KR101752910B1 - 종양 선택적 ｅ１ａ 및 ｅ１ｂ 돌연변이 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 Pea3 결합 부위 또는 이의 기능적 부분이 결실된 변형된 E1a 조절 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 특정 이소폼을 선택적으로 발현하는 변형된 E1a 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 E1b-19k 클론 삽입 부위를 제공한다. 이러한 변형된 서열은 개별적으로 사용될 수 있거나, 단백질의 종양 선택적 발현을 제공하는 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다.
Description
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 전체 내용이 모든 목적상 참조로서 본원에 포함되는, 2009년 3월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/156,822호를 우선권으로 주장한다.
발명의 배경
암을 발생시키는 기초적인 분자 메커니즘의 광범위한 지식에도 불구하고, 가장 진행된 암은 현재의 화학요법 및 방사선 프로토콜로 치료불가능하다. 암용해성(oncolytic) 바이러스가 다양한 악성종양에 대한 현재의 표준 치료를 현저히 보강하는 잠재성을 갖는 플랫폼 기술로 출현하였다(Kumar, S. et al., Current opinion in molecular therapeutics 10(4):371-379 (2008); Kirn, D. Expert opinion on biological therapy 1(3):525-538 (2001); Kirn D. Oncogene 19(56):6660-6669 (2000)). 바이러스 E1b-55k 유전자의 결실을 갖는 ONYX-015가 p53 경로에 결함을 갖는 종양에서 종양-선택적 복제를 제공하는 것으로 가정되었다(Heise, C. et al., Nat Med 3(6):639-645 (1997); McCormick, F. Oncogene 19(56):6670-6672 (2000); Bischoff, J. R. et al., Science 274(5286):373-376 (1996)). E1b-55k는 p53에 결합하고 이를 비활성화시켜, 예정되지 않은 DNA 합성 및 바이러스 복제를 가능케 한다. 정상 세포에서의 아데노바이러스의 효율적인 복제에 중요한 E1b-55k에 의한 p53의 비활성화는 p53 경로에 비활성화 돌연변이를 갖는 종양과 관련이 없는 것으로 가정되었다. 전임상 연구는 돌연변이 또는 정상 p53 유전자 서열을 갖는 광범위한 인간 종양 세포가 세포 배양에서 ONYX-015의 복제를 뒷받침한다는 것을 입증하였으며, 이는 종양 세포에서의 허용되는 바이러스 복제가 E1b-55k의 p53 결합 효과에 순전히 의존하지 않는 것을 입증한다(Heise, C. et al., Nat Med 3(6):639-645 (1997); Heise, C. et al., Clin Cancer Res 6(12):4908-4914 (2000); Rogulski, K. R. et al. Cancer Res 60(5): 1193-1196 (2000); Harada, J. N. et al., J Virol 73(7):5333-5344 (1999); Goodrum, F. D. et al., Journal of virology 72(12):9479-9490 (1998)). 이전의 연구는 E1b-55k가 감염의 초기 단계 동안 p53에 결합하여 이를 비활성화시키는 것 외에, 감염의 후기 단계 동안 핵막을 가로지르는 mRNA 수송을 촉진하는 다기능 단백질임을 입증하였다(Babiss, L. E. et al., Mol Cell Biol 5(10):2552-2558 (1985); Leppard, K. N. et al., Embo J 8(8):2329-2336 (1989)). E1b-55k의 결실로 인한 효과적인 mRNA 수송의 결핍은 야생형 Ad5와 비교하는 경우 종양 세포에서도 낮은 바이러스 복제를 발생시켰다. 상세한 분석은 E1b-55k에 의해 제공된 mRNA 수송 기능의 손실이 종양 세포주에서 보충될 수 있는 것을 입증하였고, 이는 종양-선택적 바이러스 복제의 신규한 메커니즘을 암시한다(O'Shea, C. C. et al., Cancer Cell 8(1):61-74 (2005)). 그러나, 바이러스 유전자 결실로 인한 상실된 기능의 보충은 대부분의 종양 세포에서 불완전한데, 이는 종양 세포에서의 ONYX-015의 역가가 종종 동일 종양 세포에서의 야생형 Ad5보다 1 내지 2 log 낮기 때문이다(Heise, C. et al., Clin Cancer Res 6(12):4908-4914 (2000); Goodrum, F. D. et al., Journal of virology 72(12) :9479-9490 (1998)).
두경부암, 직장결장암, 췌장암, 폐암, 유방암 및 뇌암을 포함하는 다양한 악성종양에서 ONYX-015를 이용한 임상 시험은, 암용해성 바이러스가 단독으로 투여되거나 화학요법제와 함께 투여되는 경우에 잘 용인되는 것을 입증하였다(Heise, C. et al., Nat Med 3(6):639-645 (1997); Galanis, E. et al., Gene Ther 12(5):437-445 (2005); Chiocca, E. A. et al., Mol Ther 10(5):958-966 (2004); Hecht, J. R. et al., Clin Cancer Res 9(2):555-561 (2003); Reid, T. et al., Cancer Res 62(21):6070-6079 (2002); Vasey, P. A. et al., J Clin Oncol 20(6): 1562- 1569 (2002); Reid, T. et al., Gene Ther 8(21):1618-1626 (2001); Nemunaitis, J. et al., J Clin Oncol 19(2):289-298 (2001); Kirn, D. Gene Ther 8(2):89-98 (2001); Nemunaitis, J. et al., Gene Ther 8(10):746-759 (2001)). 그러나, ONYX-015 투여 후의 실재 임상 반응은 종양내, 정맥내 및 동맥내 투여에 의해 잘 용인되는 상기 바이러스가 치료제로서의 광범위하게 적용되기에 충분한 효능이 결핍되었다는 일반적이지 않은 우려를 발생시켰다(Kirn, D. Gene Ther 8(2):89-98 (2001)). 야생형 Ad5와 비교하는 경우의 다양한 종양 세포주에서의 ONYX-015에 대한 낮은 바이러스 역가는 ONYX-015의 효능이 항암제로서 임상적으로 활성이기에 충분하지 않다는 우려를 발생시켰다. 또한, 상기 바이러스에 의해 생성된 첫번째 단백질인 E1a는 종양 선택적으로 조절되지 않고, 이는 정상 세포 뿐만 아니라 종양 세포에서 상기 효능있는 바이러스 단백질의 발현을 가능케 하였다. E1a의 기능은 세포 분열로의 세포의 진입을 촉진하는 것이므로, 암용해성 바이러스는 종양 선택적 조절하에서 E1a 및 E1b 둘 모두를 최적으로 갖는다.
ONYX-015와 비교하는 경우 개선된 항-종양 효능을 갖는 종양 선택적 바이러스를 개발하는데 광범위한 연구가 집중되었다. 본 발명자 및 기타 연구자가 암용해성 바이러스를 제조하는데 사용된 한 방법은 E1a, E1b 및 E4를 포함하는 중요한 전사 단위의 업스트림에 종양 선택적 프로모터 요소를 삽입하는 것이었다(Li, Y. et al., Clin Cancer Res 11(24 Pt 1):8845-8855 (2005); Huang, T. G. et al., Gene Ther 10(15): 1241-1247 (2003); Wirth, T. et al., Cancer Res 63(12):3181-3188 (2003); Gu, J. et al., Gene Ther 9(1):30-37 (2002); Johnson, L. et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002); Li, X. et al., Cancer Res 65(5): 1941-1951 (2005); Li, Y. et al, Mol Cancer Ther 2(10):1003-1009 (2003)). 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen, PSA), 발암성-배아 항원(carcinogenic-embryonic antigen, CEA), E2F1 및 텔로머라제(telomerase)에 대한 프로모터와 같은 이종성 프로모터 요소의 통합은 다양한 수준의 종양 선택적 복제를 달성하였다. 종양 선택적 복제를 제공하는 이종성 프로모터를 이용하는 바이러스의 잠재적 임상 유용성은 비선택적 및 취약한(leaky) 유전자 발현, 야생형 바이러스와 비교하는 경우 상기 벡터의 감소된 복제 능력, 및 이종성 프로모터 서열로 인한 재조합 사건에 의해 제한되었다. 예를 들어, E1a 및 E4의 업스트림에 E2F1 프로모터 영역의 삽입에 의해 ONYX-015의 효능을 개선하기 위한 ONYX-411이 개발되었다(Johnson, L. et al, Cancer Cell 1(4):325-337 (2002)). 그러나, 이러한 바이러스는 임상 용도용으로 개발되지 않았다. 이종성 인핸서 서열의 제한의 일부를 극복하기 위한 노력으로, 본 발명자는, 종양 선택적 바이러스 복제가 천연 E1a 인핸서의 특이적인 유전공학에 의해 달성될 수 있는지 결정하기 위해 E1a에 대한 천연 바이러스 전사 조절 영역을 평가하였다.
발명의 개요
단백질의 종양 선택적 발현을 제공하기 위해 개별적으로 사용될 수 있거나, 다른 것과 조합하여 사용될 수 있는 변형된 서열이 본원에 제공된다.
한 양태에서, 재조합 바이러스는 변형된 E1a 조절 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 Pea3 결합 부위 또는 이의 기능적 부분이 결실된다. 한 양태에서, -305 내지 -141 범위 내의 하나 이상의 누클레오티드는 보존된다.
한 양태에서, Pea3 Ⅱ, Pea3 Ⅲ, Pea3 Ⅳ 및 Pea3 Ⅴ 중 하나 이상, 또는 이의 기능적 부분이 결실된다. 또 다른 양태에서, Pea3 Ⅱ 및 Pea3 Ⅲ 중 하나 이상, 또는 이의 기능적 부분이 결실된다. 한 양태에서, Pea3 Ⅱ 또는 이의 기능적 부분, 및 Pea3 Ⅲ 또는 이의 기능적 부분이 결실된다. 또 다른 양태에서, Pea3 Ⅳ 및 Pea3 Ⅴ 중 하나 이상, 또는 이의 기능적 부분이 결실된다. 또 다른 양태에서, Pea3 I 또는 이의 기능적 부분은 보존된다.
한 양태에서, 하나 이상의 E2F 결합 부위 또는 이의 기능적 부분은 보존된다.
한 양태에서, 벡터는 dl309-6, TAV-255, dl55, dl200, dl230 또는 dl200+230이다. 또 다른 양태에서, 벡터는 TAV-255이다.
한 양태에서, 재조합 바이러스는 하나 이상의 E1a 이소폼(isoform), 예를 들어, E1a-12S 또는 E1a-13S를 선택적으로 발현한다. 또 다른 양태에서, 재조합 바이러스는 E1a 이소폼, 예를 들어, 선택적으로 발현되지 않는 E1a-12S 또는 E1a-13S외 다른 이소폼의 발현을 실질적으로 배제한다. 한 양태에서, E1a 이소폼을 엔코딩하는 서열은 변형된 E1a 조절 서열에 작동가능하게 연결되며, 여기서 하나 이상의 Pea3 결합 부위 또는 이의 기능적 부분이 결실된다.
한 양태에서, 재조합 바이러스는 DNA 서열, 예를 들어, E1b-19k 삽입 부위에 삽입된 트랜스진(transgene)을 포함한다. 한 양태에서, 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위와 E1b 55K의 시작 부위 사이에 위치된다. 또 다른 양태에서, 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위 다음에 202개의 염기쌍의 결실을 포함한다.
한 양태에서, 트랜스진은 종양 괴사 인자를 엔코딩하는 서열 또는 이의 기능적 부분이다. 또 다른 양태에서, 트랜스진은 kras를 엔코딩하는 서열 또는 이의 기능적 부분이다. 또 다른 양태에서, 트랜스진은 변형된 E1a 조절 서열에 작동가능하게 연결되며, 여기서 하나 이상의 Pea3 결합 부위 또는 이의 기능적 부분이 결실된다.
상기 양태 중 임의의 양태에서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스일 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포는 상기 재조합 바이러스 중 어느 하나로 형질전환된다.
또 다른 양태에서, 표적 세포에서 펩티드를 선택적으로 발현시키는 방법은 표적 세포와 상기 재조합 바이러스 중 어느 하나를 접촉시키는 것을 포함한다. 한 양태에서, 재조합 바이러스는 펩티드, 예를 들어, 바이러스 복제 또는 암과 관련된 펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 결실 돌연변이 E1a 조절 서열을 포함한다.
한 양태에서, 표적 세포는 신생물 세포이다. 또 다른 양태에서, 표적 세포는 정상 세포이다.
상기 방법은 생체내 또는 시험관내에서 실시될 수 있다. 한 양태에서, 바이러스는 근내, 정맥내, 동맥내, 또는 종양내 주사에 의해 투여된다.
도면의 간단한 설명
E1a
전사 조절 영역 결실
도 1. Wt Ad5로 감염된 폐 섬유모세포 및 암 세포에서의 아데노바이러스 E1A 단백질의 발현. 정지 원발성 폐 섬유모세포 및 암세포주를 5의 감염다중도(MOI)로 Wt Ad5로 감염시켰고, 단백질을 감염 후 다양한 시간(h.p.i.)에서 추출하고, E1A 발현에 대해 분석하였다. (A) 정지세포주(MRC-5 및 IMR-90) 및 암세포주(A549 및 PANC-1)에서의 E1A 단백질의 발현. (B) 다양한 종양세포주 AsPC-1, LNCaP, HeLa 및 Calu-6에서의 E1A의 발현. 289R, 243R 및 55R의 아미노산 잔기 (R)을 갖는 E1A 단백질의 다양한 스플라이스(splice) 변이체가 화살표로 제시되어 있고, β-튜불린(로딩 대조군)이 웨스턴 블롯 옆에 표시되어 있다. 시간 경과는 패널 상부에 표시되어 있고, 세포주는 각각의 블롯의 좌측에 표시되어 있다.
도 2. 감염 후 다양한 시간에서의 감염된 (a) MRC-5, (b) A549 및 (c) PANC-1 세포(MOI 5)에서의 E1A mRNA의 유도. 6 h.p.i.에서의 MRC5 세포주에서의 Wt Ad5 E1A 발현에 비한 E1A 발현 배수 증가를 계산하였다.
도 3. 아데노바이러스 E1A 프로모터/인핸서(+143 내지 +552)에 의해 유도된 리포터 플라스미드(pE1P/EGL3)로부터의 루시퍼라제의 발현. 세포를 리포터 플라스미드로 트랜스펙션시켰고, 각각의 세포주로부터 발광 값을 수득하였다. 결과는 이중 샘플의 평균이며, 3개의 독립적 실험의 대표이다. 발광 값(log)이 Y-축에 표시되며, 세포주는 X-축에 표시된다.
도 4. (A) Ad5 E1A 전사 단위의 업스트림 조절 영역의 개략적 대표도. 전사 시작 부위(+1), 인핸서 영역(-305 내지 -141) 및 ITR 영역(-498 내지 -395)가 상부에 표시된다. Pea3 및 E2F1에 대한 전사 인자 결합 부위가 작은 화살표 및 별표로 각각 표현된다. 결실 돌연변이 바이러스 및 이들이 포함하는 누클레오티드 결실이 속이 채워진 막대(solid bar)로 표시되며, 영역이 이의 상부에 표시된다. 각각의 돌연변이 바이러스의 명칭이 이의 개략적 다이어그램의 좌측에 표시된다. (B) Wt Ad5 및 돌연변이 바이러스로 감염된 MRC-5 및 A549 세포에서의 E1A 단백질의 발현. 세포를 5의 MOI로 개별적 바이러스로 감염시키고, 단백질을 24 h.p.i.에 수거하였다. 289R, 243R 및 55R의 아미노산 잔기 (R)를 갖는 E1A의 다양한 스플라이스 변이체가 화살표에 의해 제시되며, β-튜불린(로딩 대조군)이 웨스턴 블롯 옆에 표시된다. 세포주는 각각의 블롯 좌측에 표시된다. (C) MRC-5 및 A549 세포에서 Wt Ad5 및 TAV-255에 의한 E1A 발현에 대한 시간 경과 검정. 세포를 5의 MOI로 감염시키고, 단백질을 감염 후 표시된 시간에서 수거하였다. 바이러스는 실선의 상부에 표시되고, 289R, 243R 및 55R의 아미노산 잔기 (R)를 갖는 E1A 단백질의 다양한 스플라이스 변이체가 화살표에 의해 제시되고, β-튜불린(로딩 대조군)은 웨스턴 블롯 옆에 표시된다.
도 5. 감염 24시간 후에 감염된 (a) MRC-5 및 (b) A549 세포(MOI 5)에서의 E1A mRNA의 유도를 실시간 Q-PCR로 결정하였다. E1A, 배수 증가 또는 감소를 Wt Ad5와 비교하여 계산하였다.
도 6. 다양한 아데노바이러스로 감염된 세포주에서의 아데노바이러스 E1A 및 E1b 단백질의 웨스턴 블롯 분석. (a) 암세포주(A549 및 Panc-1)를 5의 MOI로 바이러스로 감염시키고, 단백질을 24 h.p.i.에 수집하였다. 작은 화살표는 E1A의 스플라이스 변이체의 발현을 나타내고, 바이러스는 블롯의 상부에 표시되고, 세포주는 속이 채워진 막대의 상부에 표시된다. (b) Wt Ad5, Onyx-015 및 TAV-255로 감염(MOI 5)된 MRC-5 및 A549 세포에서 아데노바이러스 E1b-55kDa 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 단백질 샘플을 24 h.p.i.에 수집하고, E1B 모노클로날 항체로 프로빙시켰다. 작은 화살표는 E1B 55kDa 단백질의 정확한 크기를 나타내고; 다른 밴드는 비특이적이다. 바이러스는 블롯의 상부에 표시된다.
도 7. Ad 5 돌연변이에 의한 정상 세포 및 종양 세포의 성장 억제. (a) 정상 세포주 MRC-5 및 (b) 종양 세포주(A549, HeLa 및 Calu-6)를 5의 MOI로 Wt Ad5/TAV-255/Onyx-015로 감염시키고, 세포 생활력 검정을 감염 6일 후에 CCK-8을 이용하여 수행하였다. 결과는 삼중 실험의 평균 +/- SD(오차 막대)를 나타내고, PBS 처리된 대조 세포와 같이 나타내었다. (c) MRC-5 세포를 5의 MOI로 Wt Ad5 또는 TAV-255로 감염시키고, PBS 처리된 세포를 대조군으로 제공하였다. 바이러스 처리 및 비처리(대조군) 세포를 감염 6일 후에 사직을 찍었다.
도 8. MRC-5 세포에서 dl309 및 E1a 발현의 결실 돌연변이. (A) HAd-5 E1a 전사 단위의 업스트림 조절 영역의 개략적 대표도. 전사 시작 부위(+1), 인핸서 영역(-305 내지 -141) 및 ITR 영역(-498 내지 -395)가 상부에 표시된다. dl309 유전체에서 5개의 Pea3 결합 부위가 화살표로 표시되고, 5개의 E2F 결합 부위가 별표로 표시된다. 결실 돌연변이 바이러스 및 이를 포함하는 누클레오티드가 속이 채워진 막대로 표시되고, 누클레오티드가 상부에 표시된다. 돌연변이 바이러스의 명칭은 개략적 다이어그램 좌측에 표시된다. (B) 24 h.p.i 후에 돌연변이 바이러스로 감염된 MRC-5 세포로부터 추출된 E1a 단백질의 웨스턴 블롯 분석; β-튜불린(로딩 대조군)은 E1a 블롯 아래에 표시된다. (C) 24 h.p.i.에서 MRC-5 세포에서 돌연변이 아데노바이러스에 의해 생성된 E1a mRNA의 상대 정량화.
도 9. 돌연변이 아데노바이러스로 감염된 A549 세포에서의 E1a의 발현. (A) 세포를 돌연변이 아데노바이러스로 감염시키고, 단백질을 8 및 24 h.p.i.에서 수거하고, E1a 특이적 항혈청으로 프로빙하였다; β-튜불린(로딩 대조군)이 또한 제시된다. (B) 8 h.p.i.에서 HAd-5 돌연변이로 감염된 A549 세포에서 생성된 E1A mRNA의 상대 Q-PCR 분석.
도 10. TAV-255 내에서의 결실 돌연변이 아데노바이러스 및 MRC-5 세포에서의 E1a의 발현. (A) 1개의 E2F1 부위 및 2개의 Pea3 부위 Ⅱ 및 Ⅲ를 포함하는 TAV-255의 개략적 대표도. TAV-255 내에서의 6개의 염기쌍 결실이 검은색으로 속이 채워진 막대로 표시되고, 이를 포함하는 누클레오티드가 상부에 표시된다. 각각의 바이러스 명칭이 개략적 다이어그램 좌측에 표시되고; dl200은 Pea3 결합 부위 Ⅲ를 제거하고, dl212는 E2F 결합 부위를 제거하고, dl220은 6 bp 누클레오티드를 제거(대조군)하고, dl230은 Pea3 결합 부위 Ⅱ를 제거하고, dl200+230은 Pea3 부위 Ⅱ+Ⅲ를 제거하였다. (B) 48 h.p.i.에서 다양한 돌연변이 바이러스에 의해 표현된 E1a 단백질의 웨스턴 블롯 분석; β-튜불린(로딩 대조군)은 E1a 블롯 아래에 제시된다. (C) 24 h.p.i.에서 다양한 아데노바이러스 돌연변이로 감염된 세포에서의 E1a mRNA의 상대 Q-PCR 분석.
