각각 침팬지 배설물로부터 분리된 유인원 아데노바이러스 28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35로부터의 신규 핵산 및 아미노산 서열이 제공된다. 또한 재조합 단백질 또는 단편 또는 다른 시약의 시험관 내 생성에서 사용을 위한 이들 벡터를 생성하기 위한 신규 아데노바이러스 벡터 및 팩키징 셀 라인이 제공된다. 더 나아가 치료적 또는 백신 목적을 위한 이종성 분자를 전달하는데 사용을 위한 조성물이 제공된다. 이러한 치료적 또는 백신 조성물은 삽입된 이종성 분자를 전달하는 아데노바이러스 벡터를 함유한다. 게다가, 신규의 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35 서열은 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터의 생성을 위해 필요로 되는 필수적인 헬퍼 기능을 제공하는데 유용하다. 따라서, 이러한 생성 방법에서 이들 서열을 사용하는 헬퍼 구조체, 방법 및 셀 라인이 제공된다.
핵산 또는 그것의 단편을 말할 때, 용어 "실질적인 상동성" 또는 "실질적인 유사성"은, 다른 핵산(또는 그것의 상보적 가닥)과 함께 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실에 의해 최상으로 배열될 때, 배열된 서열의 적어도 약 95 내지 99%로 뉴클레오티드 서열 동일성이 있음을 나타낸다.
아미노산 또는 그것의 단편을 말할 때, 용어 "실질적인 상동성" 또는 "실질적인 유사성"은, 다른 아미노산(또는 그것의 상보적 가닥)과 함께 적절한 아미노산 삽입 또는 결실에 의해 최상으로 배열될 때, 배열된 서열의 적어도 약 95 내지 99%로 아미노산 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 상동성은 길이에 있어서 적어도 8개의 아미노산, 또는 더 바람직하게는 적어도 15개의 아미노산인 전장 서열, 또는 그것의 단백질, 또는 그것의 단편에 있다. 적절한 단편의 예는 본원에서 기술된다.
핵산 서열에 있어서 용어 "백분율 서열 동일성" 또는 "동일한"은 최대 대응에 대해 배열될 때 동일한 두 서열의 잔기를 말한다. 한 서열과 다른 서열을 배열하는데 갭이 필요로 될 때, 스코어링의 정도는 갭에 대한 불이익 없이 더 긴 서열에 대해 계산된다. 폴리뉴클레오티드 또는 암호화된 폴리펩티드의 기능성을 보존하는 서열은 이에 의해 더욱 밀접하게 동일하다. 서열 길이 동일성 비교는 게놈의 전장(예를 들어, 약 36 kbp), 유전자, 단백질, 서브유닛, 또는 효소의 오픈리딩프레임의 전장[예를 들어, 아데노바이러스 코딩 영역을 제공하는 표]에 걸쳐 있을 수 있고, 또는 적어도 약 500 내지 5000개의 뉴클레오티드의 단편이 요망된다. 그러나, 예를 들어, 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 보통 적어도 약 20 내지 24개의 뉴클레오티드, 적어도 약 28 내지 32개의 뉴클레오티드, 적어도 약 36개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 가지는 더 작은 단편들 사이의 동일성이 또한 요망될 수 있다. 유사하게, "백분율 서열 동일성"은 단백질, 또는 그것의 단편의 전장에 걸쳐서 아미노산 서열에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적절하게, 단편은 길이에 있어서 적어도 8개의 아미노산이며, 약 700개 까지의 아미노산이 있을 수 있다. 적절한 단편의 예는 본원에서 기술된다.
동일성은 디폴트 세팅에서 정의되는 바와 같은 이러한 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 용이하게 결정된다. 바람직하게는, 이러한 동일성은 단백질, 효소, 서브유닛의 전장에 걸쳐, 또는 길이에 있어서 적어도 약 8개의 단편에 걸쳐서 있다. 그러나, 동일성은 더 짧은 영역에 기초할 수 있으며, 동일성 유전자 생성물이 배치되는 사용에 적합하다.
본원에서 기술되는 바와 같은, 배열은 인터넷의 웹 서버를 통해 접근가능한 "Clustal W"와 같은 다양한 일반 공중에게 또는 상업적으로 이용가능한 Multiple Sequence Alignment 프로그램을 사용하여 수행된다. 또 다르게는, 벡터 NTI® 유틸리티[InVitrogen]가 또한 사용된다. 상기 기술된 프로그램에 함유된 것들을 포함하는 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 알고리즘이 있다. 다른 예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 Fasta, GCG Version 6.1의 프로그램을 사용하여 비교될 수 있다. Fasta는 질의와 검색 서열 사이의 최상의 중첩 영역의 배열 및 백분율 서열 동일성을 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 사이의 백분율 서열 동일성은 참고로써 본원에 포함되는 GCG Version 6.1에서 제공되는 바와 같은 Fasta와 그것의 디폴트 매개변수(워드 크기 6 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)를 사용하여 결정될 수 있다. 유사하게 프로그램은 아미노산 배열을 수행하기 위해 이용가능하다. 일반적으로, 당업자가 필요하다면 이들 세팅을 변경할 수 있지만, 이들 프로그램은 디폴트 세팅에서 사용된다. 또 다르게는, 당업자는 기준 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 동일성 또는 배열의 최소한의 수준을 제공하는 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 사용되는 "재조합"은, 폴리뉴클레오티드가 클로닝, 제한 또는 연결 단계, 및 천연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드와 별개인 구조체를 초래하는 다른 과정의 다양한 조합의 생성물이라는 것을 의미한다. 재조합 바이러스는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자이다. 용어는 각각 본래의 폴리뉴클레오티드 구조체의 복제물 및 본래의 바이러스 구조체의 자손을 포함한다.
"이종성"은 비교되는 독립체의 나머지로부터 유전자형으로 완전한 독립체에서 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드에 유전공학 기술에 의해 도입된 폴리뉴클레오티드 또는 다른 종으로부터 유래된 벡터는 이종성 폴리뉴클레오티드이다. 원래의 코딩 서열로부터 제거되고 천연에서는 연결된 것으로 발견되지 않는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종성 프로모터이다. 바이러스 또는 바이러스 벡터의 게놈으로 클로닝된 자리-특이적 재조합 자리(바이러스의 게놈은 천연에서는 그것을 함유하지 않는다)는 이종성 재조합 자리이다. 재조합 효소에 대한 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 재조합효소를 정상적으로 발현하지 않는 세포를 유전적으로 변경하기 위해 사용될 때, 폴리뉴클레오티드와 재조합효소는 둘 다 세포에 이종성이다.
본 명세서 및 청구항을 통해 사용되는, 용어 "포함하다" 및 그것의 변형인 "포함하는"은 다른 성분, 요소, 완전체, 단계 등에 포괄적이다. 용어 "구성된다" 또는 "구성되는"은 다른 성분, 구성요소, 정수, 단계 등에 배타적이다.
I. 유인원 아데노바이러스 서열
본 발명은 각각이 천연에서 연관된 다른 물질로부터 분리된 유인원 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 제공한다. 이들 아데노바이러스 각각은 인간 아군 B로서 동일한 아군에 있는 것으로 결정되었다.
A. 핵산 서열
본원에서 제공되는 SAdV-28 핵산 서열은 SEQ 1D NO: 1의 뉴클레오티드 1 내지 35610을 포함한다. 본원에서 제공되는 SAdV-27 핵산 서열은 SEQ ID NO: 39의 뉴클레오티드 1 내지 35592를 포함한다. 본원에 제공되는 SAdV-29 핵산 서열은 SEQ ID NO: 71의 뉴클레오티드 1 내지 35646을 포함한다. SAdV-32 핵산 서열은 SEQ ID NO: 103의 뉴클레오티드 1 내지 35588을 포함한다. 본원에 제공되는 SAdV-33 핵산 서열은 SEQ ID NO: 134의 뉴클레오티드 1 내지 35694를 포함한다. 본원에 제공되는 SAdV-35 핵산 서열은 헥손 단백질의 뉴클레오티드 1 내지 35606을 포함한다.
본원에 참고로써 포함되는 서열목록을 참조. 한 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1, 29, 71, 103, 134, 및 166의 서열에 상보적인 가닥뿐만 아니라 하기 서열의 서열의 대응하는 RNA 및 cDNA 서열 및 그것의 상보적 가닥을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 서열은 서열목록과 98.5% 이상 동일한, 바람직하게는 약 99% 동일한 서열을 더 포함한다. 또한 한 구체예에서, SEQ ID NO: 1, 29, 71, 103, 134, 및 166 및 그것의 상보적 가닥에서 제공된 서열의 천연 변이체 및 공학적 변형이 포함된다. 이러한 변형은, 예를 들어, 당업계에 알려진 표지, 메틸화, 및 하나 이상의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 축퇴 뉴클레오티드로의 치환을 포함한다.
[표 1]
한 구체예에서, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35의 서열의 단편, 및 그것의 상보적 가닥, 그것에 상보적인 cDNA 및 RNA가 제공된다. 적당한 단편은 길이에 있어 적어도 15개의 뉴클레오티드이며, 기능적 단편, 즉, 생물학적 관심이 있는 단편을 포함한다. 예를 들어, 기능적 단편은 요망되는 아데노바이러스 생성물을 발현시킬 수 있고 또는 재조합 바이러스 벡터의 생성에 유용할 수 있다. 이러한 단편은 유전자 서열 및 본원의 표에 열거되는 단편을 포함한다. 표는 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35 서열의 전사체 영역 및 오픈리딩 프레임을 제공한다. 특정 유전자에 대해, 전사체 및 오픈리딩프레임(ORF)은 SEQ ID NO: 1, 29, 71, 103, 134, 및 166에서 존재하는 상보적인 가닥에 위치된다. 예를 들어, E2b, E4 및 E2a 참조. 암호화된 단백질의 계산된 분자량이 또한 나타난다. SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35의 E1a 오픈리딩프레임 및 E2b 오픈리딩프레임은 내부 스플라이스 자리를 함유한다는 것에 주의한다. 이들 스플라이스 자리는 상기 표에서 기록된다.
SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 아데노바이러스 핵산 서열은 치료제로서 및 다양한 벡터 시스템 및 숙주 세포의 구성에서 유용하다. 본원에서 사용되는, 벡터는 네이키드 DNA, 플라스미드, 바이러스, 코스미드 또는 에피솜을 포함하는 어떤 적당한 핵산 분자를 포함한다. 이들 서열 및 생성물은 단독으로 또는 다른 아데노바이러스 서열 또는 분획과 조합하여, 또는 다른 아데노바이러스 또는 비-아데노바이러스 서열로부터의 요소와 조합하여 사용될 수 있다. SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 서열은 안티센스 전달 벡터, 유전자 치료 벡터, 또는 백신 벡터로서 유용하다. 따라서, 추가로 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 서열을 함유하는 핵산 분자, 유전자 전달 벡터, 및 숙주 세포가 제공된다.
예를 들어, 본 발명은 본 발명의 유인원 Ad ITR 서열을 함유하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 예에서, 본 발명은 원하는 Ad 유전자 생성물을 암호화하는 본 발명의 유인원 Ad 서열을 함유하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 서열을 사용하여 구성되는 또 다른 핵산 분자는 본원에 제공되는 정보의 관점에서 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
한 구체예에서, 본원에서 확인되는 유인원 Ad 유전자 영역은 세포에 이종성 분자의 전달을 위한 다양한 벡터에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 패키징 숙주 세포에서 바이러스 벡터를 발생시키는 목적을 위해 아데노바이러스 캡시드 단백질(또는 그것의 단편)의 발현에 대해 발생된다. 이러한 벡터는 트랜스 발현을 위해 설계될 수 있다. 또 다르게는, 이러한 벡터는 원하는 아데노바이러스 기능을 발현시키는 서열, 예를 들어, 하나 이상의 E1a, E1b, 말단 반복 서열, E2a, E2b, E4, E4ORF6 영역을 안정하게 함유하는 세포를 제공하기 위해 설계된다.
게다가, 아데노바이러스 유전자 서열 및 그것의 단편은 헬퍼-의존 바이러스(예를 들어, 필수 기능이 결핍된 아데노바이러스 벡터, 또는 아데노-관련 바이러스(AAV))의 생성에 필요한 헬퍼 기능을 제공하는데 유용하다. 이러한 생성 방법에 대해, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35 서열은 인간 Ad에 기술된 것과 유사한 방법인 그러한 방법으로 이용될 수 있다. 그러나, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35 사이의 서열, 서열과 인간 Ad의 그것들의 차이점 때문에, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35 서열의 사용은 rAAV 생성 동안 감염성 아데노바이러스 오염물질을 생성할 수 있는 인간 Ad E1 기능을 전달하는 숙주 세포, 예를 들어, 293 세포에서 헬퍼 기능을 가지는 상동 재조합의 가능성을 크게 최소화하거나 제거한다.
아데노바이러스 헬퍼 기능을 사용하는 rAAV를 생성하는 방법은 인간 아데노바이러스 항원형과 함께 문헌에서 길이로 기술되었다. 예를 들어, 미국 특허 6,258,595 및 그것에 인용된 참고문헌을 참조. 또한, 미국 특허 5,871,982; WO 99/14354; WO 99/15685; WO 99/47691 참조. 이들 방법은 또한 비-인간 영장류 AAV 항원형을 포함하는 비-인간 항원형 AAV의 생성에 사용될 수 있다. 필요한 헬퍼 기능(예를 들어, E1a, E1b, E2a 및/또는 E4ORF6)을 제공하는 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및 SAdV-35 서열은 필요한 아데노바이러스 기능을 제공하는데 특히 유용할 수 있는 한편, 어떤 다른 아데노바이러스와 재조합의 가능성을 최소화 또는 제거하는 것은 전형적으로 인간 기원의 rAAV-패키징 세포에서 존재한다. 따라서, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35의 선택된 유전자 또는 오픈리딩프레임은 이들 rAAV 생성 방법에 사용될 수 있다.
또 다르게는, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35의 서열을 기초로 한 재조합 벡터는 이들 방법에 사용될 수 있다. 이러한 재조합 아데노바이러스 유인원 벡터는, 그것의 발현을 제어하는 조절 서열의 제어하에서 예를 들어, 침팬지 Ad 서열이 예를 들어, AAV 3' 및/또는 5' ITRs 및 이식 유전자로 구성되는 rAAV 발현 카세트 옆에 배치되는 하이브리드 침팬지 Ad/AAV를 포함할 수 있다. 당업자는 또 다른 유인원 아데노바이러스 벡터 및/또는 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 유전자 서열이 아데노바이러스 헬퍼에 의존하여 rAAV 및 다른 바이러스의 생성에 유용할 것임을 인식할 것이다.
또 다른 구체예에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서 선택된 아데노바이러스 유전자 생성물의 전달 및 발현을 위해 설계되어 원하는 생리적 효과를 이룬다. 예를 들어, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 E1a 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 핵산 분자는 암 치료제로서 사용을 위해 피험자에게 전달될 수 있다. 선택적으로, 이러한 분자는 지질-계 담체에서 제형화되고, 바람직하게는 암세포를 표적화한다. 이러한 제형은 다른 암 치료제(예를 들어, 시스플라틴, 탁솔 등)와 조합될 수 있다. 본원에 제공되는 아데노바이러스 서열에 대한 또 다른 사용은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
게다가, 당업자는 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 서열이 치료 및 면역 분자의 시험관 내, 생체 밖 또는 생체 내 전달을 위해 다양한 바이러스 및 비-바이러스 벡터 시스템에 대한 사용에 용이하게 적용될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 유인원 Ad 서열은 다양한 rAd 및 비-rAd 벡터 시스템에 이용될 수 있다. 이러한 벡터 시스템은, 예를 들어, 플라스미드, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 수두바이러스, 우두 바이러스, 및 특히 아데노-연관 바이러스 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 벡터 시스템의 선택은 본 발명의 제한이 아니다.
본 발명은 추가로 본 발명의 유인원 및 유인원-유래 단백질의 생성에 유용한 분자를 제공한다. 본 발명의 유인원 Ad DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는 이러한 분자는 네이키드 DNA, 플라스미드, 바이러스 또는 다른 유전적 구성요소의 형태일 수 있다.
B. SAdV -28, SAdV -27, SAdV -29, SAdV -32, SAdV -33 및/또는 SAdV -35 아데노바이러스 단백질
본원에 기술되는 아데노바이러스 핵산에 의해 암호화되는 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35 아데노바이러스의 유전자 생성물, 예컨대, 단백질, 효소 및 그것의 단편이 제공된다. 더 나아가, 다른 방법에 의해 발생되는 이들 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 가지는 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35 단백질, 효소, 및 그것의 단편이 포함된다. 이러한 단백질은 상기 표에서 확인되는 오픈리딩프레임에 의해 암호화되는 것, 표 2의 단백질(또한 서열목록에 나타냄) 및 단백질 및 폴리펩티드의 그것의 단편을 포함한다.
[표 2]
따라서, 한 양태에서, 실질적으로 순수한, 즉, 다른 바이러스 및 단백질성 단백질이 없는 독특한 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35 단백질이 제공된다. 바람직하게는, 이들 단백질은 적어도 10% 상동성, 더 바람직하게는 60% 상동성, 및 가장 바람직하게는 95% 상동성이다.
한 구체예에서, 독특한 유인원-유래 캡시드 단백질이 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같은, 유인원-유래 캡시드 단백질은, 제한 없이, 키메라 캡시드 단백질, 융합 단백질, 인공 캡시드 단백질, 합성 캡시드 단백질, 및 재조합 캡시드 단백질을 포함하여, 이들 단백질의 의미에 대한 제한 없이, 상기 정의한 바와 같은 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35 캡시드 단백질 또는 그것의 단편을 함유하는 어떤 아데노바이러스 캡시드 단백질을 포함한다.
적당하게, 이들 유인원-유래 캡시드 단백질은 다른 아데노바이러스 항원형의 캡시드 영역 또는 그것의 단편, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 변형된 유인원 캡시드 단백질 또는 단편과 조합하여 하나 이상의 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35 영역 또는 그것의 단편(예를 들어, 헥손, 펜톤, 섬유 또는 그것의 단편)을 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "변형된 굴성과 연관된 캡시드 단백질의 변형"은 변경된 캡시드 단백질, 즉, 펜톤, 헥손 또는 섬유 단백질 영역, 또는 그것의 단편, 예로써, 섬유 영역의 혹(knob) 도메인, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 특이성은 변경된다. 유인원-유래 캡시드는 인간 또는 비-인간 기원일 수 있는 하나 이상의 본 발명 또는 다른 Ad 항원형과 함께 구성될 수 있다. 이러한 Ad는 ATCC, 상업적 및 학업적 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 획득될 수 있고, 또는 Ad의 서열은 GenBank 또는 다른 적당한 공급원으로부터 획득될 수 있다.
