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KR101758910B1 - Recombinant Microorganisms Producing Butanol and Method for Preparing Butanol Using the Same - Google Patents

Recombinant Microorganisms Producing Butanol and Method for Preparing Butanol Using the Same Download PDF

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KR101758910B1
KR101758910B1 KR1020100055069A KR20100055069A KR101758910B1 KR 101758910 B1 KR101758910 B1 KR 101758910B1 KR 1020100055069 A KR1020100055069 A KR 1020100055069A KR 20100055069 A KR20100055069 A KR 20100055069A KR 101758910 B1 KR101758910 B1 KR 101758910B1
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promoter
butanol
dehydrogenase
coa
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최용준
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지에스칼텍스 주식회사
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Abstract

본 발명은 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 n-butyrate를 기질로 하여 부탄올을 제조하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실; (b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과 달리 성장이 용이하고, 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하다.The present invention relates to a recombinant microorganism having a butanol-producing ability and a method for producing butanol using the same, and more particularly, to a recombinant microorganism producing butanol using n-butyrate as a substrate and a method for producing butanol using the recombinant microorganism. The recombinant microorganism according to the present invention comprises (a) a gene encoding an enzyme that converts butyryl-CoA to acetyl-CoA and an enzyme that regulates the expression of a gene involved in fatty acid metabolism in a microorganism having a fatty acid metabolic pathway Gene deletion; (b) a native promoter containing an attenuator of a gene encoding an enzyme that converts fatty acids to acyl-CoA is substituted with a strong promoter; And (c) a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of butanol from butyrate is introduced. The recombinant microorganism according to the present invention is useful as an industrially produced microorganism of butanol because it is easy to grow, unlike the existing Clostridium acetobutylicum, and has a high possibility of strain improvement due to manipulation of additional metabolic flow.

Description

부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 {Recombinant Microorganisms Producing Butanol and Method for Preparing Butanol Using the Same}Technical Field The present invention relates to a recombinant microorganism having a butanol-producing ability and a method for producing butanol using the same.

본 발명은 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 n-butyrate를 기질로 하여 부탄올을 제조하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a recombinant microorganism having a butanol-producing ability and a method for producing butanol using the same, and more particularly, to a recombinant microorganism producing butanol using n-butyrate as a substrate and a method for producing butanol using the recombinant microorganism.

최근 고유가와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 바이오연료 생산이 큰 관심을 끌고 있다. 최근 바이오 부탄올이 휘발유의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 현재 전세계적으로 연간 10~12 billion pound의 부탄올이 생산되고 있으며, 7~8.4 billion dollar의 시장규모를 이루고 있다 (Lee, S.Y. et al., Biotechnology and Bioengineering 101: 209, 2008). 특히, 바이오 부탄올은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등 연료로서 적합한 특성을 가지며, 에탄올 보다 에너지 효율이 높고 휘발유와 더욱 잘 섞이며, 기존의 송유관이나 자동차 엔진 등을 그대로 사용할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 따라서, 대체연료로 가장 적합한 부탄올을 미생물을 이용하여 대량 생산한다면, 원유 수입 대체 효과 및 온실 가스 배출 감소로 인한 환경적 효과 등을 가져올 수 있다.Recently, due to high oil prices and environmental problems, biofuel production using microorganisms has attracted great interest. Recently, bio-butanol has emerged as an alternative fuel for petrol, and the market size is increasing rapidly. Currently, 10 to 12 billion pounds of butanol are produced annually around the world, with a market size of 7 to 8.4 billion dollars (Lee, SY et al., Biotechnology and Bioengineering 101: 209, 2008). In particular, biobutanol has the characteristics of being suitable as a fuel, such as energy density, volatility control, sufficient octane number, low impurity, energy efficiency higher than ethanol, better mixing with gasoline, and existing pipelines and automobile engine . Therefore, mass production of the most suitable butanol as a substitute fuel using microorganisms can bring about the effect of substituting crude oil imports and the environmental effect due to the reduction of greenhouse gas emissions.

부탄올은 Clostridial 균주의 혐기적 ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation에 의해 생물학적 방법으로 생산될 수 있는데 (Jones, D. T. and Woods, D. R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Rogers, P., Adv. Appl. Microbiol., 31:1, 1986; Lesnik, E. A. et al., Necleic Acids Research, 29: 3583, 2001), 이러한 방법이 1950년대 까지만 해도 40년 이상에 걸쳐 부탄올과 아세톤의 주요 공급원이었다. Clostridial 균주는 성장 조건이 까다롭고 분자생물학적 tool 및 omics technology 등이 완전히 갖추어져 있지 않아서 추가 균주 개량에 어려움이 있다.Butanol can be produced by biological methods by anaerobic ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation of Clostridial strain (Jones, DT and Woods, DR, Microbiol. Rev. , 50: 484, 1986; Rogers, P., . Adv Appl Microbiol, 31: 1 , 1986; Lesnik, EA et al, Necleic Acids Research, 29:... 3583, 2001), these methods until the 1950s, was a major source of butanol and acetone, over a period of 40 years . Clostridial strains are difficult to grow because of poor growth conditions, complete molecular biology tools and omics technology.

따라서, 성장이 우수하고 다양한 omics technology가 구비된 대장균 등에서의 부탄올 생산이 요구되고 있다. 특히, 대사공학 또는 omics technology 등을 이용한 균주 개발이 전무한 상태이므로 무한한 개발 잠재력이 있다고 하겠다. Therefore, production of butanol from Escherichia coli having excellent growth and various omics technology is required. In particular, since there is no development of strains using metabolic engineering or omics technology, there is unlimited development potential.

Clostridium acetobutylicum에서의 부탄올 생성 pathway는 도 1에 나타난 바와 같다 (Lee, S.Y. et al., Biotechnology and Bioengineering 101: 209, 2008). 대장균에도 해당 pathway를 도입하여 부탄올 생산이 시도되었는데, 이 중 일부 효소들 (crotonase, β-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydrogenase, butyryl-CoA dehydrogenase)의 활성이 매우 낮거나 거의 없어서 (Boynton, Z. L. et al., J. Biotechnol., 178: 3015-3024, 1996) Clostridium acetobutylicum에서처럼 효과적으로 해당 반응을 catalyze 하기는 어려운 문제점이 있었다.The butanol production pathway in Clostridium acetobutylicum is shown in Fig. 1 (Lee, SY et al., Biotechnology and Bioengineering 101: 209, 2008). However, some enzymes (crotonase, β-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydrogenase, and butyryl-CoA dehydrogenase) have very low or very little activity (Boynton, ZL et al. J. Biotechnol ., 178: 3015-3024, 1996). As with Clostridium acetobutylicum, it is difficult to effectively catalyze the reaction.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 부탄올 생합성 경로를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아를 제조하고, 이를 이용하여 부탄올 생산을 시도한 바 있으나, 그 생성량이 미미하였다 (US2007/0259419A1; US2007/0259411A1).
In order to solve such a problem, a butanol biosynthesis pathway was introduced to produce a recombinant bacterium having a butanol-producing ability, and butanol production was attempted using the same, but the amount of the produced butanol was insignificant (US2007 / 0259419A1; US2007 / 0259411A1).

이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 부탄올을 생산하는 새로운 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조한 후, 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시킬 경우 재조합 미생물의 부탄올 생성능이 증가된다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
The present inventors have made intensive efforts to develop a new method for producing butanol using microorganisms. As a result, they have found that a mutant microorganism having improved fatty acid metabolism pathway is prepared so as to be suitable for the production of butanol and then enzymes involved in biosynthesis of butanol from butyrate And that the recombinant microorganism has an increased ability to produce butanol, when the coding gene is introduced, thus completing the present invention.

