KR101748229B1

KR101748229B1 - 2,2'-비스-티아졸계 화합물 및 그 제조방법과 용도

Info

Publication number: KR101748229B1
Application number: KR1020167030768A
Authority: KR
Inventors: 파준 난; 지아 리; 신 시에; 차오준 공; 유보 져우; 후이 차이; 양밍 장; 밍보 수
Original assignee: 상하이 인스티튜트 오브 마테리아 메디카 차이니즈 아카데미 오브 싸이언시즈
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2017-06-16
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: JP6279145B2; WO2015149656A1; CN104974108A; JP2017510647A; US20170044119A1; EP3127903A4; WO2015149656A8; AU2015240237B2; AU2015240237A1; EP3127903B1; KR20160136448A; US9643941B2; CA2947912C; CA2947912A1; EP3127903A1; CN104974108B

Abstract

본 발명은 티아졸계 화합물 및 그 제조방법과 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 2,2'-비스-티아졸계 화합물, 그 제조방법, 및 항종양제, 자가 면역 질환 치료제, II형 당뇨병 및 그 합병증 치료제 또는 신경퇴행성 병변 치료제의 제조에 있어서 히스톤 데아세틸라제(histone deacetylase) 억제제로서 2,2'-비스-티아졸계 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

2,2'-비스-티아졸계 화합물 및 그 제조방법과 용도{2,2'-BIS-THIAZOLE-BASED COMPOUNDS, PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF}

본 발명은 티아졸계 화합물 및 그 제조방법과 용도에 관한 것으로, 더 구체적으로, 본 발명은 2,2'-비스-티아졸계 화합물, 그 제조방법 및 히스톤 데아세틸라제 억제제로서의 항종양 또는 자가 면역 질환 치료용 약물 제조에서의 용도에 관한 것이다.

후성 유전학은 “후생 유전학”(epigenetics)이라고도 하며, 세포핵의 DNA 서열 변화가 없는 상태에서 유전자 기능의 가역적, 유전 가능한 변화를 연구하는 생물과학이다. 이는 기능적으로 게놈을 수정하는 것이고, 뉴클레오타이드 서열의 변경과 관련이 없다. 후성 유전학 현상은 DNA메틸화, RNA간섭, 조직 단백질 변형 등을 포함한다.

히스톤의 전사 후 변형은 주로, 히스톤의 아세틸화, 메틸화, 인산화, 폴리유비퀴틴화 및 SUMO 아실화 등을 포함하며, 그 중 아세틸화는 가장 광범위하게 연구되는 방법이기도 하다. 히스톤의 아세틸화 및 탈아세틸화는 핵 염색질의 구조 변형 과정에서 관건적인 역할을 하고, 이들은 각각 히스톤 아세틸화 효소(HAT) 및 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC)에 의해 활성 조절된다(Saha, R. N, Pahan, K., Cell Death Differ 2006,13(4), 539-50).

현재까지, 18종의 인간의 HDACs를 발견 및 검증했고, 효모 HDAC의 유사성에 따라 총 4개의 군으로 분류되며, 각각 Ⅰ형(HDAC 1, 2, 3 및 8), Ⅱ형(Ⅱa：HDAC 4, 5, 7 및 9, Ⅱb：HDAC 6 및 10), 및 Ⅳ형(HDAC 11)이고, 이러한 HDACs의 활성은 모두 Zn² ⁺에 의존한다.Ⅲ형 HDACs(SirT 1-7)의 경우, 그 효모 활성은 NAD⁺에 의존한다. (Karagiannis,T.C., El-Osta, A.Leukemia 2007, 21 (1), 61-5.)

히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACi)가 조절에 참여하는 중요한 생물학적 기능은, 1) 외인성 또는 내인성 세포사멸 경로 메커니즘을 통해 세포사멸을 유도하는 것; 2) 세포주기를 저해하는 것; 3) 신생혈관의 생성을 억제하는 것; 4) 튜불린의 아세틸화 및 응집체 형성을 파괴하는 것; 5) 튜불린 구조를 변화시켜 세포 운동 및 분화에 영향을 미치는 것; 6) T 세포 수용체 기능, 면역 작동 세포의 사이토카인 환경에 영향을 주고 기타 면역 작동 인자를 직접 상향조절하여 종양 세포의 단백질 등을 식별하는 방식으로 종양 면역을 조절하는 것이다(Zain J., Hematol Oncol Clin Northam, 2012,26(3):671-704.). HDAC의 기능 장애는 히스톤 아세틸화의 불균형을 초래하여, 염색질 구조를 변화시키고, 세포 성장, 분화, 세포사멸 관련 유전자 발현을 억제시켜, 최종적으로 종양의 형성을 초래할 수 있다. HDAC는 현재 신형 항종양 약물의 연구개발에서 중요한 타깃이다. 2006년에 FDA는 SAHA(Vorinostat)를 최초로 출시된 피부 T세포 림프종(CTCL)의 치료를 위한 HDACi로 허가했고, 2009년에는 CTCL 및 말초 T세포 림프종(PTCL)의 치료를 위한 약물로서 FK228가 출시되었다.

최근 연구결과가 보여주듯이, HDACi는 다양한 자가 면역 질환과도 관련이 있을 수 있다. 2003년초에 Pahan 등은 HDAC 억제제 소듐 페닐뷰틸레이트는 다발성 경화증(MS)의 마우스 동물 모델(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)에서 마우스의 중추신경계통의 손상을 완화시킬 수 있다고 보고했으나, 이러한 결과와 HDAC의 직접적인 관계를 설명하지 않았고, 2년 후 Camelo 등은 HDACi TSA 는 마우스의 중추신경계통에 대한 T세포의 침습을 효과적으로 억제할 수 있음을 발견했고, TSA의 HDAC에 대한 억제로 인해, IGF-2 및 글루타메이트 수송체(EAAT2) 등과 같은 신경보호 단백질의 발현량을 증가시킴으로써 치료작용을 발휘할 수 있다고 핵심적으로 제시했고, 그 이후 많은 연구자들은 HDACi의 MS상에서의 응용을 발견했고, 예컨대 Ryu 등은 선택적인 HDACi는 전사인자(Sp1)의 아세틸화를 향상시켜 신경세포의 산화 스트레스하의 생존 능력을 보호한다고 연구 발표했다(Giuseppe Faraco,etc, Molecular Medcine, 2011,17(5-6),442-447). MS의 발생 메커니즘이 불명확하고, 또한 현재 민감한 진단마커의 결핍을 감안했을 때, HDACi는 MS의 치료를 적극적으로 촉진시켰다. 또한, 보도에 의하면(Charles A Dinarello,etc, Molecular Medcine,2011,17(5-6),333-352), HDACi는 Ⅱ형 당뇨병 및 그 관련 합병증, 신경퇴행성 병변(헌팅톤 무도병, 알츠하이머병과도 관련이 있으므로, HDAC는 양호한 연구전망이 있는 타깃이다.

