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KR101790354B1 - 인플루엔자 바이러스 ｈ3ｎ2를 중화시킬 수 있는 인간 결합 분자 및 그것의 용도 - Google Patents

인플루엔자 바이러스 ｈ3ｎ2를 중화시킬 수 있는 인간 결합 분자 및 그것의 용도 Download PDF

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KR101790354B1
KR101790354B1 KR1020117028080A KR20117028080A KR101790354B1 KR 101790354 B1 KR101790354 B1 KR 101790354B1 KR 1020117028080 A KR1020117028080 A KR 1020117028080A KR 20117028080 A KR20117028080 A KR 20117028080A KR 101790354 B1 KR101790354 B1 KR 101790354B1
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마크 스로스비
로버트 헤인츠 에드워드 프리센
테오도르 헨드리쿠스 야코보 곽
만디 안토니아 카타리나 욘게네이일렌
Original Assignee
얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이.
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Abstract

본 발명은 H3N2와 같은 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 결합하고, 이와 같은 인플루엔자 바이러스에 대한 광범위한 중화 활성을 갖는, 인간 모노클로날 항체와 같은, 결합분자에 관한 것이다. 본 발명은 항체를 암호화하는 핵산 분자, 그들의 서열 및 항체를 포함하는 조성물 및 항체를 동정하고 또는 생산하는 방법을 제공한다. 항체는 인플루엔자 바이러스 H3N2 감염의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 교차-서브타입 보호를 제공하고 H3, H7 및/또는 H10-기재 인플루엔자 서브타입에 의한 감염이 예방 및/또는 치료될 수 있다.

Description

인플루엔자 바이러스 Ｈ3Ｎ2를 중화시킬 수 있는 인간 결합 분자 및 그것의 용도{HUMAN BINDING MOLECULES CAPABLE OF NEUTRALIZING INFLUENZA VIRUS H3N2 AND USES THEREOF}
본 발명은 의약에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 인플루엔자 바이러스 H3N2와 같은, H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 결합분자를 중화시키는 것을 포함하여, 여러가지 인플루엔자 A 서브타입을 중화시킬 수 있는 인간 결합분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 H3 서브타입의 HA를 포함한 인플루엔자 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스 H3N2에 의한 감염의 진단, 예방 및/또는 치료에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 RNA 오르토믹소바이러스(orthomyxoviruses)이고 세가지 유형, A, B 및 C로 이루어진다. B형과 C형의 인플루엔자 바이러스가 주로 인간 병원균인 반면, 인플루엔자 A 바이러스는 인간, 말, 해양 포유류, 돼지, 흰족제비 및 닭을 포함하여, 야생의 다양한 조류 및 포유류를 감염시킨다. 동물에서 대부분의 인플루엔자 A 바이러스는 호흡기 및 내장기관의 경미한 국소적 감염을 야기한다. 그러나, 가금류에서 치사율이 100%에 도달할 수 있는 전신성 감염을 야기하는 H5N1과 같은 고병원성 인플루엔자 A 서브타입이 또한 존재한다.
인플루엔자 A 바이러스는 표면 글리코단백질을 암호화하는 2개의 유전자, 즉 바이러스 부착 및 세포 방출에 요구되는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)의 항원 영역에서의 대립 변형을 기준으로 서브 유형으로 분류될 수 있다. 기타의 주요 바이러스 단백질은 뉴클레오단백질, 뉴클레오캡시드 구조 단백질, 막단백질(M1 및 M2), 폴리머라제 (PA, PB 및 PB2) 및 비-구조 단백질(NS1 및 NS2)을 포함한다. 현재, 인플루엔자 A 바이어스에서 HA의 16가지 서브타입 (H1-H16) 및 9가지의 NA (N1-N9) 항원 변이체가 알려져 있다. 인플루엔자 바이러스 서브타입은 추가로 그들의 계통적 그룹을 참조하여 분류될 수 있다. 계통적 분석(Fouchier et al., 2005)은 HA의 세분화가 두 개의 주요 그룹으로 나누어진다는 것을 설명한다(Air, 1981): 특히, 계통적 그룹 1의 H1, H2, H5 및 H9 서브타입 및 계통적 그룹 2의 H3, H4 및 H7 (도 1).
인간에게는 오직 몇몇의 인플루엔자 A 서브타입(즉, H1N1, H1N2 및 H3N2)만이 유포되지만, 16가지 HA 및 9가지 NA 서브타입의 모든 조합물이 조류에서 동정되어 왔다. 인플루엔자 A에 감염된 동물들은 종종 인플루엔자 바이러스의 저장소로서 작용하고 고병원성 인플루엔자 A 균주 H5N1과 같은 특정 서브타입은 인간에 대한 종 장벽을 넘는 것을 나타내고 있다.
인플루엔자 감염은 인간에게 3백만 내지 5백만개 경우의 심각한 질병을 야기하고 전세계적으로 매년 250,000 내지 500,000명의 사망자를 발생시키는 것으로 알려진 가장 일반적인 질병 중 하나이다. 인플루엔자는 인구의 5-15%를 감염시키는 계절적 유행병으로 신속히 확산되고 의료서비스 비용에 대한 부담 및 생산성 저하가 광범위하다(World Healthcare Organization (WHO)). 입원 및 사망은 고-위험군(노령자, 만성질환자)에서 주로 발생한다.
인플루엔자의 연간 유행은 바이러스 표면 단백질 HA 및 NA의 항원 특성이 변형될 때 일어난다. 변형된 항원성의 메카니즘은 이중적이다: 숙주 세포의 이중 감염 후 인간과 동물 바이러스 간의 유전적 재배열에 기인한, 항원 대변이(antigenic shift); 및 바이러스 표면의 HA 및 NA 단백질에서 작은 변화에 의해 야기되고, 인플루엔자 유행을 일으킬 수 있는 항원 소변이(antigenic drift). 이들 두 메카니즘에 의한 변이체 바이러스 균주의 출현이 인플루엔자 전염의 원인이다. 지난 세기 동안 3회, 인플루엔자 A 바이러스는 주로 그들의 HA-성분에서 주요 유전적 변화를 겪어왔고, 그 결과 전세계적 유행병을 가져왔고 질병자 및 사망자 수 모두가 크게 증가하였다. 가장 유명한 대유행은 인플루엔자 바이러스 H1N1에 의해 감염된, "스페인 독감"으로, 이것은 세계 인구의 대부분을 감염시켰고 그리고 1918년과 1919년 사이에 적어도 4천만이 사망한 것으로 여겨진다. 가장 최근에는, 2개의 다른 인플루엔자 A 대유행이 1957년 (인플루엔자 바이러스 H2N2에 의한, "아시아 인플루엔자") 및 1968년 (인플루엔자 H3N2에 의한 "홍콩 인플루엔자")에 발생하였고 전세계적으로 심각한 사망률 및 치사율을 가져왔다. 현재 계절 인플루엔자 유행병과 반대로, 이러한 대유행은 건강한 청년층에서도 심각한 결과와 관련되었다.
매년 인플루엔자 유행을 다루기 위한 현재의 접근법은, 바람직하기는 이형 교차-보호를 생성하는 매년의 예방접종을 포함한다. 그러나, 위에 나타낸 바와 같이, 인간에서 인플루엔자 바이러스의 순환은 인플루엔자 백신 균주들과 순환 인플루엔자 균주들 간에 가장 밀접한 매치 가능성을 보장하도록 인플루엔자 백신 제제를 매년 적응시킬 것을 요구하는 영구적 항원 변화를 겪는다.
비록 플루 백신을 매년 접종하는 것이 플루를 예방하는 가장 좋은 방법이지만, 오셀타미비르(Tamiflu®)와 같은 항바이러스 약제가 플루의 예방 및 치료에 효과적일 수 있다. 그러나, 오셀타미비르와 같은 것에 내성을 나타내는 인플루엔자 바이러스 균주의 수가 증가하고 있다.
선택적인 접근법은 다양한 계절적 인플루엔자 바이러스를 중화시키기 위한 항체-기재의 예방 및 치료수단의 개발이다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 보호하는 항체를 중화시키는 일차적 표적은 수용체 결합 부위를 함유하는 바이러스성 HA 단백질의 구형 헤드 (HA1 부분)이지만, 이것은 항체-결합 부위 (항원 소변이)에서 아미노산 치환에 의한 연속적인 유전자 진화를 겪는다. 계통적 그룹 1 (예를 들면, H1 및 H5)의 인플루엔자 A 바이러스의 HA의 보다 보존적인 줄기-영역을 인식하는 교차-중화 항체가 최근 동정되었다 (예를 들면, WO2008/028946). 그러나, H3 바이러스와 같은 계통적 그룹 2의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입을 중화시키는 항체를 동정하는 것은 성공이 제한되어왔고, 그들의 중화의 폭은 좁고 그들의 효능은 낮다.
H3N2 인플루엔자 바이러스 균주를 특이적으로 인식하는 항체들이 설명되어왔다. 그러므로, 1968년과 1980년 사이의 해로부터 여러 H3N2 인플루엔자 바이러스 균주에 결합할 수 있고 중화시키는 인간 모노클로날 항체, C28이 Ostberg 및 Pursch (1983)에 의해 설명되었다. Wang 등(2010)은 수 십년에 걸쳐 이어진 H3 바이러스를 중화시키는 항-HA2 뮤린 항체를 기재하고 있지만, 비(non)-H3 서브타입 바이러스는 중화시키지 않는다고 기재하였다.
H3 서브타입, 뿐만 아니라 H4 및 H7 서브타입의 HA를 인식하고, H3 및 H4 인플루엔자 바이러스의 인플루엔자 바이러스 복제를 인 비트로 감소시킬 수 있는 교차-반응성 항-HA2 뮤린 항체가 Stropkovska et al.에 의해 기재되었다(2009). 이것은 HA2 에피토프가 천연 바이러스 상태의 이들 항체로 접근할 수 있는 가능성이 낮고, 항체들은 트립신 분열 및 pH 5 처리 후 HA와 높은 반응성을 갖는다는 것을 증명하였고, 이것은 바이러스 복제의 인 비트로 억제(Vareckova et al., 2003b), 뿐만 아니라 이들 항체들의 인 비보 효능이 상대적으로 낮다는 관찰을 설명할 수 있다(Gocnik et al., 2007).
WO2009/115972에 인간 모노클로날 항체 Fab28가 기재되었고, 이것은 HA의 줄기 영역에서의 에피토프를 인식하고 HA1N1에 대한 중화 활성을 나타내지만, H3N2에 대한 중화활성은 낮다.
특정 인플루엔자 A 바이러스에 의한 호흡기 질환의 극심함, 그리고 세계적 유행 가능성의 공포가 항상 존재하고, 계절적 전염의 높은 경제적 충격의 관점에서, 다양한 인플루엔자 A 서브타입의 예방 및 치료를 위한 효과적인 수단에 대한 요구가 계속되고 있다. 그러므로, H3 서브타입의 HA, 바람직하기는 H3N2를 포함하는 인플루엔자 바이러스, 계절 인플루엔자 바이러스 서브타입을 중화시킬 수 있고, 그리고 선행기술에서 알려진 항체의 결점들이 없거나 덜한 결합분자, 바람직하기는 광범위한 중화 인간 결합 분자에 대한 요구가 있다.
본 발명은 의약에 사용될 수 있는, 특히 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염, 바람직하기는 H3N2 감염의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 결합분자를 제공한다. 본 발명의 결합 분자들 중 몇몇은 H3 서브타입 내에서 중화활성의 폭이 넓다는 면에서 독특하다. 그러므로, 본 명세서에 동정된 결합분자들 중 몇몇은 하나 이상의 최근의 것을 포함하여, H3N2 서브타입 내의 균주들을 중화시킬 수 있고 원인이 되는 인플루엔자 H3N2 균주와 관계없이, 계절 인플루엔자에 대한 전세계적인 예방 및/또는 치료제로서 사용될 수 있다. 결합분자들 중 적어도 몇몇은 트립신에 의한 HA 전구체 분자 HAO의 인 비트로 분열을 막을 수 있다. 더욱이, 본 발명의 결합분자의 적어도 몇몇은 HA 단백질의 형태변화(conformational change)를 막을 수 있고, 인플루엔자 바이러스 막과 감염된 세포의 엔도좀 막의 막 융합에 포함될 것으로 간주된다. 더욱이, 본 발명의 결합 분자 중 적어도 몇몇은 그들이 H7 및/또는 H10 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스들을 포함하여, 적어도 하나의 다른 서브타입의 인플루엔자 바이러스를 교차-중합시킬 수 있고, 그러므로 원인이 되는 인플루엔자 서브타입과 관계없이, 인플루엔자 바이러스의 일반적인 예방, 진단 및/또는 치료제로서 사용될 수 있다는 점에서 독특하다.
본 발명에서 사용되는 용어들의 정의를 아래에 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "포함하고" 또는 "포함하는"은 "제한됨 없이"라는 말이 이러지는 것으로 간주된다.
본 발명에 사용되는 용어 "결합 분자'는 키메릭, 인간화 또는 인간 모노클로날 항체와 같은 모노클로날 항체를 포함하는 완전한 면역글로불린, 또는 항원-결합 및/또는 면역글로불린의 결합 파트너, 즉 H3에 특이적으로 결합하기 위해 완전한 면역글로불린과 경쟁하는 면역글로불린의 단편을 포함하는 가변 도메인을 말한다. 구조와 상관없이, 항원-결합 단편은 완전한 면역글로불린에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 적어도 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 분자"는 본 분야에 알려진 모든 면역글로불린류 및 그 아류를 포함한다. 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 결합 분자는 완전 항체의 5가지의 주류로 나눌 수 있다:IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 그리고 이들 중 여럿은 아류(이소타입)로 더욱 나눌 수 있다: 예를 들면, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4.
항원-결합 단편은, 무엇보다도, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정영역(CDR) 단편, 단일-사슬 항체(ScFv), 2가의 단일-사슬 항체, 단일-사슬 파아지 항체, 다이아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 폴리펩티드에 결합된 특이 항원을 제공하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 단편을 함유하는 (폴리)펩티드를 포함한다. 상기 단편들은 합성적으로 또는 효소적으로 또는 완전한 면역글로불린의 화학적 분열에 의해 생산될 수 있고 또는 재조합 DNA 기술에 의해 유전적으로 설계될 수 있다. 생산의 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고 예를 들면, 항체: A Laboratory Manual, Edited By: E. Harlow 및 D. Lane(1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York에 기재되어 있고, 여기에 참조로 병합되어 있다. 결합분자 또는 그들의 항원-결합 단편은 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나 이상의 결합부위를 갖는 경우, 결합 부위들은 서로 동일하거나 또는 다를 수 있다.
결합분자는 네이크(nake)된 또는 비컨쥬게이트된 결합 분자일 수 있지만, 또한 면역컨쥬게이트의 일부일 수 있다. 네이크된 또는 비컨쥬게이트된 결합분자는, 컨쥬게이트되고, 효과적으로 연결되고, 또는 한편으로 물리적으로 또는 무엇보다도, 독성 물질, 방사성 물질, 리포좀, 효소와 같은 기능적으로 작동체 부분 또는 테그와 연결되지 않는 결합분자를 말하는 의도이다. 네이크된 또는 비컨쥬게이트된 결합 분자는 작동체 부분 또는 태그의 결합에 의한 것 이외의, 안정화되고, 멀티머화되고, 인간화되거나 또는 다른 방법으로 조작된 결합분자를 배척하지 않는다. 따라서, 모든 후-번역적으로 변형된 네이크된 및 비컨쥬게이트된 결합 분자들이 여기에 포함되고, 변형이 재조합 결합 분자-생산 세포에 의해, 천연 결합 분자-생산 세포 환경에서 이루어지고, 초기 결합 분자 제조 후 인간의 손에 의해 도입되는 것을 포함한다. 물론, 용어 네이크된, 또는 비컨쥬게이트된 결합분자는 작동체세포 및/또는 분자와 기능적 관련을 형성하는 결합분자의 가능성을 배척하지 않고, 이와 같은 상호작용의 몇몇은 생리적 효과를 발휘하기 위해 필요하기 때문이다. 관련 이펙터 기 또는 태그의 결핍은 따라서 정의 면에서, 인 비트로 네이크된 또는 비컨쥬게이트된 결합분자에 적용되지만, 인 비보는 아니다.
여기서 사용되는 바에 따라, 용어 "생리적 샘플"은 혈액 및 생리적 기원의 다른 액체 샘플, 생검 시편 또는 조직 배양물과 같은 고형 조직 샘플, 또는 그로부터 유래된 세포 및 그들의 자손을 포함하여, 샘플 타입의 다양성을 망라한다. 또한, 용어는 그들의 획득 후, 예를 들면 시약으로 처리, 고형화, 또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 특정 성분의 풍부에 의한 바와 같이, 여러 방법으로 조작된 샘플을 포함한다. 용어는 어느 종류로부터 얻은 임상적 샘플의 여러 종류를 포함하고, 또한 배양물 중의 세포, 세포 상징액 및 세포 용출물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적 결정 영역(CDR)"은 면역글로불린과 같은 결합 분자의 가변영역 내의 서열을 의미하고, 보통 형태와 전하 분포에서 항원에서 인식되는 에피토프와 상보적인 항원 결합 부위에 대부분 기여한다. CDR 영역은 선형 에피토프, 불연속 에피토프, 또는 단백질의 천연 형태로 단백질 상에 존재하거나 또는 몇몇 경우, 예를 들면, SDS에서 안정화됨에 의해 변형된 단백질 상에 존재하는 바와 같이, 단백질 또는 단백질 단편의 형태적(conformational) 에피토프에 특이적일 수 있다. 에피토프는 또한 단백질의 후번역 변형으로 이루어진다.
여기서 사용되는 용어 "결실"은 각각 부모 분자와 비교하여, 종종 천연적으로 발생하는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기가 없는 아미노산 또는 뉴클레오티드에서의 변화를 말한다.
여기서 사용되는 용어 "발현-조절 핵산 서열"은 특정 숙주 유기물에서 사용가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요하거나 및/또는 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 발현-조절 핵산 서열, 무엇보다도 적절한 전사 개시, 종료, 프로모터, 인핸서 서열; 스플라이싱(splicing)과 같은 효과적인 RNA 처리 시그널 및 폴리아데닐화 시그널; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 강화하는 서열(예를 들면, 리보솜 결합부위); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 필요한 경우, 단백질 분비를 강화하는 서열은 선택된 숙주 유기체에서 활성을 나타내는 어느 핵산 서열일 수 있고 그리고 단백질을 암호화하는 유전자에서 유래될 수 있고, 이것은 숙주 유기체와 상동성 또는 비상동성이다. 발현-조절 서열의 동정 및 작용은 본 분야의 당업자들에게는 정례적인 것이다.
여기서 사용되는 용어 "기능적 변이체"는 부모 결합 분자의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산에 의해 변형되고 여전히 결합 파트너, 예를 들면, H3N2에 결합하기 위해, 부모 결합 분자와 경쟁할 수 있는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 결합분자를 말한다. 다시 말하면, 부모 결합 분자의 아미노산 및/또는 뉴클레오티드 서열에서의 변형은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나 아미노산 서열을 함유하는 결합 분자의 결합 특성에 상당한 영향을 미치거나 변형시키지 않고, 즉 결합 분자는 여전히 그것의 표적을 인식하고 결합할 수 있다. 기능적 변이체는 뉴클레오티드와 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함하는 보수적인 서열 변형을 가질 것이다. 이들 변형은 부위-지향 돌연변이 생성 및 랜덤 PCR-조절 돌연변이 생성과 같은 본 분야에 알려진 표준 기술에 의해 유도될 수 있고, 비-천연 뉴클레오티드와 아미노산 뿐 아니라 천연 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
보존(conservative) 아미노산 치환체는 아미노산 잔기가 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함한다. 유사한 부사슬을 갖는 아미노산 잔기의 종류들이 본 분야에 정의되어 있다. 이들 종류들은 염기성 부사슬(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 부사슬(예를 들면, 아스파르트산, 글루타민산), 비하전된 극성 부사슬(예를 들면, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스틴, 트립토판), 비극성 부사슬(예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 부사슬(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소로이신) 및 방향족 부사슬(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판)을 갖는 아미노산을 포함한다. 위에서 사용된 것 이외의 아미노산 잔기 종류의 분류가 또한 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 더우기, 변이체는 비-보전적 아미노산 치환물, 예를 들면, 다른 구조 및 화학적 특성을 갖는 아미노산 잔기에 의한 아미노산의 대체물을 가질 수 있다. 유사한 사소한 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 면역학적 활성의 파기없이 어느 아미노산 잔기가 치환되고, 삽입되고 또는 결실되는가를 결정하는 안내는 본 분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 발견될 수 있다.
뉴클레오티드 서열의 돌연변이는 전이 또는 전위 돌연변이와 같은 유전자자리에서 이루어지는 단일 변형(1점 돌연변이)일 수 있고, 또는 선택적으로, 복수 개의 뉴클레오티드가 단일 유전자자리에서 삽입, 결실 또는 변화될 수 있다. 이에 더하여, 하나 이상의 변형이 뉴클레오티드 서열 내의 어느 수의 유전자 자리에서 이루어질 수 있다. 돌연변이는 본 분야에 알려진 어느 알맞은 방법으로 실시될 수 있다. 본 발명에 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 서브타입"은 헤마글루티닌(H) 및 뉴라미다제(N) 바이러스 표면 단백질의 다양한 결합에 의해 특징되는 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 말한다. 본 발명에 따르면, 인플루엔자 바이러스 서브타입은 구들의 H 수에 따라, 예를 들면, "H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스" 또는 "H3 인플루엔자", 또는 H 수와 N수의 결합에 의해, 예를 들면, "인플루엔자 바이러스 서브타입 H3N2" 또는 "H3N2"와 같이 불린다. 용어 "서브타입"은 구체적으로 각각의 서브타입의 모든 개별적인 "균주"들을 포함하고, 이것은 보통 돌연변이로 생성되고 다른 병원성 프로파일을 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바에 따르면, 용어 "균주" 및 "분리균"은 대체가능하게 사용될 것이다. 인간 인플루엔자 바이러스 균주 또는 분리균에 대한 현재의 명명법은 보통 괄호안에 HA와 NA의 항원 설명과 함께, 첫번째 분리균의 지리적 위치, 균주 수 및 분리균의 년도(years)을 포함하는데, 예를 들면, A/Moscow/10/00 (H3N2)와 같다. 비-인간 균주도 명명법에서 기원 숙주를 포함한다.
인플루엔자 바이러스 서브타입은 추가로 그들의 계통발생적 그룹을 참조로 분류될 수 있다. 계통발생적 분석 (Fouchier et al, 2005)은 두 개의 주요 군으로 나우어지는 HA의 세분을 설명한다 (Air, 1981): 즉, 계통발생적 그룹 1의 H1, H2, H5 및 H9 서브타입 및 계통발생적 그룹 2의 H3, H4 및 H7 서브타입 (도 1).
본 명세서에서 사용되는 용어 "중화"는 중화가 달성되는 메카니즘과 상관없이, 인플루엔자 바이러스가 표적 세포를 복제적으로 감염시키는 것을 막는 결합분자를 말한다. 그러므로, 중화는, 예를 들면, 세포 표면에 바이러스의 부착 또는 점착을 억제함에 의해, 또는 바이러스와 세포막의 융합 및 이어진 표적 세포에 바이러스의 부착을 억제함에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에서 결합분자와 관련하여 사용되는 용어 "교차-중화하는" 또는 "교차-중화"는 예를 들면, H3, H7 및/또는 H10 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스와 같은, 다양한 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스를 중화시키기 위한 본 발명의 결합분자의 능력을 말한다.
여기서 사용되는 용어 "숙주"는 그곳으로 클로닝 벡터 또는 발현 벡터와 같은 벡터가 도입된 유기체 또는 세포를 말하는 것을 의도한다. 유기체 또는 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 바람직하기는 숙주는 숙주 세포, 예를 들면 배지 중의 숙주 세포를 단리한다. 용어 "숙주 세포"는 단지 세포가 본 발명의 결합분자의 (과)-발현을 위해 변형되고 그리고 기원적으로 이들 결합분자를 발현하는 B-세포를 포함하며 이 세포들은 불멸화, 증폭, 발현의 강화 등에 의해 결합분자를 과-발현하도록 변형되었다는 것을 의미한다. 이 용어는 특정 개체 유기물 또는 세포만을 언급하는 것이 아니며 또한 유기체와 세포의 자손도 언급하는 의미라는 것을 명심해야 한다. 어느 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해 연속적인 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이와 같은 자손은, 실제로, 부모 유기체 또는 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여기서 사용되는 용어 "숙주"의 범위에는 여전히 포함된다.
용어 "인간"은, 여기서 정의된 바와 같이 결합분자에 적용될 때, 인간으로부터 직접 유래되거나 또는 인간 서열을 기재로 하는 분자를 말한다. 결합 분자가 인간서열로부터 유래되거나 기재로 하고 이어서 변형되면, 이것은 여전히 본 명세서에 전반적으로 사용된 바와 같이 인간으로 간주된다. 다시 말하면, 용어 인간은 결합 분자에 적용될 때, 가변 또는 불변 영역 어느 것을 기준으로 하거나, 인간 또는 인간 림프구에서 또는 변형된 형태에서 발생하지 않는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 결합분자를 포함하는 것을 의도한다. 그러므로, 인간 결합 분자는 인간 생식계 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 치환 및/또는 결실을 포함한다(예를 들면, 인비트로 임의 또는 부위-특이 돌연변이 또는 인 비보 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이). 여기서 사용되는 "기재로 하는"은 핵산 서열이 주형으로부터 정확히 복사되거나, 또는 에러가 많은(error-pronc) PCT법에서와 같이 사소한 돌연변이를 갖거나, 또는 주형과 정확히 매치되도록 인공적으로 제조되거나 또는 사소한 변형을 갖는 상황을 말한다. 인간 서열을 기재로 하는 반(semi)-합성 분자는 또한 여기서 사용되는 인간으로 간주된다.
용어 "첨가"로도 알려진, 용어 "삽입"은 부모 분자와 비교하여, 종종 천연적으로 발생하는, 각각, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 첨가의 결과로 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 변화를 말한다.
용어 "단리물"은, 여기서 정의된 바와 같이 결합분자에 적용될 때, 실질적으로 다른 단백질 또는 폴리펩티드가 없는, 특히 다른 항원 특이성을 갖는 다른 결합 분자가 없고, 또한 실질적으로 다른 세포형 재료 및/또는 화학약품이 없는 결합분자를 말한다. 예를 들면, 결합 분자가 재조합적으로 생산되면, 이들은 바람직하기는 실질적으로 배지가 없고, 결합분자가 화학적 합성에 의해 생산되면, 이들은 바람직하기는 실질적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학약품이 없고, 즉 이들은 단백질의 합성에 참여한 화학적 전구체 또는 다른 화학약품으로부터 분리된다. 용어 "단리물"은, 여기에 정의된 바와 같이 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자에 적용될 때, 결합분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이, 다른 서열, 특히 H5N1 이외의 결합분자에 결합하는 결합분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 없는 핵산분자를 말하는 의도이다. 또한, 용어 "단리물"은 천연숙주에서 천연 핵산 분자를 천연적으로 수반하는 다른 세포형 성분으로부터 실질적으로 분리된 핵산분자를 말한다. 더우기, cDNA와 같은 "단리된" 핵산 분자는 다른 세포물질 또는 재조합 기술에 의해 생산될 때는 배지가 실질적으로 없을 수 있고 또는 화학적으로 합성될 때에는 화학적 전구체 또는 다른 화학약품이 실질적으로 없을 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 말한다. 모노클로날 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 또는 기재로 하는 또는 완전히 합성 서열로부터 유래된 가변 및 불변영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 모노클로날 항체의 제조방법은 결합특이성에 있어서 중요하지 않다.
여기서 사용되는 용어 "천연적으로 발생하는"은 대상이 천연적으로 발견될 수 있다는 사실을 말한다. 예를 들면, 천연 기원으로부터 단리될 수 있는 유기체에 존재하고 실험실에서 사람이 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연적으로 발생하는 것이다.
본 발명에 사용되는 용어 "핵산분자"는 뉴클레오티드의 중합형태를 말하고 RNA, cDNA, 게놈성 DNA 및 합성 형태 및 상기의 혼합된 폴리머의 센스 및 안티센스모두를 포함한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 어느 타입의 변형된 형태를 말한다. 용어는 또한 DNA의 단일- 및 이중-스트랜드 형태를 포함한다. 이에 더하여, 폴리뉴클레오티드는 천연적으로-발생하는 및 천연적으로-발생하는 및/또는 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 변형된 뉴클레오티드 중 어느 것 또는 모두를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나 또는 비-천연적 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있고, 본 분야의 당업자들에 의해 쉽게 이해될 것이다. 이와 같은 변형은, 예를 들면, 라벨, 메틸화, 하나 이상의 천연적으로 발생한 뉴클레오티드의 동족체에 의한 치환, 비하전된 연결과 같은 뉴클레오티드간 변형(예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카바메이트 등), 하전된 연결(예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등), 펜던트 모이어티(예를 들면, 폴리펩티드), 삽입물(예를 들면, 아크리딘, 소랄렌, 등), 킬레이터, 알킬레이터, 및 변형된 연쇄를 포함한다. 상기 용어는 또한, 단일-스트랜드, 이중-스트랜드, 특히 이중체, 삼중체, 머리핀형, 환형 및 패드록(padlock) 배치를 포함하는 어느 위상 배치를 포함하는 의도이기도 하다. 또한, 수소결합 및 다른 화학적 상호작용을 통해 고안된 서열에 결합할 수 있는 그들의 능력에서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자를 포함한다. 이와 같은 분자는 본 분야에 잘 알려져 있고 예를 들면, 펩티드 연쇄가 분자의 골격에서 인산염 연쇄를 대체하는 것을 포함한다. 핵산 서열에 대한 참조는 다르게 명시되지 않는 한 그것의 상보체를 포함한다. 그러므로, 특정 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 참조는 그것의 상보체 서열을 갖는, 그것의 상보체 스트랜드를 포함하는 것으로 이해되어야한다. 상보체 스트랜드는 또한, 예를 들면, 안티센스 치료법, 혼성화 프로브 및 PCR 프라이머에 유용하다.
