KR101773057B1 - Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 - Google Patents
Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101773057B1 KR101773057B1 KR1020160031411A KR20160031411A KR101773057B1 KR 101773057 B1 KR101773057 B1 KR 101773057B1 KR 1020160031411 A KR1020160031411 A KR 1020160031411A KR 20160031411 A KR20160031411 A KR 20160031411A KR 101773057 B1 KR101773057 B1 KR 101773057B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- nos
- sfts
- primer
- diagnostic kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001535172 Severe fever with thrombocytopenia virus Species 0.000 title claims abstract description 42
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 43
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 230000003582 thrombocytopenic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 208000011361 Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Diseases 0.000 description 13
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 9
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000713137 Phlebovirus Species 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000179420 Haemaphysalis longicornis Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000783701 SFTS virus HB29 Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 206010043561 Thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/12011—Bunyaviridae
- C12N2760/12211—Phlebovirus, e.g. Rift Valley fever virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 SFTS 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트에 관한 것으로서, 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍을 포함함으로써 중증열성혈소판감소증후군을 매우 높은 정확도로 진단할 수 있는 프라이머 세트 및 진단 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 SFTS 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트에 관한 것이다.
중증열성혈소판감소증후군 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)은 고열, 구토, 설사, 혈소판감소, 백혈구감소 및 다발성 장기부전과 같은 증상을 동반하며, 치사율이 6-30%에 이르는 심각한 질환이다. SFTS를 일으키는 바이러스는 Bunyaviridae 과의 Phlebovirus 속에 속하는 RNA 바이러스이며, 2009년에 중국에서 최초로 보고되었다.
SFTS 바이러스 (SFTS virus, SFTSV)는 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis)를 매개체로 하는 것으로, 상기 진드기는 한국에도 널리 퍼져 있는 것으로 알려져 있다. 또한, SFTS 바이러스의 혈청전환 및 바이러스혈증이 염소, 양, 소, 돼지 및 개와 같은 사육동물에서 발견되었으며, 이러한 동물도 SFTS 바이러스가 퍼진 지역에서 중간 매개체로 작용하는 것으로 생각된다.
SFTS 바이러스의 매개체인 작은소참진드기 및 야생동물들은 전국에 퍼져 서식하고 있으며, 등산 및 둘레길 걷기 등의 야외 활동이 점점 증가함에 따라 SFTS 바이러스 감염의 위험성도 높아지고 있고, 국내 환자 발생 빈도도 증가하고 있다. 이에 따라, SFTS 바이러스를 높은 정확도로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트의 개발이 절실한 실정이다.
본 발명은 검체에 포함된 SFTS 바이러스를 높은 민감도 및 정확도로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 중증열성혈소판감소증후군을 높은 민감도 및 정확도로 진단하기 위한 키트를 제공하는 것을 또다른 목적으로 한다.
1. 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트.
2. 위 1에 있어서, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍을 더 포함하는, 진단 키트.
3. 위 1에 있어서, 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍을 더 포함하는, 진단 키트.
4. 위 1에 있어서, 상기 중증열성혈소판감소증후군은 SFTS 바이러스에 의한 것인, 진단 키트.
5. 위 1에 있어서, 상기 프라이머쌍은 검체 내의 SFTS 바이러스를 검출하는 것인, 진단 키트.
6. 위 5에 있어서, 상기 검체는 진단 대상의 혈액 또는 작은소참진드기인, 진단 키트.
본 발명의 프라이머 세트는 검체의 SFTS 바이러스를 높은 민감도로 검출할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 검체의 SFTS 바이러스를 높은 정확도로 검출할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 SFTS 바이러스 감염 여부를 진단하기에 적합하다.
본 발명의 진단 키트는 중증열성혈소판감소증후군을 높은 민감도로 진단할 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 중증열성혈소판감소증후군을 높은 정확도로 진단할 수 있다.
본 발명은 SFTS 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트에 관한 것으로서, 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍을 포함함으로써 중증열성혈소판감소증후군을 매우 높은 정확도로 진단할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트는 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍을 포함한다.
본 발명의 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트는 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍 및 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 더 포함할 수 있다.
