KR101804696B1 - 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법 및 이를 이용한 박테리아의 제거 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 335nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광(light of excitation)을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하는 단계; (b) 상기 여기광에 의해 조사된 영역의 방출파장을 스캔하여 박테리아의 자가 형광 스펙트럼을 얻는 단계; 및 (c) 상기 자가 형광 스펙트럼이 400nm 내지 700nm 범위의 방출파장을 나타내는 경우, 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성이 있음을 관찰 또는 결정하는 단계를 포함하는 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법을 이용한 구강 질환을 유발하는 박테리아의 제거 방법으로서, 박테리아의 존재 가능성을 관찰 및 결정하는 단계; 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 광 민감제를 처리하는 단계; 및 광 민감제가 처리된 영역에 400nm 내지 500nm의 광을 조사하는 단계를 포함한 박테리아의 제거 방법에 관한 것이다.

Description

광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법 및 이를 이용한 박테리아의 제거 방법{Methods for Observing or Determining the possible presence of Bacteria that cause oral disease using light and methods using the same for eliminating the bacteria}

본 발명은 광(빛)을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법 및 이를 이용한 박테리아의 제거 방법을 제공하는 것으로, 구강 내 치아우식증, 치주질환 또는 방선균증과 같은 질환을 유발하는 박테리아의 자가 형광 성질을 이용하여 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정한 후, 광 민감제 및 이를 활성화시키는 광을 이용하여 박테리아를 제거하는 방법에 관한 것이다.

인체 내 서식하는 미생물은 약 100조개이며, 이는 서식지에 따라 그 종류와 분포가 매우 다양하다. 그 중, 구강과 혀의 배면은 미생물이 두 번째로 많이 서식하는 부위 위다.

구강 내 미생물들은 유기적으로 상호작용하여 생체막(biofilm)을 형성하며, 인체와 지속적으로 교류한다. 특히 구강내 존재하는 생체막의 일종인 치태(plaque)는 구강 건강을 위해 필수적이기도 하지만 동시에 병원체를 포함하고 있어 질병을 유발할 잠재성 또한 존재한다.

실제 구강에서 발견되는 여러 질병 중 치아우식증, 치주질환, 치수염, 캔디다증, 방선균증 등 많은 경우는 구강 내 바이러스, 세균 및 진균 등 미생물에 기인하는 것으로 알려져 있다.

이에 따라 많은 연구자들은 구강 내 질병을 예방하거나 진단하기 위해 미생물총을 구성하는 균종을 확인하고 분류하기 위해 노력하였다. 또한, 질병과 밀접한 관련이 있는 미생물을 제거하거나 사멸하는 방법을 강구하기 위한 노력도 지속적으로 이루어지고 있다.

최근 의학분야에서는 광역학 진단(photodynamic diagnosis, PDD) 및 광역학 치료(photodynamic therapy) 기술이 활발히 이용되고 있다.

일 예로, 대한민국 공개특허 제 10-2012-0100885호(구강 소독 및 구강 질환의 치료를 위한 산화제, 광감제 및 상처 치유제의 조합)는 하나 이상의 산화제, 상기 산화제를 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 광활성화제, 및 히알루론산, 글루코사민 및 알란토인으로부터 선택된 하나 이상의 치유 인자를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 광활성화된 조성물을 구강 소독 및/또는 치료를 위해 사용하는 방법을 제공하고 있으며, 미국 공개특허 제2009-0030257호(Anti-microbial photodynamic therapy)는 광역학 요법으로, 특히 인간 및 동물에서 미생물 감염 질환의 치료 및 예방을 위한 분자 복합체를 제공하고 있다.

그러나, 상기와 같은 종래기술은 구강 내 박테리아에 의한 질병을 조기에 발견하고 치료하는데 이용할 수 있지만, 실제 구강 생체막을 구성하는 개별 박테리아의 자가 형광 성질을 이용하여 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정한 후, 광 민감제 및 이를 활성화시키는 광을 이용하여 박테리아를 제거하는 방법은 보고된 바가 없다.

또한, 상기 종래기술에서 사용한 광은 약 500nm 이상의 장파장을 사용한 한계가 있다. 광은 파장이 길어질수록 더 깊이 침투할 수 있지만, 깊이 침투된 광은 에너지가 약해지기 때문에 실제 임상적인 항균력이 저감되는 문제점이 있다.

