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KR101778538B1 - 인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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KR101778538B1
KR101778538B1 KR1020150150214A KR20150150214A KR101778538B1 KR 101778538 B1 KR101778538 B1 KR 101778538B1 KR 1020150150214 A KR1020150150214 A KR 1020150150214A KR 20150150214 A KR20150150214 A KR 20150150214A KR 101778538 B1 KR101778538 B1 KR 101778538B1
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ginseng
ginseng fruit
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Abstract

본 발명은 인삼 열매를 귀부균(Botrytis sp.)에 의해 발효시켜 얻은 인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 인삼 열매를 귀부균(Botrytis sp.)에 의해 발효시켜 얻은 인삼 열매 귀부균 발효물, 또는 인삼 열매를 귀부균 및 유산균으로 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, MMPs를 저해할 뿐만 아니라 콜라겐 합성을 촉진시킴으로써 피부노화를 억제하고 주름을 개선시킬 수 있다. 또한, 멜라닌 생성을 억제시킴으로써 피부 미백효과를 나타낼 수 있다.

Description

인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising ginseng fruit Fermentation Product by Botrytis sp.}
본 발명은 인삼 열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인삼 열매를 귀부균(Botrytis sp.)에 의해 발효시켜 얻은 인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 사용되어 온 생약이며, 경험적으로 질병을 예방하고 수명을 연장 시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 있다(최신고려인삼 '성분 및 효능편', 한국인삼연초연구원, 56-112, 1996). 인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼 근(뿌리), 인삼엽 및 인삼 열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성도 다른 것으로 알려져 있다. (Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999). 특히 인삼 열매는 인삼 근(뿌리)과 다른 진세노사이드의 성분과 그 함량을 바탕으로 항당뇨 효능에 있어서 인삼근 보다 우수한 결과를 나타내는 것으로 보고되었다(Dey L. et al., Phytomedicine, 10; 600-605, 2003).
최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되고 동시에 한방 소재를 활용하는 많은 화장품들이 출시되면서 인삼도 화장품의 중요한 피부효능을 가진 식물 소재로 연구되고 있으나, 대부분 인삼근을 이용한 추출물 또는 인삼근의 진세노사이드 성분과 인삼 다당체를 활용한 것일 뿐 인삼 열매의 성분에 의한 피부 노화억제와 주름개선 효능에 대한 것은 전무한 실정이다. 또한 인삼 열매는 예로부터 인삼보다도 귀하게 여겨지는 것으로서 종자 획득을 목적으로 선별되어 수확되어 왔다. 인삼 열매는 인삼의 재배기간 중 4년생에 한해서 1회만 채종하게 되며, 3년생에서 채종하면 종자가 너무 작기 때문에 좋은 묘삼을 생산하기가 어렵고 5년생 이상에서 채종하면 종자는 충실하고 좋으나 인삼뿌리의 비대발육을 억제할 뿐만 아니라 조직이 치밀하지 못하여 홍삼을 제조할 때 홍삼품질이 크게 저하될 수 있다. 또 채종횟수를 재배기간 중에 2회 이상으로 채종하면 수량 및 홍삼품질이 크게 저하된다(최신고려인삼 '재배편', 한국인삼연초연구원, 130-131, 1996).
미국등록특허 제6524626호에서 인삼 열매즙을 동결건조하여 화장료 조성물에 사용하고 있으며, 인삼 열매즙과 다른 천연물을 복합적으로 사용함으로써 이들이 보습과 피부유연효과를 나타낸다고 기재하고 있으나, 이는 본 발명에 의한 인삼열매 추출물이 나타내는 피부 노화억제 효능 및 주름개선효능으로서의 화장품 용도와는 분명 구분되는 것이다.
인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지변화를 일으키게 된다.
노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타나게 되고, 자유라디칼 및 활성 유해 산소에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다. 또한 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는 노화가 진행되거나 자외선에 의해서 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시게나제-2(Cox-2, cyclooxygenase)의 생합성이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide) 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉, 자연적으로 진행되는 내인성 노화에 따른 세포 활성의 감소 및 미세염증에 의해 기질물질의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해 및 변성이 가속화되어 피부 기질이 파괴되고 얇아지면서 피부 노화의 제반 증상들이 나타나게 된다.
따라서, 이러한 노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행해지고 있는 것이 현실이다. 사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드와 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다. 이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다. 신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.
이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨 및 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.
오늘날 동양권의 여성들은 백옥같이 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 과색소 침착에 대한 치료 및 미용상 문제를 해결하고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.