서열번호 1 내지 12의 프라이머는 중증열성혈소판감소증후군의 원인이 되는 SFTS 바이러스 (SFTS virus, SFTSV) 유전체의 S 분절 (S segment)에 상보적인 서열을 갖는 DNA이다. SFTS 바이러스 유전체의 S 분절은 분야바이러스 (Bunyaviridae)에 속하는 바이러스들 사이에서 고도로 보존된 (highly conserved) 부위로서, S 분절에 상보적인 서열을 갖는 서열번호 1 내지 12의 프라이머는 다양한 SFTS 바이러스의 변종을 높은 정확도로 검출한다. 본 발명에서의 SFTS 바이러스 유전체는, SFTS 바이러스의 유전체 또는 그 cDNA 서열을 의미한다.
서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍을 포함하는 본 발명의 진단 키트는 중증열성혈소판감소증후군을 매우 높은 정확도로 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 진단 키트는 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍 및 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 더 포함함으로써 SFTS 바이러스 검출 정확도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍 중 어느 하나의 프라이머쌍 만을 사용하여도 100%의 중증열성혈소판감소증후군 진단 정확도를 나타내지만, 이와 같이 하나의 프라이머쌍만 사용하는 경우에는 장기간 많은 수의 대상을 진단하는 임상 사용 시 예기치 못한 새로운 SFTS 바이러스 변종의 출현 또는 진단을 수행하는 사람 또는 기계의 실수 등 미리 예견할 수 없는 변수에 의해 만에 하나 잘못된 음성 반응이 나오는 경우가 생길 가능성을 완전히 배제할 수는 없다. 본 발명의 일 실시예에 따른 진단 키트는, 추가의 프라이머쌍에 의한 중복 검사로 이를 보완할 수 있다. 예컨대, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍 및 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍 중 적어도 하나의 프라이머쌍을 더 포함함으로써, 만에 하나 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍이 진단하지 못하는 경우가 생기더라도 이를 보완하여 100%의 진단 정확도를 유지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 2개 이상의 프라이머쌍을 포함하는 진단 키트의 경우, 각각의 프라이머쌍을 사용하는 진단이 별도로 수행될 수도 있고, 다수의 프라이머쌍을 하나의 반응에 혼합 사용하여 진단이 수행될 수도 있다.
본 발명에서의 SFTS 바이러스는 Bunyaviridae 과의 Phlebovirus 속에 속하는 RNA 바이러스일 수 있다. 예컨대, 분야바이러스 (Bunyavirus)에 속하는 SFTS 바이러스 HB29 스트레인 및 그와 유사한 변종을 포함할 수 있다.
서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍, 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍, 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍 또는 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍은 검체 내의 SFTS 바이러스를 검출할 수 있다.
서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍, 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍, 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍 또는 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍은, 검체에 SFTS 바이러스가 포함되어 있는지 여부를 판별하기 위한 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)에 사용될 수 있다. 본 발명에서의 중합효소연쇄반응은 일반적인 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응 (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR) 등을 포함한다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 위의 프라이머 이외에도, 역전사효소, 중합효소, 중합효소연쇄반응을 위한 cDNA 템플릿 (template), 및 버퍼 등의 반응 시약을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 일반적인 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소연쇄반응 등에 사용될 수 있는데, 이 경우 SFTS 바이러스의 RNA 유전체로부터 역전사효소 (reverse transcriptase)의 작용을 통한 역전사 (reverse transcription) 반응을 별도로 수행하여 cDNA를 수득하고 이를 중합효소연쇄반응의 템플릿 (template)으로 사용할 수 있다. 또 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 역전사 반응과 중합효소연쇄반응을 연속적으로 수행하는 원스텝 역전사 중합효소연쇄반응 (one-step RT-PCR)에 사용될 수 있다.
중합효소연쇄반응의 결과물은 아가로즈 겔 전기영동 (agarose gel electrophoresis) 또는 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머쌍에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 중증열성혈소판감소증후군을 진단할 수 있다.
SFTS 바이러스의 고도로 보존된 S 분절의 RNA에 대한 역전사 중합효소연쇄반응의 결과물을 검출하기 위하여 계통분석 (phylogenetic analysis)이 수행될 수도 있다.
