KR101763670B1

KR101763670B1 - 숙지황 분획물을 유효성분으로 포함하는 타박상 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101763670B1
Application number: KR1020150139554A
Authority: KR
Inventors: 조정희; 함성호; 김지혜; 정성은; 이무진; 최고우
Original assignee: 재단법인 전남생물산업진흥원; 한약진흥재단
Priority date: 2015-10-05
Filing date: 2015-10-05
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2035-10-05
Also published as: KR20170040819A

Abstract

본 발명은 숙지황 분획물을 유효성분으로 포함하는 타박상 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 숙지황 분획물은 간세포와 신장사구체 내피세포 내 HO-1 및 HO-2의 활성을 증가시키는 효능을 나타내므로, 타박상을 치료하기 위한 약학적 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

숙지황 분획물을 유효성분으로 포함하는 타박상 치료용 조성물{Pharmaceutical composition for treatment of contusion comprising Rehmanniae Radix preparata faction}

본 발명은 숙지황 분획물을 유효성분으로 포함하는 타박상 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 간세포와 신장사구체 내피세포 내 헴옥시게나아제-1 및 헴옥시게나아제-2의 발현을 촉진시키는 효능을 가지는 숙지황 분획물을 유효성분으로 포함하는 타박상을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

타박상(contusion)은 외부의 충격이나 둔탁한 힘(구타, 넘어짐) 등에 의해 연부 조직과 근육 등에 손상을 입어 피하출혈(멍)과 부종이 생기는 질병으로서, 한방에서는 어혈이라고도 한다. 타박상의 경우 내부의 출혈은 반드시 나타나며, 인대 또는 근육의 염증, 부종이 순차적으로 발생하게 되는데, 일단 시간이 지나면 염증과 부종은 줄어들어 점차 회복되지만, 출혈로 인한 어혈은 근육 내에 남아있게 되는 경우가 많다. 이러한 어혈은 오래되면 혈액의 순환을 방해하여 담으로 변하게 되고, 어혈과 담이 근육 내에 남아 있게 되면 통증과 함께 혈액의 괴사로 인한 2차적 염증 질환이 발생하게 된다.

이러한 타박상의 치료에 있어서 약침요법, 순환치료법 등을 이용하여 어혈을 풀어주는 동시에 염증을 예방하고, 혈관확장에 의한 혈액순환 촉진 등과 같은 물리치료 요법이 중요하다. 그러나, 바쁜 현대사회에서 물리치료를 계속해서 실천해 가는 것은 결코 용이하지 않으며, 어혈을 풀어주는 치료를 받았다 하더라도 이는 어혈에 의한 통증과 염증을 약 80% 정도 완화하는 것일 뿐이므로 완치 효과를 보려면 어혈과 염증이 아예 생기지 않도록 혈액 순환을 원활히 하는 근본적인 치료가 이루어져야 한다.

한편, 헴옥시게나아제(heme oxygenase, HO)는 철(Fe)원자를 포함하는 포르피린고리(porphyrin ring)로 구성되어 있는 헴(heme)에 산소분자가 관여하는 산화반응을 촉매하는 효소로, 하기 반응식 1과 같이 헴옥시게나아제(HO)가 헤모글로빈을 분해하여 빌리베르딘(biliverdin)과 철(Fe) 및 일산화탄소(CO)를 만들어낸다(Noguchi et al., 1983, J. Biochem., 93(4):1027-1036.; Yoshida et al., 1980, J. Biol. Chem., 255(10):4418-4420.).

[반응식 1]

Heme b + 3O₂ + 3½NADPH + 3½H⁺ → biliberdin + Fe² ⁺ + CO + 3½NADP⁺ + 3H₂O

상기와 같은 반응은 붉은 색의 헴이 녹색의 빌리베르딘을 거쳐 황색의 빌리루빈으로 전환되면서 천천히 소실하게 하며, 그 결과 멍(어혈)이 생기는 것이다. 정상상태에서 HO의 활성이 가장 큰 곳은 비장이며, 여기에서 오래된 적혈구가 포집되어 파괴된다.