용어 "작동적으로 연결된"은 보통 물리적으로 연결되고 서로 기능적 관계에 있는 2개 이상의 핵산 서열을 말한다. 예를 들면, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현을 개시 또는 조절할 수 있다면, 프로모터는 암호화 서열과 작동적으로 연결되고, 여기서 암호화 서열은 프로모터의 "조절하에 있다"고 이해되어야 한다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제"는 약물, 약제와 같은 활성물질과 결합된 어느 불활성 물질 또는 허용가능한 편리한 투여형태를 제조하기 위한 결합 물질을 의미한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 투여량 및 적용된 농도에서 수용체에 비-독성이고, 약물, 약제 또는 결합분자를 포함하는 제형의 다른 구성성분과 양립할 수 있는 부형제이다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 본 분야에 널리 적용된다.
여기서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은, 결합분자, 예를 들면 항체 및 그것의 결합 파트너, 예를 들면 항원의 상호작용을 참조로 하여, 상호작용이 결합 파트너 상의 특정 구조체, 예를 들면 항원성 결정체 또는 에피토프의 존재에 의존한다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 항체는 결합 파트너가 다른 분자들 또는 유기체의 혼합물 중에 존재할 때에도 결합 파트너와 우선적으로 결합하거나 인식한다. 결합은 공유 또는 비-공유 결합에 의해 또는 둘 다의 조합에 의해 이루어질 것이다. 또 다시 말하면, 용어 "특이적으로 결합하는"은 항원 또는 그것의 단편에 대해 면역특이적으로 결합하고 다른 항원에는 면역특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 항원에 면역특이적으로 결합한 결합분자는, 예를 들면, 방사선면역조사(RIA), 효소-연결 면역흡수 조사(ELISA), BIACORE, 또는 본 분야에 알려진 다른 조사에 의해 측정된 바와 같이, 다른 펩티드 또는 폴리펩티드와는 낮은 친화력으로 결합할 수 있다. 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합분자 또는 단편은 관련 항원과 교차-반응될 수 있다. 바람직하기는, 항원과 면역특이적으로 결합하는 결합분자 또는 단편은 다른 항원과 교차-반응하지 않는다.
여기서 사용되는 "치환"은, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 각각 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의해 대체되는 것을 말한다.
용어 "치료적으로 효과적인 양"은 H3 서브타입의 인플루엔자에 의한 감염에 의해 생기는 질환의 예방, 개선 및/또는 치료에 효과적인 것으로 여기에 정의된 바에 따른 결합분자의 양을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 "개선(ameloriation)"은 인플루엔자 감염의 가시적 또는 인지가능한 증상, 바이러스 혈증, 또는 기타 측정가능한 징후의 감소를 말한다.
용어 "치료"는 예방뿐 아니라 치료적 처리 또는 치유 또는 정지 또는 적어도 질병의 진행의 지연을 위한 예방적 조치를 말한다. 치료가 필요하다는 것은 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 의한 병태로 이미 손상된 것뿐 아니라, H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염이 치료되는 것을 포함한다. H3 인플루엔자의 감염으로부터 부분적으로 또는 완전히 회복된 개체도 역시 치료가 필요할 수 있다. 예방은 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 확산의 억제 또는 감소, 또는 H3 인플루엔자에 의한 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 개시, 전개 또는 진행의 억제 및 감소를 포함한다.
용어 "벡터"는 복제되어질, 그리고 몇몇 경우에는 발현되어질 숙주에 도입되도록 하기 위해 제2 핵산 분자가 삽입될 수 있는 핵산분자를 말한다. 다시 말하면, 벡터는 그것이 연결되어 있는 핵산 분자를 이송할 수 있다. 발현벡터뿐만 아니라 클로닝 벡터는 여기서 사용되는 바와 같이 용어 "벡터"에 의해 의도된다. 벡터는 플라즈미드, 코스미드, 세균성 인공염색체(BAC) 및 이스트 인조염색체(YAC), 및 박테리오파아지 또는 식물 또는 동물(인간 포함)로부터 유래된 벡터를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 벡터는 제안된 숙주에 의해 인식된 복제물의 기원 및 발현 벡터의 경우, 프로모터와 숙주에 의해 인식된 다른 조절 영역을 포함한다. 제2 핵산 분자를 함유하는 벡터는 변형, 트란스펙션, 또는 바이러스성 도입 메카니즘의 사용에 의해 세포에 도입된다. 어느 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 독립적인 복제를 할 수 있다(예를 들면, 복제의 세균성 기원을 갖는 벡터는 세균에 복제될 수 있다). 다른 벡터는 숙주에 도입된 후 숙주의 게놈으로 통합될 수 있고, 그것에 의해 숙주 게놈에 따라 복제된다.
발명의 요약
본 발명은, H3N2를 포함하여, H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 균주에 특이적으로 결합할 수 있고, 이와 같은 플루엔자 바이러스에 중화활성을 나타내는 인간 결합분자를 제공한다. 구현예에서, 본 발명의 결합분자는, 이들이 인간에서의 가장 일반적인 유행성 균주인, 인플루엔자 바이러스 서브타입 H3의 적어도 하나 이상의 최근의 균주, 바람직하기는 모든 알려진 균주를 포함하여 여러 균주를 높은 효율로 중화시킬 수 있다는 점에서 독특하다. 구현예에서, 결합분자들은 H3HA 단백질의 줄기 영역에 있는 보존된 에피토프에 결합한다. 한 구현예에서, 결합분자는 혈구응집반응 억제 활성을 갖는다. 한 구현예에서, 결합분자는 HA 전구체 분자 HAO의 인 비트로 분할을 막을 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 결합분자는 감염된 세포의 엔도좀 막과 인플루엔자 바이러스 막의 융합에 요구되는 HA 단백질의 형태적 변환을 막을 수 있다.
본 발명은 또한 H3 서브타입이 속한 계통발생적 그룹 2의 인플루엔자 서브타입들 간에 공유되고, 그러므로 H3-, H7, 및/또는 H10 인플루엔자 기재 서브타입들, 및 이들 특정 에피토프를 갖는 HA 단백질을 함유하는 다른 인플루엔자 서브타입, 바람직하기는 계통발생 그룹 2의 모든 서브타입들 사이에 교차 반응하는 결합분자에 관련되는 혈구응집소 단백질 중의 에피토프에 결합하는 결합분자를 제공한다. 그러므로 본 발명의 여러 결합분자들은 H7 및/또는 H10 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스와 같은, 하나 이상의 다른 인플루엔자 바이러스 A 서브타입에 대해 교차-중화 활성을 갖는 점에서 독특하다. 바람직하기는, 본 발명의 결합분자들은 H3, H7 및 H10 서브타입을 포함하여, 계통발생적 그룹 2의 모든 인플루엔자 바이러스 서브타입을 교차-중화시킬 수 있고, 그러므로 그 계통발생적 그룹 내의 원인이 되는 인플루엔자 서브타입과 관련없이, 계통발생적 그룹 2에 속하는 인플루엔자 바이러스에 대한 광범위한 예방, 진단 및/또는 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 결합분자는 지금까지 알려지지 않은, 항원대변이 또는 항원소변이가 용이하지 않거나 또는 덜 용이한 보존된 에피토프에 결합한다. 그러므로 본 발명의 결합분자를 이들 에피토프를 동정하고 및/또는 특성화하는데 사용하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 최소한 인간 결합분자의 결합 영역을 암호화하는 핵산 분자와 관련된다. 본 발명은 추가로 H3N2 인플루엔자 감염과 같은, H3 인플루엔자 감염을 갖는, 또는 진행될 위험에 있는 개체의 예방 및/또는 치료를 위한 본 발명의 인간 결합 분자의 용도를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 이와 같은 인플루엔자의 진단/검출에서의 본 발명의 인간 결합분자의 용도에 관한 것이다.
도 1은 서브타입 수준에서 아미노산 서열의 계통수를 나타낸다. 그룹으로 나눈 서브타입을 나타내었다. 계통발생적 그룹 1으로부터, H1 서브타입을 포함하는 H1 클레이드, H9 서브타입을 포함하는 H9 클레이드, 그리고 계통발생적 그룹 2로부터, H7 서브타입을 포함하는 H7 클레이드 및 H3 서브타입을 포함하는 H3 클레이드.
도 2는 트립신(사선처리된 막대), pH 4.9 완충 매질(백색 막대) 및 DTT (교차선 막대)으로 순차적으로 처리된 후, FACS 분석에 의해 측정되고, 그리고 비처리된 rHA(검은색 막대)에 대한 결합 백분률로 표현된, H3 rHA를 발현하는 표면에 대한 UgG1의 결합을 나타내는 막대 다이아그램이다.
도 3은 인 비트로 프로테아제 민감성 분석의 결과를 나타낸다. 샘플을 1×MOPS 완충용액 중의 4~12% BisTris 겔 상에서 작동시켰다. 단백질 밴드를 콜로이드 블루 염색으로 가시화시켰다.
도 4는 감염 과정 중의 HA 단백질의 다른 형태들의 개략적 표현이다.
도 5는 트립신(사선처리된 막대), pH 4.9 완충 매질(백색 막대) 및 DTT (교차선 막대)으로 순차적으로 처리된 후, FACS 분석에 의해 측정되고, 그리고 비처리된 rHA(검은색 막대)에 대한 결합 백분률로 표현된, 다른 처리들 후 HA 발현 세포에 대한 H3의 결합을 나타내는 막대 다이아그램이다.
도 6은 H3HA의 분할을 얻기 위해 트립신으로 HA의 배양 시간을 측정하기 위한, 실시예 11에 기재된 바에 따른 타임 코스(time course) 실험의 결과를 나타낸다
도 7은 실시예 11에 기재된 바에 따른, mAbs로 예비-배양된 H3 HA 샘플의 트립신 소화의 결과를 나타낸다.
도 8은 H3 HA에서 CR8043이 pH-유도된 형태 변화를 억제한다는 것을 설명하는 막대 다이아그램이다.
도 9는 CR8020 및 CR8041이 또한 HA의 pH-유도된 형태 변화를 블로킹할 수 있다는 것을 나타낸다: A. 트립신 분할 전에 mAbs 첨가; B. 트립신 분할 후 mAbs 첨가; C. 모든 처리 후 mAbs 첨가.
도 10은 Kaplan-Meier 생존가능성 곡선을 나타낸다. 항체는 30에서 1 mg/kg의 투여량 범위를 사용하여 챌린지 하루 전에 정맥주사로 주입하였다. 대조 Ab를 30 mg/kg (grey) 투여하고, 이어서 제0일에 치사 챌린지를 25 LD50 A/HK/1/68-MA20 (H3N2)로 투여하였다. CR8020 (A)를 CR8041 (B) 및 CR8043 (C)와 별개의 연구에서 시험하였고, 이것을 실험 1에서 평가하였다. 그러므로 동일한 대조 항체군이 B와 C에 대해 사용되었다.
도 11은 제0일에 비하여 평균 체중 변화 (%)를 나타낸다. 항체를 30에서 1 mg/kg의 투여량 범위를 사용하여 챌린지 하루 전에 정맥주사로 주입하였다. 대조 Ab를 30 mg/kg (grey) 투여하고, 이어서 제0일에 치사 챌린지를 25 LD50 A/HK/1/68-MA20 (H3N2)로 투여하였다. 막대는 평균의 95% CI를 나타낸다. 마우스가 후속 연구 도중 죽거나/안락사되는 경우, 최종 관찰된 체중을 이월하였다. CR8020 (A)를 CR8041 (B) 및 CR8043 (C)와 별개의 연구에서 시험하였고, 이것을 실험 1에서 평가하였다. 그러므로 동일한 대조 항체군이 B와 C에 대해 사용되었다.
도 12는 메디안 임상 점수를 나타낸다. 항체를 30에서 1 mg/kg의 투여량 범위를 사용하여 챌린지 하루 전에 정맥주사로 주입하였다. 대조 Ab를 30 mg/kg (grey) 투여하고, 이어서 제0일에 치사 챌린지를 25 LD50 A/HK/1/68-MA20 (H3N2)로 투여하였다. 막대는 사분위수 범위를 나타낸다. CR8020 (A)를 CR8041 (B) 및 CR8043 (C)와 별개의 연구에서 시험하였고, 이것을 실험 1에서 평가하였다. 그러므로 동일한 대조 항체군이 B와 C에 대해 사용되었다. 임상 점수 설명: 0 = 임상적 사인 없음; 1 = 애벌칠(rough coat); 2 = 애벌칠, 덜 반응적, 취급 중 소극적; 3 = 애벌칠, 드러남(rolled up), 부자연스런 호흡, 취급 중 소극적; 4 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 벌렁 누웠을 때 위(stomach)에 축소되지 않음. 임상 점수 4가 관찰된 마우스는 동일자에 안락사시켰다.
도 13은 인플루엔자 A/HK/1/68-MA20 (H3N2)를 갖는 마우스 치사 챌린지 모델에서의 mAB CR8020의 치료적 효능을 설명한다. mAb CR8020 (15 mg/kg)의 단일 투여량을 챌린지 1일 전에 또는 챌린지 후 제1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일에 129X1/SvJ 마우스 (n=10 /그룹)에 정맥 투여하였다. 대조 mAb (15 mg/kg)를 챌린지 후 제1일에 투여하였다. 마우스를 제0일에 25 LD50 A/HK/1/68-MA20 (H3N2)로 챌린지하고 21일 동안 모니터링하였다. 패널 A: Kaplan-Meier 생존 가능 곡선. 패널 B: 제0일과 비교한 평균 체중 변화(%). 막대는 평균의 95% CI를 나타낸다. 마우스가 후속 연구 중 죽거나 안락사되면, 최종 측정된 체중을 이월하였다. 패널 C: 반수 임상점수. 막대는 사분위수 범위를 나타낸다. 0 = 임상적 신호 없음; 1 = 애벌칠; 2 = 애벌칠, 덜 반응적, 취급 중 소극적; 3 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 취급 중 소극적; 4 =애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 벌렁 누웠을 때 위에 축소되지 않음. 임상 점수 4가 관찰된 마우스는 동일자에 안락사시켰다.
도 14는 인플루엔자 A/CH/NL/621557/03 (H7N7)를 갖는 마우스 치사 챌린지 모델에서 mAB CR8020의 예방적 효능을 나타낸다. 패널 A: Kaplan-Meier 생존 가능성 곡선. 패널 B: 제0일과 비교한 평균 체중 변화(%). 막대는 평균의 95% CI를 나타낸다. 후속 연구 중 마우스가 죽거나 안락사된 경우, 최종 측정된 체중을 이월하였다. 패널 C: 반수 임상 점수. 막대는 사분위 수를 나타낸다. 0 = 임상적 신호 없음; 1 = 애벌칠; 2 = 애벌칠, 덜 반응적, 취급중 소극적; 3 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 취급 중 소극적; 4 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 벌렁 누웠을 때 위에 축소되지 않음. 임상 점수 4가 관찰된 마우스는 동일자에 안락사시켰다.
도 15는 암컷 Balb/c 마우스 (n=8/group)에 10에서 1 mg/kg (CR8020) 또는 30에서 1 mg/kg (CR8041 및 CR8043)의 투여량을 사용한 챌린지 1일 전에 정맥 투여한 마우스 적합된 인플루엔자 A/CH/NL/621557/03 (H7N7) MAbs를 갖는 마우스 치사 챌린지 모델에서 mAbs CR8020, CR8041 및 CR8043의 예방적 효능을 나타낸다. 대조 mAb를 1일 전에 30 mg/kg (grey)으로 투여하였다. 제0일에 치사 챌린지를 25 LD50 마우스 적합된 A/CH/NL/621557/03 (H7N7)로 비강내 접종하여 제공하였고, 마우스를 21일 동안 모니터링하였다. 패널 A: Kaplan-Meier 생존 가능성 곡선. 패널 B: 제0일과 비교한 평균 체중 변화(%). 막대는 평균의 95% CI를 나타낸다. 후속 연구 중 마우스가 죽거나 안락사된 경우, 최종 측정된 체중을 이월하였다. 패널 C: 반수 임상 점수. 막대는 사분위의 수를 나타낸다. 0 = 임상적 신호 없음; 1 = 애벌칠; 2 = 애벌칠, 덜 반응성, 취급 중 소극적; 3 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 취급 중 소극적; 4 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 벌렁 누웠을 때 위에 축소되지 않음. 임상 점수 4가 관찰된 마우스는 동일자에 안락사시켰다.
도 16은 마우스 적합된 인플루엔자 A/CH/NL/621557/03 (H7N7)를 갖는 마우스 치사 챌린지 모델에서의 mAb CR8020의 치료적 효능을 나타낸다. mAb CR8020의 단일 투여량 (15 mg/kg)을 암컷 Balb/c mice (n=8/group)에 챌린지 1일 전에 또는 챌린지 후 제 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일에 정맥 투여하였다. 대조 mAb (15 mg/kg)를 챌린지 후 제1일에 투여하였다. 마우스를 제0일에 25 LD50 마우스 적합된A/CH/NL/621557/03 (H7N7)로 챌린지하고 21일 동안 모니터링하였다. 패널 A: Kaplan-Meier 생존 가능성 곡선. 패널 B: 제0일과 비교한 평균 체중 변화(%). 막대는 평균의 95% CI를 나타낸다. 마우스가 후속 연구 중 죽거나 안락사되면, 최종 관찰된 체중을 이월하였다. 패널 C: 반수 임상 점수. 막대는 사분위 수를 나타낸다. 0 = 임상 신호 없음; 1 = 애벌칠; 2 = 애벌칠, 덜 반응적, 취급중 소극적; 3 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 취급 중 소극적; 4 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 벌렁 누웠을 때 위에 축소되지 않음. 임상 점수 4가 관찰된 마우스는 동일자에 안락사시켰다.
제 1면에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 A, 특히 H3 서브타입의 HA, 특히 H3N2를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A에 대해 특이적으로 결합할 수 있고 중화활성을 갖는 결합분자를 포함한다. 바람직하기는, 결합분자는 인간 결합분자이다. 한 구현예에서, 본 발명의 결합분자는 여러 인플루엔자 바이러스 H3N2 균주, 특히 2가지 이상의 다른 H3N2 균주, 더욱 바람직하기는 3가지 이상, 더욱 바람직하기는 4가지 이상, 더욱 바람직하기는 5가지 이상의 다른 H3N2 균주에 대해 특이적으로 결합할 수 있고 및/또는 중화활성을 갖는다. 균주는 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들면, 조류 둘 다로부터 얻을 수 있다. 한 구현예에서, 결합분자는 A/Wisconsin/67/2005, A/Hiroshima/52/2005, A/Panama/2007/99, 및 A/Johannesburg/33/94로 이루어진 군으로부터 선택되는 최근의 H3N2 균주 중 적어도 하나 이상에 결합하고 그리고 중화시킨다. 또 다른 구현예에서, 결합분자는 또한 H3N2 균주 A/Hong Kong/1/68에 결합하고 중화시킨다. 가장 바람직하기는, 결합분자는 1968년부터 2005년 사이의 모든 인플루엔자 H3N2 균주에 결합하고 중화활성을 갖는다. 바람직하기는, 결합분자는 적어도 2010년 1월 20일 전에 알려진 인플루엔자 H3N2의 모든 천연적으로 발생하는 분리균에 대한 중화활성을 갖는다.
본 발명의 결합분자는 HA 단백질의 HAO, HA1 및/또는 HA2 서브 유니트에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 HA 단백질의 HAO, HA1 및/또는 HA2 서브 유니트 상의 선형 또는 구조적 및/또는 형태적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. HA 분자는 바이러스로부터 정제되거나 또는 재조합적으로 생산되고 그리고 임의로 사용전 단리될 수 있다. 선택적으로, HA는 세포의 표면 위에 발현될 수 있다. 바람직하기는, 본 발명의 결합분자는 H3 HA 단백질의 HA2 폴리펩티드의 위치 19, 25, 27, 33 및 34에서 하나 이상의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다. 한 구현예에서, 결합분자는 위치 19의 아미노산이 아스파르트산(D)이고, 위치 25의 아미노산이글루타민(Q)이고, 위치 27의 아미노산이 글리신 (G)이고, 위치 33의 아미노산이 글리신(G)이고 그리고/또는 위치 34의 아미노산이 글루타민 (HA2의 번호는 HA1과 HA2 사이의 분할을 구성하는 아르기닌 잔기 바로 다음의 위치 1로부터 시작한다)일 때, HA2의 상기 에피토프에 결합한다. 한 구현예에서, 결합분자는 하나 이상의 상기 아미노산이 변했을 때 HA2의 상기 에피토프에 결합하지 않는다.
또 다른 면에서, 본 발명은 HA1 및 HA2의 H3 HA 전구체 분자 HAO의 트립신 분할을 적어도 인 비트로에서 막을 수 있는 결합분자를 포함한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 적어도 인 비트로에서, 인플루엔자 바이러스 막과 감염된 세포의 엔도좀 막의 막 융합에 요구되는 H3 HA 단백질의 형태 변화를 막을 수 있는 결합분자를 포함한다.
또 다른 면에서, 결합분자는 상기의 특성, 즉 교차-중합 활성, HA2의 줄기 영역에서 보존 에피토프에 대한 결합, HAO의 트립신 분할의 인 비트로 억제, 및/또는 형태적 변화 억제 중 몇몇 또는 모두를 갖는다.
한 구현예에서, 본 발명의 결합분자는 상기 특성 모두 또는 몇몇을 갖고, 이에 더하여, H1N1과 같은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A에 결합하거나 및/또는 중화시킬 수 없다.
본 발명의 결합분자는 예를 들면, 바이러스성, 생존 및/또는 전염성인 또는 불활성화된/감독된 형태인 인플루엔자 바이러스 H3N2에 특이적으로 결합할 수 있다. 바이러스, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 H3N2를 불활성화/감독시키는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고, 포르말린, β-프로피오락톤 (BPL), 메르티올레이트 및/또는 자외선으로의 처리를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 결합분자는 또한 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 단편, 그중에서도, 서브타입 H3N2로부터 유래된 하나 이상의 단백질 및/또는 (폴리)펩티드 또는 H3N2의 재조합적으로 생산된 하나 이상의 단백질 및/또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. H3N2 감염의 치료 및/또는 예방의 방법의 경우, 결합분자는 바람직하기는, 바이러스 부착 및 세포 방출에 요구되는 표면 글리코단백질, 헤마글루티닌(HA)과 같은 H3N2의 표면 접근가능한 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
다양한 H3N2의 단백질의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열은 GenBank-데이타베이스, NCBI 인플루엔자 바이러스 서열 데이타베이스, 인플루엔자 서열 데이타베이스(ISD), EMBL-데이타베이스 및/또는 기타 데이타베이스에서 확인할 수 있다. 각각의 데이타 베이스에서 이와 같은 서열을 확인하는 것은 당업자에게 가능하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 결합분자는 상기 단백질 및/또는 폴리펩티드의 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 단편은 적어도 본 발명의 결합분자에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다. 여기서 사용되는 "에피토프"는 검출가능한 항원-결합 분자 복합물을 형성하기에 충분히 높은 친화력으로 본 발명의 결합분자에 결합할 수 있는 모이어티이다.
본 발명의 결합분자는 HA의 세포외 부분 (또한 본 명세서에서 가용성 HA (sHA)로 명칭함)에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없다. 본 발명의 결합분자는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체와 같은 불활성 면역글로불린 분자일 수 있고 또는 결합분자는 Fab, F(ab') F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보적 결정영역(CDR) 단편, 단일-사슬 항체(scFv), 이가 단일-사슬 항체, 단일-사슬 파아지 항체, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 적어도 H3N2 또는 그것의 단편에 특이적 항원을 제공하기에 충분한 면역글로불린의 단편을 함유하는 (폴리)펩티드를 포함하는 항원-결합 단편일 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합분자는 인간 모노클로날 항체이다.
본 발명의 결합분자는 비-단리된 또는 단리된 형태로 사용될 수 있다. 더우기, 본 발명의 결합 분자는 단독으로 또는 적어도 하나의 본 발명의 결합분자(또는 그것의 변이체 또는 단편)를 포함하는 혼합물로 사용될 수 있다. 다시 말하면, 결합분자는 조합물, 예를 들면, 두 개 이상의 본 발명의 결합분자, 변이체 또는 그것의 단편을 포함하는 약제학적 조성물로 사용될 수 있다. 예를 들면, 다른, 그러나 상보적 활성을 갖는 결합 분자들은 원하는 예방, 치료 또는 진단 효과를 얻기 위해 단일 치료법에 조합될 수 있지만, 선택적으로, 동일한 활성을 갖는 결합분자들도 역시 원하는 예방, 치료 또는 진단 효과를 얻기 위해 단일 치료법에 조합될 수 있다. 임의로, 혼합물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제를 포함할 수 있다. 바람직하기는, 예를 들면, M2 억제제(예를 들면, 아마티딘, 리만타딘) 및/또는 뉴라민분해효소 억제제(예를 들면, 자나미비르 오셀타미비르)와 같은 치료제는 인플루엔자 바이러스 H3N2 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
통상적으로, 본 발명에 따른 결합분자는 그들의 결합 파트너, 즉 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 0.2×10-4M, 1.0×10-5M, 1.0×10-6M, 1.0×10-7 M 미만, 바람직하기는 1.0×10-8M 미만, 더욱 바람직하기는 1.0×10-9M 미만, 더욱 바람직하기는 1.0×10-10M 미만, 더욱 바람직하기는 1.0×10-11M 미만, 및 가장 바람직하기는 1.0×10-12M 미만의 친화력 상수로 결합할 수 있다. 친화력 상수는 항체 이소타입에 따라 변할 수 있다. 예를 들면, IgM 이소타입의 결합친화력은 적어도 1.0×10-7M 의 결합 친화력을 말한다. 결합 친화력은 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명, 즉, 예를 들면 BIACORE 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 측정될 수 있다.
통상적으로, 본 발명에 따른 결합분자는 실시예 6에 기재된 바와 같이 인 비트로 바이러스 중화 분석(VNA)에서 측정된 바에 따르면, 10 μg/ml 이하, 바람직하기는 5 μg/ml 이하, 더욱 바람직하기는 2 μg/ml 이하, 더욱 바람직하기는 1 μg/ml 이하의 중화 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 결합 분자는 예를 들면, 샘플에서 및 현탁액에서와 같이 가용성 형태로 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 결합될 수 있고, 또는 미세 역가 플레이트, 막 및 비드 등과 같은 담체 또는 기질에 결합 또는 부착된 H3N2 또는 그것의 단편에 결합될 수 있다. 담체 또는 기질은 유리, 플라스틱(예를 들면 폴리스티렌), 다당류, 나일론, 니트로셀룰로스, 또는 테프론 등으로 이루어질 수 있다. 이와 같은 지지체의 표면은 고형 또는 다공성일 수 있고 어느 통상의 형태일 수 있다. 또한, 결합분자는 순수/단리 또는 비-순수/비-단리된 형태로 인플루엔자 바이러스 H3N2에 결합될 수 있다.
본 발명의 결합분자는 중화활성을 나타낸다. 중화활성은 예를 들면 본 명세서에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 중화활성을 측정하는 선택적인 방법은 예를 들면, WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, 제네바: 국제보건기구, 2005, version 2002.5에 기재되어 있다.
본 발명은 인플루엔자 혈구응집소 단백질(HA) 중의 에피토프를 인식하고 결합할 수 있는 단리된 인간 결합분자에 관한 것으로, 상기 결합분자는 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A에 대해 중화활성을 갖는 것을 특징으로 한다. H3 서브타입의 HA를 함유하는 인플루엔자 균주의 예는 H3N2이다. 특히 바람직한 것은 H3N2 인플루엔자 서브타입을 중화시키는 결합분자이다. 구현예에서, 결합분자는 최근의 H3N2 균주의 적어도 하나 이상을 중화시킨다. 그러므로 구현예에서, 결합분자는 A/Wisconsin/67/2005, A/Hiroshima/52/2005, A/Panama/2007/99, 및 A/Johannesburg/33/94로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 H3N2 균주를 적어도 결합하거나 중화시킨다. 또 다른 구현예에서, 결합분자는 또한 H3N2 균주 A/Hong Kong/1/68에 결합하고 중화시킨다. 더욱 바람직하기는, 결합분자는 1968년과 2005년 사이의 모든 인플루엔자 H3N2 균주, 바람직하기는 상기 인플루엔자 바이러스 서브타입의 모든 알려진 균주에 결합하고 그에 대해 중화활성을 갖는다
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 결합분자는 또한 다른 인플루엔자 바이러스 A 서브타입의 인플루엔자 바이러스에 대해 중화활성을 갖고, 바람직하기는 적어도, 균주 A/Mallard/Netherlands/12/2000와 같은 H7 서브타입, 및/또는 균주 A/chick/Germany/N/49와 같은 H10 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 중화활성을 갖는다. 그러므로, 본 발명의 결합분자 중 몇몇은 이들 인플루엔자 서브타입을 교차-중화시킨다는 것이 알려져 있다. 그러므로 본 발명은 또한 인플루엔자 서브타입들 간에 공유되고 보존되는 혈구응집소 단백질 중의 에피토프와 결합하는 결합분자를 제공하고, 따라서 H3-, H7-, 및/또는 H10 인플루엔자 기재 서브타입들과 이들 특정 에피토프, 바람직하기는 계통발생적 그룹 2의 모든 인플루엔자 바이러스를 갖는 HA 단백질을 함유하는 기타 인플루엔자 서브타입을 교차-반응시키는 결합분자에 관한 것이다. 교차-중화하는 결합분자는 바람직하기는 H3-, H7, 및/또는 H10-서브타입의 여러 균주들에 결합하고 중화시킨다. 한 구현예에서, 이들 교차-중화하는 결합분자들은 A/Wisconsin/67/2005, A/Hiroshima/52/2005, A/Johannesburg/33/94, 및 A/Panama/2007/99로 이루어진 군으로부터 선택되는 최근의 H3N2 균주의 적어도 하나 이상에 결합하고 중화시킨다. 또 다른 구현예에서, 결합분자는 또한 H3N2 균주 A/Honh Kong/1/68에 결합하고 중화시킨다. 가장 바람직하기는, 결합분자는 1968년과 2005년 사이의 모든 인플루엔자 H3N2 균주, 바람직하기는 모든 공지의, 그리고 더욱 바람직하기는 미래의 H3N2 균주와도 결합하고 중화시킨다. 추가의 구현예에서, 결합분자는 상기 기타 인플루엔자 바이러스 서브타입의 실질적인 모든 분리균에 결합하고 중화시킨다.