SAdV-28 (SEQ ID NO:6), SAdV-27 (SEQ ID NO: 44), SAdV-29 (SEQ ID NO: 76), SAdV-32 (SEQ ID NO: 108), SAdV-33 (SEQ ID NO: 139) 및 SAdV-35 (SEQ ID NO: 171)의 펜톤 단백질의 아미노산 서열이 제공된다. 적절하게는, 이들 펜톤 단백질, 또는 그것의 독특한 단편은 다양한 목적을 위해 이용될 수 있다. 적절한 단편의 예는 각각 상기 제공된 아미노산 넘버링 및 각각 SEQ ID NO:6, 44, 76, 108, 139, 및 171에 기초한 약 50, 100, 150, 또는 200개의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 절단(truncation)을 가지는 펜톤을 포함한다. 다른 적당한 단편은 더 짧은 내부의, C-말단의 또는 N-말단의 단편을 포함한다. 추가로, 펜톤 단백질은 당업자에게 공지된 다양한 목적을 위해 변형될 수 있다.
또한 SAdV-28 [SEQ ID NO: 11], SAdV-27 (SEQ ID NO: 49), SAdV-29 (SEQ ID NO: 81), SAdV-32 (SEQ ID NO: 113), SAdV-33 (SEQ ID NO: 144) 및 SAdV-35 (SEQ ID NO: 176)의 헥손 단백질의 아미노산 서열이 제공된다. 적절하게는, 이들 헥손 단백질, 또는 그것의 독특한 단편은 다양한 목적을 위해 이용될 수 있다. 적절한 단편의 예는 상기 제공된 아미노산 넘버링 및 각각 SEQ ID NO: 11, 49, 81, 113, 144 또는 176에 기초한 약 50, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 절단을 가지는 헥손을 포함한다. 다른 적당한 단편은 더 짧은 내부의, C-말단, 또는 N-말단의 단편을 포함한다. 예를 들어, 한 적당한 단편은 헥손 단백질, 지정된 DE1 및 FG1, 또는 그것의 고도가변 영역의 루프 영역(도메인)이다. 이러한 단편은 각각 SEQ ID NO: 11, 49, 81, 113, 144 또는 176에 대하여 유인원 헥손 단백질의 아미노산 잔기 약 125 내지 443; 약 138 내지 441, 또는 더 적은 단편을 걸치는 영역, 예로써, 약 잔기 138 내지 잔기 163; 약 170 내지 약 176; 약 195 내지 약 203; 약 233 내지 약 246; 약 253 내지 약 264; 약 287 내지 약 297; 및 약 404 내지 약 430을 걸치는 것을 포함한다. 다른 적당한 단편은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 추가로, 헥손 단백질은 당업계에 공지된 다양한 목적을 위해 변형될 수 있다. 헥손 단백질이 아데노바이러스의 항원형에 대한 결정요인이기 때문에, 이러한 인공 헥손 단백질은 인공 항원형을 가지는 아데노바이러스를 초래할 수 있다. 다른 인공 캡시드 단백질은 또한 침팬지 Ad 펜톤 서열 및/또는 본 발명의 섬유 서열 및/또는 그것의 단편을 사용하여 구성될 수 있다.
한 구체예에서, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 헥손 단백질의 서열을 이용하는 변경된 헥손 단백질을 가지는 아데노바이러스가 발생될 수 있다. 헥손 단백질을 변경하는 한 적절한 방법은 참고로써 포함되는 미국 특허 5,922,315호에서 기술된다. 이 방법에서, 아데노바이러스 헥손의 적어도 하나의 루프 영역은 다른 아데노바이러스 항원형의 적어도 하나의 루프 영역으로 변경된다. 따라서, 이러한 변경된 아데노바이러스 헥손 단백질의 적어도 하나의 루프 영역은 SAdV-28 (또 다르게는, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35)의 유인원 Ad 헥손 루프 영역이다. 한 구체예에서, SAdV-28 (또 다르게는, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35) 헥손 단백질의 루프 영역은 다른 아데노바이러스 항원형으로부터 루프 영역으로써 대체된다. 다른 구체예에서, SAdV-28 (또 다르게는, SAdV-27, SAdV-29, SAdV- 32, SAdV-33 또는 SAdV-35) 헥손의 루프 영역은 다른 아데노바이러스 항원형의 루프 영역을 대체하기 위해 사용된다. 적절한 아데노바이러스 항원형은 본원에서 기술되는 바와 같은 인간과 비-인간 항원형 중으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 적당한 항원형의 선택은 본 발명에서 제한되지 않는다. SAdV-28 (또 다르게는, SAdV- 27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 또는 SAdV-35) 헥손 단백질 서열에 대한 또 다른 사용은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
SAdV-28 [SEQ ID NO:21], SAdV-27[SEQ ID NO: 59], SAdV-29 [SEQ ID NO: 91], SAdV-32 [SEQ ID NO: 123], SAdV-33 [SEQ ID NO: 154] 또는 SAdV-35[SEQ ID NO: 185]의 섬유 단백질의 아미노산 서열. 적절하게는, 이 섬유 단백질, 또는 그것의 독특한 단편은 다양한 목적을 위해 이용될 수 있다. 한 적절한 단편은 SEQ ID NO: 21, 59, 91, 123, 154 또는 185 내에 위치되는 섬유 혹이다. 다른 적절한 단편의 예는 SEQ ID NO: 21, 59, 91, 123, 154 또는 185에서 제공되는 아미노산 넘버링에 기초하여 약 50, 100, 150, 또는 200 아미노산의 N-말단의 및/또는 C-말단의 절단을 가지는 섬유를 포함한다. 또 다른 적절한 단편은 내부 단편을 포함한다. 추가로, 섬유 단백질은 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 변형될 수 있다.
SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35의 단백질의 독특한 단편은 길이에 있어서 적어도 8개의 아미노산이다. 그러나, 다른 원하는 길이의 단편이 용이하게 이용될 수 있다. 게다가, 변형은 SAdV28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 유전자 생성물의 수율 및/또는 발현을 향상시키기 위해 도입될 수 있고, 예를 들어, SAdV28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 유전자 생성물의 모두 또는 단편이 향상을 위해 융합 파트너와 융합되는(직접 또는 링커를 통해) 융합 분자의 구성이 본원에서 제공된다. 다른 적절한 변형은, 제한 없이, 보통 절단되는 전- 또는 후-단백질을 제거하기 위해 및 성숙 단백질 또는 효소 및/또는 비밀 유전자 생성물을 제공하기 위한 코딩 영역의 돌연변이를 제공하기 위해 코딩 영역(예를 들어, 단백질 또는 효소)의 절단을 포함한다. 또 다른 변형은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 더 나아가 본원에 제공된 SAdV28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 단백질과 적어도 약 99% 동일성을 가지는 단백질이 포함된다.
본원에서 기술되는 바와 같은, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35의 아데노바이러스 캡시드 단백질을 함유하는 본 발명의 벡터는 중화벡터가 다른 Ad 항원형계 벡터 뿐만 아니라 다른 바이러스 벡터의 유효성을 감소시키는 용도에서의 사용에 특히 적합하다. rAd 벡터는 반복 유전자 치료 또는 부스팅 면역 반응(백신 타이터)을 위한 재투여에서 특히 유리하다.
특정 환경 하에서, 항체를 발생시키기 위한 하나 이상의 SAdV28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 유전자 생성물(예를 들어, 캡시드 단백질 또는 그것의 단편)을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 말한다. 항체는, 예를 들어, 고친화도 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 재조합 항체 및 인간화된 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 항체는 면역글로불린 분류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로부터 기원한다.
이러한 항체는 당업계에 알려진 어떤 다수의 방법을 사용하여 발생될 수 있다. 적절한 항체는 잘-알려진 전통적인 기술, 예를 들어, Kohler 및 Milstein, 및 그것의 많은 공지된 변형에 의해 발생될 수 있다. 유사하게, 바람직한 고역가 항체는 이들 항원에서 개발된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 대한 공지된 재조합 기술을 적용함으로써 발생될 수 있다[예를 들어, PCT 특허 출원 No. PCT/GB85/00392; 영국 특허 출원 공개 번호 GB2188638A; Amit et al., 1986 Science, 233:747-753; Queen et al., 1989 Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA, 86: 10029-10033; PCT 특허 출원 번호 PCT/WO9007861; 및 Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Huse et al, 1988a Science, 246: 1275-1281 참조]. 또 다르게는, 항체는 본 발명의 항원에 동물 또는 인간 항체의 상보성 결정 영역을 조작함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, E. Mark and Padlin, "Humanization of Monoclonal Antibodies", Chapter 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 113, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag (June, 1994); Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc . Natl. Acad . Sci USA 85:5879-5883; 및 Bird et al., 1988, Science 242:423-426 참조. 추가로 본 발명에 의해 항-유전자형 항체(Ab2) 및 항-항-유전자형 항체(Ab3)가 제공된다. 예를 들어, M. Wettendorff et al., "Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies." In Idiotypic Network and Diseases, ed. by J. Cerny and J. Hiernaux, 1990 J. Am. Soc . Microbiol ., Washington DC: pp. 203-229]. 이들 항-유전자형 및 항-항-유전자형 항체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생성된다. 이들 항체는 진단적 및 임상적 방법 및 키트를 포함하는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다.
특정 환경 하에서, SAdV28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 유전자 생성물, 항체 또는 본 발명의 다른 구조체에 검출가능한 표지 또는 태그를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 검출가능한 표지는 단독으로 또는 다른 분자와 상호작용하여, 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 분자이다. 가장 바람직하게는, 표지는, 예를 들어, 면역 조직 화학 분석 또는 면역 형광 현미경검사에 의해 시각적으로 검출가능하다. 예를 들어, 적당한 표지는 플루오르세인 이소티오시아네이트 (FITC), 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌(APC), 코리포스핀-O (CPO) 또는 탠덤 염료, PE-시아닌-5 (PC5), 및 PE-텍사스 레드(ECD)를 포함한다. 모든 이들 형광 염료는 상업적으로 이용가능하고, 그것들의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 다른 유용한 표지는 콜로이드 골드 표지를 포함한다. 또 다른 유용한 표지는 방사성 화합물 또는 원소를 포함한다. 추가적으로, 표지는 분석에서 측색 신호를 나타내기 위해 작동하는 다양한 효소 시스템을 포함하며, 예를 들어, 글루코오스 옥시다아제(기질로서 글루코오스를 사용)는 페록시다아제 및 테트라메틸 벤지딘(TMB)과 같은 수소 도너의 존재하에서 푸른색으로서 보이는 산화된 TMB를 생성하는 생성물로서 과산화물을 방출한다. 다른 예는 ATP, 글루코오스, 및 NAD+와 반응하는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소와 함께 양고추냉이과산화효소 (HRP), 알칼리 포스파타아제 (AP), 및 헥소키나아제를 포함하여, 특히 340 nm 파장에서 증가된 흡광도로서 검출되는 NADH를 얻는다.
본원에서 기술되는 방법에서 이용되는 다른 표지 시스템은 다른 수단, 예를 들어, 주입된 염료가 적용가능한 분석에서 결과 복합체의 존재하에서 시각적 신호 표시를 제공하기 위한 표적 서열과 콘쥬게이트를 형성하는 효소 대신에 사용되는 착색 라텍스 마이크로입자[Bangs Laboratories, Indiana]에 의해 검출가능하다.
원하는 분자와 표지를 커플링 또는 결합하는 방법은 마찬가지로 통상적이며 당업자에게 공지되어 있다. 표지 부착의 공지된 방법이 기술된다[예를 들어, Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals, 6th Ed., R.P.M. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 1996; Pierce Catalog and Handbook, Life Science and Analytical Research Products, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1994/1995 참조]. 따라서, 표지 및 커플링 방법의 선택은 본 발명을 제한하지 않는다.
SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35의 서열, 단백질, 및 단편은 재조합 생성물, 화학적 합성, 또는 다른 합성 수단을 포함하는 임의의 적절한 수단에 의해 생성될 수 있다. 적절한 생성 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY) 참조. 또 다르게는, 펩티드는 또한 잘 공지된 고체 상 펩티드 합성 방법(Merrifield, J. Am. Chem . Soc, 85:2149 (1962); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62)에 의해 합성될 수 있다. 이들 및 다른 적절한 생성 방법은 당업자의 지식 내이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
게다가, 당업자는 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 서열이 치료 및 면역 분자의 시험관 내, 생체 밖 또는 생체 내 전달을 위한 다양한 바이러스 및 비-바이러스 벡터 시스템을 위한 사용에 용이하게 적용될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, 한 구체예에서, 유인원 Ad 캡시드 단백질 및 본원에서 기술되는 다른 유인원 아데노바이러스 단백질은 비-바이러스, 유전자의 단백질계 전달, 단백질 및 기타 바람직한 진단적, 치료적 및 면역적 분자에 대해 사용된다. 한 이러한 구체예에서, 본 발명의 단백질은 아데노바이러스에 대한 수용체와 함께 세포를 표적화하기 위한 분자에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 바람직하게는, 헥손, 펜톤, 섬유 또는 세포 표면 수용체를 위한 리간드를 가지는 그것의 단편과 같은 캡시드 단백질이 이러한 표적을 위해 선택된다. 전달에 적당한 분자는 본원에서 기술되는 치료적 분자와 그것의 유전자 생성물 중에서 선택된다. 지질, 폴리Lys 등을 포함하는 다양한 링커가 링커로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 유인원 펜톤 단백질은 Medina-Kauwe LK, et al, Gene Ther . 2001년 5월; 8(10):795-803 및 Medina-Kauwe LK, et al, Gene Ther . 2001년 12월; 8(23): 1753-1761에서 기술되는 것과 유사한 방법으로 유인원 펜톤 서열을 사용하여 융합 단백질의 생성에 의한 목적을 위해 용이하게 이용될 수 있다. 또 다르게는, 유인원 Ad 단백질 IX의 아미노산 서열은 미국 특허 출원 20010047081에 기술되는 바와 같은 세포 표면 수용체에 벡터를 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 적당한 리간드는 CD40 항원, RGD-함유 또는 폴리리신-함유 서열 등을 포함한다. 예를 들어, 헥손 단백질 및/또는 섬유 단백질을 포함하는 또 다른 유인원 Ad 단백질은 이들 및 유사한 목적을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 아데노바이러스 단백질은 당업자에게 용이하게 명백할 다양한 목적을 위하여 단독으로, 또는 다른 아데노바이러스 단백질과 조합하여 사용될 수 있다. 게다가, SAdV-28 아데노바이러스 단백질의 또 다른 사용은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
II. 재조합 아데노바이러스 벡터
본원에 기술되는 조성물은 치료 또는 백신 목적을 위해 세포에 이종성 분자를 전달하는 벡터를 포함한다. 본원에서 사용되는, 벡터는 제한 없이, 네이키드 DNA, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피솜, 플라스미드, 또는 바이러스를 포함하는 어떤 유전적 요소를 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 SAdV28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 및 미니유전자의 유인원 아데노바이러스를 함유한다. "미니유전자" 또는 "발현 카세트"는 숙주 세포에서 유전자 생성물의 번역, 전사 및/또는 발현을 작동하는데 필요한 선택된 이종성 유전자 및 다른 조절 요소의 조합을 의미한다.
전형적으로, SAdV-유래된 아데노바이러스 벡터는 설계되어 선택된 아데노바이러스 유전자에 고유한 영역에서 미니유전자는 다른 아데노바이러스 서열을 함유하는 핵산 분자에 위치된다. 미니유전자는 원한다면, 영역의 기능을 방해하기 위해 존재하는 유전자 영역에 도입될 수 있다. 또 다르게는, 미니유전자는 부분적으로 또는 완전히 결실된 아데노바이러스 유전자의 자리에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 미니유전자는 특히 선택될 수 있는 기능적 E1 결실 또는 기능적 E3 결실의 자리와 같은 자리에서 위치될 수 있다. 용어 "기능적으로 결실된" 또는 "기능적 결실"은 유전자 영역의 충분한 양이 예를 들어, 돌연변이 또는 변형에 의해 제거 또는 다르게는 손상되어, 유전자 영역은 유전자 발현의 기능적 생성물을 더 이상 생성할 수 없음을 의미한다. 원한다면, 전체 유전자 영역이 제거될 수도 있다. 유전자 파괴 또는 결실을 위한 다른 적절한 자리는 본 출원의 어디에서나 논의된다.
예를 들어, 재조합 바이러스의 발생에 유용한 생성 벡터에 대해, 벡터는 미니유전자 및 아데노바이러스 게놈의 5' 말단 또는 아데노바이러스 게놈의 3' 말단 중 하나, 또는 아데노바이러스 게놈의 5'과 3' 둘 다를 함유할 수 있다. 아데노바이러스 게놈의 5' 말단은 패키징 및 복제에 필요한 5' 시스-구성요소; 즉, 5' 역위 말단 반복 (ITR) 서열(복제의 기원으로서 작용) 및 본래의 5' 패키징 인핸서 도메인(E1 프로모터를 위한 패키징 선형 Ad 게놈 및 인핸서 요소에 필요한 서열을 함유)을 함유한다. 아데노바이러스 게놈의 3' 말단은 패키징 및 단백질 막화(encapsidation)에 필요한 3' 시스-구성요소(ITR을 포함)를 포함한다. 적절하게는, 재조합 아데노바이러스는 5' 및 3' 아데노바이러스 시스-구성요소를 함유하며, 미니유전자는 5' 및 3' 아데노바이러스 서열 사이에 위치된다. SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 기초 아데노바이러스 벡터는 또한 추가 아데노바이러스 서열을 함유할 수 있다.