헴옥시게나아제(heme oxygenase, HO)는 헴옥시게나아제-1(heme oxygenase-1, HO-1)과 헴옥시게나아제-2(heme oxygenase-2, HO-2)의 2가지 형태로 존재한다. 상기 헴옥시게나아제-1(heme oxygenase-1, HO-1)은 산화적 스트레스, 저산소증, 중금속 등에 의한 반응으로 유도되어 세포의 보호효과가 뛰어나며, 특히 출혈에 의한 헤모글로빈 수치 감소 또는 피부에 멍이 들었을 때 헴을 신속하게 제거함으로써 각종 염증 또는 산화적 자극에 대한 항산화적 세포보호효과를 발휘한다(Maines et al., 1977, J. Exp. Med., 145(4):1054-1059.; Agarwal et al., 2013, Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc., 124:111-122.). 상기 헴옥시게나아제-2(heme oxygenase-2, HO-2)는 정상적인 항상성을 유지하기 위해 항상 존재하는 효소로서, 조혈기능에 영향을 미친다.

이와 관련하여 HO-1 및 HO-2에 대한 연구로, 팔물탕은 LPS로 자극한 마크로파지(macrophage)에서 HO-1의 발현을 유도함으로써 항염 효과를 발휘한다고 알려져 있고, HO-1은 간의 산화적 조직손상을 보호하며, HO-1의 결핍은 비장에서 적혈모구(erythroblast)의 CD49d 수위를 저하시켜 산화적 적혈구 생성(oxidative erythropoiesis)에 저항력을 약하게 만든다고 알려져 있다(Oh et al., 2014, Int. J. Mol. Sci., 15(5):8443-8457.; Origassa et al., 2013, World J. Hepatol., 5(10):541-549.; Agarwal et al., 2013, Trans. Am. Clin. Clinatol. Asssoc., 124:111-122.; Cao et al., 2011, PLoS One., 6(5):e20634.). 또한, 아미산염(arsenite)은 HO-1을 불활성화 하는 반면, 비타민 C(Vit-C)는 HO-1을 유도한다고 알려졌고, HO-1의 유도는 심장에서도 항산화적 보호효과를 발휘하며, 캡사이신(capsaicin)은 HO-1의 유도를 통해 시스플라틴(cisplatin)에 의한 신장독성으로부터 보호하며, 뇌출혈과 같은 뇌손상에서도 뇌세포를 보호한다고 알려졌다(Reichard et al., 2008, J. Bio. Chem., 283(33):22363-22370.; Zhao et al., 2014, PLoS One., 9(6):e99134.; Issan et al., 2014, PLoS One., 9(3):e92246.; Jung et al., 2014, Mol. Cells., 37(3):234-240.; Wang et al., 2007, Brain., 130(Pt6):1643-1652.).

또한, HO-2는 항응고제인 메나디온(menadion)에 의해 선택적으로 활성이 강해진다고 보고되었고, HO-1과 같이 헴 대사과정에서 발생하는 일산화탄소(CO)는 산화질소합성효소(NO synthetase)를 유도하여 혈관확장 기능을 발휘하며, HO-2가 결핍되면 철분이 축적되어 독성이 나타나고, 네프론에서 염증에 의해 HO-2가 유리되면 그 대사물인 빌리베르딘과 일산화탄소(CO)는 신세뇨관의 피드백(Tubuloglomerular feedback)을 억제하여 영양성분의 재흡수가 억제되어 영양결핍 및 다뇨 증상을 나타낼 수 있으며, 저산소증(hypoxia) 상태에서 혈관내피세포의 생존율을 증가시킨다고 알려졌다(Wang et al., 2007, Brain., 130(Pt6):1643-1652.; Vukomanovic et al., 2014, Mod. Gas. Res., 4(1):4.; Zakhary et al., 1996, Prox. Natl. Acad. Sci., 93:795-798.; Leffler et al., 2011: Am. J. Physiol. Heart Cric. Physiol., 301(1):H1-H11.; Dennery et al., 1998, J. Clin. Invest., 101(5):1001-1011.; Hong et al., 2011, Am. J. Physiol. Heart Cric Physiol., 300(4):H1320-H1326.; He et al., 2010, J. Biol. Chem., 285(13):9452-9461.). 따라서, HO-1의 발현 유도는 항산화적 보호효과를 통해 출혈과 관련된 모든 염증의 악화를 예방할 수 있으며, H0-2의 발현 유도는 항상성 및 혈관확장 효과를 통해 타박상 등으로 생긴 어혈을 풀어줄 수 있다.