진단 키트가 실시간 중합효소연쇄반응에 사용되는 경우에는 SFTS 바이러스 특이적인 서열을 포함하는 프로브 (probe)를 추가적으로 사용할 수 있다. 각각의 프라이머쌍의 사용에 적합하도록 각각의 프로브를 제작하는 것이 바람직하다. 예컨대, 각각의 프로브는 해당 프로브와 함께 사용될 프라이머쌍에 의해 증폭되는 DNA 절편의 일 부분에 해당하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 각각의 프로브는 5’말단에는 형광물질이 결합되고 3’말단에는 소광체 (quencher)가 결합된 것일 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 각각의 프로브의 5’말단에는 적색, 녹색, 청색 등 특정 파장을 방출하는 형광물질이 결합되고 3’말단에는 블랙홀 소광체(black hole quencher, BHQ)가 결합될 수 있다. 형광물질과 소광체가 프로브에 결합되어 있는 상태에서는 소광체가 형광물질이 방출하는 빛을 흡수하기 때문에 형광 신호가 검출되지 않는다. 반면, DNA의 합성 및 신장 과정에서 DNA 중합효소의 exonuclease activity에 의해 결합되어 있던 형광물질이 분리되면 형광신호를 검출할 수 있다. 중합효소연쇄반응이 진행되는 동안, 이러한 형광신호를 실시간으로 측정할 수 있으며, 증가한 형광신호를 바탕으로 바이러스 존재 유무를 판별할 수 있다. 이러한 프로브의 사용은 실시간 중합효소연쇄반응에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서의 검체는 SFTS 바이러스 감염이 의심되는 대상 (즉 SFTS 바이러스 감염 여부 확인이 필요한 대상) 및 그 대상으로부터 채취한 체액 또는 조직 샘플일 수 있다. 예컨대, 검체는 인간, 야생동물, 가축, 반려동물 등을 포함하는 동물 및 그로부터 채취한 체액 또는 조직 샘플일 수 있다. 상기 체액은 혈액일 수 있다. 또한 예컨대, 검체는 진드기 및 곤충일 수 있으며, 상기 진드기는 작은소참진드기일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 검체는 진단 대상의 혈액일 수 있으며 또한 작은소참진드기일 수 있다. 본 발명에서의 혈액은 혈액 및 그로부터 유래된 물질 (예컨대, 혈청 등)을 포함한다.
SFTS 바이러스의 RNA는 중증열성혈소판감소증후군 의심 환자 및 가족의 혈액 및 혈청, 또는 진드기 등으로부터 추출될 수 있다. RNA의 추출은 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자 (이하, ‘당업자’라고 함)에게 알려진 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 추출된 RNA는 영하 70 ℃에서 보관될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 검체에 SFTS 바이러스가 존재할 경우, SFTSV의 RNA 유전체의 S 분절 부분을 증폭시킬 수 있는 프라이머와 역전사효소 (reverse transcriptase)의 작용을 통한 역전사 (reverse transcription) 반응으로 검체에 존재하는 SFTS 바이러스 유전체에 대한 cDNA를 합성할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 역전사 반응은 40℃ 내지 50℃의 온도에서 20분 내지 40분간 수행될 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면 본 발명의 역전사 반응은 45℃의 온도에서 30분간 수행될 수 있다.
역전사 반응이 완료된 후에는, 역전사 반응의 반응물을 85℃ 내지 95℃의 온도에서 5분 내지 20분간 가열하여 역전사효소를 불활성화(inactivation) 시킬 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 역전사 반응의 반응물을 90℃의 온도에서 10분간 가열하여 역전사효소를 불활성화 시킬 수 있다.
합성된 cDNA를 주형(template)으로 하여, SFTS 바이러스와 DNA 중합효소 및 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍의 작용으로, 중합효소연쇄반응을 통하여 SFTS 바이러스 cDNA의 적어도 일 부분을 증폭할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 중합효소연쇄반응은 85℃ 내지 95℃에서 5 내지 30초간 가열하여 변성한 후 40℃ 내지 65℃에서 15초 내지 60초간 가열하여 신장하는 단계를 35 내지 55 싸이클 반복하여 수행될 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 중합효소연쇄반응은 90℃에서 15초간 가열하여 변성한 후 48℃에서 30초간 가열하여 신장하는 단계를 45 싸이클 반복하여 수행될 수 있다.
본 발명의 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트는 역전사반응과 중합효소연쇄반응을 각각 별도의 반응 혼합물 (mix)을 준비하여 별도로 수행하는 것일 수 있고, 또한 하나의 반응 혼합물을 준비하여 원스텝 역전사 중합효소연쇄반응 (one-step RT-PCR)을 수행하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 원스텝 역전사 중합효소연쇄반응의 반응 혼합물 (mix)은 역전사효소, 중합효소 및 버퍼 등을 포함하는 8 ㎕의 One-step RT-PCR 프리믹스 (premix), 프라이머를 포함하는 7 ㎕의 탐지 용액 (detection solution), 검체로부터 수득한 RNA를 포함하는 5 ㎕의 RNA 템플릿 (template)로 이루어질 수 있다 (총 부피 20 ㎕).
