KR101835739B1 - 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 - Google Patents
인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항산화, 피부 미백 활성을 갖는 조성물, 및 항염, 항산화, 피부 미백 활성이 증진된 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 인진쑥(Artemisia capillaris)의 추출물 또는 이의 분획물이 항염, 항산화, 피부 미백 활성이 우수하고, 특히 멜라닌 생성 세포인 흑색종 세포에서 농도의존적으로 매우 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내며, 적은 양으로도 매우 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 화장료, 비누, 약제 또는 식품 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.
구체적으로, 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 인진쑥(Artemisia capillaris)의 추출물 또는 이의 분획물이 항염, 항산화, 피부 미백 활성이 우수하고, 특히 멜라닌 생성 세포인 흑색종 세포에서 농도의존적으로 매우 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내며, 적은 양으로도 매우 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 화장료, 비누, 약제 또는 식품 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 인진쑥(Artemisia capillaris) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항산화, 피부 미백 활성을 갖는 조성물, 및 항염, 항산화, 피부 미백 활성이 증진된 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물의 제조방법에 관한 것이다.
사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리, 화학적인 변화가 일어난다. 그 원인은 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 구체적으로, 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 자유라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다.
따라서, 신체의 대사 과정 중 발생하는 자유라디칼이나 자외선 조사, 염증 반응에 의해 매개되어 발생하는 자유라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진 대사에 의해 재생시켜 세포를 증식시켜야 건강한 피부를 유지할 수 있다.
한편, 멜라닌은 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 티로신(tyrosine)이 산화되어 도파(DOPA, 3,4-dihydro xyphenylalanine)로, 도파가 다시 산화되어 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후, 비효소적 산화 반응을 거쳐 만들어진다. 멜라닌은 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부 기관을 보호해 주는 동시에 피부의 생체 내 생겨난 자유라디칼 등에 의한 피부 내 단백질과 유전자들의 손상을 보호해 주는 유용한 역할을 하지만, 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생성되면 피부 노화를 가져오며 기미나 주근깨 등과 같은 과색소 침착증을 유발한다. 멜라닌은 활성 산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며 멜라닌 구조 내 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다. 따라서, 멜라닌 생성을 저해시키면 피부 미백 효과를 가져올 수 있다.
멜라닌 생성을 저해시킴으로써 피부 미백 효과를 갖는 것으로, 파라-메톡시페놀(p-metoxyphenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코지산(kojic acid), 알부틴(albutin), 비타민 C(ascorbic acid), 글루타티온(glutathione), 시스테인(cystein) 등의 화합물과, 상백피 추출물, 감초 추출물, 작약 추출물, 계피 추출물, 고삼 추출물, 갈근 추출물, 당귀 추출물, 목단피 추출물, 반하 추출물, 알로에 추출물 등의 식물 추출물 등이 알려져 있으나, 불충분한 미백 효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합시 제형 내에서의 안정성 문제 등 여전히 해결해야 하는 문제점을 안고 있다.
쑥(Artemisia)은 한국을 비롯한 아시아와 유럽 등에 분포되어 자생하는 국화과(compositae)의 다년생 초본 식물로서 약 400여종이 존재하는 것으로 알려져 있고 약 300여종이 우리나라에 자생하고 있으며, 그 중에서 한국 등록특허 제10-0401472호(인진쑥 추출물 함유 기능성 음료 및 그 제조방법)에서는 혈관이완용, 뇌졸중예방용 또는 항암성 음료 용도의 인진쑥 추출물을 기재하고 있다.
쑥과 같은 천연물을 대상으로 용매 극성을 이용하여 분획물을 얻는 방법은 통상적으로 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 처리하여 극성에 따라 분획물을 세분화하는 것이다. 하지만, 이러한 방법은 극성에 따라 물질 분리를 세분화할 수 있는 장점이 있지만, 활성성분을 분리하는 실험에 있어서는 활성성분이 분산되는 현상이 일어난다.
이에, 본 발명자들은 기존 알려진 용매 분획 방법에 비해, 활성성분의 분산을 방지하고 더 많은 양의 활성 분획물을 얻을 수 있는 방법을 고안하고 이를 인진쑥 추출물에 적용함으로써, 적은 양으로도 항염, 항산화 및 피부 미백 활성을 가장 잘 나타낼 수 있는 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 제조하는 방법을 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 항염, 항산화 및 피부 미백 활성을 가장 잘 나타낼 수 있는 인진쑥 추출물 및 이의 분획물을 제조하여 인체에 무해하면서 항염, 항산화 또는 피부 미백에 효과가 있는 화장료 조성물, 비누 조성물, 약제학적 조성물 및 식품 조성물을 제공함에 있다.
아울러, 본 발명의 목적은 인진쑥 건조물을 물 또는 에탄올/메탄올로 추출하는 단계를 포함하는 인진쑥 추출물의 제조방법, 또는 인진쑥 추출물을 유기용매로 추출 및 분획하는 단계를 포함하는 인진쑥 분획물의 제조방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항산화 또는 피부 미백 활성을 갖는 조성물을 제공한다.
상기 인진쑥 추출물은 인진쑥 건조물을 물, C1~C2의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 한다.
상기 인진쑥 분획물은 인진쑥을 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하여 얻은 추출물을, 물과 에틸아세테이트의 혼합용액을 용매로 하여 다시 추출한 후 얻어지는 것을 특징으로 한다.