본 발명의 목적은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다. It is an object of the present invention to provide a recombinant microorganism having improved butanol production ability and a method for producing the recombinant microorganism.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 부탄올의 제조방법을 제공하는데 있다.
It is another object of the present invention to provide a method for producing butanol using the recombinant microorganism.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조하는 단계; 및 (b) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.(A) a microorganism having a fatty acid metabolic pathway, a gene encoding an enzyme that converts butyryl-CoA into acetyl-CoA and an enzyme that regulates the expression of a gene involved in fatty acid metabolism And a native promoter containing an attenuator of a gene encoding an enzyme that converts a fatty acid to an acyl-CoA is substituted with a strong promoter to produce a mutant microorganism having an improved fatty acid metabolic pathway suitable for the production of butanol step; And (b) preparing a recombinant microorganism having a butanol-producing ability by introducing a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of butanol from butyrate into a mutant microorganism having an improved fatty acid metabolic pathway, thereby producing a recombinant microorganism having a butanol- The method comprising:

본 발명은 또한, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; 및 (b) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법을 제공한다.The invention also, (a) in E. coli, fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (DNA-binding transcriptional dual regulator gene encoding a) was deleted, the gene coding for fadD (acyl-CoA synthetase ) With a strong promoter to produce a mutant E. coli having an improved fatty acid metabolism pathway suitable for the production of butanol; And (b) a gene coding for buk (butyrate kinase), ptb (gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (gene encoding butyraldehyde dehydrogenase) and bdhAB (gene encoding butanol dehydrogenase) To produce a recombinant E. coli having a butanol-producing ability. The present invention also provides a method for producing a recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability.

본 발명은 또한, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; (b) 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 변이 대장균을 제조하는 단계; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법을 제공한다.The invention also, (a) in E. coli, fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (DNA-binding transcriptional dual regulator gene encoding a) was deleted, the gene coding for fadD (acyl-CoA synthetase ) With a strong promoter to produce a mutant E. coli having an improved fatty acid metabolism pathway suitable for the production of butanol; (b) the fatty acid metabolic pathway is improved mutant of E. coli containing the AtoDA that: the native promoter of (a gene encoding a short chain fatty acid transporter) (acetyl-CoA gene encoding the acetoacetyl-CoA transferase) and AtoE strong promoter To prepare a mutant E. coli; (C) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) Preparing a recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability by culturing a recombinant Escherichia coli strain of the present invention.

본 발명은 또한, (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실; (b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다. (A) a gene encoding an enzyme that converts butyryl-CoA into acetyl-CoA and a gene encoding an enzyme that regulates the expression of a gene involved in fatty acid metabolism in a microorganism having a fatty acid metabolic pathway fruition; (b) a native promoter containing an attenuator of a gene encoding an enzyme that converts fatty acids to acyl-CoA is substituted with a strong promoter; And (c) a gene coding for an enzyme involved in biosynthesis of butanol from butyrate is introduced into the recombinant microorganism.

본 발명은 또한, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제공한다. (A) fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (a gene encoding a DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted in E. coli; (b) a native promoter containing an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is substituted with a strong promoter; (C) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) The recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability.

본 발명은 또한, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (c) AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (d) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제공한다. (A) fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (a gene encoding a DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted in E. coli; (b) a native promoter containing an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is substituted with a strong promoter; (c) AtoDA (acetyl-CoA : acetoacetyl-CoA gene encoding a transferase) and AtoE replaced with a strong promoter of the native promoter (coding for short chain fatty acid transporter); (D) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) The recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물 또는 재조합 대장균을 배양한 다음, 상기 재조합 미생물 또는 재조합 대장균의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for producing butanol, which comprises culturing the recombinant microorganism or recombinant E. coli, and then recovering butanol from the culture medium of the recombinant microorganism or recombinant E. coli.

본 발명은 n-butyrate를 기질로 하여 부탄올을 제조하는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과 달리 성장이 용이하고, 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하다.
The present invention has an effect of providing a recombinant microorganism producing butanol using n-butyrate as a substrate. The recombinant microorganism according to the present invention is useful as an industrially produced microorganism of butanol because it is easy to grow, unlike the existing Clostridium acetobutylicum, and has a high possibility of strain improvement due to manipulation of additional metabolic flow.

도 1은 C. acetobutylicum ATCC 824 균주의 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 미생물의 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 pTrc99a_ptbbuk 플라스미드의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 pTac15k_adhE_bdhAB 플라스미드의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)의 부탄올 생성 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 1 shows the butanol production pathway of C. acetobutylicum ATCC 824 strain.
FIG. 2 shows a metabolic circuit in which butanol is biosynthesized from butyrate of a recombinant microorganism produced according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows a gene map of the pTrc99a_ptbbuk plasmid prepared according to one embodiment of the present invention.
4 shows a gene map of the pTac15k_adhE_bdhAB plasmid prepared according to an embodiment of the present invention.
5 is a graph showing the results of butanol production of the recombinant microorganism (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB) prepared according to an embodiment of the present invention.

본 발명에서는 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조한 후, 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켜 제조한 재조합 미생물이 부탄올을 생성할 수 있는지를 확인하고자 하였다.In the present invention, a recombinant microorganism prepared by introducing a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of butanol from butyrate is prepared to produce a mutant microorganism having improved fatty acid metabolism pathway suitable for the production of butanol. .

본원발명에서는 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, fadE 유전자를 결실시켜 부탄올 생합성의 중간체인 부티릴-CoA가 아세틸-CoA로 전환되지 않도록 하고, 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 조절 유전자인 fadR을 결실시켜 glucose가 존재하는 조건에서도 지방산 대사회로가 작동되도록 하고, fadD 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 다른 억제 조절 유전자의 영향을 받지 않으면서, 강하게 발현되어 지방산이 아실-CoA로 전환되도록 한 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조한 후, 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자들을 제조된 변이 미생물에 도입시키면, 제조된 재조합 미생물의 부탄올 생성능이 향상될 것으로 예측하였다. In the present invention, in a microorganism having a fatty acid metabolic pathway, fadE gene is deleted to prevent the conversion of butyryl-CoA, which is an intermediate of butanol biosynthesis, to acetyl-CoA, and fadR And the native promoter containing the attenuator of the fadD gene was replaced with a strong promoter, which was strongly expressed without being influenced by other inhibitory regulatory genes, CoA, and then introducing the genes coding for enzymes involved in biosynthesis of butanol from the butyrate into the produced mutant microorganism, the produced recombinant microorganism has improved butanol production ability Respectively.

본 발명의 일 실시예에서는 대장균 W3110의 fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter인 tac promoter로 치환시킨 WERPD3110을 제조하였다. 그리고, Clostridium acetobutylicum의 ptb, buk 유전자에 의해 n-butyrate가 butyryl-CoA로 전환된다는 사실(Journal of bacteriology, p. 4613-4618, 1988)에 근거하여 ptb(phosphate butyryltransferase를 코딩하는 유전자) 및 buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자)가 순차적으로 클로닝된 ptrc99a_ptbbuk 벡터와 adhE(butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자)를 도입시킨 벡터(pTac15k_adhE_bdhAB)를 제조한 후, 이를 WERPD3110에 도입시킴으로써 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)을 제조하였고, 제조된 재조합 미생물의 부탄올 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
In one embodiment of the present invention, fadE (gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (gene encoding DNA-binding transcriptional dual regulator) of E. coli W3110 are deleted and fadD (gene encoding acyl-CoA synthetase) WERPD3110 was constructed by replacing the native promoter containing the attenuator with the tac promoter. Based on the fact that n-butyrate is converted to butyryl-CoA by the ptb and buk genes of Clostridium acetobutylicum (Journal of bacteriology, p. 4613-4618, 1988), ptb (a gene coding for phosphate butyryltransferase) and buk butyrate kinase) are sequentially cloned, adhE (a gene encoding an enzyme that converts butyryl-CoA to butyraldehyde) and bdhAB (a gene encoding an enzyme that converts butyraldehyde into butanol) (pTac15k_adhE_bdhAB) was prepared and introduced into WERPD3110 to prepare a recombinant microorganism having the ability to produce butanol (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB), and the produced recombinant microorganism was improved in butanol production ability.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키고, 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물을 제조하는 단계; 및 (b) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.Accordingly, in one aspect, the present invention provides a method for producing a microorganism having (a) a microorganism having a fatty acid metabolic pathway, an enzyme encoding an enzyme that converts butyryl-CoA into acetyl-CoA and an enzyme that regulates the expression of a gene involved in fatty acid metabolism A native promoter containing an attenuator of a gene coding for an enzyme encoding a fatty acid to acyl-CoA is deleted by a strong promoter to prepare a mutant microorganism having an improved fatty acid metabolism pathway suitable for the production of butanol ; And (b) preparing a recombinant microorganism having a butanol-producing ability by introducing a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of butanol from butyrate into a mutant microorganism having an improved fatty acid metabolic pathway, thereby producing a recombinant microorganism having a butanol- And a method for manufacturing the same.