일 실시예에 따르면, 원스텝 역전사 중합효소연쇄반응은 다음의 조건에서 수행될 수 있다: 45 ℃에서 30 분 (1 cycle), 90 ℃에서 10 분 (1 cycle) 및 95 ℃에서 15 초 및 48 ℃에서 30 초 (45 cycle).
본 발명의 진단 키트는 인터널 컨트롤 (internal control)을 포함할 수 있다. 검체 내에 SFTS 바이러스가 존재하지 않는 경우에는 유전자 증폭이 일어나지 않는데, 이러한 경우와 중합효소연쇄반응 자체에 문제가 있어서 유전자 증폭이 일어나지 않는 경우를 구분하기 위하여, SFTS 바이러스에 존재하지 않는 외부 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머쌍 및 해당 외부 유전자 DNA를 포함하는 인터널 컨트롤을 사용할 수 있다. 인터널 컨트롤의 증폭을 통해 중합효소연쇄반응 과정의 유효성을 확인할 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 진단 키트는 용기 (예컨대, 일회용 PCR 튜브 등)에 담겨져 있는 동결건조된 (lyophilized) 프라이머를 포함할 수 있다. 두 개 이상의 프라이머쌍을 포함하는 경우에는, 다수의 프라이머쌍이 혼합되어 PCR 튜브에 담겨져 있을 수도 있고, 각각의 프라이머쌍이 개별적으로 각각의 PCR 튜브에 담겨져 있을 수도 있다. 예컨대, 두 개의 프라이머쌍을 포함하는 진단 키트의 경우, 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍 중 어느 하나의 프라이머쌍이 동결건조분말 형태로 담겨져 있는 일회용 PCR 튜브와, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍 또는 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍 중 어느 하나의 프라이머쌍이 동결건조분말 형태로 담겨져 있는 일회용 PCR 튜브가 진단 키트에 포함될 수 있다. 또한, 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍 중 어느 하나의 프라이머쌍과 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍 또는 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍 중 어느 하나의 프라이머쌍이 동결건조분말 형태로 혼합되어 담겨져 있는 일회용 PCR 튜브가 진단 키트에 포함될 수 있다. 세 개 이상의 프라이머쌍을 포함하는 진단 키트의 경우에도, 위와 유사한 형태로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 진단 키트에는 역전사효소, 중합효소 및 버퍼 등이 포함될 수 있다. 역전사효소, 중합효소 및 버퍼는 각각 별도의 용기에 담겨져 있을 수도 있으며, 역전사효소 및 중합효소의 혼합물이 한 용기에 담겨져 있고 버퍼가 별도의 용기에 담겨져 있을 수도 있고, 역전사효소, 중합효소 및 버퍼가 모두 혼합되어 한 용기에 담겨져 있을 수도 있다.
또 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 진단 키트에는 위의 프라이머, 역전사효소, 중합효소 및 버퍼를 포함하는 반응 혼합물이 액체의 형태로 용기 (예컨대, 일회용 PCR 튜브)에 담겨져 있을 수 있다. 이를 냉동 보관 하였다가 필요시 해동하여 사용할 수 있다. 이러한 진단 키트의 경우, 진단 시 검체를 추가하는 것 외에는 별도의 혼합 과정이 필요하지 않으므로 진단 편의성 및 신속성이 증대될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: SFTS 바이러스 검출용 프라이머 세트, 중합효소연쇄반응 혼합물 조성 및 반응 조건
SFTS 바이러스 검출용 프라이머 세트를 표 1에 정리하였다. one-step RT-PCR 반응 혼합물의 시약 조성은 표 2에 정리하였으며, one-step RT-PCR 반응 조건은 표 3에 정리하였다.