적절하게는, 이들 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 기초 아데노바이러스 벡터는 본 발명의 아데노바이러스 게놈으로부터 유래된 하나 이상의 아데노바이러스 구성요소를 함유할 수 있다. 한 구체예에서, 벡터는 SAdV28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-로부터의 아데노바이러스 ITR 및 동일한 아데노바이러스 항원형으로부터의 추가 아데노바이러스 서열을 함유한다. 다른 구체예에서, 벡터는 ITR을 제공하는 것보다 다른 아데노바이러스 항원형으로부터 유래되는 아데노바이러스 서열을 함유한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 슈도타입화된(pseudotyped) 아데노바이러스는 아데노바이러스의 캡시드 단백질이 ITR을 제공하는 아데노바이러스 보다 다른 아데노바이러스로부터 오는 아데노바이러스를 말한다.
추가로, 키메라 또는 하이브리드 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 본원에 기술된 아데노바이러스를 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 7,291,498호 참조.
ITR의 아데노바이러스 공급원 및 벡터에 존재하는 어떤 다른 아데노바이러스 서열의 공급원은 본 발명을 제한하지 않는다. 다양한 아데노바이러스 균주가 American Type Culture Collection, Manassas, Virginia로부터 이용가능하고, 또는 다양한 상업적 및 기관의 공급원으로부터 이용가능하다. 추가로, 많은 이러한 균주의 서열은 예를 들어, PubMed 및 GenBank를 포함하는 다양한 데이터베이스로부터 이용가능하다. 다른 유인원 또는 인간 아데노바이러스로부터 제조된 상동 아데노바이러스 벡터는 공개된 문헌에서 기술된다[예를 들어, 미국 특허 5,240,846호 참조]. 다수의 아데노바이러스 종류의 DNA 서열은 타입 Ad5[GenBank 등록 번호 M73260]를 포함하여, GenBank로부터 이용가능하다. 아데노바이러스 서열은 항원형 2, 3, 4, 7, 12 및 40과 같은 어떤 공지된 아데노바이러스 항원형으로부터 얻을 수 있고, 또한 어떤 본원에서 확인되는 인간형을 포함한다. 유사하게 비-인간 동물(예를 들어, 유인원)을 감염시키는 것으로 알려진 아데노바이러스는 또한 본 발명의 벡터 구조체에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,083,716호 참조.
바이러스 서열, 헬퍼 바이러스(필요하다면), 및 재조합 바이러스 입자, 및 다른 벡터 성분 및 본원에 기술되는 벡터의 구조체에서 사용되는 서열은 상기 기술된 바와 같이 획득된다. 본 발명의 SAdV28 유인원 아데노바이러스 서열의 DNA 서열은 벡터 및 이러한 벡터의 제조에 유용한 셀 라인을 구성하기 위해 사용된다.
서열 결실, 삽입, 및 다른 돌연변이를 포함하는 본 발명의 벡터를 형성하는 핵산 서열의 변형은 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 발생될 수 있고, 본 구체예의 범주 내이다.
A. "미니유전자"
이식 유전자의 선택, "미니유전자"의 클로닝 및 구성 및 바이러스 벡터에 그것의 삽입을 위해 사용되는 방법은 본원에서 제공되는 교시가 주어지는 당업계의 기술 내이다.
1. 이식 유전자
이식 유전자는 관심의 폴리펩티드, 단백질, 또는 다른 생성물을 암호화하는 이식 유전자 옆에 위치하는 벡터 서열에 이종성인 핵산 서열이다. 핵산 코딩 서열은 숙주 세포에서 이식 유전자 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동가능하게 연결된다.
이식 유전자 서열의 조성은 결과 벡터가 위치될 곳에서 사용에 의존할 것이다. 예를 들어, 한 종류의 이식 유전자 서열은 발현이 검출가능한 신호를 생성할 때 리포터 서열을 포함한다. 이러한 리포터 서열은, 제한 없이, DNA 서열 암호화 β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼린 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제(CAT), 루시페라아제, 예를들어, CD2, CD4, CD8를 포함하는 막 결합 단백질, 인플루엔자 헤마그글루티닌 단백질, 및 당업계에 잘 공지된 다른 것을 그것과 관련된 고친화도 항체에서 포함하며, 또는 통상적인 수단, 및 특히 헤마그글루티닌 또는 Myc로부터 항원 태그 도메인에 적절하게 융합된 막 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 의해 생성될 수 있다. 이들 코딩 서열은, 그것의 발현을 작동시키는 조절 요소와 결합될 때, 효소, 방사선 촬영, 측색, 형광 또는 다른 분광기 분석, 형광 활성화 세포 정렬 분석 및 효소면역분석(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 면역 조직 화학을 포함하는 면역 분석을 포함하는 통상적인 수단에 의해 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열은 LacZ 유전자이며, 신호를 전달하는 벡터의 존재는 베타-갈락토시다아제 활성에 대한 분석에 의해 검출된다. 이식 유전자가 GFP 또는 루시페라아제인 경우, 신호를 전달하는 벡터는 광도계에서 색 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수있다.
한 구체예에서, 이식 유전자는 단백질, 펩티드, RNA, 효소, 또는 촉매적 RNA와 같은 생물 및 의학에서 유용한 생성물을 암호화하는 비-마커 서열이다. 바람직한 RNA 분자는 tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매적 RNA, 및 안티센스 RNA를 포함한다. 유용한 RNA 서열의 한 예는 처치 동물에서 표적 핵산 서열의 발현을 끝내는 서열이다.
이식 유전자는 암 치료제 또는 백신으로서, 면역 반응의 유발, 및/또는 예방 백신 목적을 위한 예를 들어, 유전적 결함의 치료에 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 면역 반응의 유발은 분자에서 T 세포 및/또는 체액성 면역반응을 유발하는 분자의 능력(예를 들어, 유전자 생성물)을 말한다. 본 발명은 추가로 예를 들어, 멀티-서브유닛 단백질에 의해 야기되는 질환을 고치거나 또는 완화하기 위해 다양한 이식 유전자를 사용하는 것을 포함한다. 특정 상황에서, 다른 이식 유전자는 단백질의 각 서브유닛을 암호화하고, 또는 다른 펩티드 또는 단백질을 암호화하기 위해 사용될 수 있다. 이는 단백질 서브유닛을 암호화하는 DNA의 크기가 클 때, 예를 들어, 면역글로불린, 혈소판-유래 성장인자, 또는 디스트로핀 단백질에 대해 바람직하다. 멀티-서브유닛 단백질을 생성하기 위한 세포를 위해, 세포는 각각의 다른 서브유닛을 함유하는 재조합 바이러스로 감염된다. 또 다르게는, 단백질의 다른 서브유닛은 동일한 이식 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 이 경우에, 단일 이식 유전자는 내부 리보자임 유입 자리(IRES)에 의해 분리된 각 서브유닛에 대한 DNA와 함께, 각각의 서브유닛을 암호화하는 DNA를 포함한다. 이는 각각의 서브유닛을 암호화하는 DNA의 자리가 작을 때, 예를 들어, 서브유닛 및 IRES를 암호화하는 DNA의 전체 크기가 5 킬로베이스 미만일 때, 바람직하다. IRES에 대한 대안으로서, DNA는 번역-후 사건에서 자기-절단하는 2A 펩티드를 암호화하는 서열에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, ML. Donnelly, et al., J. Gen. Virol ., 78(Pt 1): 13-21 (1997년 1월); Furler, S., et al, Gene Ther ., 8(11):864-873 (2001년 6월); Klump H., et al, Gene Ther ., 8(10):811-817(2001년 5월) 참조. 이 2A 펩티드는 IRES보다 상당히 더 작으며, 공간이 제한 인자일 때 사용에 적합하도록 만든다. 그러나, 선택된 이식 유전자가 어떤 생물학적으로 활성인 생성물 또는 다른 생성물, 예를 들어, 연구에 바람직한 생성물을 암호화할 수도 있다.
적당한 이식 유전자는 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 이식 유전자의 선택은 이 구체예를 제한하는 것으로 고려되지 않는다.
2. 조절 요소
미니유전자에 대해 상기 확인된 주요 요소에 더하여, 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 트랜스펙팅된 또는 본 발명에 의해 생성되는 바이러스로 감염된 세포에서 그것의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식 유전자에 작동가능하게 연결되는 필요한 통상적인 조절 요소를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은, "작동가능하게 연결된" 서열은 관심의 유전자와 인접하는 발현 조절 서열 및 트랜스에서 또는 관심의 유전자를 조절하기 위한 거리에서 작용하는 발현 조절 서열을 둘 다 포함한다.
발현 조절 서열은 적절한 전사, 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화(폴리A) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 일치 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요하다면, 암호화된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다.
원래의, 구성의, 유도의 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함하는 매우 다수의 발현 조절 서열은 당업계에 공지되어 있으며 이용될 수 있다. 구성 프로모터의 예는, 제한없이 로우스육종바이러스 (RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서와 함께), 시토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서와 함께)[예를 들어, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985) 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터[Invitrogen]를 포함한다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고 외인성으로 공급된 화합물, 온도와 같은 환경적 인자, 또는 특이적인 생리적 상태의 존재, 예를 들어, 급성 병기, 세포의 특정 분화 상태, 또는 단지 세포를 복제하는 것에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은, 제한 없이, Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하는 다양한 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 많은 다른 시스템이 기술되었고 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 유도성 프로모터는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터 및 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터를 포함한다. 다른 유도성 시스템은 T7 폴리머라아제 프로모터 시스템[WO 98/10088]; 엑디손 곤충 프로모터 [No et al, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 93:3346-3351 (1996)], 테트라사이클린-억제성 시스템[Gossen et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:5547-5551 (1992)], 테트라사이클린-유도성 시스템[Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), 또한 Harvey et al, Curr . Opin . Chem . Biol ., 2:512-518 (1998) 참조]을 포함한다. 다른 시스템은 카스트라디올(castradiol), 디페놀 무리슬레론(diphenol murislerone)을 사용하는 FK506 다이머, VP16 또는 p65, RU486-유도성 시스템[Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al, Gene Ther ., 4:432-441 (1997)] 및 라파마이신-유도성 시스템[Magari et al, J. Clin . Invest., 100:2865-2872 (1997)]을 포함한다. 일부 유도성 프로모터의 유효성은 시간에 따라 증가한다. 이러한 경우에, 탠덤에서 다양한 억제물질을 삽입함으로써 이러한 시스템, 예를 들어, IRES에 의해 TetR에 연결된 TetR의 효율성을 향상시킬 수 있다. 또 다르게는, 원하는 기능에 대한 스크리닝 전에 적어도 3일을 기다릴 수 있다. 이 시스템의 효율성을 향상시키기 위해 공지된 수단에 의해 원하는 단백질의 발현을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE)를 사용한다.
다른 구체예에서, 이식 유전자에 대한 원래의 프로모터가 사용될 것이다. 본래 프로모터는 이식 유전자의 발현이 본래 발현을 모방하는 것으로 소망될 때 바람직할 수 있다. 원래 프로모터는 이식 유전자의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방법으로, 또는 특이적 전사 자극에 대한 반응으로 조절되어야 할 때, 사용될 수 있다. 추가 구체예에서, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 자리 또는 Kozak 일치 서열과 같은 다른 본래 발현 조절 요소는 또한 본래 발현을 모방하도록 사용될 수 있다.
이식 유전자의 다른 구체예는 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 이식 유전자를 포함한다. 예를 들어, 골격근에서 발현이 소망된다면, 근육에서 활성인 프로모터가 사용되어야 한다. 이들은 골격의 β-액틴, 미오신 경사슬 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나아제를 암호화하는 유전자로부터의 프로모터뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 프로모터보다 더 높은 활성을 가지는 합성 근육 프로모터를 포함한다(Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)). 조직-특이적인 프로모터의 예는 간(알부민, Miyatake et al, J. Virol , 71 :5124-32 (1997); B형 간염바이러스 코어 프로모터, Sandig et al, Gene Ther ., 3: 1002-9 (1996); 알파-태아 단백질(AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther ., 7: 1503-14 (1996)), 뼈 오스테오칼신(Stein et al, Mol . Biol . Rep., 24:185-96 (1997)); 뼈 시알로단백질(Chen et al, J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), 림프구 (CD2, Hansal et al, J. Immunol, 161:1063-8 (1998); 면역글로불린 중사슬; T 세포 수용체 사슬), 뉴런-특이적 에놀라아제(NSE) 프로모터와 같은 신경세포(Andersen et al, Cell. Mol. Neurobiol, 13:503-15 (1993)), 신경미세섬유 경-사슬 유전자(Piccioli et al, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 88:561 1-5 (1991)), 및 특히 뉴런-특이적 vgf 유전자(Piccioli et al, Neuron, 15:373-84 (1995))에 대해 알려져 있다.
선택적으로, 치료적으로 유용한 또는 면역성 생성물을 암호화하는 이식 유전자를 전달하는 벡터는 또한 선택가능한 마커를 포함할 수 있고, 또는 리포터 유전자는 특히 제네티신, 하이그로미신 또는 퓨리마이신 저항을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 선택가능한 리포터 또는 마커 유전자(바람직하게는 바이러스 입자안으로 패키징되는 바이러스 게놈 밖에 위치됨)는 암피실린 저항과 같은 박테리아 세포에서 플라스미드의 존재를 표시하는데 사용될 수 있다. 벡터의 다른 성분은 복제의 기원을 포함할 수 있다. 이들 및 다른 프로모터 및 벡터 요소의 선택은 통상적이며 많은 이러한 서열이 이용가능하다[예를 들어, Sambrook et al, 및 그것에 인용된 참고문헌 참조].
이들 벡터는 당업자에게 공지된 기술과 함께, 본원에 제공된 기술 및 서열을 사용하여 발생된다. 이러한 기술은 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY]에서 기술되는 것과 같은 cDNA의 통상적인 클로닝 기술, 아데노바이러스 게놈의 중복 올리고뉴클레오티드 서열의 사용, 폴리머라아제 연쇄 반응, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 어떤 적당한 방법을 포함한다.
III. 바이러스 벡터의 생성
한 구체예에서, 유인원 아데노바이러스 플라스미드(또는 다른 벡터)는 아데노바이러스 벡터를 만드는데 사용된다. 한 구체예에서, 아데노바이러스 벡터는 복제-결함의 아데노바이러스 입자이다. 한 구체예에서, 아데노바이러스 입자는 E1a 및/또는 E1b 유전자에서 결실에 의한 복제-결함이 제공된다. 또 다르게는, 아데노바이러스는, 선택적으로 E1a 및/또는 E1b 유전자를 보유하는 동안 다른 수단에 의한 복제-결함이 제공된다. 아데노바이러스 벡터는 또한 아데노바이러스 게놈에서 다른 돌연변이, 예를 들어, 다른 유전자에서 온도-민감 돌연변이 또는 결실을 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 아데노바이러스 벡터에서 무결함 E1a 및/또는 E1b 영역을 보유하는 것이 바람직하다. 이러한 무결함 E1 영역은 아데노바이러스 게놈에서 그것의 본래 위치에서 위치될 수도 있고 또는 본래 아데노바이러스 게놈에서 결실 자리(예를 들어, E3 영역)에 위치될 수도 있다.
인간(또는 다른 포유동물) 세포에 유전자의 전달을 위해 유용한 유인원 아데노바이러스 벡터의 구성에서, 아데노바이러스 핵산 서열의 범위는 벡터에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 모든 또는 일부의 아데노바이러스 지연 초기 유전자 E3은 재조합 바이러스의 부분을 형성하는 유인원 아데노바이러스 서열로부터 제거될 수 있다. 유인원 E3의 기능은 재조합 바이러스 입자의 기능 및 생성에 무관한 것으로 믿어진다. 유인원 아데노바이러스 벡터는 또한 E4 유전자의 적어도 ORF6 영역의 결실을 가지도록, 더 바람직하게는 이 영역, 전체 E4 영역 기능의 불필요한 중복 때문에 구성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 벡터는 지연된 초기 유전자 E2a에서 결실을 함유한다. 결실은 또한 유인원 아데노바이러스 게놈의 L5를 통해 어떤 말기 유전자 L1에서 만들어질 수 있다. 유사하게, 중간 유전자 IX 및 IVa2의 결실은 일부 목적에 유용할 수 있다. 다른 결실은 다른 구조적 또는 비-구조적 아데노바이러스 유전자에서 만들어질 수 있다. 상기 논의된 결실은 개개로 사용될 수 있고, 즉, 본원에 기술되는 바와 같은 사용을 위한 아데노바이러스 서열은 단지 단일 영역에서 결실을 함유할 수 있다. 또 다르게는, 전체 유전자 또는 그것의 생물학적 활성을 파괴하는데 효과적인 그것의 부분의 결실은 어떤 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 예시적인 벡터에서, 아데노바이러스 서열은 E1 유전자 및 E4 유전자, 또는 E1, E2a 및 E3 유전자, 또는 E1 및 E3 유전자, 또는 E3 등의 결실과 함께 또는 결실 없이, E1, E2a 및 E4 유전자의 결실을 가질 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 이러한 결실은 원하는 결과를 이루기 위해 온도-민감 돌연변이와 같은 다른 돌연변이와 조합하여 사용될 수 있다.
어떤 필수 아데노바이러스 서열을 결핍하는 아데노바이러스 벡터(예를 들어, E1a, E1b, E2a, E2b, E4 ORF6, L1, L2, L3, L4 및 L5)는 아데노바이러스 입자의 바이러스 전염력 및 증식에 필요로 되는 비교대상 외 아데노바이러스 유전자 생성물의 존재하에서 배양될 수 있다. 이들 헬퍼 기능은 하나 이상의 헬퍼 구조체(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스) 또는 패키징 숙주 세포의 존재하에서 아데노바이러스 벡터를 배양함으로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 1996년 5월 9일 공개되고, 본원에 참고로써 포함된 국제 특허 출원 WO96/13597의 "최소의" 인간 Ad 벡터의 제조에 대해 설명된 기술을 참조.
1. 헬퍼 바이러스
따라서, 미니유전자을 전달하는데 사용되는 바이러스 벡터의 유인원 아데노바이러스 유전자 함량에 의존하여, 헬퍼 아데노바이러스 또는 비-복제 바이러스 단편이 미니유전자를 함유하는 감염 재조합 바이러스 입자를 생성하는데 필요한 충분한 유인원 아데노바이러스 유전자 서열을 제공하기 위해 필요할 수 있다. 유용한 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스 벡터 구조체에서 존재하지 않는 및/또는 벡터가 트랜스펙팅되는 패키징 셀 라인에 의해 발현되지 않는 선택된 아데노바이러스 유전자 서열을 함유한다. 한 구체예에서, 헬퍼 바이러스는 복제-결함이며, 상기 기술된 서열에 더하여 다양한 아데노바이러스 유전자를 함유한다. 이러한 헬퍼 바이러스는 E1-발현 셀 라인과 조합하여 바람직하게 사용된다.
