KR101816345B1 - 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법에 대한 것으로, 상세하게는 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 미토콘드리아 기능 저하에 의해 암세포에서 변이되는 상기 주요 유전자를 이용하여 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단을 위한 유용한 바이오마커로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법에 관한 것이다.
미토콘드리아는 세포가 필요로 하는 에너지 생성을 관장하는 세포 내 소기관이다. 정상세포는 산소가 존재하는 환경에서는 미토콘드리아의 산화적 인산화 과정을 통해 에너지를 생성하고, 산소가 존재하지 않는 경우 해당과정만을 이용해 에너지를 생성한다. 그러나 많은 암세포의 경우, 미토콘드리아의 ATP 생성능력이 저하되어 있는 것이 관찰되어 있고, 산소의 존재 유무와 상관없이 해당과정에 의존적으로 ATP를 합성한다. 이와 같이 암세포에서 관찰되는 미토콘드리아 기능의 저하가 어떠한 기전에 의해 나타나며, 암세포의 증식능력과 전이활성(invasion)에 어떻게 연관되어 있는지에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 최근 몇몇 연구들에서 유방암, 위암 또는 간암을 포함한 여러 암 형태에서 미토콘드리아 기능 저하가 암의 전이를 촉진한다고 보고하였다. 즉, 미토콘드리아 결핍은 암의 진행에 있어 중요한 역할을 한다는 것은 밝혀졌다. 따라서, 암의 진행에 있어 미토콘드리아 결핍이 담당하는 주요 조절 기작을 밝히는 것은 매우 중요하다.
본 발명의 목적은 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 암 환자 시료로부터 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법에 대한 것으로, 상세하게는 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 미토콘드리아 기능 저하에 의해 암세포에서 변이되는 상기 주요 유전자를 이용하여 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단을 위한 유용한 바이오마커로 활용될 수 있다.
도 1은 미토콘드리아 결핍된 침습성 간암세포의 유전자 발현 변화에 대한 결과이다. 3개의 다른 SNU 간암세포주(SNU354, SNU387 및 SNU423) 및 Ch-L 클론은 지수성장기를 유지하기 위하여 2시간 동안 배양하였다. (a) 세포 산소소비율(oxygen consumption rate; OCR)은 XF analyzer를 이용하여 측정하였다. (b) 미토콘드리아 호흡 서브유닛에 대한 웨스턴블랏 분석결과이다. (c) 세포 침습 활성은 MatrigelTM-코팅된 TranswellTM을 사용하여 수행하였다. 침습된 세포수를 측정히였다. 침습된 세포에 대한 대표적 사진을 아래 패널에 나타냈다. **, p<0.01 vs. Ch-L by student t-test. (d) 미토콘드리아 호흡 활성 간암세포 및 미토콘드리아 호흡 결핍 간암세포 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자들의 열지도(Heatmap)를 나타낸다(미토콘드리아 '종양 결핍(tumoral defect)' 특성). 유전자 발현 프로파일링을 수행한 결과, 발현에 차이를 보이는 전체 2774개 유전자는 2배 이상의 발현 차이를 나타냈다. 이중에서, 미토콘드리아 활성 세포와 비교하여 미토콘드리아 결핍된 세포에서 1301개 유전자들이 공통적으로 상향-조절되었고, 1473개 유전자들이 하향-조절되었다. (e) 공통적으로 상향-조절된 유전자들(1301개 유전자들) 및 하향-조절된 유전자들(1473개 유전자들)에 대한 기능적 농축도 분석 결과를 나타낸다. 농축화 점수는 유전자 집합 농축화 분석으로부터 계산된 -log 10 전환된 p-values를 나타낸다.