| 프라이머 세트 | Sequence (5'-3') | |
| NP1 | Forward (서열번호 1) | 5'-ATCGTCAAGGCATCAGGGAA-3' |
| Reverse (서열번호 2) | 5'-TTCAGCCACTTCACCCGAA-3' | |
| NP2 | Forward (서열번호 3) | 5'-CATCATTGTCTTTGCCCTGA-3' |
| Reverse (서열번호 4) | 5'-AGAAGACAGAGTTCACAGCA-3' | |
| NP3 | Forward (서열번호 5) | 5'-TGCTGTGAACTCTGTCTTCT-3' |
| Reverse (서열번호 6) | 5'-CTTCCTCATTGCGTAAGCCT-3' | |
| NP4 | Forward (서열번호 7) | 5'-CATCCAAAACACTATATGAGCC-3' |
| Reverse (서열번호 8) | 5'-TCTTCACCAGCTTGAGCCTG-3' | |
| NP5 | Forward (서열번호 9) | 5'-CGGTTTCCATTGCCCAGCT-3' |
| Reverse (서열번호 10) | 5'-ACACAAAGAACCCCCTTCAT-3' | |
| NP0 | Forward (서열번호 11) | 5'-ACACAAAGAACCCCCAAAAA-3' |
| Reverse (서열번호 12) | 5'-TTCCCTGATGCCTTGACGAT-3' | |
| one-step RT-PCR 반응 혼합물의 시약 조성 | 1 Reaction 당 용량 | |
| Detection Mix | PCR 프리믹스 (One-step RT-PCR 믹스) |
8 ㎕ |
| 탐지 용액(SFTS 진단용 프라이머 포함) | 7 ㎕ | |
| Sample | 환자 혈액에서 추출한 SFTSV RNA |
5 ㎕ |
| 전체 부피 | 20 ㎕ | |
| RT-PCR 반응 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 수 |
| Reverse-transcription | 45 ℃ | 30 분 | 1 |
| Inactivation/ Pre-denature |
90 ℃ | 10 분 | 1 |
| PCR | 95 ℃ | 15 초 | 45 |
| 48 ℃ | 30 초 |
실시예 2: 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트의 정확도 검증
중증열성혈소판감소증후군 진단 키트의 정확도를 검증하기 위하여, 국내 병원에 내원한 중증열성혈소판감소증후군 환자 27명의 혈액 및 혈청 (serum)으로부터 RNA를 추출하여, 이를 템플릿 (template)으로 하여 위 실시예 1에 기재된 방법에 따라 one-step PCR을 수행하였으며, 그 결과를 표 4에 정리하였다.
| 프라이머 세트 | 국내 병원 내원 SFTS 환자 중 RT-PCR 결과 양성으로 나온 검체수 | 국내 병원 내원 SFTS 환자 중 RT-PCR 결과 음성으로 나온 검체수 | SFTSV 매개 작은소참진드기 2마리에서 SFTSV RT-PCR 양성갯수 | |
| NP1 | Forward (서열번호 1) | 27/27 (100%) |
0/27 (0%) |
2/2 (100%) |
| Reverse (서열번호 2) | ||||
| NP2 | Forward (서열번호 3) | 27/27 (100%) |
0/27 (0%) |
2/2 (100%) |
| Reverse (서열번호 4) | ||||
| NP3 | Forward (서열번호 5) | 27/27 (100%) |
0/27 (0%) |
2/2 (100%) |
| Reverse (서열번호 6) | ||||
| NP4 | Forward (서열번호 7) | 23/27 (85.2%) |
4/27 (14.8%) |
1/2 (50%) |
| Reverse (서열번호 8) | ||||
| NP5 | Forward (서열번호 9) | 27/27 (100%) |
0/27 (0%) |
2/2 (100%) |
| Reverse (서열번호 10) | ||||
| NP0 | Forward (서열번호 11) | 19/27 (70.4%) |
8/27 (29.6%) |
1/2 (50%) |
| Reverse (서열번호 12) | ||||
표 4에서 보여지는 바와 같이, NP1 (서열번호 1 및 2의 프라이머쌍), NP2 (서열번호 3 및 4의 프라이머쌍), NP3 (서열번호 5 및 6의 프라이머쌍) 또는 NP5 (서열번호 9 및 10의 프라이머쌍)의 프라이머 세트가 사용된 경우, 국내 병원 내원 환자 27명 전체에 대해 양성 결과가 나왔고, 작은소참진드기 검체 2개 전체에 대해서도 양성 결과가 나와, 전체적으로 100%의 진단 정확도를 나타내었다. 이는 본 발명의 프라이머 세트 및 진단 키트가 중증열성혈소판감소증후군을 매우 높은 (100%) 정확도로 진단할 수 있음을 의미한다.