이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.
피부(skin) 중에서 최외각에 위치한 표피(epidermis)의 가장 중요한 기능은 외부로부터의 다양한 자극(화학물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등의 물리 및 화학적 자극인자)에 대한 방어와 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 때만 그 기능을 유지할 수 있다. 표피 중에서도 가장 바깥에 존재하는 각질층(Stratum corneum, horney layer)은 각질형성세포로부터 형성되며, 분화가 완결된 각질 세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다(J. Invest. Dermatol. 1983; 80: 44-49). 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식 (proliferation)하는 기저세포(basal cell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포이며, 일정 기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화 과정을 「표피 세포의 분화」 또는 「각화(keratinization)」라고 부른다. 각화과정 중에 각질형성세포는 천연보습인자 (Natural Moisturizing Factor; NMF)와 세포간 지방질(세라마이드, 콜레스테롤, 지방산)을 생성하면서 각질층을 형성하여, 각질층이 견고함과 유연성을 가지게 하여 피부장벽(skin barrier)으로서의 기능을 보유하게 한다. 그러나, 이러한 각질층은 과도한 세안이나, 목욕 등의 생활 습관적 요인, 건조한 대기, 오염물질 등의 환경적인 요인 및 아토피성 피부나 노인성 피부 같은 내인성 질환 등으로 인해 쉽게 그 기능이 손실될 수 있으며, 실제적으로 현대에 들어서 더욱 늘어난 여러 요인들로 인해 최근에는 건조피부증상 및 이로 인한 제반 장해를 호소하는 사람들이 점점 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 적절한 피부수분을 유지하기 위하여 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분 손실을 방지하기 위한 연구가 많이 진행되어 왔으며, 실제로 수분보유능력이 있는 여러 종류의 보습제(moisturizer)가 개발되어 주로 화장품 영역에서 많이 사용되고 있다.
그러나, 생활환경 중에 인간에 대한 위해 요인이 점점 증가하고, 노령인구가 급격히 늘어나면서, 각질층의 생성-탈락속도(turnover rate)가 늦어지고, 각질형성 세포의 지질합성능력이 저하되거나, 표피에서 정상적인 세포의 분열, 성숙 및 분화가 원활하지 않음으로써, 각질층의 보습인자와 지질의 양이 감소되어 정상적인 각질층의 기능을 유지하지 못하는 상태, 즉 피부장벽기능이 와해된 상태의 피부를 갖고 있는 인간들이 점점 증가하는 추세에 있다. 이러한 비정상적인 표피세포의 분열, 분화로 인해 피부는 피부건조증, 아토피 및 건선 등의 다양한 피부 질환을 유발하게 되며, 이러한 제 질환들은 자체로 수분 보유 기능만을 갖는 통상적인 보습제 만으로는 그 증상을 약간 완화시킬 수는 있으나, 근본적인 치유를 기대하기는 어려운 실정이다. 일반적으로 두피 및 얼굴을 포함한 피부에서 피지는 피부의 보습 유지나 미생물의 침입을 막는 역할을 담당하지만, 피지가 과잉으로 분비되면 탈모가 촉진되고 여드름이 악화되며 여드름에 의한 모공 확대가 촉진되고 지루성 피부염이 발생하는 등 여러 가지 질환이 유발된다. 이러한 피지의 과분비는 여러 원인에 의해서 발생하는데 그 중에서도 가장 중요한 것은 피지선의 활성에 있어 피지 분비를 촉진하는데 관여하는 호르몬 가운데 하나인 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone : DHT)의 양에 의해서 피지선 세포가 활성화되어 피지가 과분비되는 것이다. 즉, 탈모에 있어서는 세포내에서 테스토스테론(testosterone : T)이 5-알파-리덕타아제 타입 2(5-α-reductase type 2)에 의해서 남성 호르몬 중에 하나인 디하이드로테스토스테론으로 전환됨과 동시에 세포질 내에 있는 수용체 단백질(receptor)과 결합하여 액내로 들어가 탈모를 유발하지만 피부나 피지선에서는 테스토스테론이 5-알파-리덕타아제 타입 1(5-α-reductase type 1)에 의해서 디하이드로테스토스테론으로 전환되어 피지선 세포를 활성화하여 분화가 촉진됨으로써 피지선내의 피지(sebum)를 과분비하여 여드름을 유발하게 된다(J. Invest Dermatol 105:209-214 Diane etc). 