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KR101797843B1 - 섬오가피나무 줄기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물 - Google Patents

섬오가피나무 줄기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물 Download PDF

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KR101797843B1
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Abstract

본 발명은 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항균용 화장료 조성물, 식품 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항균용 조성물은 농도의존적으로 세포 내에서 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 저해하는 활성이 우수하고, 염증성 사이토카인의 생성을 저해하는 활성이 뛰어날 뿐만 아니라 염증성 피부상재균에 대한 생장 저해 활성이 우수한 특징을 지니므로, 염증 작용 및 미생물 감염에 의해 유발되는 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 화장품, 식품 및 의약품 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

섬오가피나무 줄기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물{A composition having anti-inflammation or anti-bacterial activity comprising Acanthopanax koreanum Nakai stem extracts, fractions thereof or compounds isolated therefrom as an active ingredient}
본 발명은 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항균용 화장료 조성물, 식품 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 상처나 감염, 또는 자가면역 기전 등에 의해 나타나는 생체반응으로서 염증발생 시 염증부위에 면역세포들이 침투되고 이들 세포들은 여러 종류의
화학물질 및 사이토카인을 생산 분비하여 생체방어 및 염증반응을 일으킨다(J. Korean Soc . Food Sci . Nutr ., 2010, 39(7), 980-985). 내독소로 잘 알려진 LPS(lipopolysaccharide)는 그람-음성균의 세포외막에 존재하며, RAW 264.7과 같은 대식세포(macrophage) 또는 단핵구(monocyte)에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)들을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘(prostaglandin)으로 바뀌는 과정 및 일산화질소(nitric oxide, NO) 형성 과정으로 이어지게 된다. 체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 PGE2(prostaglandin E2) 등의 염증인자가 iNOS(inducible NO synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)에 의해 형성된다. 일반적인 NO 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 과잉 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다(Korean Soc . of Food Sci . Techn ., 2007, 39(4), 464-469). 또한 염증을 일으키는 원인은 무수히 많으나 세균, 진균, 바이러스와 같은 생물성 원인도 그 중 하나이다. 피부상재균 중 피부염증에 유발에 관여하는 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등을 들 수 있다. S. epidermidis, P. acnes, S. aureus, P. aeruginosa와 같은 세균들은 피부에서 종기, 여드름, 중이염 등의 화농성 질환을 일으키는 원인균들이다. 이러한 균들이 염증반응을 유발하는데 주된 역할을 하게 되므로 염증성 피부질환 치료에 다양한 항생제가 사용되고 있다. 현재 사용되고 있는 항생제 중에는 에리트로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline), 클린다마이신(clindamycin), 매크로라이드(macrolide), 아젤라인산(azelaic acid), 레티노이드(retinoid), 과산화 벤조일(benzoyl peroxide) 등이 있지만 레티노이드, 과산화 벤조일은 피부건조증이나 과민증을 유발하고, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 클린다마이신, 매크로라이드는 항생제에 대한 내성 발생으로 인하여 지속적인 사용이 어렵고 간독성이 심하며, 칸디다증과 같은 기회감염증이 나타날 수도 있다는 부작용이 있다. 따라서 이런 문제점을 해결하기 위해 안전성이 확보된 천연물을 이용하여 항균효과가 있으면서 부작용이 없는 피부염증 치료제를 개발하려고 노력중이며, 근래 염증분야 연구에서는 염증매개물질 생산 분비를 억제하는 천연소염물질을 찾는데 초점이 맞추어져 있는데 그 이유는 코티졸(cortisol) 합성제제와 같은 기존 소염제가 부작용이 많기 때문이다(Korean J. Medicinal Crop Sci ., 2010, 18(2), 105-112).
한편, 피부의 색은 멜라닌, 헤모글로빈, 카로틴의 3가지에 의해 결정되는데 이중 가장 중요한 역할을 하는 것이 멜라닌이다. 멜라닌세포는 표피의 기저층에서 흑갈색의 멜라닌을 생성하는 나뭇잎모양의 수지상세포이다. 멜라닌의 주요한 역할은 피부에서 발생하는 활성산소나 프리라디칼을 제거하고, 또 자외선의 투과를 막아 피부의 내부를 보호하는 것이다. 멜라닌을 만드는 출발물질은 인체에 정상적으로 존재하는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)이다. 티로신은 멜라닌 세포 내에서 티로시나아제(tyrosinase)라는 효소에 의해 산화되어 도파(DOPA)로 변하고, 도파는 더욱 산화하여 도파 퀴논(DOPA quinone)으로 바뀐다. 도파 퀴논은 이후 자동 산화반응을 거쳐 최종적으로 흑갈색의 유멜라닌(eumelanin)을 만들어낸다. 한편 도파 퀴논이 시스테인(cysteine)을 만나게 되면 시스테이닐 도파(cysteinyl DOPA)가 만들어지고 그 결과 적갈색의 페오멜라닌(pheomelanin)이 만들어진다. 이후 생성된 멜라닌은 멜라노솜(melanosome)에 실려 각질형성세포로 전달된다. 그러나 멜라닌(melanin)이 과잉 생산이 되면 기미, 주근깨, 점, 검버섯 등의 색소침착이 일어나 피부노화 및 손상을 초래하며 피부암의 유발에도 관여하는 것으로 알려져 있다(J. Korean Ind . Eng . Chem ., 2005, 16(3), 348-353). 최근의 미백효과에 대한 연구는 피부 미백효과와 항산화작용, 피부노화방지를 포함하는 포괄적인 개념으로 진행되고 있다. 현재 알려져 있는 미백에 대한 연구는 자외선 차단 소재 연구, 멜라닌 세포에 멜라닌의 합성을 명령하는 신호전달 물질인 사이토카인(cytokine)의 작용을 조절하는 연구, 유전자 발현억제, 티로시나아제(tyrosinase) 작용억제, 활성산소 제거소재, 색소환원, 각질층 제거 촉진소재 연구 등의 여러 방법으로 진행되고 있다. 이중에서도 티로시나아제의 활성을 억제하여 멜라닌의 초기 생성을 감소시키는 기전이 가장 많이 연구되고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 항염증, 또는 항균 효과를 나타내면서 부작용이 적은 천연물을 찾고자 예의 연구노력한 결과, 예로부터 민간요법으로 신경통, 관절염 등의 치료를 위한 약용식물로서 사용되어 온 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai)의 추출물, 특히 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물이 우수한 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성 저해 효과, 염증성 사이토카인 생성 억제 효과 및 피부상재균에 대한 생장 억제 효과를 가지고 있을 뿐만 아니라 멜라닌형성(melanogenesis) 및 세포내 티로시나아제(intracellular tyrosinase) 저해 활성 또한 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 2010, 39(7), 980-985 Korean Soc. of Food Sci. Techn., 2007, 39(4), 464-469 Korean J. Medicinal Crop Sci., 2010, 18(2), 105-112 J. Korean Ind. Eng. Chem., 2005, 16(3), 348-353
본 발명의 목적은 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai)"는 두릅나무과의 가지가 많은 낙엽성 관목으로, 제주도 바닷가에서부터 해발 1,400 m에 이르는 계곡이나 숲속에 드물게 자라고 있는 제주 특산종이며 탐라오갈피라고도 한다. 고산지대나 아한대지대에서 자생하는 타 오갈피들에 비해 줄기의 기부가 넓고, 강한 갈고리 모양의 가시가 달려 있으며, 잎이 두꺼운 특징을 가지고 있다. 꽃은 산형꽃차례를 이루며 7~8월에 피고, 7 mm 내외의 열매는 10월에 흑색을 나타낸다. 종자와 삽목번식을 통하여 증식이 이루어지는데 종자번식의 경우 미숙 종자로 생산되기 때문에 발아에 2년 이상이 소요되고 발아율도 낮으며, 삽목번식의 경우도 발근력이 낮아 식물체로의 재생률이 낮다. 또한 수확시기와 부위에 따라 생리활성물질의 함량이 다르기 때문에 생리활성물질 생산을 목적으로 재배할 경우 9월말에 수확하는 것이 생리활성물질 함량이 가장 높다고 보고된 바 있으며, 예로부터 민간요법으로 신경통, 관절염 등의 치료를 위한 약용식물로서 사용되어 온 것으로 알려져 있다.
상기 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물의 헥산 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 섬오가피나무 줄기의 추출물을 제조하는 단계; 및
4) 단계 3)의 섬오가피나무 줄기 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 섬오가피나무 줄기 분획물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 단계 1)에서 이에 제한되지는 않으나, 섬오가피나무 줄기 이외에 잎 또는 뿌리를 모두 포함하여 추출하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C4 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, 속슬렛(Soxhlet) 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 섬오가피나무 줄기 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하고, 24시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 노르말-헥산(n-Hexane), 에틸아세테이트(EtOAc) 또는 부탄올(BuOH)인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 섬오가피나무 줄기 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말-헥산(n-Hexane), 에틸아세테이트(EtOAc), 노르말-부탄올(n-BuOH) 및 물(H2O)로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 헥산 분획물임이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 섬오가피나무 줄기 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