현재 연구된 HDAC 억제제는 주로 3개 부분 구조를 포함하며, 각각 Zn² ⁺킬레이트 부분(ZBG), 소수성 연결부(Linker) 및 표면 인식 구조 도메인이다. 아연이온 킬레이트기가 상이함에 따라 히드록심산류, o-페닐렌디아민류, 전자 결핍 케톤류, 단쇄 지방산류 등으로 나눌 수 있다. 2013년 12월 Thomson Reuters의 데이터에 의하면, 이미 100종 이상의 HDACi가 약물개발의 서로 다른 단계에 있음을 보여줬다. 최초로 출시된 SAHA가 바로 CTCL의 치료를 위한 히드록시펜타논산 HDAC 억제제이다. 사용이 더 심화됨에 따라, 다음과 같은 단점들도 드러났다: 단독 요법 효과는 겨우 평균 정도게 그치며, 일반적으로 일선의 약물이 아니고, 고용량에서의 독성이 뚜렷하고 QT 기간 연장, 골수 억제, 설사 등 부작용을 동반하고, 고형 종양에 대한 치료효과도 이상적이지 않고, 이는 SAHA가 팬 억제제인 것과 관련이 있을 것이고, 아주 강한 아연이온 킬레이트기인 히드록심산기를 포함하는 것과 관련이 있을 것이다. 따라서 더 효과적인 신형의 HDAC 억제제를 개발하는 것은 해당 분야에 있어서 아주 중요한 연구방향이 되었다.

본 출원의 발명자가 속한 연구팀에서는 2012년에 국제특허(WO2012152208)를 출원했고, HDAC 억제제로서 종양 억제 및 다발성 경화증용 약물의 개발에 이용되는 신형의 티아졸계 화합물을 보고했다. 여기서 화합물 CFH367-C는 좋은 효소 억제 활성을 보여줬고, HCT-116 세포 상에서의 GI50도 1μM 미만이고, 또한 EAE 마우스의 임상증상을 효과적으로 완화시킬 수 있었다. 다만 히드록심산기 자체의 단점으로 인해, 활성이 더 높고, 독성이 더 낮은 HDAC 억제제를 개발하기를 희망한다.

HDAC 억제제의 기본 구조에 기초하여, 본 발명자들은 아연이온 킬레이트기(ZBG)를 교체하는 것을 고려하여, 먼저 CFH367-C중의 히드록심산을 일반적인 o-페닐렌디아민류로 교체했다. 다만 얻어진 화합물은 효소 수준에서 IC₅₀이 최초의 60nM으로부터 2-5μm로 낮아졌으나, ZBG를 트리플루오로메틸 케톤 내지 공개되지 않은 히드라존류 화합물로 교체하면, 비록 그 아연 이온의 킬레이트 능력은 약해졌으나, 의외로 이러한 화합물은 효소 억제 활성이 더 높을 뿐만 아니라(IC₅₀=30nM), 세포 수준에서의 억제 활성이 더 강하고(IC50은 100nM 수준에 달할 수 있음), 또한 EAE 마우스에 대한 임상치료효과는 CFH367-C보다 현저히 높아(도 1) 더 좋은 개발 전망을 보여줬다.

본 발명의 목적은 하기 식 I로 표시되는 구조를 가지는 2,2'-비스-티아졸계 화합물을 제공하는 것이다:

식 I

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, C₃-C₆시클로알킬기, C₁-C₆알킬기, C₂-C₆알케닐기, C₂-C₆알키닐기로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R₁ 및 R₂는 이들과 결합되어 있는 탄소원자와 5-7원의 환상 구조를 형성하고;

바람직하게는, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H 또는 C₁-C₆알킬기거나 또는 R₁ 및 R₂는 이들과 결합되어 있는 탄소원자와 5원, 6원 또는 7원의 포화 환상 구조를 형성하고;

X는

또는

이고;

Y는

또는 C₂-C₆알케닐렌기이고, 여기서 n은 1, 2, 3 또는 4이고, 더 바람직하게는, Y는

,

,

또는

이고;

R₃은 H, C₁-C₆알킬기, C₆-C₁₀아릴기로 치환된 C₁-C₆알킬기, C₃-C₆시클로알킬기, C₁-C₆알킬로 치환된 C₃-C₆시클로알킬기, C₂-C₈알케닐기, C₂-C₆알키닐기, C₆-C₁₀아릴기, 5-7원 헤테로아릴기 중의 1종이고, 상기 5-7원 헤테로아릴기는 1-3개의 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로 원자를 포함하고;

바람직하게는, R₃은 C₁-C₄알킬기, C₆-C₁₀아릴기로 치환된 C₁-C₄알킬기 또는 C₃-C₆시클로알킬기이고;

더 바람직하게는, R₃은 C₁-C₄알킬기, 벤질기, 또는 시클로프로필기이다.

R₄은 R_4a, R_4b, R_4c, R_4d 또는 R_4e:

이고,

여기서 R₅, R₆, R₇ 및 R₈은 H, 히드록시기, C₁-C₆알킬기, C₁-C₆알콕시기, 히드록시 C₁-C₆알킬렌기, C₆-C₁₀아릴기로 치환된 C₁-C₆알킬기, C₃-C₆시클로알킬기, C₁-C₆알킬로 치환된 C₃-C₆시클로알킬기, C₂-C₈알케닐기, C₂-C₆알키닐기, C₆-C₁₀아릴기, 5-7원 헤테로아릴기,

중에서 선택된 1종이고, 상기 5-7원 헤테로아릴기는 1-3개의 N, O 및 S로부터 선택되는 헤테로원자를 포함하고;

바람직하게는, R₅는 히드록시기, C₁-C₆알킬기, C₁-C₆알콕시기, C₆-C₁₀아릴기 또는

이고,

더 바람직하게는, R₅는 히드록시기, C₁-C₄알킬기, C₁-C₄알콕시기, 페닐기 또는

이고;

바람직하게는, R₆은 H, 또는 C₁-C₆알킬기이고,

더 바람직하게는, R₆은 H, 또는 메틸기이고;

바람직하게는, R₇은 C₁-C₆알킬기, C₃-C₆시클로알킬기, C₁-C₆알콕시기, 히드록시 C_1-C₆알킬렌기, C₆-C₁₀아릴기 또는 5-7원 헤테로아릴기이고, 상기 5-7원 헤테로아릴기는 1-3개의 N, O 및 S로부터 선택되는 헤테로 원자를 포함하고,

더 바람직하게는, R₇은 C₁-C₄알킬기, C₃-C₅시클로알킬기, C₁-C₄알콕시기, 히드록시 C₁-C₄알킬렌기, C₆-C₁₀아릴기 또는 5-7원 헤테로아릴기이고, 상기 5-7원 헤테로아릴기는 1-2개의 N, O 및 S로부터 선택되는 헤테로 원자(예컨대, 피리딘)를 포함하고,

가장 바람직하게는, R₇은 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, t-부틸기, 시클로프로필기, 메톡시기, 에틸옥시기, 히드록시메틸기, 히드록시에틸기, 페닐기, 피리딜기, 피리다지닐기, 피리미디닐기 또는 피라지닐기이고;

바람직하게는, R₈은 C₆-C₁₀아릴기이고,

더 바람직하게는, R₈은 페닐기이다.

본 발명의 식 I로 표시되는 구조를 가지는 2,2'-비스-티아졸계 화합물은 구체적으로 다음과 같다:

본 발명의 다른 목적은 식 I의 구조를 가지는 2,2'-비스-티아졸계 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.