도 2는 CMD 유전자 특성의 분석 결과이다. (a) Ch-L 클론은 4개의 다른 호흡 억제제를 12시간 동안 처리하여 분석하였다: 5 μM Rotenone (Ro), 200 μM TTFA, 5 μM antimycin A (AA) 또는 5 μM oligomycin (Oli). 세포의 유전자 발현 프로파일을 비교한 결과, 공통적으로 상향-조절된 131개 유전자를 얻었다(미토콘드리아 '기능 결핍(functional defect)' 특성). (b) MDA-MB435 및 이의 ρ0 세포의 유전자 발현 프로파일을 비교한 결과, 상향-조절된 1760개 유전자를 얻었다(미토콘드리아 '유전적 결핍(genetic defect)' 특성). (c) 3개의 독립적인 미토콘드리아 결핍 조건(종양, 유전적 및 기능 결핍)으로부터, 10개의 유전자를 CMD 특성으로 얻었다. (d) 및 (e) 독립적인 공개 데이터(GSE4024 및 GSE14520)로부터 얻은 전체 생존율(왼쪽 패널) 및 재발 없는 생존율(오른쪽 패널)의 Kaplan-Meier plot 분석 결과를 각각 나타낸다. 환자들은 CMD 특성의 발현 상태를 기초로 하여 계층화시켰다(CMD_UP vs CMD_DOWN).
도 2는 CMD 유전자 특성의 분석 결과이다. (a) Ch-L 클론은 4개의 다른 호흡 억제제를 12시간 동안 처리하여 분석하였다: 5 μM Rotenone (Ro), 200 μM TTFA, 5 μM antimycin A (AA) 또는 5 μM oligomycin (Oli). 세포의 유전자 발현 프로파일을 비교한 결과, 공통적으로 상향-조절된 131개 유전자를 얻었다(미토콘드리아 '기능 결핍(functional defect)' 특성). (b) MDA-MB435 및 이의 ρ0 세포의 유전자 발현 프로파일을 비교한 결과, 상향-조절된 1760개 유전자를 얻었다(미토콘드리아 '유전적 결핍(genetic defect)' 특성). (c) 3개의 독립적인 미토콘드리아 결핍 조건(종양, 유전적 및 기능 결핍)으로부터, 10개의 유전자를 CMD 특성으로 얻었다. (d) 및 (e) 독립적인 공개 데이터(GSE4024 및 GSE14520)로부터 얻은 전체 생존율(왼쪽 패널) 및 재발 없는 생존율(오른쪽 패널)의 Kaplan-Meier plot 분석 결과를 각각 나타낸다. 환자들은 CMD 특성의 발현 상태를 기초로 하여 계층화시켰다(CMD_UP vs CMD_DOWN).
이에, 본 발명자들은 암의 진행에 있어서 미토콘드리아 결핍이 담당하는 주요 조절 기작을 밝히고자 하였다. 본 발명자들은 간암세포에서 미토콘드리아 결핍이 일어나는 것을 확인하고, 독립적으로 설계된 3개의 미토콘드리아 결핍 모델(낮은 호흡 활성을 가진 간암세포, i.e., 종양 결핍; 약학적으로 호흡을 억제한 세포, i.e., 기능 결핍; 및 미토콘드리아 DNA 결핍된 암세포, i.e., 유전적 결핍)의 유전자 발현 프로파일링을 수행함으로써, 10개의 공통된 미토콘드리아 결핍 (common mitochondrial defect; CMD) 유전자들을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 NUPR1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 암은 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "NFIX"는 Nuclear factor 1 X-type(CCAAT-binding transcription factor)으로서, NCBI accession no. NC_000019.10 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SEL1L3"는 sel-1 suppressor of lin-12-like 3으로서, NCBI accession no. NC_000004.12 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "NFE2L1"은 nuclear factor, erythroid 2-like 1로서, NCBI accession no. NC_000017.11 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "PABPC1L"은 poly(A) binding protein, cytoplasmic 1-like로서, NCBI accession no. NC_000020.11 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "HINT3"는 histidine triad nucleotide binding protein 3으로서, NCBI accession no. NC_000006.12 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "PSPH"는 phosphoserine phosphatase로서, NCBI accession no. NC_000007.14 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "TGFB1"은 transforming growth factor, beta 1로서, NCBI accession no. NC_000019.10 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "PPP1R15A"는 protein phosphatase 1, regulatory subunit 15A로서, NCBI accession no. NC_000019.10 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "TMEM49"는 Transmembrane protein 49로서, NCBI accession no. NC_000017.11 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "NUPR1"은 nuclear protein transcriptional regulator 1 또는 nuclear protein 1로서, NCBI accession no. NC_000016.10 내에 존재할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
또한, 본 발명의 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 NUPR1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 암은 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 언급한 하나 이상의 단백질 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
상기 "펩타이드"란 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 펩티드는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체가 아닌 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미한다.
