KR101795920B1

KR101795920B1 - 폐암 환자의 생존 예측용 ｓｌｃ５ａ１０ 다형성 마커 및 이를 이용한 폐암 생존 예후의 예측 방법

Info

Publication number: KR101795920B1
Application number: KR1020160042121A
Authority: KR
Inventors: 박재용; 홍미정; 이신엽; 최진은; 유승수; 정득규
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2017-11-10
Anticipated expiration: 2036-04-06
Also published as: KR20170114702A

Abstract

본 발명은 SLC5A10 유전자의 인트론 내 단일염기다형성 (singlenucleotide polymorphism; SNP)을 이용한 폐암 예후 마커, 이를 이용한 폐암 생존 예후 예측용 조성물, 폐암 생존 예후 예측용 키트, 마이크로 어레이 및 폐암 생존 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폐암 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

Description

폐암 환자의 생존 예측용 ＳＬＣ５Ａ１０ 다형성 마커 및 이를 이용한 폐암 생존 예후의 예측 방법{SLC5A10 gene polymorphisms marker for predicting survival in patients with lung cancer and method for predicting survival using the same}

본 발명은 SLC5A10 유전자의 인트론에 위치한 단일염기다형성 (singlenucleotide polymorphism; SNP)을 이용한 폐암 예후 마커, 이를 이용한 폐암 생존 예후 예측용 조성물, 폐암 생존 예후 예측용 키트, 마이크로 어레이 및 폐암 생존 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 전 세계적으로 암으로 인한 사망 원인의 30%를 차지할 정도로 암으로 인한 사망의 주요 원인 중의 하나이다. 전체 폐암의 75% 이상이 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC)이며, 평균 5년 생존율이 15%에 해당한다. 폐암의 높은 사망률은 일부 절제 불가능한 종양을 가진 환자의 높은 비율과 관련되어 있으며, 또한 절제 가능한 병기의 비소세포폐암 환자 중에서도 외과적으로 절제한 환자의 상당수가 암의 재발로 사망하고 있다. 현재 폐암의 경우 병리학적 병기로 진단하고 있지만, 같은 병기에서도 재발과 생존의 상당한 차이를 보이고 있기 때문에, 폐암의 진단과 치료의 방법이 발달했음에도 불구하고 여전히 생존율이 좋지 않다. 이러한 결과는 조기 진단방법과 알맞은 선별검사의 부족으로 인한 낮은 치료율에 기인하며, 따라서 폐암 사망률을 낮추기 위하여 효과적인 조기 진단 및 맞춤진단방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 유전적 변이나 후성학적 변화의 축적으로 인해 발생되는 암은 발달 과정동안 획득하게 되는 능력들은 다음과 같이 6가지로 제시될 수 있다(Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144:646-74.). 1. 성장 신호의 자급자족 (Self-sufficiency in growth signals), 2. 성장 억제 신호에 둔감 (Insensitivity to anti-growth signals), 3. 세포사 회피 (Evading Apoptosis), 4. 무한 증식력 (Limitless Replicative Potential), 5. 지속적인 혈관생성 (Sustained Angiogenesis), 6. 침윤과 전이 (Tissue Invasion and Metastasis)이가 그것이다. 이러한 특징을 가지는 암에 중요한 역할을 할 수 후보유전자로서 현재 다형성 연구가 집중되고 있다.

단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, 이하, "SNP" 라 함)은 인간 유전자 변이의 가장 일반적인 형태로, 유전체(genome) 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 말한다. 이러한 SNP의 2/3는 염기서열 중 C와 T 간의 변이인 것으로 알려져 있고, SNP 변이는 보통 유전체상의 염기서열에서 1000개당 한번 꼴로 나타난다고 알려져 있다. 또한, SNP 는 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있고, 비슷한 형질이나 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 또는 비슷한 SNP 패턴을 보이기 때문에, 임상에서 개체의 질병에 대한 감수성(susceptibility)을 예측하는 지표로 사용될 수 있고, 약물에 대한 효과 및 부작용을 예측할 수 있는 지표로도 사용될 수 있다. 나아가 SNP 는 개체의 유전적 특성에 적합한 진단 및 치료 전략을 구사하는 맞춤의학 (personalized medicine)에 이용될 수 있고, SNP의 패턴과 질병기록을 잘 통합할 수 있다면 여러 가지 질병의 치료를 위한 의료 통계를 구축할 수 있을 것이다.