본 발명에서, "지방산 대사경로"란 지방산(fatty acid)을 합성하거나 분해하는 반응이 일어나는 경로로써, 대부분의 미생물은 지방산 대사경로를 가지고 있다.In the present invention, the term "fatty acid metabolic pathway" means a pathway in which a reaction to synthesize or decompose fatty acids occurs. Most microorganisms have a fatty acid metabolic pathway.

본 발명에서, "결실"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 해당 효소의 발현 또는 활성을 억제시키는 유전자, 효소 또는 화학물질을 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 억제시키는 것을 포괄하는 개념이다.In the present invention, the term "deletion" is intended to mean that a gene, an enzyme or a chemical substance which induces the mutation, substitution or deletion of some bases of the gene, introduces some bases or inhibits the expression or activity of the enzyme is introduced And inhibiting the activity of the enzyme.

본 발명에서, 상기 지방산 대사경로를 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 박테리아로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 대장균 등을 예시할 수 있다.In the present invention, the microorganisms having the fatty acid metabolic pathway may be bacteria, yeast, fungi, and the like, but not limited thereto. Examples of the bacteria include Corynebacterium genus, Brevibacterium genus, And E. coli.

본 발명에 있어서, 상기 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자는 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)이며, 상기 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the gene encoding the enzyme that converts the butyryl-CoA into acetyl-CoA is fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase), and an enzyme that regulates the expression of a gene involved in fatty acid metabolism The gene encoding the gene is fadR (a gene coding for a DNA-binding transcriptional dual regulator), and the gene encoding the enzyme for converting the fatty acid into acyl-CoA is fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) .

상기 fadE는 acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자로써, 상기 fadE가 미생물내에 존재할 경우 부티레이트로부터 생성된 butyryl-CoA가 추가적인 대사(further metabolism) 과정을 거쳐 Acetyl-CoA로 전환된다. 따라서, 본 발명에서는 fadE 유전자를 결실시킴으로써, 부탄올 생산에 유용하게 이용되는 butyryl-CoA를 확보하는 것을 특징으로 한다.The fadE is a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase. When fadE is present in the microorganism, butyryl-CoA produced from butyrate is converted into Acetyl-CoA through a further metabolism process. Therefore, the present invention is characterized by securing butyryl-CoA which is useful for producing butanol by deleting the fadE gene.

상기 fadR은 지방산 대사(fatty acid metabolism) 관련 모든 유전자의 발현을 조절하는 global regulator이다. 예를들어 E.coli는 glucose 혹은 다른 에너지원이 충분할 경우 fadR이 지방산 대사가 일어나지 않도록 지방산 대사 관련 유전자를 강하게 repression한다. 그러나 glucose 등 에너지원이 고갈되어 더 이상 탄소원(carbon source)이 없을 경우 지방산을 분해하여 acetyl-CoA로 전환시켜 에너지 원으로 사용한다. 이때 지방산을 분해하기 위해서 fadR의 repression이 풀리게되고 관련 유전자들이 모두 발현된다. 따라서, 본 발명에서는 fadR 유전자를 결실시킴으로써, glucose가 존재하는 조건에서도 지방산 대사가 일어날 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다. 그러나, 앞서기재한 바와 같이, fadE 유전자를 결실시켰기 때문에 지방산은 중간에서 대사가 멈추게 된다. 즉 uptake된 부티레이트는 butyryl-CoA까지만 전환되고, 이후 acetyl-CoA로는 전환되지 않는다. The fadR is a global regulator that regulates expression of all genes involved in fatty acid metabolism. For example, E. coli strongly represses fatty acid metabolism-related genes so that fadR does not cause fatty acid metabolism if glucose or other energy sources are sufficient. However, when the energy source such as glucose is depleted and there is no more carbon source, the fatty acid is decomposed and converted to acetyl-CoA and used as an energy source. At this time, repression of fadR is released to decompose fatty acids, and all related genes are expressed. Therefore, in the present invention, by deleting the fadR gene, fatty acid metabolism can be performed under the condition that glucose is present. However, as described above, the fatty acid is stopped in the middle due to the deletion of the fadE gene. That is, the uptaked butyrate is converted only to butyryl-CoA, but not to acetyl-CoA.

상기 fadD는 acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자로써, 지방산에 CoA를 붙여서 세포가 에너지 원으로 사용할 수 있는 형태로 전환 시켜준다. 즉, 지방산 대사의 시작단계에 관여하는 유전자이다. 본 발명에서는 fadD 유전자의 Native promoter를 strong promoter로 치환시켜 발현이 강하게 일어나도록 하였고, native promoter상에 위치하는 fadR 이외의 다른 repression factor(ompR 등)가 결합되지 않도록 한 것을 특징으로 한다. 상기 fadD가 발현되면 부티레이트를 부티릴-CoA로 전환시키는데 관여하는 효소인 ptbbuk의 성능을 보완시킬 수 있다.The fadD gene encodes acyl-CoA synthetase, which is converted to a form that can be used as an energy source by attaching CoA to a fatty acid. That is, it is a gene involved in the initiation of fatty acid metabolism. In the present invention, the Native promoter of the fadD gene is replaced with a strong promoter to induce strong expression, and other repression factors (ompR, etc.) other than fadR located on the native promoter are prevented from binding. The expression of fadD can complement the performance of ptbbuk, an enzyme involved in the conversion of butyrate to butyryl-CoA.

본 발명에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter, trp promoter 등을 예시할 수 있다. In the present invention, the strong promoter may include a trc promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, and a trp promoter.

본 발명에 있어서, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 부티레이트를 부티릴-포스페이트(butyryl-phosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-포스페이트를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 부티릴-CoA를 부티르알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. In the present invention, a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of butanol from the butyrate is a gene encoding an enzyme that converts butyrate to butyryl-phosphate, a gene encoding butyryl-phosphate as butyryl-CoA A gene encoding an enzyme that converts a butyryl-CoA to a butyraldehyde, and a gene encoding an enzyme that converts butyraldehyde into butanol. do.

상기 부티레이트를 부티릴-포스페이트(butyryl-phosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 부티릴-포스페이트를 부티릴-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자)이고, 상기 부티릴-CoA를 부티르알데하이드(butyraldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이며, 상기 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)이다. The gene encoding the enzyme that converts the butyrate to butyryl-phosphate is buk (a gene encoding butyrate kinase), and a gene encoding an enzyme that converts the butyryl-phosphate to butyryl-CoA Is a gene encoding ptb (phosphotrans butyrylase), and the gene encoding the enzyme that converts the butyryl-CoA to butyraldehyde is adhE (a gene coding for butyraldehyde dehydrogenase), and the butyraldehyde is replaced with butanol Is a gene encoding bdhAB (butanol dehydrogenase).