<110> LEE, Mee Young
<120> Primer set for detecting SFTS virus and kit for diagnosing SFTS
using the same
<130> 16P02004
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP1_Forward_Primer
<400> 1
atcgtcaagg catcagggaa 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP1_Reverse_Primer
<400> 2
ttcagccact tcacccgaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP2_Forward_Primer
<400> 3
catcattgtc tttgccctga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP2_Reverse_Primer
<400> 4
agaagacaga gttcacagca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP3_Forward_Primer
<400> 5
tgctgtgaac tctgtcttct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP3_Reverse_Primer
<400> 6
cttcctcatt gcgtaagcct 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP4_Forward_Primer
<400> 7
catccaaaac actatatgag cc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP4_Reverse_Primer
<400> 8
tcttcaccag cttgagcctg 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP5_Forward_Primer
<400> 9
cggtttccat tgcccagct 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP5_Reverse_Primer
<400> 10
acacaaagaa cccccttcat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP0_Forward_Primer
<400> 11
acacaaagaa cccccaaaaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP0_Reverse_Primer
<400> 12
ttccctgatg ccttgacgat 20
Claims (6)
- 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍을 포함하는 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트.
- 청구항 1에 있어서, 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍을 더 포함하는, 진단 키트.
- 청구항 1에 있어서, 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍을 더 포함하는, 진단 키트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 중증열성혈소판감소증후군은 SFTS 바이러스에 의한 것인, 진단 키트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 프라이머쌍은 검체 내의 SFTS 바이러스를 검출하는 것인, 진단 키트.
- 청구항 5에 있어서, 상기 검체는 진단 대상의 혈액 또는 작은소참진드기인, 진단 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160031411A KR101773057B1 (ko) | 2016-03-16 | 2016-03-16 | Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160031411A KR101773057B1 (ko) | 2016-03-16 | 2016-03-16 | Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101773057B1 true KR101773057B1 (ko) | 2017-08-30 |
Family
ID=59760496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160031411A Active KR101773057B1 (ko) | 2016-03-16 | 2016-03-16 | Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101773057B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014172661A1 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | The Regent Of The University Of California | Lone star virus |
-
2016
- 2016-03-16 KR KR1020160031411A patent/KR101773057B1/ko active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014172661A1 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | The Regent Of The University Of California | Lone star virus |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GenBank Accession No. AB817995.1* |
| GenBank Accession No. KF358693.1 |
| Journal of Clinical Microbiology Vol.52, No.9, pp.3325-3333, September 2014* |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Soliman et al. | Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS) | |
| Reid et al. | Diagnosis of foot-and-mouth disease by RT-PCR: evaluation of primers for serotypic characterisation of viral RNA in clinical samples | |
| CN102140543B (zh) | 鉴定发热伴出疹症候群传染病相关病毒病原体的多重实时定量pcr的引物、探针及检测方法 | |
| Ronish et al. | Design and verification of a highly reliable Linear-After-The-Exponential PCR (LATE-PCR) assay for the detection of African swine fever virus | |
| Upadhayay et al. | Epidemiology and diagnosis of foot-and-mouth disease: A review | |
| Jackwood et al. | Molecular studies on suspect very virulent infectious bursal disease virus genomic RNA samples | |
| CN105132590A (zh) | 一种牛传染性鼻气管炎病毒的lamp可视化检测方法 | |
| KR101786311B1 (ko) | Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 | |
| RU2703394C1 (ru) | Способ выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней | |
| KR101857684B1 (ko) | 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법 | |
| KR101773057B1 (ko) | Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 | |
| EP4001438B1 (en) | Composition for detecting leptospirosis and method of diagnosing leptospirosis using same | |
| KR20210073220A (ko) | 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| CN103789430B (zh) | 一种快速检测血液中附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的试剂盒及应用 | |
| RU2615465C2 (ru) | Диагностическая система для выявления днк провирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции | |
| RU2607025C1 (ru) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления РНК атипичного пестивируса крупного рогатого скота | |
| Chen et al. | Advances in the differential molecular diagnosis of vesicular disease pathogens in swine | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2700481C1 (ru) | Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| KR101764321B1 (ko) | 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 진단 키트 | |
| RU2689718C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя ротовирусной инфекции у сельскохозяйственных животных | |
| KR101540717B1 (ko) | 에볼라 및 마버그 바이러스 검출용 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 원 스텝 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 방법 | |
| RU2510851C1 (ru) | Тест-система для обнаружения рнк вируса блютанга методом от-пцр в режиме реального времени | |
| RU2694501C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2756474C1 (ru) | Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20160316 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20170112 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20170601 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20170824 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20170824 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20210824 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20220718 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20230824 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240826 Start annual number: 8 End annual number: 8 |