단순한 피지의 과분비외에 발생되는 피부 트러블인 여드름, 탈모 등은 피부의 미세한 염증 반응에 의해서 더욱 악화된다. 여드름의 발생 과정을 살펴보면 과도한 피지가 모낭에 축적되어서 여드름균이 활성화되고 염증이 유발된다. 뛰어난 항산화 효과와 함께 항염증 효과를 가지고 있어서 세포 염증 반응의 프로스타글란딘 생성, 특히 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 억제하고 iNOS에 의한 전염증인자인 NO(nitric oxide)의 생성을 억제하여 피지 과분비에 따른 여드름과 같은 피부 트러블을 완화 시킬 수 있다. 그러나, 이와 같이 피부에 안전한 천연 소재로서 피지 분비를 근본적인 원인을 통해서 감소시키고, 동시에 염증작용을 완화해 주는 원료는 많지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 인삼 열매를 화장품 분야에서 전혀 사용된 바 없고 귀부균(Botrytis sp.)에 의해 발효시켜 얻은 인삼 열매 귀부균 발효물, 또는 인삼 열매를 귀부균 및 유산균으로 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, MMPs를 저해할 뿐만 아니라 콜라겐 합성을 촉진 시킴으로써 피부노화를 억제하고 주름을 개선시킬 수 있으며, 멜라닌 생성을 억제 시킴으로써 피부 미백효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999 Dey L. et al., Phytomedicine, 10; 600-605, 2003 최신고려인삼 '재배편', 한국인삼연초연구원, 130-131, 1996
따라서, 본 발명의 주된 목적은 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, MMPs를 저해할 뿐만 아니라 콜라겐 합성을 촉진 시킴으로써 피부노화 억제 및 주름개선 효과를 나타내는 동시에 멜라닌 생성을 억제 시킴으로써 피부 미백 효과를 나타내는 인삼열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인삼열매 귀부균 발효물을 이용한 인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 인삼 열매를 귀부균(Botrytis sp.)에 의해 발효시켜 얻은 인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되면서 인삼도 화장품 소재 중 하나로 연구되고 있으나, 인삼 열매 성분의 피부노화 억제 및 주름 개선 효능과 피부 미백 효능에 대한 연구는 아직 미미하다. 이에, 본 발명자들은 인삼 열매를 귀부균으로 발효한 발효물을 화장료 조성물로 함유할 경우, 피부노화 억제 및 주름 개선에 효과적인 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 있어서, 상기 귀부균은 보트리티스 속의 균, 바람직하게는 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)인 것을 특징으로 한다.
귀부균인 보트리티스속의 균은 토양, 부패과실에서 볼 수 있고, 보통 과실이나 야채의 병원균으로 존재한다. 형태적으로는 동일하나 귀부균으로 딸기의 오염곰팡이와 곰팡이 냄새를 갖지 않는 점에서 다르다. 콜로니(colony)는 회색 또는 암갈색, 격벽을 내며 길이가 긴 기균사로부터 불규칙하게 지분되어 팽대한 말단세포의 방상의 치상 돌기에서 다수의 분생자를 형성한다. 분생자는 난형에서 구형, 1세포이고, 또한 B. allii는 양파, 부추의 회색분패병균으로서 알려져 있다. 귀부균은 유럽에서는 포도주를 제조할 때 이용된다고 알려져 있으나, 인삼 열매를 발효하기 위하여 이용된 적은 없다.
본 발명에 있어서, 상기 인삼 열매 귀부균 발효물은 인삼 열매를 고체 배지 위에 놓고 귀부균을 접종하여 고상 발효하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실험예에서, 귀부균만으로 발효하여 발효물을 얻고자 할 때는 액상발효는 진행하지 않고 고상 발효만 진행하였다 (실시예 2 참조).
본 발명에서, 상기 고상 발효란 발효 소재를 고체 배지에 놓거나 고체 배지 없이 발효 소재를 공기에 완전히 노출시켜 공기를 매체로 이용하여 고체 상태로 발효하는 것을 의미한다. 상기 고체 배지는 당업계에 알려진 어떠한 고체 배지도 사용가능하나 바람하게는 아가 배지를 사용하는 것이 좋다. 고상발효는 액상발효와 비교 하였을 때, 기능성물질의 다양성과 생산량이 극대화 된다고 알려져 있으며, 수율 또한 우수하다. 이에 반하여, 액상 발효란 발효 소재를 액체 배지에 넣고 물을 매체로 이용하여 액체 상태로 발효하는 것을 의미한다.