한편, 이에 제한되지는 않으나, 상기 에텔아세테이트(EtOAc) 분획물에는 3,4-다이하이드록시 벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid), 3,4-다이하이드록시벤조산 메틸에스터(3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester), 카페익산(caffeic acid) 및 클로로제닉산 메틸에스터(chlorogenic acid methyl ester) 화합물을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 노르말-헥산(n-Hexane) 분획물에는 클로올릭산(coriolic acid), 16알파-하이드록시-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산(16α-hydroxy-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid), 16알파-하이드로-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산(16α-hydro-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid) 및 코레노익산(kaurenoic acid)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "항염증"은 염증를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 염증 반응의 조절은 대단히 복잡한 것으로 알려져 있는데, 이는 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것으로 알려져 있다. 그러나 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 활성 질소종(reactive nitrogen species, RNS)이 과다 생성되고 그 결과로 영구적인 유전자의 변형이 야기된다. 이처럼 ROS와 RNS는 생체 내 여러 가지 세포의 작용을 조절하는 염증 반응과 깊이 관련되어 있다. 염증 과정 중에는 많은 양의 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines), 일산화질소(nitric oxide, NO) 그리고 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)이 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase-2, COX-2)에 의해 생성된다. 염증은 다양한 염증성 질환을 유발하는 원인으로써, 본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물, 특히 상기 줄기 추출물의 헥산 분획물을 포함하는 조성물은 항염증 작용을 통해 다양한 염증성 질환에 대한 예방 및 개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 섬오가피나무 줄기 추출물 또는 이의 분획물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, RAW 264.7 뮤린 대식세포(RAW 264.7 murine macrophage cell)를 이용하여 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성 저해 활성과 염증성 사이토카인인 IL-6(interleukin-6) 생성 저해 활성을 측정한 결과, 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 또는 이의 분획물, 특히 헥산 분획물이 세포독성 없이 농도의존적으로 NO 생성 저해 활성 및 염증성 사이토카인 생성 저해 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 2, 표 3, 표 4, 도 3, 도 4 및 도 5). 따라서, 본 발명의 항염증 효과는 NO 생성 저해 및 염증성 사이토카인 생성 억제 활성에 의해 달성되는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "항균"은 세균이나 진균 등의 미생물의 생장 및 증식을 억제 또는 제어하는 작용을 의미하는 것으로, 본 발명의 미생물은 이에 제한되지는 않으나, 피부 상재균인 스타필로코쿠스 에피더미디스(S. epidermidis), 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes), 스테피로코커스 오우러스(S. aureus) 또는 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa)일 수 있다. 여러 종류의 피부 질환은 주로 피부상재균에 의해서 발생되며 여드름균, 비듬균 등이 대표적이다. 여드름의 발병은 여드름균이 염증 반응을 유발하는 주된 요인으로 보고되고 있으며, 비듬균은 등, 목덜미와 같은 피부에서 이상적으로 증식하여 지루성 피부염을 유발시킨다. 아토피성 피부염의 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나, 발병 원인균으로 포도상 구균으로 보고되고 있다. 이러한 피부상재균 및 기타 세균에 의한 피부질환의 발생을 감소시키고 피부를 보호하기 위해 방부제 및 항균제의 사용은 필수적이지만 기존에 사용되고 있는 합성물질들은 피부에 알러지를 유발할 수 있으므로 비교적 인체에 무해한 물질을 사용하는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물, 특히 상기 줄기 추출물의 헥산 분획물을 화장품, 식품 또는 의약품 등에 포함시키면 미생물, 특히 피부 미생물 생장 억제 효과를 달성함으로써, 피부 질환 예방 및 개선에 기여할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 섬오가피나무 줄기 추출물 또는 이의 분획물의 항균 효과를 확인하기 위하여, 페이퍼 디스크 확산법(paper disc diffusion method)을 이용하여 피부상재균인 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis; CCARM 3709, 3710, 3711), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes ; CCARM 9009, 9010, 0081), 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus ; KCCM 11335) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa; KCCM 11802) 총 8개의 균주에 대한 항균 활성을 측정한 결과, 원형 발육 저지환(clear zone)의 직경 크기가 n-헥산 분획물에서 8개의 모든 균주, 에틸아세테이트 분획물에서 4개의 균주에 대하여 생장 저해 활성이 우수함을 확인하였다(표 5). 따라서, 본 발명의 항균 효과는 피부 미생물에 대한 생장 억제 활성에 의해 달성되는 것일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물에 관해서는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물은 항염증 효과 및 항균 효과를 갖기 때문에 항염증 또는 항균을 목적으로 화장료 조성물에 첨가할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 여드름, 아토피, 무좀, 건선, 습진 및 피부염을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 개선하며, 피부 미백 효과가 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물이 스타필로코쿠스 에피더미디스(S. epidermidis), 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes), 스테피로코커스 오우러스(S. aureus) 및 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa) 균주의 생장을 억제하는 효과가 있음을 확인하였으며(표 5), 멜라닌 색소 함량(melanin contents) 감소 및 세포내 티로시나아제(intracellular tyrosinase) 활성이 감소함을 확인함으로써 미백 효과도 있음을 검증하였다(표 15, 표 16, 표 19, 도 16, 도 17 및 도 20의 A).
본 발명은 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물이 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스 뿐만 아니라, 여드름균 감염 이후 2차 피부 감염균인 스타필로코쿠스 에피더미디스에 대하여 항균 작용이 우수해 여드름 개선에 뛰어난 효과가 있고, 대식세포에서 염증 관련 사이토카인 IL-6를 억제시킴과 동시에 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO 생성을 억제하는 우수한 항염증 효과가 있음을 제공한다. 테트라사이클린과 같은 항생제는 부작용 및 내성균의 출현 등 사용상의 한계점이 있는 반면, 본 발명에 따른 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물은 안전하고 부작용이 없어 화장료 조성물로 적합하다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물에 관해서는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 하므로 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 혼합량에 큰 제한은 없다.
본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
본 발명의 용어 "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 용어 "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물 및 이의 분획물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예:스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물에 관해서는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 추출물 및 이의 분획물은 항염증 효과 및 피부상재균에 대한 항균 효과를 갖기 때문에 약학 조성물로 활용하여 염증성 질환 및 피부상재균에 인해 발생하는 피부 질환을 예방, 개선 및 치료하기 위한 의약품에 포함시킬 수 있다.
상기 항염증에 대해서는 전술한 바와 같으며, 그에 따라 항염증, 즉 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 포함될 수 있다. 상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염, 및 인플루엔자 감염증일 수 있다.
