KR101809447B1

KR101809447B1 - 류코노스톡 메센테로이드 drc1506 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101809447B1
Application number: KR1020160158488A
Authority: KR
Inventors: 최혜영; 류병희; 김대현
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2017-12-15

Abstract

본 발명은 만니톨 생성능, 및 가바(GABA) 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(KCCM11712P) 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 고만니톨 생성능을 가지며 가바 생성능이 우수하다. 이에, 본 발명은 상기 균주 및 이의 배양물을 포함하는 식품 첨가제 및 발효식품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(KCCM11712P)는 김치 제조를 위한 발효 스타터(starter) 균주로 사용될 수 있다.

Description

류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주 및 이의 용도{Leuconostoc mesenteroides DRC1506 and Use thereof}

본 발명은 내산성 및 내담즙성이 우수하고 만니톨 및 가바 생성능이 우수한 신규의 류코노스톡 메센테로이드 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법에 관한 것이다.

김치는 주원료인 절임 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 파 등을 혼합한 후, 저온에서 발효시킨 식품으로 과거에는 주로 가정에서 자체적으로 생산이 되어온 식품이었으나 생활환경의 변화에 의해 최근에는 상품화된 김치의 유통이 활발한 실정이다.

그러나 일반적으로 시중에서 판매되고 있는 상품김치의 경우, 같은 원료와 방법을 사용하여 제조하여도 김치 발효를 주도하는 젖산균의 종류와 수가 달라지고 숙성 중에는 그 차이가 더욱 커져 김치의 맛을 일정하게 재현하는 것이 어려운 문제점이 발생한다.

최근에는 이러한 문제점을 해결하기 위해, 김치에서 유래되는 유산균을 분리하여 김치 제조시 스타터(starter)로 첨가함으로써, 김치의 맛과 품질을 조절하려는 연구들이 진행되고 있으며 특히 류코노스톡 메센테로이드를 이용하여 김치의 품질을 향상시키려는 연구가 계속 진행되고 있다.

류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides)균주는 이형젖산발효균으로, 김치의 숙성시 증가하여 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 내는 주된 요인 중 하나이다. 김치 제조시 초기부터 생육을 시작하여 이산화탄소, 젖산, 초산, 에탄올, 가바 및 만니톨 등의 대사산물을 생산함으로써 김치를 복합적이고 독특한 풍미를 지닌 상태로 발효시킨다. 또한, 생산된 이산화탄소로 하여금 김치 내부를 혐기적 조건으로 유지시켜 호기성 세균의 번식을 강력히 억제시킴으로써 정상적인 김치 발효가 되게 한다고 알려져 있다.

한편, 만니톨(mannitol)은 버섯, 포도 등의 과일이나 해조류 등에 광범위하게 존재하는 6탄소 당알코올이며, 항산화 능력, 증점제, 항고착제, 보습제 등의 기능이 있어 식품의 저장수명을 연장하는데 도움을 주어 식품이나 의약품 등의 제조에 많이 사용되고 있다. 또한, 만니톨은 감미도가 설탕의 0.4 내지 0.5배이고, 열량은 설탕의 열량인 4.2kcal/g의 1/3 정도인 1.6kcal/g으로 낮아 대체 감미료로 사용되고 있다. 특히, 김치의 발효 과정 중 과당으로부터 젖산균이 함유하는 만니톨 디하이드로게나아테(mannitol dehydrogenase)라는 효소에 의해 적숙기 이후 생성되는 만니톨은 상쾌하고 부드러운 단맛이 있으므로 김치에서 청량감을 주고 신맛을 억제하여 김치가 과도하게 시어지는 현상을 억제하기 때문에 김치의 맛을 향상시키는데 도움이 된다고 보고되어 있다(비특허문헌 1).

가바(GABA; γ-aminobutyric acid)는 포유류의 뇌속에 존재하는 아미노산으로서 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 글루타메이트로부터 생성되는 신경전달물질이다. 특히, 혈관의 운동을 활성화시켜 혈압을 저하시키고, 뇌기능 개선작용을 하여 정신안정 및 학습능력을 증가시킨다고 알려져 있다. 김치의 맛뿐만 아니라 기능성을 향상시키기 위한 일환으로 이러한 가바가 다량 함유된 김치가 개발된 바 있으나(한국등록특허 제10-0536108호) 대두단백질이나 두유 등을 첨가하여 간접적으로 가바가 김치 내에서 생산되게 하였기 때문에, 대두나 두유 등에 의해 김치 고유의 맛이 없어질 수도 있다는 문제점이 있다.