본 발명의 일 목적은 박테리아의 고유한 자가 형광 특성을 활용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 400 nm 내지 500 nm의 광 및 이에 활성화되는 광 민감제를 사용하여, 박테리아의 활성을 제어할 수 있는 구강 질환을 유발하는 박테리아 제거 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법으로서, (a) 335nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광(light of excitation)을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하는 단계; (b) 상기 여기광에 의해 조사된 영역의 방출파장(emission wavelength)을 스캔하여 박테리아의 자가 형광 스펙트럼을 얻는 단계; 및 (c) 상기 자가 형광 스펙트럼이 400nm 내지 700nm 범위의 방출파장을 나타내는 경우, 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성이 있음을 관찰 또는 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 구강질환은 치아우식증, 치주질환, 및 방선균증 중에서 선택된 어느 하나 이상이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 구강질환을 유발하는 박테리아가 충치균(strepcococcus mutans), 락토바실러스 가세리(lactobacillus gasseri) 엔테로코커스 패시움(enterococcus faecium), 푸소박테리움 뉴클레아툼(fusobacterium nucleatum), 포피로모나스 진지발라스(porphyromonas gingivalis), 베일로넬라 파르불라균(veillonella Parvula), 및 악티노마이세스 이스라엘리(actinomyces israelii) 중에서 선택된 어느 하나 이상이나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 335nm 내지 355nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 조사하여, 460nm 내지 480nm의 최대방출파장을 나타내는 자가 형광 스펙트럼을 얻을 경우, 박테리아가 충치균, 악티노마이세스 이스라엘리, 엔테로코커스 패시움, 또는 베일로넬라 파르불라균중 어느 하나 이상인 것으로 관찰 또는 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 355nm 내지 385nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 조사하여, 500nm 내지 520nm의 최대방출파장을 나타내는 자가 형광 스펙트럼을 얻을 경우, 박테리아가 푸소박테리움 뉴클레아툼 또는 락토바실러스 가세리 중 어느 하나 이상인 것으로 관찰 또는 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 385nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 조사하여, 525nm 내지 545nm의 최대방출파장을 나타내는 경우, 박테리아가 포피로모나스 진지발라스인 것으로 관찰 또는 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서, 형광분광기를 이용하여 박테리아의 자가 형광 스펙트럼을 얻는다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 제거 방법으로서, 본 발명에 의한 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법에 따라 박테리아의 존재 가능성을 관찰 및 결정하는 단계; 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 광 민감제를 처리하는 단계; 및 광 민감제가 처리된 영역에 400nm 내지 500nm의 광을 조사하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 광 민감제는 커큐민(curcumin), 프로토포르피린 9(protoporphyrin IX), 레사주린(resazurin) 및 리보플라빈(riboflavin) 중에서 선택된 어느 하나 이상이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 광 민감제를 처리하는 단계는 광 민감제 함유 스프레이형, 패치형 또는 주사제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 박테리아 존재 가능성이 있는 영역이 구강 내부일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 구강 질환을 유발하는 박테리아가 악티노마이세스 이스라엘리, 엔테로코커스 패시움, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 충치균 또는 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나 이상인 경우, 커큐민 또는 프로토포르피린 9 중 어느 하나 이상의 광 민감제를 사용 하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 구강 질환을 유발하는 박테리아가 악티노마이세스 이스라엘리 또는 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나 이상인 경우, 커큐민, 프로토포르피린 9 또는 레사주린 중 어느 하나 이상의 광민감제를 사용 하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 구강 질환을 유발하는 박테리아가 베일로넬라 파르불라균일 경우, 리보플라빈의 광 민감제를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 장치로서, 상기 구강질환을 유발하는 박테리아는 충치균, 락토바실러스 가세리, 엔테로코커스 패시움, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 포피로모나스 진지발라스, 베일로넬라 파르불라균, 및 악티노마이세스 이스라엘리 중에서 선택된 어느 하나이고, 335nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하는 조사부; 및 상기 여기광에 의해 조사된 영역의 방출파장을 측정하는 측정부; 상기 측정부에서 측정된 형광 스펙트럼이 400nm 내지 700nm 범위의 방출파장인지를 나타내는 연산부를 포함한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 박테리아는 충치균, 악티노마이세스 이스라엘리, 엔테로코커스 패시움, 또는 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나이고, 상기 조사부는 335nm 내지 355nm 범위의 파장의 여기광을 조사하며, 상기 연산부는 460nm 내지 480nm 범위의 방출파장인지를 나타낸다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 박테리아는 푸소박테리움 뉴클레아툼 또는 락토바실러스 가세리 중 어느 하나 이고, 상기 조사부는 355nm 내지 385nm 범위의 파장의 여기광을 조사하며, 상기 연산부는 500nm 내지 520nm 범위의 방출파장인지를 나타낸다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 박테리아는 포피로모나스 진지발라스이고, 상기 조사부는 385nm 내지 425nm 범위의 파장의 여기광을 조사하며, 상기 연산부는 525nm 내지 545nm 범위의 방출파장인지를 나타낸다.