또한, 상기 항균에 대해서는 전술한 바와 같으며, 그에 따라 항균을 목적으로 하는 약학 조성물에 포함될 수 있으며, 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ; CCARM 3709, 3710, 3711), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes ; CCARM 9009, 9010, 0081), 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus ; KCCM 11335) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa; KCCM 11802)와 같은 피부상재균으로 인해 발생하는 피부 질환의 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다. 상기 피부상재균에 의해 발생하는 질환들은 이에 제한되지는 않으나, 여드름, 아토피, 무좀, 건선, 습진 및 피부염을 포함하는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 싸이코트리아 루브라 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어 "개체"란 는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물은 천연 약용식물을 원료로 하므로 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로 안전하게 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항균용 조성물은 농도의존적으로 세포 내에서 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 저해하는 활성이 우수하고, 염증성 사이토카인의 생성을 저해하는 활성이 뛰어날 뿐만 아니라 염증성 피부상재균에 대한 생장 저해 활성이 우수한 특징을 지니므로, 염증 작용 및 미생물 감염에 의해 유발되는 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 화장품, 식품 및 의약품 등에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물을 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물의 농도의존적 DPPH 자유라디칼 소거 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물에 의한 NO 생성 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 NO 생성 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 IL-6 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 IL-6 생성 저해 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 3,4-다이하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid; 화합물 1), 카페익산(caffeic acid; 화합물 3) 및 클로로제닉산 메틸에스터(chlorogenic acid methyl ester; 화합물 4)을 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 3,4-다이하이드록시벤조산 메틸에스터(3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester; 화합물 2)를 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 클로올릭산(coriolic acid; 화합물 5), 16알파-하이드록시-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산(16α-hydroxy-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid; 화합물 6), 16알파-하이드로-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산(16α-hydro-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid; 화합물 7) 및 코레노익산(kaurenoic acid; 화합물 8)을 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 3,4-다이하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid; 화합물 1) 및 카페익산(caffeic acid; 화합물 3)의 HPLC 정성 분석 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 10은 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 3,4-다이하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid; 화합물 1) 및 카페익산(caffeic acid; 화합물 3)의 HPLC 정량 분석 결과를 나타낸 검정곡선 그래프이다.
도 11은 본 발명의 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물들의 농도의존적 DPPH 자유라디칼 소거 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 총 8개의 화합물에 의한 NO 생성 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 13은 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물 2, 화합물 4, 화합물 6 및 화합물 7의 농도에 따른 NO 생성 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 14는 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 화합물 1 및 화합물 3의 농도에 따른 NO 생성 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 15는 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 TNF-α 및 IL-6 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물 2, 화합물 4, 화합물 6 및 화합물 7의 농도에 따른 TNF-α 및 IL-6 생성 저해 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물 및 이의 용매별 분획물에 의한 멜라닌 형성(melanogenesis) 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 17은 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 멜라닌 형성(melanogenesis) 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 18은 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 총 8개의 화합물에 의한 멜라닌 형성(melanogenesis) 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 19는 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 색소 생성에 대한 본 발명의 섬오가피나무 줄기 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물 6, 화합물 7 및 화합물 8의 농도에 따른 멜라닌 형성(melanogenesis) 저해 활성 측정 결과(A) 및 세포 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 섬오가피나무 줄기의 에탄올 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물(A), 그리고 상기 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물 6, 화합물 7 및 화합물 8(B)의 농도에 따른 티로시나제 억제 활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 재료 준비
실시예 1-1: 시약 및 기기
본 발명에서 시료의 추출, 용매분획 분리 및 분석에 사용된 용매들은 Merck, Junsei의 제품을 사용하였다. VLC(vacuum liquid chromatography)에는 silica gel(2-25 ㎛, Sigma Co.)을 사용하였으며, 순상 칼럼 크로마토그래피에는 silica gel(95-110 ㎛, Merck Co.) 그리고 겔 여과 크로마토그래피에는 Sephadex LH-20 (0.1-0.025 ㎜)을 사용하였다. 또한 분리를 위하여 MPLC(medium pressure liquid chromatography, KP-C18-HS, Biotage Co.)를 사용하였다. 분리 과정에 사용된 TLC(thin-layer chromatography)는 precoated silica gel aluminium sheet(silica gel 60 F254, 2.0 mm, Merck Co.)를 사용하였다. TLC 상에서 분리된 물질들을 확인하여 위하여 UV lamp(254 nm)를 사용하거나, visualizing agent에 침적시킨 후 heat-gun을 이용하여 건조시켰다. Visualizing agent로는 KMnO4 수용액(3% KMnO4, 20% K2CO3, 0.25% NaOH) 및 1% anisaldehyde-MeOH를 필요에 따라 사용하였다.
분리된 화합물의 생리활성 연구를 위한 흡광도 측정에는 SunriseTM(Tecan Co.)이나 Biochrom Libra S22(Biochrom Co.)을 이용하였다.
구조분석에 이용된 NMR(nuclear magnetic resonance spectrometer)은 JNM-ECX 400(FT-NMR system, JEOL)과 AVANCE Ⅲ(FT-NMR, Bruker Co.)을 이용하였으며, NMR 측정 용매는 Merck의 NMR 전용용매로 CD3OD, CDCl3를 사용하였다.
HPLC 분석에는 HPLC(Waters Co. 600 Pump)를 이용하였고, 이때 칼럼은 INNO Column(250×4.6 ㎜, 5 ㎛)을, 검출기는 UV-Visible Detector(Waters Co. 966 PDA 254.0 nm)를 사용하였다.
실시예 1-2: 실험 시료
본 발명에 사용된 시료인 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기는 섬오가피나무를 직영농장에서 재배하여 가공·판매하는 제주도 소재의 식품가공업체인 '한라산오가피'를 통해 2013년 12월에 제주도 애월읍 고성리에서 채집하여 건재 및 분말화 된 상품을 구입하여 사용하였다.
실시예 2: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 용매 분획물 제조
건조 및 분쇄된 섬오가피나무 줄기 1 kg을 70%(v/v) 에탄올(EtOH) 20 L에 넣고 실온에서 24 시간동안 교반하였다. 침출시킨 시료를 감압 여과 장치를 이용하여 여액만 취하였으며, 이와 같은 방법으로 분리한 잔사에 대하여 동일한 조건으로 2회 더 반복 실시하였다. 이후 여과하여 얻어진 여액은 40℃ 이하의 수욕 상에서 회전 농축기(rotary evaporator)로 농축하여 70% 에탄올 추출물 100.6 g을 수득하였다. 상기 수득한 70% 에탄올 추출물을 증류수 1 L에 현탁시키고, 분별 깔때기를 이용해 극성순서에 따라 순차적으로 분획하여 n-헥산(n-hexane, n-Hex), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc), n-부탄올(n-butanol, n-BuOH), 및 물(water, H2O) 순서로 총 4개의 용매 분획 층을 얻었다(도 1). 상기 생성된 분획물들은 각각 감압 건조하여 분말 형태의 섬오가피나무 분획물로 준비하였다.