상기 인진쑥 분획물은 인진쑥 추출물을 에틸아세테이트로 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물을, 메탄올과 헥산 혼합 용액을 용매로 하여 다시 추출한 후 얻어지는 것을 특징으로 한다.
상기 인진쑥 분획물은 인진쑥 추출물을 에틸아세테이트로 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물을, 메탄올과 헥산 혼합 용액을 용매로 다시 추출하여 메탄올 분획물을 얻고, 상기 메탄올 분획물을 에틸아세테이트와 헥산 혼합 용액을 이용하여 분리되는 것을 특징으로 한다.
상기 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물은 NO 생성을 억제하고 자유 라디칼을 제거하며 티로시나아제 활성과 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 화장료 조성물, 비누 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.
상기 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 젤, 팩, 클렌징폼, 클렌징로션, 클린징크림, 바디크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 파우더 또는 아이섀도우 제형으로 제조된 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 여드름, 아토피, 건선, 피부염, 피부 노화, 주름 또는 피부 과색소 침착 질환을 예방 또는 치료하는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
상기 피부 과색소 침착 질환은 기미, 주근깨, 검버섯, 모반, 흑색종, 약물에 의한 색소 침착 또는 염증에 의한 색소 침착인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 인진쑥 건조물을 준비하는 단계; 및
상기 건조물에 물, C1~C2의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계를 포함하는 인진쑥 추출물의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 아래 단계를 포함하는 인진쑥 분획물의 제조방법을 제공한다:
(1) 인진쑥 건조물을 준비하는 단계;
(2) 상기 건조물에 물, C1~C2의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계에서 얻어진 추출물에, 에틸아세테이트와 물의 혼합 용액을 용매로 하여 추출하는 단계.
상기 (3)단계에서 얻어진 추출물에, 메탄올과 헥산의 혼합 용액을 용매로 하여 추출하는 단계를 더 포함하거나, 메탄올과 헥산의 혼합 용액을 용매로 추출한 다음 얻어진 추출물을 에틸아세테이트와 헥산의 혼합 용액을 용매로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 항염, 항산화, 피부 미백 활성을 갖는 인진쑥 추출물과 항염, 항산화, 피부 미백 활성이 증진된 인진쑥 추출물의 제조방법을 제공함으로써, 항염, 항산화, 피부 미백 효과가 우수한 화장료 조성물, 비누 조성물, 약제학적 조성물 및 식품 조성물을 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 인진쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부에 안전하면서도 여드름, 아토피, 건선, 피부염, 피부 노화, 주름 또는 피부 과색소 침착 질환을 예방 또는 개선하는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면, 높은 피부 미백 활성을 갖는 인진쑥의 에틸아세테이트 분획물 또는 메탄올 분획물이 포함된 조성물과 그 제조방법을 제공함으로써, 피부 미백 효과가 우수한 화장료 조성물 또는 비누 조성물을 개발할 수 있다.
도 1은 본 발명의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물의 제조 공정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 인진쑥 추출물의 NO 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 인진쑥 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 인진쑥 추출물의 세포 독성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 인진쑥 추출물의 세포 내 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 사진이다.
도 6은 본 발명의 인진쑥 추출물의 세포 내 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 인진쑥 추출물의 세포 내 티로시나아제 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 인진쑥 추출물(a), 에틸아세테이트 분획물(b) 및 물 분획물(c)의 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과 사진과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 메탄올 분획물과 헥산 분획물의 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과 사진과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 개별 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 TLC를 이용하여 활성물질의 분포화를 확인한 결과 사진이다:
(A) Staining solution: Vanillin/H2SO4;
(B) UV 254nm 파장 조사;
(C) UV 365nm 파장 조사;
E: 에틸아세테이트 분획물;
H: 물 분획물;
M: 메탄올 분획물;
He: 헥산 분획물; 및
인: 인진쑥 추출물(에탄올 추출물).
도 11은 본 발명의 인진쑥 세부 분획물(Fr.1~Fr.7) 각각의 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과 사진이다.
도 2는 본 발명의 인진쑥 추출물의 NO 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 인진쑥 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 인진쑥 추출물의 세포 독성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 인진쑥 추출물의 세포 내 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 사진이다.
도 6은 본 발명의 인진쑥 추출물의 세포 내 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 인진쑥 추출물의 세포 내 티로시나아제 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 인진쑥 추출물(a), 에틸아세테이트 분획물(b) 및 물 분획물(c)의 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과 사진과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 메탄올 분획물과 헥산 분획물의 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과 사진과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 개별 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 TLC를 이용하여 활성물질의 분포화를 확인한 결과 사진이다:
(A) Staining solution: Vanillin/H2SO4;
(B) UV 254nm 파장 조사;
(C) UV 365nm 파장 조사;
E: 에틸아세테이트 분획물;
H: 물 분획물;
M: 메탄올 분획물;
He: 헥산 분획물; 및
인: 인진쑥 추출물(에탄올 추출물).
도 11은 본 발명의 인진쑥 세부 분획물(Fr.1~Fr.7) 각각의 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인진쑥(Artemisia Capillaris) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항산화 또는 피부 미백 활성을 갖는 조성물 및 이에 준하는 치료를 목적으로 하는 조성물을 제공한다.