한 구현예에서, 결합분자는 계통발생 그룹 2의 모든 인플루엔자 바이러스 서브타입에 결합하고 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 것을 근거로, 당업자는 항체가 다른 서브타입의 HA 단백질과 교차-반응하는지를 결정할 수 있고, 또한 이들이 다른 서브타입의 인플루엔자 바이러스를 인비보 중화시키는지를 결정할 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 표적 세포의 세포 표면에 있는 시알산 잔기에 결합하고, 이어서 그들의 막을 엔도좀 막과 융합시키고 그리고 게놈-트란스크립타아제 복합물을 세포로 방출함으로써 세포를 감염시킨다. 수용체 결합 및 막 융합 공정은 모두 HA 글리코단백질에 의해 매개된다. 인플루엔자 바이러스 A의 HA는 두 개의 구조적으로 구별되는 영역, 즉 표적 세포에 대한 바이러스 부착에 책임이 있는 수용체 결합 부위를 함유하고, 그리고 HA의 혈구응집반응에 관여하는 구형 헤드 영역과, 바이러스 엔벨로프와 세포의 엔도좀 막 사이의 막 융합에 필요한 융합 펩티드를 함유하는 줄기 영역을 포함한다. HA 단백질은 트라이머로, 여기서 각각의 모노머는 전구체 (HAO)의 단백질분해 분열에 의해 감염 중 생산되는, 두 개의 다이설파이드-결합된 글리고펩티드, HA1 및 HA2로 이루어진다. 분열은 HA가 막 융합을 위해형태 변화를 허용하도록 하는데 요구되기 때문에 바이러스 감염력에 요구된다. 준비된(primed) 분자의 활성은 엔도좀에서 낮은 pH, pH 5~pH 6 사이에서 일어나고 HA 구조에서의 광범위한 변화를 요구한다. 융합-전 비분할된 (I), 융합-전 분할된(II) 및 융합-후 HA(III)의 3차원 구조를 대략적으로 도 4에 나타내었다. 막 융합 공정에 참여하기 위한 HA의 준비 및 활성화 중의 각각의 단계는, 예를 들면, 모노클로날 항체에 의한 억제를 위해 다양한 표적을 제시한다.
본 발명의 구현예에서, 결합분자는 인 비트로 분석, 예를 들면 하기 실시예에 기재된 바와 같은 분석에서 최소한 HA 전구체 분자 HAO의 분열을 막을 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 숙주 프로테아제에 의한 HA 전구체 분자 HAO의 HA1 및 HA2로의 분열은 바이러스 감염능을 활성시키는데 요구된다. 그러므로 본 발명에 의한 HA 전구체 분자 HAO의 분열의 예방은 인플루엔자 바이러스에 의한 감염을 막는다.
한 구현예에서, 결합분자는 H3 HA 단백질의 HA2 폴리펩티드의 위치 19, 25, 27, 33 및/또는 34에서 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다. 한 구현예에서, 결합분자는 위치 19의 아미노산이 아스파르트산(D)이고, 위치 25의 아미노산은 글루타민(Q)이고, 위치 27의 아미노산은 글리신(G)이고, 위치 33에서의 아미노산은 글리신(G)이고 및/또는 위치 34에서의 아미노산이 글르타민인 경우 HA2에서 상기 에피토프에 결합한다. 바람직하기는, 결합분자는 상기 아미노산의 하나 이상이 변화되면 HA2에 있는 상기 에피토프에 결합하지 않는다. 아미노산의 번호는 Uniprot database number Q91MA7 (SEQ ID NO: 193)로부터의 헤마글루틴 서열을 근거로 한다. Q91MA7는 A/Hong Kong/1/1968로부터 미숙 HA의 완전길이 서열을 제공한다. HA2 서열은 쪼개지지 않은 HA 미숙 단백질의 G346에서 시작한다. 상기 번호에서 G346은 HA2 서열에서 G1이다.
바람직하기는 본 발명에 따른 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) SEQ ID NO:81의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:82의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:83의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
b) SEQ ID NO:87의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:88의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:89의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
c) SEQ ID NO:103의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:104의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:105의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
d) SEQ ID NO:109의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:110의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:111의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
e) SEQ ID NO:115의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:116의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:117의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
f) SEQ ID NO:121의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:122의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:123의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자;
g) SEQ ID NO:126의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:127의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:128의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
h) SEQ ID NO:132의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:133의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:134의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
i)SEQ ID NO:138의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:139의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:140의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
j) SEQ ID NO:144의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:145의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:146의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
k) SEQ ID NO:150의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:151의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:152의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
l) SEQ ID NO:156의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:157의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:158의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
m) SEQ ID NO:162의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:163의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:164의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
n) SEQ ID NO:168의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:169의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:170의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
o) SEQ ID NO:173의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:174의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:175의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자, 및
p) SEQ ID NO:179의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:180의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:181의 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 결합분자는 의약으로서 그리고 바람직하기는 인플루엔자 감염의 진단, 치료 및/또는 예방적 치료에 사용된다. 바람직하기는, 인플루엔자 감염을 일으키고 본 발명의 결합분자에 의해 처리될 수 있는 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H3N2이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 결합분자와 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 예방, 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명에 따른 결합분자의 용도에 관한 것이다. 이와 같은 감염은 작은 개체군에서 발생할 수 있지만, 또한 계절적 유행으로 전세계적으로, 또는 수백만의 개인이 위험한 전세계 유행병으로 확산될 수 있다.
본 발명은 계절적 유행병뿐만 아니라 잠재적인 전세계적 유행병을 야기하는 인플루엔자의 감염을 중화시킬 수 있는 결합분자를 제공한다. 중요한 것은, 본 발명의 결합분자가 서브타입 H3, H7 및 H10을 포함하는, 계통발생 그룹 2의 다양한 인플루엔자 서브타입을 교차-중화시킬 수 있다고 기재되었으므로, 이제 다양한 인플루엔자 서브타입과 관련하여 본 발명의 결합분자에 의해 보호 및 치료를 기대할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다:
a) SEQ ID NO:81의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:82의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:83의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:84의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:85의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:86의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
b) SEQ ID NO:87의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:88의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:89의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:90의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:91의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:92의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
c) SEQ ID NO:87의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:88의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:89의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:93의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:94의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:95의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
d) SEQ ID NO:87의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:88의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:89의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:936 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:97의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:98의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
e) SEQ ID NO:87의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:88의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:89의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:99의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:100의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:101의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
f) SEQ ID NO:87의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:88의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:89의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:85의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:86의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
g) SEQ ID NO:103의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:104의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:105의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:106의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:107의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:108의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
h) SEQ ID NO:109의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:110의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:111의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:112의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:113의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:114의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
i) SEQ ID NO:115의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:116의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:117의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:118의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:119의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:120의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
j) SEQ ID NO:121의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:122의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:123의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:124의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:119의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:125의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
k) SEQ ID NO:126의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:127의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:128의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:129의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:130의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:131의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
l)SEQ ID NO:132의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:133의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:134의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:135의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:136의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:137의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
m) SEQ ID NO:138의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:139의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:140의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:141의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:142의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:143의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
n) SEQ ID NO:144의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:145의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:146의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:147의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:148의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:149의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
o) SEQ ID NO:150의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:151의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:152의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:153의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:154의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:155의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
p) SEQ ID NO:156의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:157의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:158의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:159의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:160의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:161의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
q) SEQ ID NO:162의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:163의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:164의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:165의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:166의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:167의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
r)SEQ ID NO:168의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:169의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:170의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:171의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:172의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:137의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
s) SEQ ID NO:173의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:174의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:175의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:176의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:177의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:178의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자, 및
t) SEQ ID NO:179의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:180의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:181의 중사슬 CDR3 영역, SEQ ID NO:182의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:183의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:184의 아미노산 영역을 갖는 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자.
구체적인 구현예에서, 본 발명의 결합분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: SEQ ID NO:81의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:82의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:83의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자; SEQ ID NO:109의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:110의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:111의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자; SEQ ID NO:138의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:139의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:140의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자; SEQ ID NO:144의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:145의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:146의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자; 및 SEQ ID NO:173의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:174의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:175의 아미노산 서열을 갖는 중사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자.
본 발명의 결합분자의 CDR 영역을 표 1에 나타내었다. CDR 영역은 Sequences of Proteins of Immunological Interest에 기재된 바와 같이 Kabat 등 (1991)에 따랐다. 본 발명의 구현예에서, 결합분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은, CDR 영역을 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개 모두를 포함할 수 있다. 바람직하기는 본 발명에 따른 결합분자는 본 명세서에 기재된 CDR 중 적어도 2개를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 결합분자는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:74, 및 SEQ ID NO:78로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 중사슬 가변 영역을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명에 EKfms 결합분자는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, 및 SEQ ID NO:80로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변영역을 포함한다.
본 발명의 또 다른 면은 본 명세서에 기재된 바와 같은 결합분자의 기능적 변이체를 포함한다. 분자들은, 변이체가 "부모" 또는 "참조" 결합분자와 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 특이적으로 결합하는데 경쟁할 수 있다면, 다시 말하면, 기능적 변이체가 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편의 동일하거나 또는 오버래핑 에피토프에 여전히 결합할 수 있을 때, 본 발명에 따른 결합분자의 기능적 변이체로 간주된다. 본 출원서에서, "부모" 및 "참조"는 참조 또는 부모 분자, 또는 물리적 분자 자체의 정보가 변이체를 근거로 형성된다는 것과 같은 의미로 사용될 것이다. 바람직하기는, 기능적 변이체는 참조 결합 분자에 의해 특이적으로 결합하는 적어도 2개 (이상)의 다른 인플루엔자 바이러스 H3N2 균주 또는 그들의 단편에 특이적으로 결합하기 위해 경쟁할 수 있다. 더욱이, 분자들은, 이들이 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대해, 바람직하기는 부모 결합분자가 그것에 대해 중화 활성을 나타내는, 적어도 2개(이상)의 인플루엔자 바이러스 H3N2 균주에 대해 중화활성을 갖는다면, 본 발명에 따른 결합분자의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는, Fc 수용체 또는 이펙터 기능에 관여하는 다른 영역에서 변형이 있는 것, 및/또는 부모 결합분자에서는 발견되지 않는, 예를 들면 인 비트로 또는 인 비보 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품을 포함하여, 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체들을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 변형에는 무엇보다도, 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합, 가교, 이황화결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질분해, 인산화 등을 포함한다.
선택적으로 기능적 변이체는 부모 결합분자의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에 정의된 바와 같은 결합분자일 수 있다. 더우기, 기능적 변이체는 아미노 또는 카르복시 말단 어느 것 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체(truncation)를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 기능적 변이체는 부모 결합분자와 비교하여 동일하거나 다른, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 결합할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 기능적 변이체는 부모 결합 분자와 비교하여 인플루엔자 바이러스 H3n2 또는 그것의 단편에 대해 증가된 또는 감소된 결합 친화력을 가질 수 있다. 바람직하기는 골격구조, 초가변(hypervariable) 영역, 특히 CDR3 영역을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아닌 가변 영역의 아미노산 서열이 변형된다. 일반적으로, 경사슬 및 중사슬 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존 영역, 소위 골격 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하기 위한 기능적 변이체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 부모 결합 분자와, 적어도 약 50% ~ 약 99%, 바람직하기는 적어도 약 60% ~ 약 99%, 더욱 바람직하기는 적어도 약 70% ~ 약 99%, 더욱 바람직하기는 적어도 약 80% ~ 약 99%, 더욱 바람직하기는 약 90% ~ 약 99%, 특히 적어도 약 95% ~ 99%, 및 특히 적어도 약 97% ~ 약 99% 아미노산 서열 동질성을 갖는다. 컴퓨터 알고리즘, 무엇보다도 본 분야의 당업자들에게 알려진 Gap 또는 Bestfit를, 비교되어질 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 결합분자 또는 그것의 일부를, 오류가 많은 PCR, 올리고머뉴클레오티드-지향 돌연변이생성 및 부위-지향 돌연변이생성을 포함하는 공지의 일반 분자생물학적 방법에 의해 변화시킴으로써 얻을 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 구현예에서 본 발명의 기능적 변이체는 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대해 중화활성을 갖는다. 중화활성은 부모 결합분자와 비교하여 동일하거나 또는 더 높거나 낮을 수 있다. 지금까지, 용어 (인간) 결합분자가 사용되면, 이것은 또한 (인간) 결합분자의 기능적 변이체를 포함한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 면역컨쥬게이트, 즉 여기서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 결합 분자 또는 그것의 기능적 변이체를 포함하고 그리고 추가로, 무엇보다도 검출가능 모이어티/약제와 같은, 적어도 하나의 태그를 포함하는 분자를 포함한다. 또한, 본 발명에서 고려되는 것은 본 발명에 따른 면역컨쥬게이트의 혼합물 또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 면역 컨쥬게이트와 치료적 약제 또는 또 다른 결합 분자와 같은 다른 분자 또는 면역컨쥬게이트의 혼합물이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 태그를 포함할 수 있다. 이들 태그들은 동일하거나 또는 서로 구별할 수 있고 결합분자에 비-공유적으로 연결/컨쥬게이트 될 수 있다. 태그(들)은 또한 공유결합을 통해 인간 결합분자에 직접적으로 연결/컨쥬게이트될 수 있다. 선택적으로, 태그(들)은 하나 이상의 연결화합물에 의해 결합분자에 연결/컨쥬게이트될 수 있다. 태그를 결합분자에 컨쥬게이트하는 기술은 당업자들에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 면역컨쥬게이트의 태그는 치료약제일 수 있지만, 바람직하기는 이들은 검출가능한 모이어티/약제이다. 치료 및/또는 예방에 적합한 태그는 독소 또는 그것의 기능적 일부, 항체, 효소, 식균작용 또는 면역 자극을 강화하는 다른 결합분자일 수 있다. 검출가능한 약제를 포함하는 면역컨쥬게이트는 진단적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 개체가 인플루엔자 바이러스 H3N2에 의해 감염되었는지를 평가하거나 또는 임상적 시험과정의 일부로서 인플루엔자 바이러스 H3N2 감염의 전개 또는 진행을 모니터하기 위해, 예를 들면 제공된 치료 처방계획의 효율성을 결정하기 위해, 진단적으로 사용될 수 있다. 그러나, 이들은 또한 다른 검출 및/또는 분석 및/또는 진단목적을 위해 사용될 수 있다. 검출가능한 모이어티/약제는 효소, 보결분자단, 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성 물질, 양전자 방출금속, 및 비방사성 파라마그네틱 금속이온을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 검출 및/또는 분석 및/또는 진단 목적을 위해 결합분자를 라벨하는데 사용되는 태그는 특정 검출/분석/진단 기술 및/또는 사용되는 방법, 그중에서도 (조직)샘플의 면역조직화학적 염색, 유동세포계측법, 주사레이저세포계측법, 형광면역분석, 효소-연결 면역흡착제 분석(ELISA's), 방사면역분석(RIA's), 생검 (예를 들면 중화분석), 웨스턴 블로팅 응용법 등에 의존한다. 본 분야에 알려진 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법에 적합한 라벨은 당업자에게 알려져 있다.
더우기, 본 발명의 인간 결합분자 또는 면역컨쥬게이트는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이것은 특히 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편의 인 비트로 면역조사 또는 정제에 유용하다. 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비-평면일 수 있다. 본 발명의 결합분자는 정제를 용이하게 하는 펩티드와 같은, 마커 서열에 융합될 수 있다. 예를 들면, 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌(HA) 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 선택적으로 항체는 항체 헤테로컨쥬에이트를 형성하기 위해 제2 항체에 컨쥬게이트될 수 있다. 또 다른 면에서, 본 발명의 결합분자는 하나 이상의 항원에 컨쥬게이트/부착될 수 있다. 바람직하기는, 이들 항원은 결합분자-항원 컨쥬게이트가 투여될 개체의 면역시스템에 의해 인식되는 항원이다. 항원들은 동일할 수 있지만 서로 다를 수도 있다. 항원과 결합분자를 부착하기 위한 컨쥬게이션 방법은 분 분야에 알려져 있고, 가교제의 사용을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 결합분자는 인플루엔자 바이러스 H3N2에 결합되고 결합분자에 부착된 항원은 컨쥬게이트 상에 강력한 T-세포 공격을 개시할 것이고, 이것은 결국 인플루엔자 바이러스 H3N2의 파괴를 가져올 것이다.
예를 들면 링커를 통해 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이트에 의해 화학적으로 면역컨쥬게이트를 생성한 다음, 면역 컨쥬게이트는 본 발명의 결합분자와 적합한 태그를 포함하는 융합 단백질로서 생산될 수 있다. 융합단백질은 본 분야에 알려진 방법 예를 들면, 알맞은 태그를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 결합분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 구조화하고 그리고 나서 핵산분자를 발현함으로써 재조합적으로 생산될 수 있다.
본 발명의 또 다른 면은 적어도 본 발명에 따른 결합분자, 기능적 변이체 또는 면역 컨쥬게이트를 암호화하는 핵산분자를 제공하는 것이다. 이와 같은 핵산 분자는 클로닝 목적을 위한 중간체로서, 예를 들면 상기 친화성 성숙의 과정에 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산분자는 단리되거나 또는 정제된다.
당업자는 이들 핵산분자의 기능적 변이체가 본 발명의 일부로서 의도된다는 것을 이해할 것이다. 기능적 변이체는, 부모 핵산분자로부터 번역된 것과 동일한 아미노산 서열을 제공하기 위해, 표준 유전자코드를 사용하여 직접적으로 번역될 수 있는 핵산서열이다.
바람직하기는, 핵산분자는 상기와 같은 CDR 영역을 포함하는 결합분자를 암호화한다. 추가의 구현예에서, 핵산분자는 본 발명의 결합분자의 CDR 영역을 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 모두를 포함하는 결합분자를 암호화한다.
또 다른 구현예에서, 핵산분자는 상기와 같은 가변 중사슬을 포함하는 중사슬을 포함하는 결합분자를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 핵산분자는 상기와 같은 가변 경사슬을 포함하는 경사슬을 포함하는 결합분자를 암호화한다. 본 발명의 결합분자의 중사슬 및 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 아래에 제공한다.
본 발명의 다른 면은 벡터, 즉 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물을 제공하는 것이다. 벡터는 플라즈미드, 그중에서도 F, R1, RP1, Co1, pBR322, TOL, Ti 등; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, P1 P22, Qμ, T-even, T2, T4, T7 등과 같은 파아지; 식물 바이러스로부터 유래될 수 있다. 벡터는 본 발명의 결합분자의 클로닝 및/또는 발현에 사용될 수 있고 그리고 유전자 치료목적으로도 사용될 것이다. 하나 이상의 발현-조절 핵산분자에 작동적으로 연결된 본 발명에 따른 핵산분자를 하나 이상 포함하는 벡터는 또한 본 발명의 범위이다. 벡터의 선택은 다음의 재조합 과정과 사용되는 숙주에 따른다. 숙주세포로의 벡터의 도입은 무엇보다도, 인산칼슘 트란스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트란스펙션, 리포펙타민 트란스펙션 또는 전기영동법에 의해 수행될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제되거나 또는 그들이 집적되어 있는 염색체와 복제될 수 있다. 바람직하기는, 벡터는 하나 이상의 선택 마커를 함유한다. 마커의 선택은 선택된 숙주세포에 의존하며, 이것이 본 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 그들은 카나마이신, 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, 제오신, 헤르페스 단순 바이러스로부터의 티미딘 키나제 유전자(HSV-TK), 마우스로부터의 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자(dhfr)을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 인간 결합분자를 단리하는데 사용될 수 있는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산분자에 작동적으로 연결된 상기와 같은 결합분자를 암호화하는 하나 이상의 핵산분자를 포함하는 벡터는 또한 본 발명에 속한다. 이들 단백질 또는 펩티드는 글루타티온-S-트란스퍼라제, 말토스 결합 단백질, 금속-결합 폴리히스티딘, 녹색형광 단백질, 루시퍼라제 및 베타-갈락토시다제를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터의 하나 이상의 사본을 함유하는 숙주는 본 발명의 추가의 대상이다. 바람직하기는, 숙주는 숙주세포이다. 숙주세포는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세균성 기원의 세포를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 세균성 세포는 E. Coli 및 Pseudomonas 와 같은 Escherichia 속의 여러 종과 같은 그램-성 세균으로부터의 세포 또는 그램 음성 세균으로부터의 세포를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 균류 세포의 군에서 바람직하기는 이스트 세포가 사용된다. 이스트에서의 발현은 무엇보다도 Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae 및 Hansenula polymorpha와 같은 이스트 균주를 사용하여 얻어질 수 있다. 더우기, 초파리 및 Sf9의 세포와 같은 곤충 세포가 숙주 세포로 사용될 수 있다. 그 외에, 숙주세포는 산림식물과 같은 작물의 세포와 같은 식물 세포일 수 있고, 또는 곡물 또는 약용식물과 같은 음식 또는 원료를 제공하는 식물의 세포, 또는 관상용식물의 세포 또는 화초구근작물의 세포일 수 있다. 변형(유전자변형) 식물 또는 식물 세포는, 예를 들면 아그로박테리움-매개 유전자 전이, 잎 디스크의 변형, 폴리에틸렌 글리콜-유도 DNA 전이에 의한 원형질체 변형, 전기영동, 고주파분해, 현미주사 또는 볼리스틱 유전자 전이와 같은 공지의 방법에 의해 생산될 수 있다. 추가적으로, 알맞은 발현 시스템은 바쿨로바이러스 시스템일 수 있다. 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, BHK 세포 또는 바우스(Bowes) 흑색종 세포를 사용한 발현 시스템이 본 발명에 바람직하다. 포유동물 세포는 발현된 단백질에 포유동물 기원의 천연 분자와 거의 유사한 후번역 변형을 제공한다. 본 발명은 인간에게 투여될 수 있는 분자를 다루기 때문에, 완전 인간 발현 시스템이 특히 바람직할 것이다. 그러므로, 더욱 바람직하기는, 숙주 세포는 인간세포이다. 인간 세포의 예는 무엇보다도 HeLa, 911, AT1080, A549, 293 및 HEK293T 세포이다. 바람직한 구현예에서, 인간 프로듀서 세포는 발현 포멧에서 아데노바이러스 E1 영역을 암호화하는 핵산 서열의 적어도 기능적 일부를 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 인간 망막세포로부터 유래되고 European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain에 기탁번호 96022940으로 1996년 2월 29일자로 기탁되고 상표명 PER.C6®(PER.C6는 크루셀 홀란드 비.브이.의 등록상표이다)로 시판중인 세포 또는 911 세포와 같은 아데노바이러스 E1 서열을 포함하는 핵산으로 고정된다. 이 출원의 목적을 위해, "PER.C6"는 제96022940로 기탁된 세포 또는 원형종, 기탁된 세포의 원형종으로부터의 자손 뿐 아니라, 계대 상류 또는 하류 뿐 아니라, 상기의 유도체를 말한다. 숙주세포에서 재조합 단백질의 생산은 본 분야에 잘 알려진 방법에 따라 실시될 수 있다. 관심있는 단백질의 생산 플랫폼으로서 상표명 PER.C6®으로 시판중인 세포의 사용은 그 전체가 본 명세서에 참조로서 병합되어 있는 WO 00/63403에 기재되어 있다.
결합분자는 다양한 수단에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 결합분자의 생산방법은 본 발명의 추가적인 부분이다. 본 방법은 a)본 발명에 따른 숙주를 결합분자의 발현을 가져오는 조건하에서 배양하는 단계, 및 임의로 b) 발현된 결합 분자를 회수하는 단계를 포함한다. 발현된 결합분자는 세포 프리 추출물로부터 회수될 수 있지만, 바람직하기는 이들은 배지로부터 회수된다. 상기 생산방법은 본 발명의 결합분자 및/또는 면역컨쥬게이트의 기능적 변이체를 제조하는데도 사용될 수 있다. 세포 프리 추출물 또는 배지로부터 결합분자와 같은 단백질을 회수하는 방법은 본 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 방법으로 얻을 수 있는 결합분자, 기능적 변이체 및/또는 면역컨쥬게이트들은 또한 본 발명의 일부이다.
선택적으로, 숙주 세포와 같은 숙주에서의 발현에 이어서, 본 발명의 결합분자 및 면역컨쥬게이트가 통상의 펩티드 합성기에 의해 또는 본 발명에 따른 DNA 분자로부터 유래된 RNA 핵산분자를 사용한 세포-프리 번역 시스템에서 생산될 수 있다. 상기 합성생산법 또는 세포-프리 번역 시스템에 의해 얻을 수 있는 바와 같은 결합분자 및 면역컨쥬게이트는 또한 본 발명의 일부이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 인간 결합 분자는 유전자 변이, 비-인간 포유동물, 그 중에서도 토끼, 염소 또는 소와 같은 포유동물에서도 생산될 수 있고, 예를 들면 그것의 우유로 분비된다.
또 다른 선택적인 구현예에서, 본 발명에 따른 결합분자, 바람직하기는 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 특이적으로 결합된 인간 결합분자는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 유전자변이 마우스 또는 래빗과 같은 비-인간 포유동물의 유전자 변이에 의해 생성될 수 있다. 바람직하기는, 유전자 변이 비-인간 포유동물은 상기 인간 결합 분자의 전체 또는 일부를 암호화하는 인간 중사슬 트란스유전자와 인간 경사슬 트란스유전자를 포함하는 게놈을 갖는다. 유전자 변이 비-인간 포유동물은 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편의 정제된 또는 풍부한 제제로 면역화될 수 있다. 비-인간 포유동물을 면역화하기 위한 프로토콜은 본 분야에 잘 알려져 있다. 그 내용이 여기에 참조로서 기재된 Using Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by :E.Harlow, D. Lane(1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 및 Current Protocols in Immunology, Edited By:J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. margulies, E.M. Shevach, W. Strober(2001), John Wiley & Sons Inc., New York을 참조하라. 면역프로토콜은 종종 프로인트 완전 보조액과 프로인트 불완전 보조액과 같은 보조액을 갖거나 또는 갖지 않는 다중의 면역을 포함하지만, 또한 네이크된 DNA 면역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 인간 결합분자는 유전자도입 동물로부터 유래된 B-세포 또는 플라즈마 및/또는 메모리 세포에 의해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 인간 결합분자는 상기 유전자 변이 비-인간 동물로부터 얻어진 B 세포의 불멸화된 세포에의 융합에 의해 제조되는 하이브리도마에 의해 생산된다. 상기 유전자 변이 비-인간 포유동물로부터 얻을 수 있는 B 세포, 플라즈마 세포 및 하이브리도마와 상기 유전자 변이 비-인간 포유동물, B-세포, 플라즈마 및/또는 메모리세포 및 하이브리도마로부터 얻을 수 있는 인간 결합분자는 또한 본 발명의 일부이다.
추가의 면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합분자, 예를 들면, 구체적으로 인플루엔자 바이러스 H3N2에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그것의 단편인, 인간 결합분자와 같은 결합분자 또는 이와 같은 결합분자를 암호화하는 핵산분자를 동정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 복제가능한 유전자 패키지의 표면 상에서 결합분자의 수집물을, 결합이 수행되는 조건하에서, 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편과 접촉시키는 단계, (b) 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 결합된 복제가능한 유전 패키지에 대해 적어도 1회 선택하는 단계, (c) 인플루엔자 바이러스 H3N2에 결합하지 않은 복제가능한 유전 패키지로부터 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 결합된 복제가능한 유전 패키지를 분리하고 회수하는 단계로 이루어진다. 여기서 사용된 복제가능한 유전 패키지는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있고, 세포, 생식세포, 이스트, 세균, 바이러스, (박테리오)파아지, 리보솜 및 폴리솜을 포함한다. 바람직한 복제가능한 유전 패키지는 파아지이다. 예를 들면 단일 사슬 Fvs와 같은 결합분자는 복제가능한 유전 패키지 상에 나타나고, 즉 그들은 복제가능한 유전 패키지의 외표면에 위치하는 기 또는 분자에 부착된다. 복제가능한 유전 패키지는 결합분자를 암호화하는 핵산 분자에 연결된다고 스크리닝될 수 있는 결합분자를 포함하는 검사가능 유니트이다. 핵산 분자는 인비보(예를 들면, 벡터로서) 또는 인비트로(예를 들면, PCR, 전사 및 번역에 의해)에서 복제가능하다. 인비보 복제는 숙주 인자의 도움으로(바이러스의 경우) 또는 숙주와 헬퍼 바이러스의 도움으로 (플라즈미드의 경우) 독립적(세포의 경우)일 수 있다. 결합 분자의 수집물을 나타내는 복제가능한 유전 패키지는, 복제가능한 유전 패키지의 외표면으로부터 일반적으로 발현되는 내인성 단백질을 갖는 융합 단백질을 형성하기 위해, 나타내어질 외인성 결합분자를 암호화하는 핵산 분자를 복제가능한 유전 패키지에 도입함으로써 형성된다. 융합 단백질의 발현, 외표면으로의 이동 및 조립체는 복제가능한 유전 패키지의 외표면으로부터 외인성 결합 분자를 나타낸다.