그러나, 종래 HO-1 또는 HO-2의 발현을 유도하는 물질은 대부분 화학물질로서 장기간 사용시 골다공증, 동맥경화, 발암 가능성 및 내성으로 인한 증상 악화 등의 문제가 있다. 따라서 천연물로부터 유래하여 부작용이 적어 안전하면서 HO-1 및 HO-2의 발현을 촉진하여 어혈 및 출혈에 의한 염증을 개선 또는 예방함으로써 타박상을 치료할 수 있는 조성물의 개발이 절실히 요망되고 있다.

따라서 본 발명자들은 천연소재로부터 타박상을 치료하기 위한 조성물을 개발하고자 노력하던 중, 숙지황 분획물이 HO-1 및 HO-2의 발현을 촉진시킴으로써 타박상을 치료하는 용도로 사용할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 숙지황 분획물을 유효성분으로 포함하는 타박상 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 숙지황 분획물을 유효성분으로 포함하는 타박상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "타박상 치료"는 외부의 충격이나 둔탁한 힘(구타, 넘어짐) 등에 의한 연부 조직과 근육 등의 손상으로 발생하는 어혈을 풀어주고, 피하출혈에 의한 염증을 예방 및 개선하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 숙지황(Rehmanniae Radix preparata)은 지황(地黃, Rehmannia glutonosa Liboschitz)의 뿌리를 황주, 백주 또는 사인주로 찐 후 말린 것을 포제 가공한 것으로, 혈류를 좋게 하여 허혈을 해소함으로써 사지냉증을 해소하고 동시에 혈류가 상대적으로 어려운 하초의 기운을 보충하여 신양부족, 요슬산연, 도한유정에 효과가 있고, 뼈의 골수를 보하여 각종 면역세포와 혈액세포의 증식 및 골수세포를 활성화하여 빈혈을 해소하며 세포성 면역을 증강하여 강건하게 하는 효능이 있다고 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서와 같이 숙지황 분획물의 HO-1 및 HO-2의 발현 촉진에 의한 타박상 치료 효능에 대한 연구는 거의 전무한 실정이다.

본 발명에 있어서, 상기 숙지황 분획물은 열수 추출법을 이용하여 숙지황에서 추출된 추출액을 여과한 다음, C₁ 내지 C₄ 저급알콜 용액으로 분획하여 수득된 것으로, 간세포 및 신장사구체 내피세포 내 HO-1 및 HO-2의 활성을 증가시키는 효능을 나타내는 물질을 말한다.

상기 C₁ 내지 C₄ 저급알콜 용액은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 보다 바람직하게는 50% 내지 70% 에탄올, 보다 더 바람직하게는 60% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

하나의 구체적 실시예로서, 본 발명의 숙지황 분획물은 숙지황을 숙지황 총 중량의 10배의 물에 습윤시킨 다음, 95 내지 100℃에서 2 내지 4시간 동안 가열한 후 여과한 다음, 상기 여과액을 30 내지 99.5% 에탄올로 유출시켜 분획하여 수득할 수 있다.