국화과 쑥속에 속하는 인진쑥은 국내 각지에서 자생하는 사철쑥(Artemisia capillaris; AC)으로서 그 어린 줄기와 잎을 인진호(茵陳蒿)라 하고, 이담작용, 천식억제, 구충작용, 이뇨작용 등이 알려져 있으며 그 성분으로는 스코파론(Scoparone), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카필린(Capillin) 등이 알려져 있다(정보섭 및 신민교, 향약대사전, pp 1016-1017, 영림사, 1998). 국화과 쑥속에 속하는 다년생초는 아래와 같이 여러 종이 있으며, 같은 속에 속한다 하더라도 그 특징과 함유된 성분, 활성물질의 차이로 인해 각기 다른 효능을 나타낸다.
본 발명에 따른 조성물은 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물이 인체에 독성을 미치지 않는 범위 내에서 임의의 양으로 포함될 수 있고 구체적으로 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 내지 99.99 중량%로 포함될 수 있다.
상기 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물은 NO 생성을 억제하고 활성산소종을 제거해 주며 티로시나아제의 활성과 멜라닌의 생성을 억제함으로써, 신체 대사 과정 중 발생하는 자유라디칼이나 자외선 조사, 염증 반응에 의해 매개되어 발생하는 자유라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진 대사에 의해 재생시키고 세포를 증식시켜 주는 효과가 있다.
따라서, 본 발명에 따른 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염, 항산화 및 피부 미백 조성물은 피부 잡티를 제거하고 미백 효과와 동시에 염증 반응을 예방 및 치료하고 자유라디칼을 소거하여 생체 내 항산화 시스템을 유지해 노화를 방지하고 맑고 건강한 피부를 유지시켜 주는 효과가 있다.
본 발명에 따른 조성물의 구체적인 양태에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물로 이용될 수 있다. 예를 들어, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 합성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩 또는 분말 등의 형태로 제조될 수 있고, 화장품 제제에 있어서 당해 기술분야에서 통상의 기술자가 적절하게 선택하여 사용 가능한 알코올, 오일, 계면 활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등의 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 다른 구체적인 양태에 있어서, 상기 조성물은 비누 조성물로 이용될 수 있다. 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등의 비누 베이스에 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다. 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다. 또한, 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속 이온봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 다른 구체적인 양태에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물로 이용될 수 있다. 구체적으로 염증 반응에서 비롯되는 여드름, 아토피, 건선, 피부염 등과, 활성산소 증가에서 비롯되는 피부 노화, 주름 등과, 멜라닌 색소의 합성 증가로 피부에 국소적으로 발생하는 기미, 주근깨, 검버섯, 모반, 흑색종, 약물에 의한 색소 침착, 염증에 의한 색소 침착 등과 같은 피부 색소 침착 질환에 대해 예방 또는 치료 효과가 있는 약제학적 조성물로 이용이 가능하다. 약제학적 조성물은 임상 투여 시에 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있고 피부 외용제로 도포될 수 있다. 또한, 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 콩 추출물 등에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 건강식품은 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 인진쑥 추출물의 제조방법, 및 인진쑥 추출물을 유기용매로 추출 및 분획하는 단계를 포함하는 인진쑥 분획물의 제조방법을 제공한다.
상기 본 발명의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
1) 인진쑥(Artemisia Capillaris) 추출물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 인진쑥 추출물을 제조하는 단계; 및
4) 단계 3)의 인진쑥 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 인진쑥 분획물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 인진쑥(Artemisia Capillaris)은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다. 상기 인진쑥은 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 종자 등 모든 기관이 이용가능하고, 줄기 또는 잎인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출 방법으로는 진탕 추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 인진쑥 분량에 1 내지 5배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 1 내지 2배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하며, 1.5배 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 12 내지 36시간인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 1 내지 2회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 1회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 이때 농축 농도는 당도 측정기로 측정하였을 때 약 2~10 브릭스(Brix)가 되도록 하는 것이 바람직하며, 3~6 브릭스가 되도록 하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 에틸아세테이트, 메탄올, 헥산, 또는 이의 혼합용액일 수 있고, 물과 에틸아세테이트 혼합용액, 메탄올과 헥산 혼합 용액, 또는 에틸아세테이트와 헥산 혼합용액인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 4)의 인진쑥 분획물의 제조 방법은, 인진쑥 추출물을 물과 에틸아세테이트의 혼합 용액을 용매로 하여 다시 추출하는 단계를 포함할 수 있고, 이를 통해 본 발명의 에틸아세테이트 분획물을 얻을 수 있다.
이때, 상기 물과 에틸아세테이트 혼합 용액 내 에틸아세테이트의 농도는 부피 농도로 40 내지 70%인 것이 바람직하고, 50 내지 60%인 것이 더욱 바람직하며, 50%인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 4)의 인진쑥 분획물의 제조 방법은, 상기 본 발명의 에틸아세테이트 분획물을 메탄올과 헥산 혼합 용액을 용매로 하여 다시 추출하는 단계를 포함할 수 있고, 이를 통해 본 발명의 메탄올 분획물을 얻을 수 있다.
이때, 상기 메탄올과 헥산 혼합 용액 내 메탄올의 농도는 부피 농도로 70 내지 95%인 것이 바람직하고, 80 내지 90%인 것이 더욱 바람직하며, 90%인 것이 가장 바람직하나, 층 분리가 가능한 농도라면 모두 가능하다.
상기 단계 4)의 인진쑥 분획물의 제조 방법은, 상기 본 발명의 메탄올 분획물을 에틸아세테이트와 헥산 혼합 용액을 용매로 하여 분리하는 단계를 포함할 수 있고, 이를 통해 본 발명의 세부 분획물(Fr.1~Fr.7)을 얻을 수 있다.