상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutyricum 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.The gene coding for an enzyme involved in biosynthesis of butanol from the butyrate may be characterized by being derived from Clostridium acetobutyricum. However, even if it is derived from another microorganism, there is no limitation as long as it is expressed in host cells to be introduced and exhibits the same enzyme activity.

또한, 상기 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 strong promoter에 포함되어 도입되는 것이 바람직하다. 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter, trp promoter 등을 예시할 수 있다. Also, it is preferable that a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of butanol from the butyrate is incorporated in a strong promoter. Examples of the strong promoter include a trc promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, and a trp promoter.

본 발명에 있어서, 상기 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법은 상기 (a) 단계의 개량된 변이 미생물이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. In the present invention, the butanol method for producing a recombinant microorganism having a producing ability is the (a) step AtoDA that an improved mutant containing the microorganism of (acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase gene encoding a) and AtoE (short chain fatty acid transporter) with a strong promoter may be further included.

야생형 대장균은 atoDAEB operon을 가지고 있다. atoD는 acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase, alpha subunit을 코딩하는 유전자이고, atoA는 acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase, beta subunit을 코딩하는 유전자이고, atoE는 short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자이며, atoB acetyl-CoA acetyltransferase를 코딩하는 유전자로 알려져 있다.The wild-type Escherichia coli has the atoDAEB operon. AtoD is a gene encoding acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase and alpha subunit. AtoA is a gene encoding acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase and beta subunit. AtoE is a gene encoding short chain fatty acid transporter , and atoB acetyl-CoA acetyltransferase.

즉, atoDA는 미생물의 butyrate metabolism에 속해 있는 유전자로써 butyrate를 butyryl-CoA로 전환시키는 역할을 하고, atoE는 short chain fatty acid를 uptake하는 역할을 한다. 따라서, atoDA 및 atoE 유전자의 promoter를 발현이 강한 strong promoter로 치환시킬 경우, 부탄올 생성능을 높일 수가 있다.In other words, atoDA is a gene belonging to the butyrate metabolism of microorganisms. It converts butyrate to butyryl-CoA and atoE uptakes short-chain fatty acid. Therefore, substitution of atoDA and atoE gene promoters with strong expression promoters can increase the butanol production ability.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 개량된 변이 미생물이 함유하는 atoDAEB operon은 미생물이 본래 가지고 있거나, 외부로부터 도입되어 있는 것 모두 포함한다.In the present invention, the atoDAEB operon contained in the modified mutant microorganism of step (a) includes all microorganisms originally contained or introduced from outside.

본 발명은 다른관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; 및 (b) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법에 관한 것이다.
The invention in another aspect, (a) in E. coli, fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR and deleting the (DNA-binding transcriptional dual regulator gene encoding a), fadD (acyl-CoA synthetase coding A native promoter containing an attenuator of a gene encoding a strong promoter to produce a mutant E. coli having an improved fatty acid metabolic pathway suitable for the production of butanol; And (b) a gene coding for buk (butyrate kinase), ptb (gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (gene encoding butyraldehyde dehydrogenase) and bdhAB (gene encoding butanol dehydrogenase) To produce a recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability. The present invention also relates to a method for producing a recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; (b) 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 변이 대장균을 제조하는 단계; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법에 관한 것이다.
In another aspect, the present invention provides a recombinant vector comprising (a) fadE (gene coding for acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (gene encoding DNA-binding transcriptional dual regulator) in E. coli and fadD (acyl-CoA synthetase Encoding gene is replaced with a strong promoter to produce a mutant E. coli having an improved fatty acid metabolic pathway suitable for the production of butanol; (b) the fatty acid metabolic pathway is improved mutant of E. coli containing the AtoDA that: the native promoter of (a gene encoding a short chain fatty acid transporter) (acetyl-CoA gene encoding the acetoacetyl-CoA transferase) and AtoE strong promoter To prepare a mutant E. coli; (C) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) Producing a recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability. The present invention also relates to a method for producing a recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실; (b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
(A) a microorganism having a fatty acid metabolic pathway, encoding a gene encoding an enzyme that converts butyryl-CoA to acetyl-CoA and an enzyme that regulates the expression of a gene involved in fatty acid metabolism, The gene is deleted; (b) a native promoter containing an attenuator of a gene encoding an enzyme that converts fatty acids to acyl-CoA is substituted with a strong promoter; And (c) a gene coding for an enzyme involved in biosynthesis of butanol from butyrate is introduced into the recombinant microorganism.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균에 관한 것이다.
(A) fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (a gene encoding a DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted in E. coli; (b) a native promoter containing an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is substituted with a strong promoter; (C) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) To produce recombinant Escherichia coli.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (c) AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (d) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균에 관한 것이다. (A) fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (a gene encoding a DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted in E. coli; (b) a native promoter containing an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is substituted with a strong promoter; (c) AtoDA (acetyl-CoA : acetoacetyl-CoA gene encoding a transferase) and AtoE replaced with a strong promoter of the native promoter (coding for short chain fatty acid transporter); (D) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) To produce recombinant Escherichia coli.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 미생물의 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다. FIG. 2 shows a metabolic circuit in which butanol is biosynthesized from butyrate of a recombinant microorganism produced according to an embodiment of the present invention.

상기 재조합 미생물 및 재조합 대장균은 앞서 기재한 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
The recombinant microorganism and the recombinant E. coli can be produced according to the above-described production method.

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 WERPD3110에 ptrc99a_ptbbuk 벡터 및 pTac15k_adhE_bdhAB벡터를 도입시켜 제조한 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)을 글루코스 및 부티레이트를 함유하는 배지에서 배양한 결과, 부탄올이 고농도로 생성되는 것을 확인하였다. Meanwhile, in one embodiment of the present invention, the recombinant microorganism (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB) prepared by introducing the ptrc99a_ptbbuk vector and the pTac15k_adhE_bdhAB vector into WERPD3110 was cultured in a medium containing glucose and butyrate and found that a high concentration of butanol Respectively.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 부티릴-CoA를 아세틸-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방산 대사에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실; (b) 지방산을 아실-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양한 다음, 상기 재조합 미생물의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
Accordingly, the present invention provides, in another aspect, (a) a microorganism having a fatty acid metabolic pathway, wherein the gene encoding an enzyme that converts butyryl-CoA into acetyl-CoA and an enzyme that regulates the expression of a gene involved in fatty acid metabolism Lt; / RTI > is deleted; (b) a native promoter containing an attenuator of a gene encoding an enzyme that converts fatty acids to acyl-CoA is substituted with a strong promoter; And (c) a recombinant microorganism having a butanol-producing ability, wherein a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of butanol from butyrate is introduced, followed by recovering butanol from the culture broth of said recombinant microorganism Butanol.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 배양한 다음, 상기 재조합 대장균의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
(A) fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (a gene encoding a DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted in E. coli; (b) a native promoter containing an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is substituted with a strong promoter; (C) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) And recovering butanol from the culture broth of said recombinant E. coli. The present invention also relates to a method for producing butanol, which comprises culturing said recombinant E. coli having a butanol-producing ability.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실; (b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (c) AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 치환; 및 (d) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 배양한 다음, 상기 재조합 대장균의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
(A) fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (a gene encoding a DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted in E. coli; (b) a native promoter containing an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is substituted with a strong promoter; (c) AtoDA (acetyl-CoA : acetoacetyl-CoA gene encoding a transferase) and AtoE replaced with a strong promoter of the native promoter (coding for short chain fatty acid transporter); (D) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) And recovering butanol from the culture broth of said recombinant E. coli. The present invention also relates to a method for producing butanol, which comprises culturing said recombinant E. coli having a butanol-producing ability.

