의하여 형성되는 신경 재생 방향이 채널에 따라 달라지므로, 동일한 방향으로의 신경 재생이 어려워지는 문제점이 발생한다.

PLGA-TG 용액이 침투된 유리섬유를 직경 1.5mm 길이 15cm의 와이어(wire)를 이용하여 유리관으로부터 분리한 즉시 10~20℃의 초순수수(distilled water, DW)에 24시간 이상 완전히 침지시켜, 유리섬유를 모두 용해하고 유리섬유가 녹은 공간에 PLGA로 이루어지는 10~20 μm 크기의 미세채널(미세채널의 직경: 16.54 ± 3.6 μm)이 약 7,000~8,500 개(미세채널의 수: 7,777 ± 716.2 개) 형성되도록 하였다. 10~20℃의 DW 내에서 유리섬유가 용해되는 동시에, PLGA가 경화되어 미세채널을 형성하였다. 또한, PLGA-TG 용액이 침투된 유리섬유를 DW에 침지하는 과정에서 TG가 DW와 반응(DW에 용해)하여 미세채널로부터 빠져나오면서 미세채널 내부에 미세기공을 형성하였다. 신경도관으로부터 빠져나온 TG는 DW보다 밀도가 높아 DW 아래쪽에 아지랑이 모양으로 가라앉았다.

DW 처리를 통해 유리섬유와 TG가 제거되고 PLGA로 이루어지는 다공성 미세채널, 즉 제조된 신경도관을 액체 질소에 약 30초간 얼린 후 사용 목적에 맞는 크기로 절단하고 성형하였다.

< 실시예 2> 신경세포 in vitro 배양장치 제작

도 2A 및 도 2B의 규격으로 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어지는 챔버(chamber)를 제작하였다.

제작한 PDMS 챔버에 직경 1.6~1.7mm, 길이 16mm로 성형한 실시예 1의 신경도관을 삽입하고, 물에 완전히 녹인 4% 아가로스(agarose)를 40~50℃로 냉각시킨 후 PDMS 챔버와 신경도관 사이의 공간에 침투시켰다. 아가로스가 완전히 경화되도록 상온에서 5 분간 방치 후에 아가로스와 PDMS 챔버 표면의 높이가 균일하도록 다듬고 커버글라스로 덮어 밀폐함으로써, PDMS 장치를 제조하였다(도 2C). 이때, 아가로스가 신경도관의 상하부 말단에 침투하여 미세채널을 막지 않도록 주의하였다. 신경도관의 길이는 다양한 크기로 제작이 가능하므로 이에 따라 다양한 길이의 PDMS 장치를 준비할 수 있다(도 3).

이후, 실리콘 튜브를 이용하여 신경도관이 삽입되어 있는 PDMS 장치의 상부 쪽으로 멀티채널 연동펌프(multichannel peristaltic pump)(Gilson's MINIPULS^®3)(도 4A)를 연결하고 하부 쪽에는 25ml T-플라스크(T-flask)를 변형하여 만든 배지 공급용기(media reservoir)(도 4B 및 도 5)를 연결하여, 신경세포 in vitro 배양장치를 제작하였다. 25ml T-플라스크는 윗부분을 천공하여 주입(inlet)과 배출(outlet)을 위한 바늘(needle) 및 튜브를 삽입하였으며, 필터 캡(Filter cap)이 있는 T-플라스크를 사용하여 공기의 흐름은 유지하되 오염을 방지할 수 있도록 하였다. 제작된 신경세포 in vitro 배양장치는 펌프를 이용하여 배지 공급용기 내 배양배지가 신경도관이 삽입되어 있는 PDMS 장치로 공급하였다.

< 실시예 3> DRG 외식편 시딩 (seeding)

신경도관 내부에 배근신경절(dorsal root ganglion, DRG)의 외식편(explant)을 시딩(seeding)하기 위해, 흰쥐의 15일차 배아로부터 분리한 DRG(도 6 및 도 7) 외식편을 파파인(papain) 수용액 상에서 1분간 처리한 후 배양배지로 충분히 세척하였다. DRG를 1ml 이하의 배양배지에 섞은 후, 연동펌프를 이용하여 분당 50 μl(μl/min)의 속도로 신경도관의 상부에 DRG 외식편을 시딩하였다(도 8). 시딩 시, 직경 1.6~1.7mm, 길이 16mm의 신경도관의 경우 2 내지 3 개의 DRG가 적절하였다. 신경도관은 지름이 1.6~1.7mm 이고 내부의 미세채널의 직경은 10~20 μm 이므로 직경이 약 300~500 μm 인 DRG 외식편은 신경도관 내부로 들어가지 않고 신경도관 상단에 자리 잡았다.