최근 들어, 유전자의 다형성을 이용한 질병들에 대한 감수성을 예측하고 진단하는 방법들이 개발되고 있으며, 특히 암과 관련된 유전자의 다형성과 암과의 연관성에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다.

또한, 최근에는 인간 지놈 상에 있는 모든 기능적 구성 인자들을 규명함을 목적으로 하는 ENCODE(Encyclopedia of DNA elements) 프로젝트가 수행되고 있으며, 이는 전사인자(transcription factor)나 크로마틴 구조(chromatin structure) 및 히스톤 변이(histone modification)와 관련된 부위를 Hiseq 기술을 이용해 전체적으로 지도화하는 것이며 인간 지놈의 80%는 최소한 하나의 생화학적인 기능과 연관되어 있다는 내용을 발표하였다.

이러한 ENCODE 프로젝트를 통해 해당 연구자들은 유전자의 발현이 더욱 복잡하고 정교하게 구성되어 있다는 것을 알 수 있었고, 코딩 지역으로부터 먼 거리에 위치하는 지역도 유전자의 발현이 영향을 줄 수 있음을 예측할 수 있었으며, 전사 인자와 관련된 활성인자(activator) 또는 사일런스(scilencer) 부위도 중요한 레귤옴(regulome)으로 작용하며 이들 부위에 존재하는 다형성이 유전자 기능을 조절하는 기능에도 영향을 줄 수 있을 것으로 생각된다.

한편, 인간 게놈은 약 30억쌍의 염기로 이루어져 있는데, 이 중 98%는 프로테인을 직접 만들지 않는 비코딩(non coding) DNA로 밝혀졌다. 비코딩(non coding) DNA는 생리학적 활성이 없는 것으로 여겨져 오랫동안 Junk DNA로 취급되기도 했으나, 최근 GWAS 결과 junk라고 생각되던 유전자와 유전자 사이 및 인트론 지역과 같은 비코딩(non coding) 지역도 다양한 질병과 관련되어 있다고 보고되고 있다.

이에 본 발명자들은 질병과 연관된 감수성 유전적 변이를 폐암 환자들에 대한 예후 인자로 이용할 경우, 예후의 평가, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화할 수 있어 폐암 환자의 맞춤 치료가 가능할 것으로 기대되고 있는 바, 비코딩 DNA 지역에 존재하고 있는 폐암 관련 유전자 다형성을 연구하던 중, SLC5A10 유전자의 인트론 부위에 존재하는 특정 염기의 다형성이 폐암 환자, 특히 외과적 수술로 폐암을 절제한 환자의 생존 예후를 예측할 수 있는 마커로 이용될 수 있음을 최초로 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제10-2011-0009609호

따라서 본 발명의 목적은 폐암 환자의 생존 예후를 효과적으로 예측(진단)할 수 있는 다형성 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 폐암 환자의 생존 예후를 효과적으로 예측(진단)할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 다형성 마커를 이용하여 폐암 환자의 생존 예후를 효과적으로 예측(진단)하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)가 C 또는 T이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암일 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 검체로부터 추출한 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SNP의 유전자형이 TT 또는 CT인 경우 생존 예후가 낮은 군으로 판정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SNP의 유전자형이 CC인 경우, TT 또는 CT인 경우에 비해 생존 예후가 좋은 군으로 판정할 수 있다.

본 발명에 따른 폐암 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

도 1은 잠재적인 기능성 SNP들을 선택할 수 있는 알고리즘을 나타낸 것이다.
도 2는 카프란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 분석한 SLC5A10 rs2257609C>T 유전자형에 따른 전체 생존 및 무병 생존의 곡선을 나타낸 것이다. 다변량 콕스 위험 모델에서의 상호우성 모델의 P-값. 여기서 A는 Discovery cohort를 나타낸 것이고, B는 Replication cohort를, C는 Pooled analysis를 나타낸 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 SLC5A10 (Solute carrier family 5 (sodium/sugar cotransporter), member 10) 유전자의 인트론(intron) 내 다형성 부위를 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)용 마커에 관한 것이다.

보다 구체적인 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)가C 또는 T이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 상기 SLC5A10 유전자의 인트론 내 다형성 부위는 SLC5A10 유전자(진뱅크 번호: NT_010718.17)의 전사시작부위를 기준으로 11192번째에 존재하는 염기 또는 SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째에 존재하는 염기에 해당하며, 상기 다형성 부위를 포함하고 있는 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다. 즉, 본 발명에 따른 서열번호 1은 SLC5A10 유전자(Genebank accession No.NT_010718.17) 서열 중에서 18472381~18473381번째 서열을 나타낸 것이다. 한편, 본 발명에서는 상기 다형성 부위를 “SLC5A10 rs2257609C>T”로 표시한다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 10 내지 50개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequenc)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다.