여기서 화합물(Ⅰa)는 하기 경로 1 내지 경로 3 중 하나를 통해 수득될 수 있고, (화합물(1) 및 화합물(2)는 특허공개공보 WO2012152208호 또는 WO2011116663호에 개시된 방법을 통해 얻을 수 있다):

경로 1：

여기서, R₁, R₂, R₃ 및 n의 정의는 식 I 중의 정의와 동일하고,

구체적으로, 화합물(1)은 염화 아실 시약(예컨대 염화옥살릴, 염화티오닐 등)을 이용하여 염화 아실로 전환한 후, 염화 아실은 알칼리(예컨대 피리딘)의 존재하에 실온 또는 가열 조건에서 트리플루오로 아세트산 무수물(TFAA)과 치환반응을 일으키고 가수 분해를 통해 화합물(Ia)를 얻는다.

경로 2：

여기서, R₁, R₂, R₃및 n의 정의는 상기 식 I 중의 정의와 동일하고,

구체적으로, 화합물(2)은 염화 아실 시약(예컨대 염화옥살릴, 염화티오닐 등)을 이용하여 염화 아실을 형성한 다음, 얼음욕 조건에서 진한 암모니아수와 반응시켜 화합물(3)을 얻고,

화합물(4)은 테트라부틸암모늄 플로오라이드(TBAF)의 촉매 작용하에, 테트라히드로푸란 중에서 트리플루오로메틸 트리메틸 실란(TMS-CF₃)과 첨가반응을 일으켜 화합물(5)을 얻고; 화합물(5)는 산(H⁺) 가수분해를 거쳐 화합물(6)을 얻고; 화합물(6)은 K₂CO₃의 존재하에DMF 중에서 2-클로로에탄올과 반응시켜 화합물(7)을 얻고; 화합물(7)은 TsCl 및 Et₃N의 존재하에 DCM 중에서 술포닐화시켜 화합물(8)을 얻고; 화합물(8)과 화합물(3)은 수소화나트륨의 작용하에 DMF 중에서 반응시켜 화합물(9)을 얻고; 화합물(9)은 루이스산(예컨대 BBr₃)의 작용하에 에틸렌글리콜의 탈보호 반응을 거쳐 화합물(Ia)을 얻는다.

경로 3：

구체적으로, 화합물(8)은 DMF 중에서 아지드화나트륨(NaN₃)과 반응시켜 화합물(10)을 얻고; 화합물(10)은 수소화 환원을 거쳐 아민(11)을 얻고; 아민(11)은 축합제(예컨대 EDCI) 존재하에 DCM 중에서 산(2)과 축합반응을 하여 화합물(9)를 얻고; 화합물(9)는 루이스산(예컨대 BBr₃)의 작용하에 에틸렌글리콜의 탈보호 반응을 거쳐 화합물(Ia)을 얻고,

화합물(Ib)은 경로 4의 방법으로 얻을 수 있다:

경로 4：

여기서, R₁, R₂, R₃및 n의 정의는 상기 식 I 중의 정의와 동일하다.

구체적으로, 화합물(2)은 쿠르티우스(Curtius) 재배열 반응을 통해 Boc 보호 아민(12)을 얻고; 아민(12)은 Boc 기를 제거하여 자유 아민(13)을 얻고; 동시에 화합물(7)은 TEMPO와 요오도벤젠 디아세테이트(BAIB)의 산화를 통해 산(14)을 얻고; 산(14)은 축합제 EDCI의 작용을 통해 아민(13)과 반응시켜 화합물(15)을 얻고; 화합물(15)은 루이스산(예컨대 BBr₃)의 작용하에 에틸렌글리콜의 탈보호 반응을 거쳐 본 발명의 상기 티아졸계 화합물(Ⅰb)을 얻는다.

화합물(Ic)은 경로 5의 방법을 이용하여 얻을 수 있다:

경로 5：

여기서, R₁, R₂, R₃,R₅, R₆, R₇, X 및 Y의 정의는 상기 식 I 중의 정의와 동일하다.

R₉은 R_4b, R_4c 및 R_4d 으로부터 선택된 1종이다.

구체적으로，화합물(Ⅰab)은 실온 또는 가열 조건(예컨대 65℃)에서 용매(예컨대 에탄올, 피리딘 등) 중에서 상응한 아민 또는 하이드라진과 탈수 축합 반응을 일으켜 본 발명의 상기 디티아졸계 화합물(Ⅰc)을 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 히스톤 데아세틸라제 억제제 약물 제조에 있어서의 식 I의 구조를 가지는 디티아졸계 화합물의 용도를 제공하고; 항종양제, 자가 면역질환의 치료제, II형 당뇨병 및 그 합병증 치료제 또는 신경퇴행성 병변의 치료제의 제조에 있어서의 식 I의 구조를 가지는 디티아졸계 화합물의 용도를 제공하는 것이고, 상기 종양은 다발성 골수종, 피부 T세포 림프종, 말초 T세포 림프종 등이고, 상기 자가 면역질환은 다발성 경화증이고, 상기 신경퇴행성 병변은 헌팅턴병 또는 알츠하이머병 등이다.

본 발명의 또 다른 목적은 치료적 유효량의 식 I의 구조를 가지는 디티아졸계 화합물로부터 선택되는 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 HDAC 억제제(HD1)의 EAE 마우스 효능 실험에서의 임상 점수이다.

이하, 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명에 대해 추가로 설명하지만 본 발명은 이러한 실시예에 한정되지 않는다.

제조 실시예

아래의 제조 실시예 중, NMR은 Varian이 생산한 Mercury-Vx 300M 기구로 측정한다. NMR캘리브레이션(calibration): δ H 7.26 ppm(CDCl₃), 2.50 ppm(DMSO-d ₆ ), 3.31 ppm(CD₃OD); 모든 용매는 분석용 시약이고, 일반적으로 모두 처리를 거치지 않고 직접 사용된다. 무수 용매는 표준 방법으로 건조 처리한다. 기타 시약은 일반적으로 모두 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Accela ChemBio Co., Ltd., GL Biochem (Shanghai) Ltd., Shenzhen Meryer Chemical Technology Company, Aldrich, Alfa-Aesar, Acros, Fluka, Merck, TCI 또는 Lancaster 등 시약 회사로부터 구매했고, 소수의 시약은 제조업체로부터 구매했고, 별도의 설명이 없는 한, 이러한 시약은 모두 처리를 거치지 않고 직접 사용된다. 자체 제조한 시약은 사용 전에 통상적으로 NMR를 통해 구조 및 대체적인 순도를 확정한다. TLC 박층 크로마토그래피용 실리카겔 플레이트는 Huiyou Silicone Development Co., Ltd., Yantai, Shandong에서 생산된 것이고, 모델은 HSGF 254이고; 화합물 정제에 사용된 순상 크로마토그래피용 실리카겔은 Qingdao Haiyang Chemical Co., Ltd.의 자회사에서 생산된 것이고, 모델은 zcx-11, 200-300 메쉬이다.