도 11. E2F의 결실 돌연변이 바이러스 및 MRC-5 세포에서의 E1a의 발현. (A) E1a 인핸서 영역 및 이를 포함하는 누클레오티드에서 별표로 제시된 E2F 부위의 개략적 대표도가 상부에 제시된다. 돌연변이 바이러스 명칭이 개략도 좌측에 표시되고; dl212 및 dl275는 단일한 E2F 부위 결실을 갖고, dl212+275는 둘 모두의 E2F 부위 결실을 갖고, dl220는 대조군으로 제조하였다. (B) 24 h.p.i.에서 다양한 아데노바이러스 돌연변이로 감염된 세포에서 발현된 E1a 단백질의 웨스턴 블롯 분석; β-튜불린은 로딩 대조군으로 제시된다. (C) 다양한 아데노바이러스 돌연변이로 감염된 세포에서의 24 h.p.i.에서의 E1a mRNA 발현에 대한 상대 Q-PCR.
도 12. 다양한 아데노바이러스로 형질전환되지 않은 세포주 및 아데노바이러스로 감염된 형질전환 세포주에서의 E1a 단백질의 발현. (A) 형질전환되지 않은 세포주; (a) MRC-5, (b) IMR-90 및 (c) WI-38, 및 (B) 형질전환된 세포주; (e) HeLa, (f) Panc-1 및 (g) Calu-6을 dl309/dl200+230으로 감염시키고, 단백질을 표시된 감염 시간 후에 수거하고, E1a 발현에 대한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 13. 시험관내에서의 암용해성 활성. (A) 형질전환된 세포주(A549, HeLa, Panc-1 및 Calu-6) 및 형질전환되지 않은 세포주(MRC-5)를 바이러스; Wt HAd-5, 및 dl200+230으로 감염시키고, 감염 4일 및 5일 후에 CCK-8 키트를 이용하여 생활력에 대해 분석하였다. (B) 다양한 아데노바이러스의 세포변성 효과를 표시된 MOI로 감염된 MRC-5 세포에서 크리스탈 바이올렛 검정에 의해 분석하고, 감염 5일 후에 염색하였다.
도 14. 형질전환되지 않은 WI-38 세포를 컨플루언스(confluence)로 성장시킨 후, 10의 MOI로 Ad5 또는 TAV-255로 감염시켰다. 감염되지 않은 대조 세포 및 감염된 세포를 감염 7일 후에 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 4Ox 배율로 사진을 찍었다. 이미지는 대조 세포 및 TAV-255로 처리된 세포에서 바이러스 세포용해의 증거 없이 세포의 균일한 단층을 나타낸다. 대조적으로, Ad5로 처리된 세포에 대해 광범위한 세포용해가 관찰된다.
도 15. 형질전환된 A549 세포를 컨플루언스로 성장시킨 후, 10의 MOI로 Ad5 또는 TAV-255로 감염시켰다. 감염되지 않은 대조 세포 및 감염된 세포를 감염 3일 후에 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 4Ox 배율로 사진을 찍었다. 이미지는 대조 세포에서 바이러스 세포용해의 증거 없이 세포의 균일한 단층을 나타낸다. 대조적으로, Ad5 및 TAV-255로 처리된 세포에 대해 광범위한 세포용해가 관찰된다.
E1a 이소폼 12S 및 13S의 선택적 발현
도 16. (A) WI-38 및 (B) MRC-5 세포에서 야생형 Ad5 (WT) 및 PM975 아데노바이러스를 이용한 감염(MOI=5) 후의 E1a 발현의 시간 경과.
도 17. (A) A549 및 (B) Panc 1에서의 E1a 발현.
도 18. A) a) WI-38 세포 및 b) MRC-5 세포(MOI=5)에서의 E1A 발현의 시간 경과. B) c) A549 세포 및 d) Panc-1 세포(MOI=5)에서의 E1A 발현의 시간 경과.
도 19. A) WI-38 세포 및 B) A549 세포(MOI=5)에서의 E1A 발현의 시간 경과.
도 20. 48 및 72 시간에서 E1a에 대한 Ad5, TAV 및 TAV-13s로 감염(MOI=5)된 성장 정지된 WI-38 세포에서의 E1a 발현.
도 21. 30의 MOI로 감염 7일 후에 WI-38 세포 및 3의 MOI로 감염 5일 후에 A549, Panc-1, LnCap 및 Hep3b에서의 dl309, PM975, dl1520 또는 dl1520을 이용한 감염 후의 세포의 생활력.
도 22. 2의 MOI에서 A549에서의 E1a 발현: A549 세포를 2의 MOI로 Ad5, TAV, PM975(13s) 또는 13sTAV로 감염시켰다. 단백질을 감염 24 및 48시간 후에 감염된 세포로부터 분리시키고, 웨스턴 블롯에 의해 E1a의 발현에 대해 분석하였다. 13S E1a mRNA(289R)의 발현이 대략 동등한 존재비(abundance)로 모든 레인에서 관찰되며, 이는 13S(PM975) 및 13S-TAV의 발현으로 제한된 바이러스에서 관찰된 유일한 형태이다. 이는 나타낸 바와 같은 인핸서 결실의 도입(TAV 및 13s-TAV)이 E1a-289R의 발현에서 현저한 감소를 발생시키지 않은 것을 입증한다.
도 23. 2의 MOI에서의 WI138에서의 E1a 발현: 성장 정지된 WI-38 세포를 Ad5, TAV-255(TAV), PM975(13S 발현 단독), 및 13S-TAV(TAV-255 프로모터 결실 및 13S로의 발현의 제한)로 감염시켰다. 단백질을 감염 24 및 48시간 후에 세포로부터 추출하고, 웨스턴 블롯에 의해 E1a의 발현에 대해 분석하였다. E1a의 289R 및 243R 형태의 발현이 Ad5로 감염된 세포에서 감염 48시간 후에, 보다 덜한 정도(TAV)로 관찰된다. E1a의 검출가능한 발현이 PM975 또는 13S-TAV로 감염된 세포에서 관찰된다.
E1b 19K 클론 삽입
도 24. 아데노바이러스 타입 5의 E1 영역의 구성. E1b-19k 및 E1b-55k는 mRNA 스플라이싱 변이체에 의해 중첩 서열로부터 유래된다. E1b-19k로부터 처음 202개의 누클레오티드가 E1b 시작 부위 후에 결실되었고, DNA 삽입물이 E1b-55k 시작 부위의 파괴 없이 프레임(frame)으로 상기 부위에 클로닝되었다.
도 25. E1b-19k 삽입 부위를 갖는 E1a 및 E1b 영역의 개략도가 제시된다.
도 26a 및 b. Ad5의 E1b-19k 영역으로 선택적으로 삽입된 막 안정화 TNF의 서열을 나타낸다.
도 27. E1b-19k 및 TAV-255 프로모터 결실에서 결실을 갖는 벡터를 발생시키는 E1a의 프로모터에서의 50 염기쌍 결실의 서열을 나타낸다.
도 28. AD19kTNF를 이용한 감염 후의 종양 세포 표면에서의 TNF의 발현.
도 29. (A) 감염 3일 후 및 (B) 감염 5일 후의 MRC5에서의 세포독성 검정.
도 30. (A) 감염 3일 후 및 (B) 감염 5일 후의 A549에서의 세포독성 검정.
도 31. (A) 감염 3일 후 및 (B) 감염 5일 후의 Panc1에서의 세포독성 검정.
도 32a-c. 유세포분석을 이용한 AdTAV19kmmTNF에 의한 TNF의 표면 발현의 분석.
도 33. 감염 3일 후의 SK-Mel-28(흑색종)에서의 크리스탈 바이올렛 검정.
도 34. 감염 48시간 후의 5의 MOI로 Ad19k 또는 AdTAV19TNF로 감염된 Hep3b 세포에서의 카스파제-3의 활성화.
도 35. 감염 48시간 후의 2의 MOI에서의 AD-Δ19kD-kras/TAV에서의 E1b-55kD 발현.
도 36. Ad19kTAVhrGFP 트랜스펙션 용해물로부터의 GFP 및 E1A의 PCR 증폭.
도 37. Ad19kTAVGFP를 이용한 2의 MOI로 감염된 A549에서의 GFP 발현.
발명의 상세한 설명
Ⅰ. 약어 및 정의
본원에서 사용된 약어는 화학적 및 생물학적 분야에서의 이의 통상적인 의미를 갖는다. 참조의 용이성을 위해, 본원에서 사용되는 약어는 하기와 같이 정의된다:
Wt Ad5: 야생형 아데노바이러스 타입 5
MOI: 감염다중도
hpi: 감염 후 시간
본원에서 언급된 신생물 세포주는 하기를 포함한다:
A549: 폐암
PANC-1: 췌장암
AsPC-1: 췌장암
LNCaP: 전립선암
HeLa: 자궁경부암
Calu-6: 폐암
SK-Mel-28: 흑색종
본원에 언급된 비-신생물 세포주는 호흡기 폐 섬유모세포 세포주 MRC-5, WI-38 및 IMR-90을 포함한다. 세포주 HEK-293A는 아데노바이러스 E1-형질전환된 인간 배아 신장 세포이다.
본원에서 사용된 결실 돌연변이는 하기 표시된 누클레오티드의 결실을 특징으로 한다. 결실에 의해 영향을 받은 결합 부위가 괄호로 표시된다.
dl309: -498 내지 -395, -305 내지 -141
dl309-6: -393 내지 -304(Pea3 Ⅴ 및 Pea3 Ⅳ)
dl340-12: -145 내지 -44
TAV-255: -305 내지 -255(Pea3 Ⅲ, E2F Ⅱ, Pea3 Ⅱ)
dl87: -201 내지 -195(Pea3 Ｉ)
dl55: -270 내지 -240(Pea3 Ⅱ)
dl275: -225 내지 -218(E2F Ｉ)
dl200: -299 내지 -293(Pea3 Ⅲ)
dl212: -287 내지 -281(E2F Ⅱ)
dl220: -280 내지 -275
dl230: -270 내지 -265(Pea3 Ⅱ)
dl200+230: -299 내지 -293(Pea3 Ⅲ), -270 내지 -265(Pea3 Ⅱ)
dl212+275: -287 내지 -281(E2F Ⅱ), -225 내지 -218(E2F Ｉ)
본원에서 사용되는 단수형은 단수로 특별히 기재하지 않는 한 하나 이상을 의미한다.
Ⅱ. E1a 전사 조절 영역에서의 결실의 연구
E1a는 HAd-5 감염 후에 발현된 첫번째 유전자이고, 이는 성공적인 바이러스 복제에 본질적으로 필요하다 (Gaynor, R. B., and Berk, A. J. (1983). Cis-acting induction of adenovirus transcription. Cell 33: 683-693). 아데노바이러스 E1a 전사 조절 영역은 E2F1에 대해 2개의 결합 부위 및 Pea3에 대해 5개의 결합 부위를 포함하는 다수의 조절 요소를 갖는다(Bruder, J. T. et al, J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). 이러한 전사 인자는 일반적으로 종양 세포에서 이상 발현된다(de Launoit, Y. et al., Adv Exp Med Biol 480:107-116 (2000); Hanahan, D. et al., Cell 100(1):57-70 (2000)). 이러한 전사 인자에 대한 다수의 결합 부위가 존재하므로, 본 발명자는 상기 결합 부위의 일부가 정상 세포에서 효과적인 E1a 발현에 중요하고, 종양 세포에서는 중요하지 않은지 결정하는 것을 연구하였다. 본 발명자는 E1a mRNA 및 단백질이 인간 아데노바이러스 5(Ad5)로 감염된 형질전환되지 않은 세포에 비해 종양 세포에서 보다 이른 시간 및 보다 높은 수준으로 발현되는 것을 관찰하였다. 이러한 효과의 메커니즘을 이해하기 위해, 본 발명자는 종양 세포 및 형질전환되지 않은 호흡기 상피 세포의 발현에 대한 E1a 전사 조절 영역을 통한 일련의 작은 결실의 영향을 평가하였다. E1a 개시 부위의 업스트림 영역에서의 다양한 결실은 종양 세포에서의 E1a의 발현에 대한 최소 영향을 가지면서 형질전환되지 않은 호흡기 상피 세포에서 E1a의 발현을 감소시켰다. 특히, E1a 개시 부위의 업스트림의 -305 내지 -255에 위치된 50개 염기쌍 영역의 결실을 갖는 TAV-255는 종양 세포에서 Wt Ad5와 유사한 E1a 발현을 유지하면서 형질전환되지 않은 세포에서 E1a mRNA 및 단백질 발현의 현저한 감소를 발생시켰다. 또한, 이러한 50 bp 결실은 종양 세포에서 E1b의 정상 수준 근처를 유지하면서 형질전환되지 않은 세포에서 E1b의 현저히 감소된 발현을 발생시켰다. 형질전환되지 않은 세포에서 매우 약화되나, TAV-255는 종양 세포주에서 E1a 및 E1b의 발현 및 세포독성 활성에서 야생형 Ad5와 유사하다.
E1a mRNA 및 단백질은 형질전환되지 않은 세포에서보다 종양 세포에서 보다 초기 및 보다 높은 존재비로 유도된다. Ad5의 천연 전사 조절 영역은 E2F1, Sp1 및 Pea3에 대한 결합 부위를 포함하는 종양 세포에서 통상적으로 과다 발현되는 전사 인자에 대한 결합 부위를 갖는다. 결과적으로, E1a 발현의 조절은 형질전환되지 않은 세포에서보다 종양 세포에서 다양할 수 있다. 이러한 가능성을 평가하기 위해, 야생형 Ad5가 종양 세포 및 형질전환되지 않은 세포를 감염(MOI=5)시키는데 사용되었고, E1a 단백질의 발현이 세포의 감염 후에 여러 시점에서 평가되었다. 결과(도 1a)는 E1a 발현이 형질전환되지 호흡기 상피 세포(MRC-5 및 IMR-90)에 비해 종양 세포주(A549 및 PANC-I)에서 보다 초기 및 보다 높은 존재비로 검출되는 것을 입증한다. E1a의 검출가능한 발현이 형질전환되지 않은 호흡기 상피 세포주 MRC-5 및 IMR-90에서 상기 시험에서 관찰되지 않으면서 E1a 단백질의 풍부한 발현이 종양 세포주에서 감염 6 내지 8시간 후(h.p.i.)에서 관찰된다. 감염 24시간 후, E1a의 발현(289R 및 243R, 13s 및 12s mRNA 종 각각에 상응함)이 MRC-5 및 IMR-90 둘 모두에서 동등한 수준으로 관찰된다. 그러나, 웨스턴 블롯에 의해 종양 세포에서 검출된 E1a(55R, 243R 및 289R)의 양은 형질전환되지 않은 세포에서 관찰된 양을 크게 초과한다. 감염 8시간 후에 종양 세포에서 관찰된 E1a의 존재비는 감염 24시간 후에 형질전환되지 않은 세포에서 관찰된 E1a의 존재비와 동등하다. 이러한 효과를 추가로 평가하기 위해, E1a 발현의 발생 및 존재비가 AsPc-I 및 PANC-I(췌장), Calu-6(폐), LNCaP(전립선) 및 HeLa(자궁경부) 세포를 포함하는 종양 세포주의 패널(도 1b)에서 평가되었다. 이러한 세포주의 각각에서, E1a의 발현이 형질전환된 세포에서 감염 6 내지 8시간 후까지 검출되고, 감염 6 내지 8시간 후에서 형질전환된 세포에서 관찰된 E1a의 양은 감염 24시간 후에서 형질전환되지 않은 세포에서 관찰된 E1a의 양과 동등하다(도 1a).
E1a mRNA 발현은 초기에 발생하고, 정량 PCR에 의해 형질전환된 세포에 비해 종양 세포에서 더욱 풍부하다. E1a mRNA에서의 검출가능한 증가가 감염 2 내지 4시간 이내에 A549 및 PANC-1 세포에서 발생하였고, 이는 MRC-5 세포에서의 발현을 거의 6배까지 초과한다(도 2). 8 내지 24시간까지 형질전환된 세포에서의 E1a 의 발현은 MRC-5 세포에서의 E1a의 발현을 40배 내지 70배까지 크게 초과한다. 이러한 결과는 E1a의 전사가 형질전환되지 않은 세포 보다 종양 세포에서 더욱 효과적이어서, Ad5를 이용한 감염 후에 종양 세포에서 E1a의 초기 및 풍부한 발현을 발생시키는 것을 추가로 입증한다.
E1a 인핸서/프로모터로부터의 전사를 추가로 평가하기 위해, E1a 대신에 루시퍼라제를 갖는 플라스미드 리포터가 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포로 트랜스펙션되었다. 발광이 트랜스펙션 24 및 48시간 후에 정량되었다. 트랜스펙션 24시간 후에 수행된 검정은 MRC5 세포주에서 검출가능한 루시퍼라제 발현을 발생시키지 않았고, 암세포주는 대조군 값과 비교하는 경우 루시퍼라제 발현의 1000배의 향상을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음). 검출가능한 루시퍼라제 발현이 감염 48시간 후까지 MRC-5 및 IMR-90(폐 섬유모세포) 세포에서 관찰되었으나, 이는 암 세포주에서의 루시퍼라제 발현에 비해 약 100-1000배 미만으로 유지되었다(도 3). 레닐라(Renilla) 발현이 또한 측정되었고, 세포주 사이에 트랜스펙션 효율을 결정하기 위해 대조군으로 제공되었다.
E1A 전사 조절 영역의 결실 돌연변이를 제조하였고, 종양 세포 및 형질전환되지 않은 세포에서의 E1A 발현이 분석되었다. 종양 세포와 형질전환되지 않은 세포 사이의 E1a의 전사 조절 사이의 차이가 존재하는 것을 결정하기 위해, 본 발명자는 E1a에 대한 업스트림 조절 영역에서 다양한 결실을 갖는 아데노바이러스 작제물을 이용한 종양 세포 및 형질전환되지 않은 세포에서의 E1a 발현을 평가하였다, 도 4a. 상기 결실 벡터의 각각으로부터의 형질전환되지 않은 세포(MRC-5) 및 형질전환된 세포(A549)에서의 E1a 발현의 결과가 도 4b에 제시된다. 결과는 결실이 A549 세포에서의 E1a 발현에 대해 유의한 영향을 갖지 않는 것을 입증한다. 그러나, 결실 돌연변이 바이러스 dl309-6 및 TAV-255가 MRC-5 세포에서의 E1a 발현을 감소시켰다. 특히, -305 내지 -255의 영역에 걸친 결실이 MRC-5 세포로부터 E1a 발현의 거의 완전한 손실을 발생시켰으나, 이는 A549 세포로부터의 E1a 발현에 대해 측정가능한 영향을 미치지 않았다. 이러한 결실은 형질전환되지 않은 세포와 형질전환되지 않은 세포 사이에 E1a의 가장 큰 차별적 발현을 제공하였다. 이러한 효과를 추가로 평가하기 위해, 본 발명자는 야생형 Ad5 및 TAV-255를 이용한 MRC-5 및 A549 세포의 감염 후에 시간에 따른 E1a 단백질의 발현을 비교하였다, 도 4c. 이러한 결과는 둘 모두의 벡터를 이용한 감염 후의 A549 세포주에서의 풍부한 E1a 발현을 입증한다. 그러나, E1a의 발현은 TAV-255를 이용한 감염 후에 형질전환되지 않은 MRC-5 세포에서 급격히 감소되었다.
인핸서 돌연변이로부터의 E1A mRNA 발현이 정량-PCR에 의해 분석되었다. 본 발명자는 야생형 Ad5, TAV-255, 및 E1a 시작 부위에 가장 근접하여 위치된 단일 Pea3 부위를 제거하는 결실을 갖는 dl87를 이용한 MRC-5 및 A549 세포의 감염 후에 E1a mRNA의 발현을 추가로 특성규명하였다. E1a mRNA 발현은 Ad5 야생형 및 dl87에 비해 TAV-255로 감염된 MRC-5 세포에서 20-30배 감소되었다. 그러나, E1a mRNA 발현은 상기 바이러스 각각으로 감염된 A549 세포에서 대략 동등하다(도 5).