한국등록특허 제10-0536108호

Falguni Patra et al 2011; Seung Hoon Song et al 2009

본 발명자들은 김치의 품질 및 관능을 향상시키고 김치의 발효 상태를 조절할 수 있는 신규한 유산균 스타터를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 김치로부터 내산성, 내담즙성이 우수할 뿐만 아니라 만니톨 및 가바 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주를 새로이 분리 및 동정하는데 성공하였으며, 상기 균주의 발효제품에 대한 응용가능성을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 내산성, 내담즙성이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides )DRC1506 균주(KCCM11712P)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)DRC1506 균주(KCCM11712P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 첨가용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 본 발명의 균주(KCCM11712P)를 이용한 김치를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 본 발명의 김치의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 내산성 및 내담즙성이 우수하고 만니톨 및 가바 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(KCCM11712P)를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides ) DRC1506 균주(KCCM11712P)는 pH3.0~5.0에서 내산성, 옥스갈 0.3~0.5%에서 내담즙성을 갖는다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주는 유산균으로서 김치에서 분리하였으며, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다.

본 발명의 미생물의 동정은 미생물의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 이루어졌다.

미생물의 분리 및 동정

본 발명의 신규 유산균은 관능 평가를 통해 가장 풍미가 우수한 시점의 김치 시료를 PES 아가 배지 플레이트에 접종한 후 배양하고, 생성된 각각의 콜로니를 PES 아가 플레이트에 획선 접종한 다음 배양하여 유산균 콜로니들을 분리하였다.

그 다음, 상기 분리된 유산균 콜로니들을 MRS 브로스에 접종한 후 배양하여 산 생성이 가장 적은 유산균을 선별하였다. 또한, 상기 분리된 유산균 콜로니들을 젖산(lactic acid)으로 pH 3.0, 3.5, 4.0, 5.0으로 각각 조정한 MRS 브로스에 각각 접종한 후 배양하면서 상기 pH 범위에서도 가장 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다.

또한, 상기 분리된 유산균 콜로니들을 옥스갈(oxgall)로 0.3, 0.5, 1, 2, 3%로 조정한 MRS 브로스에 각각 접종한 후 배양하면서 생균수를 관찰하여 상기 담즙 농도에서도 생육이 활발한 내담즙성 균주를 선별하였다.

한편, 유해 미생물을 뉴트리언트 아가배지에 1% 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조한 후 여기에 코크 보어러로 직경 9 mm의 구멍을 뚫고 상기 분리한 각각의 유산균 배양 상등액을 적하시킨 다음, 배양 후 억제 환을 형성하는 유산균 중 가장 우수한 균주를 선발하였다.

이렇게 선별된 유산균을 동정한 결과, 그람 양성 균주이며 구균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

이후, 상기 균주를 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효 패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정한 결과, 상기 선별된 유산균은 하기 표 5의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는, 류코노스톡 메센테로이드에 속하는 균주인 것으로 판명되었고, 16S rRNA 유전자 염기서열(Gene Sequence)을 이용하여 얻어진 결과(도 2)와 일치하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 유산균을 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506으로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2015년 6월 19일자로 기탁하였다(KCCM11712P).

본 발명의 유산균의 내산성

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주는 종래 류코노스톡 속 균주에 비하여 내산성이 현저히 강하고, pH 3.0-4.0에서 생육이 활발하게 유지된다(표 1).

본 발명의 유산균의 내담즙성

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주는 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비하여 내담즙성이 현저히 강하고, 옥스갈 0.3~0.5 %에서 내담즙성을 갖는다(표 3).

본 발명의 유산균의 저 산생성능

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주는 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비하여 산도값(0.5-0.6%)이 낮고 pH는 5.0~5.3 으로 높으며 CaCO₃ 배지에서 환의 직경이 가장 작은 저산생성 유산균이다(표 2).

본 발명의 유산균의 항균력

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1560 균주는 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCCM11774), 스타필로코커스 아우레우스(Staplyococcus aureus KCCM 11335), 및 대장균(E.coli)에 대한 항균력이 우수하였다(표 5).

한편, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1560 균주는 위해성을 분석 결과, biogenic amin 검사에서 음성으로 나타나 인체에 안정한 균주로 확인되었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(KCCM11712P) 또는 이의 배양물을 포함하는 정장용 조성물 또는 생균제 조성물을 제공한다.

상기 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 mg/kg이다.

본 발명의 정장용 조성물 또는 생균제 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 등으로 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(KCCM11712P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 첨가용 조성물 또는 발효식품을 제공한다.