헬퍼 바이러스는 또한 Wu et al, J. Biol . Chem ., 264:16985-16987 (1989); K. J. Fisher 및 J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1994년 4월 1일)에서 기술된 바와 같은 폴리-양이온 콘쥬게이트로 형성될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 선택적으로 제 2 리포터 미니유전자를 함유할 수 있다. 다수의 이러한 리포터 유전자는 당업계에 공지되어 있다. 아데노바이러스 벡터에서 이식 유전자와 다른 헬퍼 바이러스 상의 리포터 유전자의 존재는 독립적으로 모니터링되는 Ad 벡터와 헬퍼 바이러스 둘 다를 허용한다. 이런 제 2 리포터는 정제 시 결과 재조합 바이러스와 헬퍼 바이러스 사이의 분리를 가능하게 하는데 사용된다.
2. 상보성 셀 라인
상기 기술된 어떤 유전자에서 결실된 재조합 유인원 아데노바이러스(Ad)를 발생시키기 위해, 바이러스의 복제 및 전염력에 필수적이라면, 결실된 유전자 영역의 기능은 헬퍼 바이러스 또는 셀 라인, 즉, 상보성 또는 패키징 셀 라인에 의해 재조합 바이러스에 공급되어야 한다. 많은 환경에서, 인간 E1을 발현시키는 셀 라인은 침팬지 Ad 벡터를 서로 보완하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 침팬지 Ad 서열과 현재 이용가능한 패키징 세포에서 발견되는 인간 AdE1 서열 사이의 다양성에 기인하여, 현재 인간 E1-함유 세포의 사용이 복제 및 생성 과정 동안 복제-가능 아데노바이러스의 생성을 방지하기 때문에 이는 특히 유리하다. 그러나, 특정 환경에서, E1 유전자 생성물을 발현시키고 E1-결핍 유인원 아데노바이러스의 생성에 이용될 수 있는 셀 라인을 이용하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 셀 라인은 기술되었다. 예를 들어, 미국 특허 6,083,716호 참조.
원한다면, 선택된 모 셀 라인에서 발현을 위한 프로모터의 전사 조절 하에서 SAdV28로부터 아데노바이러스 E1 유전자를 최소한으로 발현시키는 패키징 세포 또는 셀 라인을 발생시키기 위해 본원에 제공되는 서열을 이용할 수 있다. 유도성 또는 구성적 프로모터는 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 본 명세서의 어디에서나 상세하게 설명된다. 모 세포는 어떤 요망되는 SAdV28 유전자를 발현시키는 신규 셀 라인의 생성을 위해 선택된다. 제한 없이, 이러한 모 셀 라인은 특히 HeLa [ATCC Accession No. CCL 2], A549 [ATCC Accession No. CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [예를 들어, Detroit 510, CCL 72] 및 WI-38 [CCL 75] 세포일 수 있다. 이들 셀 라인은 모두 American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209로부터 이용가능하다. 다른 적당한 모 셀 라인은 다른 공급원으로부터 획득될 수 있다.
이러한 E1-발현 셀 라인은 재조합 유인원 아데노바이러스 E1 결실 벡터의 생성에서 유용하다. 추가적으로, 또 다르게는, 하나 이상의 유인원 아데노바이러스 유전자 생성물, 예를 들어, E1a, E1b, E2a, 및/또는 E4 ORF6을 발현시키는 셀 라인은 재조합 유인원 바이러스 벡터의 생성에서 사용되는 바와 같은 본질적으로 동일한 과정을 사용하여 구성될 수 있다. 이러한 셀 라인은 그런 생성물을 암호화하는 필수적 유전자에서 결실된 아데노바이러스를 서로 보완하기 위해, 또는 헬퍼-의존 바이러스(예를 들어, 아데노-관련 바이러스)의 패키징에 필요한 헬퍼 기능을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 숙주 세포의 제조는 선택된 DNA 서열의 조합과 같은 기술을 수반한다. 이 조합은 통상적인 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 기술은 폴리머라아제 연쇄 반응, 합성 방법, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 어떤 다른 적당한 방법과 조합된, 잘 공지되어 있고 상기 인용한 Sambrook et al.에서 기술되는 cDNA 및 게놈 클로닝, 아데노바이러스 게놈의 중복 올리고뉴클레오티드 서열의 사용을 포함한다.
또 다른 대안으로, 필수적인 아데노바이러스 유전자 생성물이 아데노바이러스 벡터 및/또는 헬퍼 바이러스에 의해 트랜스에서 제공된다. 이러한 예에서, 적절한 숙주 세포는 원핵(예를 들어, 박테리아) 세포를 포함하는 어떤 생물학적 유기체, 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵세포로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 숙주 세포는, 제한 없이, A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293 세포 또는 PERC6 (이들 둘 다 기능적 아데노바이러스 E1을 발현시킨다) [Fallaux, FJ et al, (1998), Hum Gene Ther, 9:1909-1917], Saos, C2C12, L 세포, HT1080, HepG2 및 일차 섬유아세포, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼 및 햄스터를 포함하는 포유동물로부터 유래된 간세포 및 근원세포와 같은 세포를 포함하는 어떤 포유동물 종 중에서 선택된다. 세포를 제공하는 포유동물 종의 선택은 본 발명을 제한하지 않으며; 포유동물 세포, 즉, 섬유아세포, 간세포, 종양 세포 등의 종류도 아니다.
3. 셀 라인의 바이러스 입자 및 트랜스펙션의 조합
일반적으로, 트랜스펙션에 의해 미니유전자를 포함하는 벡터를 전달할 때, 벡터는 약 1 x 104 세포 내지 약 1 x 1013 세포, 및 바람직하게는 약 105 세포에서 약 5 μg 내지 약 100 μg DNA, 및 바람직하게는 약 10 내지 약 50 μg DNA의 양으로 전달된다. 그러나, 선택된 벡터, 전달 방법 및 선택된 숙주 세포로서 고려하여, 숙주 세포에서 벡터 DNA의 상대적 양은 조절될 수 있다.
벡터는 네이키드 DNA, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피솜, 바이러스 등을 포함하여 당업계에 알려진 또는 상기 기재된 어떤 벡터일 수 있다. 벡터의 숙주 세포에 도입은 트랜스펙션, 및 감염을 포함하는 당업계에 공지된 또는 상기 기재된 바와 같은 어떤 수단에 의해 달성될 수 있다. 하나 이상의 아데노바이러스 유전자는 숙주 세포의 게놈에 안정적으로 통합되고, 에피솜으로서 안정적으로 발현되고, 또는 일시적으로 발현될 수 있다. 유전자 생성물은 모두 에피솜에서 일시적으로 발현되거나 안정적으로 통합될 수 있고, 또는 유전자 생성물의 일부는 안정적으로 발현되는 반면, 나머지는 일시적으로 발현될 수도 있다. 추가로, 각각의 아데노바이러스 유전자의 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 본래 아데노바이러스 프로모터로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 프로모터는 예를 들어, 유기체 또는 세포의 특이적 생리학적 상태에 의해(즉, 분화상태에 의해 또는 복제 또는 정지 세포(quiescent cell)에서) 또는 외인성으로-첨가된 인자에 의해 조절될 수 있다.
숙주 세포에 분자(플라스미드 또는 바이러스)의 도입은 또한 당업자에게 공지되고, 본 명세서를 통해 논의되는 바와 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표준 트랜스펙션 기술, 예를 들어, CaPO4 트랜스펙션 또는 전기천공법이 사용된다.
재조합 바이러스 입자를 생성하기 위해 아데노바이러스의 선택된 DNA 서열뿐만 아니라 이식 유전자 및 다른 벡터 요소의 다양한 중간체 플라스미드에의 조합, 및 플라스미드 및 벡터의 사용은 통상적인 기술을 사용하여 모두 달성된다. 이러한 기술은 문헌[Sambrook et al, 상기 인용]에서 기술되는 것과 같은 cDNA의 통상적인 클로닝 기술, 아데노바이러스 게놈의 중복 올리고뉴클레오티드 서열의 사용, 폴리머라아제 연쇄 반응, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 어떤 적당한 방법을 포함한다. 표준 트랜스펙션 및 공동-트랜스펙션 기술, 예를 들어, CaPO4 침지 기법이 사용된다. 사용되는 다른 통상적인 방법은 바이러스 게놈의 상동 재조합, 한천중층에서 바이러스의 플라크, 신호 생성을 측정하는 방법 등을 포함한다.
예를 들어, 원하는 미니유전자-함유 바이러스 벡터의 구성 및 조합에 따라서, 벡터는 헬퍼 바이러스의 존재하에서 패키징 셀 라인 안으로 시험관 내에서 트랜스펙팅된다. 상동 재조합은 헬퍼와 벡터 서열 사이에서 발생하며, 이는 비리온 캡시드로 복제되고 패키징되는 벡터에서 아데노바이러스-이식 유전자 서열을 허용하여, 재조합 바이러스 벡터 입자를 초래한다. 이러한 바이러스 입자를 생성하는 현재의 방법은 트랜스펙션에 기초한다. 그러나, 본 발명은 이러한 방법에 제한되지 않는다.
결과 재조합 유인원 아데노바이러스는 선택된 이식 유전자가 선택된 세포로 이동하는데 유용하다. 패키징 셀 라인에서 성장한 재조합 바이러스에 의한 생체내 실험에서, 본 발명의 E1-결실 재조합 유인원 아데노바이러스 벡터는 이식 유전자를 비-유인원, 바람직하게는 인간, 세포에 이동시키는데 유용함을 증명한다.
IV. 재조합 아데노바이러스 벡터의 사용
재조합 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 기초 벡터는 시험관내, 생체 밖, 및 생체 내 인간 또는 비-유인원 수의과 환자에서 유전자 전달에 유용하다.
본원에 기술되는 재조합 아데노바이러스 벡터는 시험관내 이종성 유전자에 의해 암호화되는 생성물의 생성을 위한 발현 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, E1 결실의 위치로 삽입되는 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스는 상기 기술한 바와 같은 E1-발현 셀 라인에 트랜스펙팅될 수 있다. 또 다르게는, 복제-가능 아데노바이러스는 다른 선택된 셀 라인에서 사용될 수 있다. 트랜스펙팅된 세포는 그 후 통상적인 방법으로 배양되고, 프로모터로부터 유전자 생성물을 발현시키기 위한 재조합 아데노바이러스를 허용한다. 유전자 생성물은 그 후 배양물로부터 단백질 분리 및 회수의 공지된 통상적인 방법에 의해 배양물 배지로부터 회수될 수 있다.
SAdV28 SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35-유래 재조합 유인원 아데노바이러스 벡터는 생체내 또는 생체밖에서 조차 선택되는 숙주 세포에 선택된 이식 유전자를 전달할 수 있는 효율적인 유전자 전달 비히클을 제공하며, 유기체는 하나 이상의 AAV 항원형에서 중화 항체를 가진다. 한 구체예에서, rAAV 및 세포는 생체밖에서 혼합되고; 감염 세포는 통상적인 방법을 사용하여 배양되며; 형질도입된 세포는 환자에 재주입된다. 이들 조성물은 치료적 목적 및 보호 면역을 유발하는 것을 포함하는 면역을 위한 유전자 전달에 특히 적합하다.
더 흔하게는, SAdV28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 재조합 아데노바이러스 벡터는 하기 기술되는 바와 같은 치료 또는 면역 분자의 전달을 위해 이용될 것이다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터의 반복 전달을 수반하는 요법에서 사용에 특히 적합하다는 것이 두 용도에 대해 용이하게 이해될 것이다. 이러한 요법은 전형적으로 바이러스 캡시드가 변형되는 일련의 바이러스 벡터의 전달을 수반한다. 바이러스 캡시드는 각각의 이후의 투여를 위해, 또는 특정 항원형 캡시드의 미리-선택된 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상)의 투여 후 변형될 수 있다. 따라서, 요법은 제 1 유인원 캡시드와 함께 rAd의 전달, 제 2 유인원 캡시드와 함께 rAd의 전달, 및 제 3 유인원 캡시드와 함께 전달을 수반할 수 있다. 본 발명의 Ad 캡시드를 단독으로, 다른 것과 조합하여, 또는 다른 아데노바이러스와 조합하여(바람직하게는 면역적으로 비-교차반응임) 사용하는 다양한 다른 요법은 당업자에게 명백할 것이다. 선택적으로, 이러한 요법은 다른 비-인간 영장류 아데노바이러스, 인간 아데노바이러스, 또는 본원에 기술되는 것과 같은 인공 서열의 캡시드와 함께 rAd의 투여를 수반할 수 있다. 요법의 각 단계는 단일 Ad 캡시드로 일련의 주입(또는 다른 전달 경로) 후 다른 Ad 공급원으로부터 일련의 다른 캡시드의 투여를 수반할 수 있다. 또 다르게는, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터는 다른 바이러스 시스템, 비-바이러스 전달 시스템, 단백질, 펩티드, 및 다른 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 다른 비-아데노바이러스-매개 전달 시스템을 수반하는 요법에서 이용될 수 있다.
하기의 섹션은 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 통해 전달될 수 있는 예시적인 분자에 초점을 맞출 것이다.
A. 치료 분자의 Ad-매개 전달
한 구체예에서, 상기-기술된 재조합 벡터는 유전자 치료를 위해 공개된 방법에 따라서 인간에 투여된다. 선택된 이식 유전자를 함유하는 유인원 바이러스 벡터는 환자에 투여될 수 있으며, 바람직하게는 생물학적으로 양립가능한 용액 또는 약학적으로 허용가능한 전달 비히클에서 현탁된다. 적당한 비히클은 멸균 식염수를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체로 공지되고 당업자에게 잘 알려진 다른 수성 및 비-수성 등장 멸균 주사 용액 및 수성 및 비-수성 멸균 현탁액은 본 목적을 위해 사용될 수 있다.
유인원 아데노바이러스 벡터는 표적 세포를 형질도입하고 유전자 전달 및 발현의 충분한 수준을 제공하는데 충분한 양으로 투여되어, 지나친 불리함 없이 또는 의학적으로 허용가능한 생리적인 효과와 함께 치료적 이점을 제공하며, 이는 의학 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여의 통상적인 및 약학적으로 허용가능한 경로는, 제한되는 것은 아니지만, 망막에 직접적인 전달 및 다른 안구 전달 방법, 간에 직접적인 전달, 흡입, 비강내, 정맥내, 근육내, 기관내, 피하, 피내, 직장, 경구 및 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 투여 경로는, 원한다면, 이식 유전자 또는 질환에 따라서 조합 또는 조절될 수 있다. 투여 경로는 주로 치료되는 질환의 특성에 의존할 것이다.
바이러스 벡터의 투약은 치료되는 질환, 환자의 연령, 체중 및 건강상태와 같은 요인에 주로 의존할 것이고, 따라서 환자들 사이에서 다양할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 치료적으로 유효한 성인 인간 또는 수의과 투약량은 일반적으로 약 1 x 106 내지 약 1 x 1015 입자, 약 1 x 1011 내지 1 x 1013 입자, 또는 약 1 x 109 내지 1 x 1012 입자 바이러스의 농도를 함유하는 담체의 약 100 μL 내지 약 100 mL의 범위에 있다. 투약량은 동물의 크기 및 투여 경로에 의존하는 범위에 있을 것이다. 예를 들어, 근육내 주사에 대해 적당한 인간 또는 수의적 투약량(약 80 kg 동물)은 단일 자리에 대해 mL 당, 약 1 x 109 내지 약 5 x 1012 입자의 범위에 있다. 선택적으로, 투여의 다양한 자리는 전달될 수 있다. 다른 예에서, 적당한 인간 또는 수의적 투여는 경구 제형에 대해 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1015 입자의 범위에 있을 수 있다. 당업자는 투여 경로, 및 재조합 벡터가 사용되기 위한 치료 또는 백신 용도에 따라서 이들 용량을 조절할 수 있다. 이식 유전자의 발현 수준, 또는 면역원, 순환 항체의 수준은 투약량 투여의 빈도를 결정하기 위해 모니터링 될 수 있다. 투여 빈도의 시간을 결정하기 위한 또 다른 방법은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
선택적 방법 단계는 바이러스 벡터의 투여와 동시에, 또는 전 또는 후에 적당한 양의 짧은 작동 면역 조절자의 환자에서 공동-투여를 수반한다. 선택된 면역 조절자는 본 발명의 재조합 벡터에 대해 관련된 중화 항체의 형성을 억제할 수 있는 또는 벡터의 T 림프구 (CTL) 제거를 억제할 수 있는 약제로서 본원에 정의된다. 면역 조절자는 T 헬퍼 서브셋(TH1 또는 TH2)과 B 세포 사이에서 상호작용을 방해하여 중화 항체 형성을 억제할 수 있다. 또 다르게는, 면역 조절자는 TH1 세포와 CTL 사이의 상호작용을 억제하여 벡터의 CTL 제거의 발생을 감소시킬 수 있다. 다양한 유용한 면역 조절자 및 그것의 사용을 위한 투약량은, 예를 들어, Yang et al., J. Virol., 70(9) (Sept., 1996); 1996년 5월 2일 공개된 국제 특허 출원 번호 WO96/12406; 및 본원에 모두 참고로써 포함되는 국제 특허출원 번호 PCT/US96/03035에서 개시된다.