본 발명에 의하면, 박테리아의 고유한 자가 형광 특성을 활용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정함으로써, 추가로 형광물질을 박테리아에 도입하는 단계를 포함하지 않아 시간적 및 경제적으로 절감되는 효과를 가질 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 400nm 내지 500nm의 광 및 이에 활성화 되는 광 민감제를 사용함으로써, 인체에 유해하지 않으면서 박테리아의 활성을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 구강 질환의 진행 정도 확인 및 향후 질환의 예측에 이용될 수 있으며, 구강 질환에 관련된 치료 기술에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1는 본 발명의 일 실시예로, 실시예 1의 박테리아에 대한 자가 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예로, 실시예 2의 박테리아에 대한 자가 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예로, 실시예 3의 박테리아에 대한 자가 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예로, 실시예 4의 박테리아에 대한 자가 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예로, 실시예 5의 박테리아에 대한 자가 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예로, 실시예 6의 박테리아에 대한 자가 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예로, 실시예 7의 박테리아에 대한 자가 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 8는 본 발명의 일 실시예로, 광 민감제 처리 농도 및 광 존재 여부에 따라 실시예 8의 박테리아 활성정도를 도시한 655nm에서의 흡광도이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예로, 광 민감제 처리 농도 및 광 존재 여부에 따라 실시예 9의 박테리아 활성정도를 도시한 655nm에서의 흡광도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예로, 광 민감제 처리 농도 및 광 존재 여부에 따라 실시예 10의 박테리아 활성정도를 도시한 655nm에서의 흡광도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예로, 광 민감제 처리 농도 및 광 존재 여부에 따라 실시예 11의 박테리아 활성정도를 도시한 655nm에서의 흡광도이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

본 발명은 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법 및 이를 이용한 박테리아의 제거 방법을 제공하는 것으로, 구강 내 치아우식증, 치주질환 또는 방선균증과 같은 질환을 유발하는 박테리아의 자가 형광 성질을 이용하여 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정한 후, 광 민감제 및 광을 이용하여 박테리아를 제거하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 일 구현 예에 따르면 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법으로서, (a) 335nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광(light of excitation)을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하는 단계; (b) 상기 여기광에 의해 조사된 영역의 방출파장(emission wavelength)을 스캔하여 박테리아의 자가 형광 스펙트럼을 얻는 단계; 및 (c) 상기 자가 형광 스펙트럼이 400nm 내지 700nm 범위의 방출파장을 나타내는 경우, 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성이 있음을 관찰 또는 결정하는 단계를 포함한다.

여기서, 상기 (a) 단계 전에 박테리아를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이에 따라 동정하고자 하는 박테리아의 자가 형광 특성을 명확히 파악할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 (b) 단계는 여기광의 파장에 따라 발산하는 방출파장의 자료를 얻기 위한 것이며, 이를 통하여 박테리아의 광학적 성질을 확인할 수 있다.

또한, 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서 박테리아의 광학적 성질에 대하여 분석하기 위해 형광분광기를 이용한다. 이는 화학 및 생화학 분야에서 일반적으로 사용되는 형광분광법이므로, 자세한 설명은 생략한다.

다음으로, 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 얻은 박테리아의 자가 형광 스펙트럼에서 여기광에 따른 최대방출파장을 확인하여, 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정할 수 있다.

여기서, 최대방출파장은 가장 강한 세기를 갖는 방출파장을 의미한다.