실시예 3: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 용매 분획물의 항산화 효과 분석
상기 실시예 2에서 수득한 섬오가피나무 줄기 70% 에탄올(EtOH) 추출물 및 4가지 용매 분획물의 자유 라디칼(free radical) 소거활성을 측정하기 위하여, Blois 방법(Blois, M.S., Nature, 1958, 181;1199-1200)을 응용한 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디컬 소거 활성 실험을 수행하였다. 이때, DPPH는 0.2 mM 농도가 되도록 에탄올에 용해시켜 사용하였다.
구체적으로, 섬오가피나무 에탄올 추출물 및 이의 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물 시료를 각각 3.125 ㎍/mL, 6.25 ㎍/mL, 12.5 ㎍/mL, 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL의 농도별로 에탄올로 희석하여 준비하였다. 이후, 96웰(well) 플레이트(plate)에 0.2 mM DPPH 용액 180 ㎕와 상기 희석하여 준비한 각각의 시료용액 20 ㎕를 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소거율(%)은 하기 수학식 1에 의해 계산하였으며, 각 시료가 DPPH를 50% 저해할 때의 농도(SC50; Scavenging concentration of 50%)를 구하였다. 각 시료는 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다. 이때 활성을 비교하기 위한 항산화제로는 vitamin C를 사용하였다.
Figure 112016010635646-pat00001
섬오가피나무 줄기 70% 에탄올(EtOH) 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물의 자유 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 자유 라디칼 소거 활성은 상기 추출물 및 분획물 모두에서 나타났으며, 특히 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 DPPH SC50값이 34.6 ㎍/mL로 자유 라디칼 소거 활성이 우수함을 확인하였다(표 1 및 도 2).
시료 SC 50 (㎍/mL)
EtOH >100
n-Hex >100
EtOAc 34.6
n-BuOH 88.7
H2O >100
Vitamin C 9.1
실시예 4: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 용매 분획물의 항염증 효과 분석
상기 실시예 2에서 수득한 섬오가피나무 줄기 에탄올(EtOH) 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, RAW 264.7 뮤린 대식세포(RAW 264.7 murine macrophage cell)를 이용하여 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성 저해 활성과 염증성 사이토카인인 IL-6(interleukin-6) 생성 저해 활성을 측정하였다. 또한, 상기 항염증 효과를 확인하기 위해 처리한 시료의 세포독성을 평가하기 위해 MTT(Dimethylthiazaolyl diphenyl tetrazolium salt) assay를 수행하였다.
실시예 4-1: 세포배양
RAW 264.7 뮤린 대식세포(RAW 264.7 murine macrophage cell)는 한국세포주 은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배지(dulbecco's modified eagle’s medium, GIBCO, Grand Island, YY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator) 조건에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양하였다.
실시예 4-2: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 용매 분획물의 NO 생성 저해 활성 측정 및 세포독성 평가
상기 실시예 4-1에서 배양한 RAW 264.7 세포를 24웰 플레이트에 2×105 cells/mL의 세포수가 되도록 분주하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건하에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 세척한 후 1 ㎍/mL의 LPS(lipopolysaccharides)가 포함된 배지로 교환하였다. LPS가 포함된 배지로 교환한 후, 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물 시료를 각각 100 ㎍/mL의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, 생성된 NO의 양은 Greiss 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine in 2.5% phosphoric acid)을 사용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 96웰 플레이트에 상기 24시간 동안 배양한 세포 배양액 100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 아질산나트륨(sodium nitrite, NaNO2)를 사용하여 검정곡선을 작성한 후 비교하였다. 이때 활성을 비교하기 위한 항염증제로는 2-amino-4-picoline(10 μM)을 사용하였다.
한편, 상기 NO 생성 저해 활성 실험에 사용하고 남은, 나머지 세포 배양액 900 ㎕에 500 ㎍/mL 농도의 MTT 시약을 첨가하여 3시간 동안 반응시킨 후 상등액을 완전히 제거하고, 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 570 nm에서 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 세포독성을 평가하였다. 세포독성은 하기 수학식 2에 의해 계산되었다.
Figure 112016010635646-pat00002
섬오가피나무 줄기 70% 에탄올(EtOH) 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물의 NO 생성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 세포독성 없이 각각 89.2% 및 87.7%로 NO 생성 저해 활성이 우수함을 확인하였다(표 2 및 도 3).
시료 처리농도 NO 저해율( % ) 세포 생존율( % )
Control(LPS 처리) - 0 100.0
2-Amino-4-picoline 10 uM 84.8 97.3
EtOH 100 ㎍/mL 34.5 109.5
n-Hex 100 ㎍/mL 89.2 103.0
EtOAc 100 ㎍/mL 87.7 104.6
n-BuOH 100 ㎍/mL 13.6 110.5
H2O 100 ㎍/mL N.D. 104.6
(N.D.* : Not Detected)
실시예 4-3: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 NO 생성 저해 활성 측정 및 세포독성 평가
상기 실시예 4-2에서 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 4가지 용매 분획물 중, n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물이 세포독성 없이 NO 생성 저해 활성이 우수함을 확인하고, 추가적으로 상기 2가지 분획물 시료를 각각 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 100 ㎍/mL 및 200 ㎍/mL의 농도별로 NO 생성 저해 활성 및 세포독성을 측정하였다. 이때, NO 생성 저해 활성 및 세포독성 측정 방법은 상기 실시예 4-2와 같은 방법으로 수행하였다.
섬오가피나무 줄기 70% 에탄올(EtOH) 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 NO 생성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 세포독성 없이 농도 의존적으로 NO 생성이 매우 효과적으로 저해됨을 확인하였다(표 3 및 도 4).
시료 처리농도 NO 저해율( % ) 세포 생존율( % )
Control(LPS 처리) - 0 100.0
2-Amino-4-picoline 10 uM 77.6 113.1
n-Hex 25 ㎍/mL 39.3 117.9
50 ㎍/mL 72.7 110.4
100 ㎍/mL 88.4 103.8
200 ㎍/mL 95.1 95.4
EtOAc 25 ㎍/mL 31.3 120.8
50 ㎍/mL 65.9 110.6
100 ㎍/mL 90.6 105.1
200 ㎍/mL 93.8 100.4
실시예 4-4: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 IL-6 생성 저해 활성 측정
상기 실시예 4-1에서 배양한 RAW 264.7 세포를 24웰 플레이트에 2×105 cells/mL의 세포수가 되도록 분주하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건하에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 세척한 후 1 ㎍/mL의 LPS(lipopolysaccharides)가 포함된 배지로 교환하였다. LPS가 포함된 배지로 교환한 후, 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 시료를 각각 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 100 ㎍/mL 및 200 ㎍/mL의 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후 수득한 배양 배지의 상층액을 이용하여 IL-6 함량을 측정하였다. 이때, IL-6의 함량 측정은 제조업자의 메뉴얼에 따라 ELISA Kit(Life technologies Co. invitrogen)를 사용하여 수행하였으며, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고 정량화하였다. 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성 저해 활성 정도는 대조군(control)인 LPS 처리군과 비교하여 분석하였다.
섬오가피나무 줄기 70% 에탄올(EtOH) 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 IL-6 생성 저해 활성을 측정한 결과, 세포독성이 없는 농도범위 내에서 농도 의존적으로 IL-6 생성량이 현저하게 감소함을 확인하였다(표 4 및 도 5).
시료 처리농도 IL-6 저해율( % )
Control(LPS 처리) - 0
n-Hex 25 ㎍/mL 36.4
50 ㎍/mL 44.6
100 ㎍/mL 61.3
200 ㎍/mL 71.5
EtOAc 25 ㎍/mL 37.8
50 ㎍/mL 48.4
100 ㎍/mL 74.4
