KR101781069B1 - 닥나무 속 식물의 캘러스를 함유하는 피부 개선 조성물 - Google Patents
닥나무 속 식물의 캘러스를 함유하는 피부 개선 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 개시한다. 상기 조성물은 피부 재생 촉진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 톤 개선, 노화 방지 또는 개선 효과가 있다.
Description
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
식물은 과거 식량 자원의 의미였으나, 현재에는 약제, 향료, 색소, 농약, 염료 등을 포함한 광범위한 화학 물질의 공급원으로서 그 의미가 확대되고 있다. 특히, 식물 유래 유용 물질의 대부분은 항바이러스, 항박테리아, 항암, 항산화 능력 등의 생리 활성이 있어, 신규 효능 물질로서 발전 가능한 이상적인 자원으로 주목받고 있으며, 식물을 유래로 하기 때문에 효능이 있으면서도 인체에 친화적이라는 장점 또한 가지고 있다.
그러나 식물 자원으로부터의 신규 효능 물질을 상업적으로 개발하기에는 현실적으로 어려움이 많다. 그 이유는 다음과 같다. 식물은 성장 속도가 매우 느리며, 식물 내 효능 물질의 함량이 극히 제한적이고, 식물 내 효능 물질은 식물의 특정 기관 내에만 소량 존재하며, 식물을 자원으로 이용할 경우 자연 훼손의 문제가 발생한다. 그리고 마지막으로 식물 유래의 효능 물질은 화학적인 구조가 매우 복잡하여, 다단계 중합 과정들이 요구되며 이로 인해 생산 비용이 매우 높아지는 경제적인 문제가 발생한다. 이러한 이유로 인해 식물 유래의 효능 물질이 안정적으로 공급되기 어려웠다.
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물,캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상이 피부 재생 촉진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 톤 개선, 노화 방지 또는 개선 효과가 있다는 것을 밝혀내어, 이에 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는 피부 상태 개선 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 개시한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부 재생 촉진 용도를 갖는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 예방 또는 개선 용도를 갖는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백 용도를 갖는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부 보습 용도를 갖는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부 톤 개선 용도를 갖는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 노화 방지 또는 개선 용도를 갖는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하여 피부 재생 촉진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 톤 개선, 노화 방지 또는 개선 효과를 가진다.
도 1은 본 발명에 따른 조성물의 멜라닌 생성 억제률(%)에 대한 실험예 5의 결과 그래프이다.
본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.
이하에서, 본 발명을 상세하게 설명한다.
생물공학기법이 발전하면서 최근 미분화 세포에서 유도 분화된 식물 세포 분야가 새로이 대두가 되고 있고, 발생 과정에 관여하는 시그널에 대한 연구 등 미분화 세포의 유도 분화와 관련된 많은 실험들이 진행되고 있다. 이를 이용한 식물 세포 배양 방법은 환경 문제를 유발하지 않으면서도 식물 유래 유용 물질을 안정적으로 공급할 수 있는 이상적인 기술로 대두되었다. 식물 세포 배양에 의한 유용 물질의 생산은 식물에서 직접적인 추출에 의한 방법보다 수많은 장점이 있다. 특히, 기존의 추출법과는 달리, 외부 환경의 영향을 받지 않고도 지속적인 생산이 가능하여, 생태계 파괴와 같은 현안 문제들을 해결할 수 있는 최적의 방법이라고 생각된다.
식물로부터 효능 물질을 얻기 위해 잎이나 줄기를 채취할 경우에는 식물을 손상시키지 않는 범위에서 채취를 지속할 수 있으나, 뿌리를 채취하여야 할 경우에는 식물 전체를 훼손하여 더 이상 식물이 생존할 수 없게 된다. 하지만 분화된 세포를 이용할 경우, 아주 적은 양의 식물 세포만으로도 쉽게 뿌리 조직으로 분화된 세포를 다량으로 얻을 수 있어 식물을 훼손하지 않고도 효능 물질의 원료를 얻을 수 있으며, 이로 인해 생태계를 보호하면서도 식물 자원을 원료화하는 그린 프로세스를 정립할 수 있다.
닥나무 속은 뽕나무 과의 식물로 Broussonetia kaempferi, Broussonetia kazinoki(닥나무), Broussonetia kurzii, Broussonetia papyrifera(꾸지나무)를 포함한다. 본 발명에서 닥나무 속 식물은 상기 4종을 포함하고, 보다 구체적으로 닥나무(Broussonetia kazinoki)와 꾸지나무(Broussonetia papyrifera)를 포함한다. 이들은 닥나무 속의 낙엽 활엽성 관목으로 한국의 대부분 지역(주로 남부에 많이 분포됨), 중국, 대만, 일본 등에 분포하며 지리적으로는 산기슭 양지 쪽, 밭둑 등에 난다. 닥나무는 그 인피섬유가 제지의 원료로 사용된 오랜 역사가 있으며, 이전부터 여러 가지 약효를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 강장, 명목 작용, 음위, 수종, 익기, 이뇨 등에 효과가 있고 풍을 제거하며, 피를 맑게 하고 시력 감퇴 등에 효능이 있는 것으로 보고되고 있다.
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 개시한다. 상기 조성물은 피부 재생 촉진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 톤 개선, 노화 방지 또는 개선 효과를 가진다. 닥나무 속 식물의 캘러스 또는 캘러스에서 분화된 세포에는 kazinol이 많이 존재한다. 이는 닥나무 속 식물 자체가 아니라 닥나무 속 식물의 캘러스 또는 캘러스에서 분화된 세포를 이용함으로써, 식물을 훼손하지 않고도 효능 물질의 원료를 얻을 수 있는 장점을 지닌다. 또한 이는 닥나무 속 식물 자체보다 우수한 효능을 지닐 수 있다.