또한, 본 발명에서 제공하는 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법은 구강질환의 원인균인 박테리아의 존재 여부를 확인 할 수 있는 방법으로, 구강 질환의 진행 정도 확인 및 향후 질환의 예측에 이용될 수 있다.

여기서, 상기 구강질환은 치아우식증, 치주질환, 또는 방선균증 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

또한, 구강질환의 원인균은 충치균(strepcococcus mutans), 락토바실러스 가세리(lactobacillus gasseri) 엔테로코커스 패시움(enterococcus faecium), 푸소박테리움 뉴클레아툼(fusobacterium nucleatum), 포피로모나스 진지발라스(porphyromonas gingivalis), 베일로넬라 파르불라균(veillonella Parvula), 또는 악티노마이세스 이스라엘리(actinomyces israelii) 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 335nm 내지 355nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하여, 계 460nm 내지 480nm의 최대방출파장을 나타내는 자가 형광 스펙트럼을 얻을 경우, 구강 질환을 유발하는 박테리아가 충치균, 악티노마이세스 이스라엘리, 엔테로코커스 패시움, 또는 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에서, 355nm 내지 385nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하여, 500nm 내지 520nm의 최대방출파장을 나타내는 자가 형광 스펙트럼을 얻을 경우, 구강 질환을 유발하는 박테리아가 푸소박테리움 뉴클레아툼 또는 락토바실러스 가세리 중 어느 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에서, 385nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하여 525nm 내지 545nm의 최대방출파장을 나타내는 자가 형광 스펙트럼을 얻을 경우, 구강 질환을 유발하는 박테리아가 포피로모나스 진지발라스일 수 있다.

상기에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 각각의 박테리아의 자가 형광 스펙트럼을 통해 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정할 수 있으며, 박테리아의 종을 구별해낼 수 있다.

따라서, 박테리아의 고유한 자가 형광 특성을 활용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰하고 결정함으로써, 박테리아의 존재하는 정도를 정량적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라 추가로 형광물질을 박테리아에 도입하기 위한 단계를 포함하지 않아 시간적 및 경제적으로 절감되는 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 방법에 따라 박테리아의 존재 가능성을 관찰 및 결정하는 단계; 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 광 민감제를 처리하는 단계; 및 광 민감제가 처리된 영역에 400nm 내지 500nm의 광을 조사하는 단계를 포함하는 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 제거 방법을 제공한다.

본 발명의 박테리아의 제거 방법에 포함된 박테리아의 존재 가능성을 관찰 및 결정하는 단계는 상기한 바와 같이 본 발명에서 제공하는 것으로, 앞서 기재한 바와 동일하다.

본 발명의 박테리아의 제거 방법의 광 민감제는 커큐민(curcumin), 프로토포르피린 9 (protoporphyrin IX), 레사주린(resazurin) 또는 리보플라빈(riboflavin) 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 커큐민이나, 이제 제한되는 것은 아니다.

여기서, 상기 광 민감제를 처리하는 단계는 광 민감제 함유 스프레이형, 패치형 또는 주사제를 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 광 민감제가 함유된 패치형을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명의 박테리아의 제거 방법은 박테리아 존재 가능성이 있는 영역이 구강 내부일 수 있으며, 구강 질환을 유발하는 박테리아가 악티노마이세스 이스라엘리, 엔테로코커스 패시움, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 충치균 또는 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나 이상인 경우 커큐민 또는 프로토포르피린 9 중 어느 하나 이상의 광 민감제를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 박테리아의 제거 방법은 구강 질환을 유발하는 박테리아가 악티노마이세스 이스라엘리 또는 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나 이상인 경우, 커큐민, 프로토포르피린 9 또는 레사주린 중 어느 하나 이상의 광민감제를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 박테리아의 제거 방법은 구강 질환을 유발하는 박테리아가 베일로넬라 파르불라균일 경우, 리보플라빈의 광 민감제를 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면, 종래에 비해 파장의 길이가 짧은 400 nm 내지 500 nm의 파장을 갖는 광원 및 이에 활성화 되는 광 민감제를 사용함으로써, 인체에 유해하지 않으면서 박테리아의 활성을 억제할 수 있다. 더불어, 구강 질환의 진행 정도 확인 및 향후 질환의 예측에 이용될 수 있으며, 구강 질환에 관련된 치료 기술에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하는 장치로서, 상기 구강질환을 유발하는 박테리아는 충치균, 락토바실러스 가세리, 엔테로코커스 패시움, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 포피로모나스 진지발라스, 베일로넬라 파르불라균, 및 악티노마이세스 이스라엘리 중에서 선택된 어느 하나이고, 335nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광(light of excitation)을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하는 조사부; 및 상기 여기광에 의해 조사된 영역의 방출파장을 측정하는 측정부; 상기 측정부에서 측정된 형광 스펙트럼이 400nm 내지 700nm 범위의 방출파장인지를 나타내는 연산부를 포함하는 장치를 제공한다.