본 발명에 따른 방법에서 선택 단계(들)는 살아있고 여전히 감염성이거나 불활성된 인플루엔자 바이러스 H3N2으로 수행될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 H3N2의 불활성화는 당업자에게 잘 알려져 있는 포르말린, β-프로피오락톤(BPL), 메티올레이트 및/또는 자외선으로 처리와 같은 방법으로 수행될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 H3N2가 여전히 살아있고, 감염성 및/생육력이고 또는 부분적으로 또는 완전히 불활성인가를 시험하는 방법은 본 분야의 당업자에게 알려져 있다. 상기 방법에 사용된 인플루엔자 바이러스 H3N2는 비-단리된 것일 수 있고, 예를 들면 감염된 개개인의 혈청 및/또는 혈액에 존재할 수 있다. 사용된 인플루엔자 바이러스 H3N2는 적합한 매질에서 세포 배양물로부터 단리될 수 있다.
한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 H3N2는 복재가능한 유전자 패키지와 접촉할 때 현탁액 상태이다. 선택적으로 이들은 또한 접촉이 일어날 때 캐리어에 결합될 수 있다. 한 구현예에서, 첫번째 및 추가의 선택은 동일한 클레이드의 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대해 일어날 수 있다. 선택적으로, 처음 및 이후의 선택 라운드는 다른 클레이드의 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대해 수행될 수 있다(예를 들면, 첫번째 선택은 클레이드 1 균주에서 그리고 두번째 선택은 클레이드 2 또는 3 균주에서). 선택적으로, 선택 단계(들)은 예를 들면 세포막 제제, 재조합 H3N2 단백질 또는 폴리펩티드, H3N2 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 재조합 H3N2 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 세포 등과 같은 인플루엔자 바이러스 H3N2의 단편의 존재하에 수행될 수 있다. 이들 단백질 또는 폴리펩티드의 세포외적으로 노출된 부분은 선택 재료로서 사용될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 H3N2의 단편은 사용 전에 적절한 재료에 고정화되거나 또는 현탁액 상태로 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 선택은 인플루엔자 바이러스 H3N2의 다양한 단편 또는 다른 인플루엔자 바이러스 H3N2 균주의 단편 상에서 수행될 수 있다. 적합한 선택 조합을 찾는 것은 당업자의 범위 내이다. 선택은 ELISA 또는 FACS에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 추가의 면에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 H3N2 균주 또는 그것의 단편에 특이적으로 결합하는 결합분자 또는 이와 같은 결합분자를 암호화하는 핵산 분자를 얻는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 a) 결합분자를 동정하는 상기 방법을 수행하는 단계, 및 b) 회수된 복제가능한 유전 패키지로부터 상기 결합분자 및/또는 상기 결합분자를 암호화하는 핵산 분자를 단리하는 단계를 포함한다. 복제가능한 유전 패키지의 표면상의 결합분자의 수집물은 scFvs 또는 Fabs의 수집물일 수 있다. 일단 새로운 scFv 또는 Fab이 결합분자 또는 상기 결합분자를 암호화하는 핵산 분자를 동정하는 상기 방법으로 확립되거나 또는 동정되면, scFv 또는 Fab를 암호화하는 DNA는 세균 또는 파아지로부터 단리되고 원하는 특이성 (예를 들면, IgG, IgA 또는 IgM)을 갖는 scFvs, 이가 scFvs, Fabs 또는 완전 인간 면역글로불린을 암호화하는 구조물을 만들기 위해 표준 분자 생물학적 기술로 결합할 수 있다. 이들 구조물은 적절한 세포주로 트란스펙트될 수 있고 완전 인간 모노클로날 항체들이 생산될 수 있다(HuIs et al., 1999; Boel et al., 2000 참조).
위에서 언급한 바와 같이, 바람직한 복제가능한 유전 패키지는 파아지이다. (인간) 결합 분자, 예를 들면 (인간) 모노클로날 항체를 동정하고 얻기 위한 파아지 디스플레이법은, 본 분야의 당업자에 의해 알려진 잘-확립된 방법이다. 이들은 미국특허 제5,696,108호; Burton and Barbas, 1994; de Kruif et al, 1995b; 및 Phage Display: A Laboratory Manual. Edited by: CF Barbas, DR Burton, JK Scott and GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York에 기재되어 있다. 이들 참조 모두는 본 명세서에 참조로서 병합되어 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리의 구성을 위해, 인간 모노클로날 항체 중 및 경사슬 가시영역 유전자의 수집물은 박테리오파아지, 바람직하기는 필라멘트성 박테리오파아지, 입자, 예를 들면 단일-사슬 Fv(scFv) 또는 Fab 포멧(de Kruif et al., 1995b)의 표면에 발현된다. 항체 단편-발현 파아지의 큰 라이브러리는 통상적으로 1.0×109 항체 특이성을 함유하고 면역화된- 또는 비-면역화된 개인의 B 림프구에서 발현되는 면역글로불린 V-영역으로부터 조립될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 결합분자의 파아지 라이브러리, 바람직하기는 scFv 파아지 라이브러리는 세균에 대해 백신화되었던, 최근 백신화된 또는 급성 세균 감염, 예를 들면 H3N2 감염된, 또는 건강한 개인으로부터 얻어진 세포로부터 단리된 RNA로부터 제조된다. RNA는 그중에서도, 골수 또는 말초혈액으로부터, 바람직하기는 말초혈액 림프구 또는 단리된 B-세포 또는 CD24+/CD27+ B-세포로 동정된, 메모리 B-세포와 같은 B-세포의 서부개체군으로부터 단리될 수 있다. 개체는 동물일 수 있고 바람직하기는 인간이다. 바람직한 구현예에서, 라이브러리는, IgM+/CD24+/CD27+ 세포로 동정된, IgM 메모리 B-세포에 의해 발현되는 면역글로불린 V-영역으로부터 조립될 수 있다.
선택적으로, 파아지 디스플레이 라이브러리는 라이브러리에 추가의 항체 다양성을 도입하기 위해 부분적으로 인 비트로 조립된 면역글로불린 가변 영역으로부터 구성될 수 있다(세미-합성 라이브러리). 예를 들면, 인 비트로 조립된 가변 영역은 항체 특이성에 중요한 분자의 이들 영역, 예를 들면 CDR 영역에서 합성적으로 생산된, 무작위의 또는 부분적으로 무작위의 DNA의 확장을 함유한다. 인플루엔자 바이러스 H3N2와 같은 세균에 대한 특이 파아지 항체는, 세균에 또는 그것의 재료에 노출시켜 세균 또는 그것의 재료에 특이한 항체-단편을 발현하는 파아지의 결합을 허용하도록 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 비-결합된 파아지는 세척에 의해 제거되고 결합된 파아지는 E. coli 세균의 감염에 대해 용출되고 이어서 번식된다. 세균 또는 그들의 재료에 특이적으로 결합하는 파아지를 충분히 풍부하도록 하기 위해 통상적으로 복수 개의 선택과 번식 라운드가 요구된다. 필요하다면, 파아지 라이브러리를 세균 또는 그것의 재료에 노출시키기 전에, 우선 파아지 라이브러리를 예를 들면, 비-H3N2 인플루엔자 바이러스와 같은, 다른 균주의 바이러스 또는 그것의 단편과 같은 비-표적 재료에 노출시킴에 의해 파아지 라이브러리를 제거한다. 이들 제거된 세균 또는 그들의 단편은 고형상에 결합되거나 또는 현탁물 중에 있을 수 있다. 파아지는 다른 재료로 임의로 보충되는 H3N2 단백질 또는 (폴리)펩티드의 복합 혼합물과 같은 복합물 항원에 결합되도록 선택될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 H3N2와 같은 하나 이상의 단백질 또는 (폴리) 펩티드를 발현하는 숙주 세포가 선택 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들 숙주세포를 사용한 파아지 디스플레이법은, 표적 분자 또는 표적과 유사하지만 동일하지 않은 비-표적 분자를 함유하지 않는 다량의 숙주세포의 첨가에 의해 스크리닝 동안 비-관련 바인더를 제거하고, 그것에 의해 관련 결합 분자를 찾을 확률을 크게 높임으로써 확장되고 개선될 수 있다. 물론 이 제거는 세균성 유기체 또는 그것의 재료로 스크리닝하기 전, 동안, 또는 후에 수행될 수 있다. 이 과정을 MABSTRACTTM 법이라 부른다(MABSTRACTTM법은 크루셀 홀란드 비.브이.의 계류중인 상표명이다. 또한, 여기에 참조로서 병합된 미국특허 제6,265,150를 참조).
또 다른 면에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대해 잠재적으로 중화활성을 갖는 결합분자를 얻는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 (a) 상기와 같은 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자 또는 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 특이적으로 결합하는 결합분자를 얻기 위한 방법을 수행하는 단계, 및 (b) 단리된 결합분자가 바이러스에 대해, 바람직하기는 A/Hong Kong/1/68, A/Johannesburg/33/94, A/Panama/2007/99, A/Wisconsin/67/2005 및 A/Hiroshima/52/2005 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 H3N2, 바람직하기는 모든 H3N2 균주, 특히 바람직하기는 모든 공지의 그리고 미래의 H3N2 균주에 대해 중화활성을 갖는가를 확인하는 단계를 포함한다. 결합분자가 중화활성을 갖는가를 확인하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다(WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: World Health Organisation, 2005 version 2002.5 참조).
추가의 면에서, 본 발명은 적어도, 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A에 대해 중화활성을 갖는 인간 결합분자에 관한 것이다.
또 다른 추가의 면에서, 본 발명은 적어도 하나의 결합분자 바람직하기는 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체, 적어도 그들의 기능적 변이체, 적어도 본 발명에 따른 면역컨쥬게이트 및/또는 그들의 조합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 이에 더하여 조성물은 그중에서도, 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 안정화 분자 또는 염을 포함할 수 있다. 바람직하기는, 사용된 염은 결합분자의 원하는 생리활성을 유지하고 원하지 않는 독물학적 효과를 제공하지 않는 염이다. 필요에 따라, 본 발명의 인간 결합분자는 결합분자를 불활성화할 수 있는 산의 작용 또는 다른 천연 또는 비천연 조건으로부터 그들을 보호하기 위해 결합분자에 또는 그 위에 코팅될 수 있다.
또 다른 추가의 면에서, 본 발명은 본 발명에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 핵산분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 염(예를 들면, NaCl 또는 상기와 같은 염), 세척제(예를 들면, SDS) 및/또는 다른 적절한 성분을 함유하는 수용액과 같은 수용액을 포함할 수 있다.
더우기, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 인간 결합분자와 같은 결합분자(또는 그것의 단편 또는 변이체), 적어도 하나의 본 발명에 따른 면역컨쥬게이트, 적어도 하나의 본 발명에 따른 조성물 또는 그들의 조합을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 추가로 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 다른 치료제를 더욱 포함할 수 있다. 적합한 약제는 또한 본 분야에 잘 알려져 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 결합분자를 포함하고, 즉 약제학적 조성물은 결합분자들의 칵테일 또는 혼합물일 수 있다. 약제학적 조성물은 적어도 두 개의 본 발명에 따른 결합분자, 또는 적어도 하나의 본 발명에 따른 결합분자 및 추가로 적어도 하나의 분자에 결합하고 및/또는 중화시키는 인플루엔자 바이러스를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 추가의 결합분자는 동시에 개별적으로 또는 순차적으로 투여되도록 제제화될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 H3N2와 같은, H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A에 대한 중화활성을 갖는 두 개 이상의 결합분자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 결합분자는 조합물로 사용될 때 상승작용에 의한 중화활성을 나타낸다. 다시 말하면, 조성물은 중화활성을 갖는 적어도 두 개의 결합분자를 포함하고, 결합분자는 인플루엔자 바이러스 H3N2를 상승작용에 의해 중화하는 작용을 하는 것을 특징으로 한다. 여기에 사용된 바에 따르면, 용어 "상승작용에 의해"는 결합분자의 결합 효과가 조합물로 사용하였을 때 개별적으로 사용할 때보다 그들의 추가적 효과가 더 큰 것을 의미한다. 상승작용에 의해 작용하는 결합분자는 인플루엔자 바이러스 H3N2와 같거나 다른 단편 위의 다양한 구조에 결합될 수 있다. 상승작용을 계산하는 방법은 복합 인덱스에 의한다. 조합 인덱스(CI)의 개념은 Chou 및 Talalay(1984)에 의해 기재된다. 조성물은 또한 중화활성을 갖는 하나의 결합분자와 비-중화 H3N2 특이의 하나의 결합분자를 포함할 수 있다. 비-중화 및 중화 H3N2-특이 결합분자는 또한 인플루엔자 바이러스 H3N2의 중화에 상승적으로 작용할 것이다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 두 개의 인플루엔자 바이러스 중화 결합분자를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 결합분자는 계통적 그룹 1의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 서브타입을 중화시킬 수 있고 그리고 여기서 적어도 하나의 결합분자는 계통적 그룹 2의 인플루엔자 바이러스 서브타입을 중화시킬 수 있다.
한 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 결합분자 및 적어도 하나의, 추가의 인플루엔자 바이러스 중화 결합분자를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 추가의 인플루엔자 바이러스 중화 결합분자는, WO 2008/028946에 기재된 바와 같은 결합분자와 같이, 다른 서브타입의 인플루엔자 바이러스, 바람직하기는 H1N1과 같은 H1의 HA 및/또는 H5N1과 같은, H5 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 결합하고 그리고 중화시킬 수 있다. 더욱 바람직하기는, 상기 추가의 결합분자는 H1, H2, H5, H9을 포함하여, 계통적 그룹 1의 (모든) 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 교차-중화 결합분자이다. 바람직한 구현예에서, 추가의 결합분자는, SEQ ID NO:186의 아미노산 서열의 아미노산 1-121을 포함하는 중사슬 가변 영역, 또는 그것의 기능적 변이체, 및/또는 SEQ ID NO: 188의 아미노산 1-112를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하는, WO 2008/028946에서 CR6261로 동정된 결합분자이다. 또 다른 구현예에서, 결합분자는 각각 SEQ ID NO: 186과 SEQ ID NO:188의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 및 경사슬을 포함한다. 그러므로 약제학적 조성물 중의 결합분자는 바람직하기는 다양한 서브타이브이 인플루엔자 바이러스와 반응할 수 있다. 결합분자는 높은 친화성을 가져야 하고 그리고 광범위한 특이성을 가져야 한다. 바람직하기는 둘 다의 결합분자는 그들이 다른 서브타입의 인플루엔자 바이러스를 각각 중화시키는 교차-중화 분자이다. 이에 더하여, 바람직하기는 이들은 가능한 한 다른 인플루엔자 바이러스 서브타입의 각각의 균주를 중화시킨다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제, 예방제 및/또는 진단제를 포함할 수 있다. 바람직하기는, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 예방제 및/또는 치료제를 포함한다. 바람직하기는, 상기 추가의 치료 및/또는 예방 약제는 인플루엔자 바이러스 H3N2 감염 및/또는 이와 같은 감염에 의한 병태를 예방 및/또는 치료할 수 있는 약제이다. 치료 및/또는 예방 약제는 항-바이러스 약제를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 약제는 결합분자, 소분자, 유기 또는 무기 화합물, 효소, 폴리뉴클레오티드 서열, 항-바이러스성 펩티드 등 일 수 있다. 인플루엔자 바이러스 H3N2로 감염된 환자를 치료하는데 현재 사용되는 다른 약제는 M2 억제제(예를 들면, 아만티딘, 리만타딘) 및/또는 뉴라미니다제 억제제(예를 들면, 자나미비르, 오셀타미비르)이다. 이들은 본 발명의 결합분자와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "조합하여"는 별개의 제제로서 동시에, 또는 하나의 단일의 조합된 제제로서, 또는 어느 순서로, 별개의 제제로서 순차적 투여 처방에 따르는 것을 의미한다. 인플루엔자 바이러스 H3N2에 의한 감염 및/또는 이와 같은 감염으로부터 생긴 병태를 예방 및/또는 치료할 수 있는, 실험기간 중인 약제가 본 발명에 유용한 치료적 및/또는 예방 약제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 결합분자 또는 약제학적 조성물은 인간에게 사용되기에 앞서 적절한 동물 모델 시스템에서 시험될 수 있다. 이와 같은 동물 모델 시스템은 마우스, 흰담비 및 원숭이를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
통상적으로, 약제학적 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 무균이며 안정하다. 본 발명의 결합분자, 면역컨쥬게이트, 핵산분자 또는 조성물은 전달시 또는 전달 전에 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 재구성을 위해 분말 형태로 존재할 수 있다. 살균성 주사용액의 제조를 위한 살균분말의 경우, 바람직한 제조방법은 활성 구성성분의 분말과 그것의 미리 살균-여과된 용액으로부터의 추가의 원하는 구성성분을 생산하는 진공건조 및 냉동-건조(냉동건조)이다.
선택적으로, 본 발명의 결합분자, 면역컨쥬게이트, 핵산 분자 또는 조성물은 용액상태일 수 있고, 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제가 단위 투여량 주사형을 제공하기 위해 전달되기 전 또는 전달시에 첨가 및/또는 혼합될 수 있다. 바람직하기는, 본 발명에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 부형제는 고 약물농도에 알맞고, 알맞은 흐름성을 유지할 수 있고, 필요에 따라 흡수가 지연될 수 있다.
약제학적 조성물의 투여의 최적 경로의 선택은 조성물 내의 활성 분자들의 물리-화학적 특성, 임상적 상황의 긴급성 및 원하는 치료적 효과에 대한 활성분자의 플라즈마 농도의 관계를 포함하는 여러 인자들에 의해 영향을 받는다. 예를 들면, 본 발명의 결합분자는 필요에 따라, 임플란트, 피부에 바르는 패치, 및 마이크로캡슐화 전달시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같은 그들의 신속한 방출을 막는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 또한, 결합분자는 인간 결합분자의 불활성화를 막는 물질 또는 화합물로 코팅되거나 또는 함께 투여되는 것이 필요할 수 있다. 예를 들면, 결합분자는 적절한 담체에서, 예를 들면 리포좀 또는 희석제에서 개체로 투여될 수 있다.
투여경로는 2개의 주요 카테고리, 경구 및 비경구로 나뉠 수 있다. 바람직한 투여 경로는 정맥내이다.
경구 투여형태는 그중에서도 정제, 트로키제, 약용 드롭스제, 수성 또는 유성 현택제, 산제 또는 분산과립제, 에멀션제, 강성 캡슐제, 연성 젤라틴 캡슐제, 시럽제 또는 엘릭서제, 필제, 당의정, 액제, 겔제, 또는 슬러리제로서 제제화될 수 있다. 이들 제형은 불활성 희석제, 과립화 또는 붕해제, 결합제, 광택제, 보존제, 착색제, 풍미제 또는 감미제, 식물성유 또는 미네랄유, 습윤제, 및 점증제를 함유하는 약제학적 부형제를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구적 투여용으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 그중에서도, 수성 또는 비-수성 등장성 살균 비-독성 주사 또는 주입 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 용액 또는 현택액은 적용된 투여량 및 농도에서 수용체에 비독성인 1,3-부탄디올, 링거스 용액, 행크스용액, 등장성 염화나트륨 용액과 같은 약제, 오일, 지방산, 국소마취제, 보존제, 완충액, 점도 또는 용해도 증가제, 수용성 항산화제, 유용성 항산화제, 및 금속 킬레이트화제를 포함할 수 있다.
추가의 면에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 (그것의 기능적 단편 및 변이체)와 같은 결합분자, 면역 컨쥬게이트, 조성물 또는 약제학적 조성물은 의약으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 결합분자, 면역컨쥬게이트, 조성물 또는 약제학적 조성물을 사용한 인플루엔자 바이러스 H3N2 감염의 치료 및/또는 예방법은 본 발명의 또 다른 부분이다. 상기 분자는 무엇보다도 인플루엔자 바이러스 H3N2 감염의 진단, 예방, 치료 또는 그것의 조합을 위해 사용될 수 있다. 이들은 인플루엔자 바이러스 H3N2에 감염된 비처리 환자 및 인플루엔자 바이러스 H3N2에 감염된 또는 그것에 대해 치료된 환자의 치료에 알맞다.
상기 분자 또는 조성물은 진단, 예방 및/또는 치료에 유용한 다른 분자들과 함께 적용될 수 있다. 이들은 인비트로, 엑스비트로 또는 인비보에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 인간 모노클로날 항체(또는 그것의 기능적 변이체)와 같은 결합분자, 면역컨쥬게이트, 조성물 또는 약제학적 조성물은 (이용가능하다면) 인플루엔자 바이러스 H3N2에 대한 백신과 함께 투여될 수 있다. 선택적으로, 백신은 또한 본 발명의 분자를 투여하기 전 또는 후에 투여될 수 있다. 백신 대신, 항균제가 본 발명의 결합분자와 함께 적용될 수 있다. 적합한 항균제는 상기와 같다.
분자는 통상적으로 치료적으로 또는 진단학적으로 유효한 양으로 본 발명의 조성물과 약제학적 조성물에서 제형화된다. 선택적으로, 그들은 개별적으로 제형화되고 투여될 수 있다. 예를 들면, 항-바이러스 약제와 같은 다른 분자가 전신에 적용되고, 반면 본 발명의 결합분자는 정맥내 적용될 수 있다.
치료는 H3N2 감염된 환자군을 표적으로 할 수 있다. 이와 같은 환자의 군은 성인 (예를 들면, 50세 초과, 60세 초과, 및 바람직하기는 65세 초과) 및 어린이(예를 들면 5세 미만, 1세 이하), 입원환자 및 항바이러스 화합물로 치료받았지만 불충분한 항바이러스 반응을 나타내는 환자의 군을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
투여량 처방은 원하는 최적 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다. 알맞은 투여량 범위는 예를 들면, 0.1~100 mg/kg(체중)이고, 바람직하기는 1~50 mg/kg(체중), 바람직하기는 0.5~15 mg/kg(체중) 일 수 있다. 더우기 예를 들면, 단일의 큰 알약이 제공되는 경우 몇 개로 나누어진 투여량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있고 또는 투여량은 치료적 상황의 긴급사태에 의해 나타나는 바에 따라 비례적으로 감소 또는 증가 될 수 있다. 본 발명에 따른 분자 및 조성물은 바람직하기는 살균된다. 이들 분자들과 조성물을 살균하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. 진단, 예방 및/또는 치료에 유용한 다른 분자는 본 발명의 결합분자에 제안되는 유사한 투여량 처방계획으로 투여될 수 있다. 다른 분자들이 개별적으로 투여된다면, 이들은 개체에게 하나 이상의 본 발명의 결합 분자 또는 약제학적 조성물의 투여 전(예를 들면, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 4주 또는 6주), 동시에, 또는 이후에 (예를 들면, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 4주 또는 6주 후)에 투여될 수 있다. 정확한 투여량 처방계획은 보통 인간 환자에서의 임상시험 동안 가려진다.
인간결합분자와, 인간결합분자를 포함하는 약제학적 조성물은, 투여된 항체에 대한 수용체 면역반응이 실질적으로 모노클로날 뮤린(murine), 키메릭 또는 인간화된 결합분자의 투여에 의해 발생하는 것보다 실질적으로 덜하므로, 인간에게 인 비보 치료제로서 투여될 때 특히 유용하고, 종종 바람직하다.
또 다른 면에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 H3N2 감염의 진단, 예방, 치료 또는 그들의 조합을 위한 의약의 제조에서의 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체(그것의 기능적 단편 및 변이체)를 중화시키는 결합분자, 면역 컨쥬게이트, 핵산분자, 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
그 다음, 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체 (그것의 기능적 단편 및 변이체)를 중화시키는 적어도 하나의 결합분자, 적어도 하나의 면역 컨쥬게이트, 적어도 하나의 핵산분자, 적어도 하나의 조성물, 적어도 하나의 약제학적 조성물, 적어도 하나의 벡터, 적어도 하나의 숙주 또는 그들의 조합물을 포함하는 키트는 또한 본 발명의 일부이다. 임의로 본 발명의 키트의 상기 성분들은 표시된 병태의 진단, 예방 및/또는 치료를 위해 알맞은 용기에 포장되고 라벨을 붙일 수 있다. 상기 성분들은 유니트 또는 다중-용량 용기, 예를 들면, 바람직하기는 멸균된 수용액으로서 또는 재구성을 위해 냉동건조된, 바람직하기는 멸균된 제형으로 저장될 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있고 멸균 통로구멍을 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하주사기용 바늘이 꽂힐 수 있는 마개를 갖는 정맥 용액 주머니 또는 바이알 일 수 있다). 키트는 추가로 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 용기를 포함한다. 이것은 추가로 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 하나 이상의 알맞은 숙주용 배지 그리고 가능하기는 적어도 하나의 다른 치료제, 예방제 또는 진단제를 포함하는 시판 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 포함할 수 있다. 키트와 관련한 것은 치료적, 예방적, 또는 진단적 제품의 시판 패키지에 관습적으로 포함되는 구성물로, 즉, 예를 들면, 치료적, 예방적, 또는 진단적 제품의 사용에 관한 증상, 사용법, 투여량, 제조사, 투여, 부작용에 대한 정보 및/또는 이와 같은 치료적, 예방적 또는 진단적 제품의 사용에 대한 경고를 포함한다.
본 발명에 따른 결합분자는 계통발생적 그룹 2 서브타입 인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 인 비트로 방법에서 진단제로서 유리하게 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 추가로 샘플에서 인플루엔자 바이러스 계통발생적 그룹 2 서브타입 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 (a) 샘플을 진단적으로 효과적인 양의, 본 발명에 따른 결합분자(그것의 기능적 단편 및 변이체) 또는 면역컨쥬게이트와 접촉시키는 단계, 및 (b) 결합분자 또는 면역 컨쥬게이트가 특이적으로 샘플의 분자에 결합하는가를 결정하는 단계를 포함한다. 샘플은, 혈액, 혈청, 대변, 가래, 비인후흡입액, 기관지 세척제, 뇨, 조직 또는 다른 (잠재적으로)감염된 개체의 생리적 물질을 포함하는 생리적 샘플, 또는 물, 음료 등과 같은 비생리적 샘플일 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. (잠재적으로) 감염된 개체는 인간 환자일 수 있지만, 또한 인플루엔자 바이러스 계통적 그룹 2 서브타입 인플루엔자 바이러스의 전달자라고 추측되는 동물이 본 발명의 인간 결합분자 또는 면역컨쥬게이트를 사용하여 바이러스의 존재에 대해 시험될 수 있다. 샘플은 우선 검출방법에 더욱 알맞도록 조작될 수 있다. 조작은 바이러스를 함유하고 있다고 추측되는 및/또는 함유하는 샘플을, 상기 유기체가 단백질, (폴리)펩티드 또는 다른 항원 단편과 같은 항원성 성분들로 분해되도록 하는 방법으로 처리하는 것을 의미한다. 바람직하기는, 본 발명의 인간 결합분자 또는 면역컨쥬게이트는, 인간 결합분자와 바이러스 또는 그것의 항원성 성분들간의 면역 복합체의 형성을 허용하는 조건하에서 샘플과 접촉한다. 샘플 중에 바이러스의 존재를 나타내는 면역학상의 복합체의 형성은 알맞은 방법에 의해 검출되고 측정된다. 이와 같은 방법은, 무엇보다도, 방사면역측정법(RIA), ELISA, 면역형광법, 면역세포화학, FACS, BIACORE 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 균질 및 이종성 결합면역분석을 포함한다.
바람직한 분석법, 특히 환자 혈청 및 혈액과 혈액-유도 산물의 대규모 임상 스크리닝을 위한 분석법은 ELISA 및 웨스턴 블롯법이다. ELISA 시험이 특히 바람직하다. 이들 분석에서 시약으로 사용하기 위해, 본 발명의 결합분자 또는 면역컨쥬게이트는 통상적으로 미세역가 웰의 내부표면에 결합된다. 본 발명의 결합분자 또는 면역컨쥬게이트는 미세역가 웰에 직접 결합된다. 그러나, 본 발명의 결합분자 또는 면역컨쥬게이트의 웰에 대한 최대 결합은 본 발명의 결합분자 또는 면역컨쥬게이트의 첨가 전에 웰을 폴리라이신으로 예비처리하는 것에 의해 수행된다. 더우기, 본 발명의 결합분자 또는 면역컨쥬게이트는 공지의 수단에 의해 웰에 공유결합적으로 결합 될 수 있다. 일반적으로 본 발명의 결합분자 또는 면역컨쥬게이트는 더 높거나 낮은 양으로 사용될 수 있지만, 코팅을 위해 0.01~100㎍/㎖의 농도로 사용된다. 그리고 나서 샘플을 본 발명의 결합분자 또는 면역컨쥬게이트로 코팅된 웰에 첨가한다.