본 발명에 있어서, 재조합 변이 미생물의 배양 및 부탄올 회수 과정은 종래 발효 공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 알코올의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 아울러, 상기 부탄올의 회수는 배양이 완료된 이후에 수행하는 것이 일반적이나, 생산성을 높기기 위하여 gas-stripping 방법(Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27:207, 2005)등을 이용하여 배양도중에 회수할 수도 있다. 즉, 배양중에 생성된 부탄올을 회수하면서 계속 배양하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.
In the present invention, the cultivation of the recombinant mutant microorganism and the recovery of butanol can be carried out using conventional culturing methods and separation and purification methods of alcohol, which are conventionally known in the fermentation industry. However, in order to increase the productivity, cultivation of the butanol was carried out using a gas-stripping method (Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27: 207, 2005) It can also be recovered on the way. That is, it is also within the scope of the present invention to continuously cultivate while recovering the butanol produced during the culture.

[실시예][Example]

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.

특히, 하기 실시예에서는 대장균 W3110을 숙주 미생물로 이용하였으나, 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 사용하여 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량시키고, 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시킨 다음, 이를 이용하여 부탄올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. In particular, in the following examples, Escherichia coli W3110 was used as a host microorganism, but an enzyme involved in biosynthesis of butanol from the butyrate was coded by using other E. coli, bacteria, yeast, And then using the same to produce butanol will be apparent to those skilled in the art.

또한, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래인 것만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.In the following examples, only those genes derived from a specific strain are exemplified as genes to be introduced, but it will be apparent to those skilled in the art that there is no restriction as long as they are expressed in the introduced host cell and exhibit the same activity.

아울러, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이, 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것 (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001)도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
In the following examples, only a specific medium and a culture method are exemplified. However, as described in the literature, when a medium different from a saccharified liquid such as whey or CSL (corn steep liquor) is used or fed- Batch culture, continuous culture, and the like (Lee et al. , Bioprocess Biosyst. Eng. , 26: 63, 2003; Lee et al. , Appl. Microbiol. Biotechnol. , 58: 663, 2002; et al, Biotechnol Lett, 25: 111, 2003; Lee et al, Appl Microbiol Biotechnol, 54:....... 23, 2000; Lee et al, Biotechnol Bioeng, 72:... 41, 2001) FIG. And will be apparent to those skilled in the art.

실시예 1: 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 미생물의 제조Example 1: Preparation of a mutant microorganism with improved fatty acid metabolism pathway suitable for butanol production

1-1: 1-1: fadEfade 유전자의 결실 (WE3110) Genetic deletion (WE3110)

서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, 대장균 W3110(ATTC 39936)에서 fadE 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하여 WE3110 균주를 제조하였다. One step inactivation method using primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 (Warner et al. , PNAS, 6: 97 (12): 6640-6645, 2000) The fadE gene was deleted from E. coli W3110 (ATTC 39936) and the antibiotic resistance was removed to prepare strain WE3110.

[서열번호 1] WfadE k/o F : 5'-atgatgattttgagtattctcgctacggttgtcctgctcgg cgcgttgttgtgtaggctggagctgcttc-3`[SEQ ID NO: 1] WfadE k / o F: 5'-atgatgattttgagtattctcgctacggttgtcctgctcgg cgcgttgttgtgtaggctggagctgcttc-3`

[서열번호 2] WfadE k/o R: 5`-actgggcataagccgagaactccagcccgccgtactc ttttttgatgatccatatgaatatcctccttag-3`
[SEQ ID NO: 2] WfadE k / o R: 5`-actgggcataagccgagaactccagcccgccgtactc ttttttgatgatccatatgaatatcctccttag-3`

1-2: 1-2: fadRfadR 유전자의 결실 (WER3110) Genetic deletion (WER3110)

서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, 1-1의 대장균 WE3110에서 fadR 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하여 WER3110 균주를 제조하였다. Using one-step inactivation method (Warner et al. , PNAS, 6: 97 (12): 6640-6645, 2000) using the primers of SEQ ID NOS: 3 and 4, The fadR gene was deleted from Escherichia coli WE3110 of 1-1 and the antibiotic resistance was removed to prepare strain WER3110.

[서열번호 3] WfadRk/oF: 5'-atggtcattaaggcgcaaagcccggcgggtttcgcggaa gagtacattatgtgtaggctggagctgcttc-3'[SEQ ID NO: 3] WfadRk / oF: 5'-atggtcattaaggcgcaaagcccggcgggtttcgcggaa gagtacattatgtgtaggctggagctgcttc-3 '

[서열번호 4] WfadRk/oR: 5'-ccggattggcgaaatagtgacgaccaatacgcgtatacag ccctttcatc catatgaatatcctccttag-3'
[SEQ ID NO: 4] WfadRk / oR: 5'-ccggattggcgaaatagtgacgaccaatacgcgtatacag ccctttcatc catatgaatatcctccttag-3 '

1-3: 1-3: fadDfadD 의 native promoter에 있는 attenuator sequence의 tac promoter로 치환(WERPD3110)(WERPD3110) of the attenuator sequence in the native promoter

1-2에서 제조된 대장균 WER3110에서, fadD promoter 상에 위치하는 전사조절 기작에 관여하는 attenuator sequence를 강력한 promoter인 tac promoter로 치환하였다. In Escherichia coli WER3110 prepared from 1-2, the attenuator sequence involved in the transcriptional regulatory mechanism located on the fadD promoter was replaced with the strong promoter tac promoter.

먼저, attenuator sequence의 치환을 위해, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용해 상기 유전자 제거와 동일한 방법으로, attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환하여 WERPD3110 균주를 제조하였다. First, for the substitution of the attenuator sequence, the WERPD3110 strain was prepared by replacing the native promoter containing the attenuator with the tac promoter, using primers of SEQ ID NOS: 5 and 6, in the same manner as the gene deletion.

[서열번호 5] WfadDpchF: 5'-gtataatcccggccccgcgagagtacaaacagttgtaact gaataattgccgcgtcatacacatacgatt-3'[SEQ ID NO: 5] WfadDpchF: 5'-gtataatcccggccccgcgagagtacaaacagttgtaact gaataattgccgcgtcatacacatacgatt-3 '

[서열번호 6] WfadDpchR: 5'-ttgatctccgtcggaacgtccgcgggataacggttaagcc aaaccttcttcatggtctgtttcctgtgtg-3'
[SEQ ID NO: 6] WfadDpchR: 5'-ttgatctccgtcggaacgtccgcgggataacggttaagcc aaaccttcttcatggtctgtttcctgtgtg-3 '

실시예 2: 부티레이트로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 벡터의 제조Example 2: Preparation of a vector into which a gene encoding an enzyme involved in biosynthesis of butanol from butyrate is introduced

2-1: pTrc99a_ptbbuk 벡터의 제조2-1: Preparation of pTrc99a_ptbbuk vector

C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 7와 8의 프라이머로 PCR을 수행하여, phosphate butyryltransferase 와 butyrte kinase를 코딩하는 ptbbuk 유전자 절편을 제조하였다. The ptbbuk gene fragment coding for phosphate butyryltransferase and butyrate kinase was prepared by PCR using primers of SEQ ID NOS: 7 and 8 using acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA as a template.

[서열번호 7] bukptbF: 5'-tatagaattcgtgattaagagttttaatga-3'[SEQ ID NO: 7] bukptbF: 5'-tatagaattcgtgattaagagttttaatga-3 '

[서열번호 8] bukptbR: 5'-tattgagctcttatttgtattccttagctt-3'
[SEQ ID NO: 8] bukptbR: 5'-tattgagctcttatttgtattccttagctt-3 '

다음으로, 상기 제조된 ptbbuk 절편을 trc 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTrc99a 플라스미드(Phamacia, Biotech, Uppsala, Sweden)에 제한효소(EcoRI 및 SacI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 ptbbuk 절편 및 pTrc99a 플라스미드를 접합시킴으로써, 복제율이 높은(high copy number) 재조합 플라스미드인 pTrc99a_ptbbuk를 제조하였다(도 3).
Next, the prepared ptbbuk fragment was treated with restriction enzymes ( EcoRI and SacI ) to a pTrc99a plasmid (Phamacia, Biotech, Uppsala, Sweden) for progressing strong gene expression of the trc promoter, followed by treatment with T4 DNA ligase PTrc99a_ptbbuk , which is a high copy number recombinant plasmid, was prepared by joining the pTbcub fragment and pTrc99a plasmid digested with restriction enzymes (Fig. 3).