제조 실시예 1 (화합물 번호 HD 1-경로 1)

화합물(16)의 제조방법은 특허공개공보 WO2012152208호에서 공개되었고, 합성 단계에 대한 설명은 생략한다. 화합물(16)(87mg, 0.25mmol)을 무수 DCM(5mL)에 용해시키고, 얼음욕에서 냉각시킨다. N₂보호하에, 염화티오닐((177mg, 1.49mmol)을 적가한다. 적가 완료 후 70-80 ℃ 에서 2시간 동안 환류시키고, 방치하여 냉각시킨다. 용매를 스핀 건조시키고, 오일펌프(lubropump) 상에서 염화티오닐을 펌핑 제거하면 염화 아실 조제품을 얻는다. 조제품을 5mL의 무수 DCM에 직접 용해시키고, 얼음욕에서 트리플루오로 아세트산 무수물(313mg，1.49mmol)을 천천히 적가한다. 적가 완료 후 5분간 온도를 유지한 다음, 무수 피리딘(157mg, 1.98mmol)을 적가하고, 실온에서 교반하여 2h 동안 반응시킨다. TLC에 의해 원료가 사라진 것으로 검출되면, 0℃에서 5mL H₂O을 추가하고 서서히 온도를 상승시켜 일정 시간 동안 교반한다. 반응액은 DCM을 이용하여 2회 추출하고, 유기 상을 결합하고, 각각 1N HCl 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 칼럼 크로마토그래피(PE:Acetone=3:1)의 농축을 통해 생성물 HD1(8mg, 8%, 백색고체)을 얻는다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.85 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.44 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 3.49 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.46 - 3.40 (m, 1H), 2.82 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.81 - 1.73 (m, 2H), 1.72 - 1.62 (m, 2H), 1.37 - 1.28 (m, 2H), 0.81 - 0.77 (m, 2H). ESIMS(m/z): 426.1[M+Na⁺]

제조 실시예 2(화합물 번호 HD 1-경로 2)

화합물(17)의 제조방법은 특허공개공보 WO2012152208호에서 공개되었고, 합성단계에 대한 설명은 생략한다. 화합물(17)(252mg, 1mmol)을 4mL의 무수 THF에 용해시키고, 20μL의 DMF을 추가한다. 0℃에서 염화옥살릴 0.25mL을 적가하고, 적가 완료 후 실온에서 3h 동안 반응시킨다. 이후 다시 0℃까지 냉각시키고, 1.5mL의 진한 암모니아수와 4.5mL의 물의 혼합액을 추가하고, 실온에서 30분간 교반하고, 여과하여 화합물(18)(118mg, 47%, 백색고체)을 얻는다. ¹H NMR((300 MHz, CDCl₃) δ 7.85 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.24 - 7.19 (s, 1H), 5.54 (s, 1H), 3.49 - 3.33 (m, 1H), 1.37 - 1.32 (m, 2H), 0.85 - 0.79 (m, 2H)，ESIMS(m/z): 274.0[M+Na⁺]

화합물(19)(25g, 0.25mol) 및 트리플루오로메틸 트리메틸 실란(39g，0.27mol)을 150mL의 무수 THF에 용해시킨다. 0℃, N₂보호하에, 2.7mL의 TBAF(1M in THF)를 조심스럽게 적가한 후, 자연 승온시키고, 실온에서 하루 밤 반응시킨다. 용매를 스핀 제거하고, 잔여물은 오일펌프 상에서 감압 증류시키고, 72-74℃의 증류분(fraction)을 수집하여，화합물(20)을 얻는다(46.3g，77%，무색액체). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3.79 (dd, J = 6.4, 2.6 Hz, 2H), 1.72 - 1.57(m, 6H), 0.21 (s, 9H)

화합물(20)을 1N HCl 용액에 직접 용해시키고, 실온에서 밤새 교반시키고, 디에틸 에테르는 추출하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 용매를 조심스럽게 스핀 건조시켜 화합물(21)을 얻고, 정제할 필요가 없다. 조 화합물(21)(37g，0.11mol) 및 2-클로로 에탄올(26.5g, 0.33mol)을 250mL의 DMF에 용해시킨다. 실온에서 2시간 동안 교반 반응시킨 다음, K₂CO₃(45.6g, 0.33mol)을 추가하여 실온에서 밤새 반응시킨다. 대량의 H₂O를 추가하여 반응액을 희석하고, EA로 3회 추출하고, 유기상을 결합하고, 물과 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 용매를 스핀 건조시켜 화합물(22)(28.8g, 2 단계에서 70%, 무색액체)을 얻고, 정제할 필요가 없다. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ 4.15 - 4.11(m, 2H), 4.11 - 4.07 (m, 2H), 3.64 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.03 (s, 1H), 1.88 - 1.80 (m, 2H), 1.62 - 1.43 (m, 4H), ESIMS(m/z): 237.1[M+Na⁺]

화합물(22)(28g, 0.13mol)을 250mL의 DCM에 용해시키고, 4-메틸벤젠술포닐클로라이드(37g, 0.19mol) 및 피리딘(20.6g，0.26mol)을 추가하고, 실온에서 밤새 반응시킨다. 용매를 스핀 제거하고, EA에서 용해시키고, 각각 H₂O, 1N HCl, H₂O, 포화 NaHCO₃수용액, 포화 식염수로 유기상을 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 칼럼 크로마토그래피(PE:EA=10:1-4:1)의 농축을 통하여 화합물(23)을 얻는다(20.5g, 43%, 무색오일). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.15 - 4.13 (m, 2H), 4.08 - 4.05 (m, 2H), 4.02 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H), 1.79 - 1.62 (m, 4H), 1.48 - 1.45 (m, 2H), ESIMS(m/z): 391.1[M+Na⁺]

화합물(23)(587mg，1.59mmol) 및 화합물(18)(600mg, 2.39mmol)을 20mL의 무수 DMF에서 용해시키고, N₂분위기하에 NaH(100mg，2.5mmol)를 추가하고, 이후 실온에서 3시간 동안 반응시킨다. TLC에 의해 화합물(23)이 거의 사라진 것을 검출하면, 반응액에 10mL의 1N HCl을 추가하고, EA로 3회 추출하고, 유기상을 결합한다. 각각 H₂O 및 포화 식염수로 유기상을 3회 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 칼럼 크로마토그래피(PE:Acetone=6:1)의 농축을 통해 화합물(24)을 얻는다(266mg，37.5%，무색 오일 상태의 물질). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.84 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.43 (d, J = 3.0Hz, 1H), 4.15 - 4.11 (m, 2H), 4.13 - 4.07 (m, 2H), 3.46 (t，J= 6.3Hz，2H), 3.42 - 3.39 (m, 1H), 1.93 - 1.85 (m, 2H), 1.72 - 1.67 (m, 2H), 1.56 - 1.50 (m, 2H), 1.34 - 1.27 (m, 2H), 0.83 - 0.79 (m, 2H), ESIMS(m/z): 470.1[M+Na⁺]

화합물(24)(656mg.1.46mmol)을 10mL의 무수 DCM에 용해시킨다. 0℃, N₂ 분위기하에, 5mL의 BBr₃(2N in DCM)용액을 천천히 적가한 후, 자연 승온시켜 반응시킨다. 1시간 후, TLC에 의해 원료가 사라진 것이 검출된다. 얼음욕에서 반응액을 냉각시키고, 5mL의 H₂O를 조심스럽게 적가하여 급랭(quenching)시킨 후 DCM으로 추출하고, 포화 식염수로 유기상을 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 스핀 건조시켜 조제품을 얻는다. 조제품을 5mL의 아세톤에 용해시키고, 5mL의 1N HCl을 추가하고, 50℃에서 밤새 반응시킨다. 냉각 후, 용매를 스핀 제거하고, 1N NaOH는 약 pH2로 조절하고, 고체가 석출되면, 여과하고 소량의 1N NaOH로 고체를 세척하여 생성물 HD 1(260mg, 44%, 백색고체)을 얻는다. ¹H NMR는 상기와 동일하다.