종래에 인삼 열매를 효모 또는 유산균으로 액상 발효하는 것은 알려져 있으나, 귀부균을 이용하여 인삼 열매를 고상 발효하는 것은 아직 알려진 바 없다. 또한, 인삼 열매를 귀부균을 이용하여 고상 발효 하는 경우, 효모 또는 유산균으로 액상 발효하는 것보다 더 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 고상 발효 단계후에 상기 고상 발효된 인삼열매를 액체 배지에 넣고 유산균을 추가 접종하여 액상 발효하는 2차 발효 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.
귀부균만을 이용하여 고상 발효 하는 경우도 효모 또는 유산균으로 접종하여 액상 발효하는 경우보다 더 우수한 효과를 나타내었으나, 귀부균으로 1차 고상 발효 후 유산균으로 2차 액상 발효한 경우가 더 우수한 효과는 나타냈었다.
본 발명에 있어서, 상기 인삼 열매 귀부균 발효물은 조성물 총 중량에 대비 0.001 내지 30 중량% 함유할 수 있으며, 바람직하게는 0.001~30.0중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 한다. 상기 유효성분의 함량이 0.001중량% 미만일 경우에는 효능, 효과가 미약하고, 90중량%를 초과할 경우에는 제형 안정화에 문제가 있으며, 함량의 증가에 따른 효능의 증가가 미약하다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화억제 및 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 조성물은 콜라겐생성을 촉진하고, MMP-1 억제효과를 나타내며, 세포재생과 세포증식 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실험예에 따르면, 인삼 열매를 귀부균으로 고상 발효한 발효물(실시예 2)이 효모 또는 유산균으로 액상 발효한 발효물(비교예2-3)보다 더 우수한 콜라겐생성 촉진효과, MMP-1 억제효과 및 세포재생과 세포증식 효과를 나타내었으며, 더욱이 귀부균으로 고상 발효 후 유산균으로 액상 발효한 발효물(실시예 3)이 더욱 우수한 콜라겐생성 촉진효과, MMP-1 억제효과 및 세포재생과 세포증식 효과를 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 인삼 열매를 귀부균으로 고상 발효한 발효물과, 고상 발효 후 유산균으로 액상 발효한 발효물이 콜라겐생성을 촉진하고, MMP-1 억제하며, 세포재생과 세포증식을 촉진함으로써 피부노화 억제 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다(실험예 1-4 참조).
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 조성물은 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실험예에 따르면, 인삼 열매를 귀부균으로 고상 발효한 발효물(실시예 2)이 효모 또는 유산균으로 액상 발효한 발효물(비교예2-3)보다 더 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었으며, 더욱이 귀부균으로 고상 발효 후 유산균으로 액상 발효한 발효물(실시예 3)이 더욱 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 인삼 열매를 귀부균으로 고상 발효한 발효물과, 고상 발효 후 유산균으로 액상 발효한 발효물이 멜라닌 생성을 억제함으로써, 피부 미백 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다(실험예 5 참조).
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다. 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스 등의 화장료 제형을 가질 수 있으며 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투과형 제형을 갖는 화장료 조성물 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 다음 2 단계를 포함하는 화장료 조성물용 인삼 열매 귀부균 발효물의 제조방법을 제공한다.
a) 인삼 열매를 고체 배지 위에 놓고 귀부균을 접종하여 고상 발효하는 1차 발효 단계; 및
b) 상기 1차 발효된 인삼 열매를 액체 배지에 넣고 유산균을 추가 접종하여 액상 발효하는 2차 발효 단계.
본 발명의 조성물에 사용되는 인삼 열매의 발효 추출물의 제조방법은 특별히 한정되며, 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있고, 구체적으로는 인삼 열매에 상기 균을 첨가, 배양하고 발효시켜 수득할 수 있다.
보다 구체적으로, 발효시 귀부균(Botrytis cinerea)를 사용할 경우에는 121℃로 멸균처리된 인삼 열매를 Potato Dextrose Agar 고체 배지에 살포하고, 살포된 tray 위의 가운데에 Botrytis cinerea 종균을 접종하여 7일간 배양한다. 이때 사용되는 균체는 (약 105 ~107 cell/mL)로 접종하여 배양한다. 7일간 배양 후 1차 발효된 인삼 열매는 재회수하여 다시 MRS media(BD) 와 1:3 의 비율로 혼합하여 121℃ 고압멸균 처리하여 준비한다. 멸균 완료 후 유산균을 접종하여 2차 발효를 실시한다. 이때 점종하는 균체는 (약 107~109)로 접종한다. 접종된 인삼 열매는 약 5일간 발효한다. 배양한 후, 이 발효액을 원심분리하여 고분자 침전물과 유산균제가 제거된 최종 인삼 열매 발효 추출물을 수득할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 귀부균을 이용한 인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 피부노화 억제 및 주름 개선 효과와 함께 피부 미백효과를 통해 피부에 안전하면서도 전반적인 피부 상태를 개선 시키는 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 인삼 열매를 고상 발효 하는 것을 나타내는 도면이다.