이때, 상기 에틸아세테이트와 헥산 혼합 용액 내 에틸아세테이트의 농도는 10 내지 70%인 것이 바람직하고, 20 내지 50% 또는 55 내지 70%인 것이 더욱 바람직하며, 20 내지 50%, 또는 55 내지 66%인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 분리는 순상 실리카겔(silicagel) 또는 역상 ODS(octadecylsilyl silica gel)를 이용할 수 있으나, 농도별 구배가 가능한 방법이라면 어느 것이든 이용할 수 있다.
상기 분획물의 제조 방법에서 추출온도는 20℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하며, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 12 내지 36시간인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 분획물은 인진쑥 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기와 같은 본 발명의 방법을 통해 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물을 제조할 경우 활성 성분의 분산을 방지하고 더 많은 양의 활성 분획물을 얻을 수 있어, 적은 양으로도 항염, 항산화 및 피부 미백 활성을 가장 잘 나타낼 수 있는 추출물 또는 분획물을 효과적으로 얻을 수 있다.
구체적으로, 인진쑥 추출물을 물과 에틸아세테이트 혼합 용액으로 추출하는 경우, 물 층에는 수용성 성분들이 포함되고, 에틸아세테이트 층에는 지용성 성분이 포함될 것이며, 이때 에틸아세테이트 층에서만 활성 효과가 나타났다는 것은 활성을 나타내는 성분이 대부분 지용성 성분이라는 것을 의미한다. 또한, 에틸아세테이트 층만을 분리하여, 메탄올과 헥산 혼합 용액으로 추출하는 경우, 헥산에는 지질 성분들이 포함되고, 메탄올 층에는 플라보노이드, 리그난 등의 극성이 다소 높은 성분이 포함될 것이며, 이때 메탄올 층에서만 활성 효과가 나타났다는 것은 활성을 나타내는 성분이 대부분 지용성 중에서도 극성이 다소 높은 성분이라는 것을 의미한다.
이에 반해, 통상적인 용매 분획법을 이용하였을 때는 극성에 따라 성분들이 다양한 용매에 세분화되어 포함될 것이기 때문에 활성 성분들이 분산됨으로써 본 발명과 같이, 활성성분이 대부분 극성을 띄는 경우에는 많은 양의 활성 성분을 얻는 데 불리할 것이다.
따라서, 본 발명의 제조 방법은 인진쑥을 이용한 활성 성분의 분리 시에, 기존 방법의 한계를 극복하여 더 많은 양의 활성 성분을 손쉽게 얻을 수 있는 효과적인 방법이다.
하기에 본 발명에 따른 인진쑥 추출물을 포함하는 여러 가지 제제예 및 제형예를 설명하고 있으나, 이는 본 발명을 제한하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 정제의 제조
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물...........100㎎
전분.......................................................50mg
유당.......................................................50mg
스테아린산 마그네슘..............................5mg
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 정제의 제조방법에 따라 습식과립법 또는 건식과립법을 이용하여 정제를 제조하였다.
제제예 2. 캡슐제의 제조
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물........0㎎
전분....................................................50mg
유당....................................................50mg
탈크....................................................1mg
스테아린산마그네슘............................. 5mg
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 캡슐제의 제조방법에 따라서 캡슐제를 제조하였다.
제제예 3. 액제의 제조
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물..........500㎎
이성화당..................................................10ｇ
자당......................................................10ｇ
레몬향...................................................적당량
정제수를 가하여 전체..............................50㎖
상기의 성분들을 통상적인 액제의 제조방법에 따라서 혼합하여 갈색병에 충전하고 멸균시켜서 액제를 제조하였다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물.......50㎎
소디움 메타비설파이트...........................2.6㎎
메틸파라벤......................................0.5㎎
프로필파라벤....................................0.1㎎
주사용 멸균증류수...............................적당량
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 방법으로 2 ml로 조절한 후, 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
제제예 5. 음료의 제조
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물..........100㎎
비타민B2..................................................5㎎
비타민B6..................................................5㎎
비타민C...................................................80㎎
식이섬유..............................................1,000㎎
액상과당............................................10,000㎎
유화제................................................100㎎
레몬향.................................................50㎎
정제수.................................................적당량
상기의 성분들을 혼합하여 용량이 50 ml가 되도록 하고, 혼합액을 3 μm의 필터로 통과시켜 여과한 최종 혼합액을 90 내지 93 ℃에서 20 초간 1차 살균하여 50 ml 병에 충진하고 80 내지 85 ℃에서 20 분간 2차 살균하여 음료제품을 제조하였다.
제형예 1. 유연 화장수(스킨 로션)
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물.......2.0
글리세린...............................3.5
올레일알코올......................1.5
에탄올............................5.5
폴리솔베이트 80..................3.2
카르복실비닐폴리머...............1.0
부틸렌 글리콜....................2.0
프로필렌 글리콜..................2.0
방부제, 향료.....................적량
정제수...........................잔량
계...............................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연 화장수를 제조하였다(단위 중량%).
제형예 2. 영양 화장수(밀크 로션)
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물...............2.0
글리세린..................................................3.0
부틸렌글리콜...........................................3.0
프로필렌글리콜........................................3.0
카르복시비닐폴리머.................................0.1
밀납...........................................................4.0
폴리솔베이트 60......................................1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드...........5.0
스쿠알란........................................5.0
솔비타세스퀴올레이트...........................1.5
세테아릴 알코올.................................1.0
트리에탄올아민...................................0.2
방부제, 향료...................................적량
정제수...........................................잔량
계...........100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 화장수를 제조하였다(단위 중량%).