200 ㎍/mL 84.1
실시예 5 : 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 용매 분획물의 항균 효과 분석
상기 실시예 2에서 수득한 섬오가피나무 줄기 에탄올(EtOH) 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물의 항균 효과를 확인하기 위하여, 페이퍼 디스크 확산법(paper disc diffusion method)을 이용하여 항균 활성을 측정하였다.
실시예 5-1: 균주 배양
상기 실시예 2에서 수득한 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물 시료의 항균활성을 측정하기 위해, 피부상재균인 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ; CCARM 3709, 3710, 3711), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes ; CCARM 9009, 9010, 0081), 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus ; KCCM 11335) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa ; KCCM 11802) 총 8개의 균주를 한국 미생물보존 센터로부터 분양받아 사용하였다. S. epidermidis, S. aureus 및 P. aeruginosa의 경우, TSB(tryptic soy broth) 배양 배지를 사용하여 3계대 배양하고, P. acnes의 경우, GAM(gifu anaerobic medium) 배양 배지를 사용하여 3계대 배양한 후 항균 활성 실험에 사용하였다.
실시예 5-2: 페이퍼 디스크 확산법(Paper disc diffusion method)
상기 실시예 5-1에서 3계대 배양한 총 8개의 균주에 대하여, 본 발명의 섬오가피나무 줄기 에탄올(EtOH) 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물 시료의 항균활성을 측정하기 위해 페이퍼 디스크 확산법(paper disc diffusion method)을 이용하여 생장 저해 활성을 측정하였다.
구체적으로, P. acnes(CCARM 9009, 9010, 0081)는 0.5 McFarland standard로 탁도를 조절하여 1.5×106 CFU/mL로 맞춰준 후 0.8% 한천을 포함하는 GAM 배지에 넣어 1.5% 한천을 포함하는 GAM 배지 위에 부어 주었다. 이후 배지가 굳으면 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물 시료가 각각 100 ㎎/mL의 농도로 처리된 직경 8 mm paper disc를 배지 위에 올려서 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양하였다. 배양 후 형성된 원형 발육 저지환(clear zone)의 직경 크기를 측정하였다. 또한, S. epidermidis(CCARM 3709, 3710, 3711), S. aureus(KCCM 11335) 및 P. aeruginosa(KCCM 11802)는 0.5 McFarland standard로 탁도를 조절하여 1.5×106 CFU/mL로 맞춰준 후 0.8% 한천을 포함하는 TSB 배지에 넣어 1.5% 한천을 포함하는 TSB 배지 위에 부어 주었다. 이후 배지가 굳으면 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물 시료가 각각 100 ㎎/mL의 농도로 처리된 직경 8 mm paper disc를 배지 위에 올려서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 형성된 원형 발육 저지환(clear zone)의 직경 크기를 측정하였다. 이때 비교하기 위한 활성물질로는 에리트로마이신(erythromycin, 1 ㎎/mL)을 사용하였다.
피부상재균인 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ; CCARM 3709, 3710, 3711), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes ; CCARM 9009, 9010, 0081), 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus ; KCCM 11335) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa ; KCCM 11802) 총 8개의 균주에 대한 섬오가피나무 줄기 70% 에탄올(EtOH) 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물의 항균 활성을 측정한 결과, 원형 발육 저지환(clear zone)의 직경 크기가 n-헥산(n-Hex) 분획물에서 8개의 모든 균주, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 4개의 균주에 대하여 생장 저해 활성이 우수함을 확인하였다(표 5).
Bacterial density
(1.5×106 CFU/mL)		 추출물 및 분획물(처리농도: 100 ㎎/mL) Erythromycin
(처리농도:
1 mg/mL)
Extract n-Hex EtOAc n-BuOH H2O
Clear zone (mm)
S. epidermidis (CCARM 3709) N.D. 12 18 N.D. N.D. 30
S. epidermidis (CCARM 3710) N.D. 10 14 N.D. N.D. N.D.
S. epidermidis (CCARM 3711) N.D. 9 10 N.D. N.D. 26
P. acnes
(CCARM 0081)		 N.D. 10 N.D. N.D. N.D. N.D.
P. acnes
(CCARM 9009)		 N.D. 12 12 N.D. N.D. 30
P. acnes
(CCARM 9010)		 N.D. 10 N.D. N.D. N.D. 28
S. aureus
(KCCM 11335)		 N.D. 15 N.D. N.D. N.D. 28
P. aeruginosa
(KCCM 11802)		 N.D. 14 N.D. N.D. N.D. 30
(N.D.* : Not Detected)
실시예 6: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 용매 분획물로부터 생리활성 화합물 분리 및 구조 동정
상기 실시예 2에서 수득한 섬오가피나무 용매 분획물로부터 생리활성 화합물을 분리하고 구조를 동정하기 위해, 상기 실시예 3 내지 실시예 5의 결과를 토대로 생리활성 기능이 있는 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물을 선택하고 이로부터 생리활성 화합물(compound)을 분리하고 구조를 동정하였다.
실시예 6-1: 에틸아세테이트( EtOAc ) 분획물의 활성성분 분리 및 구조 동정
상기 실시예 2에서 수득한 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 5.0 g을 극성에 따라 순차적으로 세분화하기 위하여 MPLC(medium pressure liquid chromatography)를 수행하였다. 에틸아세테이트 분획물 5.0 g을 메탄올(MeOH) 8 mL에 녹이고 0.45 ㎛ PVDF filter를 이용해 여과한 후 주입하였으며 컬럼(column)은 역상 실리카겔(C18)을 사용하였다. 기울기 용리법을 이용해 메탄올(MeOH):물(H2O)(10→90%, 80분), 메탄올(90→100%, 10분)의 용매 조건들로 극성 비율을 순차적으로 낮추면서 각각 40 mL씩 용출시켜 총 43개의 분획물(fraction, Fr.)을 얻었다. MPLC 분획들 중 Fr.7-9로부터 compound 1(196.0 mg)을 얻었으며, Fr.11-12(100.0 mg)를 클로로포름(CHCl3):메탄올(MeOH) = 3:1의 용매 조건으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column chromatograpy)를 수행하여 compound 4(11.5 mg)을 얻었다. 또한, MPLC 분획들 중 Fr.13-15로부터는 compound 3(100.8 mg)을 얻었다(도 6).
한편, 상기 실시예 2에서 수득한 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 4.8 g을 극성에 따라 순차적으로 세분화하기 위하여 VLC(vacuum liquid chromatography)용 순상 실리카 겔(normal phased silica gel)로 충진한 글라스 컬럼(glass column)을 이용하여 VLC를 수행하였다. 기울기 용리법을 이용해 n-헥산(n-Hex):에틸아세테이트(EtOAc)(0→100%), 에틸아세테이트(EtOAc):메탄올(MeOH)(90→100%)의 용매 조건들로 극성 비율을 5, 10 또는 20%씩 높이면서 각각 300 mL씩 용출시켜 총 27개의 분획(fraction, Fr.)을 얻었다. VLC 분획들 중 Fr.2-4(150.0 mg)를 n-헥산(n-Hex):에틸아세테이트(EtOAc) = 1:1의 용매 조건으로 순상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(normal phased silica gel column chromatograpy)를 수행하여 compound 2(11.5 mg)를 얻었다(도 7).
상기와 같이 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 총 4개의 활성 화합물을 분리하여 1H-핵자기공명 스펙트럼(1H-NMR spectrum) 및 13C-핵자기공명 스펙트럼(13C-NMR spectrum)을 측정하여 구조를 동정한 결과, compound 1은 3,4-다이하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)으로, compound 2는 3,4-다이하이드록시벤조산 메틸에스터(3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester)로, compound 3은 카페익산(caffeic acid)으로, compound 4는 클로로제닉산 메틸에스터(chlorogenic acid methyl ester)로 동정되었다(표 6).
Figure 112016010635646-pat00003
실시예 6-2: n - 헥산 ( n -Hex) 분획물의 활성성분 분리 및 구조 동정
상기 실시예 2에서 수득한 n-헥산(n-Hex) 분획물 4.0 g을 극성에 따라 순차적으로 세분화하기 위하여 VLC(vacuum liquid chromatography)용 순상 실리카 겔(normal phased silica gel)로 충진한 글라스 컬럼(glass column)을 이용하여 VLC를 수행하였다. 기울기 용리법을 이용해 n-헥산(n-Hex):에틸아세테이트(EtOAc)(0→100%)의 용매 조건들로 극성 비율을 5 또는 10%씩 높이면서 각각 300 mL씩 용출시켜 총 15개의 분획(fraction, Fr.)을 얻었다. VLC 분획들 중 Fr.2로부터 compound 8(222.2 mg)을 얻었으며, Fr.3(50.0 mg)을 클로로포름(CHCl3) 100%의 용매 조건으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column chromatograpy)를 수행하여 compound 7(17.0 mg)을 얻었다. 또한, 상기 compound 7을 얻은 동일한 방법을 통해 Fr.6(180.0 mg)으로부터 compound 5(18.3 mg) 및 compound 6(31.4 mg)을 얻었다(도 8).