본 명세서에서 “캘러스”는 캘러스를 유도하여 고체 배지에서 배양한 초기 단계의 세포 덩어리를 의미한다. “캘러스에서 분화된 세포”는 캘러스에서 유도하여 고체 배지에서 배양한 초기 단계에서부터, 식물 호르몬을 처리하여 특정 기관으로 분화시킨 단계까지를 말한다. 본 발명의 일실시예에서 상기 특정 기관은 잎, 줄기 또는 뿌리일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 캘러스에서 분화된 세포는 캘러스에서 잎으로 분화된 세포, 캘러스에서 줄기로 분화된 세포, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포를 포함한다. 통상적으로 목본 식물의 특정 기관으로 분화에 소요되는 시간은 1일~60일 정도이며, 구체적으로 1일~45일 사이의 분화 기간을 가질 수 있다.
본 명세서에서 “파쇄물”이란, 세포를 일반적인 detergent 등을 이용하여 화학적인 방법 또는 프렌치 프레스(French Press) 등을 이용한 물리적인 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 “배양액”이란, 당 업계의 일반적인 방법으로 세포를 6시간 ~ 72시간 동안 배양하는 과정을 거친 후 초고속 원심분리(ultracentrifugation) 등의 물리적인 방법을 이용하여 펠렛을 제거한 나머지 배양액을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 “추출물”이란, 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로 증류 또는 증발을 이용하여 농축한 것을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로는 건조 분쇄한 후 추출 용매를 넣고 가열하여 유효성분을 추출하고 감압 농축하여 추출물을 얻는다. 추출 용매로는 일반적으로 사용될 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜 등을 포함한다.
본 발명에서 이용하는 세포 배양 방법은 공지의 고체배양법이다. 고체 배양은 고체 배지 위에 캘러스 세포를 배양하는 것으로 캘러스는 다음과 같이 유도될 수 있다: 차아염소산 나트륨과 에틸알코올로 표면 살균 처리한 잎과 줄기를 적당한 크기로 자르고 고체 배양용 배지 위에 무균적으로 배양한다. 배양 수주 후에 뿌리와 잎의 절단면에서 캘러스 세포가 형성되어 자라기 시작하면, 캘러스를 연속적으로 계대배양하여 안정된 세포주를 확립한다.
캘러스 세포 유도에 사용되는 배지는 MS(Murashige & Skoogs) 배지일 수 있다. 이 MS 배지에 한천을 0.5-1.0% 첨가하여 고체 배지로 이용한다. 생장 조절제로서 식물 호르몬 옥신을 첨가하는데 옥신으로는 인체 유해성 문제가 심각한 2,4-D 대신에 1-나프탈렌아세트산(NAA)을 사용할 수 있다. 또한 배지 내에 자당(sucrose)의 농도를 30g/1 또는 그 이하로 유지할 때 세포의 성장이 좋다.
배양 온도는 20-25℃가 적당하고, 빛이 있는 명조건 보다 암조건 하에서 세포의 생장이 우수하다. 이러한 조건에서 고체 배지에서 생장하는 캘러스 세포를 4 내지 5주마다 새로운 배지에 계대배양하고 이 기간 동안 세포의 양은 약 2 내지 3배 정도씩 증가한다.
본 발명의 캘러스에서 분화된 세포는 캘러스에서 뿌리, 줄기, 잎으로 분화된 세포로 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이 때 배지에 생장 조절제로서 옥신과 지베렐린산, 피토호르몬 등이 0.1~3mg/L 사이의 농도로 분화시키려는 기관에 알맞게 그 농도를 달리하여 첨가될 수 있다.
피부는 외부에서부터 순서대로 표피, 진피, 피하지방 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 인체의 일차 방어막으로 체내의 기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해 물질 등 외부 환경의 자극으로부터 보호해주고, 체온 조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 그러나 자외선, 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양 결핍 등은 피부의 정상 기능을 저하시키고 탄력 손실, 각질화, 주름 생성 등의 피부 노화 현상을 촉진시키게 된다. 특히, 각질 세포가 차례차례로 계속해서 만들어지고 최외층의 오래된 각질 세포가 때때로 이탈해가므로 표피가 일정한 두께를 유지하게 되는 각화 과정이 순조롭지 못하면 비정상적인 각질 세포가 생성되고 피부 표면에 쌓여 각질층이 두꺼워지게 되어 피부가 거칠어지고 칙칙해지며, 미세한 잔주름이 생기게 되고 결국 피부 노화가 진행되는 것이다. 따라서 각질 형성 세포의 성장을 촉진하는 경우, 피부 재생을 촉진할 수 있을 뿐 아니라, 주름을 예방 및 개선하고, 피부 미백 효과가 있으며, 피부 톤을 개선하고, 나아가 노화를 방지 또는 개선할 수 있다.
콜라겐은 동물 결합 조직의 중요한 섬유성 단백질을 말하는데, 이는 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 재생, 흉터 예방 또는 개선, 피부 탄력 강화, 피부 노화 방지 기능을 갖는다. 프로콜라겐은 여러 척추 동물의 피부 및 기타의 기관에서 발견되는 콜라겐의 전구물질로, 결과적으로 콜라겐과 동일한 기능을 가지게 된다. 따라서, 콜라겐 및 프로콜라겐의 수치가 높아지면 피부 주름이 예방 또는 개선되며, 피부가 재생되고, 흉터를 예방 또는 개선하며, 피부 탄력이 강화되고, 피부 노화가 예방 또는 개선될 수 있다. 한편, “콜라게네이즈”는 콜라겐을 분해하는 효소로, 피부 주름을 만드는 원인 중 하나로 알려져 있다. 콜라게네이즈(Matrix metalloproteinase-1, MMP-1)는 피부 기질의 분해에 관련한 자외선에 의해 생합성될 수 있고 이는 타입 1 프로콜라겐의 생합성 감소를 야기한다. 따라서 MMP-1의 발현을 저해하면 피부의 콜라겐 수치가 높아지므로 역시 피부 주름이 예방 또는 개선되며, 피부가 재생되고, 피부 탄력이 강화되며, 피부 노화가 예방 또는 개선될 수 있다. 또한, 피부 진피층에 존재하는 섬유아세포의 분열 능력 저하도 피부 노화와 관련이 있다.