본 발명의 상기 SLC5A10는 sodium/glucose transporter family중의 하나로 역할을 하고 있다고 알려져 있다. 그러나 아직까지 SLC5A10유전자의 다형성과 폐암 발병 위험성 및 폐암 환자의 생존 예후 예측(진단)에 관한 연구는 보고된 바 없다.

본 발명자들은 인코딩 DNA와 비코딩 DNA에 대한 새로운 접근방식으로 개발된 Regulome DB를 이용하였는데, Regulome DB는 비코딩(non-coding) 지역에 있는 변이가 유전자의 발현을 조절하는 다양한 근거에 초점을 맞춰 점수화하여 6가지의 카테고리로 분류되어 있으며, 스코어가 낮을수록 타겟 유전자의 발현에 영향을 미치는 기능적 확증(functional evidence)을 많이 가지고 있다. 구체적으로 카테고리 1은 eQTL이 알려져 있어 타겟 유전자도 예측이 가능하다. 이는 다시 1a 부터 1f로 구분되어져 있는데, 그 중에서 1a는 전사인자 결합(transcription factor binding)과 그 TF의 motif 및 매치되는 Dnase footprint 결과까지 가지고 있어 가장 확실하다고 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 Regulome DB를 통해 카테고리 1에 해당하는 SNP를 분석하여 폐암의 예후에 영향을 줄 수 있는 SNP들을 스크리닝하고 초기 비소세포폐암 수술 후 예후와의 연관성을 조사하던 중, 상기 SLC5A10 유전자의 인트론 내 다형성 부위가 폐암 환자의 생존 예후 예측에 유용함을 확인하였다.

본 발명자들은 초기 비소세포폐암의 암조직과 정상조직을 수득한 후, 이들 조직내에서 SLC5A10 rs2257609C>T 다형성을 조사하여, 유전형과 전체 생존 (overall survival, OS) 및 무병 생존 (disease-free survival, DFS)과의 관계를 분석하였다. 상기 전체 생존(OS)이란 수술한 날부터 어떤 원인으로 죽는 날까지 또는 마지막으로 추적 조사한 날까지를 말하며, 상기 무병생존(DFS)이란 수술한 날부터 어떤 원인으로 재발 또는 사망하는 날까지를 말한다.

분석 결과, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 유전자형이 적어도 하나의 T 대립유전자를 가진 CT 또는 TT일 경우 CC에 비하여 전체 생존 및 무병생존이 낮은 것으로 나타났다. 즉, SLC5A10 rs2257609C>T 다형성의 경우, CC유전자형을 갖는 환자군의 전체생존 및 무병생존의 위험비가 CT유전자형을 가지는 환자군에 비해 낮은 것으로 나타났으며 통계적으로 유의한 것으로 나타났다. 따라서 비소세포암 환자에서 LC5A10 rs2257609C>T의 다형성이 폐암 생존 예후와 관련성이 있음을 알 수 있었다.

구체적으로, rs2257609C>T 다형성이 CC유전자형일 경우, 폐암의 수술 후 예후가 좋아 생존율이 높다는 것을 알 수 있고, CT 또는 TT 유전자형일 경우에는 폐암의 수술 후 예후가 낮아 생존율이 낮다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서 용어, “예후”는 폐암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 발병, 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 폐암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 폐암의 발병 위험성 및 폐암 발병 후의 생존 예후를 의미하며, 바람직하게는 폐암을 수술로 절제한 환자, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자의 예후를 의미한다.