상기와 같이 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 총 4개의 활성 화합물을 분리하여 1H-핵자기공명 스펙트럼(1H-NMR spectrum) 및 13C-핵자기공명 스펙트럼(13C-NMR spectrum)을 측정하여 구조를 동정한 결과, compound 5는 클로올릭산(coriolic acid)으로, compound 6은 16알파-하이드록시-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산(16α-hydroxy-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid)으로, compound 7은 16알파-하이드로-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산(16α-hydro-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid)으로, compound 8은 코레노익산(kaurenoic acid)으로 동정되었다(표 7).
Figure 112016010635646-pat00004
실시예 7: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 에틸아세테이트( EtOAc ) 분획 물로부터 분리된 활성 화합물의 정성 및 정량 분석
상기 실시예 6-1에서 수득한 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 화합물 중 비교적 과량으로 존재하는 3,4-다이하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid; 화합물 1) 및 카페익산(caffeic acid; 화합물 3)에 대한 정성 및 정량 분석을 위해 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 분석 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 화합물의 정성분석에는 10 ㎎/mL로 녹인 화합물 1 및 화합물 3을 각각 첨가한 후 0.45 ㎛ PVDF filter를 이용해 여과하고 여액을 분석하여, 화합물 1과 화합물 3을 개별로 첨가했을 때 증가되는 피크를 가지고 상기 화합물별 머무름 시간을 확인하였다. 또한, 상기 화합물의 정량분석에는 화합물 1 및 화합물 3에 각각 해당하는 3,4-다이하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid, Cas:99-50-3, Sigma-aldrich Co.) 및 카페익산(caffeic acid, Cas:331-39-5, Sigma-aldrich Co.) 표준용액을 사용하여, 얻어진 피크의 면적 값을 가지고 각 화합물의 정량을 위한 검정곡선을 작성하였다. 검정곡선을 작성하기 위해 3,4-다이하이드록시벤조산 및 카페익산 표준물질 각 1,000 ㎎을 1ℓ 메탄올(MeOH)에 녹여 1,000 ppm으로 저장 용액(stock solution)을 제조하고, 이를 각각 25, 50, 100 및 200 ppm이 되도록 희석하여 검정곡선을 작성하였다.
준비된 샘플 10 ㎕씩을 30℃ 칼럼 조건에서 분석하는데 HPLC(Waters Co. 600 Pump)를 이용하였고, 사용된 칼럼 및 검출기는 각각 INNO Column(250×4.6 ㎜, 5 ㎛) 및 UV-Visible Detector(Waters Co. 966 PDA 254.0 nm)이었다. 용리액은 아세토나이트릴(acetonitrile)/0.1% 아세트산(acetic acid)을 사용하여 하기 표 8의 조건으로 기울기 용리시켰고, 1.0 mL/분(min)의 유속으로 60분 동안 분석하였다(표 8).
Time (min) Flow (mL/min) 0.1% acetic acid (%) Acetonitrile (%)
0 1.0 90 10
15 1.0 60 40
30 1.0 30 70
42 1.0 5 95
45 1.0 90 10
역상 칼럼(C18)을 이용하여 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 분리한 화합물 중 비교적 과량으로 존재하는 3,4-다이하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid; 화합물 1) 및 카페익산(caffeic acid; 화합물 3)에 대하여 정성 및 정량 분석을 실시한 결과, HPLC 정성 분석 결과에서 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 피크의 머무름 시간 중 7분은 화합물 1로, 18분은 화합물 3으로 확인되었다(도 9).
또한, HPLC 정량 분석 결과에서 3,4-다이하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid) 및 카페익산(caffeic acid) 표준용액을 사용한 검정곡선을 작성하여 외부표준법(external standard method)을 가지고 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 분리한 화합물 1과 화합물 3의 함량을 측정한 결과, 화합물 1과 화합물 3은 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에 각각 4.18% 및 2.30%의 함량으로 존재하는 것이 확인되었다(도 10).
실시예 8: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 에틸아세테이트( EtOAc ) 분획물 및 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물로부터 분리된 활성 화합물의 항산화, 항염 및 항균 효과 분석
상기 실시예 6에서 분리 동정한 8개의 화합물에 대한 항산화, 항염 및 항균 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3, 실시예 4 및 실시예 5와 동일한 방법으로 DPPH 자유라디칼(free radical) 소거 활성, NO(nitric oxide) 생성 저해 활성 및 피부상재균에 대한 생장 저해 활성을 측정하였다.
실시예 8-1: 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트( EtOAc ) 분획물 및 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물로부터 분리된 활성 화합물의 항산화 효과 분석
섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 총 8개의 활성 화합물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 DPPH 자유라디칼 소거 활성을 측정하였다. 이때, 총 8개의 활성 화합물은 각각 25 μM, 50 μM, 100 μM, 300 μM 및 500 μM의 농도로 DPPH assay를 수행하였다.
섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물에 대해 DPPH 자유 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 및 화합물 4에서 각각 361.8 μM, 275.8 μM, 276.0 μM 및 165.8 μM로 자유 라디칼 소거 활성이 우수함을 확인하였다(표 9 및 도 11).
화합물
(compound) 		화합물 명칭 SC 50
( μM )
Cpd1 3,4-다이하이드록시벤조산
(3,4-dihydroxybenzoic acid)		 361.8
Cpd2 3,4-다이하이드록시벤조산 메틸에스터
(3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester)		 275.8
Cpd3 카페익산(caffeic acid) 276.0
Cpd4 클로로제닉산 메틸에스터
(chlorogenic acid methyl ester)		 165.8
Cpd5 클로올릭산(coriolic acid) >100
Cpd6 16알파-하이드록시-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산
(16α-hydroxy-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid)		 >100
Cpd7 16알파-하이드로-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산
(16α-hydro-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid)		 >100
Cpd8 코레노익산(kaurenoic acid) >100
Vit.C 비타민 C(vitamin C) 44.6
실시예 8-2: 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트( EtOAc ) 분획물 및 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물로부터 분리된 활성 화합물의 항염증 효과 분석
섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 총 8개의 활성 화합물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 RAW 264.7 뮤린 대식세포(RAW 264.7 murine macrophage cell)를 이용하여 NO 생성 저해 활성을 측정하고, 상기 실시예 4-4와 동일한 방법으로 ELISA Kit(Life technologies co. invitrogen)를 사용하여 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6(interleukin-6) 생성 저해 활성을 측정하였다. 또한, 상기 항염증 효과를 확인하기 위해 처리한 화합물의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다.
섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물을 각각 100 μM의 농도로 RAW 264.7 뮤린 대식세포에 처리하고 NO 생성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, 모든 화합물에서 세포독성 없이 NO 생성 저해 활성이 나타남을 확인하였다. 이 중 화합물 6 및 화합물 8에서 NO의 생성을 현저하게 저해함을 확인하였다(표 10 및 도 12).
시료 처리농도( uM ) NO 저해율( % ) 세포 생존율( % )
Control(LPS 처리) - 0 100.0
2-Amino-4-picoline 10 83.8 118.3
화합물 1(Cpd1) 100 9.9 104.8
화합물 2(Cpd2) 100 38.6 112.5
화합물 3(Cpd3) 100 19.6 104.6
화합물 4(Cpd4) 100 19.9 109.2
화합물 5(Cpd5) 100 49.4 115.6
화합물 6(Cpd6) 100 61.7 103.4
화합물 7(Cpd7) 100 29.7 100.6
화합물 8(Cpd8) 100 59.9 105.2
또한, 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 총 8개의 활성 화합물 중, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 6 및 화합물 7을 각각 25 μM, 50 μM 및 100 μM의 농도별로 RAW 264.7 뮤린 대식세포에 처리하고, 상기 4개 화합물의 농도에 따른 NO 생성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, 세포독성 없이 농도 의존적으로 NO 생성이 저해됨을 확인하였다(표 11 및 도 13).
시료 처리농도( uM ) NO 저해율( % ) 세포 생존율( % )
Control(LPS 처리) - 0 100.0
2-Amino-4-picoline 10 77.9 108.2
화합물 2(Cpd2)