Onyx-015 및 TAV-255가 E1a 및 E1b의 발현에 관하여 비교되었다. Onyx-015는 E1b-55k 바이러스 유전자의 결실을 가지나, 형질전환되지 않은 세포에서 E1a 발현을 제한하는 변형을 갖지 않는다. 도 6a는 Ad5, TAV-255 및 Onyx-015로 감염된 A549 및 Panc-1 세포에서의 E1a 발현의 동등한 수준을 입증한다. E1b의 발현에 대한 TAV-255의 영향을 결정하기 위해, 본 발명자는 MRC-5 및 A549 세포에서 단백질 발현을 평가하였다. 도 6b에 제시된 결과는 TAV-255으로부터의 E1b의 발현이 Ad5에 비해 MRC-5 세포에서 감소된 것을 입증한다. E1b-55k의 결실을 갖는 Onyx-015는 검출가능한 E1b 발현을 갖지 않는다. 대조적으로, E1b-55k는 Ad5 및 TAV-255 둘 모두로부터 종양 세포에서 유사한 수준으로 발현되고, Onyx-015로 감염된 종양 세포주에서 존재하지 않는다. 이러한 결과는 E1b의 발현이 종양 세포에서 대략 야생형 수준으로 유지되면서 형질전환되지 않은 세포에서의 E1b 발현의 기능적 약화를 입증한다.
본 발명자는 세포 생활력에 대한 TAV-255의 효과를 평가하였다. MRC-5, A549, HeLa 및 CaLu-6 세포가 야생형 Ad5, Onyx-015 및 TAV-255로 감염되었다. 야생형 Ad5는 이러한 검정에서 MRC-5 세포를 효과적으로 사멸시킨 반면; Onyx-015 및 TAV-255 둘 모두는 MRC-5 세포에 대한 최소의 세포독성을 나타내었다(도 7a). 대조적으로, TAV-255의 세포독성은 3개의 종양 세포주(A549, HeLa 및 CaLu-6)에서 야생형 Ad5와 동등하였고, A549 및 HeLa 세포 둘 모두에서 Onyx-015보다 현저히 나았다(도 7b). 야생형 및 TAV-255 바이러스로 감염된 MRC-5 세포의 현미경사진(도 7c)은 감염 6일 후에 TAV-255로 최소 세포독성이 관찰되면서 야생형 Ad5를 이용한 MRC-5 세포의 본질적으로 완전한 세포 사멸을 입증한다. Wt Ad5 또는 TAV-255로 감염된 A549 세포에 대해 완전한 세포독성이 관찰되었다(데이터는 제시되지 않음).
ONYX-015는 암용해성 바이러스의 원형이며, 이는 두경부암, 폐암, 직장결장암, 난소암, 췌장암 및 뇌암을 포함하는 다양한 악성종양에서 임상 시험을 거쳤다. ONYX-015의 1000회를 초과하는 종양내 주사가 두경부 종양을 갖는 환자에 투여되었고, 200회를 초과하는 주입이 전이 직장결장 암을 가지나, 부작용과 관련된 심각한 치료가 없는 환자의 간동맥으로 투여되었다(Reid, T. et al, Cancer Res 62(21):6070-6079 (2002); Nemunaitis, J. et al, Gene Ther 8(10):746-759 (2001); Khuri, F. R. et al., Nat Med 6(8):879-885 (2000); Nemunaitis, J. et al., Cancer Gene Ther 10(5):341-352 (2003); Nemunaitis, J. et al., Cancer Gene Ther 14(11):885-893 (2007) Reid, T. R. et al., Cancer Gene Ther 12(8):673-681 (2005)). 주요한 부작용은 열 및 오한을 포함하는 등급 Ⅰ/Ⅱ 플루-유사 증상이었다. 잘 용인되는 경우, ONYX-015에 대한 객관적 반응률은 소수의 환자에 제한되었다. ONYX-015에 대한 객관적 반응률이 적당하였으므로, 개선된 효능을 갖는 암용해성 벡터를 개발하기 위한 노력이 이루어졌다(Kirn D. Oncogene 19(56):6660-6669 (2000); Li, Y. et al., Clin Cancer Res 11(24 Pt 1):8845-8855 (2005); Johnson, L. et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002); Hermiston, T. Current opinion in molecular therapeutics 8(4):322-330 (2006)). 별개의 종양 특이적 이종성 프로모터 하에 E1a 및 E1b를 배치하기 위한 노력을 포함하는 암용해성 바이러스의 종양 선택성 및 효능을 개선시키 위해 다양한 방법을 이용하였다. 그러나, 이러한 벡터는 형질전환되지 않은 세포에서 E1a 및 E1b의 취약한 전사, 야생형 Ad5에 비한 재조합 및 낮은 복제 잠재성을 갖는다.
E1a 및 E1b의 발현을 조절하기 위한 이종성 프로모터의 사용에서 선천적인 제한 중 일부를 극복하기 위해, 본 발명자는 E1a에 대한 내생 아데노바이러스 프로모터 및 인핸서의 분석에 관심을 집중시켰다. 본 발명자는 E1a mRNA 및 단백질 발현의 발생이 초기에 발생하고, 호흡기 상피 세포에서보다 종양 세포주에서 더욱 풍부한 것을 발견하였다. E1a의 초기 및 풍부한 발현이 폐암, 췌장암, 자궁경부암 및 전립선암으로부터의 세포주를 포함하는 다양한 종양 세포주에서 관찰되었다. E1a 단백질은 시험된 종양 세포의 패널에서 감염 6 내지 8시간 후에 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있다. 감염 6 내지 8시간 후에 E1a 발현의 존재비는 감염 24시간 후까지 2개의 형질전환되지 않은 호흡기 상피 세포주에서 관찰된 E1a 발현과 유사하였다.
종양 세포에서 E1a의 초기 및 풍부한 발현을 추가로 평가하기 위해, 본 발명자는 E1a 시작 부위의 DNA 서열 업스트림에서 다양한 결실을 갖는 바이러스로부터의 E1a의 발현을 연구하였다. 인핸서 서열은 위치 또는 배향과 독립적으로 전사를 강화시키며, 이는 아데노바이러스를 포함하는 다양한 시스템에서 기재되어 있다(Hearing, P. et al, Cell 33(3):695-703 (1983)). 코어 서열이 위치 또는 배향과 독립적으로 E1a의 발현을 강화시킬 수 있는 E1a 시작 부위의 업스트립의 200 내지 300 누클레오티드로 확인되었다(Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). 이전의 연구는 이러한 코어 인핸서 서열의 결실이 감염 5시간 후에 HeLa 세포에서 mRNA 발현에서 2 내지 5배 감소를 발생시키나; 이러한 결실이 감염 24시간 후까지 mRNA 발현에 대해 영향이 거의 없고, 바이러스 복제에 대해 영향을 갖지 않는 것을 입증한다(Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). 그러나, E1a 인핸서의 이전의 분석이 아데노바이러스 타입 5 감염에 대한 천연 숙주 세포인 호흡기 상피 세포가 아닌 종양 세포, 주로 HeLa 세포에서 수행되었다. Ad5 인핸서 영역 내의 특이적 전사 인자 결합 부위는 E2F1에 대해 2개의 결합 부위 및 Pea3에 대해 5개의 결합 부위를 포함한다. 상기 전사 인자가 통상적으로 종양 세포에서 과다발현되므로, E1a 인핸서의 중요한 기능이 호흡기 상피 세포가 아닌 종양 세포의 상황에서 인핸서의 분석에 의해 가려질 수 있다.
본 발명자는 종양 세포 및 형질전환되지 않은 호흡기 상피 세포에서 E1a의 발현에 대해 E1a 시작 부위의 업스트림 영역 내에서의 결실의 영향을 비교함으로써 아데노바이러스의 인핸서 영역의 분석까지 확장시켰다. 이전의 간행물과 일치하게, 본 발명자는 E1a 인핸서 영역의 큰 영역의 결실이 종양 세포주에서 E1a 발현 및 바이러스 복제에 대해 거의 영향이 없는 것을 발견하였다(Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). 그러나, 본 발명자는 이제 이전에 정의된 인핸서 영역 외부의 결실을 포함하는 다양한 결실이 형질되지 않은 호흡기 상피 세포에서 E1a 발현 및 바이러스 복제에 대해 현저한 영향을 갖는 것을 입증한다. 특히, 본 발명자는 1개의 E2f1 부위 및 2개의 Pea3 부위를 제거하는 천연 Ad5 인핸서의 5개의 염기쌍의 서열의 결실이 호흡기 상피 세포에서 E1a 및 E1b mRNA 및 단백질 발현의 현저한 억제를 발생시키나; 이러한 결실이 종양 세포주의 패널에서 E1a의 발현에 대해 거의 영향을 갖지 않는 것을 발견하였다. 본 발명자는 제안된 E1a 인핸서의 업스트림의 99개의 누클레오티드 서열의 결실이 시험된 종양 세포주로부터 E1a의 발현에 대해 최소의 영향을 가지면서 형질전환되지 않은 호흡기 상피 세포에서 E1a의 발현을 실질적으로 감소시키는 것을 추가로 입증한다. 이러한 영역은 E1a 시작 부위의 가장 먼 업스트림에 2개의 Pea3 부위를 포함한다. 대조적으로, E1a 시작 부위에 가장 근접한 Pea-3 부위를 제거하는 작은 결실은 종양 세포 또는 호흡기 상피 세포에서 E1a 발현에 대해 현저한 영향을 갖지 않는다. 또한, 인핸서와 E1a 시작 부위 사이의 영역으로부터의 101개의 누클레오티드 결실이 종양 세포로부터 E1a 발현에 현저히 영향을 미치지 않고 호흡기 상피 세포에서 E1a 발현에서 22 내지 30% 증가를 발생시켰다. 이러한 결과는 인핸서 영역을 포함하는 결실이 종양 세포에서 관찰되지 않는 호흡기 상피 세포에서의 E1a 발현에 대한 현저한 효과를 갖는 것을 입증한다. 따라서, 아데노바이러스 E1a 인핸서 영역은 더욱 복잡하고, 종양 세포 대신 호흡기 상피 세포에서 분석하는 경우 보다 큰 영역에 걸쳐 있다.
-255 내지 -305의 영역에 걸친 50개의 누클레오티드 결실은 Pea3에 대해 2개의 결합 부위 및 E2fl에 대해 1개의 결합 부위를 포함한다(Bruder, J. T. et al., J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). 이러한 전사 인자는 광범위한 종양에서 통상적으로 과다 발현된다. E2f는 Rb와 복합체를 형성하고, 세포 주기 진행 및 세포 분화 조절에서 중요한 역할을 하는 서열 특이적 전사 인자이다. 사이클린 의존성 키나아제에 의한 RB의 인산화는 E2F1의 방출, 및 DNA 복제, 복구 및 재조합과 관련된 유전자의 전사 활성화를 발생시킨다(Johnson, D. G. et al., Front Biosci 3:d447-448 (1998); Muller, H. et al., Biochimica et biophysica acta 147O(1):M1-12 (2000)). RB 경로의 규제해제(deregulation)가 통상적으로 악성종양에서 발생하며, 이는 폐암을 포함하는 다양한 종양에서 100%에 도달한다(Hanahan, D. et al., Cell 100(1):57-70 (2000)). E2F1에 대한 2개의 결합 부위가 E1a에 대한 조절 영역에서 발생한다. E1a 시작 부위로부터 가장 먼 2개의 Pea3 부위를 포함하는 결실은 E1a 발현에 대해 단지 보통의 영향을 갖는다. 그러나, E2F1 부위 바로 옆에 위치하는 2개의 Pea3 부위와 함께 원위의 E2F 부위의 결실은 형질전환되지 않은 세포에서 E1a, E1b의 발현 및 바이러스 복제의 현저한 감소를 발생시킨다. 이러한 결과는 상기 50개의 염기쌍 단편 내에 위치된 E2F1 및/또는 Pea3 부위가 호흡기 세포에서 E1a 조절을 위한 우세한 부위이며, 상기 결실에 의해 영향을 받는 추가 인자가 E1a 발현을 결정하는 것을 암시한다.
Pea3는 고도로 보존된 Ets 전사 인자 패밀리의 일원이다(de Launoit, Y. et al., Biochimica et biophysica acta 1766(1):79-87 (2006)). Pea3는 배아발생 동안 정상적으로 발현되고, 이는 조직 리모델링 사건, 세포 분화 및 증식과 관련이 있다. Pea3는 정상적인 리모델링 사건 동안 세포외기질을 파괴시키는 작용을 하는 세포외 기질단백질(MMPs)을 포함하는 다양한 유전자를 전사적으로 활성화시킨다. Pea3는 MMP의 과다발현이 전이를 촉진하는 것으로 생각되는, 유방암, 폐암, 결장암, 난소암 및 간암을 포함하는 다양한 암에서 통상적으로 과다 발현된다(de Launoit, Y. et al., Adv Exp Med Biol 480: 107-116 (2000); Hakuma, N. et al., Cancer Res 65(23):10776-10782 (2005); Boedefeld, W. M., 2nd et al., Mol Carcinog 43(1): 13-17 (2005); Cowden, D. et al., Mol Cancer Res 5(5):413-421 (2007)). 이전의 연구는 Pea3 부위 사이의 협력적인 결합이 E1a 발현을 증가시키는 것을 입증하였다(Bruder, J. T. et al., J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). 결과적으로, 특이적 전사 인자 결합 부위의 영향 및 이러한 결합 부위 사이의 협력성은 전사 인자의 풍부한 발현이 E1a의 전사를 향상시키기 위한 협력적인 결합에 대한 필요성을 무시할 수 있는 종양 세포에서보다 전사 인자가 제한되는 형질전환되지 않은 세포에서 더욱 명백할 수 있다. 단독 및 복합체로서 다양한 전사 인자 결합 부위의 상대적 중요성은 추가 연구 중이다.
본 발명의 결과는 E1b 전사 단위의 종양 선택적 발현이 E1a 인핸서의 변형에 의해 달성될 수 있음을 추가로 입증한다. E1b 프로모터는 서열 특이적 전사 인자 SP-1에 결합하는 GC 박스 및 TATA 박스로 구성된다. 둘 모두의 도메인은 E1b의 효과적인 발현에 필요하다(Wu, L. et al., Nature 326(6112):512-515 (1987)). 이전의 연구는 E1b가 E1a로부터 전체-판독(read-through) 전사체로서 발현된다는 것을 입증하였다(Montell, C. et al., Mol Cell Biol 4(5):966-972 (1984)). 베타-글로빈 종결 서열의 삽입에 의한 E1a로부터의 E1b의 전체-판독 전사의 종결은 CMV 프로모터와 같은 강한 프로모터의 삽입이 전체-판독 전사의 필요성을 회피하면서 E1b의 발현을 현저히 감소시켰다(Maxfield, L. F. et al., J Virol 71(11):8321-8329 (1997); Falck-Pedersen, E. et al., Cell 40(4):897-905 (1985)). 본 발명의 발견은 E1b의 발현이 E1a 인핸서에서의 작은 결실로 인해 E1a와 함께 형질전환되지 않은 호흡기 상피 세포에서 협력적으로 약화될 수 있음을 입증한다. 이러한 결과는 형질전환되지 않은 세포에서의 E1b의 효과적이지 않은 전체-판독 전사와 일치한다. 대조적으로, E1a 및 E1b 둘 모두는 A549 세포에서 야생형 수준과 가깝게 발현되고, 이는 종양 세포에서의 E1a로부터의 효과적인 전체-판독 전사를 나타낸다.
E1b 55K는 바이러스 복제에 중요한 다기능 단백질이므로, 상기 유전자의 결실이 아닌 상기 단백질의 발현의 종양 선택적 약화는 E1a 및 E1b 둘 모두의 감소된 발현으로 인해 형질전환되지 않은 세포에서 높은 정도의 약화를 유지하면서 종양 세포에서 상기 바이러스의 효능을 개선시킬 수 있다. 본 발명자는 종양 세포 및 정상 세포에서 ONYX-015에 대한 TAV-255의 암용해성 활성을 비교하였고, TAV-255가 형질전환되지 않은 세포에서 ONYX-015와 유사한 수준의 약화를 유지하면서 ONYX-015보다 종양 세포에서 세포 용해를 유도하는데 더욱 효능이 있음을 발견하였다.
+1로 표시된 E1a 전사 시작 부위와 관련하여 -225 및 -287에 존재하는 E2F 부위의 결실은 형질전환된 세포에서 E1a 발현에 영향을 미치지 않았다(Bruder, J. T., and Hearing, P. (1989). Nuclear factor EF-1A binds to the adenovirus E1A core enhancer element and to other transcriptional control regions. Mol Cell Biol 9: 5143-5153). Pea3에 대한 결합 부위는 -200, -270, -300, -344, -386에 위치되고, Pea3 결합 부위 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 단독의 결실은 HeLa 세포에서 E1a 발현에 대해 최소의 영향을 미쳤다(Hearing, P., and Shenk, T. (1983). The adenovirus type 5 E1A transcriptional control region contains a duplicated enhancer element. Cell 33: 695-703). 이전의 연구는 형질전환된 세포주에서의 E1a 전사 조절 영역의 중요성을 규정하였다. 그러나, 종양 세포는 바이러스에 대한 천연 숙주인 형질전환되지 않은 세포와 현저히 상이하다. 종양 세포는 활발히 증식하며, 많은 신호전달, 세포 조절 및 아폽토시스 경로의 이상 발현을 갖는다. E1a 전사 조절 영역에 결합하는 E2F 및 Pea3를 포함하는 다양한 전사 인자가 종양 세포에서 이상 발현된다(de Launoit, Y., et al. (2000). The PEA3 group of ETS-related transcription factors. Role in breast cancer metastasis. Adv Exp Med Biol 480: 107-116; Hanahan, D., and Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70). 따라서, E1a 전사 연구의 E1a 발현 조절은 상기 전사 인자의 변경된 발현에 의해 종양 세포에 영향을 미칠 수 있다.
종양 세포에서의 시험관내에서의 E1a 인핸서의 기능의 이해는 종양 세포에서의 E1a의 조절이 형질전환되지 않은 인간 세포에서의 E1a의 조절과 비교되는 경우에 더욱 드러날 수 있다. 인간 이배체 섬유모세포(MRC-5, WI-38 및 IMR-90)가 백신 개발, 진단 바이러스학, 및 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 많은 다른 바이러스를 포함하는 광범위한 바이러스를 배양하고 연구하기 위한 연구 실험실에서 표준 실험실 세포주로서 수십년 동안 광범위하게 사용되었다(Friedman, H. M., and Koropchak, C. (1978). Comparison of WI-38, MRC-5, and IMR-90 cell strains for isolation of viruses from clinical specimens. J Clin Microbiol 7: 368-371). 본 발명자는 Pea3 및 E2F에 결합하는 DNA 요소의 역할을 결정하기 위해 Had-5 E1a 전사 조절 영역에서 일련의 결실을 제조하고, 형질전환 세포주 및 형질전환되지 않은 세포주의 패널에서 E1a의 발현을 비교하였다. 본 발명자는 형질전환되지 않은 세포의 상황에서 평가시 E1a 인핸서 서열이 이전에 보고된 것보다 크고 더욱 복잡한 것을 제안한다. 본 발명자는 효능있는 암용해성 작용제로서 HAd-5 돌연변이 바이러스의 잠재성을 논의한다.
Ⅲ. 결합 부위 결실의 연구
HAd-5 E1a 전사 조절 영역의 결실 돌연변이가 제조되었고, 형질전환되지 않은 세포 및 형질전환 세포에서 E1a의 발현이 연구되었다. HAd-5 전사 조절 영역은 다수의 전사 인자에 대한 결합 부위를 함유하며, 이중 많은 수는 암 세포에서 과다 발현된다. 결과적으로, E1a 전사를 연구하기 위한 형질전환된 세포의 사용은 상기 중요한 조절 서열에 영향을 주는 다양한 전사 인자의 이상 발현에 의해 영향을 받을 것이다. 이러한 제한을 극복하기 위해, 본 발명자는 E1a 유전자 발현을 연구하기 위해 성장 정지된 인간 폐 상피 세포주를 이용하였고, 이러한 결과를 종양 세포주의 패널에서의 E1a 발현과 비교하였다. 특이적 Pea3 및 E2F 결합 부위를 표적으로 하는 다양한 결실 돌연변이가 생성되었다. 도 8a는 상기 전사 인자 부위에 걸쳐 있는 Pea3 및 E2F에 대한 결합 부위 및 결실 돌연변이를 입증한다. 이러한 결실 돌연변이가 플라스미드에서 제조되었고, 상동 재조합을 통해 HAd-5 유전체로 도입되었다. 상기 돌연변이를 갖는 HAd-5 돌연변이 바이러스가 MRC-5(형질전환 되지 않은 폐) 및 A549(형질전환된 폐) 세포를 감염시키는데 사용되었고, 이후 웨스턴 블롯(도 8b) 및 Q-PCR(도 8c)에 의해 E1a 유전자 발현에 대해 분석되었다. 형질전환되지 않은 세포에서, Pea3 부위 번호 Ⅳ 및 Ⅴ가 제거된 dl309-6은 Wt HAd-5(dl309)에 비해 감소된 E1a 단백질 발현을 나타내었다. Pea3 부위 번호 Ｉ가 제거된 dl87, 및 E2F 결합 부위가 제거된 dl275의 결실 돌연변이는 Wt HAd-5에 비해 E1a 발현에서 차이를 나타내지 않았다. 2개의 Pea3 부위 사이에 위치된 E2F와 함께 Pea3 부위 번호 Ⅱ 및 Ⅲ를 제거한 TAV-255, 및 Pea3 부위 번호 Ⅱ를 제거한 dl55는 감염 24시간 후(h.p.i.)까지 E1a 단백질의 검출가능한 발현을 나타내지 않았다. TAV-255 및 dl55에 상응하는 레인에 존재하는 작은 밴드는 대조군 레인에 존재하는 밴드와 유사하며, 이는 E1a 항혈청과의 비특이적 반응을 암시한다. 24 h.p.i.에서 추출된 mRNA로부터 수행된 상대 Q-PCR은 dl309-6가 Wt HAd5에 비해 2.5배 더 적은 E1a mRNA를 발현한 반면, dl87 결실이 E1a 유전자 발현에 대해 현저한 영향이 없는 것을 암시하였다. 돌연변이 dl275는 Wt HAd-5에 비해 E1a mRNA에서 20 퍼센트의 감소를 나타내었다. 결실 돌연변이 dl55는 E1a mRNA 발현에서 10배 감소를 나타낸 반면, TAV-255는 Wt HAd-5에 비해 E1a mRNA 발현에서 33배 감소를 나타내었다.