1. 치료 이식 유전자
이식 유전자에 의해 암호화되는 유용한 치료적 생성물은, 제한 없이, 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 파라티로이드 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 여포 자극 호르몬(FSH), 황체 형성 호르몬(LH), 인간 융모성 고나도트로핀(hCG), 혈관내피성장인자(VEGF), 엔지오포이에틴, 엔지오스태틴, 백혈구조혈성장인자 (GCSF), 에리스로포이에틴(EPO), 결합조직 성장인자(CTGF), 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF), 상피세포성장인자(EGF), 형질전환 성장인자 (TGF), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 인슐린 성장 인자 1 및 II (IGF-I 및 IGF-II), TGF, 액티빈, 인히빈을 포함하는 형질전환 성장 인자 수퍼패밀리의 어떤 하나, 또는 어떤 뼈 형성 단백질(BMP) BMPs 1-15, 성장 인자의 헤레귤인/뉴레귤린/ARIA/neu 분화 인자(NDF) 패밀리 중 어떤 하나, 신경 성장인자(NGF), 뇌-유래 신경 친화성 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT-4/5, 섬모 향신경성 인자(CNTF), 신경아교세포계 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 애그린, 세마포린/콜랩신의 패밀리 중 어떤 하나, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포성장인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 히드록실라아제를 포함하는 호르몬 및 성장 및 분화 인자를 포함한다.
다른 유용한 이식 유전자 생성물은, 제한 없이, 사이토카인 및 림포카인, 예로써, 트롬보포이에틴(TPO), IL-25를 통한 인터류킨(IL) IL-1(예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12 및 IL-18을 포함), 단핵세포 화학유인물질 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립성 백혈구 - 대식세포 집락 자극인자, 파스(Fas) 리간드, 종양 괴사 인자 및, 인터페론, 및 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드를 포함하는 면역 체계를 조절하는 단백질을 포함한다. 면역 체계에 의해 생성되는 유전자 생성물은 또한 본 발명에 유용하다. 이들은, 제한 없이, 면역글로불린 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일쇄 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일쇄 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자, 및 공학변형된 면역글로불린 및 MHC 분자를 포함한다. 유용한 유전자 생성물은 또한 상보적 조절 단백질, 막 보조 단백질(MCP), 붕괴 촉진인자(DAF), CR1, CF2 및 CD59를 포함한다.
또 다른 유용한 유전자 생성물은 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 림포카인, 조절 단백질 및 면역 체계 단백질에 대한 수용체 중 어떤 하나를 포함한다. 본 발명은 저밀도 리포단백질(LDL) 수용체, 고밀도 리포단백질(HDL) 수용체, 매우 낮은 밀도 리포단백질(VLDL) 수용체, 및 스캐빈저 수용체를 포함하는 콜레스테롤 조절을 위한 수용체를 포함한다. 본 발명은 또한 글루코코르티코이드 수용체 및 에스트로겐 수용체, 비타민 D 수용체 및 다른 핵 수용체를 포함하는 스테로이드 호르몬 수용체 수퍼패밀리의 멤버와 같은 유전자 생성물을 포함한다. 게다가, 유용한 유전자 생성물은 전사 인자, 예컨대, jun , fos, max, mad, 혈청반응인자(SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD 및 마이오제닌, ETS-박스 함유 단백질, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-박스 결합 단백질, 인터페론 조절 인자 (IRF-1), 윌름 종양 단백질, ETS-결합 단백질, STAT, GATA-박스 결합 단백질, 예컨대, GATA-3, 및 날개달린(winged) 나선형 단백질의 포크헤드(forkhead) 패밀리를 포함한다.
다른 유용한 생성물은, 카르바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제, 아르기노숙시네이트 합성효소, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나아제, 푸마릴아세트아세테이트 가수분해효소, 페닐알라닌 가수분해효소, 알파-1 안티트립신, 글루코오스-6-포스페이트, 포르포빌리노겐 디아미나아제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-합성효소, 가지사슬 케토산 데카르복실라아제, 알부민, 이소발레릴-coA 탈수소효소, 프로피오닐 CoA 카르복실라아제, 메틸 말로닐 CoA 무타아제, 글루타릴 CoA 탈수소효소, 인슐린, 베타-글루코시다아제, 파이루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라아제, 포스포릴라아제 키나아제, 글리신 데카르복실라아제, H-단백질, T-단백질, 낭포성 섬유증 막단백질 조절자(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 cDNA 서열을 포함한다.
다른 유용한 유전자 생성물은 비-천연적으로 발생하는 폴리펩티드, 예컨대, 삽입, 결실 또는 아미노산 치환을 함유하는 비-천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가지는 키메라 또는 하이브리드 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 단일-사슬 공학변형된 면역글로불린은 특정 면역타협 환자에서 유용할 수 있다. 비-천연적으로 발생하는 유전자 서열의 다른 종류는 표적의 과발현을 감소시키는데 사용될 수 있는 안티센스 분자 및 촉매적 핵산, 예를 들어 리보자임을 포함한다.
유전자 발현의 감소 및/또는 조절은 암 및 건선과 같이 이상증식 세포를 특징으로 하는 이상증식 질환의 치료에 특히 바람직하다. 표적 폴리펩티드는 정상 세포와 비교하여 이상증식 세포에서 배타적으로 또는 더 높은 수준으로 생성되는 폴리펩티드를 포함한다. 표적 항원은 myb, myc, fyn, 및 전좌 유전자 bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF과 같은 종양유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함한다. 표적 항원으로서 종양유전자 생성물에 더하여, 항-암 치료를 위한 표적 폴리펩티드 및 보호 요법은 B 세포 림프종에 의해 만들어지는 항체의 가변 영역 및 T 세포 림프종의 T 세포 수용체의 가변 영역을 포함하며, 일부 구체예에서, 이는 또한 자가면역 질병에 대한 표적 항원으로서 사용된다. 다른 종양-관련 폴리펩티드는 모노클로날 항체 17-1A 및 폴레이트 결합 폴리펩티드에 의해 인식되는 폴리펩티드를 포함하는 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발견되는 폴리펩티드와 같은 표적 폴리펩티드로서 사용될 수 있다.
다른 적당한 치료 폴리펩티드 및 단백질은 세포 수용체 및 자기-관련 항체를 생성하는 세포를 포함하는 자가면역과 관련된 표적에 대하여 광범위 기초 보호 면역 반응을 부여함으로써 자가면역 질병 및 장애를 겪고 있는 개체를 치료하는데 유용할 수 있는 것들을 포함한다. T 세포 매개 자가면역 질병은 류마티스 관절염(RA), 다발성경화증(MS), 쇼그렌증후군, 유육종증, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상샘염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성 근염, 건선, 혈관염, 베게너 육아종증, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함한다. 각각의 이들 질병은 내인성 항원에 결합하고 자가면역 질병에 관련되는 면역 캐스캐이드를 시작하는 T 세포 수용체(TCR)를 특징으로 한다.
본 발명의 유인원 아데노바이러스 벡터는 특히 이식 유전자의 다양한 아데노바이러스-매개 전달이 요망되는 치료 요법에서, 예를 들어, 동일한 이식 유전자의 회복을 수반하는 요법에서 또는 다른 이식 유전자의 전달을 수반하는 요법과 조합하여 적합하다. 이러한 요법은 SAdV28 유인원 아데노바이러스 벡터의 투여 후, 동일한 항원형 아데노바이러스로부터의 벡터와 함께 재-투여를 수반할 수 있다. 특히 바람직한 요법은 SAdV28 유인원 아데노바이러스 벡터의 투여를 수반하며, 제 1 투여로 전달되는 벡터의 아데노바이러스 캡시드 서열의 공급원은 하나 이상의 이후의 투여에서 이용되는 바이러스 벡터의 아데노바이러스 캡시드 서열의 공급원과 다르다. 예를 들어, 치료 요법은 SAdV28 벡터의 투여 및 동일 또는 다른 항원형의 하나 이상의 아데노바이러스 벡터에 의한 반복 투여를 수반한다. 다른 예에서, 치료 요법은 아데노바이러스 벡터의 투여 후 제 1 전달 아데노바이러스 벡터에서 캡시드의 공급원과 다른 캡시드를 가지는 SAdV28 벡터에 의한 반복 투여, 및 선택적으로 투여 단계 전 벡터의 아데노바이러스 캡시드의 공급원과 동일한 또는, 바람직하게는 다른, 벡터에 의한 투여를 수반한다. 이들 요법은 SAdV28 유인원 서열을 사용하여 구성되는 아데노바이러스 벡터의 전달에 제한되지 않는다. 오히려, 이들 요법은, 제한 없이, 하나 이상의 SAdV28 벡터와 조합하여, 다른 유인원 아데노바이러스 서열(예를 들어, Pan9 또는 C68, C1, 등), 다른 비-인간 영장류 아데노바이러스 서열, 또는 인간 아데노바이러스 서열을 포함하는 다른 아데노바이러스 서열을 용이하게 이용할 수 있다. 이러한 유인원, 다른 비-인간 영장류 및 인간 아데노바이러스 항원형의 예는 본 문서에서 어디에서나 논의된다. 추가로, 이 치료 요법은 비-아데노바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 및/또는 다양한 다른 치료적으로 유용한 화합물 또는 분자와 조합하여 SAdV28 아데노바이러스 벡터의 자발적 또는 순차적 전달을 수반할 수 있다. 본 발명은 이들 치료 요법에 제한되지 않으며, 다양한 것들이 당업자에게 용이하게 명확할 것이다.
B. 면역성 이식 유전자의 Ad-매개 전달
재조합 SAdV-28 벡터는 또한 면역성 조성물로서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역성 조성물은 체액(예를 들어, 항체) 또는 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포) 반응이 포유동물, 및 바람직하게는 영장류에 전달 후 면역성 조성물에 의해 전달되는 이식 유전자 생성물에 고정되는 조성물이다. 재조합 유인원 Ad는 원하는 면역원을 암호화하는 그것의 아데노바이러스 서열 결실 유전자 중 어떤 것을 함유할 수 있다. 유인원 아데노바이러스는 인간 기원의 아데노바이러스와 비교하여 다른 동물 종에서 살아있는 재조합 바이러스 백신으로서 사용에 더 적합할 가능성이 있지만, 이러한 사용에 제한되는 것은 아니다. 재조합 아데노바이러스는 면역 반응의 유발에 결정적이고 병원체의 확산을 제한할 수 있다는 것이 확인된 항원(들)에 대한 어떤 병원체 및 cDNA에 대해 이용가능한 어떤 병원체에 대하여 예방 또는 치료 백신으로서 사용될 수 있다.
이러한 백신(또는 다른 면역원) 조성물은 상기 기술한 바와 간은 적당한 전달 비히클에서 제형화된다. 일반적으로 면역성 조성물에 대한 용량은 치료 조성물에 대해 상기 정의한 범위에 있다. 선택 유전자의 면역의 수준은, 만약에 있다면, 부스터에 대한 필요를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 혈청에서 항체 타이터의 평가에 따라서, 선택적인 부스터 면역이 요망될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 백신 조성물은, 예를 들어, 보조제, 안정화제, pH 조절제, 보존제 등을 포함하는 다른 성분을 함유하기 위해 제형화될 수 있다. 이러한 성분은 백신 업계에서 당업자에게 잘 공지되어 있다. 적당한 보조제의 예는, 제한없이, 리포좀, 알륨, 모노포스포릴 지질 A, 및 어떤 생물학적으로 활성인 인자, 예로써, 사이토카인, 인터류킨, 케모킨, 리간드 및 최상으로는 그것의 조합을 포함한다. 특정의 이들 생물학적으로 활성인 인자는 생체내, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 통해 발현될 수 있다. 예를 들어, 이러한 보조제는 항원만을 암호화하는 DNA 백신과 함께 프라이밍 시 발생되는 면역 반응과 비교하여, 항원-특이적 면역 반응을 향상시키기 위해 항원을 암호화하는 프라이밍 DNA 백신과 함께 투여될 수 있다.
재조합 아데노바이러스는 "면역원 양", 즉, 원하는 세포를 트랜스펙팅하기 위해 투여되는 경로에서 효과적이고, 면역 반응을 유발하기 위해 선택되는 유전자의 발현의 충분한 수준을 제공하는 양으로 투여된다. 보호 면역이 제공되는 경우, 재조합 아데노바이러스는 감염 및/또는 재발을 예방하는데 유용한 백신 조성물이 되는 것으로 고려된다.
또 다르게는, 또는 추가로, 본 발명의 벡터는 선택된 면역원에 대한 면역 반응을 유발하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 이식 유전자를 함유한다. 재조합 SAdV-28, AdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터는 벡터에 의해 발현되는 삽입된 이종성 항원 단백질에서 세포 용해 T 세포 및 항체를 유발할 때 매우 효율적인 것으로 기대된다.
예를 들어, 면역원은 다양한 바이러스 과로부터 선택될 수 있다. 면역 반응이 바람직한 바이러스 패밀리의 예는, 보통 감기의 약 50%의 경우를 초래하는 리노바이러스 속; 폴리오바이러스, 콕사키 바이러스, 에코바이러스 및 A형 간염 바이러스와 같은 인간 엔테로바이러스를 포함하는 엔테로바이러스 속; 및 주로 비-인간 동물에서 발 및 구강 질병을 초래하는 압소바이러스 속을 포함하는 피코르나바이러스 과를 포함한다. 바이러스의 피코르나바이러스 과 내에서, 표적 항원은 VP1, VP2, VP3, VP4, 및 VPG를 포함한다. 다른 바이러스 과는 바이러스의 노워크(Norwalk) 군을 포함하고, 유행성 위장염의 중요한 감염인자인 칼시바이러스 과를 포함한다. 인간 및 비-인간 동물에서 면역 반응을 유발하기 위한 표적 항원에서 사용에 바람직한 또 다른 바이러스 과는 토가바이러스 과이며, 이는 신드비스 바이러스, 로스리버 바이러스 및 베네수엘라, 동부형&서부형 마뇌염, 및 루벨라 바이러스를 포함하는 루비바이러스를 포함하는 알파바이러스 속을 포함한다. 플라비비리다에과는 뎅기열, 황열, 일본 뇌염, 세인트루이스 뇌막염 및 진드기매개 바이러스를 포함한다. 다른 표적 항원은 C형 간염 또는 코로나바이러스과로부터 발생될 수 있으며, 이는 다수의 비-인간 바이러스, 예컨대, 전염성 기관지염(가금류), 돼지 전염성 위장염 바이러스(돼지), 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스(돼지), 고양이 전염성 복막염 바이러스(고양이), 고양이 장 코노나바이러스(고양이), 개 코로나바이러스(개), 및 인간 호흡 코로나바이러스를 포함하며, 이는 보통의 감기 및/또는 비-A, B 또는 C형 간염을 야기할 수 있다. 코로나바이러스과 내에서, 표적 항원은 E1 (또한 M 또는 매트릭스 단백질로 불림), E2 (또한 S 또는 스파이크 단백질로 불림), E3 (또한 HE 또는 헤마그글루틴-엘터로오스로 불림) 글리코단백질(모든 코로나바이러스에 존재하지 않음) 또는 N(뉴클레오캡시드)을 포함한다. 또 다른 항원은 베시큘로바이러스속(예를 들어, 소수포형 구내염 바이러스), 및 리사 바이러스속(예를 들어, 광견병)을 포함하는 랩도 바이러스과를 표적으로 할 수 있다.
랩도바이러스 과 내에서, 적당한 항원은 G 단백질 또는 N 단백질로부터 유래될 수 있다. 마르부르크 및 에볼라 바이러스와 같은 출혈열 바이러스를 포함하는 필로바이러스 과는 항원의 적당한 공급원일 수 있다. 파라믹소바이러스 과는 파라인플루엔자 바이러스 타입 1, 파라인플루엔자 바이러스 타입 3, 소 파라인플루엔자 바이러스 타입 3, 루불라바이러스(멈프스 바이러스), 파라인플루엔자 바이러스 타입 2, 파라인플루엔자 바이러스 타입 4, 뉴캐슬병 바이러스(닭), 우역, 홍역 및 개디스템퍼를 포함하는 모르비리바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스를 포함하는 뉴모바이러스를 포함한다. 인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스 과 내로 분류되며 적당한 항원(예를 들어, HA 단백질, N1 단백질)의 공급원이다. 분야바이러스 과는 분야바이러스 속(캘리포니아뇌염, La Crosse), 플레보바이러스(리프트 밸리열), 한타바이러스 (퓨어말라(puremala)는 헤마하긴(hemahagin) 열 바이러스이다), 나이로바이러스(진드기증(Nairobi sheep disease)) 및 다양한 미지정 분야바이러스를 포함한다. 아레나바이러스 과는 LCM 및 라사열 바이러스에 대한 항원의 공급원을 제공한다. 레오 바이러스 과는 레오바이러스, 로타바이러스(어린이에게서 급성위장염을 야기한다), 오르비바이러스, 및 컬티바이러스(콜로라도진드기열, 레봄보(Lebombo) (인간), 말 뇌증, 청설병) 속을 포함한다.