본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(KCCM11712P) 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식, 유제품 등의 식품에 대한 식품 첨가용 조성물(식품첨가제)로 사용될 수 있다.

상기 식품 첨가용 조성물은 본 발명에 따른 균주 또는 이의 배양물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.

상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크 로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일 리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양물은 발효식품의 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기 발효식품은 치즈, 발효생식제품, 발효주 및 김치 등을 포함한다.

상기 발효식품은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 발효생식식품은 현미 및 율무 등의 곡류 분말에 본 발명의 균주를 처리하여 적정 온도에서 발효시킨 후, 백태, 찹쌀, 수수 등의 다양한 농산물을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 제조할 수 있다.

발효주를 제조하는 경우에는, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 전분질 원료를 액화 및 당화하여 당화액을 얻고, 상기 당화액에 효모 및 본 발명의 균주의 배양물을 첨가하여 알코올을 발효시킨 후 수득한 발효액을 여과하여 제조할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 발효식품은 김치이다.

김치를 제조하는 경우에는, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 예컨대, 소금으로 절인 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕과 같은 일반적인 김치 양념들을 혼합한 후, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주의 배양물을 첨가하여 김치를 제조할 수 있다.

상기 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주는 상기 균주의 파쇄된 세포벽 분획, 생균, 사균 또는 건조균을 포함하고, 상기 배양물은 상기 균주를 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함한다. 또한, 상기 배양물은 이를 건조(예: 동결 건조)한 후 분말화한 것도 포함한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주를 첨가하여 제조된 김치는 산도 증가 속도가 완만할 뿐 아니라(도 4), 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주는 김치에 첨가될 경우 김치에서 우점종(dominant species)으로서 발효를 주도한다(도 5). 또한, 관능평가에서 있어, 대조군에 비교하여 탄산미는 개선되고 이미 및 이취는 감소하여 종합적인 맛에 있어 개선된 효과를 나타내었다(표 10). 따라서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1560 균주를 첨가하여 제조된 김치는 산도 증가속도가 완만하여 김치의 적정 숙성도(산도 0.4-0.8%)를 오랫동안 유지할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides ) DRC1506 균주(KCCM11712P) 및 이의 배양물을 첨가하는 단계를 포함하는 발효식품의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 발효식품을 제조하는 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 발효식품이 김치인 경우에, 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 (Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주 자체를 직접 김치에 첨가할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 균의 배양물을 첨가할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 김치 제조시 사용되는 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주의 배양물은 (a) 상기 균주를 영양배지(펩톤, 효모 추출물, 글루코스/증류수)에 접종하고 25-30℃에서 18-24시간 동안 1차 전배양하는 단계; (b) 상기 1차 전배양물을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0％(v/v) 접종하고 25-30℃에서 18-24시간 동안 2차 전배양하는 단계; 및 (c) 상기 2차 전배양물을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0％(v/v) 접종하고 25-30℃에서 18-24시간 동안 본 배양하는 단계:를 포함하는 방법으로 제조된다. 또한, 상기 배추즙은 다음과 같은 방법으로 제조되는 것이 바람직하다: (ⅰ) 절임배추를 분쇄 및 착즙하고 염농도를 2.0-3.0％(보다 바람직하게는 2.8％)로 조정하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)의 결과물에 포도당을 1.0-3.0％(w/v)(바람직하게는 1.0％(w/v)) 첨가하고 멸균하는 단계.

상기 김치에서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DSR1310 균주의 배양물은 김치 총 중량에 대하여 0.1-5 중량%로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5-3 중량%로 포함되며, 보다 더 바람직하게는 0.7-1.5 중량%로 포함된다.

상기 균주의 배양물이 김치 총 중량에 대하여 0.1 중량% 미만인 경우에는 균주에 의한 효과가 미미하고, 5중량％를 초과하는 경우에는 김치의 풍미가 저하되고 김치가 과숙성되는 문제점이 발생할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides ) DRC1560 균주를 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄을 포함하는 배지에서 20-40℃에서 10-40 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides ) DRC1560 균주의 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 배양 방법에 이용되는 배양 배지는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄를 포함하며, 바람직하게는 영양배지, MRS(Man-Rogosa-Sharp) 배지 또는 김치 배지를 사용할 수 있다. 상기 김치 배지는 숙성된 김치, 바람직하게는 김치 제조 후 24시간 동안 4℃에서 숙성된 김치를 분쇄하고 착즙한 후, 멸균하여 사용할 수 있다.