2-2: pTac15k_adhE_bdhAB 벡터의 제조2-2: Manufacture of pTac15k_adhE_bdhAB vector

C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9의 프라이머와 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 adhE 절편을 pTac15k 플라스미드에 제한효소(SacI 및 XbaI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 adhE 절편 및 pTac15k 플라스미드를 접합시킴으로써, pTac15k_adhE를 제조하였다. The PCR reaction was carried out using the C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA as a template and the primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. The resulting adhE fragment was treated with restriction enzymes ( Sac I and Xba I) to pTac15k plasmid, treated with T4 DNA ligase, and ligated with the restriction enzyme-digested adhE fragment and pTac15k plasmid to prepare pTac15k_adhE Respectively.

다음으로, C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11의 프라이머와 서열번호 12의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 bdhAB 절편을 pTac15k_adhE 플라스미드에 제한효소(BamHI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 bdhAB 절편 및 pTac15k_adhE 플라스미드를 접합시킴으로써, pTac15k_adhE_bdhAB를 제조하였다(도 4). Next, the PCR reaction was carried out using primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 using C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA as a template. The obtained bdhAB fragment was treated with restriction enzyme ( Bam HI) to the pTac15k_adhE plasmid, treated with T4 DNA ligase, and ligated with restriction enzyme-digested bdhAB fragment and pTac15k_adhE plasmid to prepare pTac15k_adhE_bdhAB 4).

[서열번호 9] adhEfn: 5'-acgcgagctcatgaaagttacaaatcaaaa-3'[SEQ ID NO: 9] adhEfn: 5'-acgcgagctcatgaaagttacaaatcaaaa-3 '

[서열번호 10] adhErs: 5'-acgttctagaatagtctatgtgcttcatga-3'[SEQ ID NO: 10] adhErs: 5'-acgttctagaatagtctatgtgcttcatga-3 '

[서열번호 11] bdhfst: 5'-atgcggatctcaacgaaaaattcaccccct-3'[SEQ ID NO: 11] bdhfst: 5'-atgcggatctcaacgaaaaattcaccccct-3 '

[서열번호 12] bdhrst: 5'-acgtggatctccggtaggtttacacagatt-3'[SEQ ID NO: 12] bdhrst: 5'-acgtggatctccggtaggtttacacagatt-3 '

실시예 3: 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB)의 제조 및 부탄올 생성능 확인Example 3: Preparation of a recombinant microorganism having a butanol-producing ability (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB) and its ability to produce butanol

실시예 1에서 제조된 WERPD3110에 실시예 2에서 제조된 pTrc99a_ptbbuk 벡터 및 pTac15k_adhE_bdhAB를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물 (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB)을 제조하였다.Recombinant microorganism (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB) having butanol production ability was prepared by introducing pTrc99a_ptbbuk vector and pTac15k_adhE_bdhAB prepared in Example 2 into WERPD3110 prepared in Example 1.

제조된 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 엠피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100㎖ LB를 함유한 250㎖ 플라스크에 glucose (5g/L)를 첨가하고 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 10시간 배양하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 13.5g KH2PO4, 4.0 g (NH4)2HPO4, 1.7g citric acid, 1.4g MgSO4ㆍ7H2O, 3g yeast extract, 10㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 함유)의 성분으로 구성된 배지 2.0 리터를 함유한 5.0 리터 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Korea)를 121℃에서 15분간 멸균한 후 실온까지 온도를 낮추었다. 상기 발효기에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃, 200rpm에서 anaerobic 조건으로 배양하였고, optical density(OD)가 0.7 일 때 IPTG 1mM을 처리하였다. butyrate는 NaOH를 이용하여 pH를 5로 조정하였고, 멸균된 증류수로 1/10 로 희석하여 50초 한번씩 1초 동안 feeding 하였다. 배양액의 pH는 50%(v/v) NH4OH의 automatic feeding에 의해 5.5로 유지하였고, Nitrogen (N2) 으로 charging 하여 anaerobic 조건을 유지시켰다.Recombinant microorganisms having the ability to produce butanol were selected on LB plate medium supplemented with ampicillin and kanamycin at 50 占 퐂 / ml and 30 占 퐂 / ml, respectively. The transformant was inoculated in 10 ml of LB medium and pre-cultured at 37 ° C for 12 hours. Thereafter, glucose (5 g / L) was added to a 250 ml flask containing 100 ml LB taken out at 80 ° C or higher after sterilization, and 1 ml of the preculture was inoculated and cultured at 31 ° C for 10 hours. After that, 20 g glucose, 13.5 g KH 2 PO 4 , 4.0 g (NH 4 ) 2 HPO 4, 1.7 g citric acid, 1.4 g MgSO 4 .7H 2 O, 3 g yeast extract and 10 ml trace metal solution distilled water 1 liter and 10g FeSO 4 7H 2 O, 1.35g CaCl 2, 2.25g ZnSO 4 and 7H 2 O, 0.5g MnSO 4 and 4H 2 O, 1g CuSO 4 and 5H 2 O, 0.106g (NH 4 ) 6 Mo (LiFlus GX, Biotron Inc., Korea) containing 2.0 liters of a medium composed of the components of 7 O 24揃 4H 2 O, 0.23 g Na 2 B 4 O 7揃 10H 2 O, 35% HCl ) Was sterilized at 121 DEG C for 15 minutes and then cooled to room temperature. The fermenter was inoculated with the preculture medium, cultured under anaerobic conditions at 31 DEG C and 200 rpm, and treated with 1 mM IPTG at an optical density (OD) of 0.7. Butyrate was adjusted to pH 5 with NaOH, diluted 1/10 with sterilized distilled water, and fed for 50 seconds every 1 second. The pH of the culture was maintained at 5.5 by automatic feeding of 50% (v / v) NH 4 OH, and anaerobic conditions were maintained by charging with Nitrogen (N 2 ).

상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 부탄올 농도를 packed column (Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m ㅧ 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography (Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.The glucose of the medium glucose analyzer (STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA) the butanol concentration is collected with the medium, and generating therefrom, when measured when glucose is exhausted to the packed column (Supelco Carbopack TM (Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA) equipped with a B-AW / 6.6% PEG 20M, 2 m ㅧ 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA) Respectively.

도 5는 재조합 미생물(WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk +pTac15k_adhE_bdhAB)의 부탄올 발효 결과를 나타낸 그래프로서, 배양시간에 따라 부티레이트의 농도는 점차 감소되면서, 부탄올이 생성되는 것을 알 수 있었다.FIG. 5 is a graph showing the results of butanol fermentation of the recombinant microorganism (WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB). It can be seen that the concentration of butyrate gradually decreases according to the incubation time to produce butanol.

StrainStrain Butanol (mg/L)Butanol (mg / L) W3110W3110 ND1 ND 1 WERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhABWERPD3110 + pTrc99a_ptbbuk + pTac15k_adhE_bdhAB 466.4466.4

표 1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 부탄올이 생성되지 않은 반면, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 466.4mg/L 의 부탄올을 생성하였다.As shown in Table 1, no butanol was produced in wild-type E. coli W3110, whereas the recombinant microorganism according to the present invention produced 466.4 mg / L butanol.