멜라닌은 피부, 머리카락의 색을 결정하는 색소로, 멜라노사이트로부터 생성된 멜라닌은 피부 바깥쪽으로 이동하여 각질층에 분포한다. 자외선을 받으면 멜라노사이트의 수도 증가하고 멜라닌 생성량도 증가하여 색소침착, 기미, 주근깨의 원인이 된다. Becker 모반(Becker's nevus), 흑자(lentigines), 반문성모반(Nevus spilus) 등의 질병 역시 표피 멜라닌의 과도한 침착에 의해 일어난다.
멜라닌은 티로신이 복잡한 효소적, 비효소적 산화작용을 거쳐 만들어지는 복합체로 이 과정에서 티로시나제가 중추적인 역할을 하는 효소로 알려져 있다. 티로시나제는 구리와 결합한 금속 단백질 효소로서, 동물, 식물, 미생물 및 사람 등에 넓게 분포되어 있고 티로신(tyrosine)을 디하이드록시 페닐알라닌(도파, dihydroxyl-L-phenylalanine, L-DOPA)으로, 디하이드록시 페닐알라닌을 도파퀴논 (dopaquinone)으로 변환시키는 작용을 한다. 도파퀴논은 도파크롬(dopachrome)으로, 도파크롬은 디하이드록시인돌(dihydroxyindole)로 전환되고 디하이드록시인돌의 산화적 중합을 통해 최종적으로 멜라닌을 합성한다. 따라서, 티로시나제 활성을 억제하거나 L-DOPA의 산화를 억제하면 멜라닌 합성을 저해할 수 있다. 멜라닌 생성을 억제하면 피부 미백 효과를 가지고, 피부 톤을 개선할 수 있으며, 노화를 방지 또는 예방할 수 있다.
현재 널리 사용되는 대부분의 미백제는 티로시나제 저해제나 티로시나제 저해제를 함유한 물질로 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 하이드록시아니솔(hydroxyanisole), 아스코빈산(ascorbic acid) 유도체, 코지산(kojic acid), 코티코스테로이드(corticosteroids), 레티노이드(retinoids) 등이 있으나, 일부 저해제는 돌연변이를 유발하여 발암 가능성이 있다는 연구결과가 보고되었으며, 그 외에도 안전성과 경제성, 경피를 통한 흡수성 등의 문제점으로 사용에 있어서 어려움이 있다. 특히, 하이드록시아니솔 및 하이드로퀴논 등은 강력한 멜라닌 생성 저해 활성을 가지지만 색소 세포의 변성 또는 치사를 유발하고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타낸다. 또한, 코지산은 낮은 저해활성, 사용 중의 변색, 물질 자체의 불안정성 등의 문제점이 있다.
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물,캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하여 각질 세포 성장을 촉진하고 MMP-1를 억제하며, 프로콜라겐을 증가시키고, 티로시나제의 활성을 촉진하며, L-DOPA의 산화를 억제하고, 멜라닌 생성을 억제하여 피부 재생 촉진, 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 미백, 피부 보습, 피부 톤 개선, 노화 방지 또는 개선 효과를 가지는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물,캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001~25.0 중량%로 함유될 수 있다. 그 함량이 0,0001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미미하고, 25.0 중량%를 초과하는 경우에는 제품의 사용감 및 제형의 안정성에 문제가 발생할 수 있기 때문이다.
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소 적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 멀티에멀젼, 현탁액, 마이크로 에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이, 클렌져 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기한 물질 이외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유하는 것도 무방하며, 본 발명의 유효 성분 이외에 다른 성분을 기타 화장료 조성물의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
예컨대, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료 조성물에 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있고, 이의 예로서 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함될 수 있는 기타 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니고, 또한 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 가능하다.
상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 제형을 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 유연 화장수(스킨로션 및 밀크로션), 영양 화장수, 에센스, 영양 크림, 마사지 크림, 파우더, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 패취, 분무제, 팩, 젤, 에센스, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌져, 보디로션, 보디크림, 보디오일 및 보디 에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우에는, 상기 조성물을 유효 성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다. 본 발명의 유효 성분을 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며, 계면활성제, 부형제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.
상기 경구 투여를 위한 제재로서는 정제(錠劑), 환제(丸劑), 과립제(顆粒劑), 연·경질 캅셀제, 산제, 세립제, 분제, 액제, 유탁제(乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 이들 제형은 유효 성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 상기 비경구 투여제는 예를 들어, 피부 외용제일 수 있으며, 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.
또한, 상기 유효 성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적인 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 2000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일이다.
이하, 제조예, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 제조예, 실험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 제조예, 실험예, 실시예 및 비교예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[제조예] 캘러스 배양 및 캘러스 파쇄물, 배양액, 추출물의 제조
채집한 닥나무, 꾸지나무 중 생장 상태가 좋은 뿌리와 잎을 생체 시료로 하여 캘러스 유도에 이용하였다. 생체 시료를 약 10cm 길이로 자른 다음 세척한 후 트윈-20 0.1%를 함유한 0.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액에 넣고 교반하며 20분간 표면 살균하였다. 이 기간 중에 3초 동안 초음파 파쇄(sonication)하여 생체 시료 표면의 미세 기포를 제거하였다. 여기에 멸균수로 1회 세척한 후 70% 에탄올 용액에 넣어 1분간 재차 표면 살균한 다음, 살균 및 세척된 생체 시료를 약 0.5 cm 정도의 크기로 자른 뒤, MS 배지에 한천 0.5-1.0%을 혼합한 고체 배양용 배지 위에 옮겨 배양을 시작하였다. 생장조절제로서 식물호르몬 옥신의 일종인 1-나프탈렌아세트산(NAA)을 사용하였다. 또한 배지 내에 자당(sucrose)의 농도를 30g/ℓ이하로 유지하였다.
모든 조작은 무균 조작대에서 무균적으로 실시하였고, 25℃ 암조건에서 배양 시작 후 2-3주 후부터 캘러스가 유도되어 자랐다. 여러 생체 시료로부터 캘러스가 잘 유도되었으며, 이중 우수한 것을 매 1개월마다 새로운 배지에 옮겨 계대배양을 실시하여 세포주(cell line)를 확립하였다.