또한, 본 발명의 결합분자는 인플루엔자 바이러스 H3N2의 특이 결합 구조를 동정하는데 사용될 수 있다. 결합구조는 단백질 및/또는 폴리펩티드 상의 에피토프일 수 있다. 그들은 선형일 수 있지만, 또한 구조적 및/또는 형태적일 수 있다. 한 구현예에서, 결합구조는 PEPSCAN 분석 수단에 의해 분석될 수 있다 (그 중에서도, WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al. 1996 참조). 선택적으로, 인플루엔자 바이러스 H3N2 단백질의 펩티드를 포함하는 랜덤 펩티드 라이브러리는 본 발명의 결합분자에 결합할 수 있는 펩티드를 스크리닝할 수 있다. 발견된 결합구조물/펩티드/에피토프는 인플루엔자 바이러스 H3N2 감염의 백신으로 및 진단용으로 사용될 수 있다. 단백질 및/또는 폴리펩티드 이외의 단편이 결합분자와 결합된 경우, 결합 구조물은 질량스펙트럼, 고성능 액체 크로마토그래피 및 핵자기 공명으로 동정될 수 있다.
추가의 면에서, 본 발명은 본 발명의 인간 결합분자에 의해 결합된 에피토프와 같이, 인플루엔자 바이러스 H3N2의 동일한 에피토프에의 특이 결합을 위한 결합분자(또는 그것의 기능적 단편 또는 변이체)를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 a) 스크리닝될 결합분자, 본 발명의 결합분자 및 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편을 접촉하는 단계, b) 스크리닝될 결합분자가 본 발명의 결합분자와, 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편과의 특이적 결합에 대해 경쟁할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함한다. 추가의 단계에서, 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 특이적으로 결합하기 위해 경쟁할 수 있는 스크린된 결합분자가 중화활성을 갖는가를 측정할 수 있다. 본 발명의 결합분자와, 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편에 특이적으로 결합하기 위해 경쟁할 수 있는 결합분자는 본 발명의 또 다른 부분이다. 상기 스크리닝법에서, "동일한 에피토프에 대한 특이적 결합"은 또한 본 발명의 결합분자에 의해 결합된 에피토프와 실질적으로 또는 필수적으로 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 말한다. 본 발명의 결합분자가 인플루엔자 바이러스 H3N2에 결합하는 것을 블록하거나 경쟁할 수 있는 능력은 통상적으로 스크리닝될 결합분자가 본 발명의 결합분자에 의해 면역특이적으로 인식되는 인플루엔자 바이러스 H3N2의 결합부위와 실질적으로 오버랩하는 인플루엔자 바이러스 H3N2 상의 결합부위 또는 에피토프와 결합한다는 것을 나타낸다. 선택적으로, 이것은 스크리닝될 결합분자가 에피토프 또는 본 발명의 결합분자에 의해 면역특이적으로 인식되는 결합부위에 충분히 근접한 결합부위에 입체구조적으로 결합하거나 그렇지 않으면 본 발명의 결합분자가 인플루엔자 바이러스 H3N2에 결합하는 것을 억제한다는 것을 나타낼 수 있다.
일반적으로, 경쟁적 저해를 분석에 의해 측정하고, 여기서 항원 조성물, 즉 인플루엔자 바이러스 H3N2 또는 그것의 단편을 포함하는 조성물은 참조결합분자, 즉, 본 발명의 결합분자, 그리고 스크리닝될 결합분자와 혼합된다. 보통 스크리닝될 결합분자는 과량으로 존재한다. ELISA 및 웨스턴 블롯을 기준으로 하는 프로토콜이 이와 같은 단순 경쟁 연구에 사용하기에 알맞다. 종 또는 이소타입 2차 항체를 사용하여 오직 결합된 참조결합분자만을 검출할 수 있고, 그것의 결합은 실질적으로 동일한 에피토프를 인식하는 스크리닝 될 결합분자의 존재에 의해 감소될 것이다. 참조 결합분자와 스크리닝 될 어느 결합분자 간의 (종 또는 이소타입과 관계없이) 결합분자 경쟁연구의 실시에서, 참조분자는 검출가능한 라벨, 예를 들면 비오틴, 효소적, 방사활성과 같은 검출가능한 라벨 또는 이후의 동정화가 가능한 라벨로 우선 라벨화된다.
이들 경쟁 분석에 의해 동정된 결합분자("경쟁결합분자" 또는 "교차-반응성 결합분자")는 항체, 항체 단편 및 에피토프 또는 스크리닝 되어질 결합분자와 참조결합분자 사이의 경쟁 결합 일어나기 위해 참조결합분자에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 결합부위에 결합하는 다른 약제뿐 아니라, 항체, 항체 단편 및 에피토프 또는 참조결합분자에 의해 결합된 결합부위에 결합하는 다른 결합 약제를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 바람직하기는 본 발명의 경쟁 결합분자는, 과량으로 존재할 때, 선택된 표적 종에 대한 참조 결합분자의 특정 결합을 적어도 10%, 바람직하기는 적어도 25%, 더욱 바람직하기는 적어도 50%, 및 가장 바람직하기는 적어도 75%~90% 또는 그 이상으로 억제한다. 본 발명의 결합분자와 거의, 실질적으로 또는 필수적으로 또는 동일한 에피토프에서 결합하는 하나 이상의 경쟁 결합분자의 동정은 간단한 기술문제이다. 경쟁 결합분자의 동정이 참조 결합분자, 즉 본 발명의 결합분자와 비교하여 정의됨에 따라, 참조 결합분자와 경쟁 결합분자가 결합하는 에피토프를 실질적으로 결정하는 것은, 참조결합분자와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 경쟁 결합분자를 동정하기 위해 어떤 점에서는 요구되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 다음의 실시예 및 도면들을 참조로 더욱 설명될 것이다. 실시예들은 본 발명의 범위를 어느 방법으로도 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1
메모리 B 세포로부터 추출된 RNA 를 사용한 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리의 구축
정상의 건강한 공여자로부터의 말초혈액을 정맥 천자에 의해 EDTA 항-응고 샘플튜브에 수집하였다. 본 발명에 참조로 병합된 WO 2008/028946에 기재된 바와 같이 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리를 얻었다. 메모리 B 세포(CD24+/CD27+)를 단순(naive) B 세포 (CD24+/CD27-) 및 메모리 T 세포 (CD24-/CD27+)로부터 분리하였고, 다음 단계에서, IgM 발현을 사용하여 스위치 메모리 B 세포(IgM-)로부터 IgM 메모리 B세포 (IgM+)를 분리하였다. RNA를 IgM 메모리B 세포와 제조된 cDNA로부터 단리하였다.
2 라운드 PCR 증폭법을 표 1과 2에 나타낸 프라이머 세트를 사용하여 적용하여 면역글로불린 VH와 VL 영역을 각각의 공여자 레퍼터리로부터 단리하였다.
표 1에 기재된 프라이머 세트를 사용한 각각의 cDNA에서의 첫번째 라운드 증폭으로 각각의 VH, V카파 및 V람다에 대해 약 650 염기쌍의 7, 6 및 9의 산물을 산출하였다. IgM 메모리 B 세포 VH 영역 증폭의 경우, OCM 불변 프라이머를 OH1 내지 OH7과 조합하여 사용하였다. 첫번째 라운드 증폭을 위한 열순환 프로그램은 다음과 같다: 96℃ 2분(변성 단계), 96℃ 30초/ 55℃ 30초/ 72℃ 60초의 순환 30회, 72℃ 10분 최종 신장 및 4℃ 냉장보관. 산물을 1% 아가로스 겔에 장전하고 겔-추출 칼럼(Qiagen)을 이용하여 단리하고, 1 mM Tris-HCl pH 8.0 50 ㎕로 용출하였다. 첫번째 라운드 산물의 10%(5㎕)를 표 2에 언급한 프라이머를 사용하여 두번째 라운드 증폭시켰다. 이들 프라이머를 각각의 VL과 VH 영역의 방향성 클로닝이 가능한 제한 부위를 사용하여 파아지 디스플레이 벡터 PDV-C06로 연장시켰다. 두번째 라운드 증폭을 위한 PCR 프로그램은 다음과 같다: 96℃(변성 단계) 2분, 96℃ 30 초/ 60℃ 30초/ 72℃ 30초의 순환 30회, 72℃ 10분 최종 신장 및 4℃ 냉장보관. 두번째 라운드의 산물(~350 염기쌍)을 면역글로불린 유전자 산물에서 발견된 J 세그먼트의 천연 발생에 따라 우선 조사하여, 각각 VH, V 카파 및 V 람다 가변 영역에 대해 7, 6 및 9개의 풀을 가져왔다 (표 3 및 4 참조). 면역 라이브러리에서 면역글로불린 서열의 정상화된 분포를 얻기 위해, 6개의 V 카파 및 9개 V 람다 경사슬 풀을 표 3에 언급된 비율에 따라 혼합하였다. 이 단일 최종 VL 풀(3 ㎍)을 SaiI 및 NotI 제한 효소로 밤새도록 분해하고, 1.5% 아가로스 겔 (~350 염기쌍)에 장전하고 Qiagen 겔-추출 칼럼을 사용하여 단리시키고 SalI-NotI 절단 PDV-C06 벡터(~5000 염기쌍)로 다음과 같이 결찰하였다: PDV-C06 벡터 10 ㎕ (50 ng/㎕), VL 삽입물 7 ㎕ (10 ng/7 ㎕), 1O× 결찰 완충액 5 ㎕ (NEB), 2.5 T4 DNA 리가아제 (400 U/㎕) (NEB), 초순수물 25.5 ㎕(벡터 대 삽입물의 비율은 1:2였다). 결찰을 16℃의 수조에서 밤새도록 수행하였다. 그리고 나서, 물을 이용하여 부피를 두 배로 하고, 동일한 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀알콜(75:24:1)로 추출하고(Invitrogen), 이어서 클로로포름 (Merck) 추출 및 펠렛 페인트(Novogen) 1 ㎕, 아세트산나트륨 10 ㎕(3M, pH 5.0) 및 이소프로판올 100 ㎕로 2시간 동안 -20℃에서 침전시켰다. 얻어진 샘플을 순차적으로 20.000×g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 10분 동안 20.000×g로 실온에서 원심분리하였다. 에탄올을 진공 흡인하여 제거하고 펠렛을 수분동안 공기 건조시키고 그리고 나서 10mM Tris-HCl, pH 8.0을 함유하는 완충액 50 ㎕에 용해시켰다. 결찰 혼합물 1 ㎕를, 냉각된 0.1 cm 전기천공 큐벳(Biorad)에서 1.7 kV, 200 Ohm, 25 μF (시간 상수 ~4,5 msec)에 맞춘 Genepulser Ⅱ 장비(Biorad)를 사용하여 TG-1 전자-적격세포 (Stratagene) 40 ㎕의 형질전환에 사용하였다. 펄스 후 직접, 세균을 37℃에서 5%(w/v) 글루코스 (Sigma)를 함유하는 SOC 매질 1000 ㎕을 사용하여 큐벳에서 씻어내고 15 ㎖ 둥근바닥 배양튜브로 옮겼다. 또 다른 SOC 클루코스 500 ㎕를 사용하여 큐벳에 남은 세균들을 씻어내고 배양 튜브에 첨가하였다. 세균을 220 rpm의 쉐이커 배양기에서 37℃에서 정확히 1시간 배양 후 회수하였다. 형질전환된 세균을 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 5% (w/v) 글루코스(Sigma)가 보충되어 있는, 200㎖ 2TY 아가를 함유하는 240mm 스퀘어 페트리접시(NUNC)(박토-트립톤 16 g/ℓ, 박토-이스트 추출물 10 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, 아가 15 g/ℓ, pH 7.0)에 도금하였다. 1 내지 1000 희석물을 계수를 목적으로 동일한 매질을 함유하는 15 cm 페트리디시에 도금하였다. 이 형질전환 공정을 이어서 20회 반복하고 완전 라이브러리를 총 30개의 큰 사각형 페트리 디시에 도금하고 37℃ 배양 스토브에서 밤새도록 성장시켰다. 통상적으로, 상기 프로토콜을 사용하여 대략 1×1O7 cfu를 얻었다. 중간의 VL 경사슬 라이브러리를 플레이트 당 10 ㎖ 2TY 매질에 세균을 부드럽게 긁어서 플레이트로부터 수득하였다. 세포 덩어리를 OD600 측정으로 측정하고 세균의 500 OD의 제조자 지침에 따른 2개의 P500 maxiprep 칼럼(Qiagen)을 사용하여 맥시 플라즈미드 DNA 제조에 사용하였다.
VL 가변 영역과 유사하게, 두번째 라운드 VH-JH 산물을 우선 함께 혼합하여 정상 J 세그먼트 유용 분포(Table 4 참조)를 얻었고, 그 결과 PH1 내지 PH7으로 불리는 7개의 VH 서브풀을 얻었다. 풀들을 표 4에 나타낸 백분률을 사용하여 혼합하여 정상화된 서열 분포를 수득하였고, 하나의 VH 분획은 SfiI 및 XhoI 제한효소로 소화되었고 상기와 같이 얻어진 SfiI-XhoI 절단 PDV-VL 중간체 라이브러리에서 결찰되었다. 결찰 셋업, 정화법, TG1의 순차적 형질전환 및 세균의 수확은 VL 중간체 라이브러리에 대한 기재와 같이 기재되었다(상기 참조). 최종 라이브러리(대략 5×106 cfu) 삽입된 VH-VL 영역을 플랭킹(flanking)하는 프라이머 세트를 사용하여 콜로니 PCR로 사입 빈도를 확인하였다. 클로니의 95% 이상이 정확한 길이 삽입을 나타내었다(표 5 참조). 콜로니 PCR 산물을 이후의 DNA 서열 분석에 사용하여 서열 변이를 확인하고 완전 ORF를 나타내는 콜로니 퍼센트를 평가하였다. 이것은 통상적으로 70%를 넘었다(표 5 참조). V 유전자에서 돌연변이의 빈도를 또한 분석하였다. 50개의 서열 중에서, 47개 (94%)는 돌연변이 공정을 나타내는 게르밀린 배열이 아니고 라이브러리에 대한 RNA 서열로서 B 세포의 서열의 메모리 표현형과 일치한다. 최종적으로, 라이브러리를 구조하고 CT 헬퍼 파아지(WO 02/103012 참조)의 사용에 의해 증폭시키고 그리고 하기 패닝법에 따라 파아지 항체 선택에 사용하였다.
실시예 2
인플루엔자 서브타입 H3 및 H7 및 인플루엔자 B에 대한 단일 사슬 Fv 단편을 수반하는 파아지의 선택
항체 단편을 본질적으로 상기와 같이 구축된 항체 파아지 디스플레이 라이브러리와 일반 파아지 디스플레이 기술 및 본질적으로 US 특허 제6,265,150호 및 WO 98/15833 (둘 다 참조로서 본 발명에 병합되었다)에 기재된 바와 같은 MABSTRACT® 기술을 사용하여 선택하였다. 더우기, WO 02/103012 (본 발명에 참조로서 병합되었다)에 기재된 바와 같은 방법과 헬퍼 파아지를 본 발명에 사용하였다.
선택은 인플루엔자 A 서브타입 H3(A/Wisconsin/67/2005) 및 H7(A/Netherlands/219/2003) 또는 인플루엔자 B(B/Ohio/01/2005)의 재조합 헤마글루티닌 (HA)에 대해 수행하였다. HA 항원을 PBS(5.0 ㎍/㎖)에 희석시키고, MaxiSorp™ Nunc-Immuno Tubes (Nunc)에 첨가하고, 밤새도록 4℃에서 회전 휠 중에서 배양하였다. 면역튜브를 비우고 블록 완충액(PBS 중의 2% 탈지분유(ELK))으로 3회 세척하였다. 이어서, 면역튜브를 블록 완충액으로 완전히 채우고 실온에서 1~2 시간동안 배양하였다. 파아지 디스플레이 라이브러리의 일정부분(500-1000㎕, 0.5×1013 - 1×1013 cfu, CT 헬퍼 파아지를 사용하여 증폭(WO 02/103012 참조))을 10% 비-가열 불활성 송아지 태아 혈청과 2% 마우스 혈청이 보충된 블록 완충액으로 실온에서 1~2시간 동안 블록시켰다. 블록된 파아지 라이브러리를 면역튜브에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 배양하고, 그리고 세척 완충액(PBS 중의 0.05%(v/v) Tween-20)으로 세척하여 결합하지 않은 파아지를 제거하였다. 결합된 파아지를 각각의 항원으로부터 실온에서 10분 동안 100mM 트리에틸아민(TEA) 1 ㎖로 배양하여 용출하였다. 이어서, 용출된 파아지를 pH를 중화하기 위해 pH 7.5의 1 M Tris-HCl 0.5 ㎖과 혼합하였다. 이 혼합물을 사용하여 약 0.3의 OD 600nm까지 37℃에서 성장시킨 XL1-Blue E.coli 5㎖를 감염시켰다. 파아지를 37℃에서 30분 동안 XL1-Blue 세균에 감염되도록 하였다. 그리고 나서, 혼합물을 실온에서 10분 동안 3000×g로 원심분리하였고, 세균 펠렛을 0.5㎖ 2-트립신 이스트 추출물(2TY) 매질에 재현탁 하였다. 얻어진 세균 현탁물을 테트라시클린, 앰피실린 및 글루코스가 공급된 2개의 2TY 아가 플레이트로 나누었다. 37℃에서 플레이트를 밤새도록 배양한 후, 콜로니들을 플레이트로부터 걷어내어, 본질적으로 De Kruif et al. (1995a) 및 WO 02/103012에 기재된 바와 같이 농축된 파아지 라이브러리를 제조하는데 사용하였다. 간단히 말하자면, 걷어낸 세균을 앰피실린, 테트라실린 및 글루코스를 함유하는 2TY 매질을 배양하는데 사용하였고 37℃에서 ~0.3의 OD 600nm로 성장시켰다. CT 헬퍼 파아지를 첨가하고 세균으로 감염시키고 그 후 매질을 앰피실린, 테트라실린 및 카나마이신을 함유하는 2TY로 교환하였다. 배양을 30℃에서 밤새도록 계속하였다. 다음날, 세균을 원심분리에 의해 2TY 매질로부터 제거한 후 매질 중의 파아지를 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6000/NaCl을 이용하여 침전시켰다. 최종적으로, 파아지를 1% 송아지 혈청 알부민(BSA)를 갖는 PBS 2 ㎖에 용해시키고, 여과-살균하고 다음 라운드의 선택에 사용하였다.
연이은 2회의 선택 라운드를 개개의 단일 사슬 파아지 항체의 단리 전해 수행하였다. 두번째 선택 라운드 후, 개개의 E.coli 콜로니들을 모노클로날 파아지 항체를 제조하는데 사용하였다. 본질적으로, 개개의 콜로니들을 96 웰 플레이트 포맷의 대수증식기로 성장시키고 VCS-M13 헬퍼 파아지로 감염시키고 그 후 파아지 항체 생산을 밤새도록 진행시켰다. 파아지 항체를 함유하는 상등액을 HA 항원에 결합하기 위한 ELISA에 직접적으로 사용하였다. 선택적으로, 파아지 항체를 PEG/NaCl-침전시키고 필터-살균하여 흐름세포 분석을 수행하였다.
실시예 3
HA 특이 단일-사슬 파아지 항체의 확인
상기 스크리닝에서 얻은 선택된 단일-사슬 파아지 항체를 특이성, 즉 다른 HA 항원에 대한 결합에 대해 ELIDA에서 확인하였다. 이 목적을 위해, 바쿨로바이러스 발현 재조합 H3(A/Wisconsin/67/2005) 및 H7(A/Netherlands/219/2003) 또는 B(B/Ohio/01/2005)HA's(Protein Science, CT, USA)를 Maxisorp™ ELISA 플레이트에 코팅하였다. 코팅 후, 플레이트를 0.1% v/v Tween-20를 함유하는 PBS로 3회 세척하고 3% BSA 또는 2% ELK를 함유하는 PBS로 1시간 동안 실온에서 블록하였다. 선택된 단일-사슬 파아지 항체를 동일부피의 4% ELK 함유 PBS에서 1시간 동안 배양하여 블록된 파아지 항체를 얻었다. 플레이트를 비우고, PBS/0.1 % Tween-20로 3회 세척하고 블록된 단일-사슬 파아지 항체를 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 배양을 진행시키고, 플레이트를 PBS/0.1% Tween-20로 세척하고 결합된 파아지 항체를 과산화물에 컨쥬게이트된 항-M13 항체를 사용하여(OD 492nm 측정법을 사용) 검출하였다. 대조로서, 단일-사슬 파아지 항체 없이 그리고 음성 대조 단일-사슬 파아지 항체로 동시에 과정을 수행하였다. IgM 메모리 B 세포 라이브러리를 갖는 다른 HA 항원에 대한 선택으로부터, 재조합 H3 HA 및 재조합 H7 둘 다에 대해 특이적인 6개의 독특한 단일-사슬 파아지 항체를 얻었다(SC08-001, SC08-003, SC08-006, SC08-014, SC08-017 및 SC08-018). 이에 더하여, 재조합 H3HA (SC08-015 및 SC08-016)에 특이적인 2개의 독특한 단일-사슬 파아지 항체 및 재조합 H7 HA (SC08-007, SC08-009, SC08-010, SC08-011 및 SC08-013)에 대한 5개를 단리하였다. 표 6 참조.
선택적으로, PEG/NaCl-침전된 및 필터-살균된 파아지 항체를 elisa 결합 및 특이성에 대해 평가하는데 사용하였다. 이 목적을 위해, 바쿨로바이러스 발현된 재조합 인플루엔자 A H1 (A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/Wisconsin/67/2005), H5 (A/Nietnam/1203/2004), H7 (A/Netherlands/219/2003) 및 인플루엔자 B (B/Ohio/01/2005, B/Malaysia/2506/2004, B/Jilin/219/2003) HA's (Protein Sciences, CT, USA)를 Maxisorp™ ELISA 플레이트에 코팅하였다. 코팅 후, 플레이트를 0.1% v/v Tween-20를 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 3% BSA 또는 2% ELK를 함유하는 PBS 중에 블록하였다. 선택된 단일-사슬 파아지 항체를 블록된 파아지 항체를 얻기 위해 4% ELK를 함유하는 PBS의 동일한 부피 중에서 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 비우고, PBS/0.1% Tween-20로 3회 세척하고 블럭된 단일-사슬 파아지 항체를 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 배양시키고, 플레이트를 PBS/0.1% Tween-20로 세척하고, 퍼옥시다아제에 컨쥬게이트된 항-M13 항체를 사용하여 (OD 492nm 측정기로) 결합된 파아지 항체를 검출하였다. 대조로서, 단일-사슬 파아지 항체없이, 그리고 음성 대조 단일-사슬 파아지 항체를 가지고 동시에 과정을 수행하였다. IgM 메모리 B 세포 라이브러리를 갖는 다른 HA 항체에 대한 선택으로부터, 재조합 H1, H3 및 H7 HA에 특이적인 2개의 독특한 단일 사슬 파아지 항체를 얻었다(SC08-001 및 SC08-014). 이에 더하여, 재조합 H3 HA에 특이적인 6개의 독특한 단일-사슬 파아지 항체 (SC08-003, SC08-006, SC08- 015, SC08-016, SC08-017 및 SC08-018) 및 재조합 H7 HA에 대한 5개 (SC08-007, SC08-009, SC08-010, SC08-011 and SC08-013)를 단리하였다. 표 7 참조.
선택적으로, PEG/NaCl-침전된 및 필터-살균된 파아지 항체를 FACS 분석에 의해 결합 및 특이성을 평가하는데 사용하였다. 이 목적을 위해, 전장 재조합 인플루엔자 A 서브타입 H1 (A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/Wisonsin/67/2005), H5(TV), H7 (A/Netherlands/219/2003) 및 인플루엔자 B (B/Ohio/01/2005) HA's를 PER.C6 세포의 표면에 발현시켰다. 세포들을 1 시간 동안 단일-사슬 파아지 항체로 배양하고 이어서 PBS+0.1%BSA로 3회 세척하였다. 결합된 파아지들을 FITC 컨쥬게이트된 M13-항체로 검출하였다. IgM 메모리B 세포 라이브러리를 갖는 다른 HA 항원들에 대한 선택으로부터, 인플루엔자 서브타입 H1, H3 및 H7 HA에 특이적인 하나의 단일-사슬 파아지 항체를 단리하였다 (SC08-001). 이에 더하여, H3 HA에 특이적인 6개의 독특한 단일-사슬 파아지 항체 (SC08-003, SC08-006, SC08-015, SC08-016, SC08- 017 및 SC08-018), H7 HA에 특이적인 4개의 독특한 단일-사슬 파아지 항체 (SC08-007, SC08-010, SC08-011 및 SC08-013)를 단리하였다. 표 8 참조. 이들 중, 6개의 파아지 항체(SC08-001, SC08-003, SC08-015, SC08-016, SC08-017, SC08- 018)를 추가의 특성화를 위해 완전 인간 면역글로불린의 구축에 사용하였다(실시예 5 참조).
실시예 4
인플루엔자 A ( H3N2 ) HA 특이 불멸화 B-세포의 선택 및 확인
파아지 디스플레이에 더하여, 본 발명의 결합분자는 또 다른 방법, 예를 들면 WO 2007067046에 기재된 바와 같이, 불멸화된 B 세포를 사용하여 단리시킬 수 있다. 접종된 공여자부터 유래된 불멸화된 IgM 메모리 세포(CD19+/CD27+, IgD+)를 APC 라벨된 H3 HA 및 제한된 희석 배양물로 분류된 단일 세포로 오염시켰다. 회수 및 세포 팽창 후, H3 HA 분류된 세포의 상등액을 H1, H3 및 H7 면역원성에 대해 고체상 ELISA로 측정하였다.
이어서, 표적 특이 B 세포를 결합활성 및 중화에 대해 특성화하였다. B 세포를 단일 클론을 산출하기 위해 희석을 제한하여 클론하였다. 클론을 배양 플레이트에 시드하였고 세포를 14일 동안 배양하였다. 클론의 상등액을 HA 유래 H1, H3, H5 및 H7 을 발현하는 HA-트란스펙트된 293 세포에 결합하는 항-HA 모노클로날 항체의 생산에 대해 스크리닝하였다. 비특이적 또는 배경 오염에 대한 대조로서, 트란스펙트되지 않은 293 세포를 사용하였다.
상기 스크리닝에서 얻어진 IgM 또는 IgG 항체 중 어느 하나를 함유하는 선택된 B-세포 클론 상등액이 인플루엔자 A (H3N2) 감염을 블록할 수 있는지를 결정하기 위해, 인 비트로 바이러스 중화 분석(VNA)를 수행하였다. VNA를 MDCK 세포 (ATCC CCL-34)에 대해 수행하였다. MDCK 세포를 MDCK 세포 배지에서 배양하였다 (항생물질이 보충된 MEM 매질, 10% (v/v) 소 태아 혈청이 보충된 20 mM Heped 및 0.15% (w/v) 탄산수소나트륨 (완전MEM 매질)). H3N2 (A/Wisconsin/67/2005), 분석에 사용된 계통을 Spearman and Karber의 방법에 따라 산출된 역가를 사용하여, 5,7 x1O3 TCID50/ml (50% tissue culture infective dose per ml)의 역가로 희석하였다. IgG 또는 IgM 제조물을 4중(quadruplicate) 웰에서 완전 MEM 매질 중에 연쇄적으로 2-배 희석하였다(1:2 - 1:64). 각각의 IgG 희석물 25 ㎕를 바이러스 현탁액 25㎕(100 TCID50/25 ㎕)와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 현탁액을 4중으로, 50 ㎕ 완전 MEM 매질 중에 융합(confluent) MDCK 배지를 함유하는 96-웰 플레이트로 옮겼다. 사용하기 전에, MDCK 세포를 웰당 3x104 세포로 시드하고, 세포가 융합에 도달할 때까지 성장시키고, 300-350 ㎕ PBS, pH 7.4로 세척하였고, 최종적으로 50 ㎕ 완전 MEM 매질을 각각의 웰에 첨가하였다. 접종된 세포를 3-4일 동안 37℃에서 배양하고 세포변성 효과(CPE)의 전개에 대해 매일 관찰하였다. CPE를 양성 대조군과 비교하였다.
시험한 187개의 IgG 상등액 중, 43개가 이 분석에 사용된 H3N2 (A/Wisconsin/67/2005) 균주를 중성화시켰다는 것을 발견하였다. 이들 중에서, 14개는 실시예 5에 기재된 바에 따라 인간 IgG 면역글로불린의 구축에 사용하였다.
실시예 5
선택된 단일 사슬 Fvs 및 B-세포 클론으로부터 완전 인간 면역글로불린 분자 (인간 모노클로날 항체)의 구축
선택된 특이 단일사슬 항체 (scFv) 클론으로부터 플라즈미드 DNA를 얻었고 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 표준 기술에 따라 결정하였다. scFv의 중사슬 및 경사슬 가변 영역을 IgG 발현 벡터 pIg-C911-HCgamma 1 (SEQ ID No: 189 참조), pIG-C909-Ckappa (SEQ ID NO: 190 참조), 또는 pIg-C910-Clambda (SEQ ID No: 191 참조)에서 발현을 위해 제한 소화로 직접 클론하였다. B-세포 클론의 중사슬 및 경사슬 가변 영역을 PCR-증폭하였고 IgG 발현 벡터 pIg-C911-HCgamma1 (SEQ ID No: 190 참조), pIG-C909-Ckappa (SEQ ID NO: 191 참조), 또는 pIg-C910-Clambda (SEQ ID No: 192 참조)에서 발현을 위해 제한 효소로 직접 클론하였다. scFv의 VH 및 VL 유전자 동정 (Tomlinson IM et al. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997) 참조)을 확인하였다(표 9 참조).