레트로바이러스 과는 고양이 백혈병 바이러스, HTLVI 및 HTLVII, 렌티바이러스(인간 면역결핍 바이러스(HIV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역부전 바이러스(FIV), 말 전염성 빈혈 바이러스 및 스푸마바이러스를 포함)로서 인간 및 수의과 질병을 포함하는 옹코리비리날(oncorivirinal) 아과를 포함한다. 렌티바이러스 중에서, 많은 적당한 항원이 기술되었고 용이하게 선택될 수 있다. 적당한 HIV 및 SIV 항원의 예는, 제한 없이, gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef, 및 Rev 단백질뿐만 아니라 그것의 다양한 단편을 포함한다. 예를 들어, Env 단백질의 적당한 단편은 gp120, gp160, gp41과 같은 어떤 그것의 서브유닛, 또는 그것의 더 작은 단편, 예를 들어, 길이에 있어 적어도 약 8개의 아미노산을 포함할 수 있다. 유사하게, tat 단백질의 단편이 선택될 수 있다. [미국 특허 5,891,994호 및 미국 특허 6,193,981호 참조] 또한, D.H. Barouch et al, J. Virol., 75(5):2462-2467 (March 2001년 3월), 및 R.R. Amara, et al, Science, 292:69-74 (2001년 4월 6일)에서 기술되는 HIV 및 SIV 단백질 참조. 다른 예에서, HIV 및/또는 SIV 면역성 단백질 또는 펩티드는 융합 단백질 또는 다른 면역성 분자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 2001년 8월 2일 공개된 WO 01/54719, 및 1999년 4월 8일 공개된 WO 99/16884에서 기술되는 HIV-1 Tat 및/또는 Nef 융합 단백질 및 면역 요법을 참조. 본 발명은 HIV 및/또는 SIV 면역원성 단백질 또는 본원에 기술되는 펩디드로 제한되지 않는다. 게다가, 이들 단백질에서 다양한 변형이 기술되었고, 또는 당업자에 의해 용이하게 만들어질 수 있었다. 예를 들어, 미국 특허 5,972,596에서 기술되는 변형된 구역 단백질(gag protein)을 참조. 추가로, 어떤 요망되는 HIV 및/또는 SIV 면역원은 단독으로 또는 조합하여 전달될 수 있다. 이러한 조합은 단일 벡터 또는 다중 벡터로부터 발현을 포함할 수 있다. 선택적으로, 다른 조합은 단백질 형태에서 하나 이상의 면역원의 전달과 함께 하나 이상의 발현된 면역원의 전달을 수반할 수 있다. 이러한 조합은 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
파포바바이러스 과는 폴리오마바이러스 아과(BKU 및 JCU 바이러스) 및 파필로마바이러스 아과(암 또는 유두종의 악성 진행과 관련)를 포함한다. 아데노바이러스 과는 호흡기 질병 및/또는 장염을 야기하는 바이러스(EX, AD7, ARD, O. B.)를 포함한다. 파보바이러스 과 고양이 파보 바이러스(고양이 장염), 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 개 파보바이러스 및 돼지 파보바이러스. 헤르페스바이러스 과는 심플렉스바이러스 속 (HSVI, HSVII), 바리셀로바이러스 (가성광견병, 바리셀라-조스터 바이러스)를 포함하는 알파헤르페스바이러스 아과 및 시토메갈로 바이러스(HCMV, 무로메갈로바이러스)를 포함하는 베타헤르페스바이러스 아과 및 림포크립토바이러스 속, EBV (버킷 임파종(Burkitts lymphoma)), 전염성비기관염, 마렉병 바이러스, 및 라디노바이러스를 포함하는 감마헤르페스바이러스 아과를 포함한다. 수두 바이러스과는 오르토폭스바이러스(바리올라 (두창) 및 백시니아 (우두)), 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스, 레포리폭스바이러스, 수이폭스바이러스 속을 포함하는 초르도폭스바이러스아과, 및 엔토모폭스바이러스 아과를 포함한다. 헤파드나바이러스 과는 B형 간염 바이러스를 포함한다. 적당한 항원의 공급원일 수 있는 한 미분류 바이러스는 델타감염 바이러스이다. 또 다른 바이러스 공급원은 조류 전염성 훼브리셔스낭병 바이러스 및 돼지 호흡기 생식기 증후군 바이러스를 포함할 수 있다. 알파바이러스 과는 말동맥염바이러스 및 다양한 뇌염바이러스를 포함한다.
다른 병원체에 대한 인간 또는 비-인간 동물을 면역화하는데 유용한 면역원은, 예를 들어, 인간 및 비-인간 척추동물을 감염시키는 박테리아, 진균, 기생충미생물 또는 다세포 기생충, 또는 암 세포 또는 종양 세포를 포함한다. 박테리아 병원체의 예는 폐렴쌍구균; 포도상구균; 및 연쇄상구균을 포함하는 병원체의 그램양성 구균을 포함한다. 병원체의 그램-음성 구균은 뇌척수막염균; 임균을 포함한다. 병원체의 장 그램-음성 간균은 장내세균(enterobacteriaceae); 슈도모나스, 아시네토박테리아 및 에이케넬라; 멜리오이도시스; 살모넬라; 시겔라; 헤모필루스; 모락셀라; H. 듀크레이(무른 궤양을 야기함); 브루셀라균; 프란시셀라 툴라렌시스균(툴라레미아를 야기); 예르시니아(파스튜렐라); 모닐리포르미스사슬막대균 및 나선균을 포함하고; 그램-양성 간균은 리스테리아모노사이토제네스; 돈단독균(erysipelothrix rhusiopathiae); 코리네박테리움 디프테리아(디프테리아); 콜레라; 탄저균 (탄저병); 도노반증(서혜육아종); 및 바르토넬라증을 포함한다. 병원성 혐기성 세균에 의해 야기되는 질병은 파상풍; 보툴리즘; 다른 클로스트리디아; 결핵; 나병; 및 다른 마이코박테리아를 포함한다. 병원성 스피로헤타병은 매독; 트레포네마병: 매종, 핀타 및 풍토병성 매독; 및 렙토스피라병을 포함한다. 더 고등의 병원체 박테리아 및 병원성 진균에 의해 야기되는 다른 감염은 방선균증; 노카르디아증; 효모균증, 분아진균증, 히스토플라스마증 및 콕시디오이데스 진균증; 칸디다증, 아스페르길루스증, 및 뮤코르 진균증; 스포로트릭스증; 파라콕시디오이드마이세스증, 페트리엘리듐증, 토룰롭시스증, 균종 및 색소진균증; 및 피부사상균증을 포함한다. 리케차감염은 발진티푸스, 로키산 홍반열, Q열, 및 리켓치아폭스를 포함한다. 마이코플라스마 및 클라미디아 감염의 예는: 마이코플라즈마 뉴모니아; 서혜 림프 육아종; 앵무새병; 및 주산기 클라미디아 감염을 포함한다. 병원성 진핵생물은 병원성 원생동물 및 장내 기생충을 포함하고, 이에 의해 생성되는 감염은: 아메바성 감염; 말라리아; 리슈만편모충증; 트리파노소마증; 톡소플라스마증; 폐포자충(Pneumocystis carinii); 트리칸스(Trichans); 톡소포자충(Toxoplasma gondii) ; 바베스열원충증; 지알디아증; 선모충병; 필라리아병; 주혈흡충병; 선충; 흡충 또는 요행; 및 촌충류(촌충) 감염을 포함한다.
다수의 이들 유기체 및/또는 이에 의해 생성되는 독소는 생물학적 공격에서 사용을 위한 가능성을 가지는 약제로서 질병 대책 센터(Centers for Disease Control)[(CDC), Department of Heath and Human Services, USA]에 의해 확인되었다. 예를 들어, 일부의 이들 생물학적 약제는 탄저균 (탄저병), 클로스트리디움 보툴리늄 및 그것의 독소(보툴리즘), 페스트균(Yersinia pestis)(흑사병), 대두창(두창), 프란키셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(툴라레미아), 및 바이러스성 출혈열[필로바이러스(예를 들어, Ebola, Marburg], 및 아레나바이러스[예를 들어, Lassa, Machupo])를 포함하며, 이들 모두는 현재 카테고리 A 약제로서 분류되며; 콕시엘라 부르네티(Q 열); 브루셀라 종(브루셀라병), 비저균(Burkholderia mallei)(마비저), 부르코홀데리아 슈도 말레이(Burkholderia pseudomallei)(유비저), 피마자 및 그것의 독소(리신 독소), 클로스트리듐 균(clostridium perfringen) 및 그것의 독소(엡실론 독소), 포도상구균 종 및 그것의 독소(엔테로톡시 B), 클라미디아 시타시(앵무새병), 물의 안전성 위협(예를 들어, 비브리오콜레라, 크립토스포리듐 파르붐), 발진티푸스(리케챠 포와제키(Rickettsia powazekii)), 및 바이러스성뇌염(알파바이러스, 예를 들어, 베네수엘라마뇌염; 동부형마 뇌막염; 서부형 마뇌염)를 포함하고; 이들 모두는 카테고리 B 약제로서 분류되고; 니판 바이러스 및 한타바이러스를 포함하고, 이것은 카테고리 C 약제로서 분류된다. 게다가, 이렇게 분류 또는 다르게 분류되는 다른 유기체는 장래의 목적을 위해 확인 및/또는 사용될 수 있다. 본원에서 기술되는 바이러스 벡터 및 다른 구조체는 이들 유기체, 바이러스, 그것의 독소 또는 다른 부산물로부터, 이들 생물학적 약제에 의한 감염 또는 다른 역반응을 예방 및/또는 치료할 항원을 전달하는데 유용하다는 것이 이해될 것이다.
T 세포의 가변 영역에 대해 면역원을 전달하는 SAdV-28 벡터의 투여는 이들 T 세포를 제거하기 위해 CTL을 포함하는 면역반응을 일으키는 것으로 예상된다. RA에서, 질병에 수반되는 TCR의 몇몇의 특정 가변 영역은 특성이 기술되었다. 이들 TCR은 V-3, V-14, V-17 및 Vα-17을 포함한다. 따라서, 적어도 하나의 이들 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 전달은 RA에 수반된 T 세포를 표적화할 면역반응을 유발할 것이다. MS에서, 질병에 수반된 TCR의 몇몇 특정 가변 영역은 특성이 기술되었다. 이들 TCR은 V-7 및 Vα-10을 포함한다. 따라서, 적어도 하나의 이들 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 전달은 MS에 수반되는 T세포를 표적화할 면역반응을 유발할 것이다. 경피증에서, 질병에 수반된 TCR의 몇몇 특정 가변 영역은 특성이 기술되었다. 이들 TCR은 V-6, V-8, V-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 및 Vα-12을 포함한다. 따라서, 적어도 하나의 이들 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 유인원 아데노바이러스의 전달은 경피증에 수반된 T 세포를 표적화할 면역 반응을 일으킬 것이다.
C. Ad-매개 전달 방법
선택된 유전자의 치료 수준, 또는 면역의 수준은, 만약에 있다면, 부스터에 대한 필요를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 혈청에서 CD8+ T 세포 반응, 또는 선택적으로 항체 타이터의 평가에 따라서, 선택적인 부스터 면역화가 요망될 수 있다. 선택적으로, 재조합 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터는 단일 투여에서 또는 예를 들어, 다른 활성 성분을 수반하는 요법 또는 치료의 과정과 조합하는 다양한 요법 또는 프라임-부스트 요법에서 전달될 수 있다. 다양한 이러한 요법은 당업계에서 기술되었고 용이하게 선택될 수 있다.
예를 들어, 프라임-부스트 요법은 일차 면역 체계로 DNA(예를 들어, 플라스미드) 기초 벡터를, 이차의 부스터로 이러한 항원을 암호화하는 서열을 전달하는 단백질 또는 재조합 바이러스와 같은 일반적인 항원의 투여를 수반할 수 있다. 예를 들어, 참고로써 포함되는 2000년 3월 2일 공개된 WO 00/11140 참조. 또 다르게는, 면역 요법은 항원, 또는 단백질을 전달하는 벡터(바이러스 또는 DNA-기초)에 대한 면역 반응을 촉진하기 위해 재조합 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터의 투여를 수반할 수 있다. 또 다른 대안으로, 면역 요법은 단백질의 투여 후 항원을 암호화하는 벡터와 함께 부스터를 수반한다.
한 구체예에서, 상기 항원을 전달하는 플라스미드 DNA 벡터를 전달한 후 재조합 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터로 부스팅함으로써 선택된 항원에서 면역반응을 프라이밍하고 부스팅하는 방법이 기술된다. 한 구체예에서, 프라임-부스트 요법은 프라임 및/또는 부스트 비히클로부터 멀티단백질의 발현을 수반한다. 예를 들어, HIV 및 SIV에 대한 면역 반응을 발생시키는데 유용한 단백질 서브유닛의 발현에 대한 멀티단백질 요법을 기술하는 R. R. Amara, Science, 292:69-74 (2001년 4월 6일) 참조. 예를 들어, DNA 프라임은 단일 전사로부터 Gag, Pol, Vif, VPX 및 Vpr 및 Env, Tat, 및 Rev를 전달할 수 있다. 또 다르게는, SIV Gag, Pol 및 HIV-1 Env는 재조합 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 아데노바이러스 구조체에서 전달된다. 또 다른 요법은 WO 99/16884 및 WO 01/54719에서 기술된다.
그러나, 프라임-부스트 요법은 HIV에 대한 면역 또는 이들 항원의 전달에 제한되지 않는다. 예를 들어, 프라이밍은 제 1 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터에 의한 전달단계 후 제 2 Ad 벡터로, 또는 단백질 형태에서 항원 그 자체를 함유하는 조성물과 함께 부스팅하는 단계를 수반할 수 있다. 한 예에서, 프라임-부스트 요법은 항원이 유래된 바이러스, 박테리아 또는 다른 유기체에 대한 보호 면역 반응을 제공할 수 있다. 다른 구체예에서, 프라임-부스트 요법은 치료제가 투여되는 질환의 존재의 검출을 위한 통상적인 분석을 사용하여 측정될 수 있는 치료효과를 제공한다.
프라이밍 조성물은 요망되는 면역 반응이 표적화되는 항원에 따라서 용량 의존적 방법으로 다양한 자리에 투여될 수 있다. 주사(들)의 양 또는 위치 또는 약학적 담체는 제한되지 않는다. 오히려, 요법은 이들 각각이 매 시간마다, 매일, 주마다 또는 매월 또는 매년마다 투여되는 단일 용량 또는 투약량을 포함할 수 있는 프라이밍 및/또는 부스팅 단계를 수반할 수 있다. 예로서, 포유동물은 담체에서 약 10 μg 내지 약 50 μg의 플라스미드를 함유하는 하나 이상의 용량을 수용할 수 있다. DNA 조성물의 바람직한 양은 약 1 μg 내지 약 10,000 μg의 DNA 벡터의 범위에 있다. 투약량은 피험자 체중 당 1 μg 내지 1000 μg DNA로 다양할 것이다. 전달의 양 또는 자리는 포유동물의 동일성 및 질환에 기초하여 바람직하게 선택된다.
포유동물에 대한 항원의 전달에 적당한 벡터의 투약 단위는 본원에서 기술된다. 벡터는 등장 식염수; 등장 염 용액 또는 이러한 투여에서 당업자에게 명백할 다른 제형과 같은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체로 현탁 또는 용해됨으로써 투여를 위해 제조된다. 적절한 담체는 당업자에게 명백할 것이고 투여 경로의 상당 부분에 의존할 것이다. 본원에 기술되는 조성물은 상기 기술된 경로에 따라서, 서방성 제형으로 생체분해가능한 생체적합성 폴리머를 사용하여, 또는 미셀, 겔 및 리포좀을 사용하는 현장 전달에 의해 포유동물에 투여될 수 있다. 선택적으로, 프라이밍 단계는 또한 본원에 기술되는 바와 같은 프라이밍 조성물, 적당한 양의 보조제와 함께 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 부스팅 조성물은 포유동물 피험자에 대해 프라이밍 조성물을 투여 후 약 2 내지 약 27주에 투여된다. 부스팅 조성물의 투여는 프라이밍 DNA 백신에 의해 투여되는 동일한 항원을 함유하는 또는 전달할 수 있는 부스팅 조성물의 유효량을 사용하여 수행된다. 부스팅 조성물은 동일한 바이러스 공급원(예를 들어, 본 발명의 아데노바이러스 서열) 또는 다른 공급원으로부터 유래된 재조합 바이러스 벡터로 구성될 수 있다. 또 다르게는, "부스팅 조성물"은 프라이밍 DNA 백신에서, 그러나 조성물이 숙주에서 면역 반응을 유발하는 단백질 또는 펩티드의 형태로 암호화되는 바와 같은 동일한 항원을 함유하는 조성물일 수 있다. 다른 구체예에서, 부스팅 조성물은 포유동물 세포에서 그것의 발현을 지시하는 조절 서열, 예를 들어, 잘-공지된 박테리아 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터의 제어하에서 항원을 암호화하는 DNA 서열을 함유한다. 부스팅 조성물의 일차적 요건은 조성물의 항원이 프라이밍 조성물에 의해 암호화되는 동일 항원, 또는 교차-반응 항원이다.
다른 구체예에서, SAdV-28 벡터는 또한 다양한 다른 면역 및 치료 요법에서 사용을 위해 적합하게 된다. 이러한 요법은 다른 항원형 캡시드의 Ad 벡터와 함께 동시에 또는 순차적으로 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터의 전달, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터가 동시에 또는 순차적으로 비-Ad 벡터와 함께 전달되는 요법, SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 벡터가 동시에 또는 순차적으로 단백질, 펩티드 및/또는 다른 생물학적으로 유용한 치료 또는 면역원성 화합물과 함께 전달되는 요법을 수반할 수 있다. 이러한 사용은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
하기 실시예는 SAdV-28, SAdV-27, SAdV-29, SAdV-32, SAdV-33 및/또는 SAdV-35 및 대표적인 재조합 SAdV-28 벡터의 구성의 클로닝을 예시한다. 이들 실시예는 단지 예시적이며, 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예 1 - 유인원 아데노바이러스의 분리.
University of Louisiana New Iberia Research Center, 4401 W. Admiral Doyle Drive, New Iberia, Louisiana, USA에서 침팬지 집단, 및 Michael E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Bastrop, Texas, USA에서 침팬지 집단으로부터 채변 샘플을 얻었다. 행크스 평형화 염 용액의 현탁액에서 침팬지 채변 샘플로부터의 상청액을 0.2 미크론 실린지 필터를 통해 멸균 여과하였다. 100 μl의 각각의 여과된 샘플을 인간 셀 라인 A549 배양물에 접종하였다. 이들 세포를 10% FBS, 1% Penn-Strep 및 50μg/ml 겐타마이신과 함께 Ham's F12에서 성장시켰다. 배양물에서 약 1 내지 2주 후, 시각적 세포변성 효과(CPE)는 몇몇의 접종물과 함께 세포 배양물에서 명백하였다. 아데노바이러스를 아데노바이러스 정제를 위한 표준 공개된 염화세슘 기울기 기술을 사용하여 A549 세포에서 배양물로부터 정제하였다. 정제한 아데노바이러스로부터 DNA를 분리하였고 Qiagen Genomic services, Hilden, Germany에 의해 완전히 서열화하였다.
바이러스 DNA 서열의 계통발생적 분석에 기초하여, 아데노바이러스 지정된 유인원 아데노바이러스 27 (SAdV-27), 유인원 아데노바이러스 28 (SAdV-28), 유인원 아데노바이러스 29 (SAdV-29), 유인원 아데노바이러스 32 (SAdV-32), 유인원 아데노바이러스 33, (SAdV-33) 및 유인원 아데노바이러스 35 (SAdV-35)를 인간 아군 B로서 동일 아군 내가 되도록 결정하였다.
벡터를 만들기 위해 사용되는 방법은 우선 전체 E1-결실 아데노바이러스 벡터의 박테리아 플라스미드 분자 클론을 만든 후 E1 보완 셀 라인 HEK 293에 플라스미드 DNA의 트랜스펙션을 하여 바이러스 벡터를 구제한다.