제형예 3. 영양 크림
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물......2.0
글리세린.........................................3.5
부틸렌글리콜.....................................3.0
유동파라핀.......................................7.0
베타글루칸.......................................7.0
카보머...........................................0.1
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드...................3.0
스쿠알란.........................................5.0
세테아릴 글루코사이드............................1.5
소르비탄 스테아레이트............................0.4
폴리솔베이트 60..................................1.2
트리에탄올아민...................................0.1
방부제, 향료....................................적량
정제수..........................................잔량
계.....................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 크림을 제조하였다(단위 중량%).
제형예 4. 팩
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물........2.0
글리세린.....................................4.0
폴리비닐알콜............................15.0
히알루론산 추출물...................5.0
베타글루칸.................................7.0
알란토인.......................................0.1
노닐 페닐에테르.........................0.4
폴리솔베이트 60........................1.2
방부제, 향료..............................적량
정제수.........................................잔량
계....................................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다(단위 중량%).
제형예 5. 국소 투여용 약제(패취제)
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물..............2.0
베타-1,3-글루칸...................................3.0
디에틸아민...............................................0.7
아황산나트륨...................................0.1
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9).................1.0
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르(Cetomacrogol 1000).......1.0
점성의 파라핀 오일..................................2.5
카프릴산에스테르/카프르산에스테르(Cetiol LC)...............2.5
폴리에틸렌글리콜 400....................................3.0
폴리아크릴산(Carbopol 934P)......................1.0
정제수.........................................................잔량
계..........................................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 국소 투여용 약제를 제조하였다(단위 중량%).
제형예 6. 비누
실시예의 인진쑥 추출물 또는 이의 분획물...........1~30
유지........................................................적당량
수산화나트륨.........................................적당량
염화나트륨.............................................적당량
향료........................................................소량
계..............................................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 비누를 제조하였다(단위 중량%).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인진쑥 추출물의 제조
인진쑥(Artemisia Capillaris; AC; 화순불미나리(주), 인진쑥 줄기 및 잎)을 증류수로 1~2회 세척한 후 20~60 ℃에서 1~2일 동안 건조시킨 다음, 건조된 인진쑥 1,000 g에 1500 ml의 주정, 메탄올 또는 증류수를 가하여 상온에서 12~36 시간 동안 추출하였다. 이후, 5 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는 여과지를 이용하여 자연 여과한 다음, 당도 측정기로 측정하였을 때 약 3~6 브릭스(Brix)가 되도록 감압 농축기로 농축하여 동결 건조한 후 습기가 없는 곳에서 믹서기로 균질화하여 인진쑥 추출물 96.7g을 제조하였다.
실시예 2. 인진쑥 유기용매 분획물 제조
상기 실시예 1에서 주정(에탄올)을 통해 제조된 본 발명의 인진쑥 추출물(에탄올 추출물) 96.7g에 에틸아세테이트 혼합용액 2000ml(에틸아세테이트 1000ml, 물 1000ml)을 가하여 현탁한 후 상온에서 12~36 시간 동안 추출하였으며, 에틸아세테이트 층과 물 층으로 나뉘어진 분획물을 각각 분리/여과하여 본 발명의 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물을 제조하였다.
상기 제조된 에틸아세테이트 분획물 52.2g에 다시 90% 메탄올 혼합 용액 1400ml (90% 메탄올 700ml, 헥산 700ml)을 가하여 현탁한 후 상온에서 12~36 시간 동안 추출하였으며, 90% 메탄올 층과 헥산 층으로 나뉘어진 분획물을 각각 분리/여과하여, 본 발명의 메탄올 분획물 및 헥산 분획물을 제조하였다.
실시예 3. 인진쑥 유기용매 분획물의 세부 분획물(Fr.1~Fr.7) 제조
상기 실시예 2에서 제조된 메탄올 분획물 중에서 활성을 나타내는 세부 분획물을 얻기 위하여, 90% 메탄올 분획물 5g을 대상으로, 에틸아세테이트와 헥산이 포함된 혼합 용액을 용매로 하고 YMC-DispoPack AT SIL-25 컬럼을 이용하여 MPLC(LC-Forte/R, YMC사)를 수행하였다. 에틸아세테이트와 헥산 비율이 20:80인 용매(20% 에틸아세테이트 용액)로 시작하여, 용매 내 에틸아세테이트의 양을 순차적으로 증가시키는 농도 구배법을 통해, 에틸아세테이트의 농도가 100%가 될 때까지 60분간 유속 30ml/min으로 용매를 흘려주었다. 이때 254nm, 285nm, 356nm 3가지 파장을 검출 UV 파장으로 하였고, 각각의 fraction은 용출되는 피크를 기준으로 분획하여 총 7개의 fraction을 얻게 되었다. 이를 Fr.1~Fr.7이라 명명하였으며, 각 fraction이 분리된 시간 및 용매 농도를 아래 표에 기재하였다.
각 단계에서 분리된 분획물들은 감압 농축기로 농축하고 동결건조한 후 습기가 없는 곳에서 믹서기로 균질화하였으며, 본 발명의 인진쑥 추출물 및 이의 분획물을 얻는 과정은 도 1에 나타내었다.