상기 수득된 숙지황 분획물 중 60% 에탄올로 유출시켜 수득된 숙지황 분획물은 간세포 및 신장사구체 내피세포 내 HO-1의 발현을 약 1.6 내지 3배 증가시키며, HO-2의 발현을 약 1.4 내지 3.2배 증가시키는 효능이 있음이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 숙지황 분획물은 타박상을 치료하기 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 숙지황 분획물을 전체 조성물 중량 대비 0.00001 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 숙지황 분획물의 중량이 0.00001 중량% 미만인 경우에는 HO-1 및 HO-2 발현 촉진 효능이 미약하고, 30 중량%를 초과하는 경우에는 그 이하의 숙지황 분획물에 비해 HO-1 및 HO-2의 발현을 촉진시키는 효능의 증가가 미비하고 제형상의 안전성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 약학적 조성물에는 유효성분으로서 숙지황 분획물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 이때, 비경구 경로로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 도포에 의한 국부 투여(topical application)가 가장 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중) 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제로 사용될 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 외용제제에는 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 숙지황 분획물은 천연소재인 숙지황으로부터 분획된 것으로 인체에 무해하며 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있어 상기한 바와 같은 약학적 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

본 발명에서 유효성분으로 이용되는 숙지황 분획물은 간세포와 신장사구체 내피세포 내 HO-1 및 HO-2의 활성을 증가시키는 효능을 나타내므로, 타박상을 치료하기 위한 약학적 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 (A) 표준품(5-HMF), (B) 숙지황 추출물, (C) Fr-1(물 분획물), (D) Fr-2(30% EtOH 분획물), (E) Fr-3(60% EtOH 분획물), (F) Fr-4(99.5% EtOH 분획물)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 숙지황 분획물인 Fr-1(물 분획물), Fr-2(30% EtOH 분획물), Fr-3(60% EtOH 분획물), Fr-4(99.5% EtOH 분획물)와 5-HMF를 농도별로 처리한 인간 간세포(HH)와 인간 신장사구체 내피세포(HRGEC) 내 HO-1의 활성도를 측정한 그래프이다.
도 3은 숙지황 분획물인 Fr-3(60% EtOH 분획물) 및/또는 헤민(hemin)을 처리한 인간 간세포(HH)와 인간 신장사구체 내피세포(HRGEC) 내 HO-1의 활성도를 측정한 그래프이다.
도 4는 숙지황 분획물인 Fr-1(물 분획물), Fr-2(30% EtOH 분획물), Fr-3(60% EtOH 분획물), Fr-4(99.5% EtOH 분획물)와 5-HMF를 농도별로 처리한 인간 간세포(HH)와 인간 신장사구체 내피세포(HRGEC) 내 HO-2의 활성도를 측정한 그래프이다.
도 5는 숙지황 분획물인 Fr-3(60% EtOH 분획물) 및/또는 헤민(hemin)을 처리한 인간 간세포(HH)와 인간 신장사구체 내피세포(HRGEC) 내 HO-2의 활성도를 측정한 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 시료의 제조 및 성분 분석

1-1. 숙지황 추출물 또는 숙지황 분획물의 제조

숙지황 추출물은 숙지황 1kg과 물 10L를 추출기에 넣고, 이를 95~100℃로 3시간 추출하여 여과한 다음, 건조시켜 제조하였다.

숙지황 분획물은 숙지황 1kg과 물 10L를 추출기에 넣고, 이를 95~100℃로 3시간 추출하여 여과한 다음, 상기 여과한 추출액 100ml을 HP 20이 500g으로 충전된 컬럼에 넣고 물 3L(Fr-1), 30% 에탄올 3L(Fr-2), 60% 에탄올 3L(Fr-3) 또는 99.5% 에탄올 3L(Fr-4)로 유출시켜 제조하였다. 이때, 분획용매에 따른 수득율은 각각 54.7%(Fr-1), 18,8%(Fr-2), 12.5%(Fr-3), 14.1%(Fr-4)이였다.