폐암의 이상적인 치료법은 조기 발견하여 수술로 완전히 암을 제거하는 것이지만, 폐암의 진단 시 환자의 반수 이상이 수술을 할 수 없을 정도로 진행된 상태이므로 조기치료는 현실적으로 어렵다. 본 발명의 상기 방법을 이용하면 폐암 발병 위험성을 손쉽게 예측할 수 있으며, 폐암 발병 위험성을 관리함으로써 폐암을 조기 발견하여 수술로 암을 완전히 제거하여 완치시킬 수 있다. 또한, 폐암 발병 후의 경우, 특히 비소세포암은 외과적 수술을 할 수 있을 만큼 진행되지 않은 경우라면 우선 수술을 시행하는데, 근치절제술을 시행할 수 있는 경우는 30%에 불과하다. 수술 후 완치 여부를 판정하는 5년 생존율은 암의 진행 정도에 따라 다르나, 근치절제술을 시행한 전체 환자를 대상으로 보면 편평상피암 37%, 선암 27%, 대세포암 27% 정도가 완치되었다. 따라서 본 발명의 상기 다형성 마커를 이용하면 폐암의 이러한 예후를 손쉽게 판단할 수 있으며, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 손쉽게 결정할 수 있다. 이로써 폐암 발병 후의 생존율을 현저히 높일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 폐암 발병할 가능성이 있는지를 판별하고, 화학요법 또는 방사선 치료 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 폐암 발병 위험성이 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 폐암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다.

본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에서 용어, "폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커"란 폐암 발병 위험성, 발병한 폐암의 완치 여부, 혹은 경과를 예측할 수 있는 다형성을 가진 마커를 의미하며, 바람직하게는 상기에서 서술한 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 상기 환자는 폐암 발병 위험성을 판별하기 위한 환자 또는 폐암, 특히 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미한다. 상기 폐암을 수술로 절제한 환자는 바람직하게는 비소세포암, 편평상피암, 선암, 대세포암 등의 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미하며, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자를 의미한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물에 포함되는, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열을 가진다. 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 10 내지 60개, 보다 더 바람직하게는 20 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적 (allele-specific) 이다.

대립형질 특이적 (allele-specific) 이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 폐암 생존 예후의 예측용 마커인, SLC5A10 유전자의 인트론 내 SLC5A10 rs2257609C>T 다형성 부위(SNP)를 확인함으로써 폐암 생존 예후를 예측하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 폐암 생존 예후의 예측용 키트에는 SLC5A10 rs2257609C>T의 SNP를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 폐암 생존 예후 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.

마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 검체로부터 추출한 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번1216번째 염기)의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

자세하게는, a) 검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; b) 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하거나 프로브(probe)와 혼성화하는 단계; 및 c) 상기 (b) 상기 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 폐암 환자의 핵산으로부터 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP의 rs2257609C>T 다형성의 유전자형이 CT 또는 TT인 경우 생존 예후가 나쁘다고 예측될 수 있으며, 반면 CC인 경우 생존 예후가 좋다고 예측될 수 있다.

바람직하게, 상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암일 수 있고, 보다 바람직하게는 비소세포성폐암일 수 있다.

또한, 상기에서 환자는 폐암, 즉 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비세포암이 발병한 환자를 의미한다. 바람직하게, 상기 환자는 폐암, 즉 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비세포암을 수술로 절제한 환자를 포함한다.

폐암 환자의 핵산은 이들 폐암 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는뇨 등의 시료로부터 수득할 수 있으며, 그 핵산 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다. 상기 폐암 환자의 핵산은 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리방법과 같은 통상의 방법과 분리방법에 의하여 수행될 수 있으며, 또한 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다.

본 발명의 SNP 의 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan- PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

나아가, 상기 SNP 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

연구 대상의 선정

본 실험에서는 암과 관련된 유전자의 다형성과 비소세포성폐암 수술 후 예후와의 관계를 다기관 임상코호트를 통해 평가하였다. 경북대학교병원에서 1998년부터 2007년에 초기 비소세포암으로 진단받아 수술을 받은 376명으로부터 샘플(조직)을 채취하여 사용하였다. 여기서 발굴된 다형성은 다시 서울대학교병원에 2005년에서 2010년 동안 등록된 환자군의 샘플을 이용하여 밸리데이션하였다.