미생물의 배양은 통상의 류코노스톡 속 미생물의 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 20 내지 40℃에서 10시간 내지 40시간 정도 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 37℃에서 18시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

본 발명은 내산성 및 내담즙성이 우수할 뿐만 아니라 만니톨 및 가바 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides ) DRC1506 균주 (KCCM11712P) 및 이의 용도를 제공한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506은 내산성이 우수하여 김치의 발효 숙성기간 동안 우점종으로 증식하며, 내담즙성이 우수하고 발효기간 동안 만니톨 생성능이 높아 김치의 맛과 품질이 우수하고 일정하게 유지되는 김치를 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 균주는 가바(GABA) 생성능이 우수하기 때문에 신경안정, 혈압강하, 스트레스 해소, 치매 예방에 효과적인 기능성 김치를 제조하여 김치의 상품성을 높일 수 있다.

본 발명의 유산균은 정장제, 생균제, 식품첨가제 및 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이데스 DRC1506은 김치 발효를 위한 스타터로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )DRC1506 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )DRC1506 균주의 서열목록을 나타낸 것이다.
도 3은 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )DRC1506 균주로부터 Biogenic amine 발현여부를 확인한 것이다.
도 4는 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )DRC1506 균주가 첨가된 김치와 첨가되지 않은 김치의 저장기간에 따른 산도 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )DRC1506 균주의 우점율의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )DRC1506 균주가 첨가된 김치에서 다양한 성분이 생성되는 것을 나타낸 것이다.
도 7은 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides )DRC1506 균주를 첨가한 김치와 다른 균주(KCCM35471)를 첨가한 김치에서의 만니톨 생성량을 비교한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 김치로부터 내산성 , 내담즙성 및 고만니톨 생성 균주의 분리

1-1. 김치로부터 유산균의 분리

통상적인 김치의 제조방법으로 제조된 여러 종류의 김치(배추김치, 무김치, 열무김치, 파김치, 기타 등등)를 수집하여 유산균 분리 김치 시료로 사용하였다. 상기 김치시료를 채취하여, 0.85% 식염수로 10배 희석하고, 이를 0.1㎖씩 MRS 아가 배지에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 37℃의 항온 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 37℃에서 1일 동안 배양하여 유산균 콜로니를 분리하였다. 상기 분리된 균주에 대해 그람양성(Gram strain kit, BD Co., USA)과 카탈라제 테스트(Biomerieux Co., France)를 수행한 결과, 그람양성이고, 카탈라제 음성인 집락을 유산균으로 잠정적으로 확인하였다.

1-2. 내산성 유산균 분리

상기 실시예 1-1에서 분리된 유산균 콜로니들을 젖산(lactic acid)으로 pH 3.0, 3.5, 4.0, 5.0으로 각각 조정한 MRS 브로스(MRS 브로스, 디프코(Difco.) 10㎖에 각각 접종하였다. 25℃에서 72시간 동안 배양하면서 생육 유무를 관찰하여 상기 pH 범위에서도 가장 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다. 선별된 내산성 유산균은 pH 3.0-5.0에서 생육이 활발하게 유지되어 종래 류코노스톡 속 균주 대비 내산성이 강한 것으로 나타났다.

균주 pH	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드	류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471
4.0	+	+
3.5	+	+
3.0	+	-

1-3. 저산생성 유산균 분리

상기 실시예 1-2에서 분리된 유산균 콜로니들을 MRS 브로스(MRS 브로스, 디프코(Difco.); 박토펩톤 10g, 소고기추출물 10g, 효모추출물 5g, 글루코스 20g, 트윈80 1g, 구연산 암모늄 2g, 제2인산칼륨 2g, 초산나트륨 5g, 황산망간 0.1g, 황산마그네슘 0.05 g/증류수 1 L) 10㎖에 각각 접종하였다. 25℃에서 72시간 동안 배양 후 산 생성 정도 측정을 위해서 산도, pH를 측정하였다. 분리된 유산균 중에서 산 생성이 가장 적은 유산균을 선별하였다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드는 종래 류코노스톡 메센테로이드 균주 대비 산도 값이 낮고 CaCO₃ 배지에서 환의 직경이 작아 저산생성 유산균임을 확인하였다.