상기 조사부는 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 여기광을 조사하는 것으로서, 박테리아에 광을 조사하여 박테리아 내 생화학물질 및 조직이 발광할 수 있다.

상기 측정부는 상기 조사부와 병렬로 연결되고, 상기 조사부에 의해 광이 조사된 박테리아가 발산하는 방출파장을 측정할 수 있다.

상기 연산부는 상기 조사부와 측정부 후단에 있으며, 상기 측정부로부터 측정된 방출파장이 400nm 내지 700nm 범위에 해당하는지 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로, 충치균, 악티노마이세스 이스라엘리, 엔테로코커스 패시움, 또는 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나 이상의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하기 위해, 상기 조사부는 335nm 내지 355nm 범위의 파장의 여기광을 조사하며, 상기 연산부는 460nm 내지 480nm 범위의 방출파장인지를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예로, 푸소박테리움 뉴클레아툼 또는 락토바실러스 가세리 중 어느 하나 이상의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하기 위해, 상기 조사부는 355nm 내지 385nm 범위의 파장의 여기광을 조사하며, 상기 연산부는 500nm 내지 520nm 범위의 방출파장인지를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예로, 포피로모나스 진지발라스의 존재 가능성을 관찰 또는 결정하기 위해, 상기 조사부는 385nm 내지 425nm 범위의 파장의 여기광을 조사하며, 상기 연산부는 525nm 내지 545nm 범위의 방출파장인지를 나타낼 수 있다.

실시예

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 박테리아의 배양 및 광학적 특성 확인

1. 박테리아의 배양

하기 표 1에 나타낸 7종의 박테리아를 생물자원센터로부터 분양 받았으며, 박테리아 배양은 각각 고체 배양과 액체 배양으로 나누어 진행하였다.

구분	박테리아 종	고체 배양	액체 배양
실시예 1	악티노마이세스 이스라엘리	콜롬비아 혈액 배지(Columbia blood medium)	티오글리콜레이트 배지(Thioglycollate broth)
실시예 2	엔테로코커스 패시움	콜롬비아 혈액 배지	티오글리콜레이트 배지
실시예 3	푸소박테리움 뉴클레아툼	콜롬비아 혈액 배지	티오글리콜레이트 배지
실시예 4	락토바실러스 가세리	콜롬비아 혈액 배지	엠알에스 배지(MRS broth)
실시예 5	포피로모나스 진지발라스	콜롬비아 혈액 배지	트립틱 소이 배지(Tryptic soy broth)
실시예6	충치균	콜롬비아 혈액 배지	뇌심장침출 배지(Brain heart infusion broth)
실시예 7	베일로넬라 파르불라균	콜롬비아 혈액 배지	뇌심장침출 배지

고체 배양과 액체 배양을 위한 배지의 조성은 하기 표 2와 같다.

제조한 고체 배지에 각각의 박테리아를 접종하여 37℃ 혐기 조건(H2:CO2:N2=10:10:80)에서 4일간 배양하였다. 다만, 실시예 5의 박테리아는 성장 속도가 상대적으로 느려 7일간 배양하였다.

다음, 액체 배양의 경우, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 각각의 실시예 1 내지 7의 박테리아를 액체 배지에 접종한 뒤, 37℃ 혐기 조건에서 4일간 배양하였다.

3. 박테리아의 자가 형광 스펙트럼 측정

박테리아의 광학적 성질을 파악하기 위해, 형광분광기(LS 55, Perkin Elmer, Massachusetts, USA)를 이용하여, 박테리아에 조사하는 여기광의 파장(wavelength)에 따라 발산하는 방출파장의 자료를 얻었다. 먼저, 상기 상술한 바와 같이 고체 배지에서 배양된 상기 실시예 1 내지 7의 박테리아는 각각의 종별로 콜로니(colony)를 수집하여 3ml 증류수에 혼합하여 형광분석 샘플을 준비하였다.