모든 구축물에 대한 뉴클레오티드 서열을 당업자에게 알려진 표준 기술에 따라 확인하였다. 인간 IgG1 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 생성된 발현 구축물을 293T 세포와 조합하여 일시적으로 발현하였고 인간 IgG1 항체를 함유하는 상등액을 얻었고 표준 정제과정을 사용하여 생성하였다. 인간 IgG1 항체를 H3, H7 또는 B 항원에 대해 10 내지 0.003μg/ml의 농도 범위에서 적정하였다(자료는 도시하지 않음). 관련없는 항체를 대조 항체로서 포함시켰다. 선택된 면역글로불린 분자의 중사슬 및 경사슬의 CDR의 아미노산 서열을 표 9에 나타내었다. 중사슬 및 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 아래에 나타내었다. 면역글로불린은 아래에 나타낸 바와 같이, CR6261의 중사슬 및 경사슬 불변 영역을 포함한다.
실시예 6
H3N2 결합 IgG 에 의한 인플루엔자 바이러스의 인 비트로 중화 (바이러스 중화 분석)
선택된 IgG가 인플루엔자 A(H3N2) 감염을 블로킹할 수 있는지를 결정하기 위해, 인 비트로 바이러스 중화 분석(VNA)을 수행하였다. VNA를 MDCK 세포(ATCC CCL-34)에 대해 수행하였다. MDCK 세포를 MDCK 세포 배양 매질에서 배양하였다(항체가 보충된 MEM 매질, 20 mM Hepes 및 10%(v/v) 송아지 태아 혈청이 공급된 0.15% (w/v) 탄산수소나트륨(완전 MEM 매질)). 이 분석에 사용된 H3N2 (A/Wisconsin/67/2005) 균주를 5.7×103 TCID50/㎖ (50% 조직 배양 감염성 투여량/㎖)로 Spearman 및 Karber의 방법에 따라 산출된 역가로 적정하였다. IgG 제제(200 ㎍/㎖)를 중복된 웰에서 완전 MEM 매질에서 연속적으로 2-배 희석하였다(1:2 - 1:16). 각 IgG 희석물 25 ㎕를 바이러스 현탁액 25 ㎕와 혼합하고(100 TCID50/25 ㎕) 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그리고 나서 현탁액을 완전 MEM 매질 50 ㎕ 중에 융합성 MDCK 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에 이중으로 옮겼다. 사용하기 전에, MDCK 세포를 MDCK 세포 배양 매질에 웰당 3×104 세포로 시드하고, 세포가 융합에 도달할 때까지 성장시키고, PBS 300-350 ㎕, pH 7.4로 세척하고 최종적으로 완전 MEM 매질 50 ㎕을 각 웰에 첨가하였다. 접종된 세포를 37℃에서 3~4일간 배양하고 세포병리학적 효과(CPE)의 진행을 매일 관찰하였다. CPE를 양성 대조와 비교하였다.
실시예 5의 인간 항-H3 HA 및/또는 항-H7 HA 항체를 상기 VNA에 따라 측정하였다. 이들 항체 중, CR8040, CR8052 및 CR8069를 제외한 모든 항체는 A/Wisconsin/67/2005 H3N2 균주를 중화시켰다. 이들 항체가 CPE에 대해 MDCK 배양물을 보호하는 농도(㎍/㎖)를 표 11에 나타내었다.
실시예 7
항- H3N2 IgG 의 교차-결합 반응성
상기 H3N2 중화 IgG 항체를 결합 특이성, 즉 다른 HA 항원에 대한 결합에 대해 ELISA에서 확인하였다. 이 목적을 위해, 바쿨로바이러스 발현 재조합 H1(A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/Wisconsin/67/2005, A/New York/55/2004, A/Wyoming/3/2003) 및 H7 (A/Netherlands/219/2003) HA's (Protein Sciences, CT, USA)를 Maxisorp™ ELISA 플레이트에 코팅하였다. 코팅 후, 플레이트를 0.1% v/v Tween-20를 함유하는 PBS로 3회 세척하고 3% BSA 또는 2% ELK를 함유하는 PBS 중에서 1시간 동안 실온에서 블로킹하였다. 플레이트를 비우고, PBS/0.1% Tween-20로 세척하고 IgG 항체를 웰에 첨가하였다. 배양을 1시간 동안 진행시키고, 플레이트를 PBS/0.1% Tween-20 로 세척하고 결합된 항체를 퍼옥시다아제에 컨쥬게이트된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 검출하였다(OD 492nm 측정기 사용). 대조로서, 비관련 IgG CR4098를 사용하였다.
선택된 H3N2 중화 항체로부터, CR8001는 모든 시험된 재조합 HA에 헤테로서브타입 가교-결합을 나타내고, CR8020, CR8021, CR8041, CR8043 및 CR8057는 H7 HA 뿐 아니라 시험된 모든 3개의 H3 HA에 헤테로서브타입 가교-결합을 나타낸다. CR8003, CR8015, CR8016, CR8017, CR8018, CR8038, CR8039, CR8040, CR8049, CR8050, CR8052 및 CR8069는 시험된 3개의 H3 HA 모두에 교차-결합을 나타낸다. 하나의 항체, CR8019는 오직 H3 HA 중 2개에만 결합을 나타낸다. 표 12 참조.
부가적으로, 시험된 H3N2 중화 항체는 FACS 분석에 의해 헤테로서브타입 결합을 시험하는데 사용되었다. 이 목적을 위해, 전장 재조합 인플루엔자 A 서브타입 H1(A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/Wisonsin/67/2005) 및 H7 (A/Netherlands/219/2003) HA'를 PER.C6 세포의 표면에 발현시켰다. 세포를 IgG 항체와 1시간 동안 배양시키고 이어서 PBS+0.1%BSA로 3단계 세척하였다. 결합된 항체를 PE 컨쥬게이트된 항-인간 항체를 사용하여 검출하였다. 대조로서, 트란스펙트되지 않은 PER.C6 세포를 사용하였다.
H3N2 중화 항체로부터, CR8001은 인플루엔자 A 서브타입 H1, H3, 및 H7 HA에 대한 교차-결합 활성을 나타내지만, 야생형 PER.C6 세포는 아니다. 이에 더하여, CR8020 및 CR8041은 H3 및 H7 HA 둘 다에 강한 결합을 나타낸다. CR8043 및 CR8057 은 H3HA에 강한 결합을 나타내고 H7 HA에는 약한 결합을 나타낸다. CR8055는 PER.C6 세포에 낮은 수준의 배경 오염을 나타내었다. 나머지 13개의 항체는 표 12를 참조로, H3 트란스펙트된 세포에 결합을 나타낸다.
실시예 8
항- H3N2 IgI 의 교차-중화 활성
선택된 IgG가 다중 인플루엔자 A 균주를 블로킹할 수 있는가를 측정하기 위해, 추가의 인 비트로 바이러스 중화 분석(VAN)을 수행하였다. VNA을 MDCK 세포(ATCC CCL-34)에 대해 수행하였다. MDCK 세포를 MDCK 세포 배지에서 배양하였다(10% (v/v) 소 태아 혈청이 보충된, 항생물질, 20 mM Hepes 및 0.15% (w/v) 탄산수소나트륨(완전 MEM 매질)이 보충된 MEM 매질). 평가에 사용된 H1N1 (A/New Caledonia/20/1999 A/Brisbane/59/2007 and A/Solomon Islands/IVR-145), H3N2 (A/Hong Kong/1/68, A/Johannesburg/33/94, A/Panama/2000/1999, A/Hiroshima/52/2005 및 A/Wisconsin/67/2005), H7N3 (A/Mallard/Netherlands /12/2000) 및 H1O (A/Chick/Germany/N/49) 균주들 모두를 Spearman 및 Karber 법에 따라 산출된 역가를 사용하여, 5.7 x1O3 TCID50/ml (50% 조직 배양 비감염성 투여량/ml)의 역가로 희석하였다. IgG 제제(80 ㎍/㎖)를 중복된 웰에서 완전 MEM 매질에서 연속적으로 2-배 희석하였다(1:2 - 1:16). 각 IgG 희석물 25 ㎕를 바이러스 현탁액 25 ㎕와 혼합하고(100 TCID50/25 ㎕) 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그리고 나서 현탁액을 완전 MEM 매질 50 ㎕ 중에 융합성 MDCK 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에 이중으로 옮겼다. 사용하기 전에, MDCK 세포를 MDCK 세포 배양 매질에 웰당 3×104 세포로 시드하고, 세포가 융합에 도달할 때까지 성장시키고, PBS 300-350 ㎕, pH 7.4로 세척하고 최종적으로 완전 MEM 매질 50 ㎕을 각 웰에 첨가하였다. 접종된 세포를 37℃에서 3~4일간 배양하고 세포병리학적 효과(CPE)의 진행을 매일 관찰하였다. CPE를 양성 대조와 비교하였다.
H3N2 중화 항체 패널로부터, CR8020 및 CR8041은 H1 바이러스를 제외한 모든 시험된 인플루엔자 A 서브타입 H3, H7 및 H10에 대해 헤테로서브타입 교차-중화 활성을 나타내었다. 이에 더하여, CR8043는 모든 시험된 H3 및 H10 바이러스 균주에 대해 교차-중화를 나타낸다. CR8039, CR8041, CR8043 및 CR8057는 모든 시험된 H3 바이러스 균주의 교차-중화를 나타낸다. 추가의 13 항체는 시험된 H3 바이러스 균주의 1개 이상에서 교차-중화를 나타낸다. 표 13 참조.
실시예 9
HA 의 융합-전 형태에 대한 항- H3N2 항체의 결합
선택된 IgG가 HA 분자의 융합-전 또는 융합-후 형태에 결합할 수 있는가를 확인하기 위해, 인 비트로 pH-이동 실험을 수행하였다.
이 목적을 위해, 전장 재조합 인플엔자 서브타입 H3(A/Wisonsin/67/2005) HA를 PER.C6 세포의 표면에 발현시켰다. 다른 구조적 HA 형태에서의 특이적 반응성을 평가하기 위해, 3x105 세포를 30분 동안 실온에서 DMEM 중의 10 μg/ml 트립신-EDTA 세포로 처리하고, 세척하고 그리고 5분 동안 산성화된 PBS(pH 4.9)에서 배양하고, 세척하고 그리고나서 20분 동안 20 mM DTT의 존재하에 실온에서 배양하였다. 세포를 각각의 단계에서 나누고 처리되지 않은 부착 세포를 0.05% EDTA 중에 재현탁하였다. 각각의 처리의 세포 일부분을 항-H3N2 IgGs CR8001, CR8020, CR8041, CR8043 및 CR8057로 30분 동안 배양하였다. 세포를 그리고 나서 30분 동안 피코에리트린-컨쥬게이트된 항-IgG (Southern Biotech)로 배양하였다. 염색된 세포를 CELLQuest Pro software (Becton Dickinson)를 갖는 FACS Calibur를 사용하여 분석하였다. H3 rHA를 발현하는 표면에 IgG1의 FACS 결합을 트립신(사선표시 막대), pH 4.9 완충 매질(흰색 막대) 및 DTT (십자교차표시 막대)로 순차적으로 처리한 후 측정하였고 처리하지 않은 rHA(검은색 막대)에 대한 결합 백분률로 나타내었다. 도 2 참조. 항체 CR8001, CR8020, CR8041 및 CR8043는 모두 HA 분자의 낮은 pH 유래 형태 변화 전에만 존재하는 에피토프에 특이적임을 나타내는 pH-이동 후 결합의 현저한 감소를 나타낸다. 항체 CR8057는 DTT 처리 후에만 결합에서의 감소를 나타내었고 이것은 HA1이 존재할 때만 이용가능한 형태 무관 에피토프에 대한 특이성을 나타낸다.
실시예 10
항- H3N2 항체 CR8041 은 HAO 의 분열을 막는다
선택된 IgG가 HA 분자가 프로테아제 분열되는 것을 막을 수 있는가를 측정하기 위해, 인 비트로 프로테아제 민감성 평가를 수행하였다.
이 목적을 위해, 7.5 μg 재조합 가용성 인플루엔자 A 서브타입 H3 (A/Wisonsin/67/2005) HA (Protein Sciences, CT, USA)를 1시간 동안 37℃에서 다른 pH (4.9, 5.3 및 8.0)로 처리하였다. 배양 후, 반응물을 중화시켰다. 샘플을 7.5 μg CR8041 또는 CR8057 Fab 단편의 존재 및 부재하에 0.5 μg 트립신으로 밤새 소화시켰다. 반응을 SDS 장전 완충액을 첨가하여 급랭시켰다. 3㎕ Nupage 환원제(Invitrogen)를 각각의 샘플에 첨가하였다. 샘플을 1x MOPS 완충액 중의 4-12% BisTris 겔 상에서 작업하였다. 단백질 밴드를 콜로이드 블루 염색에 의해 가시화하였다(도 3 참조). Fab 분획의 부재시, H3 HA 분자는 pH 4.9 또는 5.3에서 그것의 프로테아제-민감 후-융합 형태로 쉽게 전환하지만, pH 8.0에서는 아니다. Fab 단편 CR8057의 존재하에, H3HA의 열화 그리고 그러므로 pH 4.9에서의 형태 변화는 억제되지 않는다. 반대로, Fab CR8041의 존재는 H3 HA 형태 변화와 낮은 pH에서의 열화 뿐만 아니라 HAO의 HA1 및 HA2로의 pH 무관 분할도 막는다. 이 결과는 분열 위치에서의 또는 근처에서의 CR8041에 대한 에피토프를 지시한다. 항-H3N2 항체 패널과의 경쟁 실험(결과는 도시하지 않음)은 오버래핑 에피토프 및 CR8001, CR8020 및 CR8043 항체에 대한 유사한 작업 메카니즘을 나타낸다.
실시예 11
본 발명의 결합 분자의 작용 메카니즘
HA 당단백질은 각각의 모노머가 전구체 (HAO)의 계통적 분열에 의해 감염 중 생산되는 두 개의 다이설파이드-링크된 글리코폴리펩티드 (즉, HA1 및 HA2)로 구성된 트라이머이다. 분열은 막 융합을 위해 HA가 형태 변화를 허용하도록 하는데 요구되기 때문에 바이러스 감염력에 필요하다.
준비된 분자의 활성은 엔도좀 중에서 낮은 pH, pH 5~pH6 사이에서 일어나고 HA 구조에서의 광범위한 변화를 요구한다. 융합-전 분열되지 않은 (I), 융합-전 분열된 (II) 및 융합-후 HA (III) 형태의 3차원 구조를 대략적으로 도 4에 나타내었다.
인 비트로, HA 분자의 형태 변화는 HA 표면-발현된 포유류 세포를 사용하여 모방될 수 있다. 우선, 단백질분해 분열은 세포에 트립신을 첨가함에 의해 촉발될 수 있다. 두 번째, 융합-전에서 융합-후 형태 변화는 pH를 낮춤으로써 달성될 수 있다. 이에 더하여, 분자의 HA 1 부분은 DTT와 같은 환원제를 첨가하여 제거할 수 있다. 이 방법에서 그리고 특정 단계에서 항체를 첨가함에 의해, 어느 단계에서 항체가 감염 과정에 개입하는지를 조사하는 것이 가능하다. 따라서, PER.C6® 세포는 A/Wisonsin/67/2005로부터 HA를 수확하는 H3 HA 발현 구조물로 트란스펙트되고 실시예 10에 기재된 바와 같이 다양하게 처리된다.
이 실험을 위해, 세포를 트립신 분열하기 전에 항-H3 mAbs와 함께 우선 배양하고 이어서 상기와 같이 처리하였다(도 5 참조). 항-H3 mAbs의 결합을 표준 프로토콜에 따라 PE-컨쥬게이트된 항-인간 항체로 검출하였다. 형광 신호를 FACS 분석을 통해 측정하였다. '세포 유일(only)'은 비처리된 세포에 대한 mAb 결합 후 얻은 신호를 의미하고 100%에 맞춰졌다. 도 5에 나타낸 바와 같이, mAbs는 다른 처리 후 HA에 여전히 결합하고 있다. 위의 실시예 10에서 H3 mAbs CR8020, CR8041 및 CR8043은 예비-융합 상태(즉, 낮은 pH로 인한 형태 이동 전)에만 결합한다는 것이 알려졌으므로, 사실 항체의 결합은 최소한 인 비보에서 트립신 분열(실시예 10 참조)을 억제하고, 따라서 이후의 단계들이 형태 변환 및 융합되는 것을 막는다고 결론되었다. 수용체 부착 위치 근처의 HA 분자의 HA1 부분에 결합하는 항체 CR8057는 형태 이동 후 HA에 결합할 수 있고, 그리고 예상되는 바와 같이, DTT 처리에 의해 HA1 및 HA2 도메인 사이의 이황화물 결합의 HA1 부분의 붕괴 후 제거되면 손실된다.
트립신 분열의 억제는 다른 인 비트로 실험에서 순차적으로 확인되었다. 우선, HA1과 HA2에서 HAO의 적절한 분열을 얻기 위해 H3 HA을 트립신과 얼마나 오래 배양해야 하는가를 결정하기 위한 시간대별 실험을 수행하였다. 그로부터 재조합 가용성 H3 HA (A/Wisconsin/67/2005; Protein Sciences, CT, USA)을 6.7 μg/ml 트립신 및 1% N-도데실-β-데말토시드를 함유하는 pH 8.0에서 4mM Tris.HCl 완충액 중에서 배양하였다. 트립신 소화를 1% BSA를 첨가함에 의해 여러 시점에서 멈추었다. 샘플을 SDS-page 겔 (reduced)에서 작동시키고 표준 방법으로 블로팅하였다. HAO, HA1 및 HA2 밴드를 토끼 항-H3HA 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하였다 (Protein Sciences, CT, USA). 도 6은 환원 겔에서 HA1과 HA2 밴드가 출현함에 의해 거의 완전한 분열을 증거하는데 2시간의 배양으로 충분하다는 것을 나타낸다. 그리고 나서, 재조합 가용성 H3 HA를 CR8020, CR8041, CR8043 또는 CR8057와 배양하였고, 이어서 pH 8.0에서 트립신 분열하였다. 트립신 소화를 또한 1% BSA의 첨가에 의해 수차례 멈추었다. 샘플을 SDS-page (reduced)에서 작동시키고 블로팅하였다. HAO, HA1 및 HA2 밴드를 항-H3 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 결과는 항체에 결합된 H3 HA의 트립신과의 배양이 겔에서 HA의 HAO 형태의 보호를 가져오기 때문에, 3개의 mAbs CR8020, CR8041 및 CR8043 모두가 인 비트로에서 트립신 분열을 막는다는 것을 나타내었다(도 7). 반대로, 동일 조건에서 대조 mAb(CR8057)과의 H3 HA의 배양은 HAO 밴드의 사라짐을 가져왔다. 이 실험은 CR8041에 대해 실시예 10에서 논의된 데이타를 확인하고 이 관찰을 CR8020 및 CR8043 항체로 확장한다. 그러므로, 본 발명의 결합분자는 적어도 인 비트로에서, HAO 분자의 적어도 트립신 분열을 막는다. 그러나, 이것이 추가의 억제 효과가 감염 과정 중 더 하류이고 pH-유도 형태 이동 및/또는 융합 공정의 방해를 가져오는 CR8020, CR8041 및 CR8043 mAbs에 의해 또한 중재 될 수 있다는 것을 배제하지 않는다는 것을 명심하라. 이것이 가능한가를 조사하기 위해, 상기 논의된 실험을 이번에는 대조로서 항체 CR8043 또는 항체 CR8057를 트립신 분열 후에만 H3 HA를 발현하는 세포에 첨가하여 반복하였다. 배양에 이어서 세포를 순차적으로 실시예 10에 기재된 바와 같은 낮은 pH의 완충액 중에서 배양하고 DTT로 처리하였다. 작용 메카니즘이 트립신 분열의 억제를 제한한다면, 본 발명자들은 항체가 HA의 융합-후 형태에 결합하지 않은 것으로 설정하였으므로 mAb CR8043은 pH 처리 후 결합을 잃을 것으로 예상된다. 반대로, 도 8로부터 확인할 수 있는 바와 같이, mAb CR8043 결합은 낮은 pH에 노출되고 이어서 DTT 처리된 후에도 여전히 검출되고 이것은 pH-유도 형태 이동이 또한 적어도 인 비트로에서는 CR8043에 의해 억제된다는 것을 나타낸다. HA의 HA1 영역에 결합하는 것으로 나타났던 CR8057는 예상과 같이 행동하고 그리고 HA1 부분이 DTT 처리 후 손실되면, 더 이상 관찰되지 않는다.
항체 CR8020 및 CR8041이 또한 HA의 pH-유도 형태 변화를 블로킹할 수 있는가를 조사하기 위해, 상기 논의된 실험을 반복하였다. 이번에는 항체 CR8020, CR8041 및 CR8043, 또는 대조로서 항체 CR8057를, 상기의 모든 처리 후, 또는 낮은 pH 배양 전 또는 트립신 분열 전에, A/Hong Kong/1/1968, A/Hong Kong/24/1985 또는 A/Wisconsin/67/2005 서브타입 H3 HA를 발현하는 세포에 첨가하였다. A/Wisconsin/67/2005 H3 HA에 대해 초기에 나타낸 바와 같이, CR8020, CR8041 및 CR8043 항체는 오직 낮은 pH 처리 전에만 존재하는 에피토프를 인식한다. 이 에피토프는 도 9c에 나타낸 바와 같이 이 실험에 사용된 3개의 HA에서 보존된다. 작용 메카니즘이 트립신 분열의 억제를 제한한다면, 본 발명자들은 실시예 10에서 항체가 HA의 융합-후 변형에 결합하지 않는다고 설정하였으므로, mAbs CR8020, CR8041 및 CR8043은 pH 처리 후 거의 분열된 HA의 결합을 잃는다. 반대로 도 9b에 나타낸 바와 같이, mAb 결합은 낮은 pH에의 노출 및 이어서 DTT 처리 후에도 여전히 3개의 다른 H3 HA서 검출되고, 이것은 pH-유래 변형 이동이 적어도 인 비트로에서 CR8020, CR8041 및 CR8043에 의해 억제된다는 것을 나타낸다. HA의 매우 가변적인 HA1 영역에 결합하는 것으로 나타나고 있는 CR8057은 A/Hong kong/1/1968 및 A/Hong Kong/24/1985 HAs에 대한 결합은 나타나지 않는다.
실시예 12
인 비트로 발생된 탈출 돌연변이가 에피토프의 위치가 H3HA 의 보존된 서열과 일치하는 것을 나타냄
HA CR8020, CR8041 및 CR8043의 어느 영역에 결합하는가를 조사하기 위해 인 비트로 배양에서 탈출 돌연변이의 발생을 시도하였다. A/Hong Kong/1/1968 바이러스를 한정된 양의 모노클로날 항체의 존재하에서 MDCK 세포 배양물 중에서 계대배양하였다. 우선, 어느 농도의 항체가 다른 양의 모노클로날 항체와 혼합된 100 TCID50으로 MDCK 세포의 접종 및 3일 동안의 배양 후, 바이러스 감염의 3 로그 감소를 가져오는가를 측정하였다. 이 농도의 항체를 일련의 계대배양에서 접종원에 첨가하고 각각의 계대배양 후 바이러스를 바이러스들이 항체-중재된 중화에 여전히 민감한지 여부를 측정하기 위해 다른 양의 항체의 부재 및 존재하에 플라그 적정하였다. 이 과정을 mAbs CR8020, CR8041 및 CR8043 각각에 대해 수행하였다. 각각의 배양으로부터 탈출 바이러스를 플라그 분석에 의해 단리할 수 있었고 각각의 두 단리물 중에서, 바이러스 RNA를 추출하고 HA 서열을 측정하는데 사용하였다. 관찰된 돌연변이 아미노산은 다음과 같았다:
CR8020: 분석된 플라그 둘 다에서 D19N 및 Q27L;
CR8041 : 두 개의 플라그에서 G33E;
CR8043 : 하나에서 R25M 및 다른 플라그에서 Q34R.
세 개의 모노클로날 항체 모두가 융합 펩티드에 근접한 HA 스템 영역의 HA2 부분의 유사한 영역에서 탈출 돌연변이를 나타내었다.
이 영역에서 NCBI 인플루엔자 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov /genomes/FLU/Database/select.cgi)에 존재하는 H3N2 바이러스의 아미노산 서열들의 비교는 서열의 두드러진 보존을 드러낸다. 표 14는 관찰된 탈출 돌연변이 강조된 것을 갖는 아미노산 W14 및 K39 사이의 HA2 영역에서 서열 변이(variation)를 서술한다. N= 특이 서열을 갖는 균주의 수. 이에 더하여, 단리물의 년(햇수)을 H3 항체에 대한 중화 실험에서 양성 시험된 균주와 함께 표시하였다(Pa= A/Panama/2000/1999; Wis= A/Wisconsin/67/2005; Hs= A/Hiroshima/52/2005; HK= A/HongKong/1/1968). 언급된 HA2 서열을 함유하는 데이타베이스에 존재하는 1363 H3 바이러스 중에서, 대부분(81%)은 중화될 것으로 나타난 바이러스 균주에 존재하는 서열을 가졌다. 남은 서열들 중 대부분은 변화를 보존하였다고 간주할 수 있는 아미노산을 갖는다. 다른 돌연변이들 중에서 기능적 중화 시험은 변화가 항체의 기능성에 영향을 미치는가를 확립하는데 필요할 것이다. 중요하기는 탈출 바이러스 실험에서 나온 3 아미노산 변화(R25, G33 및 Q34)는 천연 인플루엔자 서열에서는 일어나지 않고 다른 두 개의 돌연변이는 오직 조합물(D19 및 Q27), 천연 서열에는 존재하지 않는 조합물에서만 나타난다. 이것은 돌연변이가 바이러스 맞춤에 부정적 영향을 갖는다는 것을 의미할 수 있다. 전체적으로, 항체는 모노클로날 항체의 광범위한 중화 가능성을 확인하는 H3 서브타입 바이러스들 사이에서 높게 보존되는 HA2 상의 에피토프와 상호작용한다고 결론된다
실시예 13
인 비보 실험을 위한 모노클로날 항체의 제조
인 비보에서 잠재력 있는 치료 항체로서 IgG의 특성 및 순차적 확인을 위해 이들은 충분한 양으로 제조되고 정제되어야 한다. IgG를 25L 웨이브-백에서 PER.C6® 세포에서 생산하였고 배양물을 수확하였다. 밝혀진 수확물로부터, IgG를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 완충액 교환 과정을 통해 정제하였다. 정제된 완충액 교환된 IgG의 모노머 함량은 0.2 ㎛ 살균 여과 전 및 여과 후 둘 다에서 ~99%였다. 추가의 인 비트로 바이러스 중화 평가 (VNA)를 상기와 같이, 얻어진 다른 항체 제조물에 대해 수행하였다. 결과를 표 15에 나타내었다.
실시예 14
인 비보 치명적 H3N2 챌린지에 대한 인간 IgG 모노클로날 항체의 예방적 활성
MAbs CR8020, CR8041 및 CR8043을 암컷 129Xl/SvJ 마우스(Jackson Labs) (MA=mouse adapted)에서 인플루엔자 A/HK/1/68-MA20 (H3N2) 바이러스를 갖는 마우스 치사 챌린지 모델에서 예방효율성에 대해 시험하였다. A/HK/1/68-MA20 바이러스를 캐나다 온타리오 오타와에 위치하는 오타와 대학의 교수인 E.G. Brown로부터 얻었다; Brown, E. G. et al. (2001). 바이러스를 마우스 실험 전에 부화계란에서 일단 계대배양하였다. 모든 마우스를 실험 개시 전 최소 4일의 기간 동안 순응시키고 유지시켰다.
MAbs를 챌린지 전 제-1일에 꼬리 정맥에 정맥주사로 30, 10, 3 및 1 mg/kg 투여하였고(vena coccygeus), 마우스 당 평균 중량 18g 및 투여 부피는 0.2 mLg으로 가정하였다. 마우스 (그룹 당 n=8)에 비강내 접종에 의해 25 LD50 A/HK/1/68-MA20 (H3N2) 바이러스를 제0일에 접종하였다. 투여된 바이러스의 실제 투여량은 동물의 접종이 완료된 후 남은 접종원으로부터 약간의 복제 샘플을 적정함에 의해 평가하였다. 접종원의 바이러스 역가(TCID50/mL)를 MDCK 세포에서 결정하였다. 결과는 접종원의 제조 또는 투여 중 바이러스의 의도되지 않은 불활성화가 일어나지 않았다는 것을 나타낸다. 임상 신호 및 체중을 챌린지 전 제-1일부터 제21의 연구 종료시까지 매일 측정하였다. 임상 신호를 점수화 시스템으로 점수화하였다(0=임상 신호 없음; 1= 애벌칠; 2=애벌칠, 덜 반응성, 취급 중 소극적; 3 = 애벌칠, 드러남(rolled up), 부자연스런 호흡, 취급 중 소극적; 4 = 애벌칠, 드러남, 부자연스런 호흡, 벌렁 누웠을 때 위 축소되지 않음). 점수가 4이면 마우스를 안락사시켰다. 제0일에서의 mAb 플라즈마 수준을 분석하고 제21일에 혈구응집반응 억제(HI) 항체의 존재를 측정하기 위해, 혈액 샘플을 챌린지 직전 D0에 그리고 감염 후 D21에 모든 마우스로부터 추출하였다.
mAbs를 2개의 개별 실험에서 시험하였다. 각각의 실험에서 음성 대조 항체(CR3014) 군을 30 mg/kg의 투여량으로 수행하였다. MAb CR8020을 첫번째 실험에서 시험하였고, mAbs CR8041 및 CR8043을 두번째 실험에서 시험하였다. 모든 마우스들은 활동적이었고 순응 기간 동안 질병의 징후를 나타냄 없이 건강하게 보였다. 도 10은 mAb 투여 후 마우스의 생존률을 나타낸다. 명백한 용량-반응 관계를 관찰하였고, 30, 10 또는 3 mg/kg에서 CR8020, CR8041 또는 CR8043이 투여된 모든 군에서 100% 생존을 확인 한 반면, 1 mg/kg CR8020에서는 마우스의 25%가 생존하였고, 1 mg/kg CR8041 및 CR8043 군에서는 생존한 마우스가 없었다. 두 개의 대조 mAb 그룹은 0%의 생존률을 나타내었다. 첫번째 실험에서, mAb CR8020의 투여는 시험된 모든 4가지 농도에서 생존 시간에서, 대조군과 비교하여 통계적으로 의미있는 차이를 가져왔다(p<0.005; Log Rank Test). 두번째 실험에서, mAbs CR8041 및 CR8043의 투여는 또한 대조군과 비교하여 시험된 모든 4 가지 농도에서 생존 시간에서 통계적으로 의미있는 차이를 가져왔다(p<0.001 for both mAbs; Log Rank Test).