 25 0.7 112.3
50 22.4 117.6
100 36.7 105.9
화합물 4(Cpd4)

 25 N.D. 100.9
50 4.7 106.2
100 18.3 105.7
화합물 6(Cpd6)

 25 5.7 102.5
50 21.6 102.2
100 61.7 96.2
화합물 7(Cpd7)

 25 0.7 101.5
50 14.7 100.4
100 26.6 94.2
(N.D.* : Not Detected)
한편, 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 활성 화합물 중, 비교적 과량으로 존재하고 HPLC로 정성 및 정량 분석을 수행한 화합물 1 및 화합물 3을 RAW 264.7 뮤린 대식세포에 각각 100 μM, 200 μM 및 400 μM의 농도별로 처리하고, 상기 2개 화합물의 농도에 따른 NO 생성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, 세포독성 없이 농도 의존적으로 NO 생성이 저해됨을 확인하였다(표 12 및 도 14).
시료 처리농도( uM ) NO 저해율( % ) 세포 생존율( % )
Control(LPS 처리) - 0 100.2
2-Amino-4-picoline 10 77.7 108.2
화합물 1(Cpd1)

 100 10.4 111.3
200 19.5 108.2
400 28.7 106.3
화합물 3(Cpd3)

 100 16.5 109.6
200 25.6 111.3
400 46.8 110.3
아울러, 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 총 8개의 활성 화합물 중, 화합물 2, 화합물 4, 화합물 6 및 화합물 7을 각각 25 μM, 50 μM 및 100 μM의 농도별로 RAW 264.7 뮤린 대식세포에 처리하고, 상기 4개 화합물의 농도에 따른 TNF-α 및 IL-6의 생성 저해 활성을 측정한 결과, 세포독성이 없는 농도범위 내에서 농도 의존적으로 염증 매개 인자인 TNF-α의 생성량이 조금씩 감소하고, IL-6 생성량 또한 농도 의존적으로 현저하게 감소함을 확인하였다(표 13 및 도 15).
시료 처리농도( uM ) TNF -α 저해율( % ) IL-6 저해율( % )
Control(LPS 처리) - 0 0
화합물 2(Cpd2)

 25 N.D. 10.6
50 9.6 37.1
100 25.0 71.8
화합물 4(Cpd4)

 25 4.5 40.2
50 10.6 57.2
100 19.7 71.5
화합물 6(Cpd6)

 25 N.D. 46.3
50 17.6 64.4
100 20.1 77.2
화합물 7(Cpd7)

 25 N.D. 40.3
50 16.9 57.2
100 23.3 67.6
(N.D.* : Not Detected)
실시예 8-3: 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트( EtOAc ) 분획물 및 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물로부터 분리된 활성 화합물의 항균 효과 분석
섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 총 8개의 활성 화합물의 항균 활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 총 8개의 균주에 대한 생장 저해 활성을 측정하였다.
피부상재균인 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ; CCARM 3709, 3710, 3711), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes ; CCARM 9009, 9010, 0081), 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus ; KCCM 11335) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa; KCCM 11802) 총 8개의 균주에 대해 섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 총 8개의 화합물의 항균 활성을 측정한 결과, 하기 표 14에 나타낸 바와 같이, 원형 발육 저지환(clear zone)의 직경 크기가 화합물 2에서 1개의 균주, 화합물 3에서 3개의 균주, 화합물 5에서 3개의 균주, 화합물 6에서 5개의 균주, 화합물 8에서 1개의 균주에 대하여 우수한 생장 저해 활성이 있음을 확인하였다(표 14).
Bacterial density
(1.5×106 CFU/mL)		 화합물(처리농도: 100 mM) Erythromycin
(처리농도:
1 mM)
Cpd1 Cpd2 Cpd3 Cpd4 Cpd5 Cpd6 Cpd7 Cpd8
Clear zone (mm)
S. epidermidis (CCARM 3709) N.D. N.D. 14 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 22
S. epidermidis (CCARM 3710) N.D. N.D. 10 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
S. epidermidis (CCARM 3711) N.D. N.D. 9 N.D. N.D. 10 N.D. N.D. 19
P. acnes
(CCARM 0081)		 N.D. N.D. N.D. N.D. 9 12 N.D. 9 N.D.
P. acnes
(CCARM 9009)		 N.D. 12 N.D. N.D. 9 14 N.D. N.D. 24
P. acnes
(CCARM 9010)		 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 22
S. aureus
(KCCM 11335)		 N.D. N.D. N.D. N.D. 10 12 N.D. N.D. 22
P. aeruginosa
(KCCM 11802)		 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 11 N.D. N.D. 22
(N.D.* : Not Detected)
실시예 9: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물, 이의 용매 분획물 및 상기 분획물로부터 분리된 화합물의 미백 효과 분석
상기 실시예 2에서 수득한 섬오가피나무 줄기 에탄올(EtOH) 추출물, 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물과, 상기 분획물로부터 분리된 화합물의 미백 효과를 확인하기 위하여, B16F10 뮤린 멜라노마 세포(B16F10 murine melanoma cell)를 이용하여 멜라닌형성(melanogenesis) 저해 활성을 측정하였다. 또한, 상기 미백 효과를 확인하기 위해 처리한 시료의 세포독성을 평가하기 위해 MTT(Dimethylthiazaolyl diphenyl tetrazolium salt) assay를 수행하였다.
실시예 9-1: 세포배양
상기 실시예 2에서 수득한 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물, 이의 4가지 용매 분획물 및 상기 분획물로부터 분리된 화합물 시료의 미백 활성을 측정하기 위해, B16F10 뮤린 멜라노마 세포(B16F10 murine melanoma cell)은 한국세포주 은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배지(dulbecco's modified eagle’s medium, GIBCO, Grand Island, YY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator) 조건에서 배양하였으며, 3일 간격으로 계대 배양하였다.
실시예 9-2: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 용매 분획물의 멜라닌형성(melanogenesis) 저해 활성 측정 및 세포독성 평가
상기 실시예 9-1에서 배양한 B16F10 세포를 6웰 플레이트에 5×104 cells/mL의 세포수가 되도록 분주하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 세척한 후 100 nM의 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)가 포함된 배지로 교환하였다. α-MSH가 포함된 배지로 교환한 후, 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물 시료를 각각 100 ㎍/mL의 농도로 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 72시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하고 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 처리하여 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포를 원심분리시켜 상등액이 제거된 세포 펠렛(pellet)만을 취하였다. 상기 세포 펠렛에 소니케이션 버퍼(sonication buffer; 6.7 mM sodium phosphate buffer containing 1% triton X-100, 0.2 mM PMSF)를 넣어 소니케이션(sonicatoion) 해준 후 다시 원심분리하였다. 분리된 상등액은 L-도파(L-DOPA)와 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 475 nm에서 세포내 티로시나아제(intracellular tyrosinase) 저해 활성을 측정하였고, 펠렛은 1 N 수산화나트륨(NaOH)을 첨가한 후 405 nm에서 흡광도를 측정해 멜라닌 색소 함량(melanin contents)을 확인하였다. 이때 활성을 비교하기 위한 미백제로는 멜라솔브(melasolv, 20 μM)을 사용하였다.
한편, 상기 멜라닌형성 저해 활성 실험에 사용한 세포와 동일한 조건으로 배양한 세포 배양액 900 ㎕에 500 ㎍/mL 농도의 MTT 시약을 첨가하여 3시간 동안 반응시킨 후 상등액을 완전히 제거하고, 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 570 nm에서 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 세포독성을 평가하였다. 세포독성은 상기 수학식 2에 의해 계산되었다.
섬오가피나무 줄기 70% 에탄올(EtOH) 추출물 및 이의 4가지 용매 분획물인 n-헥산(n-Hex) 분획물, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물, n-부탄올(n-BuOH) 분획물, 물(H2O) 분획물의 멜라닌형성(melanogenesis) 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 각각 79.7% 및 63.7%로 멜라닌 색소 함량이 감소하였으나, 세포독성이 나타났다(표 15 및 도 16).
시료 처리농도 멜라닌형성 저해율( % ) 세포 생존율( % )
Control(α-MSH 처리) - 0 100.0
Melasolv 20 uM 74.7 111.4
EtOH 100 ㎍/mL N.D. 111.7
n-Hex 100 ㎍/mL 79.7 73.0
EtOAc 100 ㎍/mL 63.7 70.3
n-BuOH 100 ㎍/mL N.D. 100.4
H2O 100 ㎍/mL N.D. 99.3
(N.D.* : Not Detected)
실시예 9-3: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 멜라닌형성( melanogenesis ) 저해 활성 측정 및 세포독성 평가
상기 실시예 9-2에서 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 4가지 용매 분획물 중, 세포독성을 보였으나 멜라닌 색소 함량(melanin contents)은 감소한 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 시료를 추가적으로 농도를 낮추어 각각 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL의 농도별로 멜라닌형성(melanogenesis) 저해 활성 및 세포독성을 측정해 보았다. 이때, 멜라닌형성 저해 활성 및 세포독성 측정 방법은 상기 실시예 9-2와 같은 방법으로 수행하였다.
섬오가피나무 줄기 70% 에탄올(EtOH) 추출물의 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물의 농도에 따른 멜라닌형성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 100 ㎍/mL 이하의 농도에서 치명적인 세포독성 없이 농도 의존적으로 멜라닌 색소 함량(melanin contents)이 감소함을 확인하였다(표 16 및 도 17).