본 발명자는 8 및 24 h.p.i.에서 상기 돌연변이 바이러스(도 8a에 기재된 바와 같음)로 감염된 A549 세포에서 E1a mRNA 및 단백질의 발현을 비교하였다. 도 9a에 도시된 이러한 결과는 8 h.p.i.에서 E1a 단백질 발현의 작은 감소를 나타낸 반면, 이러한 바이러스는 24 h.p.i. 후에 E1a 발현에서 임의의 현저한 차이를 나타내지 않았다. Q-PCR 분석을 이용하여, dl87, TAV-255, dl55 및 dl275는 E1a 유전자 발현에서 약 2배 감소를 나타낸 반면, 돌연변이 바이러스 dl309-6은 8 h.p.i. 후에 Wt HAd-5와 비교하여 E1a 발현에서 20 퍼센트 증가를 나타내었다(도 9b).
24 h.p.i. 후에 수행된 Q-PCR은 Wt HAd-5와 비교하여 E1a 유전자 발현에서 차이를 나타내지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 결과로부터, E1a 인핸서의 결실 돌연변이가 A549 세포에 비해 MRC-5 세포의 상황에서 연구되는 경우에 E1a 유전자 발현에 대해 더욱 큰 영향을 미치는 것이 명백하다. TAV-255 내에 존재하는 누클레오티드의 역할을 추가로 이해하기 위해, 본 발명자는 TAV-255 내에 여러 6 bp 결실을 제조하였고, HAd-5 유전체에서 상기 돌연변이를 재구성시켰고, 형질전환되지 않은 세포주에서 E1a 발현을 연구하였다.
결실 돌연변이 TAV-255는 2개의 pea3 및 1개의 E2F 전사 인자 결합 부위를 포함한다. 각각의 조절 요소의 역할을 특성규명하기 위해, 본 발명자는 개별적 Pea3 및 E2F 요소의 결실을 제조하였고, HAd-5 유전체에서 상기 돌연변이를 재구성시켰다(도 10a). 2개의 Pea3 부위 사이의 무작위적 6 bp 결실(dl220)이 또한 대조군으로 생성되었다. E1a 단백질 발현이 MRC-5 세포에서 48 h.p.i.에서 돌연변이 바이러스 및 Wt HAd-5에 대해 결정되었다(도 10b). E1a의 유사한 발현 프로파일이 Pea3 결합 부위 번호 Ⅱ 및 Ⅲ의 결실을 갖는 TAV-255 및 dl200+230에 대해 관찰되었다. E2F 결실 돌연변이(dl212) 및 대조군 결실 돌연변이(dl220)는 Wt HAd-5에 비해 E1a 발현에 대해 현저한 효과를 갖지 않았다. 돌연변이 바이러스 dl200+230로 감염된 세포는 Q-PCR 분석에서 24 h.p.i.에서 Wt HAd-5와 비교하여 E1a mRNA에서 50배 감소를 나타내었다(도 10c). E2F 부위와 함께 Pea3 부위 번호 Ⅱ + Ⅲ의 결실을 갖는 TAV-255는 E1a 발현에서 33배 감소를 가졌다. E2F 부위를 제거한 결실 돌연변이 dl212는 E1a 유전자 발현에서 20퍼센트 감소를 가졌다. dl220은 Wt HAd-5에 비해 E1a의 발현에서 현저한 차이가 없었다.
E1a 인핸서 요소에 존재하는 E2F 부위의 역할 및 E1a 발현에 대한 이의 영향을 추가로 평가하기 위해, 본 발명자는 E2F 부위의 단일 및 이중 돌연변이를 생성시켰고, E1a 발현에 대한 상기 돌연변이의 영향을 연구하였다. 아데노바이러스 인핸서 요소는 -225 및 -287에 E2F 전사 인자에 대한 2개의 결합 부위를 함유한다(도 11A). 개별적 E2F 결합 부위 뿐만 아니라 둘 모두의 부위가 함께 돌연변이되었고, 상동 재조합에 의해 HAd-5 유전체에서 재구성되었다. E1a 단백질 발현이 24 h.p.i.에서 돌연변이 바이러스로 감염된 MRC-5 세포에서 연구되었다(도 11B). 이러한 돌연변이 바이러스는 Wt HAd-5와 비교하여 E1a 유전자 발현에서 임의의 현저한 차이를 나타내지 않았고, 이는 E2F가 성장 정지된 MRC-5 세포에서 E1a 유전자 발현에서 유의한 역할을 하지 않는 것을 암시한다. 24 h.p.i.에서 수행된 Q-PCR 분석은 dl212 뿐만 아니라 dl212+275 돌연변이 바이러스를 이용하여 20 내지 30 퍼센트 감소를 나타낸 반면, 돌연변이 바이러스 dl275는 Wt HAd-5와 비교하여 E1a 유전자 발현에서 임의의 감소를 나타내지 않았다(도 11C). 형질전환된 세포주(A549)에서 상기 돌연변이 바이러스로 수행된 연구는 E1a 발현에 대해 임의의 현저한 영향을 발생시키지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
본 발명자는 다양한 혈질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포에서 E1a 발현 및 돌연변이 바이러스 dl200+230에 의해 나타난 세포독성을 분석하였다. 24 h.p.i.에서 A549 세포주에서 임의의 현저한 감소 없이 MRC-5 세포주에서 E1a 발현에서 가장 높은 감소를 나타낸 돌연변이 바이러스 dl200+230이 Pea3 결합 부위 Ⅱ & Ⅲ 결실의 영향을 평가하기 위해 다양한 형질전환되지 않은 세포주에서 시험되었다. IMR-90 및 WI-38 세포주에서 수행된 연구는 MRC-5 세포로부터 수득된 것과 유사한 결과를 나타내었고, 이는 E1a 발현의 감소가 MRC-5 세포에 제한되지 않고, 다른 형질전환되지 않은 폐 세포주와 유사한 것을 암시한다. 형질전환되지 않은 세포주에서, dl200+230 바이러스는 24 h.p.i.까지 E1A 단백질 발현의 검출가능한 수준을 나타내지 않았다. 48 h.p.i. 후, 돌연변이 바이러스는 MRC-5 및 IMR-90 세포에서 E1a 유전자 발현의 낮은 수준을 나타내었으나, WI-38 세포에서는 나타내지 않았다. 돌연변이 바이러스와 대조적으로, Wt HAd-5 E1a 발현이 24 h.p.i.에서 검출될 수 있었고, 이는 48 h.p.i.에서 돌연변이 바이러스로부터 E1a의 발현을 현저히 초과하였다(도 12a). 본 발명자는 또한 다양한 형질전환된 세포주(HeLa, Panc-1 및 Calu-6)에서 돌연변이 바이러스의 발현을 시험하였고, 24 h.p.i.에서 dl200+230과 Wt HAd-5 사이의 E1a 단백질 발현에서 현저한 차이가 없는 것을 발견하였다(도 12b). 본 발명자는 감염 4일 후 다양한 형질전화된 세포주(HeLa, Panc-1, Calu-6, 및 A549) 및 감염 5일 후 형질전환되지 않은 세포주(MRC-5)에서 Wt HAd-5, ONYX-015 및 dl200+230 바이러스의 세포독성 영향을 비교하였다. 돌연변이 바이러스 dl200+230은 Wt HAd-5에 비해 유사한 수준의 세포독성을 나타내었고, A549 및 Calu-6 세포주에서 ONYX-015에 비해 높은 효능을 나타내었다. 형질전환되지 않은 세포주에서, dl200+230은 HAd-5에 비해 매우 낮은 세포독성을 나타내었고, ONYX-015에 비해 매우 유사한 수준의 안전성을 나타내었다(도 13 A&B).
HAd-5 E1a 전사 조절 영역은 E2F에 대해 2개의 결합 부위 및 Pea3에 대해 5개의 결합 부위를 포함하는 종양 세포에서 이상 발현되는 여러 전사 인자에 대한 결합 부위를 함유한다[19, 20]. 이전의 연구는 E1a에 대한 인핸서 도메인을 규정하려 노력하였으나; 이러한 연구는 아데노바이러스 감염에 대한 천연 숙주인 형질전환되지 않은 세포가 아닌 악성종양 세포에서 수행되었다. E1a 인핸서를 더욱 정확히 규정하기 위해, E2F 및 Pea3의 결실 돌연변이가 생성되었고, E1a 발현에 대한 이의 영향이 형질전환되지 않은 세포에서 평가되었다.
Pea3는 다양한 종양 세포주에서 통상적으로 과다발현되는 전사 인자이고, 이는 침습성 전이 표현형과 관련이 있다(de Launoit, Y., et al. (2000). The PEA3 group of ETS-related transcription factors. Role in breast cancer metastasis. Adv Exp Med Biol 480: 107-116). Pea3 결합 부위 Ⅱ & Ⅲ 뿐만 아니라 원위 E2F 부위를 제거한 결실 돌연변이 TAV-255는 감염 24시간 후에 E1a mRNA 발현에서 33배 감소를 나타내었다. 대조적으로, Pea3 결합 부위 Ⅱ 및 Ⅲ를 제거하나, 원위 E2F 부위를 보유한 결실 돌연변이 dl200+230은 감염 24 시간 후에 형질전환되지 않은 세포에서 E1a mRNA 발현에서 50배 감소를 나타내었다. 이러한 발견은 Pea3 전사 인자 결합 부위 Ⅱ 및 Ⅲ가 형질전환되지 않은 세포에서 E1a 발현을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것을 입증한다. 24시간에서의 E1a 단백질 발현은 E1a mRNA에 대한 발견과 유사하였다. 흥미롭게도, Pea3 결합 부위 번호 Ⅱ 및 Ⅲ의 결실을 가지나, E2F 부위를 보유한 dl200+230은 E1a 발현에서 가장 높은 감소를 나타내었다. 이러한 결과는 E2F 부위가 E1a 발현에 대해 최소의 영향을 가지는 것을 암시하며, E2f 부위가 E1a 발현의 초기 기간 동안 억제자로서 작용할 수 있는 가능성을 암시한다. 또한, 트랜스펙션 검정에서, 본 발명자는 E2F 부위의 점 돌연변이를 비활성화시키는 것은 E2F에 의한 E1a의 전사 활성화가 아닌 E2F에 대한 억제자 기능을 선호하는 E1a 발현을 증가시키는 것을 발견하였다(데이터는 제시되지 않음). 특정 조건하에서 전사 억제자로서 작용하는 E2F의 가능성이 이전에 제시되었다(Weintraub, S. J., Prater, C. A., and Dean, D. C. (1992). Retinoblastoma protein switches the E2F site from positive to negative element. Nature 358: 259-261).
본 발명자는 형질전환되지 않은 세포 및 형질전환된 세포에서 E1a의 전사에 대한 Pea3 부위의 각각의 상대적 중요성을 평가하였다. Pea3 부위 Ⅰ(dl87)의 결실은 형질전환되지 않은 세포에서 E1a 발현에 대해 최소의 영향을 갖는다. 대조적으로, Pea3 부위 Ⅱ 및 Ⅲ의 결실은 형질전환되지 않은 세포에서 E1a mRNA 발현에서 각각 약 10 및 20배 감소를 발생시켰다. Pea3 부위 Ⅱ 및 Ⅲ 둘 모두의 결실은 형질전환되지 않은 세포에서 E1a mRNA 발현에서 50배 감소를 발생시켰다. 감소된 E1a mRNA 발현 외에, E1a 단백질의 발현은 보통 상기 Pea3 결합 부위의 결실로 인해 현저히 감소된다. E1a 단백질은 감염 24시간 후에 3개의 형질전환되지 않은 세포주의 패널에서 검출 수준 아래이며, 감염 48시간 후에 검출가능하나 매우 감소된 수준이다. 이러한 결과는 형질전환되지 않은 세포에서 E1a의 효과적인 발현에 결정적으로 중요하다. 그러나, 이러한 Pea3 부위는 E1a 발현의 유일한 결정인자가 아닌데, 이는 낮은 수준의 E1a의 후기 발현이 형질전환되지 않은 세포에서 발생할 수 있기 때문이다. 본 발명의 발견은 Pea3 부위 Ⅱ 및 Ⅲ 둘 모두의 결실이 감염 24시간 후에 종양 세포주의 패널에서 E1a 발현에 대해 최소의 영향을 갖는 것을 추가로 나타낸다. 종양 세포주에서의 본 발명의 결과는, Pea3 부위 번호 Ｉ 또는 Ⅲ의 결실 단독이 감염 5시간 후에 E1a 유전자 전사가 2-3배까지 감소하는 것을 나타내는 이전의 연구와 일치한다(Hearing, P., and Shenk, T. (1983). The adenovirus type 5 E1A transcriptional control region contains a duplicated enhancer element. Cell 33: 695-703). 이러한 이전의 연구에서, 이후의 시점에서 E1a 단백질 발현이 결정되지 않았다.
E2F는 Rb 경로의 규제해제로 인해 종양 세포에서 통상적으로 과다 발현되는 전사 인자이다. 사이클린 의존성 키나아제에 의한 Rb의 인산화는 E2F의 방출을 발생시키고, 이후 이는 전사 조절 단위에 결합하고, S-단계로의 진입을 매개하는 유전자를 유도한다. 본 발명의 결과는 E1a cap 부위의 업스트림에 위치된 E2F 결합 부위 중 하나 또는 둘 모두의 결실이 형질전환되지 않은 세포주에서 E1a 발현에 대해 최소의 영향을 갖는 것을 입증한다. 특히, cap 부위에 가장 근접한 E2F 부위 -218 내지 -225의 결실은 E1a mRNA 또는 단백질 발현에 영향을 미치지 않았다. cap 부위의 가장 원위의 E2F 부위 -281 내지 -287의 결실은 mRNA 발현에서 30% 감소를 발생시켰으나, 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정시 E1a 단백질 발현에 현저한 영향을 미치지 않았다. 둘 모두의 부위의 결실은 E1a mRNA 발현에서 20% 감소를 발생시켰으나, 대조군에 비해 E1a 단백질 수준에서 검출가능한 차이가 없었다. 이러한 결과는 E1a cap 부위의 업스트림에 위치된 2개의 E2F 전사 인자 결합 부위의 결실이 형질전환되지 않은 세포에서 E1a 발현에서 약간의 역할만 하는 것을 나타낸다. 이전의 연구와 일치하게, 본 발명자는 둘 모두의 E2F 부위의 결실이 종양 세포주의 패널에서 E1a 발현에 대해 최소의 영향을 나타낸 것을 발견하였다(데이터는 제시되지 않음)(Bruder, J. T., and Hearing, P. (1989). Nuclear factor EF-1A binds to the adenovirus E1A core enhancer element and to other transcriptional control regions. Mol Cell Biol 9: 5143-5153).
E1a는 초기 아데노바이러스 유전자 발현을 조절하며, 이는 효과적인 바이러스 증식에 필수적이다(Hearing, P., and Shenk, T. (1983). The adenovirus type 5E1A transcriptional control region contains a duplicated enhancer element. Cell 33: 695-703). Pea3 부위 Ⅱ 및 Ⅲ의 결실이 형질전환되지 않은 세포의 패널에서 E1a의 매우 약화된 발현을 발생시키나, 종양 세포의 패널에서 E1a의 발현에 대해 거의 영향을 갖지 않으므로, 이러한 인핸서 결실 돌연변이는 암용해성 바이러스로서 유용할 수 있다. 본 발명자는 종양 세포 및 형질전환된 세포에서 dl200+300(Pea3 부위 Ⅱ 및 Ⅲ의 이중 결실)의 세포독성 활성을 평가하였다. dl200+300의 세포독성 활성은 형질전환되지 않은 세포에서 최소의 세포독성을 나타내면서 종양 세포주의 패널에서 대조군 바이러스와 유사하다(도 13a 및 b). 이전의 연구는 dl1520(ONYX-015)이 다양한 종양 세포주에서 야생형 바이러스와 비교하는 경우 현저히 약화되는 것을 나타내었다. dl1520에 대한 종양 세포에서 복제하는 감소된 능력은 E1b-55k가 다기능 단백질인 사실과 관련이 있다. p53에 결합하여 이를 비활성화시키는 것 외에, E1b-55k는 핵막을 가로지르는 mRNA 수송과 관련이 있다. 효과적인 mRNA 수송의 부재하에서, dl150가 다양한 종양 세포주에서 비효율적으로 복제한다. 다양한 암, 주로 두경부암 및 직장결장암을 갖는 환자에서의 임상 연구는 소수의 환자에서 유의한 임상 반응을 나타내었고, ONYX-015의 임상 개발이 정지되었다. 중요한 다기능성 단백질의 결실로 인한 바이러스의 효능의 결핍은 암용해성 바이러스의 제한된 임상 효과를 가질 수 있다. 본 발명자는 형질전환되지 않은 호흡기 세포에서 E1a의 효과적인 발현 및 Had5의 복제에 중요한 특정 전사 인자 결합 부위를 결정함으로써 암용해성 바이러스의 개발에 접근하였다. 내생 E1a 인핸서로부터의 Pea3 부위의 결실은 암용해성 바이러스를 개발하는 경우에 여러 장점을 갖는다. 첫째로, 이종성 DNA 서열이 E1a의 종양 선택적 발현을 달성하기 위해 도입되지 않았다. 둘째로, E1a는 아데노바이러스를 이용한 세포의 감염 후에 발현된 첫번째 유전자이며, 이후 초기 바이러스 유전자 발현을 조절하는 이러한 유전자는 대략 아데노바이러스 감염을 조절하기 위해 관찰된 수준으로 발현된다. 셋째로, 다기능성 E1b-55k 유전자는 무손상으로 남겨진다.
도 14 및 15는 Ad5 또는 프로모터 결실 바이러스(TAV-255)로 감염된 정상 세포(WI-38) 및 종양 세포(A549) 세포의 현미경사진을 도시한다. 정상 세포에서, TAV-255를 이용한 감염 7일 후까지 바이러스 매개 세포독성 효과의 증거가 없다. 대조적으로, 광범위한 세포 사멸이 Ad5로 감염된 정상 세포에 대해 관찰된다. 종양 세포(A549)에서, 광범위한 종양 세포 사멸이 감염 3일 후에 Ad5 및 TAV-255 둘 모두에서 관찰된다. 따라서, TAV-255는 종양 세포의 용해에 대해 선택적이고, 정상 세포는 그대로 둔다.
요약하면, 본 발명자는 E1a 전사의 메커니즘이 형질전환되지 않은 세포와 형질전환된 세포 사이에서 명백히 상이한 것을 결정하였다. 또한, 본 발명자는 형질전환되지 않은 세포에서 연구하는 경우 E1a 인핸서가 이전에 인지된 것 보다 큰 영역에 걸쳐 있고, 보다 복잡한 것을 입증한다. 이러한 결과는 E2f 결합 부위가 아닌, Pea3 전사 인자 결합 부위 Ⅱ 및 Ⅲ가 형질전환되지 않은 세포의 패널에서 E1a의 효과적인 발현에 중요하나, 형질전환된 세포에서는 그렇지 않은 것을 입증한다. 이러한 결과는 Pea3 전사 인자 결합 도메인 Ⅱ 및 Ⅲ의 선택적 결실이 갖는 바이러스가 효능있는 암용해성 활성을 가질 수 있음을 암시한다.
Ⅳ. 변형된 조절 서열
한 구체예에서, E1a 조절 서열이 변형된다. "변형된 조절 서열"은 야생형 서열에 비해 하나 이상의 누클레오티드의 결실, 치환 또는 첨가를 갖는다. 한 구체예에서, 전사 인자 결합 부위의 서열이, 예를 들어, 이의 일부를 결실시키거나, 결합 부위로 단일 점 돌연변이를 삽입함으로써 전사 인자에 대한 친화성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 결실 돌연변이는 다른 돌연변이 형태에 비해 향상된 안정성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 변형된 조절 서열은 신생물 세포에서의 발현을 가능케 하나, 정상 세포에서 발현을 약화시킨다. 이러한 변형된 조절 서열은 하기에 추가로 기재되는 바와 같이 바이러스 벡터 또는 형질전환된 세포 내에서 사용될 수 있다.