또한, 본 발명은 (1) 암 환자 시료로부터 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (2) 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 (1) 단계에서는 NUPR1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 더 측정할 수 있다. 바람직하게는 상기 암은 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “환자 시료”란 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오 마커인 상기 유전자들의 발현수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “미토콘드리아 결핍된 암”, “미토콘드리아 호흡 결핍된 암”또는“미토콘드리아 기능 저하된 암”이란, 암세포에서 미토콘드리아의 ATP 생성능력이 저하되는 것을 의미한다. 한편, 유방암, 위암 또는 간암을 포함한 여러 암 형태에서 미토콘드리아 기능 저하가 암의 전이를 촉진한다고 보고하였다(PLoS One 2013;8:e61677, Biochim Biophys Acta 2012;1820:1102-1110, PLoS One 2013;8:e69485).
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
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실험예
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하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포 배양 및 미토콘드리아 결핍 조건 확립
인간 간암세포(SNU-354, SNU-387 및 SNU-423)는 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)로부터 구입하였고, 10% GIBCOTM fetal bovine serum (FBS; Invitrogen) 및 GIBCOTM antibiotics (Invitrogen)가 첨가된 GIBCOTM RPMI1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 5% CO2 습윤배양기로 37℃에서 배양하였다. Chang 세포 클론은 단일 세포 희석 및 Chang cell 확장(ATCC, Rockville, MD)에 의해 분리되었다. 알부민 및 카바모일-포스페이트 합성효소-1(carbamoyl-phosphate synthase-1)의 간 특이적 발현을 확인함으로써 검증한 강한 간 특성(hepatic characteristics; Ch-L)을 가진 Chang 클론을 본 발명에 사용하였다. Ch-L 클론은 10% GIBCOTM FBS가 첨가된 GIBCOTM Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Invitrogen)에서 배양하였다.
3개의 다른 미토콘드리아 결핍 조건을 확립하였다. '종양 결핍(tumoral defect)'에 있어서는, 미토콘드리아 결핍된 간세포(SNU-354 및 SNU-423)를 사용하였다. '기능 결핍(functional defect)' 조건은 Ch-L 클론을 서브-세포독성을 나타내는 양의 호흡 억제제[rotenone (complex I inhibitor), TTFA (complex II inhibitor), antimycin A (complex III inhibitor) 및 oligomycin (complex V inhibitor)에 12시간 동안 노출시켜 확립하였다. 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA; mtDNA)가 결핍된, MDA-MB435의 Rho0 클론은 Singh KK로부터 제공받았고, '유전적 결핍(genetic defect)' 조건으로 사용하였다.
2. 인간
HCC
검체
HCC 종양 및 주변 조직은 2008년 8월부터 2010년 1월까지 아주대학교 병원에 내원한 23명의 HCC 환자(34-70세)로부터 얻었고, 아주대학교 기관생명윤리위원회를 통해 환자의 동의를 받았다. 본 발명에 참가한 환자 중 수술 전 화학치료 또는 방사선 치료를 받은 환자는 없었다.