상기 실시예 1 내지 7의 박테리아에 대한 각각의 형광분석 샘플을 형광 셀(fluorescence cell, 101-QS, Hellma, Mullheim, Germany)에 넣어 분석에 이용하였다. 형광 분광 스펙트럼은 335 ~ 425nm사이의 여기 파장을 10nm 간격으로 설정하였고, 여기에 대한 반응은 400 ~ 700nm 방출파장 영역을 스캔하였다. 이때 430nm의 컷 오프 필터 (cut-off filter) 와 500nm/min의 스캔 속도를 적용하여 분석하였으며, 각각 박테리아의 자가 형광 스펙트럼을 도 1 내지 7에 나타내었다.

상기 도 1은 상기 실시예 1의 악티노마이세스 이스라엘리의 자가 형광 스펙트럼으로, 345㎚의 여기파장에서 최대방출파장이 관찰되었고, 이에 최대방출파장은 462㎚였다.

상기 도 2는 상기 실시예 2의 엔테로코커스 패시움의 자가 형광 스펙트럼으로, 335㎚의 여기파장에서 최대방출파장이 관찰되었고, 이에 최대방출파장은 461㎚였다.

상기 도 3은 상기 실시예 3의 푸소박테리움 뉴클레아툼의 자가 형광 스펙트럼으로, 375㎚의 여기파장에서 최대방출파장이 관찰되었고, 이에 최대방출파장은 512㎚였다.

상기 도 4는 상기 실시예 4의 락토바실러스 가세리의 자가 형광 스펙트럼으로, 375㎚의 여기파장에서 최대방출파장이 관찰되었고, 이에 최대방출파장은 519㎚였다.

상기 도 5는 상기 실시예 5의 포피로모나스 진지발라스의 자가 형광 스펙트럼으로, 395㎚의 여기파장에서 최대방출파장이 관찰되었고, 이에 최대방출파장은 531㎚였다.

상기 도 6은 상기 실시예 6의 충치균의 자가 형광 스펙트럼으로, 335㎚의 여기파장에서 최대방출파장이 관찰되었고 최대방출파장은 462㎚였다.

상기 도 7은 상기 실시예 7의 베일로넬라 파르불라균의 자가 형광 스펙트럼으로, 345㎚의 여기파장에서 최대방출파장이 관찰되었고 최대방출파장은 463㎚였다.

실험예 2: 광 민감제의 박테리아 항균력 평가

광 민감제에 따른 박테리아의 항균력을 평가하기 위해, 먼저 상기 실험예 1과 같이 각각의 하기 실시예 8 내지 11의 박테리아를 배양하여각각 박테리아의 자가 형광 성질을 파악 후, 광 민감제를 처리하였다. 그 다음, 405nm의 광을 조사하였다. 이 후, 37℃혐기 조건에서 박테리아를 배양 하였다. 이와 같이 하기 실시예 8 내지 11 및 하기 비교예 1 내지 4는 형광분석기(model 680, Bio-Rad, California, USA)를 이용하여 655nm에서의 흡광도를 측정하여 도 9 내지 12에 나타내었다.

655nm에서의 흡광도는 박테리아의 존재량을 의미하므로, 흡광도가 적을수록 박테리아의 활성이 억제 되는 것을 말하며, 흡광도가 높을수록 박테리아의 활성이 활발해지는 것을 말한다. 이때, 항균력에 대한 평가는 3번 반복하였다.

[제조예 1] 광 민감제 용액 제조

하기 표 3에 나타낸 바와 같이 4 종류의 광 민감제를 각각 1㎎/㎖ 농도로 준비하였다. 물에 대한 용해도가 낮은 커큐민과 프로토포르피린 9은 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시켰고, 레사주린과 리보플라빈은 증류수에 용해시켰다.