A. 결실 돌연변이
한 구체예에서, 변형된 E1a 조절 서열(E1a 전사 조절 영역)은 결실 돌연변이이다. 즉, 하나 이상의 누클레오티드는 야생형 조절 서열에 비해 결실되었다.
결실된 누클레오티드는 연속적일 수 있으므로, 단일 결실 영역을 형성할 수 있다. 이러한 경우에, 전체 결실은 결실된 영역과 동일하다. 또 다른 구체예에서, 결실은 비연속적이다. 한 구체예에서, 전체 결실은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 이 이상의 결실 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 전체 결실은 3개의 결실 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 전체 결실은 2개의 결실 영역을 포함한다. 달리 기재하지 않는 경우, 일반적인 용어 "결실"은 "전체 결실"의 특성 및/또는 임의의 하나 이상의 "결실 영역"을 기재하는데 사용된다.
한 구체예에서, 결실(전체 결실 및/또는 임의의 결실 영역)은 약 1 내지 약 400개, 약 1 내지 약 300개, 약 1 내지 약 200개, 약 1 내지 약 100개, 약 50 내지 약 100개, 약 25 내지 약 75개, 약 5 내지 약 50개, 약 5 내지 약 25개, 또는 약 5 내지 약 10개의 누클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, 결실은 약 100개, 약 90개, 약 50개, 약 30개, 약 10개, 또는 약 5개의 누클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, 결실은 250개 이하, 150개 이하, 100개 이하, 90개 이하, 50개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 또는 5개 이하의 누클레오티드이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 누클레오티드는 E1a 조절 서열의 -255 내지 -393, -304 내지 -393, -255 내지 -305, -265 내지 -270, 또는 -293 내지 -299의 영역에서 결실된다.
한 구체예에서, 인핸서 영역(-141 내지 -305)에서 하나 이상의 누클레오티드가 보존(즉, 결실되지 않음)된다. 또 다른 구체예에서, Pea3 Ⅱ 부위(-1 내지 -255)에 근접한 하나 이상의 누클레오티드가 보존된다. 또 다른 구체예에서, Pea3 Ⅴ 부위(-395 내지 -498)의 원위의 하나 이상의 누클레오티드가 보존된다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 누클레오티드가 -1 내지 -255, -141 내지 -305, 및 -395 내지 -498 범위 중 하나에서 보존된다.
상기 기재된 바와 같이, Pea3 및 E2F는 프로모터 서열에 결합하는 전사 인자이다. E1a 조절 서열은 Pea3 Ｉ, Pea3 Ⅱ, Pea3 Ⅲ, Pea3 Ⅳ 및 Pea3 Ⅴ로 지정된 5개의 Pea3 결합 부위를 함유하고, 여기서 Pea3 Ｉ은 E1a 시작 부위에 가장 근접한 Pea3 결합 부위이며, Pea3 Ⅴ는 가장 원위이다. E1a 조절 서열은 또한 E2F Ｉ 및 E2F Ⅱ로 지정된 2개의 E2F 결합 부위를 함유하며, 여기서 E2F Ｉ은 E1a 시작 부위에 가장 근접한 E2F 결합 부위이고, E2F Ⅱ는 더욱 원위이다. E1a 시작 부위로부터, 결합 부위가 배열된다: Pea3 Ｉ, E2F Ｉ, Pea3 Ⅱ, E2F Ⅱ, Pea3 Ⅲ, Pea3 Ⅳ, 및 Pea3 Ⅴ.
한 구체예에서, 상기 7개의 결합 부위의 하나 이상 또는 이의 기능적 부분이 결실된다. "기능적 부분"은 결실되는 경우 각각의 전사 인자(Pea3 또는 E2F)로의 결합 부위의 기능, 예를 들어, 결합 친화성을 감소시키는 결합 부위의 부분이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 전체 결합 부위가 결실된다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 결합 부위의 기능적 부분이 결실된다. "결실된 결합 부위"는 전체 결합 부위의 결실 및 기능적 부분의 결실 둘 모두를 포함한다. 2개 이상의 결합 부위가 결실되는 경우, 전체 결합 부위 결실 및 기능적 부분 결실의 임의의 조합물이 사용될 수 있다.
다른 한편으로, 일부 구체예에서, 결합 부위 중 하나 이상 또는 이의 기능적 부분이 E1a 조절 서열에 보존(예를 들어, 이로부터 결실되지 않음)된다. 결합 부위의 적어도 기능적 부분을 보존함으로써, 각각의 전사 인자에 대한 결합 친화성은 실질적으로 유지된다. "보존된 결합 부위"는 전체 결합 부위를 보존하고, 이의 기능적 부분을 보존하는 것을 포함한다. 2개 이상의 결합 부위가 보존되는 경우, 전체 결합 부위 보존과 기능적 부분 보존의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 하나 이상의 Pea3 결합 부위 또는 이의 기능적 부분이 결실된다. 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 I, Pea3 Ⅱ, Pea3 Ⅲ, Pea3 Ⅳ, 및/또는 Pea3 Ⅴ일 수 있다. 한 구체예에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 Ⅱ, Pea3 Ⅲ, Pea3 Ⅳ, 및/또는 Pea3 Ⅴ이다. 또 다른 구체예에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 Ⅳ 및/또는 Pea3 Ⅴ이다. 또 다른 구체예에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 Ⅱ 및 /또는 Pea3 Ⅲ이다. 또 다른 구체예에서, 결실된 Pea3 결실 부위는 Pea3 Ⅱ 및 Pea3 Ⅲ 둘 모두이다.
또 다른 구체예에서, Pea3 Ｉ 결합 부위 또는 이의 기능적 부분이 보존된다.
한 구체예에서, 하나 이상의 E2F 결합 부위 또는 이의 기능적 부분이 결실된다.
또 다른 구체예에서, 하나 이상의 E2F 결합 부위 또는 이의 기능적 부분이 보존된다. 한 구체예에서, 보존된 E2F 결합 부위는 E2F Ⅰ 및/또는 E2F Ⅱ이다. 또 다른 구체예에서, 보존된 E2F 결합 부위는 E2F Ⅱ이다.
또 다른 구체예에서, 전체 결실은 본질적으로 Pea3 Ⅱ, Pea3 Ⅲ, Pea3 Ⅳ 및/또는 Pea3 Ⅴ 중 하나 이상 또는 이의 기능적 부분으로 구성된다. 즉, 다른 결합 부위(잔여 Pea3 부위 및 둘 모두의 E2F 결합 부위)가 보존된다.
한 구체예에서, 결실 돌연변이는 dl309-6, dl340-12, TAV-255, dl87, dl55, dl275, dl200, dl212, dl220, dl230, dl200+230, 또는 dl212+275이다. 한 구체예에서, 결실 돌연벼이는 dl309-6, TAV-255, dl55, dl200, dl230, 또는 dl200+230이다. 또 다른 구체예에서, 결실 돌연변이는 TAV-255, dl55, dl200, dl230, 또는 dl200+230이다. 한 구체예에서, 결실 돌연변이는 TAV-255이다.
Ⅴ. E1a 이소폼 12S 및 13S의 선택적 발현
상기 기재된 바와 같이, -305 내지 -255(TAV-255) 영역을 제거한 아데노바이러스 인핸서의 결실은 종양 세포에서 E1a의 종양 선택적 발현 및 상기 바이러스의 우선적 복제를 발생시킨다. 이전의 연구는 E1a가 아폽토시스 유발(pro-apoptotic) 활성(Flinterman, Gaken et al. 2003)을 가져, E1a의 종양 선택적 발현이 종양 세포 사멸을 향상시킬 수 있는 가능성을 상승시키는 것을 나타내었다. 아데노바이러스 E1a 단백질은 주로 13s, 12s 및 9s mRNA를 발생시키는 RNA 스플라이싱에 의해 변형된 단백질의 복합체이다.
본 발명자는 천연 E1a 프로모터 및 종양 세포에서 E1a의 우선적 발현을 촉진하는 인핸서 결실을 갖는 벡터(TAV-255)로부터 발현되는 경우에 형질전환되지 않은 세포 및 형질전환된 세포에서 E1a-13s 유전자 생성물을 선택적으로 발현하도록 변형된 아데노바이러스의 발현, 바이러스 복제, 및 용해 활성을 평가하였다. 본 발명자는 13s 유전자 생성물을 선택적으로 발현하는 바이러스가 종양 세포의 패널에서 289R 단백질을 효율적으로 발현하고, 상기 바이러스의 바이러스 복제 및 용해 활성이 야생형 Ad5와 유사한 것을 입증한다. 대조적으로, 본 발명자는 E1a 13s 발현이 종양 세포에 비해 성장 정지된 형질전환되지 않은 세포에서 현저히 지연되고, 감소되는 것을 발견하였다. 13s 제한 바이러스의 암용해성 활성이 dl1520(Onyx-015)과 비교되었다. 13s 제한 바이러스는 형질전환되지 않은 세포에서 dl1520 만큼 약화되었고, 시험된 일부 종양 세포주에서 dl1520 보다 현저히 더욱 효능이 있었다. 이러한 결과는 13s 제한 바이러스의 종양 선택적 발현을 기초로 한 암용해성 바이러스 벡터는 실행가능하고, 종양 세포에서는 효과적인 바이러스 복제를 제공할 수 있는 반면, 형질전환되지 않은 세포에서는 바이러스 복제를 매우 제한하는 것을 입증한다.
E1a 단백질의 발현이 형질전환되지 않은 이배체 폐 섬유모세포인 성장 정지된 WI-38 세포에서 평가되었다(Hayflick and Moorhead 1961). 도 16a-b에 도시된 결과는 야생형 아데노바이러스를 이용한 감염이 2개의 단백질의 발현을 발생시키는 것을 입증한다. 289개의 아미노산 단백질은 13s mRNA로부터 유래되는 반면, 243개의 아미노산 단백질은 12s mRNA로부터 유래된다. 12s mRNA는 다른 초기 바이러스 유전자를 전이활성화(transactivate)시키는 기능을 하는 내부 도메인의 제거로 인해 13s mRNA와 상이한 mRNA 스플라이싱 생성물이다. WI-38 세포에서, 243개의 아미노산 단백질이 우세한 종이다. 둘 모두의 종의 존재비는 24과 48시간 사이에서 증가하고, 이후 감염 72시간 후까지 289개의 아미노산 생성물의 상대 존재비에서 현저한 감소가 발생한다. 야생형 바이러스와 대조적으로, E1a의 289개의 아미노산의 발현으로 제한되는 PM975 바이러스는 E1a 발현의 발생에서 현저한 지연을 나타내고, 이는 감염 48시간 후까지 관찰되지 않는다. 또한, E1a의 289R 이소폼의 존재비는 감염 24 및 28시간 후에 야생형 바이러스에 비해 실질적으로 감소된다. 감염 72시간 후까지, 289R 이소폼의 존재비는 야생형 바이러스와 PM975 사이에서 유사하나; E1a 단백질의 전체 발현은 PM975에서 현저히 감소되는데, 이는 우세한 종인 243R이 생성되지 않기 때문이다. 또 다른 형질전환되지 않은 세포주 MRC-5에 대해 유사한 결과가 관찰된다, 도 16b.
야생형 아데노바이러스 및 PM975로부터 E1a의 발현의 발생이 2개의 종양 세포주 A549(폐) 및 Panc-1(췌장)에서 평가되었고, 결과가 도 17a-b에서 도시된다. E1a의 큰 형태의 검출가능한 발현이 감염 48시간 후까지 관찰되지 않았던 형질전환되지 않은 세포와 대조적으로, 289R의 발현이 종양 세포주에서 감염 8 내지 24시간 후까지 종양 세포주에서 검출되었다. E1a의 243R 종이 WI-38 세포에서 가장 풍부한 형태였으며, 가장 초기의 시점에서도, 289R 및 243R 종의 존재비는 종양 세포에서의 초기 시점과 유사하였으며, 주로 289R 이소폼의 발현이 감염 후 가장 초기의 시점에서 243R 이소폼을 초과하였다. 감염 과정에 걸쳐서, 종양 세포주에서 감염 48 내지 72시간 후까지 243R 종의 우선적 축적이 관찰되었다. PM975로부터의 E1a의 289R 형태의 발현은 각각의 세포주에서 야생형 바이러스에 대해 관찰된 발현과 유사하였으며, 피크 발현은 감염 약 24시간 후에 발생하나, 감염 48 및 72시간 후에 풍부한 발현이 지속되었다. 감염 72시간에서의 PM975로부터의 289R 종의 존재비는 야생형 바이러스로 감염된 세포에서 발현된 289R의 존재비와 동등하거나, 이를 초과하였다.
본 발명자는 성장 정지된 형질전환되지 않은 세포(WI-38 및 MRC-5) 및 종양 세포(A549 및 Panc1)에서 E1a의 243R 이소폼만 발현하는 바이러스인 dl1500로부터의 E1a의 243R 이소폼의 발현의 발생을 평가하였다. 243R 이소폼의 발현은 야생형 바이러스로 감염된 세포와 비교하는 경우 dl1500로 감염된 세포에서 지연된다. 243R 이소폼의 발현에서의 지연이 둘 모두의 형질전환되지 않은 세포주(WI-38 및 MRC-5)에 대해 관찰되었다, 도 18a(패널 a 및 b). 243R 이소폼의 발현은 야생형 바이러스를 이용한 감염 후 24시간까지 매우 명백하나; 243R은 dl1500를 이용한 감염 후 24시간에서 검출 수준 이하이다. 243R 이소폼의 발현은 둘 모두의 세포주에서 dl1500를 이용한 감염 후 48시간까지 명백하고, 감염 후 72시간까지 야생형 바이러스를 이용한 감염 후에 관찰된 존재비와 대략 동등하다. 형질전환되지 않은 세포주와 대조적으로, 243R 이소폼의 발현은 종양 세포주에서 dl1500을 이용한 감염 후 16 내지 24시간까지 매우 명백하다, 도 18b(패널 a 및 b). 비교 목적을 위해, WI-38 및 A549 세포에서 E1a의 발현이 시간에 따라 제시된다(도 19 패널 A 및 B 각각). WI-38 감염된 세포, 특히 dl1500로 감염된 세포에서 E1a 발현의 발생이 명백히 지연된다.
본 발명자는 이전에 2개의 Pea3 부위 및 1개의 E2f 부위(TAV-255)를 제거한 E1a 프로모터의 결실을 갖는 바이러스로부터의 E1a 발현의 지연 발생을 입증하였다. 본 발명자는 E1a의 289R 형태를 선택적으로 발현하는 벡터로 상기 50 bp 결실을 도입시키고, WI-38 및 A549 세포에서 E1a 발현의 발생을 비교하였다.
본 발명자는 24, 48 및 72시간에서 E1a에 대해 1) Ad5, PM975 및 TAV-13으로 감염(MOI=5)된 성장 정지된 WI-38 세포에서 E1a 발현의 발생을 평가하였다. 이러한 결과는 E1a의 발현이 감염 72시간 후까지 TAV-13S에 대한 결실의 수준 이하임을 입증한다.
24, 48 및 72시간에서 E1a에 대한 1) Ad5, PM975, TAV-13s로 감염된 A549 세포의 웨스턴 블롯은 A549 세포에서의 야생형 바이러스 또는 PM975에 비해 TAV-13s로부터의 E1a의 발현에서 현저한 지연이 없는 것을 나타낸다.
도 21은 30 MOI의 감염 7일 후에 WI-38 세포, 및 3 MOI의 감염 5일 후에 A549, Panc-1, LnCap 및 Hep3b에서의 dl309, PM975, dl1520 또는 dl1520을 이용한 감염 후의 세포의 생활력을 도시한다. 이러한 결과는 E1a의 289R 이소폼(PM975) 및 E1a의 243R 이소폼(dl1500)만 발현하는 바이러스가 매우 높은 MOI(30)에서도 감염 7일 후까지 세포 생존에 대해 최소의 영향을 미치는 것을 입증한다. 상기 2개의 E1a 제한 바이러스에 대한 세포 독성은 야생형 바이러스(dl309) 또는 E1b-55k 결실 바이러스(dl1520) 보다 현저히 적었다. 3의 MOI(WI-38 세포를 이용한 실험을 위한 투입 바이러스 보다 1 log 적음)를 이용한 감염 5일 후에 세포 생존에 대해 종양 세포주를 평가하였다. 이러한 결과는 E1a의 289R 형태(PM975)를 발현하는 바이러스를 이용한 상기 종양 세포주의 감염이 dl1520 또는 dl1500에 비해 증가된 세포독성 활성을 갖고, PM975에 대한 세포독성 활성의 수준이 상기 세포주에서 야생형 바이러스와 유사한 것을 입증한다.
Ad5의 E1a 유전자는 mRNA 스플라이싱에 의해 가공되어 5개의 별개의 이소폼 13S, 12S, 11S, 10S 및 9S가 생성된다. 2개의 E1a 단백질 289R 및 243R을 각각 코딩하는 주요 형태 13S 및 12S는 아데노바이러스 감염된 세포에서 바이러스 유전자 및 세포 유전자 둘 모두의 전사를 조절하고, 아데노바이러스 복제에 필수적이다. 289R 형태는 초기 아데노바이러스 유전자의 전사를 활성화시키는 중요한 전이활성화 도메인을 포함한다: E2, E3 및 E4(Berk, Lee et al. 1979; Jones and Shenk 1979). 이러한 도메인은 스플라이싱되어 E1a의 243R 이소폼이 생성되고, 243R 형태만을 발현하는 바이러스는 초기 바이러스 유전자로부터의 발현을 전이활성화시킬 수 없다(Montell, Courtois et al. 1984). E1a는 c-Fos, c-Jun 및 c-Myc를 포함하는 세포 유전자의 발현을 유도하고, c-erbB2 및 상피 성장 인자 수용체의 전사를 억제한다. E1a 단백질은 pRB, p27, cyclin A, cyclin E, CtBP 및 p300/CBP를 포함하는 중요한 세포 주기 단백질과의 상호작용에 의해 정지 세포를 세포 분열로 유도할 수 있다.
이전의 연구는 E1a의 289R 형태를 선택적으로 발현하도록 유전공학처리된 아데노바이러스가 초기 및 후기 바이러스 단백질의 대략 정상적인 발현을 가지나, 성장 정지된 WI-38 세포에서 감소된 바이러스 DNA 합성을 갖는 것을 나타내었다(Spindler, Eng et al. 1985). 성장 억제된 WI-38 세포가 천연 바이러스 감염의 모델로 사용되었고, 상기 저자는 바이러스 DNA 합성이 성장 억제된 세포에서 감염 24 내지 36시간 후에 대조 수준의 20-30%까지 감소되나, 증식하는(서브컨플루언스) WI-38 세포 또는 HeLa 세포에서는 그렇지 않은 것을 입증하였다. 감소된 바이러스 DNA 합성이 E1a의 289R 형태의 발현으로 제한된 바이러스로 감염된 세포에서 관찰되었으나, 이들은 초기 바이러스 mRNA 발현에서 현저한 차이가 없고, 초기 또는 후기 바이러스 단백질 합성에서 차이가 없는 것을 발견하였다. 그러나, 초기 바이러스 단백질 발현이 E1a 발현의 분석에 의해서가 아닌 E1b 및 E2 단백질의 분석에 의해 결정되었다. 이전에 공개된 작업과 대조적으로, 본 발명자는 E1a의 발현의 발생이 현저히 지연되고, 야생형 바이러스(dl309)로 감염된 동일 세포와 비교하는 경우 E1a에 대한 289R 이소폼(PM975)만의 발현으로 제한된 아데노바이러스로 감염되는 경우에 성장 정지된 형질전환되지 않은 세포(WI-38 및 MRC-5)에서 존재비가 감소되는 것을 입증한다. 형질전환되지 않은 세포에서, 289R의 발현이 감염 후 48시간까지 관찰되지 않은 반면, 야생형 Ad5로부터의 E1a의 발현은 형질전환되지 않은 세포에서 24시간 이내에 관찰된다. 관찰되는 경우에도, E1a의 존재비는 대조군 수준에 비해 매우 낮다. 본 발명자는 이전의 연구를 확대시켰고, E1a의 243R 형태의 발현이 야생형 바이러스에 비해 dl1500로 감염되는 경우 성장 정지된 WI-38 세포에서 지연되는 것을 입증한다. 이러한 결과는 E1a의 정상 처리의 부재하에서, E1a의 289R 및 243R 둘 모두의 발현이 지연되고, 성장 정지된 형질전환되지 않은 세포에서 존재비의 감소를 입증한다.