제조 실시예 3(화합물 번호 HD 1-경로 3)

화합물(23)(20g，0.054mol)을 200mL의 DMF에 용해시키고, 아지드화나트륨(7g，0.108mol) 및 K₂CO₃(22.4g, 0.162mol)을 추가하여, 실온에서 반응시킨다. 2시간 후 TLC에 의해 원료가 사라진 것을 검출하면, 반응액에 100mL의 H₂O를 추가한 다음, 아세트산에틸(100mL*3)로 추출하고, 유기상은 각각 H₂O(150mL*3) 및 포화 식염수(150mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 용매를 스핀 건조시켜 화합물(25)(11.9g，92%, 무색 액체)을 얻고, 정제할 필요가 없다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.20 - 4.14 (m, 2H), 4.13 - 4.09 (m, 2H), 3.29 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.86 (t, J=7.5Hz, 2H), 1.66 - 1.58 (m, 2H), 1.56 - 1.48 (m, 2H)

화합물(25)(8.39g，0.035mol)을 150mL의 아세트산에틸에 용해시키고, N₂를 치환한 후, 10%의 팔라듐 탄소 수소화 촉매 839mg을 추가하고, 다시 N₂를 치환하고, 마지막으로 H₂을 3회 치환하고, 실온에서 반응시킨다. 5시간 후 TLC에 의해 원료가 사라진 것이 검출되면, N₂를 다시 치환하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 아세트산에틸로 필터 케이크를 세척하고, 여과액을 스핀 건조시켜 화합물(26)(7.38g, 98%, 담황색 액체)을 얻는다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.16 - 4.11 (m, 2H), 4.09 - 4.07 (m, 2H), 2.70 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.83 (t, J=7.8Hz, 2H), 1.47 (s, 4H), ESIMS (m/z): 214.1[M+H⁺]

화합물(17)(6.82g，0.027mol) 및 화합물(26)(7.38g，0.035mol)을 150mL의 DCM에 용해시키고, DMAP(4.9g, 0.04mol)을 추가한다. 10분간 교반한 후, 얼음욕에서 EDCI(7.76g，0.04mol)을 추가하고, 실온에서 밤새 반응시킨다. 각각 1N HCl 및 포화 식염수로 유기상을 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 칼럼 크로마토그래피(PE:Acetone=6:1)의 농축을 통해 화합물(24)(6.37g，53%，무색 오일 상태의 물질)을 얻고, ¹H NMR데이터는 상기와 동일하다. 경로 2의 방법으로 화합물(24)의 보호기를 제거하면 동일하게 화합물 HD 1을 얻을 수 있다.¹H NMR는 상기와 동일하다.

상기와 같은 세 경로 중 하나를 사용하여 모두 하기와 같은 화합물을 얻을 수 있다:

제조 실시예 4(화합물 번호 HD 60)

화합물(17)(1g, 3.96mmol)을 20mL의 t-부탄올(tert-butanol)에 넣고, N₂분위기하에 30℃에서 트리에틸아민(600mg, 5.9mmol) 및 디페닐포스포릴아자이드(DPPA, 1.4g, 5.15mmol)를 적가한 후, 차광 회류시키면서 밤새 반응시킨다. 반응액을 실온까지 냉각시키고, 대량의 H₂O를 추가하고, 아세트산에틸을 추출하고, 유기상을 결합한다. 각각 H₂O, 포화 NaHCO₃ 용액, 5%의 구연산 용액 및 포화 식염수로 유기상을 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 칼럼 크로마토그래피(PE:EA=10:1)의 농축을 통해 화합물(27)(245mg，20%, 담황색 고체)을 얻는다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 2.12 - 2.04 (m, 1H), 1.51 (s, 9H), 1.14 - 1.06 (m, 2H), 0.77 - 0.71 (m, 2H)이다. ESIMS(m/z): 346.1[M+Na⁺]

화합물(27)(90mg，0.278mmol)을 5mL의 DCM에 용해시키고, 0℃에서 5mL의 2N HCl/EA용액을 적가한 후, 실온까지 자연 승온시켜 반응시킨다. 4시간 후, TLC에 의해 반응이 완료된 것으로 검출되면, 포화 NaHCO₃용액을 넣어 pH를 알칼리성으로 조절하고, DCM 추출하고, 포화 식염수로 유기상을 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 농축하여 화합물(28)(40mg，65%，노란색 오일 상태의 물질)을 얻는다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.79 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.13 (s, 2H), 1.74 - 1.67 (m, 2H), 1.02 - 0.97 (m, 2H), 0.70 - 0.65 (m, 2H). ESIMS(m/z): 246.0[M+Na⁺].

화합물(29)(무색 액체)은 ε-카프로락톤에 의해 경로 2의 상기 방법을 통해 얻는다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.19 - 4.13 (m, 2H), 4.11 - 4.05 (m, 2H), 3.65 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.84 (t, J=6.0Hz，2H), 1.63 - 1.54 (m, 2H), 1.45 - 1.36 (m, 4H).

화합물(29)(113mg，0.495mmol)을 총 2mL 의 CH₃CN:H₂O=1:1g 용매에 용해시키고, 요오도벤젠 디아세테이트(BAIB，479mg，1.49mmol) 및 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실 라디칼(TEMPO, 23mg, 0.149mmol)을 추가하고, 실온에서 밤새 반응시킨다. TLC에 의해 반응물이 사라진 것이 검출되면, 반응액에 1mL의 포화 Na₂S₂O₃용액을 추가하고, 아세트산에틸을 추출하고, 포화 식염수로 유기상을 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 칼럼 크로마토그래피(PE: 아세톤=4:1)의 농축을 통해 화합물(30)(100mg, 83%, 백색에 가까운 고체)을 얻는다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.16 - 4.11 (m, 2H), 4.09 - 4.07 (m, 2H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.84 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.69 - 1.61 (m, 2H), 1.50 - 1.43 (m, 2H). ESIMS (m/z): 241.0[M-H⁺].

화합물(28)(41mg, 0.186mmol) 및 화합물(30)(45mg, 0.186mmol)을 DCM에 용해시키고, DMAP(68mg, 0.557mmol)을 추가하고, N₂분위기하에 0℃에서 EDCI(53mg，0.276mmol)을 추가한 후, 실온에서 밤새 반응시킨다. 반응액에 H₂O을 추가하고, 아세트산에틸을 추출하고, 포화 식염수로 유기상을 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 칼럼 크로마토그래피(PE: 아세톤=10:1-4::1)의 농축을 통해 화합물(31)(35mg, 42%, 담황색 고체)을 얻는다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.83 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.39 (d, J = 3.0Hz, 1H), 4.15 - 4.11 (m, 2H), 4.11 - 4.08 (m, 2H), 2.44 (t，J= 6.9Hz，2H), 1.87 - 1.76 (m, 4H), 1.53 - 1.43(m, 2H), 1.16 - 1.08(m, 2H), 0.85 - 0.71(m, 2H), ESIMS(m/z): 470.1[M+Na⁺].