캘러스 추출물은 상기 세포주를 원심분리하여 무균 정제수로 깨끗이 세척한 후, 무균건조하여 얻어진 세포(중량 100g)를 분쇄하고, 이 분쇄물에 95% 에탄올 0.5 ℓ를 부가한 다음, 냉각콘덴서가 부착된 추출기에서 3일 동안 45℃에서 가열하여 추출하는 방법으로 제조하였다. 추출물을 350 메쉬 여과포로 여과한 다음 와트만 2번 여과지로 여과하여 하기 실험에 사용하였다.
상기 확립한 세포주를 기초로 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액을 일반적인 방법으로 제조하였다.
[실험예 1] 각질형성세포 성장 촉진 효과 평가(MTT assay)
닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물, 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물이 각질형성세포의 성장능에 미치는 효과를 MTT 방법으로 측정하였다.
먼저, 각질형성세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 웰 당 200㎕ 당 5×103 개 농도로 심어서 24시간 배양한 후, 닥나무와 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물, 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물을 각각 0.001, 0.01 및 0.1%로 처리하여 48시간 동안 배양한 다음, 배양액을 흡입하여 제거한 후, PBS로 1회 세척하고, MTT(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, Sigma, USA)(0.5 ㎎/㎖) 용액을 100㎕씩 세포에 첨가하고, 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 그 후, 배양액을 흡입하여 제거한 다음 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액 200㎕를 첨가하고, 쉐이커(shaker)에서 10분간 흔들어 준 후 ELISA 리더(reader)(DIbiotech, Korea)로 540㎚에서의 흡광도를 판독하였다. 이 때, 대조군으로는 아무 것도 처리하지 않은 무처리군을 사용하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 흡광도가 높을수록 각질형성세포의 성장을 촉진하는 효과가 있음을 나타낸다.
| 농도(%) | 흡광도 | ||
| 닥나무 | 꾸지나무 | ||
| 캘러스 파쇄물 | 0.001% | 135 | 138 |
| 0.01% | 136 | 141 | |
| 0.1% | 143 | 154 | |
| 캘러스 배양액 | 0.001% | 148 | 135 |
| 0.01% | 152 | 137 | |
| 0.1% | 162 | 140 | |
| 캘러스 추출물 | 0.001% | 113 | 115 |
| 0.01% | 115 | 119 | |
| 0.1% | 118 | 124 | |
| 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 125 | 128 |
| 0.01% | 126 | 131 | |
| 0.1% | 138 | 137 | |
| 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액 | 0.001% | 122 | 121 |
| 0.01% | 125 | 125 | |
| 0.1% | 129 | 126 | |
| 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 추출물 | 0.001% | 112 | 114 |
| 0.01% | 115 | 118 | |
| 0.1% | 121 | 123 | |
| 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 115 | 121 |
| 0.01% | 121 | 127 | |
| 0.1% | 127 | 129 | |
| 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 배양액 | 0.001% | 128 | 128 |
| 0.01% | 130 | 132 | |
| 0.1% | 138 | 139 | |
| 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 추출물 | 0.001% | 103 | 106 |
| 0.01% | 103 | 108 | |
| 0.1% | 106 | 110 | |
| 무처리 대조군 | 0% | 100 | 101 |
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 유효 성분으로 사용되는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물, 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물,배양액, 추출물은 모두 각질형성세포 성장을 촉진하는 효과가 우수함을 알 수 있었다. 또한, 각각의 성분 농도가 높아질수록 각질형성세포의 분열을 촉진하는 효과도 함께 증가하였다.
상기와 같이 우수한 각질형성세포 성장을 촉진 효과를 가지는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물, 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물은 피부의 재생을 촉진하며, 피부 주름을 예방 및 개선하고, 피부 톤을 개선하는 효과를 가지며, 나아가 노화를 방지하고 개선하는 효과를 가진다. 이들은 2 가지 이상 혼합하여 사용이 가능하다.
[실험예 2] MMP-1 억제 및 프로콜라겐 생성 촉진 효과 평가(procollagen assay)
닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액의 MMP-1의 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과를 알아보기 위하여 MMP-1 및 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같은 방법으로 수행하였다.
먼저, 정상 표피의 지방층을 제거하고 잘게 잘라 콜라겐아제(collagenase)로 표피와 진피를 분리한 후, 표피와 진피 조직을 각각 0.25% 트립신(trypsin) 용액에 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 10 분간 처리하였다. 이후 보텍스(vortex)를 시행하여 각질형성세포와 섬유아세포를 각각 유리시켰다. 유리된 세포를 모아 세척한 후 각질형성세포는 KGM(keratinocyte growth medium, Clonetics, USA)에 1×104 cells/cm2 농도로 배양하였으며, 섬유아세포는 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3-4차 계대 배양한 세포를 실험에 이용하였다.
MMP-1의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 하루 동안 기아(starvation)상태로 하였다. 이후 PBS로 2회 세척한 다음 PBS를 100㎕씩 넣어준 상태에서 플레이트(plate)의 뚜껑을 열고 자외선 A(UVA filters가 장치된 Dermlight cube 401, UVAtec, USA)를 15J/cm2로 조사하였다. 조사 직후 다시 PBS로 1회 세척하고, 각각 0.001%, 0.01%, 0.1%의 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액이 포함된 우태아 혈청을, 이를 포함하지 않은 DMEM에 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 48 시간 동안 배양한 후, 배지 중에 유리된 MMP-1의 양을 MMP-1 인간 ELISA 시스템(human ELISA system)(RPN2610, Amersham Pharmacia Biotech, UK)을 이용하여 측정하였고, 섬유아세포의 총 단백질 양으로 보정하였다. 이 때, 대조군으로는 아무 것도 처리 하지 않은 무처리군을 사용하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
한편, 프로콜라겐의 양을 측정하기 위해 상기 MMP-1의 양을 측정하는 방법과 동일한 조건에서 기아(starvation)상태로 자외선 조사 없이 각각 0.001%, 0.01%, 0.1%의 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액을 가하고, 24 시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐 타입-1 C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다. 이 때, 대조군으로는 아무 것도 처리하지 않은 무처리군을 사용하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
| 농도(%) | MMP-1의 양 | ||
| 닥나무 | 꾸지나무 | ||
| 캘러스 파쇄물 | 0.001% | 70 | 75 |
| 0.01% | 66 | 68 | |
| 0.1% | 62 | 60 | |
| 캘러스 배양액 | 0.001% | 72 | 75 |
| 0.01% | 71 | 71 | |
| 0.1% | 66 | 64 | |
| 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 65 | 74 |
| 0.01% | 61 | 61 | |
| 0.1% | 54 | 53 | |
| 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액 | 0.001% | 67 | 70 |
| 0.01% | 63 | 64 | |
| 0.1% | 61 | 60 | |
| 무처리 대조군 | 0% | 100 | 100 |
| 농도(%) | 프로콜라겐의 양 | ||
| 닥나무 | 꾸지나무 | ||
| 캘러스 파쇄물 | 0.001% | 117 | 115 |
| 0.01% | 125 | 125 | |
| 0.1% | 129 | 134 | |
| 캘러스 배양액 | 0.001% | 107 | 117 |
| 0.01% | 115 | 124 | |
| 0.1% | 127 | 129 | |
| 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 126 | 127 |
| 0.01% | 130 | 132 | |
| 0.1% | 137 | 137 | |
| 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액 | 0.001% | 125 | 123 |
| 0.01% | 129 | 130 | |
| 0.1% | 135 | 136 | |
| 무처리 대조군 | 0% | 100 | 100 |
상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에서 유효 성분으로 사용되는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액은 모두 MMP-1를 억제함을 알 수 있었다. 또한, 각각의 성분 농도가 높아질수록 MMP-1의 양이 비례하여 감소하였다.