< 실시예 2>

비소세포성폐암과 관련된 SNP 발굴

폐암 특이적 다형성 선정을 위해 먼저 Regulome DB를 이용하여 카테고리 1에 해당하는 SNP을 모두 얻었다. 전체 SNP은 약 4만여개 였고, 1f가 삼만사천여개로 가장 많았다. 이 중에서 eQTL 및 TF motif 등의 data를 토대로 가장 functional할 것으로 예상되는 1a에 해당하는 SNP 352개를 선정하였다. 이후 ncbi 및 hapmap 데이터베이스를 이용해 아시아인에서 낮은 빈도를 가진 97개의 SNP과 LD관계가 있는 11개의 SNP을 제외하여 총 244개의 다형성을 선정하였다. 이들 SNP은 시쿼놈 매스어래이와 RFLP 방법으로 지노타이핑하였다. 시쿼놈 매스어레이 방법은 iplex reaction을 통해 SNP의 종류에 따라 특정 질량을 가지게 되는 두 앰플리콘(amplicon)을 질량분석기를 이용해 질량을 측정하고 해당 유전자형을 파악하는 방법이다. 이 방법은 한 번의 반응으로 30여개의 SNP을 약 400개까지 지노타이핑이 가능한 high throughput 방식으로 다량의 유전자형 분석에 매우 유용한 방법이다. 상기와 같인 방법으로 잠재적 기능성을 갖는 SNP들의 선정 알고리즘은 도 1에 나타내었다.

모든 통계분석은 SAS 9.2 프로그램을 이용하였고 hazard ratio와 95% confidence interval은 나이, 성별, 흡연상태 등으로 adjust 했다.

< 실시예 3>

디스코버리 코호트에서 SNP 의 생존율 분석 결과

상기 본 발명의 실시예에서 사용된 실험에 사용된 환자군의 특성은 Pathologic stage는 예외없이 survival과 상당한 관계가 있었고 연령별로 보았을 때 두 집단 모두 젊은 사람들의 overall survival이 좋은 것으로 나타났다.

디스커버리 코호트에서 SNP의 생존율을 분석한 결과, 전체 244개의 SNP중 19개의 SNP이 p value 0.05이하로 이들의 지노타입과 생존율에 따른 관계가 있는 것으로 나타났다. Regulome DB를 이용하여 폐암의 예후를 분석하는 것은 새로운 접근방법으로 일차적으로 발굴된 지노타입과 예후의 관계가 우연한 결과는 아닌지 확인하기 위해 이들 19개의 SNP은 독립적인 428명의 환자군에서 재현 확인하였다. 그 중 rs2257609만이 디스커버리 세트와 같은 방향으로 도미넌트와 코도미넌트 모델에서 예후와 유의한 관계가 있는 것으로 나타났다(하기 표 1 참조).

< 실시예 4>

rs2257609 SNP 과 생존율 분석 결과

본 발명자들은 실시예 3에서 확인된 rs2257609 SNP과 환자 생존율을 분석하기 위해, 발굴한 rs2257609의 다형성과 폐암 위험도와 연관성을 폐암 수술 후 환자들을 대상으로 로지스틱회귀분석을 통해 예후와의 연관성을 조사하였다. 유전자형 및 병기 전체에 걸쳐 카테고리별 변수에 대한 χ2 테스트를 사용하여 인구통계학 및 임상학적 정보를 비교하였다. 적합도 검정(goodness-of-fit) χ2 테스트를 사용하여 1 자유도(one degree of freedom)로 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 테스트하였다. 전체생존(Overall Survival, OS)을 수술한 날부터 어떤 원인으로 죽는 날까지 또는 마지막 추적 조사 날까지로 추정하였다. 무병생존(Disease-free Survival, DFS)을 수술한 날부터 어떤 원인으로 재발 또는 사망하는 날까지로 계산하였다. 생존 분석은 카프란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 계산하였다. 전체 다른 유전자형에서 전체생존 또는 무병생존의 차이를 로그-순위 검정법(log-rank test)을 사용하여 비교하였다. 위험비(Hazard ratio, HR) 및 95% 신뢰구간(confidence intervals, CIs)을 다변량 콕스의 비례위험모형(multivariate Cox proportional hazards models)을 사용하여 계산하였고, 이를 연령(≤64세 대 >64세), 성별(남자 대 여자), 흡연 상태(비흡연자 대 흡연경험자), 및 병리학적 병기(제I기 대 제II IIIA기)로 보정하였다. 모든 분석은 윈도우 프로그램을 위한 통계 분석 시스템 9.2 버전(Statistical Analysis System for Windows, version 9.2)[SAS Institute, 미국])을 사용하여 수행하였다.

분석 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 먼저 디스커버리 set에서 rs2257609의 유전자형이 CT 타입이나 TT의 유전자형을 가진 사람은 CC 타입을 가진 사람보다 위험율이 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과에 대해 dominant 모델로 분석해 봤을 때 위험율이 1. 76배로 유의하게 높은 것으로 나타났고 이는 독립적인 환자군에서도 두 배 높게 나타나 재현되는 것을 확인하였다.