도 11에서, mAb 투여 후 21일의 연구 기간 중 마우스의 평균 체중 변화를 나타낸다. 생존률과 마찬가지로 사용된 항체 투여량과 체중 손실 사이에는 명백한 역관계가 존재한다. 항체의 농도가 증가했을 때, 체중 손실은 감소되었다: CR8020, CR8041 또는 CR8043이 30, 10 또는 3 mg/kg 으로 투여된 군의 마우스는 일정한 노화연관 체중 증가와 함께, 제1일부터 제21일까지 대략 10-15%의 평균 체중 증가를 나타내었고, 반면, 1 mg/kg 그룹과 대조 mAb 그룹에서는 마우스의 평균 체중이 연구 기간동안 감소하였다. 체중 변화를 곡선하면적분석(AUC)으로 더욱 상세히 분석하였다. 이 분석의 목적으로, 마우스가 연구의 후속 중 죽거나/안락사된 경우, 최종 관찰된 체중을 제21까지로 이월하였다. 간단히 말하면, 제0일에 마우스 당 체중을 기본값으로 사용하였고 제0일에서 제21까지의 체중 변화를 기본값과 비교하여 측정하였다. AUC를 기본값 위 면적과 아래 면적의 합으로 정의하였다. mAb 투여 군의 평균 AUC 값을 다중 비교를 위한 Dunnet's 조정을 사용한 변화 분석을 사용하여 각각의 대조군의 값과 비교하였다 (표 16).
분석은 CR8020, CR8041 및 CR8043로부터 3, 10 및 30 mg/kg 그룹의 평균 AUC가 상응하는 대조군의 것과 통계적으로 상당히 다르다(P < 0.001)는 것을 나타낸다(표 16). 대조군과 비교하였을 때 CR8041 -뿐 아니라 CR8043 1 mg/kg 투여량 그룹에 대해, 통계적으로 상당한 차이가 발견되었다 (각각, p=0.004 및 p< 0.001). 그러나, CR8020 1 mg/kg 투여량 그룹에서의 두 마리의 생존 마우스로 인해 체중의 변화에서 증가가 관찰되었고 그러므로 대조군과 비교하였을 때 통계적 중요한 차이는 증명되지 않았다. 추가적인 분석이 다중 비교를 위한 Tukey's 조정에 의한 변화 분석을 사용하여 각각의 항체에 대해 항체 농도에 대한 평균 AUC 값을 비교함으로써 체중 손실의 감소에 대한 투여량 반응을 조사하기 위해 수행되었다 (표 16). mAbs CR8020 및 CR8041 둘 다에 대해, 1 mg/kg 그룹에서의 체중 손실은 3 mg/kg 그룹에서보다 통계적으로 상당히 높고 (p< 0.001), 반면 10 및 30 mg/kg 그룹간에는 통계적으로 중요한 차이가 없다 (p> 0.05). mAb CR8043에 대해, 1 mg/kg 그룹에서의 체중 손실은 3 mg/kg 그룹보다 통계적으로 상당히 높았고 ( p< 0.001) 3 mg/kg 그룹의 체중 손실은 10 mg/kg 그룹 (p<0.001)의 것보다 상당히 높았다. CR8043의 10 및 30 mg/kg의 평균 AUC는 크게 다르지 않았다(p=0.997).
마우스의 메디안 임상 점수를 도 12에 나타내었다. 30 및 10 mg/kg에서 CR8020, CR8041 또는 CR8043을 투여한 마우스는 두 연구에 대한 21일 동안의 연구 기간에 걸쳐 메디안 임상 점수 0으로 표현되는 바와 같이, 어느 임상적 신호를 나타내지 않았다. MAb 8020는 또한 3 mg/kg 투여량 그룹에서 임상 점수를 나타내지 않았고, 반면 mAb 8041 및 8043의 3 mg/kg 투여량 그룹에서는 임상 점수에서의 증가가 각각 메디안 점수 1 및 3으로 관찰되었다. 모든 3개의 1 mg/kg 투여 그룹에서, 임상 점수는 모든 그룹에서 메디안 점수 4에 도달하도록 증가하였다. 임상 점수 4로 관찰된 마우스를 같은 날 안락사시켰다. CR8020 1 mg/kg 투여 그룹에서 2 마리의 생존 마우스는 연구 제7일에 아프기 시작하였고 각각 1 및 3의 최대 임상 점수를 나타내었다. 두 마우스는 완전히 회복하였다. CR8041 및 CR8043 3 mg/kg 투여 그룹 중, 체중 손실 프로파일은 임상 점수 프로파일과 유사한 패턴을 나타낸다.
이러한 결과는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 동정되고 개발된 적어도 3개의 인간 항-H3N2 항체 (CR8020, CR8041 and CR8043)가 각각 인 비보에서 인플루엔자 H3N2의 치사량에 대해 보호를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 투여된 각각의 항체의 양과 생존률 사이의 명백한 투여량-반응 관계가 관찰되었다. 결과는 10 mg/kg 이상의 투여량에서 감염 하루 전 투여했을 때 마우스에서 H3N2 보호의 임상 징후를 예방할 수 있었다는 것을 나타낸다. MAb CR8020은 3 mg/kg 이상의 투여량에서 감염 하루 전에 투여했을 때 마우스에서 H3N2 감염에 대한 임상 징후를 예방할 수 있었다.
실시예 15
인 비보에서 치사 H3N2 챌린지에 대한 인간 UgG 모노클로날 항체의 보호 및 치료 활성
인 비보에서 치사 H3N2 A/HK/1/68-MA20 인플루엔자 바이러스 챌린지에 대해 감염-후 모델에서, CR8020으로 예시되는 바와 같은, 본 발명에 기재된 모노클로날 항체의 치료적 효과를 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 마우스 (그룹 당 n=10)에챌린지 하루 전에(그룹 1: 예방적 양성 대조군) 또는 챌린지 후 제1, 2, 3, 4, 5 또는 6일에 (그룹 2~7) 꼬리 정맥(정맥 미좌거근)을 통해 15 mg/kg의 mAb CR8020를 투여하였고, 마우스 당 18g의 평균 체중 및 0.2 mL의 고정된 투여부피를 가정하였다. 그룹 8은 챌린지 후 제1일에 음성 대조 mAb CR3014 (15 mg/kg)를 투여받았다. 마우스를 제0일에 25 LD50 (2.8 log TCID50) A/HK/1/68-MA20 (H3N2) 바이러스를 비강 내 접종하여 챌린지 하였다. 바이러스 배치 및 유형, 마우스의 연령은 실시예 14와 동일하였다. 임상 신호 및 체중을 챌린지 전 제-1일부터 제21일의 연구가 끝날 때까지 매일 측정하였다. 도 13A는 mAb CR8020 (모든 그룹에서 15 mg/kg) 또는 대조 mAb (15 mg/kg)의 정맥내 투여 후 마우스의 생존률을 나타낸다. 챌린지-전 제1일 또는 챌린지 후 제1일 또는 2일에 15 mg/kg mAb CR8020을 투여했을 때, 모든 동물이 바이러스 챌린지에서 생존하였지만, 반면 대조 mAb에서의 생존률은 0%였다. 챌린지 후 제3일 또는 제4일에 15 mg/kg mAb CR8020를 투여했을 때, 생존률은 각각 50% 및 10%였다. 이들 그룹의 각각의 생존 시간은 대조군과 비교하여 통계적으로 상당히 달랐다(제3일 그룹: p<0.001 및 제4일 그룹 p=0.002; Log Rank Test). 제5일 또는 6일에 15 mg/kg CR8020이 투여된 그룹은 0%의 생존률을 나타내었다. 제5일 또는 6일 처리된 그룹의 생존 시간에서 대조군과 비교하여 통계적으로 중요한 차리는 없었다 (각각 p=0.648 및 p=0.342; Log Rank Test).
도 13B에, 21일의 연구 기간 동안 마우스의 제0일과 비교한 평균 체중 변화를 나타내었다. 생존률과 마찬가지로, 15 mg/kg mAb CR8020 투여의 체중 손실과 시간 사이에 명백한 관계가 있다: 15 mg/kg mAb CR8020로의 치료가 최후 시점에 투여되었을 때, 체중 손실이 증가하였다.
체중 변화를 곡선하면적(AVC) 분석을 사용하여 더욱 상세히 통계적으로 분석하였다 (표 17). 곡선하면적 분석의 경우, 마우스가 연구의 추적 중 죽거나 안락사되면 최후 관찰된 체중을 제21일까지 이월하였다. 즉, 제0일에 마우스 당 체중을 기본값으로 사용하였고 제0일부터 제21일까지의 체중변화를 기본과 비교하여 측정하였다. AUC를 기본 위 면적과 기본 아래 면적의 합계로 정의하였다.
마우스의 메디안 임상 점수를 도 13C에 표시하였다. 챌린지-전 제-1일에 15 mg/kg CR8020이 투여된 마우스 중 모두가 생존하였고 관찰 기간 동안 어느 임상 신호도 나타내지 않았다. 그러나, 챌린지 후 제1일에 15 mg/kg CR8020로 처리한 마우스는 10마일 중 4마리가 임상 신호를 나타내었고 최대 임상점수가 1과 3 사이에 도달하였다. 챌린지 후 제 2일에 15 mg/kg CR8020로 처리된 동물 중 모두가 생존하였다. 그러나, 10마리 중 9마리는 최대 임상 점수가 2 또는 3에 도달함을 나타내었다. 챌린지 후 제3일에 15 mg/kg CR8020로 처리된 동물들은 50% 생존을 나타내었다. 생존자들 중 (n=5), 모든 동물은 최대 임상점수 3의 임상 신호를 나타내었다. 챌린지 후 제4일에 15 mg/kg CR8020이 투여된 모든 동물에서 한 마리를 제외한 모두가 죽었다. 생존한 마우스는 최대 점수가 2에 도달하는 임상 신호를 나타내었다. 치료군에 걸쳐 생존한 모든 마우스는 제21일에 증상이 없어졌다.
임상 점수를 GENMOD 과정(SAS)을 사용하여 개체로서 마우스 및 순서 척도에서 측정된 자료를 사용하여 반복 측정을 위한 모델에 맞도록 분석하였다 (표 18). 곡선들은 다른 패턴을 가지므로, 가변적인 "일(day)"을 이 모델에서의 변할 수 있는 클래스로 입력하였다. 마우스 100%가 생존한 챌린지 전 제-1일 및 챌린지 후 제1일과 제2일에 15 mg/kg mAb CR8020로 처리한 그룹들로부터, 메디안 임상 점수는 21일 동안의 연구 기간의 대부분 동안 대조 mAb 그룹과 상당히 달랐다(모두 3개 군에 대해 ≤O.OO1). 각각 50%와 10%의 마우스가 생존한 챌린지 후 제3일 또는 제4일에 15 mg/kg mAb CR8020 로 처리한 그룹으로부터, 메디안 임상 점수는 또한 21일 동안의 연구 기간의 대부분 동안 대조 mAb 그룹과 상당히 달랐다 (두 그룹에 대해 p< 0.05. 챌린지 후 제5일 또는 제6일에 15 mg/kg mAb CR8020로 처리된 그룹으로부터, 메디안 임상 점수는 제3일에만 대조 mAb 그룹과 상당히 달랐다 (p≤O.001). 통계적 중요성에도 불구하고, 이 차이는 의미있게 고려되지 않는다.
결론적으로, mAb CR8020 15 mg/kg으로의 처리는 치사 H3N2 마우스 모델에서 챌린지 후 제2일까지 100% 보호를 제공한다. 챌린지 후 제3 또는 제4일에 투여했을 때, 15 mg/kg mAb CR8020 처리는 부분적 보호를 제공한다. 챌린지 후 제5일 또는 제6일에 투여했을 때, 치사 H3N2 마우스 모델에서 15 mg/kg mAb CR8020의 보호 효과는 관찰되지 않았다.
이들 결과는 본 명세서에 기재되고 항체 CR8020로 예시된 바와 같이, H3N2 인플루엔자 바이러스에 대한 모노클로날 항체로 처리된 감염-후 처리가 H3N2 인플루엔자 바이러스의 치사 투여량으로 챌린지 된 후, 마우스에서 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 포유동물 개체를 구조할 수 있다는 것을 나타낸다. 최종 단계, 즉 감염-후 제4일에도, 항체는 인플루엔자 H3N2 바이러스에 의한 치사 감염으로부터 마우스를 부분적으로 구조할 수 있다. 명백히, 감염 후 제21일에, 모든 생존하는 항체-처리된 동물들은 정상 체중 수준에 도달하였고 어느 남은 임상 신호를 나타내지 않았다.
실시예 16
인 비보 치사 H7N7 챌린지에 대한 인간 IgG 모노클로날 하체의 예방적 활성
인 비보 H7N7 인플루엔자 바이러스에 의한 치사 챌린지에 대하여, CR8020으로 예시되는 본 명세서에 기재된 모노클로날 항체의 예방적 효과를 시험하는 연구를 수행하였다. MAb CR8020를 인플루엔자 A/Chicken/Netherlands/621557/2003 (H7N7) 바이러스(Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, The Netherlands)에 순응된 마우스를 사용하여 마우스 치사 챌린지 모델에서의 예방적 효과에 대해 시험하였다. A/CH/NL/621557/03 (H7N7)바이러스를 3 폐-대-폐 계대배양 후 마우스에 순응시켰다. H7N7 계대배양 3 바이러스 순응된 마우스를 CVF 실험실에서 수정란에서 번식시켰다. 모든 마우스(Balb/c, 암컷, 6-8 주령, 그룹 당 n=8)을 실험 개시 전 최소 4일의 기간 동안 적응시키고 유지시켰다. MAb CR8020을 챌린지 하루 전에 꼬리 정맥에 정맥주사로 30, 10, 3 또는 1 mg/kg 투여하였고, 마우스의 평균 체중은 18g으로 가정하였고 고정 투여 부피는 0.2 mL이다. 대조군을 30 mg/kg 음성 대조 mAb CR3014를 투여하여 취하였다. 그리고 나서 마우스를 제0일에 25 LD50 A/CH/NL/621557/03 (H7N7) 바이러스를 비강내 접종으로 챌린지하였다. 투여된 바이러스의 실제 투여량은 동물의 접종이 완전히 끝난 후 남은 접종물로부터 약간의 복제 샘플을 적정하여 평가하였다. 접종물의 바이러스 역가(TCID5o/mL)를 MDCK 세포에서 측정하였다. 임상 신호와 체중을 실시예 14에 기재된 것과 동일한 방법으로 챌린지 하루 전부터 제21일에 연구가 끝날 때까지 매일 측정하였다. 제0일에 mAb 플라즈마 수준을 분석하고 제 21에 적혈구 응집 억제(HA) 항체의 존재를 확인하기 위해, 챌린지 직전, 제0일(D0)에, 그리고 감염 후 D21에 모든 마우스로부터 혈액 샘플을 취하였다.
모든 마우스는 순응기간 동안 활동적이었고 질병의 신호를 나타냄 없이 건강하게 보였다. 도 14는 mAb 투여 후 마우스의 생존률을 나타낸다. 1 mg/kg mAb CR8020 이상이 투여된 마우스는 100%의 생존률을 나타낸 반면, 대조 mAb 군은 0%의 생존률을 나타내었다. 도 14B는 mAb 투여 후 21일의 연구 기간 동안 마우스의 평균 체중 변화를 나타낸다. mAb CR8020 3, 10 및 30 mg/kg 그룹에서, 마우스는 21일에 걸친 연구 기간 동안 체중 손실이 없었고, 반면 mAb CR8020 1 mg/kg 및 대조 mAb 그룹은 체중 감소가 관찰되었고, mAb CR8020 1 mg/kg 그룹에서 마우스의 평균 체중은 제21일에 기본 수준을 회복하였다. 체중 변화는 곡선하면적(AUC) 분석으로 더욱 상세히 분석하였다. 곡선하면적 분석을 위해, 마우스가 연구 추적 중 죽고/안락사되는 경우, 최종 관찰된 체중을 제21일까지 이월하였다. 즉, 제0일에서의 마우스 당 체중을 기본값으로 사용하였고 제0일부터 제21일까지의 체중 변화를 기본과 비교하여 측정하였다. AUC를 기본 위 면적과 기본 아래 면적의 합으로 정의하였다. 체중 손실과 사용한 항체 투여량 사이에는 명백한 역관계가 있다. 항체의 농도가 증가할 때, 체중 손실은 감소하였다. 대조 mAb와 비교하여, 체중 손실의 평균 차이는 mAb CR8020 1, 3, 10 및 30 mg/kg 그룹에서 각각, 47.44, 79.75, 86.71 및 80.48 g*day 그룹이었다. 모든 차이는 통계적으로 중요하였다(p<0.001). 마우스의 메디안 임상 점수를 도 14C에 표시하였다. 한, 두 마리를 제외하고 각 그룹 내의 모든 동물은 챌린지 후 제1일에 임상 신호(점수 = 1)를 나타내었다. 이것은 연구 중 취한 챌린지되지 않은 그룹도 제1일에 유사한 결과를 나타내었으므로, 아마도 바이러스 챌린지와 관련되지 않았을 것이다 (데이타는 도시하지 않음).
챌린지 전 제-1일에 3, 10 또는 30 mg/kg mAb CR8020로 처리한 마우스 중, 모두가 생존하였고 어느 동물도 관찰기간 (감염 후 제2일부터 제21일까지)동안 임상 신호를 나타내지 않았다. 챌린지 전 제-1일에 1 mg/kg mAb CR8020로 처리한 마우스는 100% 생존률을 나타냈지만, 8마리 중 8마리가 최대 임상 점수가 3에 도달하는 임상신호를 나타내었다.
이들 결과는 본 명세서에 기재된 바와 같이 동정되고 개발된 인간 항-H3N2 항체 CR8020 (CR8020)이 인 비보에서 인플루엔자 H7N7의 치사 투여량에 대하 이종 서브타입 보호를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 3 mg/kg 이상의 투여량을 감염 하루 전에 투여했을 때, mAb CR8020는 마우스에서 H7N7 감염의 임상적 징후를 완전히 예방할 수 있었다. 감염 하루 전에 1 mg/kg CR8020을 투여했을 때, 모든 마우스가 치사 챌린지에서 생존하였고, 체중 손실과 임상 신호는 21일 연구 기간의 마지막에 완전히 해결되었음을 나타내었다.
H7N7 마우스 모델에서 mAb CR8020, CR8041 및 CR8043의 예방적 효율을 평가하고 비교하기 위해 두번째 연구를 수행하였다. MAb CR8020, CR8041 및 CR8043 (PER.C6® 세포에서 생산)을 인플루엔자 A/Chicken/Netherlands/621557/2003 (H7N7)바이러스(Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, The Netherlands)에 순응된 마우스를 사용한 마우스 치사 챌린지 모델에서 예방적 효과에 대해 시험하였다. 즉, 모든 마우스 (Balb/c, 암컷, 6-8 주령, 그룹 당 n=8 마리)를 순응시키고 실험 개시 전 최소한 4일의 기간 동안 유지하였다. MAb CR8020를 챌린지 전 제-1일에 꼬리 정맥에서 정맥주사로 10, 3 또는 1 mg/kg을 투여하였고, 마우스당 평균 체중은 18g이고 고정된 투여 부피는 0.2 mL으로 가정하였다. Mabs CR8041 및 CR8043를 동일한 방식으로 30, 10, 3 또는 1 mg/kg로 투여하였다. 대조군은 30 mg/kg 음성 대조 mAb CR3014를 투여하여 취하였다. mAb 투여 후, 마우스를 비강내 접종으로 25 LD50 마우스 순응된 A/CH/NL/621557/03 (H7N7) 바이러스로 제0일에 챌린지하였다. 임상 신호 및 체중 변화를 챌린지 전 제-1일부터 제21일에 연구가 끝날 때까지 매일 측정하였다.
도 15에서, mAb의 예방적 투여 후의, 마우스의 생존률, 체중변화% 및 임상 점수를 표시하였다. 도 15A에 따르면, 3 또는 10 mg/kg CR8020, 10 또는 30 mg/kg CR8041이 투여된 그룹과 30 mg/kg CR8043이 투여된 그룹에서 100% 생존이 관찰되었다. 대조 mAb 그룹에서, 생존률은 0%였다. CR8020의 3가지 투여 수준 모두에서, 및 CR8041의 4개 모든 투여 수준에서의 예방적 투여는 대조 mAb 그룹과 비교하여 생존시간의 통계적으로 중요한 개선을 제공하였다(log-rank, p<0.002). CR8043 1 mg/kg의 예방적 투여는 대조 mAb 그룹(log-rank, p=0.692)과 비교하여, 생존 시간에 통계적으로 중요한 개선을 가져오지 않았다. CR8043 투여량을 3 mg/kg 이상으로 증가시킨 것은 대조 mAb 그룹과 비교하여, 생존 시간의 통계적으로 의미있는 개선을 가져왔다(log-rank, p<0.034).
포스트 hoc 분석에서, 생존시간을 mAbs CR8020, CR8041 및 CR8043의 가장 낮은 투여량 그룹과 비교하였다. 1 mg/kg CR8020의 예방적 투여는 CR8041 1 mg/kg 및 CR8043 1 mg/kg과 비교하여, 생존 시간에 통계적으로 의미있는 개선을 가져왔다. (log-rank, 각각 p=0.029 및 p<0.001). 이에 더하여, 1 mg/kg CR8041의 예방적 투여는 1 mg/kg CR8043와 비교했을 때 생존시간의 통계적으로 의미있는 개선을 가져왔다(log-rank, p=0.004).
도 15B에서, mAb의 예방적 투여 후 21일의 연구 기간 동안 마우스의 평균 체중 변화를 나타내었다. mAb CR8020 및 mAb CR8041 1 mg/kg 그룹에서, 대조 mAb 그룹과 비교하여 심각한 체중 손실이 관찰되었다. mAb CR8020 및 CR8041의 더 높은 투여량 그룹에서, 21일 연구 동안의 체중 손실은 제한되거나 또는 없었다. mAb CR8043이 투여된 그룹에서 심각한 체중 손실이 모든 그룹에서 관찰되었고, 30 mg/kg이 투여된 그룹의 평균 체중은 제21일에 기본선 수준으로 거의 회복되었다. 체중 변화를 곡선하면적 (AUC) 분석으로 더욱 상세히 분석하였다 (표 21). 체중 손실과 사용된 항체의 투여량 사이에 명백한 역관계가 있다. 항체의 농도가 증가했을 때, 체중 손실은 감소되었다. 1 mg/kg의 CR8020을 사용하여, 대조군과 비교하여 체중 손실에서 통계적으로 의미있는 감소는 없었다(p=0.356). 투여량을 3 내지 10 mg/kg으로 증가시키는 것은 대조군과 비교하여 체중 손실에서 통계적으로 의미있는 감소를 가져왔다 (두 경우 모두 p<0.001). CR8041 1 mg/kg을 사용하여, 대조군과 비교하여 체중 손실에서 통계적으로 의미있는 감소는 없었다.(p=1).
CR8041 투여량을 3, 10 또는 30 mg/kg로 증가시키는 것은 대조군과 비교하여, 통계적으로 의미있는 감소를 가져온다(3개 모두의 경우, p<0.001). CR8043 1, 3 또는 10 mg/kg으로는 대조군과 비교하여 통계적으로 중요한 감소가 없었다 (각각, 0.997, 0.510 및 0.992). 투여량의 30 mg/kg으로의 증가는 대조군과 비교하여, 체중 손실에서 통계적으로 중요한 감소를 가져왔다 (p<0.001). 체중 변화 데이타의 평균 AUC의 분석에 더하여, mAbs CR8020, CR8041 및 CR8043를 고정 인자로서 모델에 포함된 항체와 투여량을 사용한 변화의 일변량해석을 사용하여 비교하였다. CR8020의 30 mg/kg 투여량은 연구에 포함되지 않았기 때문에, 비교는 1, 3 및 10 mg/kg의 항체 투여량으로 제한되었다. 항체들 간의 차이는 다중 비교를 위한 Sidak adjustment을 이용한 주변평균을 사용하여 측정하였다. 고려된 항체의 3가지 투여량에 걸쳐, CR8020로의 처리는 CR8041 and CR8043과 비교하여 체중 손실의 통계적으로 중요한 개선된 감소를 가져왔다 (23.7 및 68.29 g*day의 주변평균에서의 평균차, 각각 p=0.013 및 p<0.001). 이에 더하여, CR8041로의 처리는 CR8043과 비교하여 체중 손실에 통계적으로 중요한 개선된 감소를 가져왔다(44.56 g*day의 주변 평균의 차이, p<0.001).
마우스의 메디안 임상 점수를 도 15C에 표시하였다. 제0일에 하나를 제외한 모든 마우스(3 mg/kg CR8020 group)는 제0일에서 제3일까지 임상 신호((score = 1, rough coat)를 나타내었다. 이러한 증가는 순응기간과 제-1일에는 관찰되지 않았다. 이러한 증가된 임상 점수의 원인은 명백하지 않다. 챌린지 전 제-1일에 3 또는 10 mg/kg mAb CR8020 로 처리된 그룹 중, 메디안 임상 점수는 챌린지 후 제9일에 0으로 회복된 반면, 대조 그룹에서는 메디안 임상 점수는 제8일에 4에 도달하였고, 모든 마우스는 제9일에 죽거나 안락사되었다. CR8020 1 mg/kg 그룹은 제4-13일의 메디안 임상점수 3에서, 제15일에 점수 0으로 회복되는 것을 나타내었다. 챌린지 전 제-1일에 3, 10 또는 30 mg/kg mAb CR8041로 처리된 그룹 중에서, 메디안 임상 점수는 각각 챌린지 후 제9일, 제10일, 또는 제12일에 0으로 회복되었다 CR8041 1 mg/kg 그룹은 챌린지 후 제10일에 임상점수 4에 도달하였다. 1, 3 또는 10 mg/kg CR8043으로 처리된 그룹 중, 메디안 임상 점수는 각각 제9, 9 또는 12일에 4에 도달한 반면, 30 mg/kg CR8043 그룹의 메디안 임상 점수는 제6-13일에 3에 도달하였고 제14일에 0으로 회복되었다.
상기 결과는 인간 항-H3N2 항체 CR8020, CR8041 및 CR8043이 인비보에서 인플루엔자 H7N7의 치사 투여량에 대해 이형서브타입 보호를 제공할 수 있다는 것을 분명이 나타낸다. Mab CR8020는 생존 시간과 체중 변화의 post hoc 분석연구 결과를 근거로 인플루엔자 A/CH/NL/621557/03 (H7N7) 바이러스에 순응된 마우스에 대해 3 가지 mAb 중 가장 강력하다는 것을 발견하였다. 감염 하루 전 투여된 3 또는 10 mg/kg mAb CR8020의 투여량에서, 마우스의 100%가 치사 챌린지를 생존하였고 H7N7 감염의 임상 징후는 크게 감소하였다. 감염 하루 전 1 mg/kg CR8020의 투여량에서, 마우스의 75%가 이 실험의 치사 챌린지에서 생존하였고 생존 마우스의 임상 신호는 21일의 연구 기간 중 제15일에 완전히 해소되었다.
실시예 17
인 비보 치사 H7N7 챌린지에 대한 인간 IgG 모노클로날 항체의 치료적 활성
이 연구는 H7N5 모델에서 mAb CR8020의 치료적 효능 및 기회(window)를 평가하기 위해 수행하였다. (PER.C6® 세포에서 생산된) MAb CR8020를 인플루엔자 A/Chicken/Netherlands/621557/2003 (H7N7) 바이러스 (Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, The Netherlands)에 순응된 마우스를 사용한 마우스 치사 챌린지 모델에서 치료적 효능에 대해 시험하였다. 즉, 모든 마우스(Balb/c, 암컷, 6-8 주령, 그룹 당 n=8)을 실험 개시전 최소한 4일의 기간 동안 적응시키고 유지하였다. MAb CR8020를 챌린지 전 제-1일 (그룹 1: 예방적 양성 대조) 또는 챌린지 후 1,2,3,4,5 또는 6일 (그룹 2-3)에 꼬리 정맥에 정맥주사로 15 mg/kg를 투여하였고, 마우스의 평균 체중은 18 g이고 고정된 투여 부피는 0.2 mL로 가정하였다. 그룹 8은 챌린지 후 제1일에 음성 대조 mAb CR3014 (15 mg/kg)를 투여하였다. 마우스는 비강 접종에 의해 25 LD50 마우스 순응된 A/CH/NL/621557/03 (H7N7) 바이러스를 사용하여 제0일에 챌린지하였다. 임상 신호 및 체중을 챌린지 전 -1일부터 제21일에 연구가 끝날 때까지 측정하였다.