	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드	류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471
산도	0.57	0.90
pH	5.27	4.71
환 직경(mm)	2.43	3.30

1-4. 만니톨 생성능이 우수한 균주의 선발

상기 실시예 1-3에서 선별된 내산성 유산균을 과당이 1-4％(w/v)까지 각각 첨가된 영양배지(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g∼90g/D.W. 1L) 5㎖에 1.0％(v/v)로 접종하여 25℃에서 24시간 동안 배양한 후, 생성된 만니톨의 양을 측정하였다. 만니톨 생성율은 HPLC(Waters 2695 eAlliance, Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 당 분석 검출기는 Waters RI detector를 사용하였고, column은 Sugar-pak column (Waters, USA)을 사용하였다. 시료는 20㎕를 주입하였으며, 이동상으로는 H 2 O(HPLC-grade, Fisher)를 사용하여 0.5mL/min의 속도로 흘려주었다. 만니톨(Mannitol), 포도당(glucose), 과당(fructose)의 표준물질은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 각각 100mg/mL의 농도가 되도록 계산하여 용량 플라스크에 정밀히 취하고 물을 첨가하여 정용하였으며, 물로 희석하여 0.4mg/mL, 0.8mg/mL, 1.6mg/mL, 3.2mg/mL 용액을 검량선 작성용 표준용액으로 이용하였다. 시료 중의 당 농도는 표준물질의 성분과 머무름 시간이 일치하는 피크의 면적값을 해당 표준물질의 표준곡선에 대비하여 정량하였다. 그 중 만니톨 생성능이 가장 우수한 균주를 선발하였다.

	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드	류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471
만니톨 함량(%)	3.2	2.0

1-5. 선발된 유산균 동정

상기 1-1 내지 1-4에서 최종 선정된 유산균 DRC1506은 그람염색(Gram stain kit, BD Co., USA)을 이용한 형태학적 특성 분석, API 50CHL kit(Biomerirux Co., France)을 이용한 생화학적 특성분석 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.

상기 형태학적 특성에 대한 분석은 DRC1506의 콜로니의 모양 및 색을 관찰하고, 상기 균주를 그람염색한 후에 광학현미경으로 모양을 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

특성	DRC1506
그람염색(Gram-stain)여부	예: +(양성)
콜로니 형태(Colony morphology)	예: 구균&구형
콜로니 표면(Colony surface)	예: 매끈함
콜로니 색(Colony color)	예: 연한 아이보리색
콜로니 불투명도(Colony opacity)	예: 불투명함

상기에서 보는 바와 같이, 분리 균주인 DRC1506은 그람양성 균주이고, 광학현미경 관찰 결과 구균 형태이며, 콜로니 색깔이 연한 아이보리색을 나타내는 것을 확인하였다.

상기 형태학적 분석에 추가로 생화학적 특성에 대한 분석을 API 50 CHL kit을 이용하여 당 대사능을 검토하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

대조군	-	D-만노즈	-	살리신	+	겐티오비오즈	+
글리세롤	-	L-솔보즈	-	셀로비즈	+	D-튜라노즈	+
에리쓰리톨	-	람노즈	-	말토즈	+	D-리조즈	-
D-아라비노즈	+	둘시톨	-	락토즈	-	D-타가토즈	-
L-아라비노즈	+	이노시톨	-	멜리비오즈	+	D-퓨코즈	-
리보오즈	+	만니톨	-	사카로즈	+	L-퓨코즈	-
D-자일로즈	-	솔비톨	-	트레할로즈	+	D-아라비톨	-
L-자일로즈	-	D-만노시드	+	이눌린	-	L-아라비톨	-
아도니톨	-	D-글루코시드	+	멜레지토즈	-	글루코네이트	+
자일로시드	-	글루코사민	+	D-라피노즈	-	2-세토-글루코네이트	-
갈락토즈	+	아미그달린	+	아미돈	-	5-세토-글루코네이트	-
D-글루코즈	+	알부틴	-	글리코겐	-	-	-

또한, 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 동정을 수행하였다. 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506로부터 genomic DNA를 전통적인 chromosome spooling 방법을 이용하여 추출하고, PacBio 시스템을 이용한 DRC1506 균주의 염기서열분석을 진행하였다. 그 결과, 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506의 chromosome의 크기는 1,893,478 bp로 확인되었고, 1개의 Chromosome 이외에 3개의 plasmid가 있는 것으로 판명되었다(표 6).

	Chromosome	pKLE01	pKLE02	pKLE03
Size(bp)	1,893,478	46,169	24,244	20,026
No. of coding gene sequences	1,816	43	45	27
tRNA	70	0	0	0
rRNA	12	0	0	0

상기 균주의 형태학적 특성, 당 대사능 및 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 만니톨 생성능이 우수한 DRC1506 균주는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)로 동정되었고, 그 결과 분리 균주인 DRC1506을 “류코노스톡 메센테로이드 DRC1506”으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2015년 6월 19일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM11712P를 부여 받았다.