1-2. 숙지황 분획물의 성분 분석

상기 1-1에서 제조한 숙지황 추출물, 숙지황 분획물인 Fr-1(물 분획물), Fr-2(30% 에탄올 분획물), Fr-3(60% 에탄올 분획물) 또는 Fr-4(99.5% 에탄올 분획물)을 감압농축한 다음 각 분획물을 메탄올 10 mL에 녹인 후 검액으로 사용하였다. 또한, 5-HMF(5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde)을 메탄올 10 mL에 녹여 표준액으로 사용하였다.

그 다음 상기 검액 및 표준액 10 uL씩을 입자크기가 5μm인 액체크로마토그래프(liquid chromatograph)용 옥타데실실리카겔(octadecylsilica gel)에 충전한 후 HPLC(high performance liquid chromatography)로 5-HMF 성분을 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보듯이, 각 분획물에 함유된 5-HMF 함량을 정량한 결과, 물 분획물인 Fr-1에는 0.2mg/g, 30% 에탄올 분획물인 Fr-2에는 1.1mg/g, 60% 에탄올 분획물인 Fr-3에는 56.5mg/g, 99.5% 에탄올 분획물인 Fr-4에는 5.0mg/g의 5-HMF가 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 세포실험

2-1. 실험물질 준비

상기 실시예 1-1에서 제조한 숙지황 물 분획물(Fr-1), 30% 에탄올 분획물(Fr-2), 60% 에탄올 분획물(Fr-3) 또는 99.5% 에탄올 분획물(Fr-4)을 에탄올에 녹여 농도가 각각 1mg/ml이 되도록 만들고, 이를 배지로 희석하여 100, 10, 1, 0.1 ug/ml이 되게 만들었다. 그 다음, 이를 세포액에 10배 희석되도록 가하여 세포에 노출할 최종 농도가 각각 0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ug/ml이 되도록 제조하여 준비하였다.

2-2. 세포 배양

실험대상인 HH 인간 간세포(ScienCell Research Laboratories, USA)는 5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 간세포 생장 인자(hepatocyte growth supplement; HGS, Cat. No. 5252) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(penicillin/streptomycin solution; P/S, Cat. No. 0503)을 함유하는 간세포 배지(Hepatocyte medium; ScienCell Research Laboratories, USA) 500ml에 37℃의 온도, 5% CO₂의 가습된 조건에서 배양하여 준비하였다.

또한, HRGEC 인간 신장사구체 내피세포(ScienCell Research Laboratories, USA)는 5% 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 내피세포 생장 인자(endothelial growth supplement; ECGS, Cat. No. 1052)와 1% penicillin/streptomycin solution (P/S, Cat. No. 0503)을 함유하는 내피세포 배지(endothelial Cell Medium; ScienCell Research Laboratories, USA) 500ml에 37 ℃의 온도, 5% CO₂의 가습된 조건에서 배양하여 준비하였다.

2-3. HO-1 및 HO-2 활성 측정

상기 2-2에서 준비한 HH 인간 간세포와 HRGEC 인간 신장사구체 내피세포를 12-웰 플레이트에 접종(1×10⁶cell/well)하고, 5% CO₂ ,37 ℃에서 16시간 배양하였다.

첫 번째 실험은 상기 배양한 간세포와 내피세포에 상기 2-1에서 준비한 숙지황 물 분획물(Fr-1), 30% 에탄올 분획물(Fr-2), 60% 에탄올 분획물(Fr-3), 99.5% 에탄올 분획물(Fr-4) 또는 5-HMF를 각각 0.01, 0.1, 1, 10 ug/ml 농도가 되도록 처리한 다음 24시간 배양하였다.

또한, 두 번째 실험은 상기 간세포 및 내피세포를 두 가지 그룹으로 나누고 한 그룹에는 헤민(hemin)을 1 uM 농도로 처리하고 나머지 한 그룹에는 아무것도 처리하지 않고 2시간 배양한 후, 두 그룹에 0.1, 1, 10 ug/ml 농도의 60% 에탄올 분획물(Fr-3)을 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 상기 2-2에서 준비한 HH 인간 간세포와 HRGEC 인간 신장사구체 내피세포를 사용하였다.