이 결과로부터, 본 발명에서의 ptbbuk, adhE 및 bdhAB 유전자들의 과발현으로 인해 부티레이트로부터 부탄올이 성공적으로 생성되었음을 확인 할 수 있었다.From these results, it was confirmed that butanol was successfully produced from butyrate due to overexpression of ptbbuk , adhE and bdhAB genes in the present invention.

참고로, 본 출원인의 선행특허(출원번호:10-2009-0059560)에서 제조된 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate를 중간체로 하여 부탄올을 생합성하는 재조합 미생물[Val(△ilvE)+pKBRilvBNCD-ptac-adhEbdhAB+ pTac15KlpdVbkdA1-ptac-bkdA2BicmAB]은 117.9mg/L의 부탄올을 생성하였다.
For reference, a recombinant microorganism [Val (Δ ilvE ) + pKBRilvBNCD-ptac (2) which uses 2-ketoisovalerate, which is a precursor of L-valine produced in the applicant's prior patent (Application No. 10-2009-0059560) -adhEbdhAB + pTac15KlpdVbkdA1-ptac-bkdA2BicmAB] produced 117.9 mg / L butanol.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will readily appreciate that many modifications are possible in the exemplary embodiments without materially departing from the novel teachings and advantages of this invention. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Microorganisms Producing Butanol and Method for Preparing Butanol Using the Same <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadE k/o F <400> 1 atgatgattt tgagtattct cgctacggtt gtcctgctcg gcgcgttgtt gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadE k/o R <400> 2 actgggcata agccgagaac tccagcccgc cgtactcttt tttgatgatc catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadRk/o F <400> 3 atggtcatta aggcgcaaag cccggcgggt ttcgcggaag agtacattat gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadRk/o R <400> 4 ccggattggc gaaatagtga cgaccaatac gcgtatacag ccctttcatc catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadDpch F <400> 5 gtataatccc ggccccgcga gagtacaaac agttgtaact gaataattgc cgcgtcatac 60 acatacgatt 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadDpch R <400> 6 ttgatctccg tcggaacgtc cgcgggataa cggttaagcc aaaccttctt catggtctgt 60 ttcctgtgtg 70 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bukptb F <400> 7 tatagaattc gtgattaaga gttttaatga 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bukptb R <400> 8 tattgagctc ttatttgtat tccttagctt 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhEfn <400> 9 acgcgagctc atgaaagtta caaatcaaaa 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhErs <400> 10 acgttctaga atagtctatg tgcttcatga 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bdhfst <400> 11 atgcggatct caacgaaaaa ttcaccccct 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bdhrst <400> 12 acgtggatct ccggtaggtt tacacagatt 30 <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Microorganisms Producing Butanol and Method for          Preparing Butanol Using the Same <160> 12 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadE k / o F <400> 1 atgatgattt tgagtattct cgctacggtt gtcctgctcg gcgcgttgtt gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadE k / o R <400> 2 actgggcata agccgagaac tccagcccgc cgtactcttt tttgatgatc catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadRk / o F <400> 3 atggtcatta aggcgcaaag cccggcgggt ttcgcggaag agtacattat gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadRk / o R <400> 4 ccggattggc gaaatagtga cgaccaatac gcgtatacaga ccctttcatc catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadDpch F <400> 5 gtataatccc ggccccgcga gagtacaaac agttgtaact gaataattgc cgcgtcatac 60 acatacgatt 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WfadDpch R <400> 6 ttgatctccg tcggaacgtc cgcgggataa cggttaagcc aaaccttctt catggtctgt 60 ttcctgtgtg 70 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BukPTb F <400> 7 tatagaattc gtgattaaga gttttaatga 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BuKPtB R <400> 8 tattgagctc ttatttgtat tccttagctt 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhEfn <400> 9 acgcgagctc atgaaagtta caaatcaaaa 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhErs <400> 10 acgttctaga atagtctatg tgcttcatga 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bdhfst <400> 11 atgcggatct caacgaaaaa ttcaccccct 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bdhrst <400> 12 acgtggatct ccggtaggtt tacacagatt 30

Claims (30)