상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에서 유효 성분으로 사용되는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액은 모두 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 증가시킴을 알 수 있었다. 또한, 각각의 성분 농도가 높아질수록 생성된 프로콜라겐의 양이 비례하여 증가하였다.
상기와 같이 뛰어난 MMP-1 억제 효과와 프로콜라겐 생합성 촉진 효과를 가지는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액은 피부 재생을 촉진하며, 주름을 예방 또는 개선하고, 나아가 노화를 방지 또는 개선하는 효과를 가진다. 이들은 2 가지 이상 혼합하여 사용이 가능하다.
[실험예 3] 티로시나제 활성 억제능 평가
효소 티로시나제는 버섯류(Mushroom)로부터 추출된 것으로, 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 먼저 기질인 티로신을 증류수에 용해시켜 0.3mg/ml의 용액으로 만들어서 그 용액을 1.0ml씩 시험관에 넣고, 여기에 포타슘-포스페이트 완충용액(0.1mol 농도, pH 6.8) 1.0ml 및 증류수 0.7ml를 가하였다. 0.2ml의 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 배양액, 추출물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무의 캘러스에서 잎으로 분화된 세포의 파쇄물, 꾸지나무의 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 추출물, 꾸지나무 추출물 각각을 반응액에 넣은 뒤 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이때 대조군은 실험 물질 대신 용매만을 0.2ml 넣었다. 이 반응액에 2500Unit/ml의 티로시나제 용액 0.1ml씩을 넣고 다시 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음물 속에 넣어서 급냉시켜 반응을 중지시키고 분광광도계로 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 기존의 미백제인 알부틴 및 아스코르빈산을 사용하였다.
각 실험 물질의 티로시나제 저해효과는 다음의 수학식 1로 티로시나제 저해율을 구하여 평가하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
[수학식 1]
티로시나제 저해율(%) = 100 - {(각 실험 물질의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도)×100}
| 처리농도(%) | 티로시나제 저해율 (%) | |
| 닥나무 캘러스 파쇄물 | 0.001% | 23.1 |
| 0.01% | 29.0 | |
| 0.1% | 34.6 | |
| 꾸지나무 캘러스 파쇄물 | 0.001% | 23.2 |
| 0.01% | 27.4 | |
| 0.1% | 36.1 | |
| 닥나무 캘러스 배양액 | 0.001% | 12.8 |
| 0.01% | 16.4 | |
| 0.1% | 21.7 | |
| 꾸지나무 캘러스 배양액 | 0.001% | 14.3 |
| 0.01% | 17.9 | |
| 0.1% | 21.1 | |
| 닥나무 캘러스 추출물 | 0.001% | 12.1 |
| 0.01% | 14.7 | |
| 0.1% | 19.2 | |
| 꾸지나무 캘러스 추출물 | 0.001% | 14.2 |
| 0.01% | 16.3 | |
| 0.1% | 17.8 | |
| 닥나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 75.3 |
| 0.01% | 88.7 | |
| 0.1% | 96.3 | |
| 닥나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액 | 0.001% | 15.6 |
| 0.01% | 19.2 | |
| 0.1% | 31.9 | |
| 닥나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 추출물 | 0.001% | 14.2 |
| 0.01% | 21.2 | |
| 0.1% | 26.9 | |
| 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 95.2 |
| 0.01% | 96.3 | |
| 0.1% | 99.1 | |
| 닥나무의 캘러스에서 잎으로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 4.1 |
| 0.01% | 8.7 | |
| 0.1% | 10.0 | |
| 꾸지나무의 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 3.2 |
| 0.01% | 6.5 | |
| 0.1% | 23.5 | |
| 닥나무 추출물 | 0.01% | 33.1 |
| 꾸지나무 추출물 | 0.01% | 40.4 |
| 아스코르빈산 | 0.01% | 39.2 |
| 알부틴 | 0.01% | 50.4 |
상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 유효 성분으로 사용되는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 배양액, 추출물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물, 닥나무의 캘러스에서 잎으로 분화된 세포의 파쇄물, 꾸지나무의 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물의 티로시나제 활성 억제 효과가 인정되었다. 그 중에서도 닥나무의 캘러스에서 잎으로 분화된 세포의 파쇄물, 꾸지나무의 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물보다는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물의 티로시나제 활성 억제 효과가 더 우수하였고 이들은 닥나무 및 꾸지나무의 추출물에 비해 매우 우수한 티로시나제 활성 억제 효과를 나타냈다. 또한 이들은 동일 농도의 아스코르빈산, 알부틴보다 우수한 티로시나제 활성 억제 효과를 가졌다. 그리고 각 유효 성분의 양이 증가할수록 티로시나제 활성도 억제되는 경향을 보였다.