광 민감제	분자량	구조	최대 흡수 파장값
커큐민(curcumin)	368.38		433 nm
프로토포르피린 9 (protoporphyrin IX)	606.62		406 nm
레사주린(resazurin)	251.17		610 nm
리보플라빈(riboflavin)	376.36		445 nm

[실시예 8]

하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실험예 1를 통해 배양 및 자가 형광 특성이 확인된 악티노마이세스 이스라엘리의 박테리아 용액을 준비하고, 준비된 박테리아 용액에 상기 제조예 1에 따라 제조된 광 민감제인 레사주린용액을 농도별(10㎍/㎖, 1㎍/㎖, 0.1㎍/㎖)로 액체배양 배지에 혼합하여 405nm의 광을 5분간 조사하였다. 그 다음, 37℃ 혐기 조건 배양기에서 24시간 배양하였다.

[실시예 9]

하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실험예 1를 통해 배양 및 자가 형광 특성이 확인된 엔테로코커스 패시움의 박테리아 용액 및 광 민감제로써 프로토포르피린 9을 사용한 것을 제외하고, 나머지는 상기 실시예 8과 동일하게 진행하였다.

[실시예 10]

하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실험예 1를 통해 배양 및 자가 형광 특성이 확인된 푸소박테리움 뉴클레아툼의 박테리아 용액 및 광 민감제로써 커큐민을 사용한 것을 제외하고, 나머지는 상기 실시예 8과 동일하게 진행하였다.

[실시예 11]

하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실험예 1를 통해 배양 및 자가 형광 특성이 확인된 베일로넬라 파르불라균의 박테리아 용액 및 광 민감제로써 리보플라빈을 사용한 것을 제외하고, 나머지는 상기 실시예 8과 동일하게 진행하였다.

[비교예 1 내지 4]

광을 조사하지 않고, 어두운 조건에서 배양하는 것을 제외하고 실시예 8 내지 11의 박테리아 및 광 민감제를 이용하여 박테리아 항균력을 평가하였다.

구분	박테리아	광 민감제	액체 배지
실시예 8	악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii)	레사주린(resazurin)	티오글리콜레이트 배지(Thioglycollate broth)
실시예 9	엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)	프로토포르피린 9 (protoporphyrin IX)	티오글리콜레이트 배지(Thioglycollate broth)
실시예 10	푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)	커큐민(curcumin)	티오글리콜레이트 배지(Thioglycollate broth)
실시예 11	베일로넬라 파르불라균(Veillonella Parvula)	리보플라빈(riboflavin)	뇌심장침출 배지(brain heart infusion (BHI) broth)

도 8 내지 11은 광 민감제 처리 농도 및 광 존재 여부에 따라 박테리아 활성정도를 도시한 655nm에서의 흡광도이며, 각 실시예 8 내지 11의 박테리아 항균력 평가에 대한 결과를 도시하였다.

상기 도 8은 상기 실시예 8에 대한 항균 효과 데이터로, 광 민감제인 레사주린의 농도가 높아질수록 항균성이 높아지는 것을 확인되었다. 또한, 상기 비교예 1은 광 민감제의 농도가 높아질수록 항균성이 높아지긴 하나, 1㎍/ml의 이상의 농도에서는 항균성이 높아지지 않으며, 이는 광 민감제 없이 빛만 조사한 경우와 동일한 항균력을 가지는 것으로 나타났다.

상기 도 9은 상기 실시예 9에 대한 항균 효과 데이터로, 광 민감제인 프로토포르피린 9에 의해 항균력이 나타나며, 낮은 농도의 프로토포르피린 9을 처리하여도 박테리아의 활성을 억제 할 수 있음을 확인하였다. 반면, 상기 비교예 2는 광 민감제 농도가 높을수록 박테리아의 활성을 오히려 높아지는 것을 확인하였다.

상기 도 10은 상기 실시예 10에 대한 항균 효과 데이터로, 광 민감제인 커큐민의 농도가 높아질수록 항균력이 높아지는 것을 확인되었다. 반면, 상기 비교예 3은 광 민감제의 농도가 높아질수록 항균력이 높아지나, 상기 실시예 10 보다 항균력이 떨어지는 것을 확인하였다.

상기 도 11은 상기 실시예 11에 대한 항균 효과 데이터로, 광 민감제인 리보플라빈을처리한 후, 405nm의 광을 조사할 경우 항균력이 나타났다. 반면 상기 비교예 4에서는 항균력이 나타나지 않았다.