도 2는 인삼 열매 발효물의 세포증식 효과를 나타내는 도면이다. (GB: 인삼 열매 추출물(실시예 1), GBF: 귀부균+유산균을 이용한 인삼 열매 추출물(실시예 3)
도 3은 인삼 열매 발효물의 세포 재생 효과를 나타내는 도면이다. (GB: 인삼 열매 추출물(실시예 1), GBF: 귀부균+유산균을 이용한 인삼 열매 추출물(실시예 3)
도 4는 인삼 열매 발효물의 MMP-1 저해 효과를 나타내는 도면이다. (GB: 인삼 열매 추출물(실시예 1), GBF: 귀부균+유산균을 이용한 인삼 열매 추출물(실시예 3)
도 5는 발효균 및 인삼 열매 발효물의 MMP-1 저해 효과를 나타내는 도면이다. (G-1: 효모 추출물(비교예 1-1), G-2: 유산균 추출물(비교예 1-2), G-6: 귀부균 추출물(비교예 1-3), G-8: 인삼열매 귀부균+유산균 발효물(실시예 3))
도 6은 인삼 열매 발효물의 MMP-1 저해 효과를 나타내는 도면이다. (G-3: 인삼열매 효모 발효물(비교예 3), G-4: 인삼열매 유산균 발효물(비교예 2), G-5: 인삼열매 귀부균 발효물(실시예 2))
도 7은 인삼 열매 발효물의 콜라겐 합성 촉진 효과를 나타내는 도면이다. (GB: 인삼 열매 추출물(실시예 1), GBF: 귀부균+유산균을 이용한 인삼 열매 추출물(실시예 3)
도 8은 발효균 및 인삼 열매 발효물의 콜라겐 합성 촉진 효과를 나타내는 도면이다. (G-1: 효모 추출물(비교예 1-1), G-2: 유산균 추출물(비교예 1-2), G-6: 귀부균 추출물(비교예 1-3), G-8: 인삼열매 귀부균+유산균 발효물(실시예 3))
도 9는 인삼 열매 발효물의 콜라겐 합성 촉진 효과를 나타내는 도면이다. (G-3: 인삼열매 효모 발효물(비교예 3), G-4: 인삼열매 유산균 발효물(비교예 2), G-5: 인삼열매 귀부균 발효물(실시예 2))
도 10은 발효균 및 인삼 열매 발효물의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 도면이다. (AB:알파-알부틴), G-1: 효모 추출물(비교예 1-1), G-2: 유산균 추출물(비교예 1-2), G-6: 귀부균 추출물(비교예 1-3), G-8: 인삼열매 귀부균+유산균 발효물(실시예 3))
도 11은 인삼 열매 발효물의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 도면이다. (AB: 알파-알부틴), G-3: 인삼열매 효모 발효물(비교예 3), G-4: 인삼열매 유산균 발효물(비교예 2), G-5: 인삼열매 귀부균 발효물(실시예 2))
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 인삼 열매 1차 발효 전처리, 준비 및 인삼 열매 추출물의 제조
1. 인삼 열매 전처리
생(生)인삼 열매를 수확하여 종자를 분리하여 제거한 후 인삼 열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 흐르는 물 세척을 통하여 인삼 열매를 전처리 하였다.
2. 인삼 열매 멸균처리 및 1차 준비
생(生 )인삼 열매를 세척 후 121℃ 고압 습식멸균을 실시하여, 무균조건이 유지되는 조건으로 자연 건조시킨다. Potato Dextrose Agar media 를 면적 100*100*10cm 크기의 Tray 에 고체화 시킨 뒤, 잘 건조된 진생베리를 그 위에 살포하여 준비한다.