상기 형질전환되지 않은 세포에서의 289R 형태의 효과적인 발현을 위한 스플라이싱 형태를 대체하기 위한 E1a의 처리를 위한 필요조건은 종양 세포보다 덜 엄격하다. 본 발명자는 PM975 및 dl309로 감염된 종양 세포로부터 E1a의 발현을 평가하였다. 이러한 연구의 결과는 종양 세포주가 감염 8시간 후와 같이 초기에 E1a의 289R 형태를 발현하고, 스플라이싱 형태를 대체하기 위한 E1a의 처리가 종양 세포주에서 289R 형태의 효과적인 발현을 달성하는데 필요하지 않음을 입증한다. 형질전환되지 않은 세포주와 대조적으로, 289R의 발현으로 제한된 바이러스(PM975)로 감염된 종양 세포주에서 발현된 289R의 존재비는 야생형 바이러스로 감염된 세포로부터 발현된 289R(dl309)의 존재비와 동등하거나 심지어 이를 초과할 수 있다.
야생형 바이러스(dl309), E1b-55k 유전자에 결실을 갖는 바이러스(dl1520/Onyx-015), 및 E1a의 298R(PM975) 및 243R(dl1500) 형태를 선택적으로 발현하는 바이러스로 감염된 세포의 생활력이 결정되었다. 30과 같이 높은 MOI로 PM975 또는 dl1500을 이용한 감염 7일 후까지 성장 정지된 WI-38 세포에서 세포 생활력에서의 현저한 감소가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 E1a 이소폼으로의 E1a 스플라이스 생성물의 제한이 형질전환되지 않은 성장 정지된 세포에서 상기 바이러스의 용해 활성을 매우 감소시킬 수 있음을 입증한다. 대조적으로, PM975는 시험된 종양 세포주에서 대략 야생형 바이러스 수준의 효능 있는 용해 활성을 갖는다. 또한, 이러한 분석은 PM975가 시험된 세포주에서 dl1520(Onyx-015)과 비교하는 경우에 용해 활성을 갖는 것을 나타낸다. E1a는 아데노바이러스에 의해 생성된 첫번째 단백질이므로, 289R 형태로의 상기 단백질의 선택적 제한은 암용해성 바이러스로서 유의한 잠재성을 갖는다.
종양 세포로의 E1a의 발현을 추가로 제한하고, 형질전환되지 않은 세포에서의 E1a의 발현을 제한하기 위해, 본 발명자는 E1a의 298R 형태를 선택적으로 발현하는 바이러스에 2개의 Pea3 부위 및 1개의 E2F 부위를 포함하는 E1a 프로모터(TAV-255)의 짧은 영역의 결실을 도입시켰다. 본 발명자는 상기 바이러스가 성장 정지된 WI-38 세포에서 E1a의 현저히 감소된 발현을 가지나, A549 세포에서의 289R의 발현이 A549 세포에서 야생형 바이러스와 유사한 것을 입증한다. 상기 프로모터 결실의 도입은 형질전환되지 않은 세포에서 E1a의 발현을 최소화시킬 수 있다.
동일 코딩 서열로부터의 다수의 달리 발현된 mRNA는 밀집한 유전체로부터 복잡한 아데노바이러스 유전자 발현을 가능케 하고, 별개의 mRNA가 감염 동안 여러 시점에서 축적된다. E1a pre-mRNA는 13S, 12S 및 9S mRNA로 달리 스플라이싱되고, 13S mRNA는 감염 초기 단계 동안 우세하고, 12S/9S는 감염 후기 시점 동안 우세하다. 이러한 mRNA는 통상적인 3' 스플라이스 부위에 연결된 다양한 5' 스플라이스 부위를 이용하여 생성된다(Imperiale, Akusjnarvi et al. 1995). 바이러스 mRNA 스플라이싱의 과정은 세포 스플라이싱 인자에 의존적이며, 13S로부터 12S 및 9S mRNA 발현으로의 전환은 바이러스 감염 경로 동안 특정 스플라이싱 인자의 역가측정으로 인한 것으로 생각된다(Gattoni, Chebli et al. 1991; Larsson, Kreivi et al. 1991; Himmelspach, Cavaloc et al. 1995). E1a 13s에 대한 스플라이스 조절 인자의 과다발현에 의한 정상적인 E1a 스플라이싱의 파괴는 후기 mRNA의 축적을 감소시키고, 바이러스 생산을 감소시킬 수 있다(Molin and Akusjarvi 2000). 본 발명자는 289R 형태로의 E1a의 제한된 스플라이싱이 형질전환되지 않은 세포에서 289R의 발현을 감소시키나, 종양 세포에서 289R 발현의 발생에 대해 단지 적당한 영향을 갖고, 야생형 바이러스를 이용한 감염 동안 달성된 것보다 높은 수준으로 289R의 축적을 발생시킬 수 있는 것을 입증한다. 상기 효과에 대한 가능한 설명은 바이러스 DNA 합성이 PM975로 감염된 WI-38 세포에서 지연된다는 것이다(Spindler, Eng et al. 1985). 신규한 바이러스 DNA 합성이 mRNA 처리에 영향을 줄 수 있으므로(Larsson, Kreivi et al. 1991), 신규한 바이러스 DNA의 합성에서의 지연은 성장 정지된 WI-38 세포에서 E1a 처리에 영향을 줄 수 있다. 대조적으로, 종양 세포는 조절이상 증식을 가지므로, 바이러스 DNA 합성의 발생이 지연되지 않을 수 있고, 243R의 발현의 부재하에서도 289R의 발현을 촉진할 수 있다.
요약하면, 바이러스의 종양 선택적 복제 및 종양 세포의 우선적인 바이러스 매개 용해는 암용해성 바이러스의 개념을 기초로 한다. 암용해성 바이러스의 원형은 Onyx-015(dl1520)이다. 이러한 바이러스는 바이러스의 종양 선택적 복제 및 이후에 정상 세포에는 영향을 주지 않으면서 종양의 선택적 용해를 제공하는 것으로 가정된 E1b-55k 유전자의 결실을 갖는다. 본 발명자는 형질전환되지 않은 세포 및 형질전환된 세포의 패널에서 E1a-289R의 발현이 dl1520로 제한된 바이러스의 암용해성 활성을 비교하였다. 본 발명자는 E1a의 289R 형태로의 E1a 발현의 제한이 시험된 둘 모두의 형질전환되지 않은 세포주에서 dl1520보다 약화된 바이러스를 발생시키는 것을 입증한다. 또한, 본 발명자는 289R 형태로의 E1a 발현의 제한이 시험된 종양 세포주에서 매우 효능 있는 암용해성 바이러스를 발생시키는 것을 입증한다. 289R 제한 바이러스는 시험 세포주에서 dl1520 보다 더욱 효능이 있었고, 상기 종양 세포주에서 야생형 Ad5에 대해 관찰된 암용해성 활성의 수준에 도달하였다. 기재된 E1a 프로모터 결실과 커플링이 가능한 제한된 E1a 발현은 형질전환되지 않은 세포에서 매우 제한된 용해 활성을 가지면서 종양 세포에서 야생형과 유사한 용해 활성을 갖는 암용해성 바이러스 벡터를 생성시킬 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 하나 이상의 E1a 이소폼을 선택적으로 발현하는 재조합 바이러스가 제공된다. 이소폼의 "선택적 발현"은 선택된 이소폼이 하나 이상의 다른 이소폼보다 더욱 많이 발현되는 것을 의미한다(mRNA 발현에 의해 측정됨). 한 구체예에서, 하나의 이소폼은 야생형 발현과 가까운 수준으로 발현되는 반면, 하나 이상의 다른 이소폼의 발현은 약화된다. 한 구체예에서, 선택된 이소폼의 발현은 야생형 발현의 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상이다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 다른 이소폼의 발현은 야생형 발현의 25% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하로 약화된다.
일부 구체예에서, 재조합 바이러스는 하나 이상의 이소폼의 발현을 실질적으로 배제한다. 이러한 경우, 이소폼의 발현은 야생형 발현의 25% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하로 약화된다.
한 구체예에서, 재조합 바이러스는 E1a-12S를 선택적으로 발현한다. 한 구체예에서, 재조합 바이러스는 E1a-13S에 비해 E1a-12S를 선택적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 바이러스는 E1a-12S를 선택적으로 발현하고, E1a-13S의 발현을 실질적으로 배제한다.
한 구체예에서, 재조합 바이러스는 E1a-13S를 선택적으로 발현한다. 한 구체예에서, 재조합 바이러스는 E1a-12S에 비해 E1a-13S를 선택적으로 발현한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 바이러스는 E1a-13S를 선택적으로 발현하고, E1a-12S의 발현을 실질적으로 배제한다.
Ⅵ.
E1b
19K 클론 삽입물
E1 프로모터의 변형은 종양 세포주의 패널에서 E1a 및 E1b 단백질의 우선적 발현을 발생시킨다. E1 프로모터 변형으로 감염된 종양 세포에서 E1 단백질의 초기 및 풍부한 발현이 발생하나, 형질전환되지 않은 세포에서 이후 시점에 단백질 발현의 낮은 수준이 발생한다. 그러나, 이러한 낮은 수준의 단백질 발현은 시험된 형질전환되지 않은 세포에서 감염 7일 후까지 현저한 세포 용해를 발생시키기에 충분하지 않았다. 대조적으로, 종양 세포에서 감염 8 내지 12시간 후의 초기에 종양 세포에서 풍부한 E1a 및 E1b 발현이 관찰되며, 감염 3일 후에 종양 세포주에서 광범위한 세포 사멸이 관찰된다. 이러한 발견은 E1a 프로모터 결실 벡터가 종양 세포에서 단백질의 발현에 효과적인 플랫폼으로서 우선적으로 사용될 수 있는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 벡터는 정상 세포로 낮은 수준의 단백질을 전달하는데 사용될 수 있다. 결과적으로, E1a 프로모터 결실 벡터는 1) 종양 세포를 감염시키는 경우에 효능 있는 암용해성 활성, 및 2) 형질전환되지 않은 세포를 감염시키는 경우에 효능 있는 면역 활성화 또는 백신 특성을 갖는 효과적인 이중-기능 발현 벡터일 수 있다. 본 발명자는 암용해성 백신으로서 상기 백신을 기재한다. 본 발명자는 추가로 관심 클론 DNA 서열에 대한 부위로서 E1b-19k 영역의 신규한 용도를 기재한다. 클로닝 부위로서 E1b-19k를 이용하는 것은 온전한 E1a 및 E1b-55k 바이러스 단백질의 보존을 가능케 한다. 이러한 중요한 바이러스 단백질의 보존은 바이러스 복제가 종양 세포주의 패널에서 야생형 바이러스 수준에 도달하는 것을 가능케 한다.
상기 기재된 바와 같이, E1a의 종양 선택적 발현은 내생 E1 프로모터를 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 결과적으로, 트랜스진의 선택적 발현은 변형된 E1a 인핸서를 이용하여 달성될 수 있다. 이전에, 아데노바이러스로의 유전자의 클로닝은 통상적으로 CMV 프로모터와 같은 강한 프로모터의 조절하에서 관심 트랜스진의 대체와 함께 전체 E1a 카세트의 유전적 결실을 포함하였다. 그러나, 이러한 방법은 상기 트랜스진의 종양 선택적 발현을 허용치 않는다. 본 발명자는 아데노바이러스에서 클로닝 부위로서 E1b-19k의 사용을 기재한다. 클로닝 부위로서 상기 영역을 이용하는 이전의 간행물은 존재하지 않는다. E1 단위는 2개의 주요 유전자 E1a 및 E1b로 구성되고, 둘 모두는 다양한 단백질을 생성시키는 다수의 스플라이스 생성물을 갖는다. 주요 E1a 단백질은 289R 및 243R로 명명되며, 주요 E1b 단백질은 E1b-19k 및 E1b-55k로 명명된다.
E1b 19k 유전자좌가 여러 이유로 클로닝 부위로 사용될 수 있다. E1a는 효과적인 바이러스 복제에 필수적이고, 이러한 유전자의 파괴는 효과적인 바이러스 복제를 매우 제한할 수 있다. 결과적으로, 이는 트랜스진의 클로닝을 위한 이상적인 부위는 아니다. 둘째로, E1b-55k 유전자는 p53의 결합 및 비활성화 뿐만 아니라 핵막을 가로지르는 mRNA의 수송과 관련된 다기능성 단백질이다. E1b-55k 유전자의 결실은 p53에서 돌연변이를 갖는 종양에 대한 Onyx-015의 제안된 선택성을 기초로 하였다. 그러나, E1b-55k의 결실은 또한 핵으로부터 세포질로의 mRNA 수송의 효과적인 수송을 파괴시켰다. 결과적으로, 바이러스 E1b-55k 유전자의 결실은 많은 암세포주에서 불량하게 복제하는 비정상 바이러스를 발생시킨다. 결과적으로, 이는 트랜스진의 클로닝을 위한 이상적인 부위가 아니다. 셋째로, E1b-19k 유전자는 주로 항-아폽토시스 유전자로 작용하고, 이는 세포 항-아폽토시스 유전자 BCL-2의 상동체이다. 프로제니(progeny) 바이러스 입자의 성숙 전의 숙주 세포 사멸은 바이러스 복제를 제한하므로, E1b-19k는 조숙 세포 사멸을 방지함으로써 감염이 진행되고 성숙 비리온이 발생되도록 하기 위해 E1 카세트의 일부로서 발현된다. 예를 들어, BCL-2의 과다발현에 의해 많은 종양 세포가 아폽토시스 신호를 극복하는 능력을 획득하므로, E1b-19k는 종양에서 잠재적으로 풍부하고, 삽입 유전자 및 DNA 서열을 위한 부위를 제공하기 위해 파괴될 수 있다. 그러나, E1b-19k는 E1b-55 유전자의 스플라이스 생성물이므로, E1b-55k를 파괴시키지 않는 E1b-19k 영역으로의 클로닝이 기술적으로 도전해볼만 하다. 유전자의 클로닝을 위한 E1b-19k 영역의 사용을 기재하는 간행물은 없다. 본 발명자는 E1b-19k 유전자로의 유전자의 선택적 클로닝이 E1b-55k 유전자의 파괴 없이 달성될 수 있음을 입증한다.
본 발명자는 TNF를 포함하는 외인성 유전자 및 돌연변이된 kras 펩티드가 E1b-19k 영역으로 클로닝될 수 있고, 상기 유전자가 효과적으로 발현되는 것을 입증한다. 본 발명자는 추가로 E1b-19k 영역으로의 유전자의 삽입과 조합된 E1b-19k 및 E1a 프로모터 결실을 갖는 바이러스로부터의 트랜스진의 발현을 이용한, 바이러스에 대한 효능 있는 항종양 효과를 입증한다.
도 24에 도시된 바와 같이, E1b 영역은 별개의 mRNA 시작 부위 및 스플라이싱 생성물에 의해 규정되는 여러 단백질을 엔코딩한다. E1b-19 및 E1b-55k는 중첩 서열을 가지나, 상이한 mRNA 시작 부위를 갖는다. E1b-19k 영역 내에 클로닝 부위를 제공하기 위해 E1b-19k에 대한 시작 부위 이후의 202개의 염기쌍 영역이 결실되었다. E1b-55k 시작 부위는 파괴되지 않아, E1b-55k의 발현이 보존될 수 있었다.
유세포분석에 의한 E1b-19k로부터 발현된 TNF의 표면 발현의 분석은 도 28에 도시된다. 이러한 결과는 a) R-40 마우스 췌장암, 및 b) MiaPaca 췌장암 세포주에서의 Ad19k TNF로부터의 TNF의 풍부한 발현을 입증한다. 대조군으로서, 바이러스의 E1 영역의 결실 및 TNF의 삽입과 함께 TNF가 통상적으로 사용되는 아데노바이러스 발현 벡터에 삽입되었다. TNF의 발현은 아데노바이러스 발현 벡터에서 통상적으로 사용되는 강한 프로모터인 CMV 프로모터의 조절하에 있다. 이러한 벡터는 dE1a-TNF로 명명된다. 본 발명자는 이전에 광범위한 종양 세포에서 TNF의 검출가능한 발현을 달성하기 위해 상기 벡터의 매우 높은 역가가 필요한 것을 입증하였다. 이러한 연구에서, dE1a-TNF는 세포당 750 플라크 형성 단위(plaque-forming units, pfu)로 사용된다. 세포당 750 pfu를 이용하여, R40 세포의 약 30% 및 Mia-PaCa 세포의 85%가 TNF의 검출가능한 표면 발현을 가졌다. 세포 표면에서의 TNF의 발현을 결정하기 위해 Ad19kTNF 벡터의 세포 용해질을 세포에 첨가하였다. 이러한 실험에서 바이러스 입자의 정확한 농도가 결정되지 않았으나; 후속 연구에서, 본 발명자는 2 pfu/세포로 사용된 Ad19kTNF가 750 pfu/세포로 사용된 dE1a-TNF 벡터보다 훨씬 많은 TNF 발현을 갖는 것을 입증하였다. 현재 연구 결과는 dE1a-TNF 벡터로 감염되는 경우에 세포의 단지 약 30%에 비해, Ad19kTNF 벡터를 이용한 감염 후에 R-40 세포의 70-80%가 이의 표면에서 TNF를 발현하는 것을 입증한다. Mia-PaCa 세포에서, 750 pfu/세포로 사용된 dE1a-TNF 벡터를 이용한 감염은 세포의 약 80%에서 TNF의 검출가능한 발현을 발생시킨 반면, Ad19kTNF 벡터를 갖는 용해질을 이용한 감염은 세포의 약 15-25%에서 TNF를 발현한다. 유세포분석 데이터를 나타내는 상세한 분석은 도 5b 및 5c에 도시된다. 요약하면, 이러한 데이터는 생물학적 활성인 TNF의 발현이 Ad19kTNF 벡터로부터 달성될 수 있음을 나타낸다.
세포 생활력 검정이 감염 3 및 5일 후에 형질전환되지 않은 세포에서 수행되었다(도 29). 이러한 결과는 가장 높은 MOI에서 Ad5를 이용한 적당한 세포 사멸을 제외하고는 시험된 모든 바이러스를 이용하여 최소의 세포 사멸을 입증한다. Ad5 및 Ad19k TNF 바이러스에 대한 현저한 세포 사멸이 감염 5일 후에 관찰된다. 특히, 감염 5일후까지 가장 높은 MOI에서 프로모터 결실 바이러스 TAV-255를 이용하여 검출가능한 세포 사멸이 없다. TNF를 발현하는 비복제성 바이러스는 감염 5일후까지 가장 높은 MOI에서 세포 사멸을 나타내지 않는다.
세포 생활력 검정이 감염 3 및 5일 후에 형질전환된 세포(A549)에서 수행되었다(도 30). 이러한 결과는 낮은 MOI의 Ad5, TAV 및 Ad19k TNF를 이용한 광범위한 세포 사멸, 및 가장 높은 MOI의 dl1520를 이용한 적당한 세포 사멸을 입증한다. 감염 후 5일까지, 0.1의 MOI에서의 Ad19k TNF 바이러스에 대한 유의한 세포 사멸은 Ad5 단독에 대해 관찰된 것보다 현저히 나았다. TNF를 발현하는 비복제 바이러스는 감염 후 5일까지 가장 높은 MOI에서 세포 사멸을 나타내지 않고, 중간의 활성이 가장 높은 MOI에서 dl1520에 대해 인지된다.
세포 생활력 검정이 감염 3 및 5일 후에 형질전환된 세포(패널)에서 수행되었다(도 31). 이러한 결과는 낮은 MOI에서 Ad5, TAV 및 Ad19k TNF를 이용하여 광범위한 세포 사멸, 및 가장 높은 MOI에서 dl1520를 이용하여 적당한 세포 사멸을 입증한다. 감염 후 5일까지, 0.1의 MOI에서의 Ad5, TAV 및 Ad19k TNF 바이러스에 대한 유의한 세포 사멸은 감염 후 5일까지 가장 높은 MOI에서 세포 사멸을 나타내지 않는 TNF를 발현하는 비-복제 바이러스에서 관찰된 것보다 현저히 나았다. 세포독성 활성이 dl1520에 대해 인지되나, 유사한 세포독성 활성을 위해 TAV 및 Ad19k TNF에 대해서보다 높은 MOI가 필요하다.
유세포분석을 이용한 AdTAV19kmmTNF에 의한 TNF의 표면 발현의 분석(도 32): 이러한 분석은 a) CaLu-6, b) LnCap 및 c) Hep3b 암세포주에서의 AdTAV19k TNF로부터의 TNF 발현의 풍부한 발현을 입증한다. 종양 세포의 100%에 달하는 TNF의 풍부한 발현은 2 pfu/세포와 동등한 2의 감염다중도(MOI)로 달성된다. 대조군으로서, dE1a-TNF 및 750의 MOI가 제시된다. 이러한 높은 MOI에서, 상기 세포주의 90%를 초과하는 세포가 TNF의 검출가능한 발현을 갖는다. 대조적으로, 2-5 pfu/세포로 사용된 Ad19kTNF는 80-00%의 세포에서 TNF의 검출가능한 발현을 갖는다. 유세포분석 데이터를 나타내는 상세한 분석이 도 9c-e에 도시된다. 요약하면, 이러한 데이터는 생물학적으로 활성인 TNF의 발현이, 750의 MOI에서 dE1a-TNF 벡터로 달성된 결과와 유사한, 2 내지 5의 MOI에서 Ad19kTNF 벡터로부터 달성될 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 TNF의 효과적인 발현이 E1a 프로모터에서 50개 염기쌍의 TAV-255 결실을 이용하여 달성될 수 있음을 추가로 입증한다. 본 발명자는 상기 프로모터 결실이 형질전환되지 않은 세포에서 E1a 및 E1b의 발현을 제한하는 반면, 종양 세포주에서 E1a 및 E1b의 발현을 보존하는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 TAV-255 결실을 함유하는 벡터로부터의 TNF의 효과적인 발현, 및 바이러스의 E1b-19k 영역으로 클로닝된 TNF를 이용한 효과적인 발현을 확증한다.