실험예 1. 인진쑥 추출물의 항염 활성 측정
염증반응이 유도되면 nitric oxide의 생성이 유도되는데 이를 nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안정된 형태를 greiss reagent로 측정하였다. LPS로 유도된 염증반응에서 인진쑥 추출물의 세포 염증 지표 물질인 nitric oxide(NO)의 억제 활성 분석을 위해 세포배양 시 생성된 nitrate의 양을 측정하였다. 구체적으로, RAW264.7 세포주를 10%(v/v) FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에 5 X 104 cells/ml의 세포 밀도로 96 웰 플레이트에 200㎕씩 분주하여 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 이후, LPS를 첨가한 추출물을 각기 첨가량을 달리하여 넣어 준 다음 16 시간 동안 배양하고, 세포배양 상등액 150 ㎕를 취하여 원심분리한 후 상층액 100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 5분간 반응시키고 ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준품 NaNO2를 기준으로 최종적으로 생산된 NO의 상대적인 양을 비교함으로써, 처리별 NO 억제 활성을 구하고 항염증 활성의 지표로 삼았다. LPS만 첨가한 군에서 생성된 NO의 양을 100%로 하여 시료가 첨가된 것을 %로 환산하여 평가하였다.
그 결과, LPS는 염증반응을 유도한 대조군이며 normal cell은 LPS를 처리하지 않은 세포로 염증반응이 유도되지 않았으므로 NO 억제 효과가 없었으며, 인진쑥 추출물을 농도별로 처리한 결과 NO 억제 효과가 인진쑥 추출물의 농도가 높아질수록 증가함을 확인하였다(도 2 참조). 이를 통해, 본 발명의 인진쑥 추출물이 항염 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 2. 인진쑥 추출물의 항산화 활성 측정
자유 라디칼인 DPPH에 대한 환원 또는 상쇄시키는 능력, 즉 산화 억제 활성을 확인함으로써 자유 라디칼 소거능의 항산화 활성을 측정하였다. DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 자유 라디칼로 시료에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화 활성을 측정하는 데 이용되었다. 양성 대조군 비교 물질로는 L-ascorbic acid를 사용하고 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)법으로 실험을 수행하였다. 0.2 mM DPPH 에탄올 용액 200 ㎕에 인진쑥 추출물을 2배씩 연속적으로 희석하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였디. 하기 계산식을 사용하여 자유 라디칼 소거능을 구하였으며, 전자 공여능은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
자유 라디칼 소거능 (%) = (1 - 시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) X 100
그 결과, 인진쑥 추출물을 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능이 증가하는 것으로 나타났고 100 ㎍/ml 처리 농도에서 약 84%의 라디칼 소거 활성이 있는 것으로 확인되어 인진쑥 추출물이 높은 항산화 활성을 가짐을 알 수 있었다(도 3 참조). 이를 통해, 본 발명의 인진쑥 추출물이 항산화 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 3. 인진쑥 추출물의 미백 활성 측정
(1) 세포 준비
본 발명에 따른 미백 활성 측정을 위한 실험예에서는 멜라닌을 생성하는 마우스 유래 흑색종 세포(B16F10 mouse melanoma cell)를 이용하고, 배양 배지는 10%(v/v) FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 unit/ml 스트렙토마이신을 포함한 α-MEM을 이용하였다. 배양 환경은 5% CO2, 37 ℃ 조건으로 하였다.
(2) 세포 독성 측정
B16F10 세포를 96 웰 마이크로플레이트에 1 X 103 cells/well의 농도로 배양하고, 시료를 농도별로 투여하여 48 시간 동안 배양한 후 상등액을 제거하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 측정방법에 따라 MTT 용액 100 ㎕를 36 ℃에서 4 시간 동안 처리한 후 배양액을 제거하고 DMSO 50 ㎕를 처리하여 흡광도 측정기(ELISA) 540 nm로 측정하였다. 측정값은 다음 식으로 계산하여 나타내었다.
세포독성 (%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) X 100
B16F10 세포에 인진쑥 추출물을 농도별로 처리하여 세포의 생존율을 비교한 결과, 인진쑥 추출물에 대하여 세포의 생존율이 감소되지 않아 인진쑥 추출물이 멜라노마 세포에 대하여 독성이 없음을 확인하였다(도 4 참조).
(3) 세포 내 멜라닌 농도 측정
B16F10 세포를 6 웰 마이크로플레이트에 2 X 104 cells/well의 농도로 배양하고, 시료를 농도별로 투여하여 48 시간 동안 배양한 후 상등액을 제거하였다. 세포를 튜브에 모은 후 NaOH로 세포 내 멜라닌을 용출시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
B16F10 세포에 인진쑥 추출물을 농도별로 처리하여 세포의 멜라닌 생성 정도를 비교한 결과, α-MSH(Melanocyte Stimulating Hormone)로 멜라노마 세포를 자극하여 멜라닌 생성을 유도한 후 인진쑥 추출물을 처리하면 농도 의존적으로 세포의 멜라닌 생성이 억제됨을 알 수 있었다. 인진쑥 추출물을 12.5 ㎍/ml 이상의 농도로 투여할 때 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하였으며 12.5 내지 100 ㎍/ml, 바람직하게는 50 내지 100 ㎍/ml의 농도에서 우수한 효과를 나타냈다. 특히, 인진쑥 추출물의 농도 50 ㎍/ml의 경우 α-MSH를 처리하지 않은 대조군과 비슷한 정도로 멜라닌 생성이 억제되었다(도 5 참조). 또한, 세포에서 멜라닌을 추출하여 농도 값으로 나타내었을 때 농도 의존적으로 멜라닌 생성이 억제됨을 확인하였다(도 6 참조).