3. 인삼 열매 추출물의 제조
인삼열매 추출물을 제조하기 위해 300g의 인삼열매를 흐르는 물에 세척하여 자연 건조시킨 뒤 파쇄기를 사용하여 열매를 일부 파쇄하고, 착즙기를 사용하여 압착 추출을 실시하였다. 추출된 인삼열매 추출물은 멸균을 위해 0.2um 주사기 필터를 사용하여 멸균 처리하였다.
실시예 2: 귀부균을 이용한 인삼 열매 발효 추출물
상기 실시예 1의 인삼 열매를 Tray 에 살포한 뒤 사전 배양된 귀부균(Botrytis cinerea)을 Tray 가운데에 접종하여 7일(168hr) 간 1차 배양 실시한다. 접종에 사용되는 균체량은 107-109 이며, 배양온도는 28℃로 항온배양 실시한다. 7일 뒤에는 Tray 위의 발효된 인삼 열매를 재 회수 하고, MRS media 와 1:3의 비율로 혼합하여 121℃ 고압 멸균처리한다.
실시예 3:귀부균 + 유산균을 이용한 인삼 열매 발효 추출물
상기 실시예 1의 인삼 열매를 Tray 에 살포한 뒤 사전 배양된 귀부균을 Tray 가운데에 접종하여 7일(168hr) 간 고체배양을 실시한다. 접종에 사용되는 균체량은 107-109 이며, 배양온도는 28℃로 항온배양 실시한다. 7일 뒤에는 Tray 위의 발효된 인삼 열매를 재 회수 하고, MRS media 와 1:3의 비율로 혼합하여 121℃ 고압 멸균 처리한다. 최종 멸균된 MRS media 와 인삼 열매 혼합배양 배지에 락토바실러스 (Lactobacillus sp. CXHB-4)를 107-109cell/mL로 접종하고, 5일(120hr)간 배양을 실시하고, pH 6.5~7.5, 온도 35~38℃, 통기량 1VVM의 조건을 유지하면서 액체 배양하였다. 상기 발효액을 10000 Xg에서 30분간 원심분리하여 고분자 침전물과 균체가 제거된 최종 인삼 열매 발효 추출물을 얻었다.
비교예 1: 효모추출물, 유산균 추출물, 귀부균 추출물
1. 효모추출물
인삼에서 분리한 효모종균 (Saccharomyces sp., CXHB-2)을 배양하기 위해 Potato Dextrose Broth (PDB)배지를 1리터 습식 고압멸균 (121도) 을 실시한다. 멸균후 온도를 25도까지 냉각하고, 종균을 접종한다. 접종된 PDB 배지는 28도, 100rpm 조건으로 교반배양을 5일간 실시하였다. 5일간 배양하였을 때 균체량이 균체량이 109 /ml정도로 확인되었다. 배양액은 원심분리기를 사용하여 4000 Xg 로 1시간 원심분리하여 상층액을 제거 후 3차 멸균증류수로 2번 세척하였다. 세척이 완료된 균체는 상온(25도)에서 4일간 건조시키고 건조가 완료된 균체 5g 을 멸균증류수 50ml에 재용해 시키고 초음파 파쇄기를 사용하여 1분간 세포를 파쇄한 뒤 원심분리기를 사용하여(4000 Xg) 분리된 상층액을 비교실험에 사용하였다.
2. 유산균 추출물
인삼에서 분리한 유산균종균 (Lactobacillus sp. CXHB-4)을 배양하기 위해 MRS배지를 1리터 습식 고압멸균 (121도) 을 실시한다. 멸균 후 온도를 25도까지 냉각하고, 종균을 접종한다. 접종된 MRS 배지는 37도, 정치배양을 5일간 실시하였다. 5일간 배양하였을 때 균체량이 균체량이 109 /ml정도로 확인되었다. 배양액은 원심분리기를 사용하여 4000 Xg 로 1시간 원심분리하여 상층액을 제거 후 3차 멸균증류수로 2번 세척하였다. 세척이 완료된 균체는 상온(25도)에서 4일간 건조시키고 건조가 완료된 균체 5g 을 멸균증류수 50ml에 재용해 시키고 초음파 파쇄기를 사용하여 1분간 세포를 파쇄한 뒤 원심분리기를 사용하여(4000 Xg) 분리된 상층액을 비교실험에 사용하였다.