< 실시예 4> DRG 외식편 배양

DRG 외식편을 시딩한 후, 신경재생과 관련된 인자 또는 약물을 혼합한 배양배지를 배지 공급용기에 투입하고 배양배지가 신경도관 상부에서 하부로 흐르도록 연동펌프를 작동시켰다. 이때 배양배지의 유입 속도는 분당 10 μl(μl/min) 이하로 유지하여 DRG 외식편이 신경도관의 내부로 들어가지 않도록 하였다. CO₂ 인큐베이터에서 분당 10 μl 이하의 속도로 배양배지를 계속 흘려주며 1일에서 3일간 배양하였다(도 10).

< 실시예 5> 배양된 DRG 외식편으로부터 성장한 축삭 (axon) 확인

3일간 배양한 후 DRG 외식편을 냉동한 절편을 SMI-312 항체를 이용하여 axon 염색하였다.

그 결과, DRG 외식편은 신경도관의 상단에 남아 있고 DRG의 축삭들은 신경도관 내부의 미세채널을 따라 방향성을 가지고 자라고 있는 것을 확인하였다(도 11).

Claims

(A) 소수성 용매인 테트라글리콜(TG) 1L에 녹는 소수성 고분자인 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(PLGA)의 중량(g)을 의미하는 PLGA와 TG의 중량/부피 % (w/v %)가 10 내지 40 %인 PLGA-TG 용액을 준비하고, 모세 유리관의 중앙 부위를 가열하여 병목 지점을 만들어 불연속적인 각도로 경사진 상부 채널 및 하부 채널을 형성하되, 하부 채널의 직경은 상부 채널보다 작게 형성하며, 직경이 10 내지 20 ㎛ 인 복수의 수용성 유리섬유를 상기 유리관의 상부 채널 내에 축방향으로 빽빽하게 삽입하고, 상기 유리관의 하부 채널이 상기 PLGA-TG 용액에 잠기도록 한 다음 상기 유리관 내부에 진공을 인가하여 상기 PLGA-TG 용액이 상기 유리섬유 사이의 빈틈에 침투하도록 하며, 상기 PLGA-TG 용액이 침투된 유리섬유를 상기 유리관으로부터 분리하여 초순수수(DW)에 완전히 침지시켜 상기 유리섬유를 용해하여 상기 유리섬유가 용해된 공간에 PLGA가 경화되어 직경이 10 내지 20 ㎛ 인 미세채널이 복수로 형성되도록 하고, 상기 PLGA-TG 용액이 침투된 유리섬유를 DW에 침지하는 과정에서 TG가 DW와 반응하여 상기 미세채널로부터 빠져나오면서 미세채널 내부에 미세기공이 형성되도록 하며, 상기 미세기공이 형성된 미세채널을 액체 질소로 얼린 다음 절단 성형하여 지름이 1.6 내지 1.7 ㎜인 신경도관을 제조하는 신경도관의 제조단계;
(B) 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어지는 PDMS 챔버에 상기 신경도관을 삽입하고, 물에 완전히 녹인 아가로스를 냉각시킨 후 상기 PDMS 챔버와 신경도관 사이의 공간에 침투시켜 상기 아가로스가 경화되도록 하여 PDMS 장치를 형성하고, 상기 PDMS 장치의 상부에 멀티채널 연동펌프를 마련한 다음 튜브로 상기 PDMS 장치와 연동펌프를 연결하며, 상기 PDMS 장치의 하부에 배지 공급용기를 연결하는 배양장치 준비단계;
(C) 상기 배지 공급용기 내의 배양배지에 신경세포를 투입하는 신경세포 투입단계;
(D) 상기 연동펌프를 이용하여 상기 배지 공급용기 내의 배양배지를 상기 신경도관이 삽입된 PDMS 장치로 30 내지 60 ㎕/min의 유속으로 공급하여 직경이 300 내지 500 ㎛ 인 신경세포를 상기 신경도관 상단에 시딩하는 신경세포 시딩단계; 및
(E) 상기 연동펌프를 이용하여 상기 배지 공급용기 내의 배양배지에 신경재생과 관련된 인자 또는 약물을 혼합한 다음 상기 혼합된 배양배지를 상기 신경세포가 시딩된 PDMS 장치로 5 내지 20 ㎕/min의 유속으로 공급하되, 상기 배양배지는 중력에 의해 상기 신경도관의 상단에서 하단으로 흐르게 하여 신경세포의 축삭이 하방으로 자라도록 상기 신경세포를 배양하는 신경세포 배양단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경세포 in vitro 배양방법.
청구항 1에 있어서,
상기 (B) 단계에서, 상기 배지 공급용기는 필터 캡이 마련된 T-플라스크를 사용함으로써, 공기의 순환은 유지하되 외부로부터 오염되는 것을 방지할 수 있도록 한 것을 특징으로 하는 신경세포 in vitro 배양방법.
청구항 1에 있어서,
상기 신경재생과 관련된 인자는, 신경생장인자(nerve growth factor, NGF), 신경영양인자(neurotrophic factor, NTF)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 in vitro 배양방법.
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