E1-결실 아데노바이러스 벡터의 분자 클론을 만들기 위해, 희소-절단(rare-cutting) 제한 효소 I-CeuI 및 PI-SceI에 대한 인식 자리가 E1 결실 대신에 삽입된다면, E1-결실 아데노바이러스의 플라스미드 분자 클론을 우선 만들었다. I-CeuI 및 PI-SceI에 의해 측면에 위치되고, 이들 제한 효소를 사용하여 절단되는 발현 카세트는 E1-결실 아데노바이러스 플라스미드 클론에 연결된다. E1 결실 대신에 요망되는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 아데노바이러스 분자 클론을 재조합 아데노바이러스 벡터를 구제하기 위해 HEK 293 세포에 트랜스펙팅하였다. 트랜스펙션 후 구제는 제한효소 분해에 의해 플라스미드로부터 선형 아데노바이러스 게놈을 우선 방출함으로써 가능하게 되는 것이 발견되었다.
실시예 2 - E1-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터의 유도를 가능하게 하기 위한 유인원 아군 B 아데노바이러스 27, -28, -29, -32, -33, 및 -35에 기초한 E1 결핍 플라스미드 분자 클론의 구성
AdC1(SAdV-21)을 경험하는 발명자 뿐만 아니라 두 개의 공개된 기록은 아군 B 아데노바이러스에서 E1 결핍이 HEK 293 세포에서 Ad5 E1 유전자에 의해 보완되지 않는다는 것을 나타내기 때문에, 종 B 아데노바이러스 SAdV-27, SAdV-28, SAdV-29, SAdV-32, 및 SAdV-35를 기초로 하는 벡터를 AdC1을 사용하는 하이브리드 아데노바이러스 벡터를 구성하는 이전의 기술된 전략을 기초로 구성하였고[Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21 ; Roy et al., J Gen Virol. (2006) 87, 2477-2485], 키메라 구조체의 왼쪽 및 오른쪽 말단은 침팬지 아데노바이러스 Pan 5로부터 유래된다(a.k.a. 유인원 아데노바이러스 22).
아군 B 아데노바이러스 벡터의 구성을 위한 출발 플라스미드는 2005년 1월 6일 공개된 WO 2005/001103 A3에서 기술되는 바와 같은 AdC1 키메라 벡터-pPan5CldelRI의 구조체에서 중간체로서 구성한 것이었다. 플라스미드 pPan5C1delRI는 EcoRI 제한 자리 사이에서 내부로 결핍된 E1 -결핍 키메라 Pan 5 (SAdV-22) 및 Ad C1 (SAdV-21) 아데노바이러스 게놈을 포함한다. 추가적으로, 희소-절단 제한 효소 I-CeuI 및 PI-Seel에 대한 인식 자리는 이식 유전자 카세트의 용이한 삽입을 가능하게 하기 위해 E1 결핍 대신에 존재한다.
A. 표준 분자 생물학 기술을 사용하는 SAdV -27에 기초한 E1-결핍 플라스미드 분자 클론의 구성
두 개의 공개된 기록 및 AdC1을 경험한 발명자가 아군 B 아데노바이러스에서 E1 결핍이 HEK 293 세포에서 Ad5 El 유전자에 의해 보완되지 않음이 나타냈기 때문에, 하이브리드 아데노바이러스는 AdC1을 사용하는 전략을 기초로 발생되었고[Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21 ; Roy et al., J Gen Virol. (2006) 87, 2477-2485], 키메라 구조체의 왼쪽 및 오른쪽 끝은 침팬지 아데노바이러스 Pan 5로부터 유래된다(a.k.a. 유인원 아데노바이러스 22).
1. 링커의 삽입
pPan5CldelRI (ClaI과 EcoRI 사이)로부터 Ad C1 부분을 올리고머 SAD27 top 및 SAD27 bot를 어닐링함으로써 만든 DNA 링커로 대체하였다. SEQ ID NO: 198: SAD27 top - CGCGCCGAGCATTCATGCTTGTACGTA- CCCACGCACAGCTTTAAACATTTG 및 SEQ ID NO: 199: SAD27 bot - AATTCAAATGTTTAAAGCTGTGCGTGGGTACGTACAAGCATGAATGCTCGG. 이 플라스미드는 pC5endsSAD27 올리고이다.
2. PCR
플라스미드 pC5endsSAD27 올리고를 AscI 및 EcoRI로 분해하였고, PCR-발생된 3873 bp 단편(또는 AscI 및 EcoRI로 분해함)을 pC5endsSAD27PCR을 만들기 위해 클로닝하였다. PCR 단편을 제조업자의 설명서에 따라서 주형으로서 SAdV-27 바이러스 DNA를 사용하고, 프라이머 SAD27 Asc 및 SAD27 RI를 사용하고, NEB Phusion PCR 키트를 사용하여 발생시켰다. PCR 프라이머는 AscI 및 EcoRI 자리를 각각 함유하였다.
SEQ ID NO: 200: SAD27 Asc - TACCACCAGCGGCGCGCCAGACATCAAG
SEQ ID NO: 201: SAD27 RI - AAATGGAATTCAAATGTTTAAAGCTGTG
3. SAdV-27로부터 AscI (7951 - 17458) 단편의 삽입.
플라스미드 pC5endsSAD27PCR를 AscI로 분해하였고, SAdV-27 바이러스 DNA AscI (7951 - 17458) 단편 9507 bp 단편을 클로닝하였다. 정확한 기원을 가지는 클론을 pC5SAD27 PCR Asc로 불렀다.
4. PacI (18409 - 29019) 단편의 삽입.
플라스미드 pC5SAD27 PCR Asc를 Pad로 분해하였고 SAdV-27 바이러스 DNA Pad (18409 - 29019) 10610 bp 단편을 클로닝하였다. 정확한 기원을 가지는 클론을 pC5C27delAsc-Pac로 불렀다.
5. MluI (16026) - SbfI (23007) 단편의 삽입.
플라스미드 pC5C27delAsc-Pac를 MluI + SbfI로 분해하였고 SAdV-27 바이러스 DNA MluI (16026) - SbfI (23007) 6981 bp 단편을 pC5/C27 IP을 만들기 위해 클로닝하였다.
플라스미드 pC5/C27 IP는 E1-결핍 Ad Pan 5 (SAdV-22) 바이러스 DNA를 포함하며, 내부 25603 bp 부분(bp#7955-bp #33557)은 SAdV-27로부터 기능적으로 유사한 24753 bp (bp #7951-bp #32,703) 단편에 의해 대체되었고, 즉, 이것은 말단 전 단백질, 52/55K단백질, 펜톤 염기, pVII, Mu, 헥손, 엔도프로테아제, DNA-결합 단백질 1OOK 스캐폴딩 단백질, 33K 단백질, pVIII, E3 영역, 및 섬유소에 대한 SAdV-22 유전자의 SAdV-27로부터의 그것으로 대체를 초래한다. SAdV-27 단편의 왼쪽 말단에서 AscI 자리는 DNA 폴리머라아제 오픈리딩프레임(1192 잔기 단백질의 잔기 236)의 처음에 있으며, 키메라 단백질을 초래한다. SAdV-27 단편의 오른쪽 말단을 구성하는 EcoRI 자리는 E4 orf 6/7에 대한 오픈리딩프레임 내에 있다. 오른쪽 말단은 Ad Pan 5로부터 PCR 생성된 오른쪽 말단 분획에 연결되어, 재생성된 E4 orf 6/7 번역 생성물은 Ad Pan 5와 SAdV-27 사이의 키메라이다.
B. 표준 분자 생물학 기술을 사용하는 SAdV -28에 기초한 E1-결핍 플라스미드 분자 클론의 구성
두 개의 공개된 기록 및 AdC1을 경험한 발명자가 아군 B 아데노바이러스에서 E1 결핍이 HEK 293 세포에서 Ad5 E1 유전자에 의해 보완되지 않음이 나타냈기 때문에, 하이브리드 아데노바이러스는 AdC1을 사용하는 전략을 기초로 발생되었고[Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21 ; Roy et al., J Gen Virol . (2006) 87, 2477-2485], 키메라 구조체의 왼쪽 및 오른쪽 말단은 침팬지 아데노바이러스 Pan 5로부터 유래된다(a.k.a. 유인원 아데노바이러스 22).
출발 플라스미드는 2005년 1월 6일 공개된 WO 2005/001103 A3에서 기술되는 바와 같은 AdC1 키메라 벡터 - pPan5CldelRI의 구성에서 중간체로서 구성되었다.
1. PCR
주형으로서 SAdV-28 바이러스 DNA를 사용하여 pPan5CldelRI (ClaI와 EcoRI 사이)을 PCR-발생 단편으로 대체하였다. PCR 프라이머는 각각 ClaI 및 EcoRI를 함유한다. 프라이머 CCATCTATCGATGCATAATCAGCAAACC [SEQ ID NO: 33, (W33 fwd, Tm - 64.5°)] 및 CTCAAATGGAATTCAAATGTTTAAAG [SEQ ID NO: 34,]를 사용하였다. 프라이머 'W33 fwd'는 ClaI 자리 (밑줄친 곳)를 함유한다. ClaI 자리 다음의 2개의 염기는 야생형 서열에서 CA이지만, ClaI 자리가 박테리아에서 메틸화되지 않는 것으로 변환하기 위해 프라이머에서 GC로 변형되었다. 이 변형은 Ad4 추정 11K 단백질 CR1 델타와 상동인 106개의 아미노산 E3 단백질에서 하나의 아미노산 - S94C -으로 변경된다. 프라이머 'W33 rev'는 EcoRI 자리(밑줄친 곳)를 함유한다. 대응하는 야생형 Ad 서열은 GAATCC이다. 변경된 염기는 이 변경에 의해 바뀌지 않은 이소류신에 대한 코돈(E4 orf 6/7 단백질의 잔기 123)에 있다. ClaI 자리는 SAdV-28의 30273에서 하나와 동일하며; EcoRI 자리는 프라이머에서 만들어져서 Ad Pan 5로부터 E4 영역에서 그것을 스플라이싱하는 것은 키메라 E4 orf 6/7을 만든다(pPan5CldelRI의 EcoRI 자리는 Ad Pan 5 E4 orf 6/7 단백질의 오픈리딩프레임 내이다).
PCR을 NEB Phusion 폴리머라아제를 사용하여 수행하였고, 완충제는 제조업자에 의해 공급되었다.
2474 bp 생성물을 EcoRI 및 ClaI로 분해하여 동일한 두 자리 사이에서 pBluescript II SK+로 클로닝하여 pBS W33 PCR을 수득하였다. 플라스미드 pBS W33 PCR을 ClaI 및 EcoRI 로 분해하였고, 2453 bp PCR-유래(원래) 단편을 동일한 두 자리 사이의 pPan5CldelR1로 클로닝하여 pPan5CldelR1- W33 PCR을 수득하였다.
2. ClaI (18577) 단편( pol 유전자에서 존재하는 AscI 자리와 단지 ClaI 자리 사이)에 AscI (11065)의 삽입.
플라스미드 pPan5CldelR1-W33 PCR을 AscI 및 ClaI로 분해하였고, ClaI (18577) 단편 (pol 유전자에서 존재하는 AscI 자리와 단지 ClaI 자리 사이)에서 SAdV-28 바이러스 DNA AscI (11065)를 클로닝하여, pPan5-W33 delAsc delCla를 수득하였다.
3. AscI (11065) 단편에 AscI ( 7941)의 삽입( 키메라 폴리머라아제 유전자를 만들기 위함).
플라스미드 pPan5-W33 delAsc delCla를 AscI로 분해하였고, AscI (11065)으로 SAdV-28 바이러스 DNA AscI (7941) 단편을 클로닝하였다(키메라 폴리머라아제 유전자를 만든다). 정확한 기원을 가지는 클론을 pPan5-W33 del Cla로 불렀다.
4. ClaI (30273) 단편에 ClaI (18577)의 삽입.
플라스미드 pPan5-W33 del Cla를 ClaI로 분해하였고, ClaI (30273) 단편에서 SAdV-28 바이러스 DNA ClaI (18577)을 클로닝하였다. 정확한 기원을 가지는 클론을 pC5/C28 IP로 불렀다.
플라스미드 pC5/C28 IP는 E1-결핍 Ad Pan 5 (SAdV-22) 바이러스 DNA를 포함하며, 내부 25603 bp 부분(bp#7955-bp #33557)을 SAdV-28로부터 기능적으로 유사한 24779 bp (bp #7946-bp #32657) 부분으로 대체하였고, 즉, 이는 전-말단의 단백질, 52/55K 단백질, 펜톤 염기, pVII, Mu, 헥손, 엔도프로테아제, DNA-결합 단백질, 1OOK 스캐폴딩 단백질, 33K 단백질, pVIII, E3 영역, 및 섬유소에 대한 SAdV-22 유전자를 SAdV-28로부터의 그것들로 대체를 초래한다. SAdV-28 단편의 왼쪽 말단에서 AscI 자리는 DNA 폴리머라아제 오픈리딩프레임(1192 잔기 단백질의 잔기 236)의 시작에 있고, 이는 키메라 단백질을 초래한다. SAdV-28 단편의 오른쪽 말단을 구성하는 EcoRI 자리는 E4 orf 6/7에 대한 오픈리딩프레임 내에 있다. 오른쪽 말단을 Ad Pan 5로부터 PCR 발생 오른쪽 말단 단편에 연결해서, 재발생된 E4 orf 6/7 번역 생성물은 Ad Pan 5 및 SAdV-28 사이의 키메라이다.
C. 표준 분자 생물학 기술을 사용하는 SAdV -29에 기초한 플라스미드 분자 클론의 구성
두 개의 공개된 기록 및 AdC1을 경험한 발명자가 아군 B 아데노바이러스에서 E1 결핍이 HEK 293 세포에서 Ad5 E1 유전자에 의해 보완되지 않음이 나타냈기 때문에, 하이브리드 아데노바이러스는 AdC1을 사용하는 전략을 기초로 발생되었고[Roy et al., J Virol . Methods. (2007) 141, 14-21 ; Roy et al., J Gen Virol . (2006) 87, 2477-2485], 키메라 구조체의 왼쪽 및 오른쪽 말단은 침팬지 아데노바이러스 Pan 5로부터 유래된다(a.k.a. 유인원 아데노바이러스 22).
출발 플라스미드는 2005년 1월 6일 공개된 WO 2005/001103 A3에서 기술되는 바와 같은 AdC1 키메라 벡터 - pPan5CldelRI의 구성에서 중간체와 같이 구성된 것이었다.
1. PCR
주형으로서 SAdV-29 바이러스 DNA를 사용하여 pPan5CldelRI (ClaI 및 EcoRI 사이)로부터의 AdC1 단편을 PCR-발생 단편으로 대체하였다. PCR 프라이머는 각각 ClaI 및 EcoRI 자리를 함유한다. 프라이머 CCATCTATCGATGCATAATCAGCAAACC [SEQ ID NO: 33] & CTCAAATGGAATTCAAATGTTTAAAG [SEQ ID NO: 34]를 사용하였다. 프라이머 'W33 fwd'는 ClaI 자리(밑줄친 곳)를 함유한다. ClaI 자리 다음의 2개의 염기는 야생형 서열에서 CA이지만, ClaI 자리가 박테리아에서 메틸화되지 않는 것으로 변환하기 위해 프라이머에서 GC로 변형되었다. 이 변형은 Ad4 추정 11K 단백질 CR1 델타와 상동인 106개의 아미노산 E3 단백질에서 하나의 아미노산 - S94C -으로 변경된다. 프라이머 'W33 rev'는 EcoRI 자리(밑줄친 곳)를 함유한다. 대응하는 야생형 Ad 서열은 GAATCC이다. 변경된 염기는 이 변경에 의해 바뀌지 않은 이소류신에 대한 코돈(E4 orf 6/7 단백질의 잔기 123)에 있다.
ClaI 자리는 SAdV-29의 30303에서 하나와 동일하며; EcoRI 자리는 프라이머에서 만들어져서 Ad Pan 5로부터 E4 영역에서 그것을 스플라이싱하는 것은 키메라 E4 orf 6/7을 만든다(pPan5CldelR1의 EcoRI 자리는 Ad Pan 5 E4 orf 6/7 단백질의 오픈리딩프레임 내이다).
PCR을 NEB Phusion 폴리머라아제를 사용하여 수행하였고 완충제는 제조업자에 의해 공급되었다.
2480 bp 생성물을 EcoRI 및 ClaI로 분해하여 동일한 두 자리 사이에서 pPan5CldelRI로 클로닝하여 pPan5CldelR1-C29 PCR을 수득하였다.
2. ClaI (18583) 단편( pol 유전자에서 존재하는 AscI 자리와 단지 ClaI 자리 사이)에 AscI (11065)의 삽입.
플라스미드 pPan5C1delR1-C29 PCR을 AscI 및 ClaI으로 분해하였고, ClaI (18583) 단편 (pol 유전자에서 존재하는 AscI 자리와 단지 ClaI 자리 사이)에서 SAdV-28 바이러스 DNA AscI (11065)를 클로닝하여, pPan5-C29 delAsc delCla를 수득하였다.
3. AscI (11094) 단편에 AscI ( 7941)의 삽입( 키메라 폴리머라아제 유전자를 만들기 위함).
플라스미드 pPan5-C29 delAsc delCla를 AscI로 분해하였고, AscI (11094) 단편에서 SAdV-29 바이러스 DNA AscI (7945)를 클로닝하였다(키메라 폴리머라아제 유전자를 만든다). 정확한 기원을 가지는 클론을 pPan5-C29 del Cla로 불렀다.