3. 유전자 발현 프로파일링 및 데이터 분석
바이오틴화된 cDNA를 얻기 위해서, Ambion Illumina RNA amplification kit (Ambion, Austin, TX)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 총 RNA를 증폭시켰고 분리하였다. 자세히 설명하면, oligo-dT primers를 이용하여 550 ng의 총 RNA가 cDNA로 역전사되었다. 이중 가닥 cDNA를 합성하였고, 시험관내(in vitro) 전사하였으며, 바이오틴화된 dNTP로 표지하였다. 표지된 cDNA 샘플 (750 ng)은 각각 human HT-12 expression v.4 bead array로 혼성화시켰고, 분석 신호의 검출은 제조사의 지시에 따라 수행하였다(Illumina, Inc., San Diego, CA). 미가공 데이터는 p-value < 0.05의 검출값으로 필터링하였고, log2 전환 및 분위수 표준화에 의해 추가적으로 가공하였다. 유전자 온톨로지 분석은 및 신호 경로 분석은 DAIVD software를 이용하여 수행하였다. 각 환자에 대해 동정된 유전자 특성 확인을 위한 유전자 집합 농축도 분석(gene set enrichment analysis)에 있어서, 농축도 점수(enrichment scores; ES)는 non-parametric Kolmogorov-Smirnov test analysis에 적용하여 계산하였다. -log10 전환된 p-values가 ES로서 사용되었고, ES의 유의성은 p<0.05에 의해 측정되었다. 임상적 검증을 위해서, 두 개의 독립적인 cohort 1(GSE4024, GSE1898, n=139) 및 cohort 2 (GSE14520, n=247)의 HCC 유전자 발현 프로파일 데이터 세트를 Gene Expression Omnibus (GEO) database로 얻었고, 유전자 및 어레이 센터링(gene and array centering)에 의해 전처리하였다. 모든 데이터 가공 및 생존 분석은 R/Bioconductor packages를 사용하였다.
4. 세포 산소소비율(
cellular
oxygen
consumption
rate
;
OCR
) 측정
미토콘드리아 호흡 활성을 관측하기 위해서, Seahorse XF24 analyzer (Seahorse Bioscience Inc., MA)를 이용하여 OCR을 측정하였다.
5. 세포 침습 분석
세포 침습 분석은 미리-코팅된 7% Growth Factor Reduced BD MatrigelTM Matrix (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)로 이루어진 TranswellTM Permeable Supports (8-μm pore size; Corning, Acton, MA)를 이용하여 수행하였다.
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실시예
1> 간암세포에서의 미토콘드리아 호흡 결핍-관련 전사
리프로그래밍
특성 분석
우선, 본 발명자들은 3개의 다른 간암세포주(SNU387, SNU354, and SNU423)의 미토콘드리아 호흡 상태 및 세포 침습 활성을 시험하였다. Ch-L 클론을 분리하였고, 간-특이적 유전자를 갖는 것으로 나타났다. 상기 클론은 활성 미토콘드리아에 대한 대조군으로 사용하였다. SNU387 세포는 Ch-L과 유사한 OCR 활성을 갖는 반면, SNU354 및 SNU423 세포는 OCRs이 감소하였는데, 이는 미토콘드리아 호흡 결핍을 나타내는 것이다(도 1a). 미토콘드리아 호흡 결핍 여부에 대해 확인하기 위해서, 몇몇 미토콘드리아 복합체 단백질들(I, II, III 및 IV)의 발현 수준을 관측하였다. SNU354 및 SNU423는 Ch-L 및 SNU387 보다 낮은 수준으로 미토콘드리아 복합체 단백질을 발현하였다(도 1b). 미토콘드리아 결핍과 악성 간암과의 연관성을 확인하기 위해서, 침습성을 관측하였다. 예상대로, 미토콘드리아 결핍된 세포(i.e., SNU354 및 SNU423 세포)는 SNU387 및 Ch-L 세포보다 침습성이 높았다(도 1c). 종합하면, 상기 결과는 SNU354 및 SNU423 세포가 미토콘드리아 호흡 손상과 관련된 암세포 침습성을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이는 암의 진행에 있어서 미토콘드리아 결핍의 역할을 연구하는데 적절한 모델이 될 수 있다.