본 균주와 유전학적으로 비슷한 균들 간의 계통발생학적 위치를 Phydit 프로그램을 이용하여 도 1과 같이 나타내었다. 같은 속의 균주와는 물론이고, 같은 종의 표준 균주와도 계통발생학적으로 다름을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주의 식품 적용을 위한 평가

2-1. 내담즙성 평가

상기 DRC1506 균주를 옥스갈(oxgall)로 0.3%(v/v), 0.5%(v/v), 로 조정한 MRS 배지 10㎖에 각각 접종하였다. 이후, 37℃에서 2시간 배양하면서 상기 인공 담즙 농도에서의 균주의 생육을 관찰하였다.

Oxgall 농도(%)	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 생존율(%)	류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471 생존율(%)
대조군	100% 생존	100% 생존
0.3	90% 생존	60% 생존
0.5	84% 생존	50% 생존

2-2. 바이오제닉 아민 생성여부 확인

PCR 분석을 통해 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506의 Histidine, tyrosine decarboxylase gene 유무 확인하였다(도 3). 분석 결과 Biogenic amine 생성관련 유전자 가지고 있지 않아 김치 스타터 등의 목적으로 사용 가능할 것으로 판단된다.

2-3. 항균성 평가

항균력 실험을 위해 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506을 MRS 액체배지에 3 차 계대배양하고, 뉴트리언트 아가배지(Nutrient agar)에 병원성세균 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCCM11774), 스타필로코커스 아우레우스(Staplyococcus aureus KCCM 11335, 대장균(E.coli KCCM11234)를 각각 1%씩 접종하여 플레이트에서 굳힌 후 20분간 건조하였다. 여기에 코크보어러로 직경 9mm의 구멍을 뚫고 유산균의 배양 상등액을 100㎕ 적하시켜 37℃에서 24시간 동안 배양하여 억제 환의 크기를 측정하였다(표 8).

Indicator	본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506	류코노스톡 메센테로이드KCCM35471
B. cereus (KCCM11774)	16	10
St . aureus (KCCM11335)	15	12
E. coli (KCCM11234)	14	10

실험 결과, DRC1506균주는 종래의 류코노스톡 메센테로이드 균주에 비해 병원성 미생물에 대한 항균 활성이 더 크게 나타났다.

실시예 3. 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506을 이용한 김치의 제조

본 발명에서 분리, 동정한 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506을 이용하여 김치를 제조함으써 상기 균주가 김치 내에서 갖는 특성, 발효 패턴, 만니톨 생성 등을 분석하였다.

3-1. 배양액 제조

절임배추를 브랜더로 분쇄, 착즙 후 재제염을 사용하여 염도가 2.8%가 되도록 조정하였다. 여기에 포도당을 1.0%(w/v) 첨가한 후, 멸균하여 배추즙을 제조하였다. 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506을 영양배지(펩톤 5g, 효모 추출물 2.5 g, 글루코즈 5g/증류수 1L) 5ml에 접종하여 25℃에서 24시간 1차 전배양을 하였다. 이후, 상기 1차 전배양액을 멸균된 배추즙에 1.0% 접종하여 25℃에서 24시간 동안 2차 전배양을 하였다. 상기 2차 전배양액을 다시 멸균된 배추즙에 1.0% 접종하여 25℃에서 18시간 동안 본 배양 하였다.

3-2. 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주를 첨가한 김치의 제조

배추를 각각 소금으로 절여 배추의 염도가 2.3%가 되도록 한 후 절여진 배추(82.5 중량%)에 고춧가루(2.5 중량 %), 마늘(2 중량%), 생강(0.5 중량%), 대파(2 중량%), 무채(9 중량%)의 일반적인 김치 양념을 혼합한 후 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주 배양액을 전체 김치 중량에 대해 1 중량%를 가하여 김치를 제조하였다.

비교예 1. 류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471 균주를 첨가한 김치의 제조

상기 김치제조방법과 동일한 방법으로 배추와 김치 양념을 혼합 후, 류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471 균주 배양액을 전체 김치 중량에 대해 1 중량%를 가하여 김치를 제조하였다.

비교예 2, 균주 미첨가 김치의 제조

균주 배양물을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 방법과 동일한 방법으로 배추와 김치 양념을 혼합하여 김치를 제조하였다.