시료 처리농도 멜라닌형성 저해율( % ) 세포 생존율( % )
Control(α-MSH 처리) - 0 100.0
Melasolv 20 uM 70.7 110.4
n-Hex 25 ㎍/mL N.D. 121.2
50 ㎍/mL 29.8 102.3
100 ㎍/mL 83.4 78.5
EtOAc 25 ㎍/mL N.D. 115.4
50 ㎍/mL 22.7 95.4
100 ㎍/mL 68.8 71.2
(N.D.* : Not Detected)
실시예 9-4: 섬오가피나무 줄기 에탄올 추출물의 에틸아세테이트( EtOAc ) 분 획물 및 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물로부터 분리된 활성 화합물의 멜라닌형성(melanogenesis) 저해 활성 측정 및 세포독성 평가
상기 실시예 6에서 분리 동정한 8개의 화합물에 대한 멜라닌형성(melanogenesis) 저해 활성 측정 및 세포독성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 9-2와 동일한 방법으로 멜라닌 색소 함량(melanin contents) 및 세포 생존율을 확인하였다.
섬오가피나무 줄기 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 및 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물을 각각 100 μM의 농도로 B16F10 세포에 처리하고 멜라닌형성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물 6, 화합물 7 및 화합물 8에서 치명적인 세포독성 없이 멜라닌 색소 함량(melanin contents)이 각각 73.7%, 52.6% 및 42.7% 감소함을 확인하였다(표 17 및 도 18).
시료 처리농도(uM) 멜라닌형성 저해율( % ) 세포 생존율(%)
Control(α-MSH 처리) - 0 100.0
Melasolv 20 68.8 116.2
화합물 1(Cpd1) 100 6.7 102.2
화합물 2(Cpd2) 100 76.6 63.4
화합물 3(Cpd3) 100 19.3 105.4
화합물 4(Cpd4) 100 41.8 75.2
화합물 5(Cpd5) 100 13.5 103.4
화합물 6(Cpd6) 100 73.7 82.2
화합물 7(Cpd7) 100 52.6 90.4
화합물 8(Cpd8) 100 42.7 91.2
또한, 섬오가피나무 줄기 n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물 중, 치명적인 세포독성 없이 멜라닌 색소 함량이 감소한 화합물 6, 화합물 7 및 화합물 8을 각각 25 μM, 50 μM 및 100 μM의 농도별로 B16F10 세포에 처리하고, 상기 3개 화합물의 농도에 따른 멜라닌형성 저해 활성 및 세포독성을 확인한 결과, 100 μM 이하의 농도에서 치명적인 세포독성 없이 농도 의존적으로 멜라닌 색소 함량(melanin contents)이 감소함을 확인하였다(표 18 및 도 19).
시료 처리농도(uM) 멜라닌형성 저해율( % ) 세포 생존율(%)
Control(α-MSH 처리) - 0 100.0
Melasolv 20 67.9 110.3
화합물 6(Cpd6) 25 18.5 94.6
50 57.9 85.4
100 70.9 79.2
화합물 7(Cpd7) 25 N.D. 106.4
50 4.7 100.1
100 46.7 90.2
화합물 8(Cpd8) 25 N.D. 103.2
50 4.7 94.3
100 36.7 91.3
(N.D.* : Not Detected)
실시예 9-5: 섬오가피나무 줄기 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 , 상기 n - 헥산 ( n -Hex) 분획물로부터 분리된 화합물의 농도에 따른 세포내 티로시나아제(intracellular tyrosinase) 저해 활성 측정
상기 실시예 9-3 및 실시예 9-4에서 농도별로 멜라닌 생성 억제 실험을 진행한 섬오가피나무 줄기 n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물과, n-헥산(n-Hex) 분획물로부터 분리된 화합물 6, 화합물 7 및 화합물 8에 대하여 상기 실시예 9-2의 방법으로 세포내 티로시나아제 저해 활성을 측정하였다. 그 결과, 하기 표 19 및 도 20에 나타낸 바와 같이, n-헥산(n-Hex) 분획물 및 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물과, 화합물 6, 화합물 7 및 화합물 8에서 농도 의존적으로 세포내 티로시나아제 활성이 감소함을 확인하였다(표 19 및 도 20).
시료 처리농도 세포내 티로시나아제 활성 저해율( % )
Control(α-MSH 처리) - 0
n-Hex 25 ㎍/mL 1.8
50 ㎍/mL 26.7
100 ㎍/mL 65.5
EtOAc 25 ㎍/mL N.D.
50 ㎍/mL 27.9
100 ㎍/mL 58.8
화합물 6(Cpd6) 25 uM 10.4
50 uM 49.6
100 uM 64.7
화합물 7(Cpd7) 25 uM 3.7
50 uM 5.7
100 uM 37.8
화합물 8(Cpd8) 25 uM 3.7
50 uM 6.9
100 uM 28.4
(N.D.* : Not Detected)
제조예 1: 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 화장료의 제조
제조예 1-1: 유연 화장수의 제조
상기 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 유연 화장수는 하기 표 20과 같이 제조하였다.
원료 함량(중량부)
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 10.00
1,3-부틸렌글리콜 1.00
디소듐이디티에이 0.05
알란토인 0.10
디포타슘글리시리제이트 0.05
시트릭애씨드 0.01
소듐시트레이트 0.02
글리세레스-26 1.00
알부틴 2.00
하이드로제네이티드캐스터오일 1.00
에탄올 30.00
보존제 미량
착색제 미량
착향제 미량
정제수 잔량
제조예 1-2: 영양 크림의 제조
상기 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 유연 영양 크림은 하기 표 21의 조성과 같이 제조하였다.
원료 함량(중량부)
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 10.0
1,3-부틸렌글리콜 7.0
글리세린 1.0
D-판테놀 0.1
식물 추출물 3.2
마그네슘알루미늄실리케이트 0.3
PEG-40 스테아레이트 1.2
스테아릭애씨드 2.0
폴리소르베이트 60 1.5
친유형글리세릴스테아레이트 2.0
소르비탄세스퀴올리에이트 1.5
세테아릴알코올 3.0
미네랄오일 4.0
스쿠알란 3.8
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 2.8
식물성 오일 1.8
디메치콘 0.4
디포타슘글리시리제이트 미량
알란토일 미량
소듐 히아루로네이트 미량
토코페릴아세테이트 적량
트리에탄올아민 적량
보존제 적량
착향제 적량
정제수 잔량
제조예 2: 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 식품의 제조
제조예 2-1: 밀가루 식품의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
제조예 2-2: 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
제조예 2-3: 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
제조예 2-4: 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제조예 2-5: 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다:
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부), 종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부), 본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물(3 중량부), 영지(0.5 중량부), 지황(0.5 중량부).
제조예 2-6: 건강음료의 제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
제조예 2-7: 야채 주스의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
제조예 2-8: 과일 주스의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.
제조예 3: 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 약학 조성물의 제조
제조예 3-1: 산제의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 2 g에 유당 1 g을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제조예 3-2: 정제의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제조예 3-3: 캡슐제의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 100 ㎎, 옥수수전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제조예 3-4: 환의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 1 g, 유당 1.5 g, 글리세린 1 g 및 자일리톨 0.5 g을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
제조예 3-5: 과립의 제조
본 발명의 섬오가피나무 줄기 추출물의 헥산 분획물 150 ㎎, 대두추출물 50 ㎎, 포도당 200 ㎎ 및 전분 600 ㎎을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

Claims (10)

  1. 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum Nakai) 줄기 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 클로올릭산(coriolic acid), 16알파-하이드록시-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산(16α-hydroxy-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid), 16알파-하이드로-17-아이소발러로일옥시-엔트-코란-19-오익산(16α-hydro-17-isovaleroyloxy-ent-kauran-19-oic acid) 및 코레노익산(kaurenoic acid) 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 항균용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 섬오가피나무 줄기 추출물은 물, C1-C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것인 항염증 또는 항균용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올인 것인 항염증 또는 항균용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항염증 효과는 일산화질소(nitric oxide, NO) 생성 저해 및 염증성 사이토카인 생성 억제 활성에 의해 달성되는 것인 항염증 또는 항균용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항균 효과는 피부 미생물인 스타필로코쿠스 에피더미디스(S. epidermidis), 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes), 스테피로코커스 오우러스(S. aureus) 및 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 미생물에 대한 생장 억제 활성에 의해 달성되는 것인 항염증 또는 항균용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 것인 화장료 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 식품 조성물.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항염증 또는 항균용 조성물을 포함하는 약학 조성물.
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