도 16A는 mAb CR8020 (모든 그룹에서 15 mg/kg) 또는 대조 mAb (15 mg/kg)의 정맥 투여 후, 마우스의 생존률을 나타낸다. 15 mg/kg mAb CR8020를 첼린지 -전 제1일 또는 챌린지 후 제1일 또는 제3일에 투여했을 때, 모든 동물들이 바이러스 챌린지에서 생존했고, 반면 대조 mAb 그룹에서는 생존률이 0%였다. 15 mg/kg mAb CR8020를 제2일과 제4일에 투여했을 때, 각각 87.5% 및 50%의 생존률이 관찰되었다. 이들 그룹의 생존시간은 대조 mAb 그룹의 생존시간과 통계적으로 의미있게 달랐다 (각각 p=0.002 및 p=0.014). 제5일 및 제5일에 15 mg/kg CR8020로 시험된 그룹은 0%의 생존률을 경험했고 대조 mAb 그룹과 비교하여 통계적으로 의미있는 차이가 없었다(각각 p=0.837 및 p=0.876).
도 16B에서, 21일의 연구 기간 동안 마우스의 제0일에 대한 평균 체중 변화를 나타내었다. 일반적으로, 평균 체중 손실은 mAb CR8020이 챌린지 후 최후 시점에 투여되었을 때 증가한다. 그러나, mAb CR8020 제2 및 제3일 처리군의 평균 체중 곡선은 제10일에 교차했는데, 제2일 처리군에서 단 한마리의 마우스도 생존하지 않았기 때문이다. 체중 변화의 곡선하면적 분석은 제4일 내지 제6일의 처리와 비교하여 제-1일 내지 제3일의 처리 사이의 평균 체중 손실에서 급격한 전환을 나타낸다 (표 22). 챌린지-전 제 -1일 또는 챌린지 후 제1, 2, 또는 3일에 15 mg/kg의 CR8020 처리는 대조군과 비교하여 체중 손실에서 통계적으로 의미있는 감소를 가져왔다 (모든 4개의 그룹에 대해 p<0.001). 제4, 5, 또는 6일에 15 mg/kg의 CR8020 처리는 대조군과 비교하여 체중 손실에서 통계적으로 의미있는 감소를 가져오지 않았다 (각각, p=0.566, p=0.979 및 p=0.858).
마우스의 메디안 임상 점수를 도 16C에 표시하였다. 챌린지 전 제-1일에 15 mg/kg CR8020로 처리된 마우스 중 모두가 생존하였고, 관찰 기간동안 어느 동물도 임상 신호를 나타내지 않았다. 챌린지 후 제1일에 처리된 동물은 100% 생존하였지만, 8마리 중 7마리는 임상 신호가 최대 임상 점수 1에 도달하였다. 8번째 동물은 최대 임상점수가 3에 도달하였다. 챌린지 후 제2일에 처리된 동물들 중, 한마리를 제외하고 모두 생존하였다. 생존 동물들(8마리 중 7마리)는 임상 신호가 최대임상점수 1(n=4) 또는 3(n=3)에 도달하였음을 보여준다. 챌린지 후 제3일에 처리된 동물들은 100% 생존을 나타냈고 모든 동물은 최대 임상점수 3의 임상 신호를 나타내었다. 챌린지 후 제4일에 처리된 동물 중, 50%가 치사 챌린지를 살아남았다. 생존 동물들은 최대임상점수가 3에 도달하는 임상 신호를 나타내었다. 챌린지 후 제5 및 6일에 처리된 동물들은 생존하지 않았다. 임상 신호를 GENMOD 과정 (SAS)을 사용하여 분석하여 객체로서 마우스를 사용하여 반복 측정값에 모델을 맞추었고 데이타를 순서 척도상으로 측정하였다(표 23). 챌린지 전 제-1일 및 챌린지 후 제1, 2, 3, 또는 4일에 15 mg/kg mAb CR8020로 처리된 그룹으로부터, 메디안 임상 점수는 21일의 연구 기간의 대부분 중 대조 mAb 그룹과 통계적으로 의미있게 달랐다. (제8일-21일; 4개의 그룹 모두에 대해 p <0.038). 챌린지 후 제5일에 15 mg/kg mAb CR8020로 처리된 그룹으로부터 메디안 임상 점수는 제8일에만 대조 mAb 그룹과 의미있게 달랐다 (p≤O.001). 이 차이는, 비록 통계적으로 의미있지만, 중요하다고 간주되지 않는다. 15 mg/kg mAb CR8020 제6일 처리 그룹의 메디안 임상 점수는 대조군과 통계적으로 다르지 않았다.
이 연구는 15 mg/kg mAb CR8020를 사용한 치료가 치사 H7N7 마우스 모델에서 챌린지 후 최대 3일까지 투여되었을 때 87.5-100% 보호를 제공한다는 것을 나타낸다. 챌린지 후 제4일에 투여되었을 때, 15 mg/kg mAb CR8020로의 처리는 부분적인 보호를 제공한다. 챌린지 후 제5일 또는 제6일에 투여했을 때 치사 H7N7 마우스 모델에서 15 mg/kg mAb CR8020 보호 효과는 관찰되지 않았다. 다시 말하면, 사망 전 4일 이상 투여했을 때, CR8020는 이러한 치사 마우스 모델에서 보호를 제공하였다.
실시예 18
계통발생적 그룹 1 및 2로부터 다중 인플루엔자 서브타입을 효과적으로 중화시키는 모노클로날 항체의 칵테일
매해 계절적 인플루엔자 백신은 인플루엔자 A 균주들에 대한 면역을 유도하는 두 다른 제제, 순환적 H1 서브타입의 대표 및 순환적 H3 균주의 대표로 구성된다. 이것에 대한 근원적인 이유는 H1 및 H3 서브타입의 인플루엔자 균주가 다른 서브타입에 대한 보호를 유도하지 않는 유형으로 제조된 백신과 다르기 때문이다. 이상적으로, 인플루엔자를 치료하기 위한 광범위하게 보호적인 모노클로날 항체는 계통발생 그룹 1(H1) 및 그룹 2 (H3) 둘 다로부터의 인플루엔자 균주에 대해 효과적일 것이다. 그러나, HA 분자들 간에 서열 차이에 기인하여 이와 같은 단일 항체는 거의 발견되지 않는다. 예를 들면, WO 2009/115972에 기재된 Fab28 항체는 아마도 계통적 그룹들 내의 바이러스와 비교하여 그룹 1 및 그룹 2 바이러스 사이의 에피토프의 적은 전환에 기인하여 H3 서브타입 바이러스보다 H1 서브타입과 훨씬 더 결합하고 중화시킨다. 둘 다의 계통발생 그룹으로부터 다중 인플루엔자 서브타입에 대해 효과적인 단일 산물의 목적에 도달하기 위해, 두 가지 이상의 다른 항체들을 칵테일로 결합하는 것이 필요할 것이다. 성공을 위해, 이와 같은 제제는 서로 방해하지 않는 항체들로 구성되어야 한다.
H1, H5 및 H9 서브타입으로부터의 바이러스들을 효율적으로 중화시키는 항체들이 WO2008/028946에 기재되었고, 통상적으로 예들 들면, 항체 CR6261 및 CR6323들이다. CR6261의 결합 영역 (에피토프)는 H1 또는 H5 HA 분자 및 CR6261의 공동-결정화를 사용하여 상세히 밝혀졌다(PDB database entries 3GBM and 3GBM at http://www.pdb.org and Ekiert et al, 2009 참조). 본 발명의 모노클로날 항체가 앞서 기개된 CR6261 항체와 결합하는데 사용될 수 있는가를 조사하기 위해, 항체들이 계통발생적 그룹 1 및 2 둘 다로부터의 서브타입과 결합할 수 있는가를 시험하였다. 그로부터, Elisa 및 FACS 결합 실험을 H1 및 H5 서브타입 뿐만 아니라 H3 및H7 서브타입의 HA 분자를 사용하여 실시예 7에 기재된 바와 같이 행하였다. 결과를 표 20에 요약하였고 그룹 1의 바이러스를 광범위하게 중화시키는 항체는 그룹 2의 바이러스와 결합하지 않고 또 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 항체는 서로 방해하지 않으므로 각각의 서브타입에 대한 항체의 중화 효율은 유지될 것이고 그 결과 그룹 1 및 2 서브타입 둘 다의 중화에 효과적이다.
그러므로 한편 CR6261 및/또는 CR6323 및 다른 한편 CR8020, CR8041 및/또는 CR8043 포함하는 칵테일은 적어도 H1 및 H3 모두의 서브타입의 바이러스에 활성일 것이다. 그러므로, 하나의 제제를 사용하여 계통발생적 그룹 1 및 2로부터의 인플루엔자 서브타입의 효과적인 보호가 가능하다.
실시예 19
결합 분자의 결합 반응속도
CR8020 및 CR8043의 파파인 분열된 Fab 단편의 친화도를 Octet RED 시스템 및 ForteBio사의 스트렙타비딘 바이오센서를 사용하여 측정하였다. H3 서브타입 A/Wisconsin/67/2005 (Protein Science) 및 A/B risbane/ 10/2007 (Protein Science)의 인플루엔자 혈구응집소 항원을 스트렙타비딘 바이오센서에 대한 부동화를 위해 비오티닐화하였다(ForteBio). Fab 결합 실험을 키네틱 완충액(ForteBio, 18.5032) 중에서 각각 CR8020 및 CR8043에 대해 2.3-150 nM 및 0.16-30 nM 범위의 농도를 사용하여 5회 반복하였다. Octet에 대한 친화력 측정을 위한 실험을 다음과 같이 준비하였다:1800초 동안 스트렙타비딘 바이오센서에 비노티닐화된 혈구응집소의 부동화 및 이어서 1200초 동안 연속의 희석된 Fab CR8020 및 CR8043의 해리, 그리고 이어서 1800초 동안 키네틱 완충액에서 순차적 해리. 결합 데이타를 1:1 모델을 사용하여 Octet 분석 소프트웨어로 분석하였다. H3 서브타입의 HA에 대한 결합분자의 친화력 상수(IQ-value)를 표 24에 나타내었다.
표 1: 첫번째 라운드 Vkappa, Vlambda 및 VH 증폭
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표 2: 두번째 라운드 Vkappa, Vlambda 및 VH 증폭
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Figure 112011093329350-pct00003
표 3. 두번째 라운드 VL 영역 증폭 개요
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표 4. 두번째 라운드 VH 영역 증폭 개요
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표 5: 개별적인 IgG 메모리 B 세포 라이브러리의 특질
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표 6: ELISA로 측정한 다양한 HA 서브타입의 HA 분자에 대한 단일-사슬 파아지 항체의 교차-결합 활성(ELISA titer; OD 492 nm). X= 측정안함; H3= H3 서브타입의 HA; H7= H7 서브타입의 HA; HB= 인플루엔자 바이러스 B의 HA.
Figure 112011093329350-pct00008
표 7: ELISA로 측정한 다양한 HA 서브타입의 HA 분자에 대한 PEG/NACl-침전된 및 필터-살균된 파아지 항체의 교차-결합 활성(OD 492 nm). H1= H1 서브타입의 HA, H3= H3 서브타입의 HA; H5= H5 서브타입의 HA; H7= H7 서브타입의 HA; B(O)= 인플루엔자 바이러스 B/Ohio/01/2005의 HA.
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표 8: PEG/NaCl-침전된 및 필터-살균된 파아지 항체의 FACS 분석(MFI=평균 형광 강도로 표시). PER.C6=트란스펙션 안된 PER.C6 세포 (대조); mH1, mH3, mH5, mH7, mHB = 각각, 서브타입 H1, H3, H5, H7 및 인플루엔자 바이러스의 막 결합된 HA.
Figure 112011093329350-pct00010
표 9: HA 특이 면역글로불린의 CDR 영역의 데이타 (SEQ ID NO).
Figure 112011093329350-pct00011
표 10: HA-특이 IgGs. 중사슬 및 경사슬의 가변 영역들의 뉴클레오티드와 아미노산 서열의 SEQ ID NO의 데이타.
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표 11: 선택된 IgG에 의한 인플루엔자 바이러스 H3N2의 인 비트로 중화
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표 12: 항-H3N2 IgGs의 교차-결합 반응성. NCal.=A/New Caledonia/20/1999 (H1N1); Wisc.=A/Wisconsin/67/2005 (H3N2); NY.=A/New York/55/2004 (H3N2),
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표 13: 항-H3N2 IgGs의 교차-중화 활성; ND=실행안함
Figure 112011093329350-pct00015
표 14: H3 mAbs CR8020, CR8041 및 CR8043의 결합 영역 주변의 서열 보존
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표 15: 여러가지 인플루엔자 A 균주에 대한 중화 역가
Figure 112011093329350-pct00017
모든 SK50 역가는 ㎍/ ml 단위; 마우스-적응 균주; Ma '대유행' H7 균주
표 16: 제0일의 기본선으로부터 체중 변화의 평균 곡선하 면적
Figure 112011093329350-pct00018
amAb 투여 그룹의 평균 AUC 값을 다중 비교를 위한 Dunnet's 평가의 분산분석을 사용하여 대조 Ab 그룹과 비교하였다.
b항체 농도 당 평균 AUC 값을 다중 비교를 위한 Tukey's 평가의 분산분석을 사용하여 각각의 항체에 대해 비교하였다.
ns= 통계적으로 의미 없음
표 17: 제0일의 기본선으로부터 체중 변화의 평균 곡선하면적
Figure 112011093329350-pct00019
a후-hoc 분석에서 다중 비교를 위한 Dunnet's 평가의 분산분석을 사용하여 15 mg/kg mAb CR8020 투여 그룹의 평균 AUC 값을 대조 mAb 그룹과 비교하였다. 15 mg/kg mAb CR8020를 사용한 예방적 처리는 대조그룹과 비교하여 체중 손실에서 통계적으로 의미있는 감소를 가져왔다 (p<0.001).
15 mg/kg mAb CR8020를 사용한 제1일, 제2일 또는 제3일에서의 치료적 처리 또한 대조 그룹과 비교하여 체중 손실에서 통계적으로 의미있는 감소를 가져왔다 (각각, p<0.001, p<0.001 및 p=0.003).
15 mg/kg mAb CR8020를 사용한 제4일, 제5일 또는 제6일의 처리는 대조그룹과 비교하여 통계적으로 의미있는 감소를 가져오지 않았다(모든 3개의 그룹에 대해 p> 0.05).
표 18: 메디안 임상 점수
대조 mAb 그룹과 비교한 임상 점수들 간의 의미있는 차이들 간의 간격을 열거하였다(예를 들면, 제-1일의 15 mg/kg과 대조군 사이에, 임상점수의 차이는 제4일 이후로 의미가 있다).
Figure 112011093329350-pct00020
표 19: 제0일에 기본선으로부터 체중 변화의 평균 곡선하면적
Figure 112011093329350-pct00021
amAb CR8020 투여그룹의 평균 AUC 값을 후-hoc 분석에서 다중 비교를 위한 Dunnet's 평가의 분산분석을 사용하여 대조 mAb 그룹과 비교하였다.
표 20: 인플루엔자 바이러스 HA에 특이적인 모노클로날 항체의 결합 및 중화 특성에 대한 요약
Figure 112011093329350-pct00022
표 21: 제0일에 기본선으로부터 체중변화의 평균 곡선하면적
Figure 112011093329350-pct00023
amAb CR8020 투여그룹의 평균 AUC 값을 후-hoc 분석에서 다중 비교를 위한 Dunnet's 평가의 분산분석을 사용하여 대조 mAb 그룹과 비교하였다.
표 22: 제0일에 기본선으로부터 체중 변화의 평균 곡선하면적
Figure 112011093329350-pct00024
a평균 AUC 값을 더 작은 중량(less weight)을 이상값(outlier)으로 할당하는 RobustReg 과정(SAS)을 사용하여 비교하였다.
표 23: 메디안 임상 점수
Figure 112011093329350-pct00025
표 24: 결합 반응속도
Figure 112011093329350-pct00026
중사슬 및 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열:
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참고문헌
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European Collection of Cell Cultures 96022940 19960229
SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland BV <120> Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus H3N2 and uses thereof <130> 0170 WO 00 ORD <140> PCT/EP2010/056217 <141> 2010-05-06 <160> 258 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC08-001 VH DNA <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ctgatccagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agcaactacg tgagctgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg ggctggagtg gctctcactt atttacacgg gtggtaccac atactacgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaact ccaagaatac ggtgtttctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacgcg gccatgtatt actgtgcgag agtgtcagca 300 ttacggtttt tgcagtggcc aaactacgcg atggacgtc 339 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC08-001 VH PROTEIN <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Leu Ile Tyr Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Ser Ala Leu Arg Phe Leu Gln Trp Pro Asn Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Val <210> 3 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC08-001 VL DNA <400> 3 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacggtc gatcaccatc 60 tcctgctctg gaacccgcag tgacgttggt ggtcataatt atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtcatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc agcacggcct ccctgaccat ctctggcctc 240 cagtctgagg acgaggctga ttattactgc agctcttata caggtgaagg ccccctagga 300 gtg 303 <210> 4 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC08-001 VL PROTEIN <400> 4 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly His 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser His Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Gly Glu 85 90 95 Gly Pro Leu Gly Val 100 <210> 5 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC08-003 VH DNA <400> 5 gaggtgcagc tggtggagac cgggggagac ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgttcag cctctgaatt cagcttcagt agttattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac atgaagcaag atggaagtga gaagtactat 180 gtggactctg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcattatat 240 ctgcaaatga acagcctgag aggcgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggggttcc 300 tgtgacgatt cttggactgg ttgtcatgat gcttttgaca tc 342 <210> 6 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC08-003 VH PROTEIN <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Glu Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Met Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Cys Asp Asp Ser Trp Thr Gly Cys His Asp Ala Phe 100 105 110 Asp Ile <210> 7 <211> 291 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC08-003 VL DNA <400> 7 gtgttgacgc agccgccctc ggtgtcagtg gccccaggac agacggccag gattgcctgt 60 gggggaaaca acattgggag taaaagtgtg cactggtacc agcagaagcc aggccaggcc 120 cctgtgctgg tcgtctatga tgatagcgcc cggccctcag ggatccctga gcgattctct 180 ggctccaatt ctgggaacac ggccaccctg accatcagca gggtcgaggc cggggatgaa 240 gccgactatt actgtcaggt gtgggagagt ggtagtgatc tacgactgct t 291 <210> 8 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC08-003 VL PROTEIN <400> 8 Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ala Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp 35 40 45 Ser Ala Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 50 55 60 Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu 65 70 75 80 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Glu Ser Gly Ser Asp Leu Arg Leu 85 90 95 Leu <210> 9 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC08-015 VH DNA <400> 9 caggtgcagc tgcaggagtc ggggggagac ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgttcag cctctgaatt cagcttcagt agttattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac atgaagcaag atggaagtga gaagtactat 180 gtggactctg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcattatat 240 ctgcaaatga acagcctgag aggcgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggggttcc 300 tgtgacgatt cttggactgg ttgtcatgat gcttttgaca tc 342 <210> 10 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC08-015 VH PROTEIN <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Glu Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Met Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Cys Asp Asp Ser Trp Thr Gly Cys His Asp Ala Phe 100 105 110 Asp Ile <210> 11 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC08-015 VL DNA <400> 11 gtgttgacgc agccgccctc ggtgtcagtg gccccaggac agacggccaa gattacctgt 60 gggggagaca acattggaag aaaaagtgtg cactggtacc agcagaagcc aggcctggcc 120 cctgtgctgg tcgtcaatga taatagcgac cggccctcag ggatccctgc gcgattctct 180 ggctccaact ctgggaacac ggccaccctg accatcagca gggtcgaagc cggggatgag 240 gccgactatt actgtcacgt gtggggtagt agtcgtgacc attatgtc 288 <210> 12 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC08-015 VL PROTEIN <400> 12 Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro 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Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Glu Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Met Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Cys Asp Asp Ser Trp Thr Gly Cys His Asp Ala Phe 100 105 110 Asp Ile <210> 15 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SC08-016 VL DNA <400> 15 cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggatc caggtctggc cctttagccc tcctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgtttat 300 gtc 303 <210> 16 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SC08-016 VL 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ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 agctggaaca gcggcgcctt gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa acgcgtggag 660 cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctgggc 720 ggaccctccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctcatgat cagccggacc 780 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac 900 aacagcacct accgggtggt gagcgtgctc accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcctg cccccatcga gaagaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc ccgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctcacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tcaccgtgga caagagccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc 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ctctaatttc agggttgttc 2220 cctcaggaga tgttgtgaga ttccctaata ttacaaactt gtgtcctttt ggagaggttt 2280 ttaatgctac taaattccct tctgtctatg catgggagag aaaaaaaatt tctaattgtg 2340 ttgctgatta ctctgtgctc tacaactcaa catttttttc aacctttaag tgctatggcg 2400 tttctgccac taagttgaat gatctttgct tctccaatgt ctatgcagat tcttttgtag 2460 tcaagggaga tgatgtaaga caaatagcgc caggacaaac tggtgttatt gctgattata 2520 attataaatt gccagatgat ttcatgggtt gtgtccttgc ttggaatact aggaacattg 2580 atgctacttc aactggtaat tataattata aatataggta tcttagacat ggcaagctta 2640 ggccctttga gagagacata tctaatgtgc ctttctcccc tgatggcaaa ccttgcaccc 2700 cacctgctct taattgttat tggccattaa atgattatgg tttttacacc actactggca 2760 ttggctacca accttacaga gttgtagtac tttcttttga acttttaaat gcaccggcca 2820 cggtttgtgg accaaaatta tccactgacc ttattaagaa ccagtgtgtc aattttaatt 2880 ttaatggact cactggtact ggtgtgttaa ctccttcttc aaagagattt caaccatttc 2940 aacaatttgg ccgtgatgtt tctgatttca ctgattccgt tcgagatcct aaaacatctg 3000 aaatattaga catttcacct tgctcttttg ggggtgtaag 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(HuVH4C) <400> 218 cagstgcagc tgcaggagtc sgg 23 <210> 219 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH7 (HuVH6A) <400> 219 caggtacagc tgcagcagtc agg 23 <210> 220 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OCM (HuCIgM) <400> 220 tggaagaggc acgttctttt cttt 24 <210> 221 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OK1S (HuVK1B-SAL) <400> 221 tgagcacaca ggtcgacgga catccagwtg acccagtctc c 41 <210> 222 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OK2S (HuVK2-SAL) <400> 222 tgagcacaca ggtcgacgga tgttgtgatg actcagtctc c 41 <210> 223 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OK3S (HuVK2B2-SAL) <400> 223 tgagcacaca ggtcgacgga tattgtgatg acccagactc c 41 <210> 224 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OK4S (HuVK3B-SAL) <400> 224 tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgwtg acrcagtctc c 41 <210> 225 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OK5S (HuVK5-SAL) <400> 225 tgagcacaca ggtcgacgga aacgacactc acgcagtctc c 41 <210> 226 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OK6S (HuVK6-SAL) <400> 226 tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgctg actcagtctc c 41 <210> 227 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJK1 (HuJK1-NOT) <400> 227 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatttccacc ttggtccc 48 <210> 228 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJK2 (HuJK2-NOT) <400> 228 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccagc ttggtccc 48 <210> 229 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJK3 (HuJK3-NOT) <400> 229 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc 48 <210> 230 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJK4 (HuJK4-NOT) <400> 230 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccacc ttggtccc 48 <210> 231 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJK5 (HuJK5-NOT) <400> 231 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc 48 <210> 232 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL1S (HuVL1A-SAL)* <400> 232 tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgctg actcagccac c 41 <210> 233 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL1S (HuVL1B-SAL)* <400> 233 tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgytg acgcagccgc c 41 <210> 234 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL1S (HuVL1C-SAL)* <400> 234 tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtcgtg acgcagccgc c 41 <210> 235 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL2S (HuVL2B-SAL) <400> 235 tgagcacaca ggtcgacgca gtctgccctg actcagcc 38 <210> 236 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL3S (HuVL3A-SAL) <400> 236 tgagcacaca ggtcgacgtc ctatgwgctg actcagccac c 41 <210> 237 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL4S (HuVL3B-SAL) <400> 237 tgagcacaca ggtcgacgtc ttctgagctg actcaggacc c 41 <210> 238 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL5S (HuVL4B-SAL) <400> 238 tgagcacaca ggtcgacgca gcytgtgctg actcaatc 38 <210> 239 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL6S (HuVL5-SAL) <400> 239 tgagcacaca ggtcgacgca ggctgtgctg actcagccgt c 41 <210> 240 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL7S (HuVL6-SAL) <400> 240 tgagcacaca ggtcgacgaa ttttatgctg actcagcccc a 41 <210> 241 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL8S (HuVL7/8-SAL) <400> 241 tgagcacaca ggtcgacgca grctgtggtg acycaggagc c 41 <210> 242 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL9S (HuVL9-SAL)# <400> 242 tgagcacaca ggtcgacgcw gcctgtgctg actcagccmc c 41 <210> 243 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OL9S (HuVL10-SAL)# <400> 243 tgagcacaca ggtcgacgca ggcagggctg actcag 36 <210> 244 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJL1 (HuJL1-NOT) <400> 244 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtgacc ttggtccc 48 <210> 245 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJL2 (HuJL2/3-NOT) <400> 245 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc 48 <210> 246 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJL3 (HuJL7-NOT) <400> 246 gagtcattct cgacttgcgg ccgcaccgag gacggtcagc tgggtgcc 48 <210> 247 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH1S (HuVH1B-SFI)+ <400> 247 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtgc agctggtgca rtctgg 56 <210> 248 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH1S (HuVH1C-SFI)+ <400> 248 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtcc agctggtrca gtctgg 56 <210> 249 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH2S (HuVH2B-SFI) <400> 249 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtca ccttgaagga gtctgg 56 <210> 250 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH3S (HuVH3A-SFI) <400> 250 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctggtgga g 51 <210> 251 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH4S (HuVH3C-SFI) <400> 251 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctggtgga gwcygg 56 <210> 252 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH5S (HuVH4B-SFI) <400> 252 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctacagca gtgggg 56 <210> 253 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH6S (HuVH4C-SFI) <400> 253 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagstgc agctgcagga gtcsgg 56 <210> 254 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OH7S (HuVH6A-SFI) <400> 254 gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtac agctgcagca gtcagg 56 <210> 255 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJH1 (HuJH1/2-XHO) <400> 255 gagtcattct cgactcgaga crgtgaccag ggtgcc 36 <210> 256 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJH2 (HuJH3-XHO) <400> 256 gagtcattct cgactcgaga cggtgaccat tgtccc 36 <210> 257 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJH3 (HuJH4/5-XHO) <400> 257 gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggttcc 36 <210> 258 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OJH4 (HuJH6-XHO) <400> 258 gagtcattct cgactcgaga cggtgaccgt ggtccc 36

Claims (31)

  1. H3N2의 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 중화 활성을 갖고, 그리고 최소한 H7 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 또는 H10 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 교차-중화활성을 갖는, 인플루엔자 적혈구응집 단백질(HA)에서의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있되
    a) SEQ ID NO:109의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:110의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:111의 중사슬 CDR3 영역; 및 SEQ ID NO:112의 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:113의 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:114의 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자,
    b) SEQ ID NO:138의 중사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:139의 중사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:140의 중사슬 CDR3 영역; 및 SEQ ID NO:141의 경사슬 CDR1 영역, SEQ ID NO:142의 경사슬 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:143의 경사슬 CDR3 영역을 포함하는 결합분자으로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 인간 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, H3N2의 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 중화활성을 갖는, 인플루엔자 적혈구응집 단백질(HA)에서의 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 단리된 결합분자로, 상기 결합 분자는 A/Wisconsin/67/2005, A/Hiroshima/52/2005, A/Panama/2007/99, 및 A/Johannesburg/33/94로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 H3N2 균주에 대하여 최소한 중화활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 결합분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결합분자는 추가로 H3N2 균주 A/Hong Kong/1/68에 대해 중화활성을 갖는 것인 결합분자.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 결합분자는 인 비트로에서 HA1 및 HA2에서 H3 HA 전구체 분자 HAO의 트립신 분열을 막을 수 있는 것인 결합분자.
  8. 제1항에 있어서, 결합분자는 바이러스 막과 감염된 세포의 엔도좀 막의 융합에 요구되는 H3 HA 단백질의 pH-유도된 형태 변화를 막을 수 있는 것인 결합분자.
  9. 제1항에 있어서, 결합 분자는 H1N1의 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 A와 결합하고 중화시키는 능력이 없는 것인 결합분자.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 결합분자는 인간 모노클로날 항체인 것인 결합분자.
  12. 의약으로 사용하기 위한 제1항에 따른 결합분자.
  13. H3N2의 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 기인하는 인플루엔자 감염의 진단, 치료 또는 예방적 처리에서 의약으로 사용하기 위한 제1항에 따른 결합분자.
  14. 삭제
  15. 제1항에 따른 결합분자를 포함하는 면역컨쥬게이트로, 상기 면역컨쥬게이트는 추가로 하나 이상의 태그를 포함하는 것인 면역컨쥬게이트.
  16. 제1항에 따른 결합분자, 또는 제15항에 따른 면역컨쥬게이트, 그리고 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 억제용 약제학적 조성물.
  17. 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 제15항에 따른 면역컨쥬게이트.
  18. 제17항에 있어서, 인플루엔자 감염은 H3N2의 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의해 기인하는 것을 특징으로 하는 면역컨쥬게이트.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제1항에 따른 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자.
  24. 제23항에 따른 핵산분자를 하나 이상 포함하는 벡터.
  25. 제24항에 따른 벡터를 하나 이상 포함하는 숙주.
  26. 제25항에 있어서, 숙주가 인간 세포인 것인 숙주.
  27. 제1항에 따른 결합분자를 생산하는 방법으로, 상기 방법은: 결합분자의 발현을 수행하는 조건하에서 제25항에 따른 숙주를 배양하는 단계, 및 임의로 발현된 결합분자를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
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