실시예 4. 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506을 첨가한 김치의 발효특성

상기 실시예 3, 비교예 1 및 비교예 2의 김치 제조 후 일반 숙성 온도인 10℃에서 저장하면서 산도, 유산균, 우점율, 만니톨 생성 등을 분석하였다.

4-1. 산도 분석

상기 실시예 3, 비교예 1 및 비교예 2의 김치를 대상으로 산도를 측정하였다. 각 김치 100 g을 마쇄한 후 거즈로 여과하여 김치액을 제조하였다. 김치액 20 ㎖를 0.1N NaOH을 사용하여 pH 8.1이 되도록 중화적정한 후소비된 NaOH의 양을 하기의 식에 따라 젖산 함량(％)으로 환산하여 산도를 구하였다.

<수학식 1>

산도(%)={0.00908 x 1N NaOH 인자 x 1N NaOH 첨가량} / 시료 무게

1N NaOH 인자 = 1

도 4에 나타난 바와 같이, 숙성 초기에는 각 김치의 산도 차이가 별로 크지 않았으나, 숙성기간이 길어질수록 산도의 차이가 벌어졌다. 본 발명에 따른 유산균을 이용하여 제조된 김치의 경우 산도 증가 속도가 다른 김치에 비해 완만함을 보였다. 반면, 다른 유산균이 첨가된 김치와 무첨가군은 모두 숙성 5일째에 산도 0.8%를 초과하였으며 10일째에는 산도가 더욱 증가하는 것으로 나타났다.

4-2. 우점율 분석

10℃에서 12일 동안 숙성시킨 각 김치를 0.85％ 식염수로 10배 희석하여 김치 희석액을 제조하였다. 총 유산균 수의 측정을 위해서는 상기 김치 희석액 0.1 ㎖씩을 MRS 아가 배지 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 또한, 류코노스톡 균수의 측정을 위해서는 상기 김치 희석액 0.1 ㎖씩을 PES 아가 배지 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 김치 희석액이 도말된 각 아가 플레이트를 25℃의 항온배양기에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 집락의 수를 각각의 균수로 계수하였다. 또한 우점율(％)은 총 유산균 균수 중 유산균 스타터(PES 아가 플레이트에 나타나는 류코노스톡 속 균주 중 유산균 스타터와 형태학적 타입이 일치하는 균)의 균수의 비율로 계산하였다(수학식 2).

<수학식 2>

우점율(%) = {(스타터를 첨가한 김치의 류코노스톡 속 균주의 수 / 스타터를 첨가하지 않은 김치의 류코노스톡 속 균주의수)} × 100

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471 균주를 첨가한 김치의 경우 유산균 수가 적고 저장 3일차부터 우점율이 급감하여 저장 5일차 후에는 20% 미만으로 나타났다. 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506을 첨가하여 제조한 김치는 유산균 수가 많고 저장 직후부터 3일차까지 우점율이 급격하게 상승하여 저장 5일차부터는 70%에 가까운 우점율을 나타내며 발효를 주도하였다.

따라서, 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506을 첨가하여 제조한 김치의 경우 장기간 저장하는 동안 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506 균주가 안정적으로 우점함을 확인할 수 있었다.

4-3. 만니톨 및 기타 대사산물 분석

¹H-NMR(Varian Inova 600-MHz NMR pectrometer (Varian, Inc., Palo Alto, CA)) 기기 분석을 통해 김치 착즙액의 대사산물(Glutamate, Lactate, Acetate, Ethanol, Mannitol, GABA)을 분석하였다. 상기 김치는 10℃의 온도에서 발효시키면서 사용하였으며, 0일차, 3 일차, 7 일차, 10 일차에 각각 분석을 실시하였다.

시료 전처리를 위해 김치 착즙액을 원심분리(13,000rpm, 5분) 후 필터링(0.45㎕)하였다. 1ml을 채취하여 동결건조 하고 동결건조 분말에 sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate(DSS)를 0.5mM 농도로 맞춘 D2O 용액 1ml 첨가하여 용해하였다. 샘플 농도가 1~50 mg/ml 가 되도록 희석 후 원심분리(13,000 rpm, 5분)후 상등액만 채취하여 NMR 전용 튜브에 600~750㎕ 정도를 옮겨 담아 NMR 분석 하였다. 분석 조건은 Field strength 14.1T, 1H frequency 600MHz 이다. 데이터 분석은 Chenomx NMR suite, version 6.1의 profiler module을 통해 진행하였고 DSS를 기준물질로 하여 대사산물 동정 및 정량한 결과를 도 6-7 및 하기 표 9에 나타내었다.