따라서, 구강 질환과 연관된 박테리아는 광 민감제 처리 및 광 조사 여부에 따라 생장에 영향을 받으며, 파장길이가 짧은 400~500nm의 광 및 이에 활성화 되는 광 민감제를 처리함으로써, 박테리아를 억제 시킬 수 있음을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (18)

1. (a) 335nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광(light of excitation)을 박테리아 존재 가능성이 있는 영역에 조사하는 단계;
   (b) 상기 여기광에 의해 조사된 영역의 방출파장(emission wavelength)을 스캔하여 박테리아의 자가 형광 스펙트럼을 얻는 단계;
   (c) 상기 자가 형광 스펙트럼이 460nm 내지 545nm 범위의 방출파장을 나타내는 경우, 구강 질환을 유발하는 박테리아의 존재 가능성이 있음을 관찰 또는 결정하는 단계;
   (d) 상기 박테리아의 존재 가능성이 있는 영역에 광 민감제를 처리하는 단계; 및
   (e) 상기 광 민감제가 처리된 영역에 400nm 내지 500nm의 광을 조사하는 단계를 포함하는, 광을 이용하여 구강 질환을 유발하는 박테리아를 진단 및 제거하는 방법으로서,
   상기 (c) 단계는 335nm 내지 355nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 조사하여, 460nm 내지 480nm의 최대방출파장을 나타내는 자가 형광 스펙트럼을 얻을 경우, 상기 박테리아는 충치균, 악티노마이세스이스라엘리, 엔테로코커스패시움, 및 베일로넬라파르불라균 중 어느 하나 이상인 것으로 관찰 또는 결정하며,
   355nm 내지 385nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 조사하여, 500nm 내지 520nm의 최대방출파장을 나타내는 자가 형광 스펙트럼을 얻을 경우, 상기 박테리아는 푸소박테리움뉴클레아툼 및 락토바실러스 가세리 중 어느 하나 이상인 것으로 관찰 또는 결정하며,
   385nm 내지 425nm 범위의 파장을 가지는 여기광을 조사하여, 525nm 내지 545nm의 최대방출파장을 나타내는 경우, 상기 박테리아는 포피로모나스진지발라스인 것으로 관찰 또는 결정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 구강질환은 치아우식증, 치주질환, 및 방선균증 중에서 선택된 어느 하나 이상인, 방법.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 구강질환을 유발하는 박테리아는 충치균(strepcococcus mutans), 락토바실러스 가세리(lactobacillus gasseri) 엔테로코커스 패시움(enterococcus faecium), 푸소박테리움 뉴클레아툼(fusobacterium nucleatum), 포피로모나스 진지발라스(porphyromonas gingivalis), 베일로넬라 파르불라균(veillonella Parvula), 및 악티노마이세스 이스라엘리(actinomyces israelii) 중에서 선택된 어느 하나 이상인, 방법.
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6. 삭제
7. 제 1항에 있어서,
   상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서, 형광분광기를 이용하여 박테리아의 자가 형광 스펙트럼을 얻는, 방법.
8. 삭제
9. 제 1항에 있어서,
   상기 광 민감제는 커큐민(curcumin), 프로토포르피린 9(protoporphyrin IX), 레사주린(resazurin) 및 리보플라빈(riboflavin) 중에서 선택된 어느 하나 이상인, 방법.
10. 제 1항에 있어서,
    상기 광 민감제를 처리하는 단계는 광 민감제 함유 스프레이형, 패치형 또는 주사제를 이용하는, 방법.
11. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리아 존재 가능성이 있는 영역은 구강 내부인, 방법.
12. 제 1항에 있어서,
    상기 구강 질환을 유발하는 박테리아가 악티노마이세스 이스라엘리, 엔테로코커스 패시움, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 충치균 및 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나 이상인 경우,
    커큐민 및 프로토포르피린 9 중 어느 하나 이상의 광 민감제를 사용하는, 방법.
13. 제 1항에 있어서,
    상기 구강 질환을 유발하는 박테리아가 악티노마이세스 이스라엘리 및 베일로넬라 파르불라균 중 어느 하나 이상인 경우,
    커큐민, 프로토포르피린 9 및 레사주린 중 어느 하나 이상의 광민감제를 사용하는, 방법.
14. 제 1항에 있어서,
    상기 구강 질환을 유발하는 박테리아가 베일로넬라 파르불라균일 경우,
    리보플라빈을 광 민감제로 사용하는, 방법.
    
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