다음 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법:
(a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 아실(acyl) 코엔자임(coenzyme) A 디하이드로게나제(dehydrogenase) 및 DNA-결합(binding) 전사(transcriptional) 이중 조절자(dual regulator)의 발현 또는 활성이 억제되고, 아실(acyl)-CoA 합성효소(synthetase)의 발현이 증가되도록 변이 미생물을 제조하는 단계; 및
(b) 부티레이트(butyrate) 키나아제(kinase), 포스포트랜스(phosphotrans) 부티리라제(butyrylase), 부틸알데하이드(butyraldehyde) 디하이드로게나제(dehydrogenase) 및 부탄올 디하이드로게나제(dehydrogenase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코드하는 유전자를 상기 변이 미생물에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 단계.
A method for producing a recombinant microorganism having a butanol production ability comprising the steps of:
(a) the expression or activity of an acyl coenzyme A dehydrogenase and a DNA-binding transcriptional dual regulator in a microorganism having a fatty acid metabolic pathway Preparing a mutant microorganism so that the expression of the acyl-CoA synthetase is increased; And
(b) a group consisting of a butyrate kinase, a phosphotrans butyrylase, a butyraldehyde dehydrogenase and a butanol dehydrogenase. Is introduced into the mutant microorganism to produce a recombinant microorganism having a butanol-producing ability.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 개량된 변이 미생물이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. The method according to claim 1, wherein the modified mutant microorganism of step (a) contains atoDA (acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase-encoding gene) and AtoE (short chain fatty acid transporter- lt; RTI ID = 0.0 &gt; promoter. &lt; / RTI &gt;
제1항에 있어서, 상기 지방산 대사경로를 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1, wherein the microorganism having the fatty acid metabolic pathway is selected from the group consisting of bacteria, yeast, and fungi.
제3항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. The method of claim 3, wherein the bacteria is selected from the group consisting of Corynebacterium genus, Brevibacterium genus, and E. coli.
제1항에 있어서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 결실시켜 아실(acyl) 코엔자임(coenzyme) A 디하이드로게나제(dehydrogenase)의 발현 또는 활성이 억제되도록 하거나, fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)을 결실시켜 DNA-결합(binding) 전사(transcriptional) 이중 조절자(dual regulator)의 발현 또는 활성이 억제되도록 하거나, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 아실(acyl)-CoA 합성효소(synthetase)의 발현이 증가되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1, wherein fadE (a gene coding for acyl coenzyme A dehydrogenase) is deleted to inhibit the expression or activity of acyl coenzyme A dehydrogenase, or fadR (DNA-binding transcriptional dual regulator) to inhibit the expression or activity of a DNA-binding transcriptional dual regulator or to suppress the expression of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) attenuator Wherein the native promoter comprising the promoter is replaced with a strong promoter to increase the expression of an acyl-CoA synthetase.
제5항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. The method of claim 5, wherein the strong promoter is selected from the group consisting of a trc promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, and a trp promoter.
삭제delete 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 buk (butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb (phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE (butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 또는 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 변이 미생물에 도입시켜 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. The method according to claim 1, wherein the step (b) comprises the steps of: expressing a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding a butyraldehyde dehydrogenase), or bdhAB (a gene encoding a butanol dehydrogenase ) Is introduced into the mutant microorganism.
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 유전자는 Clostridium acetobutyricum 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1, wherein the gene of step (b) is derived from Clostridium acetobutyricum .
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 유전자는 strong promoter에 포함되어 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
2. The method according to claim 1, wherein the gene of step (b) is incorporated into a strong promoter.
제10항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. The method of claim 10, wherein the strong promoter is selected from the group consisting of a trc promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, and a trp promoter.
다음 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법:
(a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계; 및
(b) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계.
A method for producing a recombinant Escherichia coli having a butanol production ability comprising the steps of:
(a) In E. coli, fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (a gene encoding DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted and an attenuator of fadD (gene encoding acyl-CoA synthetase) Preparing a mutant Escherichia coli having a modified fatty acid metabolism pathway suitable for the production of butanol by replacing a native promoter with a strong promoter; And
(b) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) And introducing the mutant Escherichia coli into a recombinant Escherichia coli having a butanol production ability.
다음 단계를 포함하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 방법:
(a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)를 결실시키고, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 부탄올 생성에 적합하도록 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균을 제조하는 단계;
(b) 상기 지방산 대사경로가 개량된 변이 대장균이 함유하고 있는 AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter를 strong promoter로 치환시켜 변이 대장균을 제조하는 단계; 및
(c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 상기 변이 대장균에 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 제조하는 단계.
A method for producing a recombinant Escherichia coli having a butanol production ability comprising the steps of:
(a) In E. coli, fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (a gene encoding DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted and an attenuator of fadD (gene encoding acyl-CoA synthetase) Preparing a mutant Escherichia coli having a modified fatty acid metabolism pathway suitable for the production of butanol by replacing a native promoter with a strong promoter;
(b) the fatty acid metabolic pathway is improved mutant of E. coli containing the AtoDA that: the native promoter of (a gene encoding a short chain fatty acid transporter) (acetyl-CoA gene encoding the acetoacetyl-CoA transferase) and AtoE strong promoter To prepare a mutant E. coli; And
(c) a mutant Escherichia coli strain which has introduced buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase) and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) Producing recombinant Escherichia coli.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. The method according to claim 12 or 13, wherein the strong promoter is selected from the group consisting of a trc promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, and a trp promoter.
(a) 지방산 대사경로를 가지는 미생물에서, 아실(acyl) 코엔자임(coenzyme) A 디하이드로게나제(dehydrogenase) 및 DNA-결합(binding) 전사(transcriptional) 이중 조절자(dual regulator)의 발현 또는 활성이 억제되고;
(b) 아실(acyl)-CoA 합성효소(synthetase)의 발현이 증가되며; 그리고
(c) 부티레이트(butyrate) 키나아제(kinase), 포스포트랜스(phosphotrans) 부티리라제(butyrylase), 부틸알데하이드(butyraldehyde) 디하이드로게나제(dehydrogenase) 및 부탄올 디하이드로게나제(dehydrogenase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
(a) the expression or activity of an acyl coenzyme A dehydrogenase and a DNA-binding transcriptional dual regulator in a microorganism having a fatty acid metabolic pathway Is inhibited;
(b) the expression of an acyl-CoA synthetase is increased; And
(c) a group consisting of a butyrate kinase, a phosphotrans butyrylase, a butyraldehyde dehydrogenase, and a butanol dehydrogenase. Wherein the recombinant microorganism has a butanol-producing ability.
제15항에 있어서, AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 추가로 치환되어 있는 것을 특징으로 재조합 미생물.
16. The method of claim 15, AtoDA (acetyl-CoA: acetoacetyl -CoA transferase gene encoding a) and AtoE recombinant characterized in that the native promoter of (a gene encoding a short chain fatty acid transporter) is further substituted with a strong promoter microbe.
제15항에 있어서, 상기 지방산 대사경로를 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
16. The recombinant microorganism of claim 15, wherein the microorganism having the fatty acid metabolic pathway is selected from the group consisting of bacteria, yeast, and fungi.
제17항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
 18. The recombinant microorganism of claim 17, wherein the bacterium is selected from the group consisting of Corynebacterium genus, Brevibacterium genus, and E. coli.
제15항에 있어서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 결실되어 아실(acyl) 코엔자임(coenzyme) A 디하이드로게나제(dehydrogenase)의 발현 또는 활성이 억제되거나, fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실되어 DNA-결합(binding) 전사(transcriptional) 이중 조절자(dual regulator)의 발현 또는 활성이 억제되거나, fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환되어 아실(acyl)-CoA 합성효소(synthetase)의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
16. The method of claim 15, wherein the expression or activity of an acyl coenzyme A dehydrogenase is inhibited by deletion of fadE (a gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase), fadR (DNA-binding transcriptional a gene encoding a dual regulator) is deleted and the expression or activity of a DNA-binding transcriptional dual regulator is suppressed or an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is contained Wherein the native promoter is replaced by a strong promoter to increase the expression of an acyl-CoA synthetase.
제19항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
20. The recombinant microorganism of claim 19, wherein the strong promoter is selected from the group consisting of a trc promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, and a trp promoter.
삭제delete 제15항에 있어서, buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 또는 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
16. The method according to claim 15, wherein buk (gene encoding butyrate kinase), ptb (gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), or bdhAB (gene encoding butanol dehydrogenase) Recombinant microorganism characterized.
제15항에 있어서, 상기 (c)의 유전자는 Clostridium acetobutyricum 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
16. The recombinant microorganism according to claim 15, wherein the gene (c) is derived from Clostridium acetobutyricum .
제15항에 있어서, 상기 (c)의 유전자는 strong promoter에 포함되어 도입되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
16. The recombinant microorganism of claim 15, wherein the gene of (c) is incorporated into a strong promoter.
제24항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
26. The recombinant microorganism of claim 24, wherein the strong promoter is selected from the group consisting of a trc promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, and a trp promoter.
(a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실;
(b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; 및
(c) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균.
(a) in E. coli, fadE (gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (gene encoding DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted;
(b) a native promoter containing an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is substituted with a strong promoter; And
(c) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) Recombinant Escherichia coli having a butanol production ability.
(a) 대장균에서, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator를 코딩하는 유전자)가 결실;
(b) fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환;
(c) AtoDA(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 및 AtoE(short chain fatty acid transporter를 코딩하는 유전자)의 native promoter가 strong promoter로 치환; 및
(d) buk(butyrate kinase를 코딩하는 유전자), ptb(phosphotrans butyrylase를 코딩하는 유전자), adhE(butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 bdhAB(butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균.
(a) in E. coli, fadE (gene encoding acyl coenzyme A dehydrogenase) and fadR (gene encoding DNA-binding transcriptional dual regulator) are deleted;
(b) a native promoter containing an attenuator of fadD (a gene encoding acyl-CoA synthetase) is substituted with a strong promoter;
(c) AtoDA (acetyl-CoA : acetoacetyl-CoA gene encoding a transferase) and AtoE replaced with a strong promoter of the native promoter (coding for short chain fatty acid transporter); And
(d) a gene encoding buk (a gene encoding butyrate kinase), ptb (a gene encoding phosphotrans butyrylase), adhE (a gene encoding butyraldehyde dehydrogenase), and bdhAB (a gene encoding butanol dehydrogenase) Recombinant Escherichia coli having a butanol production ability.
제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
27. The recombinant E. coli according to claim 26 or 27, wherein the strong promoter is selected from the group consisting of a trc promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, and a trp promoter.
제15항 내지 제20항 및 제22항 내지 제25항중 어느 한 항의 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양한 다음, 상기 재조합 미생물의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
A method for producing butanol, comprising culturing a recombinant microorganism having a butanol-producing ability according to any one of claims 15 to 20 and 22 to 25, and then recovering butanol from the culture broth of the recombinant microorganism.
제26항 또는 제27항의 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균을 배양한 다음, 상기 재조합 대장균의 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.26. A method for producing butanol, comprising culturing a recombinant Escherichia coli having a butanol-producing ability according to claim 26 or 27, and recovering butanol from the culture broth of said recombinant Escherichia coli.
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KR101863239B1 (en) * 2016-09-26 2018-06-01 한국생명공학연구원 Microorganism Capable of Using Acetic Acid as Sole Carbon Source

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102177736B1 (en) * 2019-08-21 2020-11-11 울산과학기술원 Transformed recombinant microorganism producing polyhydroxyalkanoate

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