만니톨 함량	0일차	3일차	7일차	10일차
본 발명의 류코노스톡 메센테로이드(DSR1506)	13.65	55.048	52.961	57.761
류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471	20.309	34.317	43.131	49.31

(농도단위: mM)

류코노스톡 메센테로이드 DRC1506은 종래의 류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471 대비 많은 양의 Glutamate, Ethanol, Mannitol 및 GABA를 생성을 한다. 이로부터 류코노스톡 메센테로이드 DRC1506은 glutamate, lactate, acetate, ethanol, mannitol 등 다양한 성분을 생성하여 김치에서 풍부하고 다양한 맛을 발현하는 것을 확인하였고, 특히 Mannitol 생성이 우수하여 김치에 단맛, 청량감 부여함을 확인하였다.

실시예 5. 김치의 관능평가

상기 실시예 3, 비교예 1 및 비교예 2의 김치 산도 0.6-0.7％에 대하여 훈련된 검사요원 50명에 의하여 관능검사를 수행하였다. 5점을 만점으로 기호도 척도법에 의해 실시하였으며, 유의성 검증은 t-test에 의해 실시하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

스타터 첨가 유산균	종합적인 맛	탄산미	이미	이취	외관
본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DSR1506	4.5	4.3	1.0	1.0	3.5
류코노스톡 메센테로이드 KCCM35471	4.0	3.5	1.5	1.3	2.5
스타터 무첨가	3.0	2.0	2.0	1.5	3.0

그 결과, 상기 표에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 김치의 관능 특성이 종래 유산균을 이용하여 제조된 김치에 비해 전반적으로 우수한 것으로 평가되었다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11712P

수탁일자 : 2015619

<110> DAESANG <120> Leuconostoc mesenteroides DRC1506 and Use thereof <130> 16-10647 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1509 <212> DNA <213> Leuconostoc mesenteroides <400> 1 agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60 gcacagcgaa aggtgcttgc acctttcaag tgagtggcga acgggtgagt aacacgtgga 120 caacctgcct caaggctggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg aataaaactt 180 agtgtcgcat gacaaaaagt taaaaggcgc ttcggcgtca cctagagatg gatccgcggt 240 gcattagtta gttggtgggg taaaggccta ccaagacaat gatgcatagc cgagttgaga 300 gactgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gctgcagtag 360 ggaatcttcc acaatgggcg aaagcctgat ggagcaacgc cgcgtgtgtg atgaaggctt 420 tcgggtcgta aagcactgtt gtatgggaag aacagctaga ataggaaatg attttagttt 480 gacggtacca taccagaaag ggacggctaa atacgtgcca gcagccgcgg taatacgtat 540 gtcccgagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcagacggtt tattaagtct 600 gatgtgaaag cccggagctc aactccggaa tggcattgga aactggttaa cttgagtgca 660 gtagaggtaa gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc 720 agtggcgaag gcggcttact ggactgcaac tgacgttgag gctcgaaagt gtgggtagca 780 aacaggatta gataccctgg tagtccacac cgtaaacgat gaacactagg tgttaggagg 840 tttccgcctc ttagtgccga agctaacgca ttaagtgttc cgcctgggga gtacgaccgc 900 aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tttgaagctt ttagagatag 1020 aagtgttctc ttcggagaca aagtgacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc cagcattcag 1140 atgggcactc tagcgagact gccggtgaca aaccggagga aggcggggac gacgtcagat 1200 catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggcgtatac aacgagttgc 1260 caacccgcga gggtgagcta atctcttaaa gtacgtctca gttcggattg tagtctgcaa 1320 ctcgactaca tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg 1380 ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tttgtaatgc ccaaagccgg 1440 tggcctaacc ttttaggaag gagccgtcta aggcaggaca gatgactggg gtgaagtcgt 1500 aacaaggta 1509

Claims

pH3.0~5.0에서 내산성 및 옥스갈 0.3~0.5%(v/v)에서 내담즙성이 우수하고 저 산생성능을 가지며 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(KCCM11712P).
삭제
류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(수탁번호KCCM11712P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 첨가용 조성물.
류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(수탁번호KCCM11712P) 또는 이의 배양물을 포함하는 김치.
류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(수탁번호KCCM11712P) 또는 이의 배양물을 첨가하는 단계를 포함하는 김치의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC1506 균주(수탁번호KCCM11712P)의 배양액은 김치 총 중량에 대해 0.1-5중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.