(4) 세포 내 타이로시네이즈 활성 측정
B16F10 세포를 6 웰 마이크로플레이트에 2 X 104 cells/well의 농도로 배양하고, 시료를 농도별로 투여하여 48 시간 동안 배양한 후 상등액을 제거하였다. 버퍼에 용해시킨 세포를 L-DOPA(L-3,4,-dihydroxyphenylalanine)와 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
멜라노마 세포에서 멜라닌 형성과 가장 관계가 깊은 율속 단계의 효소 tyrosinase(타이로시네이즈)에 대하여 인진쑥 추출물의 효소 활성 저해 정도를 측정한 결과, α-MSH로 멜라노마 세포를 자극하여 멜라닌 생성을 유도하면 tyrosinase 활성 또한 증가(α-MSH 처리 시 tyrosinase의 활성이 약 157%로 나타남)하고, 인진쑥 추출물 처리 시 농도 의존적으로 tyrosinase의 활성이 저해(인진쑥 추출물의 농도 50 ㎍/ml의 경우 tyrosinase의 활성이 α-MSH를 처리하지 않은 상태의 멜라닌을 100%로 하였을 때 약 107%인 것으로 나타남)되는 것으로 나타났다(도 7 참조). 인진쑥 추출물을 12.5 ㎍/ml 이상의 농도로 투여할 때 티로시나아제 활성 억제 효과가 우수하였으며 12.5 내지 100 ㎍/ml, 바람직하게는 50 내지 100 ㎍/ml의 농도에서 우수한 효과를 나타냈다.
(5) 결과 정리
상기 본 발명에 따른 실험예 1~3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 인진쑥 추출물은 항염, 항산화 또는 피부 미백 활성을 나타내는 것을 알 수 있었고, 이를 유효성분으로 하는 조성물은 인진쑥 추출물을 12.5 내지 100 ㎍/ml, 바람직하게는 25 내지 100 ㎍/ml, 더욱 바람직하게는 50 내지 100 ㎍/ml의 농도로 처리할 때 우수한 항염, 항산화 및 피부 미백 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 100 ㎍/ml 이상의 농도에서도 100 ㎍/ml 처리군과 동일/유사한 효과를 나타냄을 확인하였으며, 상기 제시된 바람직한 농도는 in vitro에서 세포 처리 시 이용된 농도에 따른 것으로서, 본 발명에 따른 인진쑥 추출물의 농도가 이에 한정되는 것은 아니다.
실험예 4. 인진쑥 유기용매 분획물의 미백 활성 측정
상기 실시예 2에서 제조된 본 발명의 인진쑥 유기용매 분획물(에틸아세테이트 분획물, 물 분획물, 메탄올 분획물, 헥산 분획물) 각각이 인진쑥 추출물과 유사한 활성을 나타내는 지 확인하기 위하여, 상기 실험예 3.(3)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 세포 내 멜라닌 농도를 측정하여, 미백 활성을 확인하였다.
구체적으로, 미백 활성 측정을 위하여 멜라닌을 생성하는 마우스 유래 흑색종 세포(B16F10 mouse melanoma cell)를 이용하고, 배양 배지는 10%(v/v) FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 unit/ml 스트렙토마이신을 포함한 α-MEM을 이용하였으며, 배양 환경은 5% CO2, 37 ℃ 조건으로 하였다. 세포 내 멜라닌 농도 측정을 위해 B16F10 세포를 6 웰 마이크로플레이트에 2 X 104 cells/well의 농도로 배양하고, 각 시료(추출물 또는 분획물)를 농도별로 투여하여 48 시간 동안 배양한 후 상등액을 제거하였다. 세포를 튜브에 모은 후 NaOH로 세포 내 멜라닌을 용출시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, (1)에탄올 추출물, (2) 에틸아세테이트 분획물, (3) 물 분획물, (4) 메탄올 분획물, (5) 헥산 분획물 중에서, (1)에탄올 추출물, (2) 에틸아세테이트 분획물, (4) 메탄올 분획물에서는 농도 의존적으로 세포의 멜라닌 생성이 억제됨을 알 수 있었으며, 이에 비해 (3) 물 분획물과 (5) 헥산 분획물에서는 멜라닌 생성을 억제하는 활성을 확인할 수 없었다(도 8 및 도 9 참조).
IC50 값은 inhibitory concentration 50 (fifty), inhibition concentration 또는 저해농도를 뜻하는 용어로서, 어떠한 반응 A의 크기를 100%로 가정하였을 때, B라는 약물을 이용하여 반응 A의 크기를 50%로 감소시킬 수 있으면, 그때의 B의 농도를 반응 A에 대한 B의 IC50이라고 한다. 만일 IC50 값이 1.4μg/ml 이면 어떤 반응을 50％로 저해시키는데 1.4μg/ml만 처리하면 된다는 말이다. 결국 IC50 값이 작을수록 반응을 저해시키는 능력이 강력한 것이 된다. 미백 활성을 보이는 (1)에탄올 추출물, (2) 에틸아세테이트 분획물, (4) 메탄올 분획물에 대해 IC50 값을 측정하여 비교한 결과는 아래 표와 같다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, 인진쑥을 에탄올로 추출하여 추출물을 제조하고 이어서 에틸아세테이트와 물의 혼합용액과 90%메탄올과 헥산의 혼합용액으로 순차적으로 추출한 결과, 에탄올 추출물에 비해 에틸아세테이트 추출물은 동일 중량 대비 2.15배, 메탄올 분획물은 동일 중량 대비 3.74배의 높은 미백 활성(멜라닌 생성 저해 능력)을 나타냄을 알 수 있었다.