먼저, HO-1 활성도는 상기 첫 번째, 두 번째 실험의 배양액을 각 웰로부터 수집하고, HO-1 분석 키트(Heme oxygenase-1 ELISA kit, MyBioSource, USA)를 사용하여 HO-1의 활성도를 측정하였다.

HO-2 활성도는 상기 첫 번째, 두 번째 실험의 배양액을 각 웰로부터 수집하고, HO-2 분석 키트(Heme oxygenase-2 ELISA kit, MyBioSource, USA)를 사용하여 HO-2의 활성도를 측정하였다. 그 결과를 표 1 및 도 2 내지 5에 나타내었다.

농도 (ug/ml)	HO-1		HO-2
농도 (ug/ml)	HH	HRGEC	HH	HRGEC
대조군	52.66±7.85	66.55±2.23	49.20±2.89	54.30±1.84
5-HMF(0.01)	98.05±8.72	100.43±2.89	69.06±11.85	75.66±5.65
5-HMF(0.1)	108.32±9.50	113.67±13.02	84.73±8.39	87.82±7.51
5-HMF(1.0)	124.96±7.85	125.10±16.96	107.93±6.68	102.90±0.62
5-HMF(10)	141.54±6.98	151.72±18.46	122.54±0.46	134.36±0.01
Fr-3(0.01)	99.47±1.07	105.99±0.24	70.97±1.95	93.48±7.93
Fr-3(0.1)	133.11±3.27	122.20±1.10	85.44±0.30	111.16±3.18
Fr-3(1.0)	142.87±7.31	147.42±2.16	104.59±6.88	142.94±1.13
Fr-3(10)	180.94±5.43	175.77±8.66	142.67±7.78	164.93±0.11

표 1 및 도 2 내지 도 5에서 보듯이, 숙지황 분획물 중 숙지황 60% 에탄올 분획물(Fr-3)을 처리한 간세포(HH) 및 신장사구체 내피세포(HRGEC)는 다른 분획물을 처리한 간세포(HH) 및 신장사구체 내피세포(HRGEC)에 비해 월등히 많은 HO-1 및 HO-2를 발현하는 것이 확인되었고, 60% 에탄올 분획물(Fr-3)을 농도별로 처리했을 때 농도가 증가할수록 HO-1 및 HO-2의 발현이 농도 의존적으로 증가하였으며, 특히, 헤민(hemin)을 처리한 간세포(HH) 및 신장사구체 내피세포(HRGEC)에서 HO-1 및 HO-2의 발현량이 더욱 증가되었음을 확인할 수 있었다.

반면, 숙지황 물 분획물(Fr-1), 숙지황 30% 분획물(Fr-2) 또는 숙지황 99.5% 분획물(Fr-4)를 처리한 간세포(HH) 및 신장사구체 내피세포(HRGEC)는 숙지황 분획물을 처리하지 않은 대조군과 유사한 HO-1 및 HO-2를 발현하였으며, 농도가 증가하더라도 H0-1 및 H0-2의 발현량이 증가하지 않음을 확인할 수 있었다.

Claims

숙지황을 열수 추출한 후 여과한 다음, C₁ 내지 C₄ 저급알콜 용액을 용매로 사용하여 분획하여 수득된 것을 특징으로 하는 숙지황 분획물을 유효성분으로 포함하는 타박상 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 C₁ 내지 C₄ 저급알콜 용액이 50%(v/v) 내지 70%(v/v) 에탄올 용액인 것을 특징으로 하는 타박상 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 숙지황 분획물이 햄옥시게나제-1(heme oxygenase-1, HO-1) 및 헴옥시게나아제-2(heme oxygenase-2, HO-2)의 단백질 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 타박상 치료용 약학적 조성물.