화합물(31)은 경로(2)와 유사한 방법으로 보호기를 제거하여 화합물 HD 60(백색고체)을 얻을 수 있다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.84 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.41 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 2.79 (s, 2H), 2.48 (s, 2H), 2.04 - 2.03 (m, 1H), 1.80 - 1.68 (m, 4H), 1.11 - 1.02 (m, 2H), 0.79 - 0.73 (m, 2H).ESIMS(m/z): 404.1[M+H⁺].

제조 실시예 5(화합물 번호 HD 46)

화합물 GCJ403(403mg，1mmol)을 10mL의 에탄올에 용해시키고, 히드록시아세틸 하이드라진(180mg, 2mmol) 및 0.5mL의 빙초산을 넣고, 65℃에서 밤새 반응시킨다. 가열을 정지시키고, 냉각시킨 후 에탄올을 스핀 제거하고, 잔여물은 아세트산에틸로 용해시키고, 각각 H₂O 및 포화 식염수로 유기상을 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 칼럼 크로마토그래피(PE:아세톤=4:1-1:1)의 농축을 통하여 화합물(HD 46)(275mg, 62%, 백색 고체)을 얻는다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 10.68 (s, 1H), 7.85 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.44 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 3.78 - 3.72 (m, 1H), 3.57 (dd, J = 11.4, 6.6 Hz, 2H), 3.12 (s, 1H), 2.68 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 1.77 - 1.73 (m, 2H), 1.73 - 1.70 (m, 2H), 1.42 - 1.37 (m, 2H), 0.87 - 0.76 (m, 2H).ESIMS(m/z): 498.0[M+Na⁺].

동일한 방법으로 다음과 같은 화합물을 합성한다:

생물 실험 실시예

실험예 1: 히스톤 데아세틸라제 1, 3, 4, 6(HDAC1, 3, 4, 6)의 활성 억제 실험

1. 실험목적:

인간의 히스톤 데아세틸라제 1, 3, 4, 6에 대한 본 발명의 화합물의 활성 억제 실험을 진행한다.

2. 실험재료:

인간의 HDAC1, HDAC3, HDAC4 및 HDAC6은, 모두 배큘로 바이러스 발현계를 이용하여, 상하이 약물 연구소 리지아 박사 연구팀에 의해 정제하여 얻었다.

기초 물질: HDAC1, 3, 4：Ac-Lys-Tyr-Lys(Ac)-AMC；

HDAC6：Boc-lys(Ac)-AMC

모두 상하이 지얼 생물화학 유한공사(GL Biochem (Shanghai) Ltd.)로부터 구매했다.

3. 실험 원리:

형광 검출법을 사용하고, 96웰 또는 384웰 평면 바닥 마이크로웰 플레이트에서 효소 활성을 검출한다. 기초 물질은 HDAC을 거쳐 탈아세틸화된 후, 트립신에 의해 가수분해하여 얻은 생성물 AMC는 형광 검출기의 355nm에 의해 여기되는 460nm의 발사광에서 형광신호가 검출될 수 있다. 시간에 따른 형광신호의 변화를 검출하여, 반응 초기 속도를 계산하여 얻는다.

4. 실험과정:

샘플처리: 샘플은 DMSO로 용해시키고, 저온에서 보존하고, DMSO의 최종계에서의 농도는 활성 검출에 영향을 주지 않은 범위로 조절한다.

데이터 처리 및 결과 설명: 처음 선택한 단일 농도 조건(예컨대 20 μg/ml)에서, 샘플의 활성을 테스트 한다. 일정한 조건에서 활성을 나타내는 샘플(예컨대 억제율%이 50이상인 것)에 대해, 활성 사용량의 의존관계를 테스트하고, 즉 IC₅₀/EC₅₀값을 테스트하고, 샘플 활성을 통해 샘플 농도에 대해 비선형 피팅하여 얻고, 계산에 사용된 소프트웨어는 Graphpad Prism 4이고, 피팅에 사용된 모델은 sigmoidal dose-response(varible slope)이고, 대다수 억제제 선별 모델에 대해, 피팅 곡선 저부 및 상단부는 0 및 100으로 설정한다. 일반적으로, 각각의 샘플은 테스트 시 모두 중복 웰(n≥2)을 설치하고, 결과는 표준 편차(Standard Deviation, SD) 또는 표준 오차(Standard Error, SE)로 표시한다. 각 테스트는 모두 이미 출시된 화합물 SAHA(Vorinostat)을 대조군으로 했다.

5. 일부 화합물의 실험 결과:

ID	IC50 : μM
ID	HDAC1	HDAC3	HDAC4	HDAC6
SAHA	0.13±0.01	0.18±0.04	0.20±0.02	0.11±0.01
CFH367-C	0.07±0.01	0.26±0.05	0.10±0.01	0.79±0.14
HD 1	0.02±0.00	0.02±0.00	0.02±0.00	0.50±0.01
HD 3	0.02±0.00	0.02±0.00	0.02±0.00	0.91±0.01
HD 6	0.06±0.01	0.04±0.00	0.04±0.00	0.55±0.09
HD 53	0.05±0.00	0.05±0.00	0.04±0.00	0.04±0.00
HD 55	0.03±0.00	0.03±0.00	0.07±0.00	0.02±0.00
HD 54	0.07±0.01	0.06±0.00	0.07±0.00	0.06±0.00
HD 37	0.18±0.03	0.35±0.00	0.16±0.01	0.08±0.01
HD 46	0.50±0.05	0.40±0.01	0.45±0.03	0.35±0.01

상기 표의 실험결과로부터 알 수 있듯이, R₄부위가 기존의 CFH467-C의 히드록심산에서 트리플루오로아세틸 케톤류로 바뀐 뒤, HDAC 각 아형의 활성은 모두 수배로 향상됐고, HD 1의 HDAC1, 3, 4에 대한 억제활성은 모두 매우 높았고, IC₅₀는 약 20nM에 도달할 수 있고, 트리플루오로아세틸 케톤을 히드라존 화합물(HD37, HD 46)로 추가로 변형하면, HDAC6의 활성을 향상시킬 수 있다. 또한 티아졸 링(thiazole ring)에서 알킬기 치환이든 아릴기 치환이든 모두 양호한 HDAC 억제 활성을 나타냈다.

실험예 2: 세포 수준 항종양 활성 실험

1. 실험목적：

본 발명의 화합물의 항종양 활성 테스트를 진행하고, 인간의 다발성 골수종 세포주8266에 대한 화합물의 성장 억제 활성을 측정하여 화합물의 시험관내 항종양 활성을 평가한다.

2. 실험재료:

인간의 다발성 골수종 세포주 8266: 상하이 창정병원 허우젠박사 제공.

3. 실험 원리：

테트라졸리움염(MTT) 분석법을 사용하며, 상기 분석방법은 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT)의 대사 환원을 기초로 한다. 살아있는 세포의 미도콘드리아 중에는 NADP와 관련된 탈수소 효소가 존재하여, 황색의 MTT를 불용성 청자색의 포르마잔(Formazan)으로 환원시킬 수 있고, 죽은 세포는 이러한 효소가 사라져, MTT는 환원되지 않는다. DMSO로 Formazan을 용해한 후 마이크로 플레이트 리더로 550/690nm 파장에서 광밀도를 측정한다.