이를 TLC(Thin Layer Chromatography) 방법을 이용하여 확인한 결과, 365nm 파장의 UV를 조사하였을 때 활성성분으로 예상되는 물질이 미백활성을 나타내는 분획물에만 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 10 c 참조).
결론적으로, 본 발명의 에틸아세테이트 분획물 및 이의 메탄올 분획물은 인진쑥 추출물에 비해 훨씬 더 높은 미백 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 이는 활성성분이 농축되었기 때문으로 예상할 수 있다.
실험예 5. 인진쑥 세부 분획물의 미백 활성 측정
상기 실시예 3에서 제조된 본 발명의 인진쑥 유기용매 분획물의 세부 분획물(Fr.1~Fr.7) 각각이 인진쑥 추출물 또는 이의 유기용매 분획물과 유사한 활성을 나타내는 지 확인하기 위하여, 상기 실험예 3.(3)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 세포 내 멜라닌 농도를 측정하여, 미백 활성을 확인하였다.
그 결과, Fr.1~Fr.5 세부 분획물에서 미백 활성(멜라닌 생성 억제 활성)이 있음을 확인하였으며, 이는 90% 메탄올 분획물을 20% 내지 66.6% 농도의 에틸아세테이트 용액을 처리하여 얻어진 분획물의 미백 활성이 훨씬 더 우수함을 의미한다.
결론적으로, 본 발명의 인진쑥 추출물, 또는 이의 유기용매 분획물은 모두 우수한 미백 활성을 나타내며, 그 중에서도 인진쑥 에탄올 추출물을 에틸아세테이트 및 90% 메탄올을 순차적으로 처리하여 얻어진 분획물에, 20%~ 67%의 에틸아세테이트 용액을 용매로 하여 추가 분리하였을 때 얻어진 세부 분획물이 가장 우수한 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 특히, 에틸아세테이트의 농도가 20 내지 50%, 또는 55 내지 66%인 Fr.1~Fr3, Fr.5에서 매우 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 나타냄을 확인하였다.
뿐만 아니라, 양성 대조군으로 사용된 500 ug arbutin과 비교하였을 때, 본 발명의 분획물은 17배나 낮은 농도인 30ug으로 처리하였을 때에도 멜라닌이 거의 생성되지 않음을 확인하였으며, 따라서 본 발명에 따른 분획물은 적은 농도에서도 매우 우수한 활성을 나타내어 화장품, 비누, 약제 또는 식품 등의 다양한 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (22)
- 하기 단계를 통해 얻어진 인진쑥(Artemisia Capillaris) 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 활성을 갖는 조성물:
1) 인진쑥(Artemisia Capillaris)을 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출물을 얻는 단계;
2) 상기 추출물을, 에틸아세테이트의 농도가 40 내지 70%인 물과 에틸아세테이트의 혼합용액을 용매로 추출하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계:
3) 상기 에틸아세테이트 분획물을, 메탄올의 농도가 70 내지 95%인 메탄올과 헥산 혼합 용액을 용매로 추출하여 메탄올 분획물을 얻는 단계; 및
4) 상기 메탄올 분획물을 에틸아세테이트와 헥산의 혼합 용액을 용매로 하여 분리하였을 때, 용매 내 에틸아세테이트의 농도가 10 내지 70%인 분획물을 획득하는 단계.
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 2)단계의 물과 에틸아세테이트의 혼합용액은 에틸아세테이트의 농도가 50 내지 60%인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 2)단계의 물과 에틸아세테이트의 혼합용액은 에틸아세테이트의 농도가 50%인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 3)단계의 메탄올과 헥산 혼합 용액은 메탄올의 농도가 80 내지 90%인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 3)단계의 메탄올과 헥산 혼합 용액은 메탄올의 농도가 90%인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 4)단계의 에틸아세테이트와 헥산 혼합 용액은 에틸아세테이트의 농도가 20 내지 50%, 또는 55 내지 70%인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 4)단계의 에틸아세테이트와 헥산 혼합 용액은 에틸아세테이트의 농도가 20 내지 50%, 또는 55 내지 66%인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 삭제
- (1) 인진쑥(Artemisia Capillaris) 건조물을 준비하는 단계;
(2) 상기 건조물에 물, C1~C2의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에서 얻어진 추출물에, 에틸아세테이트의 농도가 40 내지 70%인 에틸아세테이트와 물의 혼합 용액을 용매로 하여 추출하는 단계;
(4) 상기 (3)단계에서 얻어진 추출물에, 메탄올의 농도가 70 내지 95%인 메탄올과 헥산의 혼합 용액을 용매로 추출하는 단계;
(5) 상기 (4)단계에서 얻어진 추출물을 에틸아세테이트와 헥산의 혼합 용액을 용매로 분리하였을 때, 용매 내 에틸아세테이트의 농도가 10 내지 70%인 분획물을 획득하는 단계를 포함하는, 인진쑥 분획물의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 19항에 있어서,
상기 (5)단계의 분리는, 순상 실리카겔(silicagel) 또는 역상 ODS (octadecylsilyl silica gel)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 인진쑥 분획물의 제조방법.
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