상기와 같이 티로시나제 활성 억제 효과를 가지는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 배양액, 추출물, 닥나무의 캘러스에서 잎으로 분화된 세포의 파쇄물, 꾸지나무의 캘러스에서 줄기로 분화된 세포의 파쇄물은 피부 미백 효과를 가지며, 피부 톤을 개선하고, 피부 노화를 방지 또는 개선하는 효과를 가진다. 이들은 2 가지 이상 혼합하여 사용이 가능하다.
[실험예 4] L-DOPA의 산화 억제능 평가
멜라닌 합성과정의 속도 결정 단계를 촉매하는 티로시나제의 L-DOPA(엘-도파) 산화 반응에 대한 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 추출물, 꾸지나무 추출물의 활성 억제 효과를 평가하였다.
닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 추출물, 꾸지나무 추출물을 DMSO에 녹인 후 다시 0.1M 인산나트륨 완충용액(pH 6.5)에 희석하여 최종 농도 16.67, 33.34, 66.67, 166.67, 333.33, 666.67㎍/㎖이 되도록 준비하였다. 시험관에 0.1M 인산염완충액(pH 7.0) 850㎕와 상기 준비한 액 50㎕, 그리고 머쉬룸 티로시나제(SIGMA)(1500 ~ 2,000)U/㎖ 용액 50㎕를 순서대로 넣고 10mM이 되도록 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)액을 넣은 다음 37℃에서 15분 동안 반응시키고 실험 종료 후 분광광도계를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. L-DOPA 산화 활성 억제율(%)은 수학식 2로 다음과 같이 계산하였으며, 결과를 표 5에 나타내었다.
[수학식 2]
L-DOPA 산화 활성 저해율(%) = 100 -{(각 실험 물질의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도) × 100}
| 처리농도(%) | L-DOPA 산화 활성 억제율(%) | |
| 닥나무 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 77.1 |
| 0.01% | 80.4 | |
| 0.1% | 90.9 | |
| 꾸지나무 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 | 0.001% | 87.8 |
| 0.01% | 93.3 | |
| 0.1% | 97.9 | |
| 닥나무 뿌리 추출물 | 0.01% | 63.7 |
| 꾸지나무 뿌리 추출물 | 0.01% | 75.8 |
| 아스코르빈산 | 0.01% | 51.1 |
| 알부틴 | 0.01% | 89.1 |
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 유효 성분으로 사용되는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물은 우수한 L-DOPA 산화 억제 효과가 있음이 인정되었다. 이들은 닥나무 및 꾸지 나무의 뿌리 추출물보다 뛰어난 L-DOPA 산화 억제 효과를 가졌다. 특히 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 양이 증가할수록 L-DOPA의 산화가 억제되었으며, 이를 0.1% 첨가한 경우에는 엘-도파의 산화를 거의 100% 억제하였다. 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물의 L-DOPA 산화 억제 효과는 기존의 미백제로 널리 사용되는 알부틴보다 우수한 것으로 나타났다.
상기와 같이 엘-도파 산화 억제 효과를 가지는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물은 피부 미백 효과를 가지며, 피부 톤을 개선하고, 노화를 방지 또는 개선하는 효과를 가진다. 이들은 2 가지 이상 혼합하여 사용이 가능하다.
[실험예 5] 멜라닌 생성 억제능 평가
닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 추출물, 꾸지나무 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 평가 하였다. 아무 것도 처리하지 않은 무처리군과 용매인 DMSO만 처리한 대조군도 함께 실험하였다.
25 ㎠ T-플라스크에 DMEM 배지 5-6㎖를 넣은 후, 동결 보관 중인 마우스 유래 B-16 멜라노마(KCLB 80008) 세포주를 접종하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신을 처리하여 세포를 분리하고, 6-웰 플레이트에 웰당 1×105 개로 접종한 후 세포가 웰 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DMSO에 녹인 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 추출물, 꾸지나무 추출물이 최종 농도 0.5, 5, 50㎍/㎖로 희석된 배지로 교체한 후 5% CO2, 37℃ 하에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이를 트립신으로 처리하여 세포를 회수하고, 5,000 rpm으로 10 분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 세포 펠렛을 60℃에서 2 시간 동안 건조한 후 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100㎕에 녹인 다음 분광광도계로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 단백질당 멜라닌 양을 구하였다. 합성 멜라닌(Sigma, 미국)을 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100㎕에 여러 농도로 녹여 이로부터 표준 농도 곡선을 얻어 멜라닌의 농도를 결정하였다. 이 값을 토대로 아무 것도 처리하지 않은 무처리군을 기준으로 한 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 추출물, 꾸지나무 추출물의 멜라닌 생성 억제율(%)을 구하였다. 이 중 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 추출물, 꾸지나무 추출물을 최종 농도 50㎍/㎖ 되도록 마우스 유래 B-16 멜라노마 배양액에 첨가했을 때의 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 볼 수 있듯이, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물을 최종 농도 50㎍/㎖ 되도록 마우스 유래 B-16 멜라노마 배양액에 첨가했을 때 생성된 멜라닌의 양은 아무 것도 첨가하지 않은 무첨가 대조군보다 현저히 감소하였다. 기존 미백제로 많이 사용되는 알부틴이나 닥나무 추출물, 꾸지나무 추출물의 경우보다도 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포 파쇄물의 멜라닌 양이 적어 멜라닌 생성 억제율이 우수한 것을 확인하였다. 따라서 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물은 우수한 미백제로 작용함을 알 수 있었다.
상기와 같이 멜라닌 생성 억제 효과를 가지는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물은 피부 미백 효과를 가지며, 피부 톤을 개선하고, 노화를 방지 또는 개선하는 효과를 가진다. 이들은 2 가지 이상 혼합하여 사용이 가능하다.