SK-Mel-28(흑색종 종양 세포)의 생존이 AdTAV19TNF, dE1a-TNF 및 Ad19k를 이용한 감염 후에 평가되었다(도 33). SK-Mel-28 세포주는 아데노바이러스 벡터에 의한 사멸에 무반응성이다. 가장 높은 MOI에서 dE1a-TNF를 이용하여 현저한 세포독성이 관찰되지 않았고, Ad19k를 이용하여 단지 적당한 세포독성이 관찰된다. 대조적으로, 완전한 세포독성이 시험된 가장 낮은 MOI인 10의 MOI에서 AdTAV19TNF를 이용하여 관찰된다.
TNF는 카스파제의 유도를 통해 세포 사멸을 유도한다(도 34 참조). TNF 결합에 의한 TNF 수용체의 활성화는 사멸(death) 도메인 단백질의 보충 및 카스파제-8의 이후의 활성화, 및 이후 아폽토시스 세포 사멸의 유도를 촉발시키는 카스파제-3의 활성화를 발생시킨다. 본 발명자는 5의 MOI로 Ad19k 또는 AdTAV19TNF로 감염된 Hep3b 세포에서의 카스파제-3의 활성화를 결정하였다. 결과는 AdTAV19TNF로 감염된 세포에서 카스파제-3의 현저한 유도를 입증한다. 카스파제-3 활성에서의 현저한 증가가 Ad19k로 감염된 세포에서 관찰되지 않는다.
E1b-19k 결실을 갖는 벡터에서의 E1b-55k의 발현의 결정(도 35): E1b-19k 결실 벡터에서의 삽입 부위가, E1b-55k의 시작 부위가 파괴되지 않도록 설계되었다. E1b-55k 유전자 발현이 보유되었는지 결정하기 위해, E1b-55k의 발현이 E1b-19k 영역으로 삽입된 TNF 또는 Kras를 갖는 벡터에서 평가되었다. 결과는 E1b-19k로 삽입된 Kras를 갖는 바이러스에 대해 E1b-55k의 정상적인 발현을 입증한다. E1b-55k의 발현 수준은 야생형 Ad5로 감염된 세포에서 관찰된 E1b-55k의 발현의 수준과 동등하다. 이는 E1b-55k의 발현이 E1b-19k 영역으로의 DNA의 삽입에도 불구하고 보존될 수 있는 것을 확증한다. 흥미롭게도, TNF를 발현하는 벡터로부터 E1b-55k의 검출가능한 발현이 없다. 이 시점에서, 본 발명자는 상기 효과의 원인을 알지 못한다. TNF는 E1b-55의 발현을 직접 억제할 수 있거나, 삽입의 특성이 E1b-55k으로부터의 발현을 감소시킬 수 있다. 이는 평가되고 있다.
E1b-19k으로의 GFP 삽입의 결정. E1b-19k으로의 GFP의 삽입이 PCR에 의해 입증되었다(도 36).
종양 세포는 Ad19kTAVhrGFP를 이용한 감염 후에 GFP를 발현한다(도 37).
이중 기능 벡터의 개념: E1a 인핸서의 조절은 E1 단백질을 풍부하게 발현하는 발현 벡터를 발생시킬 수 있고, 종양 세포에서 세포 용해성이다. 그러나, 이러한 바이러스는 낮은 수준으로 E1 단백질을 발현하고, 형질전환되지 않은 세포에서 제한된 용해 활성을 갖는다. 따라서, 바이러스 벡터는 종양 세포에서 암용해성일 수 있으나, 형질전환되지 않은 세포에서 치료 트랜스제닉 및 돌연변이된 단백질(백신)을 발현하도록 사용될 수 있다. 본 발명자는 E1 프로모터 결실 벡터를 이용한 감염 후에 종양 세포에서 E1 단백질의 풍부한 발현을 이전에 입증하였다. 대조적으로, E1 단백질의 발현이 지연되고, 형질전환되지 않은 세포에서 현저히 덜하다. 도 4c를 참조하라.
돌연변이된 Kras에 특이적인 암용해성 종양 백신의 개념: Kras는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 다운스트림이다. Kras에서의 돌연변이는 Ras 경로의 항시적 활성화를 발생시킨다. 돌연변이된 Kras가 항시적으로 활성이므로, 에르비툭스(Erbitux) 및 벡티빅스(Vectivix)와 같은 EGFR 수용체에 특이적인 요법이 효과가 없다. Kras는 통상적으로 결장암의 약 50% 및 췌장암의 90% 이상에서 발생하는 다양한 악성종양에서 돌연변이된다. 다양한 Kras 점 돌연변이가 기재되었고, 이는 환자가 EGFR 특이적 암 요법에 반응하는지 결정하기 위한 Kras 돌연변이에 대해 서열에 통상적이다. 본 발명자는 가장 통상적으로 기재된 Kras 돌연변이를 19K 발현 벡터로 클로닝시켰다.
종양 항원에 대한 면역성을 향상시키기 위한 E1b-19k로부터의 발현 벡터: Kras 돌연변이된 단백질이 종양 항원의 발현을 위한 강한 플랫폼을 제공하기 위한 3개의 별개의 방식으로 E1b-19k 발현 벡터로 클로닝되었다. 첫째로, 돌연변이된 Kras 서열을 코딩하는 DNA가 E1b-19k 영역으로 삽입되었다. 둘째로, 박테리아 플라젤린 유전자가 E1b-19k 영역으로 클로닝되었다. 클로닝 부위가 플라젤린 DNA 서열로 도입되었고, Kras 특이적 서열이 플라젤린 유전자의 중앙에 도입되었다. 플라젤린은 고도로 면역원성인 단백질이고, 이는 Kras 돌연변이된 서열에 대한 면역 반응을 향상시키는 것을 도울 수 있다. 셋째로, TNF가 E1b-19k CD154-TNF 작제물의 막횡단 도메인으로부터 결실되었고, 돌연변이된 Kras DNA 서열이 CD154로 라이게이션되었다. 이는 세포의 표면에서 돌연변이된 Kras 펩티드의 풍부한 발현을 제공한다. 사용된 작제물에 따라, Kras는 종양 세포의 표면에서의 발현으로 제한될 수 있거나, 면역 인지 및 처리를 위한 면역 세포 및 림프절로의 Kras 돌연변이된 펩티드의 방출을 가능케 하도록 단백질분해적으로 분해되는 것이 가능할 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, E1b-19k 삽입 부위를 포함하는 재조합 바이러스가 제공된다. E1b-19k 삽입 부위가, 예를 들어, DNA 서열의 삽입을 위해 사용될 수 있다. 삽입된 DNA 서열은, 예를 들어, 트랜스진, 암 유전자, 또는 돌연변이된 DNA 서열을 포함하는 임의의 서열을 엔코딩할 수 있다. 한 구체예에서, 트랜스진은 TNF이다. 또 다른 구체예에서, 트랜스진은 kras이다. 또 다른 구체예에서, 트랜스진은 돌연변이된 p53 서열이다.
한 구체예에서, E1b-55k의 서열 또는 이의 기능적 부분이 유지된다. 한 구체예에서, E1b-55k 시작 부위의 서열이 유지된다. 한 구체예에서, 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위와 E1b 55K의 시작 부위 사이에 약 1 내지 약 200, 약 100 이상, 약 100 내지 약 200, 약 1 내지 약 150, 약 1 내지 약 50, 또는 약 10개 이상의 염기쌍의 결실을 포함한다. 한 구체예에서, 삽입 부위는 E1b-19k의 시작 부위 후에 202개의 염기쌍의 결실을 포함한다.
Ⅶ. 바이러스 벡터
한 구체예에서, 본원에 기재된 변형된 유전자 및 서열이 바이러스 벡터 내에서 사용된다. 용어 "바이러스 벡터" 및 "바이러스"는 단백질 합성 또는 에너지 생성 메커니즘을 갖지 않는 편성(obligate) 세포내 기생생물 중 임의의 기생생물을 의미하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 바이러스 유전체는 지질막의 단백질의 코팅된 구조에 함유된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스는 바람직하게는 배큘로바이러스과, 파보바이러스과, 피코르나바이러스과, 헤르페스바이러스과, 폭스바이러스과 또는 아데노바이러스과로부터 선택된 재조합적으로 변형된 외피 또는 비-외피 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 바이러스는 자연 발생 바이러스일 수 있고, 이의 바이러스 유전체는 외인성 트랜스진의 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술에 의해 변형될 수 있고, 이는 복제 결함, 조건부적 복제, 또는 복제 적격이 되도록 유전공학 처리될 수 있다. 부모 벡터 특성의 각각의 유리한 요소를 이용하는 키메라 바이러스 벡터(예를 들어, Feng, et al.(1997) Nature Biotechnology 15:866-870)는 또한 본 발명의 실시에서 유용할 수 있다. 바이러스 백본은 바이러스 벡터의 패키징에 필요한 서열만을 함유하고, 트랜스진 발현 카세트를 임의로 포함할 수 있는 최소 벡터 시스템은 또한 본 발명의 실시에 따라 생성될 수 있다. 이는 일반적으로 치료되는 종으로부터의 바이러스를 이용하는 것이 선호되나, 일부 예에서, 유리한 병원성 특징을 갖는 다양한 종으로부터 유래되는 벡터를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 인간 유전자 요법을 위한 말과 헤르페스 바이러스 벡터는 WO98/27216호에 기재되어 있다. 벡터는 말과 바이러스가 인간에게 병원성이지 않음에 따라 인간의 치료에 유용한 것으로 기재되어 있다. 유사하게, 양과 아데노바이러스 벡터가 이들이 인간 아데노바이러스 벡터에 대한 항체를 회피하도록 청구되므로 인간 유전자 요법에 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 WO 97/06826호에 기재되어 있다.
바람직하게는, 바이러스 벡터는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 누클레오캡시드 및 이중 가닥 선형 DNA 유전체로 구성된, 중간 크기(90-100 nm)이고, 비-외피성(네이키드(naked)), 20면체 바이러스이다. 아데노바이러스는 숙주의 복제 기구를 이용하여 포유동물 세포의 핵에서 복제한다. 용어 "아데노바이러스"는 인간, 소과, 양과, 말과, 개과, 돼지가, 쥐과, 및 원숭이과 아데노바이러스 아속을 포함하나, 이에 제한되지 않는 아데노바이러스과 속의 임의의 바이러스를 의미한다. 특히, 인간 아데노바이러스는 A-F 아속 뿐만 아니라 이의 개별적 혈청형, 및 A-F 아속, 비제한적인 예로, 인간 아데노바이러스 타입 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11A and Ad 11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 및 91을 포함한다. 인간 아데노바이러스 타입 2 및 5로부터 유래된 벡터가 바람직하다.
한 구체예에서, 변형된 조절 서열은 단백질을 엔코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, E1a 및 E1b 유전자(코딩 영역) 중 하나 이상은 변형된 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, E1a 및 E1b 유전자 중 하나 이상이 야생형 형태에 존재한다.
한 구체예에서, E1a 유전자는 변형된 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 구체예에서, E1a 유전자는 야생형이다. 또 다른 구체예에서, E1a 유전자는 E1a 이소폼을 선택적으로 발현하도록 변형된다.
또 다른 구체예에서, 변형된 E1b 유전자는 야생형 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 구체예에서, 변형된 E1a 유전자 및/또는 변형된 E1b 유전자는 변형된 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 기능적 관계의 폴리누클레오티드 요소의 연결을 의미한다. 핵산 서열은 또 다른 핵산 서열과 함께 기능적 관계로 위치되는 경우에 "작동적으로 연결된" 것이다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된은 연결되는 누클레오티드 서열이 통상적으로 연속적인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 일반적으로 수 킬로베이스에 의해 프로모터로부터 떨어진 경우에도 작용하고, 인트론 서열이 가변적인 길이일 수 있음에 따라, 일부 폴리누클레오티드 요소는 작동가능하게 연결될 수 있으나, 이는 직접 측면에 위치하지 않을 수 있고, 이는 여러 대립유전자 또는 염색체로부터 트랜스(trans)로 작용할 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 변형된 조절 서열은 세포독성 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 용어 "세포독성 트랜스진"은 표적 세포 내에서의 발현이 세포의 용해 또는 아폽토시스를 유도하는 누클레오티드 서열을 의미한다. 용어 세포독성 트랜스진은, 비제한적인 예로, 종양 억제자 유전자, 독소 유전자, 세포증식억제 유전자, 프로드러그 활성화 유전자, 또는 아폽토시스 유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 세포독성 트랜스진 중 임의의 트랜스진이 상기 기재된 바와 같이 E1b-19K 삽입 부위에 라이게이션될 수 있다.
용어 "종양 억제자 유전자"는 표적 세포에서의 발현이 신생물 표현형을 억제할 수 있고/있거나 아폽토시스를 유도할 수 있는 누클레오티드 서열을 의미한다. 본 발명의 실시에 유용한 종양 억제자 유전자의 예는 p53 유전자, APC 유전자, DPC-4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막모세포종 유전자(Lee, et al (1987) Nature 329:642), MMAC-1 유전자, 선종성 결장폴립증 단백질(Albertsen, et al, United States Patent 5,783,666, 1998년 7월 21일에 발행됨), 결장 암종에서의 삭제(deleted in colon carcinoma, DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3.에서 맵핑된 비인두 암종 종양 억제자 유전자(Cheng, et al . 1998. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047), MTS 1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF2 유전자, 및 VHL 유전자를 포함한다.
용어 "독소 유전자"는 세포에서의 발현이 독소 효과를 발생시키는 누클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 독소 유전자의 예는 슈도모나스 외독소, 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "아폽토시스 유발(pro-apoptotic) 유전자"는 이의 발현이 세포의 프로그램화된 세포 사멸을 발생시키는 누클레오티드 서열을 의미한다. 아폽토시스 유발 유전자의 예는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K, 아데노바이러스 E4orf4 유전자, p53 경로 유전자, 및 카스파제를 엔코딩하는 유전자를 포함한다.
용어 "프로드러그 활성화 유전자"는 이의 발현이 비-치료 화합물을 외부 인자에 의해 세포가 사멸에 대해 민감해지도록 하거나 세포에서 독성 조건을 야기시키는 치료 화합물로 전환시킬 수 있는 단백질을 생성시키는 누클레오티드 서열을 의미한다. 프로드러그 활성화 유전자의 예는 시토신 데아미나제 유전자이다. 시토신 데아미나제는 5-플루오로시토신을 5-플루오로우라실(효능 있는 항종양제)로 전환시킨다. 종양 세포의 용해는 종양의 국소화된 지점에서 5FC를 5FU로 전환시킬 수 있어 많은 주위 종양 세포의 사멸을 발생시킬 수 있는 시토신 데아미나제의 국소화된 파열을 제공한다. 이는 아데노바이러스를 이용하여 상기 세포를 감염시킬 필요 없이 많은 수의 종양 세포의 사멸을 발생시킨다(소위 "방관자 효과"). 추가로, 티미딘 키나아제(TK) 유전자(예를 들어, Woo, et al. United States Patent No. 5,631,236 (1997년 5월 20일에 발행) 및 Freeman, et al. United States Patent No. 5,601,818 (1997년 2월 11일에 발행) 참조)가 사용될 수 있고, 여기서 TK 유전자 생성물을 발현하는 세포는 간시클로버(gancyclovir)의 투여에 의해 선택적 사멸에 민감하다.
용어 "사이토카인 유전자"는 세포에서의 발현이 사이토카인을 생성시키는 누클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 GM-CSF, 인터루킨, 특히, IL-1, IL-2, EL-4, IL-12, IL-10, IL-19, EL-20, α, β 및 감마 서브타입의 인터페론, 특히 인터페론 α-2b 및 융합체, 예를 들어, 인터페론 α-2α-1을 포함한다.
Ⅷ. 형질전환된 세포
시험관내 또는 생체내에서 세포를 형질전환시키기 위해 벡터가 사용될 수 있다. 세포는 신생물 세포 및/또는 정상 세포일 수 있다.
"신생물 세포"는 정상 세포 성장 조절의 독립을 특징으로 하는 이상 성장 표현형을 나타내는 세포이다. 신생물 세포는 임의의 제공된 시점에서 반드시 복제하는 것이 아님에 따라, 상기 용어 신생물 세포는 활발히 복제하거나 일시적 비-복제 휴지 상태(G1 또는 G0)일 수 있는 세포를 포함한다. 신생물 세포의 국소화된 집단은 신생물로 언급된다. 신생물은 악성이거나 양성일 수 있다. 악성 신생물은 또한 암으로 언급된다. 신생물 변형은 정상 세포의 신생물 세포, 종종 종양 세포로의 전환을 의미한다. 신생물이 아닌 세포는 "정상" 또는 "비-신생물"로 언급된다.
Ⅸ. 종양 선택적 발현 방법
한 구체예에서, 재조합 바이러스는 선택적 발현을 나타낸다. 특히, 재조합 바이러스는 신생물 세포에서 발현을 가능케 하나, 정상 세포에서 발현을 약하게 한다.
따라서, 한 구체예에서, 표적 세포에서 펩티드(예를 들어, 단백질)을 선택적으로 발현시키는 방법은 세포와 펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 결실 돌연변이 E1a 조절 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 상황에서, 단백질 및 이의 부분을 포함하는 펩티드는 임의의 길이일 수 있다. 한 구체예에서, E1a 및/또는 E1b과 같은 펩티드는 바이러스 복제와 관련이 있다. 또 다른 구체예에서, 펩티드는 암과 관련이 있다.
또 다른 구체예에서, 표적 세포에서 펩티드를 선택적으로 발현시키는 방법은 세포와 단일 E1a 이소폼, 예를 들어, E1a-12S 또는 E1a-13S를 선택적으로 발현하는 재조합 바이러스를 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 표적 세포에서 펩티드를 선택적으로 발현시키는 방법은 세포와 E1b-19k 삽입 부위에 삽입된 트랜스진을 포함하는 재조합 바이러스를 접촉시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 표적 세포는 신생물 세포, 예를 들어, 암 세포이다. 이러한 경우, 펩티드는, 바람직하게는, 야생형 발현과 유사한 수준으로 발현된다. 한 구체예에서, 발현(mRNA 발현 또는 웨스턴 블롯에 의해 측정됨)은 야생형 발현의 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상이다.
또 다른 구체예에서, 표적 세포는 정상 세포이다. 이러한 경우, 펩티드 발현은 야생형 발현에 비해 선택적으로 약화된다. 한 구체예에서, 발현(mRNA 발현 또는 웨스턴 블롯에 의해 측정됨)은 야생형 발현의 25% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하로 감소된다. 한 구체예에서, 약 0% 내지 약 5%의 약화가 달성된다.
상기 선택적 발현 방법은 시험관내 또는 생체내에서 실시될 수 있다.
Ⅹ. 치료 방법
본원에서 사용되는 "질병을 치료하는 방법"은 질병 상태, 질병 상태에 의해 야기된 질환, 또는 질병 증상을 치료하는 방법을 의미한다. 질병을 "치료하는" 것은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 질병의 생리학적 원인을 처리하고, 질병 증상의 생리학적 원인을 처리하고, 질병의 중증도를 감소시키고, 질병의 진행을 느리게 하고, 질병의 증상을 개선시키고, 질병 지속기간을 감소(예를 들어, 소실(remission)을 촉진시킴)시킨다.
본원에서 사용되는 "피검체"는 암의 치료를 필요로 하는 피검체이다. 피검체는 바람직하게는 사람이나, 실험실 동물, 애완 동물, 가정용 동물 또는 가축을 또한 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 피검체는 포유동물이다.
한 구체예에서, 암을 치료하는 방법은 상기 기재된 바와 같은 재조합 바이러스를 포함하는 약학적 제형을 투여하는 것을 포함한다. 약학적 제형은 비제한적인 예로, 폐암, 췌장암, 전립선암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 두경부암, 방광암, 유방암, 결장암 및 직장암, 자궁내막암, 신장암, 백혈병, 피부암(흑색종 및 비-흑색종), 비-호지킨 림프종, 및 갑상선암을 포함하는 광범위한 단계 및 유형의 암을 치료하기 위해 전신적 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
벡터를 포함하는 약학적 제형이 또한 제공된다. 벡터는 당 분야에 공지된 방법에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 특히, 전달 시스템은 근내, 정맥내, 동맥내 또는 종양내 주사용으로 제형화될 수 있다.