간암세포에서 미토콘드리아 손상과 연관된 전사체적 조절을 연구하기 위해서, SNU354 및 SNU423 세포에 대한 유전자 발현 프로파일링을 진행하였고, Ch-L 및 SNU387 세포와 1.4 배 차이가 나는 수준을 컷오프로 하여 차등적으로 발현되는 유전자들을 동정하였다. 전체 1,301개의 유전자들이 상향-조절되었고, 1,473개의 유전자들이 하향-조절되었으며(도 1d), 이를 '종양 결핍(tumoral defect)' 유전자로 명명하였다. 기능적 유전자 집합 농축도 분석(gene set enrichment analysis) 결과, 세포 이동(cell migration) 및 세포골격 구성(cytoskeleton organization)과 관련된 유전자들이 SNU354 및 SNU423 세포에서 분명하게 상향-조절되는 것으로 나타났는데(도 1e), 이는 상향-조절된 유전자들이 공격적인 표현형의 습득과 관련되어 있고, 미토콘드리아 결핍에 의해 조절된다는 것을 나타낸다.
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실시예
2>
CMD
유전자들의 분석
1,301개의 상향-조절되는 유전자들로부터 미토콘드리아 호흡 결핍에 의해 직접적으로 조절되는 유전자들을 선택하기 위해서, 본 발명자들은 2개의 추가적인 미토콘드리아 결핍된 세포 조건을 확립하였다: (1) 여러 약학적 미토콘드리아 호흡 억제제에 노출된 세포에 의한 직접 '기능 결핍(functional defect)' 및 (2) mtDNA가 결핍된 ρ0 세포를 이용한 '유전적 결핍(genetic defect)'. 직접 기능 결핍 조건의 유전자 발현 프로파일링 결과, 직접적 호흡 억제에 대하여 131개의 상향-조절된 유전자 및 118개의 하향-조절된 유전자들이 공통적으로 나타났다(도 2a). Rho0 세포 및 모체인 MDA-MB435 세포주와의 유전자 발현 비교 결과, Rho0에서 1,760개의 상향-조절된 유전자 및 1,604의 하향-조절된 유전자가 밝혀졌다(도 2b). 3개의 독립적인 미토콘드리아 결핍 모델(종양 결핍, 기능 결핍 및 유전적 결핍)을 비교하여, 결국 10개의 CMD 유전자(NFIX , SEL1L3 , NFE2L1 , PABPC1L , NUPR1 , HINT3 , PSPH , TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49)를 얻었다(도 2c). 간암세포에서 독립적인 자극에 의해 상기 10개의 유전자들은 미토콘드리아 손상에 대하여 직접적으로 유도될 수 있는 것으로 보인다.
CMD 유전자들의 임상적 유의성을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 2개의 독립적인 간암 코호트[cohort 1 (GSE4024, n=139) 및 cohort 2 (GSE14520, n=247)]를 이용하여 상기 유전자들의 발현 증가 및 전체 생존율(overall survival; OS) 및 재발 없는 생존율(recurrence-free survival; RFS)과 같은 임상적 결과 사이의 연관성을 분석하였다. CMD 유전자들(ES>1.3, p<0.05)의 농축도 점수(enrichment scores; ES)를 기초로 환자를 계층화한 결과, CMD 유전자들의 발현이 증가한 환자들은 더 낮은 OS (cohorts 1 및 2에 있어서 각각 p=0.025 및 p=0.0005) 및 RFS (cohorts 1 및 2에 있어서 각각 p=0.008 및 p=0.0002)로 좋지 않은 예후를 나타냈다(도 2d 및 도 2e). 상기 결과들은 HCC 진행에 있어 중심 역할을 수행할 수 있는 CMD 특성의 유의적 예후 타탕성을 나타냈다.
Claims (11)
- NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 간암 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 NUPR1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 저하된 간암 진단용 바이오마커 조성물.
- 삭제
- NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 간암 진단용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 키트는 NUPR1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 저하된 간암 진단용 키트.
- 삭제
- (1) 간암 환자 시료로부터 NFIX, SEL1L3, NFE2L1, PABPC1L, HINT3, PSPH, TGFB1, PPP1R15A 및 TMEM49로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(2) 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제7항에 있어서, 상기 (1) 단계에서는 NUPR1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 더 측정하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 저하된 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 삭제
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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