[실시예 1 내지 8 및 비교예 1]
하기 표 6의 조성으로 실시예 1 내지 8 및 비교예 1의 화장료 조성물을 제조하였다.
| 성분(함량: 중량%) | 실시예1 | 실시예2 | 실시예3 | 실시예4 | 실시예5 | 실시예6 | 실시예7 | 실시예8 | 비교예1 |
| 1.비즈왁스 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 2.스테아릴알코올 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 3.스테아린산 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| 4.스쿠알렌 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 5.프로필렌글리콜모노스테아레이트 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 6.폴리옥시에틸렌에테르 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 7.방부제 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 |
| 8.글리세린 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 9.프로필렌글리콜 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| 10.트리에틸아민 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 11.소디윰폴리아크릴레이트 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 12.정제수 | To 100 | To 100 | To 100 | To 100 | To 100 | To 100 | To 100 | To 100 | To 100 |
| 13.닥나무 캘러스 파쇄물(실시예 1) | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 14.꾸지나무 캘러스 파쇄물(실시예 2) | - | 5 | - | - | - | - | - | - | - |
| 15.닥나무 캘러스 배양액(실시예 3) | - | - | 5 | - | - | - | - | - | - |
| 16.꾸지나무 캘러스 배양액(실시예 4) | - | - | - | 5 | - | - | - | - | - |
| 17.닥나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물(실시예 5) | - | - | - | - | 5 | - | - | - | - |
| 18.꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물(실시예 6) | - | - | - | - | - | 5 | - | - | - |
| 19.닥나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액(실시예 7) | - | - | - | - | - | - | 5 | - | - |
| 20.꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액(실시예 8) | 5 | - | |||||||
| 21. 카보머 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 |
상기 성분 1 내지 7을 65~75℃로 가열 용해하여 유상 파트를 제조하였다. 성분 8 내지 12를 65~75℃로 가열 용해하여 수상 파트를 제조하였다. 제조한 수상 파트를 교반하면서 제조한 유상 파트 및 성분 21을 서서히 첨가하고, 7000~8000rpm에서 5분 동안 유화시켜 크림 제형으로 제조하였다. 45℃까지 냉각한 후 각각 성분 13 내지 20 중 하나를 첨가하고 1500rpm에서 1분 동안 분산시켜 제조하여 실시예 1 내지 8로 하였다. 비교예 1의 경우에는 별도의 성분을 첨가하지 않았다.
[실험예 6] 색소 침착 억제효과
건강한 남녀 20명으로 구성된 실험 대상자의 양팔 하박부에 2×2cm2의 부위를 설정하였다. 실험 대상 부위에만 자외선이 조사되도록 알루미늄 호일을 팔에 씌우고, 10cm의 거리에서 일본 도시바(주)제 FL20S BLB 램프 및 FL20S E-30 램프를 2개 동시에 0.8×10- 7erg/cm3/회로 1일 1회씩 연속 3회 조사하였다. 조사 전에 실험대상 부위를 70% 이소프로필알콜 수용액으로 잘 세척하였다. 조사 후, 자외선 조사 부위에 닥나무 속 식물을 함유한 실시예 1 내지 8, 이를 함유하지 않은 비교예 1의 처방을 1일에 3회씩 도포하였다. 3주 도포 후에 육안으로 색소 침착도를 판정하고, 실시예들이 비교예에 비해 색소 침착을 얼마나 억제하였는가를 현저한 효과, 유효, 무효의 3단계로 평가하였다. 그 결과는 표 7과 같다.
| 도포군 | 응답자 수 | ||
| 현저한효과 | 유효 | 무효 | |
| 실시예1 | 2 | 10 | 8 |
| 실시예2 | 1 | 11 | 8 |
| 실시예3 | 3 | 6 | 11 |
| 실시예4 | 2 | 9 | 9 |
| 실시예5 | 4 | 15 | 1 |
| 실시예6 | 3 | 11 | 6 |
| 실시예7 | 4 | 13 | 3 |
| 실시예8 | 3 | 10 | 7 |
| 비교예1 | 0 | 7 | 13 |
상기 표 7의 결과에서 볼 수 있듯이, 실시예 1 내지 8은 비교예 1에 비해 현저한 효과 내지 유효의 단계로 평가된 자가 많았다. 따라서, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 배양액, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액은 뛰어난 색소 침착 억제 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같이 우수한 색소 침착 억제 효과를 가지는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 배양액, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액은 피부 미백 효과를 가지며, 피부 톤을 개선하고, 노화를 방지 또는 개선하는 효과를 가진다. 이들은 2 가지 이상 혼합하여 사용이 가능하다.
[실험예 7] 피부 장벽 기능 회복 효과 평가
상기 실시예 1 내지 6의 피부 장벽 기능 회복 효과를 측정하기 위해, 무모생쥐(hairless mouse)의 피부에 아세톤을 반복적으로 도포하여 장벽 기능을 손상시킨 후, 표피 수분 손실량(TEWL, transdermal water loss)을 servomed사(스웨덴) evaporimeter EP1으로 측정하여 4.0g/㎡/h에 도달하면, 상기 실시예 1 내지 6 및 비교예 1을 5㎠ 면적에 도포하고 1, 2, 4 및 8시간 경과 후 표피 수분 손실량을 측정하여 감소되는 정도를 평가함으로써 장벽 기능이 회복되는 정도를 평가하였다. 이때, 통상의 지질 혼합물(세라마이드: 콜레스테롤: 지방산의 2:1:1 혼합물)을 양성 대조군으로 사용하였다. 초기 손상된 장벽 상태에서의 표피 수분 손실량을 100%으로 하고 시간에 따른 변화를 비교하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
| 시료 | 표피 수분 손실량 | |||
| 1시간 후 | 2시간 후 | 4시간 후 | 8시간 후 | |
| 실시예1 | 57 | 47 | 35 | 29 |
| 실시예2 | 68 | 60 | 42 | 34 |
| 실시예3 | 65 | 51 | 40 | 32 |
| 실시예4 | 62 | 57 | 41 | 31 |
| 실시예5 | 69 | 52 | 47 | 33 |
| 실시예6 | 69 | 54 | 50 | 33 |
| 비교예1 | 76 | 67 | 61 | 58 |
| 지질혼합물 | 65 | 46 | 35 | 26 |
상기 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 배양액, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물을 함유하는 실시예 1 내지 6은 상기 유효 성분을 함유하지 않는 비교예 1 및 양성 대조군인 지질 혼합물보다 표피 수분 손실량이 적었다. 따라서 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 배양액, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물은 우수한 피부 장벽 기능 회복 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 효과를 가지는 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 배양액, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물은 피부 보습 효과를 가지며, 나아가 노화를 방지하고 개선할 수 있다. 이들은 2 가지 이상 혼합하여 사용이 가능하다.