제형은 생리학적 조건에 근접시키는데 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH-조정제 및 완충제, 긴장성 조정제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등을 함유할 수 있다.
약학적 제형 중의 활성제의 농도는, 예를 들어, 약 0.1 중량% 미만, 보통 약 2 중량% 이상에서 20 내지 50 중량%까지의 높은 농도로 매우 다양할 수 있고, 이는 주로 특정한 선택 투여 방식에 따라 유체 부피, 점성도 등에 의해 선택될 수 있다.
본원에 기재된 제형 및 방법은 단독으로 실시될 수 있거나, 통상적인 화학요법제 또는 치료 요법과 조합하여 실시될 수 있다.
ⅩⅠ.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 예시하기 위한 것으로, 본원에 기재된 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
A.
E1a
전사 조절 영역 결실
세포주, 바이러스, 및 플라스미드: HEK-293A(아데노바이러스 E1-형질전환된 인간 배아 신장 세포), HeLa(자궁경부암), A549(폐암), LNCaP(전립선암), Calu-6(폐암), PANC-1(췌장암), AsPc-1(췌장암), 및 MRC-5, WI-38, 및 IMR-90(폐 섬유모세포) 세포를 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 수득하였고, 이를 5% CO2의 존재하에서 10% 우태아 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 성장시켰다. 일차 세포를 100 퍼센트 컨플루언스로 이들을 성장시킨 후, 완전 배지에서의 연장된 인큐베이션에 의해 접촉 억제시켰다.
Ad5 유전체로의 돌연변이의 재구성: 야생형 Ad5(Dl309), E3 영역의 부분적 결실, 및 Ad5 E1A 프로모터/인핸서의 다양한 결실 돌연변이; Dl309-6, Dl340-12, 및 Dl87은 패트릭 히어링(Patrick Hearing)(Stony Brook University, USA)에 의해 제공되었다. TAV-255 바이러스를 작제하기 위해, E1a 프로모터 인핸서 영역을 권장된 메뉴얼에 따라 QuickChange Ⅱ XL 부위 특이적 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 아데노바이러스 벡터 플라스미드 pXC1(Microbix Biosystem Inc.)을 이용하여 결실시켰다. 프라이머 d194_243_F 5' - AAA GTG ACG TTT TTG GTG TGC GCC GGT GTT TTG GGC GTA ACC GAG TAA GAT TTG GCC A - 3' (서열 목록 번호:1) 및 d194_243_R 5' - TGG CCA AAT CTT ACT CGG TTA CGC CCA AAA CAC CGG CGC ACA CCA AAA ACG TCA CTT T - 3' (서열 목록 번호:2)을 상기 결실에 사용하였다. pXC1_TAV-255로 명명된 수득된 플라스미드를 E-콜리에서 증폭시키고, 서열분석하고, HiPur Plasmid Filter Midiprep 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 정제시켰다. 아데노바이러스 TAV-255를 수득하기 위해, pXC1_TAV 플라스미드를 Fugene®6 트랜스펙션 시약(Roche, Switzerland)을 이용하여 pJM17과 함께 HEK-293 세포(ATCC, Manassas, VA)에 공동 트랜스펙션시켰다. 세포를 12일에서 단일 플라크를 수득하기 위해 배양 배지에서 1.0% 시 플라크 아가로오스(Sea Plaque Agarose)로 덮었다. 2 라운드의 플라크 정제 후, 단일 플라크로부터의 바이러스를 HEK-293 세포에서 증폭시켰다. AccuPrep 유전체 DNA 추출 키트(Bioneer Inc., Alameda, CA)를 이용하여 배양 상층액으로부터 바이러스 DNA를 추출하고, 서열 분석하여, 예상 돌연변이를 확인하였다.
dl309 유전체로의 결실 돌연변이의 재구성: 모든 결실을 먼저 제조업체의 권장에 따라 스트라타진(Stratagene, CA)사로부터 수득한 부위 특이적 돌연변이유발 키트(Quick change Ⅱ XL)를 이용하여 pXC1에서 모든 결실을 제조하였다. 특정한 결실을 제조하는데 사용된 모든 프라이머는 다음과 같다(각각 서열 목록 번호:3-12): dl212(dl212S- CGG TGT ACA CAG GAA GTG ACA ATC GGT TTT AGG CG 및 dl212 As-CGC CTA AAA CCG ATT GTC ACT TCC TGT GTA CAC CG), dl220 (dl220S AGT GAC AAT TTT CGC GCA GGC GGA TGT TGT AGT A 및 dl220AS: AGT GAC AAT TTT CGC GCA GGC GGA TGT TGT AGT A), dl275 (dl275S: GTA ACC GAG TAA GAT TTG GCC ATG GAA AAC TGA ATA AGA GG 및 dl275 AS : CCT CTT ATT CAG TTT TCC ATG GCC AAA TCT TAC TCG GTT AC), dl200 (dl200S: GCG CCG GTG TAC ACA GAC AAT TTT CGC GCG 및 dl200AS: CGC GCG AAA ATT GTC TGT GTA CAC CGG CGC), dl230 (dl230S: TTC GCG CGG TTT TAG GCT GTA GTA AAT TTG GGC G 및 dl230AS: CGC CCA AAT TTA CTA CAG CCT AAA ACC GCG CGA A). 돌연변이된 플라스미드를 먼저 요망되는 돌연변이를 확인하기 위해 서열 분석하였고, 이후 HiPur Plasmid Midiprep 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 증폭시켰다. dl309 유전체에서 요망되는 돌연변이를 생성시키기 위해, Fugene6 트랜스펙션 시약(Roche, Switzerland)을 이용하여 요망되는 돌연변이를 함유하는 돌연변이된 pXC1을 pJM17과 함께 HEK-293 세포(ATCC, Manassas, VA)로 공동 트랜스펙션시켰다. 10일에서 단일 플라크를 수득하기 위해 배양 배지에서 1.0% 시 플라크 아가로오스로 세포를 덮었다. 2회 플라크 정제 후, 단일 플라크로부터의 바이러스를 HEK-293 세포에서 증폭시켰다. 바이러스 DNA를 AccuPrep 유전체 DNA 추출 키트(Bioneer INc, Alameda, CA)를 이용하여 돌연변이된 바이러스로 감염된 배양 세포로부터 추출하였고, PCR 증폭시킨 후, 예상 돌연변이를 확인하기 위해 서열 분석하였다.
바이러스 감염, 증식, 및 정량화: 모든 바이러스를 HEK-293A 세포에서 증식시켰다. 세포를 5(Ad5 유전체에 대해) 또는 10(dl309 유전체에 대해)의 MOI로 감염시키고, 감염 3일 후에, 세포를 수거하고, 완전 배지에 재현탁시키고, 3주기의 동결/해동에 의해 용해시켰다. 용해질을 0.4 μm 필터(Millipore, USA)를 통해 통과시켜 정화시켰다. 샘플에 글리세롤을 10%(v/v)의 최종 농도로 첨가하고, -80℃로 동결시켰다. 바이러스 역가를 정량하기 위해, 플라크 검정을 클론텍(Clontech, USA)사에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다.
세포 용해질의 제조 및 면역블롯 분석: 웨스턴 블롯 분석을 위해, 세포를 5의 MOI로 아데노바이러스를 이용하여 감염시킴으로써 다양한 세포주로부터의 세포 추출물을 제조하고, 감염 후 다양한 시점에서 M-PER® 포유동물 단백질 추출 시약(Pierce, USA)을 이용하여 전체 세포 용해질을 제조하였다. 단백질을 Bradford 시약(Bio-Rad, USA)을 이용하여 측정하고, 25 μg의 단백질 샘플을 2% SDS, 100 mM 디티오트레이톨, 0.05 M Tris-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤, 및 0.1% 브로모페놀 블루를 함유하는 샘플 완충액 중에서 5분 동안 비등시켰다. 단백질을 제조업체의 설명서(Invitrogen, CA)에 따라서 4 내지 12% bis-Tris 겔에서 분석하였다. 단백질 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 4-12% Bis-Tris 겔(Ad5 유전체에 대해)에서 영동시키고, 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막인 Immobilon-Psq(Millipore, USA)로 옮겼다. E1a 및/또는 E1b 단백질을, 예를 들어, Ad2 E1A 단백질에 대한 폴리클로날 항체(Santa Cruz, USA) 및 A. J. 레바인(Dr. A.J. Levine)(New Jersey, USA)박사로부터 구입한 E1b-55k 단백질에 대한 모노클로날 항혈청을 이용하여 검출하였다.
실시간 정량-PCR 분석: RNA를 RNase Easy plus mini 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 추출하고, 1.5 μg의 전체 RNA를 AMV 역전사효소(Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. 정량-PCR(Q-PCR)을 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사의 Power Cyber green 시약을 이용하여 삼중으로 수행하였고, 상기 반응을 AB Prism 7900 HT 서열 검출 시스템에서 수행하였다. 역전사 없이 RNA 샘플을 대조군으로 사용하였다. 데이터를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, USA)사에 의해 제공된 SDS 2.2.1 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
플라스미드 작제물: 아데노바이러스(Ad5) E1A 프로모터/인핸서 DNA 서열(+52 내지 -357)을 5' BamHⅠ 및 XhoⅠ 제한 부위를 각각 갖는 프라이머 Ad143F 및 Ad552R(정방향 5' GGGGTACCAC ATG TAAG CGAC GGATG TGGC 3' (서열 목록 번호:13) 및 역방향 5' AAACTCGAGCCCGGTGTCGG AGCGGCT 3' (서열 목록 번호:14))를 이용하여 PCR 증폭시키고, 루시퍼라제 리포터 벡터 pGL3-Basic, 프로모터 비함유 및 인핸서 비함유 벡터(Promega, USA)로 삽입하고, pE1AP/EGL3로 명명하였다. 플라스미드를 서열분석(Eton Biosciences, USA)하여 E1A 프로모터/인핸서 정확성을 확인하였다.
일시적 트랜스펙션 및 루시퍼라제 활성: 일시적 트랜스펙션 실험을 위해, 트랜스펙션 하루 전에 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅(5x105 세포/웰)하였다. 세포를 키아젠(Qiagen) 매뉴얼에 기재된 바와 같은 PolyFect® 매개 유전자 전달 방법으로 트랜스펙션시켰다. 간단히, 25 마이크로리터의 polyFect 시약을 1 마이크로그램의 루시퍼라제 리포터 플라스미드(pE1AEGl3) 또는 루시퍼라제 pGL3-Control 벡터(Promega, Madison, USA), 및 루시퍼라제 작제물로 수득된 값을 표준화시키기 위한 내부 대조군으로서 20 ng(50:1의 비)의 레닐라 루시퍼라제 발현 벡터 pRLCMV(Promega)를 함유하는 125 마이크로리터의 DMEM(Highclone)과 함께 혼합시켰다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 복합체를 형성시켰다. 이후, 혼합물을 1.0 ml의 DMEM에서 희석시키고, 세포 배양물에 첨가하였다. 세포를 24 내지 48시간 동안 배양하고, 수동 용해 완충액(passive lysis buffer)(Promega)을 이용하여 용해시켰다. 개똥벌레 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 발광측정기 Veritas(Turner Biosystems, CA, USA)에서 제조업체에 의해 상술된 바와 같이 이중 루시퍼라제 검정 키트(Promega, USA)에 의해 측정하였다. 모든 실험을 3회 이상으로 수행하였고, 상대 루시퍼라제 활성을 평균으로 제시하였다.
세포 생활력 검정: 제조업체의 설명서에 따라 Cell Counting Kit-8(Dojindo, Rockville, USA)를 이용하여 세포 생활력 검정을 삼중으로 수행하였다. 간단히, 세포(MRC-5, A549, PANC-1, 또는 AsPC-1)를 웰당 1x104의 밀도로 96 웰 세포 배양 접시에 시딩하였다. 다음날, 세포를 5의 MOI로 바이러스(Wt Ad5, TAV-255, ONYX-015, dl309, 또는 dl200+230)로 감염시켰다. 이후, 바이러스를 흡출시키고, 신선한 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 4-6일 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰에, 10 μl의 시약을 첨가하고, 4시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 GENious pro(Tecan, USA), 96 웰 플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독하였다. 흡광도를 기록하고, 세포 생활력을 하기와 같이 계산하였다:
세포 생활력 = (감염된 세포의 A450 nm 평균 값) / (감염되지 않은 세포의 A450 nm 평균 값) × 100%.
세포변성 효과를 또한 광학 현미경에서 시각화시키고, 100x 배율로 사진을 찍었다. 세포 생활력을 정량하기 위한 크리스탈 바이올렛 실험을 또한 일부 예에서 수행하였다(Fueyo, J., et al. (2003). Preclinical characterization of the antiglioma activity of a tropism-enhanced adenovirus targeted to the retinoblastoma pathway. Journal of the National Cancer Institute 95: 652-660).
B.
E1a
이소폼
12S 및 13S의 선택적 발현
바이러스 및 세포: A549(폐 암종), Calu-6(폐 암종), Panc-1(췌장 암종), LnCaP(전립선 선암종), Hep-3b(간세포 암종), 및 MRC-5 및 WI-38(폐 섬유모세포) 세포를 미국 미생물 보존센터(ATCC)에서 구입하고, LnCap을 제외하고는 5% CO2의 존재하에서 10% 우태아 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지에서 성장시키고, 이를 10% 우태아 혈청, 1% 탄산나트륨, 1% 피루브산 나트륨, 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 RPMI에서 유지시켰다. MRC5 및 WI-38 배양물을 100% 컨플루언스로 성장시킨 후, 감염 전에 접촉 억제와 함께 5일 동안 인큐베이션함으로써 접촉 억제시켰다. PM975 및 dl1500 바이러스는 UCLA의 아놀드 버크 박사(Dr. Arnold Berk)에 의해 제공되었다.
웨스턴 블롯 분석: 감염 후 다양한 시점에서 1 μl/ml HALT 프로테아제 억제제(Pierce)와 함께 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약(Pierce)을 이용하여 샘플 전체 세포 용해질을 제조하였다. 단백질을 Bradford 시약(Bio-Rad, USA)을 이용하여 평가하고, 20 mg의 단백질 샘플을 비등시켰다. 샘플을 190V에서 60분 동안 NuPAGE MOPS SDS 런닝 완충액 중의 1.5 mm, 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen, CA)에서 전기영동시켰다. 샘플을 100V에서 60분 동안 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막인 Immobilon-Psq(Millipore, USA)로 옮겼다. 옮긴 후, 막을 가벼운 진탕과 함께 T20 (TBS) 블로킹 완충액(Thermo Scientific) 중에서 60분 동안 블로킹시켰다. 블로킹 후, 막을 4℃에서 밤새(12-18h) 블로킹 완충액 중에 희석된 아데노바이러스 E1A 폴리클로날 항체(#sc-430, Santa Cruz Biotechnology)의 1:250 희석물 중에서 인큐베이션시켰다. 막을 TBST로 세척하고, TBST 중에 1:2000 희석된 호스라디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 항-토끼 IgG(#sc-2357, Santa Cruz Biotechnology)와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 5분 동안 TBST로 3회 헹군 후, 5분 동안 TBS 중에서 세척하였다. 막을 건조 블롯화시키고(blotted dry), 2 ml SuperSignal West Pico 화학발광 기질(Pierce, Rockford, IL) 중에서 인큐베이션시키고, 건조 블롯화시켰다. 블롯을 현상 폴더에 두고, 필름 카세트로 옮겼다. 막을 필름(Denville Scientific, Metuchen, NJ)에 노출시켰다. 2 및 5초의 노출을 수득하였다.
세포독성 검정: Cell Counting Kit-8(Dojindo, Rockville, USA)을 이용하여 세포 생활력 검정을 삼중으로 수행하였다. 세포를 웰당 1000개의 밀도로 96 웰 세포 배양 접시에 시딩하였다. 10 μl의 바이러스/배양 배지 용액과 함께 다양한 MOI의 WT, Onyx-015, PM975, 또는 dl1500 바이러스를 이용한 플레이팅 16시간 후에 플레이트를 처리하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 요망되는 길이의 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각각의 웰에 대해 10 μl의 Dojindo CCK-8 용액을 이용하여 샘플을 처리하였다. 플레이트를 인큐베이션 4시간 후에 GENious pro(Tecan, USA) 96 웰 판독기를 이용하여 450 nm에서 판독하였다.
C.
E1b
19K 클론 삽입물
바이러스 작제물: Ad TAV-255/dl 19kCD 154-TNF를 다음과 같이 작제하였다: 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 Ad 5 역위(inverted) 말단 반복부의 좌측 암(arm)에 비해 194-254로부터 50 bp의 E1A 인핸서/프로모터 요소를 결실시키기 위해 플라스미드 pXC1(Microbix, Ontario, Canada)을 사용하였다. 생성된 플라미드를 bp1716에서 SalⅠ 및 1916에서 XhoⅠ을 함유하도록 변형시켜, 상기 효소에 의한 절단 시에 E1b-19KD 단백질의 결실을 발생시키도록 하였다. CD154-TNF를 pCDNA3CD154-TNF 플라스미드를 이용하여 PCR 증폭시키고, 기재된 플라스미드의 SalⅠ 및 XhoⅠ 부위로 클로닝시켰다. 재조합 바이러스를 293 세포에서 막 안정화 TNF 카세트를 함유하는 pXC1 발현 플라스미드와 플라스미드 JM17 사이에서의 상동 재조합에 의해 제조하였다. 간단히, 293 세포를 트랜스펙션일에 60-70%의 컨플루언스로 성장시켰다. 세포 및 상층액을 감염 10일 후에 수거하였다. 3주기의 동결-해동 후, 플라크 검정을 수행하고, 개별적 플라크를 정제하고, 재조합 바이러스로부터 DNA를 분리시키고, TNF 분자의 발현에 대해 특성규명하였다.
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<223> synthetic primer Ad552R
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aaactcgagc ccggtgtcgg agcggct 27
Claims (30)
- 변형된 E1a 조절 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스로서, 하나 이상의 Pea3 결합 부위가 결실된 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항에 있어서, Ela의 전사 시작 부위로부터 -305 내지 -141 범위 내의 하나 이상의 누클레오티드가 보존된 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Pea3 Ⅱ, Pea3 Ⅲ, Pea3 Ⅳ 및 Pea3 Ⅴ 중 하나 이상이 결실된 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항에 있어서, Pea3 Ⅱ 및 Pea3 Ⅲ 중 하나 이상이 결실된 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항에 있어서, Pea3 Ⅱ 및 Pea3 Ⅲ이 결실된 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항에 있어서, Pea3 Ⅳ 및 Pea3 Ⅴ 중 하나 이상이 결실된 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항에 있어서, Pea3 I이 보존된 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항에 있어서, 하나 이상의 E2F 결합 부위가 보존된 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항에 있어서, 벡터 dl309-6, TAV-255, dl55, dl200, dl230 또는 dl200+230을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제 9항에 있어서, 벡터 TAV-255를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 E1a 이소폼(isoform)을 선택적으로 발현하는 재조합 아데노바이러스.
- 제 11항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 E1a-12S를 선택적으로 발현하는 재조합 아데노바이러스.
- 제 11항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 E1a-13S를 선택적으로 발현하는 재조합 아데노바이러스.
- 제 12항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 E1a-13S를 발현하지 않는 재조합 아데노바이러스.
- 제 13항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 E1a-12S 를 발현하지 않는 재조합 아데노바이러스.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스가 E1b-19K 삽입 부위로 삽입된 DNA 서열을 추가로 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제 17항에 있어서, 상기 삽입 부위가 E1b-19K의 전사 시작 부위와 E1b 55K의 전사 시작 부위 사이에 위치되는 재조합 아데노바이러스.
- 제 17항에 있어서, 상기 E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 전사 시작 부위 이후에 202개의 염기쌍의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 서열이 종양 괴사 인자를 엔코딩하는 서열인 재조합 아데노바이러스.
- 제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 서열이 kras를 엔코딩하는 서열인 재조합 아데노바이러스.
- 제 17항에 있어서, DNA 서열이 변형된 E1a 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 하나 이상의 Pea3 결합 부위가 결실된 재조합 아데노바이러스.
- 삭제
- 제 1항의 재조합 아데노바이러스로 형질전환된 세포.
- 표적 세포에서 펩티드를 선택적으로 발현시키기 위한, 제 1항의 재조합 아데노바이러스.
- 제 25항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스가 펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 결실 돌연변이 E1a 조절 서열을 포함하는, 재조합 아데노바이러스.
- 제 25항에 있어서, 상기 표적 세포가 신생물 세포인, 재조합 아데노바이러스.
- 제 25항에 있어서, 상기 표적 세포가 정상 세포인, 재조합 아데노바이러스.
- 제 25항에 있어서, 재조합 아데노바이러스가 생체내로 투여되는, 재조합 아데노바이러스.
- 제 25항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 근내, 정맥내, 동맥내 또는 종양내 주사에 의해 투여되는, 재조합 아데노바이러스.
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