4. ClaI (30303) 단편에 ClaI (18583)의 삽입.
플라스미드 pPan5-W33 del Cla를 ClaI로 분해하였고, ClaI (30303)에 SAdV-29 바이러스 DNA ClaI (18583) 단편을 클로닝하였다. 정확한 기원을 가지는 클론을 pC5/C29 IP로 불렀다. 플라스미드 pC5/C29 IP는 E1-결핍 Ad Pan 5 (SAdV-22) 바이러스 DNA를 포함하며, 내부 25603 bp 부분(bp#7955-bp #33557)을 SAdV-29로부터 기능적으로 유사한 24817 bp (bp #7945-bp #32761) 부분으로 대체하였고, 즉, 이는 전-말단의 단백질, 52/55K 단백질, 펜톤 염기, pVII, Mu, 헥손, 엔도프로테아제, DNA-결합 단백질, 1OOK 스캐폴딩 단백질, 33K 단백질, pVIII, E3 영역, 및 섬유소에 대한 SAdV-22 유전자를 SAdV-29로부터의 그것들로 대체를 초래한다. SAdV-29 단편의 왼쪽 말단에서 AscI 자리는 DNA 폴리머라아제 오픈리딩프레임(1192 잔기 단백질의 잔기 236)의 시작에 있고, 이는 키메라 단백질을 초래한다. SAdV-29 단편의 오른쪽 말단을 구성하는 EcoRI 자리는 E4 orf 6/7에 대한 오픈리딩프레임 내에 있다. 오른쪽 말단을 Ad Pan 5로부터 PCR 발생 오른쪽 말단 단편에 연결해서, 재발생된 E4 orf 6/7 번역 생성물은 Ad Pan 5 및 SAdV-29 사이의 키메라이다.
D. 표준 분자 생물학 기술을 사용하는 SAdV -32에 기초한 플라스미드 분자 클론의 구성
두 개의 공개된 기록 및 AdC1을 경험한 발명자가 아군 B 아데노바이러스에서 E1 결핍이 HEK 293 세포에서 Ad5 E1 유전자에 의해 보완되지 않음이 나타냈기 때문에, 하이브리드 아데노바이러스는 AdC1을 사용하는 전략을 기초로 발생되었고[Roy et al., J Virol . Methods. (2007) 141, 14-21 ; Roy et al., J Gen Virol . (2006) 87, 2477-2485], 키메라 구조체의 왼쪽 및 오른쪽 말단은 침팬지 아데노바이러스 Pan 5로부터 유래된다(a.k.a. 유인원 아데노바이러스 22).
출발 플라스미드는 2005년 1월 6일 공개된 WO 2005/001103 A3에서 기술되는 바와 같은 AdC1 키메라 벡터 - pPan5C1delRI의 구성에서 중간체와 같이 구성된 것이었다.
1. PCR
pPan5C1delRI (ClaI 및 EcoRI 사이)로부터의 AdC1 부분을 주형으로서 SAdV-32 바이러스 DNA를 사용하여 PCR-발생 단편으로 대체하였다.
프라이머 SEQ ID NO: 202: TTGTAGCATAGTTTGCCTGG[C32 fwd] 및 SEQ ID NO: CTCAAATGGAATTCAAATGTTTAAAG [SEQ ID NO: 34, (W33 rev)]를 사용하였다. 프라이머 'W33 rev'는 EcoRI 자리(밑줄친 곳)를 함유한다.
대응하는 야생형 Ad 서열은 GAATCC이다. 변경된 염기는 이 변경에 의해 바뀌지 않은 E4 orf 6/7 단백질의 이소류신에 대한 코돈에 있다. EcoRI 자리는 프라이머에서 만들어져서 Ad Pan 5로부터 E4 영역에서 그것을 스플라이싱하는 것은 키메라 E4 orf 6/7를 만든다(pPan5CldelRI의 EcoRI 자리는 Ad Pan 5 E4 orf 6/7 단백질의 오픈리딩프레임 내이다).
PCR을 NEB Phusion 폴리머라아제를 사용하여 수행하였고 완충제는 제조업자에 의해 공급되었다.
2259 bp 생성물을 MluI 및 EcoRI로 분해하여 동일한 두 자리 사이에서 pPan5C1delRI로 클로닝하여 pPan5Cl C32 PCR을 수득하였다.
2. SAdV -32의 MluI (16058) 단편에 AscI ( 7945)의 삽입( pol 유전자에서 존재하는 AscI 자리 및 MluI 자리 사이).
플라스미드 pPan5C1 C32 PCR을 AscI 및 MIuI로 분해하였고, Mlul (16058) 단편에서 SAdV-32 바이러스 DNA AscI (7945)를 클로닝하여 pPan5/C32 del Mlu를 수득하였다.
3. MluI (16058 내지 30510) 단편의 삽입.
플라스미드 pPan5/C32 del Mlu를 MIuI로 분해하였고 SAdV-32 바이러스 DNA MluI (16058 내지 30510) 단편을 클로닝하였다. 정확한 기원을 가지는 클론을 pC5/C32 IP로 불렀다.
플라스미드 pC5/C32 IP는 E1-결핍 Ad Pan 5 (SAdV-22) 바이러스 DNA를 포함하며, 내부 25603 bp 부분(bp#7955-bp #33557)을 SAdV-32로부터 기능적으로 유사한 24817 bp (bp #7945-bp #32761) 부분으로 대체하였고, 즉, 이는 전-말단의 단백질, 52/55K단백질, 펜톤 염기, pVII, Mu, 헥손, 엔도프로테아제, DNA-결합 단백질, 1OOK 스캐폴딩 단백질, 33K 단백질, pVIII, E3 영역, 및 섬유소에 대한 SAdV-22 유전자를 SAdV-32로부터의 그것들로 대체를 초래한다. SAdV-32 단편의 왼쪽 말단에서 AscI 자리는 DNA 폴리머라아제 오픈리딩프레임(1192 잔기 단백질의 잔기 236)의 시작에 있고, 이는 키메라 단백질을 초래한다. SAdV-32 단편의 오른쪽 말단을 구성하는 EcoRI 자리는 E4 orf 6/7에 대한 오픈리딩프레임 내에 있다. 오른쪽 말단을 Ad Pan 5로부터 PCR 발생 오른쪽 말단 단편에 연결하여, 재발생된 E4 orf 6/7 번역 생성물은 Ad Pan 5 및 SAdV-32 사이의 키메라이다.
E. 표준 분자 생물학 기술을 사용하는 SAdV -35에 기초한 E1-결핍 플라스미드 분자 클론의 구성
두 개의 공개된 기록 및 AdC1을 경험한 발명자가 아군 B 아데노바이러스에서 E1 결핍이 HEK 293 세포에서 Ad5 E1 유전자에 의해 보완되지 않음이 나타냈기 때문에, 하이브리드 아데노바이러스는 AdC1을 사용하는 전략을 기초로 발생되었고[Roy et al., J Virol. Methods. (2007) 141, 14-21 ; Roy et al., J Gen Virol . (2006) 87, 2477-2485], 키메라 구조체의 왼쪽 및 오른쪽 말단은 침팬지 아데노바이러스 Pan 5로부터 유래된다(a.k.a. 유인원 아데노바이러스 22).
출발 플라스미드는 2005년 1월 6일 공개된 WO 2005/001103 A3에서 기술되는 바와 같은 AdC1 키메라 벡터 - pPan5C1delRI의 구성에서 중간체와 같이 구성된 것이었다.
1. SAdV-35의 EcoRI (22198) 단편으로 AscI (11058)의 삽입.
플라스미드 pPan5C1delRI를 AscI 및 EcoRI로 분해하였고, EcoRI (22198) 단편에서 SAdV-35 바이러스 DNA AscI (11058)를 클로닝하여 pPan5CI C35 Asc-RI를 수득하였다.
2. AscI (7928 내지 11058) 단편의 삽입.
플라스미드 pPan5CI C35 Asc-RI를 AscI로 분해하였고, SAdV-35 바이러스 DNA AscI 단편(7928 내지 11058)을 클로닝하였다. 정확한 방향성(orientation)을 가지는 클론을 pPan5CI C35 Asc-RI + Asc로 불렀다.
3. EcoRI (22198 내지 32738) 단편의 삽입.
플라스미드 pPan5CI C35 Asc-RI + Asc를 EcoRI로 분해하였고, SAdV-35 바이러스 DNA EcoRI 단편(22198 내지 32738)을 클로닝하였다. 정확한 방향성을 가지는 클론을 pC5/C35 IP로 불렀다.
플라스미드 pC5/C35 IP는 E1-결핍 Ad Pan 5 (SAdV-22) 바이러스 DNA를 포함하며, 내부 25603 bp 부분(bp#7955-bp #33557)을 SAdV-35로부터 기능적으로 유사한 24817 bp (bp #7945-bp #32761) 부분으로 대체하였고, 즉, 이는 전-말단의 단백질, 52/55K 단백질, 펜톤 염기, pVII, Mu, 헥손, 엔도프로테아제, DNA-결합 단백질, 1OOK 스캐폴딩 단백질, 33K 단백질, pVIII, E3 영역, 및 섬유소에 대한 SAdV-22 유전자를 SAdV-35로부터의 그것들로 대체를 초래한다. SAdV-35 단편의 왼쪽 말단에서 AscI 자리는 DNA 폴리머라아제 오픈리딩프레임(1192 잔기 단백질의 잔기 236)의 시작에 있고, 이는 키메라 단백질을 초래한다. SAdV-35 단편의 오른쪽 말단을 구성하는 EcoRI 자리는 E4 orf 6/7에 대한 오픈리딩프레임 내에 있다. 오른쪽 말단을 Ad Pan 5로부터 PCR 발생 오른쪽 말단 단편에 연결해서, 재발생된 E4 orf 6/7 번역 생성물은 Ad Pan 5 및 SAdV-35 사이의 키메라이다.
F. E1-결핍 아데노바이러스 벡터
인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질을 발현하는 E1-결핍 아데노바이러스 벡터를 구성하기 위해, H1N1 인플루엔자 A 바이러스 NP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai, GenBank 등록 번호 AF3891 19.1)는 최적화된 코돈이었고 완전히 합성되었다(Celtek Genes, Nashville, TN). 인간 시토메갈로바이러스 초기 프로모터로 구성되는 발현 카세트, 합성 인트론(플라스미드 pCI로부터 획득(Promega, Madison, 위스콘신)), 코돈 최적화 인플루엔자 A NP 코딩 서열 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 구성하였다. 플라스미드 pShuttle CMV PI FIuA NP는 상기 기술된 발현 카세트를 포함하며, 이는 각각 희소-절단 제한 효소 I-CeuI 및 PI-SceI (New England Biolabs)에 대한 인식 자리에 의해 측면에 위치된다. E1-결핍 아데노바이러스 벡터의 분자 클론을 만들기 위해, E1-결핍 아데노바이러스의 플라스미드 분자 클론을 우선 만들었고, 희소 절단 제한 효소 I-CeuI 및 PI-Scel에 대한 인식 자리를 E1 결핍 대신 삽입하였다. E1-결핍 아데노바이러스 플라스미드를 그 후 I-CeuI 및 PI-Scel로 분해하였고, 발현 카세트(동일 효소에 의해 분해)를 연결하였다. 결과 아데노바이러스 플라스미드 분자 클론을 HEK 293 세포로 트랜스펙팅하여 재조합 아데노바이러스 벡터를 구제하였다. 트랜스펙션 후 구제를 제한 효소 분해에 의해 플라스미드로부터 선형 아데노바이러스 게놈을 우선 방출함으로써 가능하게 하는 것으로 발견하였다.
실시예 3 - 교차-중화 평가
야생형 SAdV-27, SAdV-28, SAdV-29, SAdV-32, 및 SAdV-35을 직접 면역 형광법에 의해 모니터링되는 감염 억제 중화 항체 분석을 사용하여 인간 아데노바이러스 5(아종 C) 및 침팬지 아데노바이러스 7(SAdV-24), 및 인간 풀링된 IgG와 비교하여 교차-중화 활성에 대해 평가하였다. 일반적 인간 집단이 노출되는 다수의 항원에 대한 항체를 함유하기 때문에, 인간 풀링된 IgG[Hu Pooled IgG]를 상업적으로 구입하고, 면역타협 환자에서 투여를 위해 승인한다. 인간 풀링된 IgG에 대한 유인원 아데노바이러스에서 중화 항체의 존재 또는 부존재는 일반적 모집단에서 이들 아데노바이러스에 대한 항체의 보급의 반영이다.
분석을 하기와 같이 수행하였다. HAdV-5 또는 SAdV-24로 주사한 토끼로부터의 혈청 샘플을 35분 동안 56℃에서 가열하여 불활성화하였다. 야생형 아데노바이러스(108 입자/웰)을 무혈청 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 희석하였고, 37℃에서 1시간 동안 DMEM에서 가열-불활성화된 혈청의 2-배 연속 희석으로 배양하였다. 이후에, 혈청-아데노바이러스 혼합물을 105 단일층 A549 세포와 함께 웰 내의 슬라이드에 첨가하였다. 1시간 후, 각 웰의 세포를 100 μl의 20% 소 태아혈청(FBS)-DMEM으로 보충하였고, 5% CO2로 37℃에서 22시간 동안 배양하였다. 다음에, 세포를 PBS로 2회 헹구고 DAPI로 염색하였고, 염소에 FITC로 표지된, 광범위하게 교차 반응성인 항체(Virostat)를 파라포름알데히드(4%, 30 분)에서 고정 및 0.2% Triton (4℃, 20 분)에서 침투 후 HAdV-5에 대해 길렀다. 감염의 수준을 현미경관찰 하에서 FITC 양성 세포의 수를 카운팅함으로써 결정하였다. NAB 타이터를 나이브(naive) 혈청 대조군과 비교하여 50% 이상으로써 아데노바이러스 감염을 억제한 가장 높은 혈청 희석으로서 기록한다.
< 1/20의 타이터 값이 나타나면, 중화 항체 농도는 검출의 제한, 즉 1/20 이하이다.
이들 데이터는 일반 모집단에서 SAdV-27, SAdV-29, 및 SAdV-32에 대한 검출가능한 미리 존재하는 면역이 없고; SAdV-28 및 SAdV-35에 대한 최소한의 면역반응성을 나타낸다. 이들 데이터는 HAdV-5 및 SAdV-24와 교차-반응하지 않는 앞의 표에 있는 유인원 아데노바이러스가 아데노바이러스의 순차적 전달을 수반하는 요법, 예를 들어, 프라임-부스트 또는 암 치료법에 유용할 수 있음을 추가로 나타낸다.
실시예 4 - 사이토카인 유도
형질세포양 수지상세포를 인간 말초혈액 단핵구(PBMCs)로부터 분리하였고, 96웰 플레이트로 배지에서 배양하였고 아데노바이러스로 감염시켰다. 48시간 후 세포를 스핀다운하고 상청액을 수집하였고 인터페론 α의 존재하에서 분석하였다.
더 구체적으로, PBMC를 펜실베니아 유니버시티에서 CFAR(Center For AIDS Research) 면역학 코어로부터 획득하였다. 3억개의 이들 세포를 그 후 키트와 함께 제공된 설명서에 따라서 Miltenyi Biotec제의 "인간 형질세포양 수지상세포 분리 키트"를 사용하여 형질세포양 수지상세포(pDCs)를 분리하기 위해 사용하였다. 이 키트를 사용하는 분리는 모든 다른 세포 종류를 제거하는 것을, 그러나 pDC는 PBMC로부터 제거하는 것을 기초로 하였다.
최종 세포 수는 보통 도너로부터 도너까지 다양하지만, 4십만 내지 7십만개의 세포의 범위에 있다. 따라서 발생된 데이터(하기 논의)는 다중 도너로부터의 세포의 분석에서 비롯된다. 그렇지만 놀랍게도, 인터페론 또는 다른 사이토카인 방출에 기초한 아군의 분리는 다양한 도너로부터 세포를 분리할 때조차 유지된다.
세포를 L-글루타민, 10% 소 태아 혈청(Mediatech), 1OmM 헤페스 완충제 용액(Invitrogen), 항생물질(페니실린, 스트렙토마이신 및 겐타마이신-Mediatech 제) 및 인간-인터류킨 3 (20ng/mL - R&D)으로 보충한 RPMI-1640 배지(Mediatech)에서 배양하였다. 야생형 아데노바이러스를 10,000 (세포 당 10,000개의 바이러스 입자, 106 세포/ml의 농도로)의 감염다중도(MOI)에서 세포에 직접 첨가하였다. 48 시간 후, 세포를 스핀 다운하였고, 상청액을 인터페론의 존재하에서 분석하였다. 사이토카인을 제조업자로부터 추천된 프로토콜을 사용하여 PBL 생물의학 연구소로부터 효소-결합면역흡착분석법(ELISA) 키트를 사용하여 분석하였다.
본 연구는 아군 C 아데노바이러스가 IFNα의 검출가능하지 않은 양을 만든다는 것을 나타내었다(본 분석은 1250 pg/mL의 검출 제한을 가진다). 반대로, 아군 E 아데노바이러스의 모든 시험 멤버는 IFNα를 생성하였고, 일반적으로 아군 B 아데노바이러스와 비교하여 상당히 우수한 IFNα를 생성하였다.
다양한 다른 사이토카인을 또한 아데노바이러스의 스크리닝에서 검출하였다. 그러나, 일반적으로, 아군 E 아데노바이러스는 아군 C 아데노바이러스보다 상당히 더 높은 수준의 IL-6, RANTES, MIP-1α, TNF-α, IL-8, 및 IP-10을 생성하였다. 아군 B 아데노바이러스는 또한 IFNα, IL-6, RANTES, 및 MIP1α의 유도에서 아군 C 아데노바이러스를 능가하였다.
상당한 세포 용혈이 이 연구에서 관찰되지 않았기 때문에, 이는 감염과 상관없이, 바이러스 복제의 어떤 상당한 양의 존재하에서 사이토카인이 아군 E 아데노바이러스와 세포를 접촉함으로써 생성된다는 것을 제안한다.
다른 연구에서(제시하지 않음), 세포를 중공 C7 캡시드 단백질(Ad 아군 E) 또는 UV-불활성 아데노바이러스 C7 바이러스 벡터(UV 불활성화는 교차-연결을 야기하며, 아데노바이러스 유전자 발현을 제거한다) 중 하나와 함께 상기 기술된 바와 같이 배양하였다. 이들 연구에서, 동일 또는 더 높은 수준의 IFNα가 무결함 C7과 비교하여 중공 캡시드와 불활성 바이러스 벡터 둘 다에 대해 관찰되었다.
상기 인용된 모든 문헌은 참고로써 본원에 포함된다. 수많은 변형 및 변경이 상기 확인된 설명의 범주에 포함되며 당업자에게 명백한 것으로 기대된다. 이러한 조성물 및 공정에 대한 변형 및 변경, 예로써 다른 미니유전자의 선택 또는 벡터 또는 면역 조절자의 선택 또는 투약량은 첨부되는 청구항의 범주 내인 것으로 믿어진다.