[실험예 8] 피부 톤 개선 효과 평가
피부 미백을 필요로 한다고 생각되는 성인 남,녀 108명을 9개조로 나누어, 각 조에 실시예 1 내지 8 및 비교예 1을 제공하고 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하도록 하였다.
4주 동안 사용하고 난 다음 사용성에 대한 설문조사를 통하여 피부 톤 개선 효과에 대한 평가를 시행하였고 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
| 도포군 | 응답자 수 | |||
| 매우 양호 | 양호 | 보통 | 미흡 | |
| 실시예1 | 5 | 6 | 1 | 0 |
| 실시예2 | 4 | 7 | 3 | 0 |
| 실시예3 | 3 | 6 | 3 | 0 |
| 실시예4 | 4 | 4 | 4 | 0 |
| 실시예5 | 2 | 4 | 5 | 0 |
| 실시예6 | 3 | 4 | 5 | 0 |
| 실시예7 | 2 | 4 | 6 | 0 |
| 실시예8 | 3 | 6 | 3 | 0 |
| 비교예1 | 1 | 3 | 7 | 1 |
상기 표 9의 결과에서 알 수 있듯이, 상기 실시예 1 내지 8을 바른 사람은 비교예 1을 바른 사람보다 상대적으로 미백 효과가 더 우수하다고 느끼는 것으로 나타났다.
따라서 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스 배양액, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 닥나무 및 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액은 피부 미백 효과를 가져, 피부 톤을 개선하고, 노화를 방지 또는 개선할 수 있다. 이들은 2 가지 이상 혼합하여 사용이 가능하다.
이하 본 발명에 의한 닥나무 속 식물의 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액, 캘러스 추출물, 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물, 캘러스에서 분화된 세포의 배양액 및 캘러스에서 분화된 세포의 추출물로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 화장료 조성물 및 약학 조성물의 제형예를 보다 상세하게 설명하나, 화장료 조성물 및 약학 조성물은 여러 가지 제형으로 응용 가능하고, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 현탁유액 화장수
하기 표 10의 조성으로 현탁유액 화장수를 제조하였다.
| 구성성분 | 함량(중량%) |
| 메칠파라벤 향료 세틸옥타노에이트 폴리옥시에칠렌경화피마자유 폴리실록산 초산토코페롤 에탄올 글리세린 프로필렌글리콜 카르복시비닐폴리머 닥나무 캘러스 파쇄물 정제수 |
적량 적량 1.0 0.6 0.4 0.1 12.0 6.0 2.0 0.12 2.0 TO 100 |
[제형예 2] 에센스
하기 표 11의 조성으로 에센스를 제조하였다.
| 구성성분 | 함량(중량%) |
| 메칠파라벤 향료 세틸옥타노에이트 옥틸도데스-16 콜레스-24/세테스-24 폴리실록산 초산토코페롤 에탄올 글리세린 산탄검 프로필렌글리콜 카르복시비닐폴리머 닥나무 캘러스 배양액 정제수 |
적량 적량 1.0 0.5 0.2 0.4 0.1 6.0 15.0 0.07 4.0 0.12 6.0 TO 100 |
[제형예 3] 영양크림
하기 표 12의 조성으로 영양크림을 제조하였다.
| 구성성분 | 함량(중량%) |
| 유동파라핀 세토스테아릴알코올 밀납 폴리실록산 친유형모노스테아린산스테아레이트 스테아린산 세테아릴글루코사이드 모노스테아린산폴리옥시에칠렌소르비탄(20 E.O) 하이드로제네이티드레시친 세틸옥타노에이트 메칠파라벤 프로필파라벤 향료 에칠렌다아민테트라초산나트륨 글리세린 카르복시비닐폴리머 프로필렌글리콜 꾸지나무 캘러스 파쇄물 정제수 |
15.0 2.0 3.0 0.5 2.0 2.0 1.5 1.3 2.0 1.0 0.2 0.1 적량 0.02 5.0 0.10 2.0 2.0 TO 100 |
[제형예 4] 젤
하기 표 13의 조성으로 젤을 제조하였다.
| 구성성분 | 함량(중량%) |
| 방부제 향료 세테아릴글루코사이드 세틸옥타노에이트 글리세린 호호바왁스 디엘판텐놀 에탄올 카르복시비닐폴리머 프로필렌글리콜 닥나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액 정제수 |
적량 적량 1.5 1.0 5.0 3.0 1.0 7.0 0.6 3.0 6.0 TO 100 |
[제형예 5] 팩
하기 표 14의 조성으로 팩을 제조하였다.
| 구성성분 | 함량(중량%) |
| 메칠파라벤 향료 세틸옥타노에이트 폴리옥시에칠렌경화피마자유 폴리실록산 셀룰로오스검 에탄올 글리세린 프로필렌글리콜 폴리비닐알코올 꾸지나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물 정제수 |
적량 적량 1.0 0.6 0.2 0.2 6.0 5.0 3.0 15.0 3.0 TO 100 |
[제형예 6] 피부외용제 중 연고
하기 표 15에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 정제수 | 잔량 |
| 글리세린 | 8.0 |
| 부틸렌글리콜 | 4.0 |
| 유동파라핀 | 15.0 |
| 베타글루칸 | 7.0 |
| 카보머 | 0.1 |
| 닥나무의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 배양액 | 1.0 |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 | 3.0 |
| 스쿠알란 | 1.0 |
| 세테아릴 글루코사이드 | 1.5 |
| 소르비탄 스테아레이트 | 0.4 |
| 세테아릴 알코올 | 1.0 |
| 방부제 | 적량 |
| 향 | 적량 |
| 색소 | 적량 |
| 밀납 | 4.0 |
Claims (3)
- 닥나무(Broussonetia kazinoki)의 캘러스에서 뿌리로 분화된 세포의 파쇄물을 유효 성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 유효 성분을 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 25.0 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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