4. 실험과정:

샘플처리: 샘플은 DMSO로 용해하고, 저온에서 보존하고, DMSO의 최종계에서의 농도는 활성 검출에 영향을 주지 않은 범위로 조절한다.

MTT법을 응용하여 세포 생존율을 검출한다. 즉 대수 증식기에 성장한 세포를 0.05％의 트립신에 의해 소화시키고, 계수하고, 2.0×10³/웰의 세포밀도로 96웰 플레이트에 100μL 이식하고, 5% CO₂배양기 내에 넣고 37℃에서 밤새 배양한다. 각각의 화합물은 6개의 농도 구배를 설치하고, 각각의 농도는 3개 중복 웰을 설치하고, 각각의 농도를 대응하는 웰에 각각 넣고, 5% CO₂ 37℃ 배양기 내에서 72시간 동안 배양하고, 20μL의 5 mg/mL MTT을 추가한다. 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상청액을 버리고, 100μL의 DMSO을 넣어 용해시키고, SpectraMAX 340을 사용하여 550 nm(L1) 흡광 값을 측정하고, 파장 690 nm(L2)을 참고하여, (L1- L2)값을 억제제의 상이한 농도에 대해 플로팅하고, 공식을 통해 피팅하여 IC₅₀을 얻었다.

데이터 처리 및 결과 설명: 처음 선택한 단일 농도 조건(예컨대 20 μg/ml)에서, 샘플의 활성을 테스트 한다. 일정한 조건에서 활성을 나타내는 샘플(예컨대 억제율%이 50 이상인 것)에 대해, 활성 사용량의 의존관계를 테스트하고, 즉 IC₅₀/EC₅₀값을 테스트하고, 샘플 활성을 샘플 농도에 대해 비선형 피팅하여 얻고, 계산에 사용된 소프트웨어는 Graphpad Prism 4이고, 피팅에 사용된 모델은 sigmoidal dose-response (varible slope)이고, 대다수 억제제 선별 모델에 대해, 피팅 곡선 저부 및 상단부는 0 및 100으로 설정한다. 일반적으로, 각각의 샘플은 테스트 시 모두 중복 웰(n≥2)을 설치하고, 결과는 표준 편차(Standard Deviation, SD) 또는 표준 오차(Standard Error, SE)로 표시한다. 각 테스트는 모두 이미 출시된 화합물 SAHA(Vorinostat)을 대조군으로 하여 실험하였다.

4. 일부 화합물의 실험 결과:

인간의 다발성 골수종 세포주 8266상의 활성결과:

ID	IC₅₀(mM)	ID	IC₅₀(mM)
SAHA	2.466±0.024	CFH367-C	1.139±0.149
HD 1	0.333±0.011	HD 46	0.117±0.026
HD 3	0.240±0.021	HD 6	0.457±0.012
HD 37	2.140±0.022

상기 표를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 상기 화합물도 양호한 종양세포 증식 억제 활성을 나타냈고, 기존에 공개된 화합물 CFH367-C(IC₅₀=1.139μM)에 비해, 세포 수준 상의 활성은 10배에 가깝게 향상되었고(HD 46：IC₅₀=0.117μM)，화합물의 세포 상에서의 활성은 기본적으로 효소상의 활성과 매칭된다.

실험예 3: EAE 마우스 모델에서 화합물의 효능 실험

1. 실험목적：

EAE 마우스 모델에서의 효능 테스트를 통해, 히스톤 데아세틸라제 억제제로서의 화합물의 EAE 치료 활성을 실험한다.

항원 MOG35~55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)을 완전 프로인트 보강제(불활성 결핵균 5mg/ml을 포함)에 넣어 유화시킨다. 8주령 암컷 C57BL/6마우스에 200μg의 유화된 MOG35~55항원을 주사하고, 동시에 각각의 마우스에 200ng의 백일해 독소를 주사하고, 유도 당일은 제0일이다. 제2일에 각각의 마우스에 200ng의 백일해 독소를 추가로 주사한다. 매일 마우스의 증상에 대해 평점하고 기록하고, 평점 규칙은 다음과 같다:

0점：정상, 증상이 없음

0.5점：꼬리 끝은 힘이 없고 직립 불가

1점：전체 꼬리가 완전히 힘이 없음,

2점：뒷다리가 힘이 없음. 마우스의 한 뒷다리를 케이지에 거꾸로 매달고, 만약 이 뒷 다리가 힘이 없을 경우 마우스는 케이지에 매달리지 못하여, 케이지 내로 다시 기어들어갈 수 없어, 케이지로부터 추락하고, 한쪽 뒷다리가 힘이 없을 경우 1.5점, 두 개 뒷다리가 힘이 없을 경우 2점

3점：마우스 뒷다리 마비, 행동능력 상실

4점：마우스 앞다리가 힘이 없음 또는 마비

5점：마우스 죽음 또는 죽어감

2. 실험재료：

EAE 마우스：Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.；

항원 MOG35~55：GL Biochem (Shanghai) Ltd.;

3. 실험방법：

HD 1는 순수 화합물의 형태이고, CFH367-C를 대조군으로 하고, 약물은 CMC-Na을 직접 넣어 초음파 연마를 통해 균일한 상태로 만들고, 사용량은 모두 10mg/kg이고, 하루에 2회 위내 투여한다. 대조군은 직접 PBS를 투여했다.

4. 실험결과：

HDACi HD 1는 EAE 모델 마우스의 발병을 효과적으로 완화시킬 수 있다. 발병율 및 발병곡선(도 1)을 통해 나타난 바와 같이, HDAC 억제제 HD 1은 EAE 모델 마우스의 임상증상에 양호한 치료작용이 있고, 효과도 CFH367-C보다 좋고, 치료군 마우스의 질병의 심각 정도는 용매 대조군(P<0.01)보다 현저하게 낮다.

발병률：

	발병 개수/총 수
공백대조	6/6
HD 1	3/6
CFH367-C	5/6

Claims

하기 식 I의 구조를 가지는 2,2'-비스-티아졸계 화합물:

식 I
상기 식에서,
R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로 H 및 C₁-C₆알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이거나, 또는 R₁ 및 R₂는 이들과 결합되어 있는 탄소원자와 5-7원의 환상 구조를 형성하고;
X은
또는
이고；
Y는
또는 C₂-C₆알케닐렌기이고, 여기서 n은 1, 2, 3 또는 4이고;
R₃은 C₁-C₆알킬기, C₆-C₁₀아릴기로 치환된 C₁-C₆알킬기 및 C₃-C₆시클로알킬기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이고;
R₄은 R_4a, R_4b, R_4c, R_4d또는 R_4e이고;