3. 귀부균 추출물
인삼에서 분리한 귀부균 종균 (Botrytis cinerea, CXHB-3) 를 배양하기 위해 PDA배지를 1리터 습식 고압멸균 (121도) 을 실시한다. 멸균후 배지를 150 파이 패트리접시에 부어 고체상태로 굳힌다. 굳힌 PDA 배지 가운데에 종균을 접종하여 약 7일간 28도 인큐베이터에서 배양한다. 배양후 균체가 형성된 부분을 멸균된 수술용 칼을 사용하여 잘라낸 뒤 균체 5g 을 멸균증류수 50ml 에 용해 시키고 초음파 파쇄기를 사용하여 1분간 세포를 파쇄한 뒤 원심분리기를 사용하여(4000 Xg) 분리된 상층액을 비교실험에 사용하였다.
비교예 2: 유산균을 이용한 인삼 열매 발효 추출물
상기 실시예 2에서 최종 멸균된 MRS media 와 인삼 열매 혼합배양 배지에 락토바실러스 (Lactobacillus sp. CXHB-4)를 107-109cell/mL로 접종하고, 5일(120hr)간 배양을 실시하고, pH 6.5~7.5, 온도 35~38℃, 통기량 1VVM의 조건을 유지하면서 2차 배양하였다. 상기 발효액을 10000 Xg에서 30분간 원심분리하여 고분자 침전물과 균체가 제거된 최종 인삼 열매 발효 추출물을 얻었다.
비교예 3: 효모를 이용한 인삼 열매 발효 추출물
멸균된 PD media 와 인삼 열매 혼합 배지에 사카로마이세스 (Saccharomyces sp.)를 107-109cell/mL로 접종하고, 5일(120hr)간 배양을 실시하고, pH 6.5~7.5, 온도 35~38℃, 통기량 1VVM의 조건을 유지하면서 교반 배양하였다. 발효가 끝난 상기 발효액을 10000 Xg에서 30분간 원심분리하여 고분자 침전물과 균체가 제거된 최종 인삼 열매 발효 추출물을 얻었다.
시험예 1: 인삼 열매 발효물의 세포증식 촉진능 평가
인삼열매(실시예 1) 및 인삼열매 발효물(실시예 3)의 인간 섬유아세포주인 Hs68 fibroblast에서 세포증식 촉진 효능 유무를 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)시약을 이용한 측정법으로 수행하였다.
인간 섬유아세포주인 Hs68 fibroblast를 2x104 cells/well 농도로 96 well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 농도별로 비교예 1의 추출물 또는 실시예 2의 발효물을 첨가한 배지로 교환해 준 다음 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후 각 well의 배지를 제거하고 DPBS washing 과정을 1회 거친 다음 0.5mg/ml 농도의 MTT 시약을 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응과정에서 생긴 formazan crystal은 MTT 시약을 제거한 다음 DMSO를 넣어 녹여준 다음 ELISA reader를 이용하여 590 nm에서 측정하였다. 세포 생존율은 아무 시료도 넣지 않은 대조군의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도면 2에 나타낸 바와 같이 인삼 열매 추출물(실시예 1)의 경우에서보다 인삼 열매 발효물(실시예 3)에서 동일 농도 대비 더 높은 세포 증식 효능을 나타냄을 확인하였다.
시험예 2: 인삼 열매 발효물의 세포손상 회복능 평가
자외선에의 노출은 세포에 직접적인 손상을 주어 세포 증식을 억제하는 작용을 갖는다. 이에 대한 인삼 열매 추출물(실시예 1)과 발효물(실시예 3)의 세포손상 회복능을 비교하기 위하여 자외선을 조사한 인간 섬유아세포주(Hs68)을 이용하여 실험을 수행하였다.
시험예 1에서와 동일 농도로 접종 및 배양한 섬유아세포에서 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 다음 control을 제외한 나머지 세포군에 15 mJ/cm2의 UVB를 조사한 뒤 실시예 1의 추출물과 실시예 3의 발효물을 각각 농도별로 첨가한 배지로 교환하여 추가적으로 24시간 배양하였다. 이후의 MTT시약을 이용한 시험법은 시험예 1에서와 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, 도면 3에서의 결과와 같이 인삼 열매 추출물과 발효물 모두에서 뛰어난 세포손상 회복 효능을 보였으나, 고농도 처리군에서의 경우에는 발효물(실시예 3)에서 월등히 뛰어난 효능을 나타내었다.
시험예 3: MMP-1 저해능 평가
본원발명 실시예 1-3 및 비교예 1-3의 자외선에 의해 증가하는 콜라게나아제(MMP-1)에 대한 저해능을 비교하기 위해 인간 섬유아세포주 Hs68을 이용하여 MMP-1 발현량 측정을 진행하였다.
섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 4x105의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 15 mJ/cm2의 UVB를 조사한 뒤 인삼 열매 추출물 또는 발효물을 농도별로 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 260 nm에서 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 MMP-1 주형과 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 MMP-1 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 주형의 서열과 반응 조건은 하기 표 1과 같았으며, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
주형(primer) 서열 반응 조건
MMP-1 F 5’-CGAATTTGCCGACAGAGATGA-3’ 94℃, 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
R 5’-GTCCCTGAACAGCCCAGTACTT-3’
COL1A1 F 5'-CACCAATCACCTGCGGTACAGAA-3'
R 5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3'
COL3A1 F 5'-TGGAGGATGGTTGCACGAAA-3'
R 5'-ACAGCCTTGCGTGTTCGATA-3'
β-Actin F 5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’
R 5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’
그 결과, 도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이 UVB 조사군에서 MMP-1 발현량이 급격히 증가한 것에 반해 인삼 열매 추출물(실시예 1) 및 인삼 열매 발효물(실시예2-3)을 처리군에서 그 발현량이 감소하는 모습을 보였으며, 더욱이, 인삼 열매 발효물 중에서도 유산균(비교예 2) 또는 효모(비교예 3)로 인삼 열매를 발효한 발효물보다 귀부균(실시예 2) 또는 귀부균 및 유산균(실시예 3)으로 발효한 인삼 열매 발효물이 월등히 뛰어난 MMP-1 발현 억제 효능을 보였다.
시험예 4: 인삼 열매 발효물의 콜라겐 합성 촉진능 평가
본원발명 실시예 1-3 및 비교예 1-3의 콜라겐 합성 촉진 효능을 비교 평가하기 위해 시험예 3에서와 동일 세포를 사용하여 동일 조건으로 실험을 진행하였다. 단지 최종적으로 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하는 과정에서 MMP-1 주형을 대신하여 콜라겐전구체 합성 유전자인 COL1A1 주형을 사용하였다. 주형의 서열과 반응 조건은 상기의 표 1과 같았으며, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
그 결과, 도 7-9에 나타낸 바와 같이 UVB 조사로 인해 감소한 COL1A1의 발현이 인삼 열매 추출물(실시예 1, 비교예1-5)을 처리한 경우에서는 증가하지 않거나 증가율이 미미한 반면, 발효물(실시예 2-3)을 처리한 경우에서는 통계유의적으로 증가함을 확인하였다.
실험예 5: 멜라닌 생성 억제능 평가
본원발명 실시예 1-3 및 비교예 1-3의 멜라닌 생성 억제 효능을 비교 평가하기 위해 C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM에 10% 우태반 혈청, 100nM 12-O-테트라데카노일포르볼(tetradecanoylphorbol)-13-아세테이트, 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 105 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양한 다음, 이틀째부터 3일 연속으로 각 시험물질을 가하여 배양하였다. 시험물질로는 알부틴과 상기 실시예 1-3 및 비교예 1-3의 추출물을 100ppm의 농도로 하여 사용하였다. 이때, 상기 하이드로퀴논은 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 나타내었다.
그 결과, 도 10-11에서 나타나는 바와 같이, 알파-MSH 처리로 멜라닌 생성이 급격히 증가한 대조군에 비해 실시예 1, 비교예 1-3은 멜라닌 생성을 억제하지 못하거나 그 효과가 미미하였으나, 인삼 열매를 귀부균 또는 귀분균 및 유산균으로 발효한 인삼 열매 발효물인 실시예 2-3은 멜라닌 생성 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 인삼 열매를 귀부균(Botrytis sp.)에 의해 발효시켜 얻은 인삼 열매 귀부균 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상기 인삼 열매 귀부균 발효물은 인삼 열매를 고체 배지 위에 놓고 귀부균을 접종하여 고상 발효하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 귀부균은 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 고상 발효 단계후에 상기 고상 발효된 인삼열매를 액체 배지에 넣고 유산균을 추가 접종하여 액상 발효하는 2차 발효 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 인삼 열매 귀부균 발효물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30.0 중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화억제 및 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  10. 다음 2 단계를 포함하는 화장료 조성물용 인삼 열매 귀부균 발효물의 제조방법:
    a) 인삼 열매를 고체 배지 위에 놓고 귀부균을 접종하여 고상 발효하는 1차 발효 단계; 및
    b) 상기 1차 발효된 인삼 열매를 액체 배지에 넣고 유산균을 추가 접종하여 액상 발효하는 2차 발효 단계.
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