이 두 세트를 합하여 분석해 본 결과에서도 CT 타입의 유전자 형 또는 TT타입의 유전자형을 가진 환자군에서 CC 유전자형을 가진 환자군에 비해 예후가 좋지 않은 것을 알 수 있었다.

이는 Kaplan-meir method를 이용한 생존곡선을 통해서도 확인할 수 있다. 도미넌트 모델로 분석해봤을 때 모든 세트에서 CT 혹은 TT 유전자형을 가진 환자군보다 CC 유전자형을 가지면 폐암의 수술 후 예후가 좋은 것으로 나타났다(도 2 참조).

< 실시예 5>

rs2257609 다형성을 이용한 폐암 예후 위험지수 설정

본 발명자들은 상기와 같은 실험결과들을 토대로, SLC5A10 rs2257609C>T 다형성을 이용하여 폐암 예후 위험도 지수를 설정하였다.

SLC5A10 rs2257609C>T 다형성은 공동우성 모델을 이용하여 좋은 예후에 관계하는 rs2257609 CC형은 1점의 위험지수를 주었으며, rs2257609 CT형은 2점의 위험지수를 설정했고, 폐암환자의 낮은 생존율과 유의한 연관이 있는 rs2257609 TT형은 3점의 위험지수를 설정하였다.

SLC5A10 rs2257609C>T 다형성의 유전자형(genotype)에 따른 위험도 지수

유전자	다형성	위험도 지수
유전자	다형성	1점	2점	3점
SLC5A10	rs2257609	CC	CT	TT

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Kyungpook National University <120> SLC5A10 gene polymorphisms marker for predicting survival in patients with lung cancer and method for predicting survival using the same <130> pn1601-026 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> SLC5A10 rs2257609 SNP sequence <400> 1 gaccaccccc agacacatcc tgcctcttcc cacctctctc tttgtcattt gctcccatcc 60 cccatcagta tccctgtctc catcagagcc caactcaaat gccaccccca gcaagccccg 120 ctgtgtcctc ttctgagttt catgcctgtc ccatgcatcc atctatttct caccacagtg 180 cgagcccctg gcagaccagg gccaggtctt gtttatttct gtatccctgg tttccaggga 240 ggtggctggc atgggggtgg ctggcatggg ggtggggtgg agatcaagaa atgtgggaga 300 ggaaggaaga gtatgagtgg aaagctctaa actcagcctt aagggcaggc caaggccaag 360 tccctccgga ctctaaaggg ctcccagaga aagcaaacct cctacagtac gccaagggca 420 tctggcgaag actgcggtac ggggtttgct gctggccact cctgagacct gcccacacga 480 aggatgagac actctgggaa tcccctcaga gtcacctagc aacaccagtg cagatagagg 540 ccaggctgag gctgccgagg ggatgcccca ggagaggaga gggcgggtca gatgctgcat 600 gagaccccca ccggggcccc gtgggggctc tggatggacc ctttagggcc ctcttcccag 660 gtagccctgc ccacagctcc tggctgacca gcgaggcctc tacctctccg gcctctgcac 720 ctccattccc ttcactaaat cgacgcctct tctgggcttt cctagtccca ggactgaatg 780 aagagggccc aggaggccat ttgcctctga gggaaagctg ggcctcacag agcacttccc 840 gcagacacag cagccctcac acggtggtcc tgcccattgc taccaccaac tcacaggagc 900 cctaggagac aaggtctgcc gcccctcctt acaagggagg agccccaggc acagggaggc 960 tcggaggtcg caggggctag tgtcagctct ctcagccaga a 1001

Claims

서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)가 C 또는 T이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커 조성물.
삭제
서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP를 포함하는 10~100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머인 것을 특징으로 하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 조성물.
삭제
제3항 또는 제4항에 따른 조성물을 포함하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 키트.
제3항 또는 제4항에 따른 조성물을 포함하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측용 마이크로어레이.
검체로부터 추출한 핵산으로부터, 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기(SLC5A10 유전자의 인트론 5번 1216번째 염기)의 SNP를 확인하는 단계를 포함하는, 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 SNP의 유전자형이 TT 또는 CT인 경우 생존 예후가 낮은 군으로 판정하는 것을 특징으로 하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 SNP의 유전자형이 CC인 경우, TT 또는 CT인 경우에 비해 생존 예후가 좋은 군으로 판정하는 것을 특징으로 하는 비소세포폐암 환자의 생존 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
삭제