상기 식에서, R₅, R₆, R₇ 및 R₈은 H, 히드록시기, C₁-C₆알킬기, C₁-C₆알콕시기, 히드록시(C₁-C₆)알킬렌기, C₃-C₆시클로알킬기, C₆-C₁₀아릴기, 5-7원 헤테로아릴기 및
로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이고, 상기 5-7원 헤테로아릴기는 N, O 및 S로부터 선택되는 1-3개의 헤테로 원자를 포함함.
제1항에 있어서,
R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로 H 또는 C₁-C₆알킬기거나, 또는 R₁ 및 R₂는 이들과 결합되어 있는 탄소원자와 5원, 6원 또는 7원의 포화 환상 구조를 형성하고;
Y는
또는
이고;
R₃은 C₁-C₄알킬기, C₆-C₁₀아릴기로 치환된 C₁-C₄알킬기 또는 C₃-C₆시클로알킬기이고;
R₅은 히드록시기, C₁-C₆알킬기, C₁-C₆알콕시기, C₆-C₁₀아릴기 또는
이고;
R₆은 H 또는 C₁-C₆알킬기이고;
R₇은 C₁-C₆알킬기, C₃-C₆시클로알킬기, C₁-C₆알콕시기, 히드록시(C_1-C₆)알킬렌기, C₆-C₁₀아릴기 또는 5-7원 헤테로아릴기이고, 상기 5-7원 헤테로아릴기는 N, O 및 S로부터 선택되는 1-3개의 헤테로 원자를 포함하고;
R₈은 C₆-C₁₀아릴기인, 2,2'-비스-티아졸계 화합물.
제2항에 있어서,
R₃은 C₁-C₄알킬기, 벤질기, 또는 시클로프로필기이고;
R₅은 히드록시기, C₁-C₄알킬기, C₁-C₄알콕시기, 페닐기 또는
이고;
R₆은 H 또는 메틸기이고;
R₇은 C₁-C₄알킬기, C₃-C₅시클로알킬기, C₁-C₄알콕시기, 히드록시C₁-C₄알킬렌기, C₆-C₁₀아릴기 또는 5-7원 헤테로아릴기이고, 상기 5-7원 헤테로아릴기는 N, O 및 S로부터 선택되는 1-2개의 헤테로 원자를 포함하고;
R₈은 페닐기인, 2,2'-비스-티아졸계 화합물.
제2항에 있어서,
R₇은 C₁-C₄알킬기, C₃-C₅시클로알킬기, C₁-C₄알콕시기, 히드록시C₁-C₄알킬렌기, C₆-C₁₀알릴기 또는 피리딘기인, 2,2'-비스-티아졸계 화합물.
제3항에 있어서,
R₇은 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, t-부틸기, 시클로프로필기, 메톡시기, 에틸옥시기, 히드록시메틸기, 히드록시에틸기, 페닐기, 피리디닐기, 피리다지닐기, 피리미디닐기 또는 피라지닐기인, 2,2'-비스-티아졸계 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 화합물로부터 선택되는 2,2'-비스-티아졸계 화합물:
제1항의 2,2'-비스-티아졸계 화합물의 제조방법으로서,
화합물(Ⅰa)는 하기와 같은 경로 1 내지 경로 3 중의 어느 하나를 통해 제조되고:
경로 1：

여기서, R₁, R₂, R₃ 및 n의 정의는 제1항의 식 I에서 정의된 바와 같고,
화합물(1)은 염화 아실 시약을 이용하여 염화 아실로 전환하고, 상기 염화 아실은 알칼리 존재하에 실온 또는 가열 조건에서 TFAA와 치환반응시킨 후, 가수분해하여 화합물(Ⅰ_a)을 얻고,
경로 2：

여기서, R₁, R₂, R₃ 및 n의 정의는 제1항의 식 I에서 정의된 바와 같고,
화합물(2)는 염화 아실 시약을 이용하여 염화 아실로 전환한 다음, 얼음욕에서 농축 암모니아수와 반응시켜 화합물(3)을 얻고,
화합물(4)은 TBAF 촉매 작용하에, 테트라히드로푸란 중에서 TMS-CF₃와 첨가반응을 일으켜 화합물(5)을 얻고; 화합물(5)은 H⁺로가수분해 후 화합물(6)을 얻고; 화합물(6)은 K₂CO₃ 존재하에 DMF 중에서 2-클로로에탄올과 반응시켜 화합물(7)을 얻고; 화합물(7)은 TsCl 및 Et₃N의 존재하에 DCM 중에서 술포닐화되어 화합물(8)을 얻고; 화합물(8)과 화합물(3)은 DMF 중에서 NaH의 작용하에 반응시켜 화합물(9)을 얻고; 화합물(9)은 루이스산 작용하에 에틸렌글리콜의 탈보호 반응을 통해 화합물(Ia)을 얻고,
경로 3：

여기서, R₁, R₂, R₃ 및 n의 정의는 제1항의 식 I에서 정의된 바와 같고,
화합물(8)은 DMF 중에서 NaN₃과 반응시켜 화합물(10)을 얻고; 화합물(10)은 수소화 환원을 거쳐 아민(11)을 얻고; 아민(11)은 축합제 존재하에 DCM중에서 산(2)과 축합반응시켜 화합물(9)을 얻고; 화합물(9)은 루이스산 작용하에 에틸렌글리콜의 탈보호 반응을 거쳐 화합물(Ia)을 얻고,
화합물(Ib)는 하기 경로 4를 통해 제조되고:
경로 4：

여기서, R₁, R₂, R₃ 및 n의 정의는 제1항의 식 I에서 정의된 바와 같고,
화합물(2)은 쿠르티우스 재배열 반응(Curtius rearrangement reaction)을 통해 Boc-보호 아민(12)을 얻고; 아민(12)은 Boc기를 제거하여 자유 아민(13)을 얻고; 동시에 화합물(7)은 TEMPO와 BAIB의 산화를 통해 산(14)을 얻고; 산(14)은 축합제 작용하에 아민(13)과 반응시켜 화합물(15)을 얻고; 화합물(15)은 루이스산 작용하에 에틸렌글리콜의 탈보호 반응을 통해 화합물(Ib)을 얻고,
화합물(Ⅰc)는 하기 경로 5를 통해 제조되고,
경로 5：

여기서, R₁, R₂, R₃, R₅, R₆, R₇, X 및 Y의 정의는 제1항의 식 I에서 정의된 바와 같고
R₉은 R_4b, R_4c 및 R_4d로부터 선택된 1종이고,

여기서, R₅, R₆ 및 R₇의 정의는 제1항의 식 I에서 정의된 바와 같고,
화합물(I_ab)은 실온 또는 가열 조건에서 용매 중에서
또는
과 탈수 축합 반응을 일으켜 화합물(Ic)을 얻는, 2,2'-비스-티아졸계 화합물의 제조방법.
제1항에 있어서,
히스톤 데아세틸라제 억제제 약물 제조에 사용되는, 2,2'-비스-티아졸계 화합물.
제1항에 있어서,
항종양제, 자가 면역질환 치료제, II형 당뇨병 및 그 합병증 치료제 또는 신경퇴행성 병변 치료제의 제조에 사용되는, 2,2'-비스-티아졸계 화합물.
제9항에 있어서,
상기 종양은 다발성 골수종, 피부 T 세포 림프종 또는 말초 T 세포 림프종이고, 상기 자가 면역질환은 다발성 경화증이고, 상기 신경퇴행성 병변은 헌팅턴병 또는 알츠하이머병인, 2,2'-비스-티아졸계 화합물.
치료적 유효량의 제1항의 식 I의 구조를 가지는 2,2'-비스-티아졸계 화합물로부터 선택되는 1종 이상의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 항종양제, 자가 면역질환 치료제, II형 당뇨병 및 그 합병증 치료제 또는 신경퇴행성 병변 치료제 제조에 사용되는 약학 조성물.