KR101740294B1 - Formulations of dihydroxy octadecenoic acid and method for producing formulations - Google Patents
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Abstract
미생물 생변환 기술을 이용하여 과일가공의 부산물인 과일씨앗으로부터 넓은 범위의 식물 병원성균에 대해 높은 항균활성을 갖는 친환경 신소재 하이드록시지방산(dihydroxy octadecenoic acid)을 제형화하는 하이드록시 지방산의 제형 및 그 제조방법에 관한 것으로, (a) 복숭아 씨, 천도복숭아 씨, 자두 씨, 매실 씨 중의 어느 하나의 씨앗을 마련하고, 분리한 다음 분쇄하여 추출하는 단계, (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 씨앗과 노멀 헥산(n-hexane)을 1:3의 비율로 혼합하고, 침지시킨 후 상층액을 분리하고 농축하여 농축액을 마련하는 단계, (c) 상기 단계 (b)에서 마련된 농축액을 이용하여 하이드록시 지방산을 생성하는 단계, (d) 하이드록시 지방산에 보조제를 투입하여 제형화하는 단계를 포함하는 구성을 마련하여, 작목 맞춤형 작물 보호를 실행할 수 있다.Formulation and production of hydroxy fatty acid which formulate dihydroxy octadecenoic acid which has high antimicrobial activity against a wide range of phytopathogenic fungi from fruit seeds, which is a byproduct of fruit processing, using microbial biotransformation technology (A) seeding any one of peach seeds, peach seeds, plum seeds, plum seeds, separating and then pulverizing the seeds; (b) seeding the seeds extracted in step (a) (N-hexane) at a ratio of 1: 3, separating the supernatant from the supernatant and concentrating the supernatant to prepare a concentrate, (c) mixing the concentrate prepared in step (b) with hydroxy And (d) adding an auxiliary agent to the hydroxy fatty acid to formulate the composition, so that crop-tailored crop protection can be carried out.
Description
본 발명은 하이드록시 지방산의 제형 그 제조방법에 관한 것으로, 특히 미생물 생변환 기술을 이용하여 과일가공의 부산물인 과일씨앗으로부터 넓은 범위의 식물 병원성균에 대해 높은 항균활성을 갖는 친환경 신소재 하이드록시지방산(dihydroxy octadecenoic acid, 이하, 'DOD'라 함)을 제형화하는 하이드록시 지방산의 제형 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a hydroxy fatty acid, and more particularly, to a method for producing a hydroxy fatty acid, which comprises using a microbial biotransformation technology to produce an eco-friendly new material hydroxy fatty acid having a high antimicrobial activity against a broad range of phytopathogenic fungi dihydroxy octadecenoic acid (hereinafter referred to as " DOD "), and a method for preparing the same.
현재 사용되고 있는 살균제들은 우수한 살균 효과에도 불구하고 표적 병원균류들의 내성증가와 그에 따른 처리량의 증가로 인한 환경오염이 새로운 문제점으로 대두되어 왔다. 따라서 저약량으로 강력한 살균효과를 나타내면서 보다 넓은 살균 스펙트럼을 갖는 환경친화적인 살균제를 개발할 필요성이 대두되고 있다. 이러한 요구에 따라 기존 살균제들의 단점을 보완하면서 차별성을 가지는 새로운 계통의 살균제의 개발이 절실히 요구되고 있다.Despite the excellent germicidal effect, currently used germicides have become a new problem because of increased tolerance of target hospital fungi and consequent increase of throughput. Therefore, there is a need to develop an environmentally friendly fungicide having a broad sterilization spectrum while exhibiting a strong sterilization effect at a low dose. In response to these demands, it is urgently required to develop a new line of disinfectant having differentiation while complementing the disadvantages of existing disinfectants.
또 하이드록시 지방산(Hydroxy fatty acid, HFA)은 일반 지방산의 중심사슬에 1개 이상의 하이드록실기를 갖고 있는 형태로 자연계에서 주로 식물체에서 극미량으로 발견되고 있다. 상기 하이드록시 지방산은 지방산 사슬에 추가적으로 붙어 있는 하이드록실기에 의해 지방산으로 하여금 높은 점성이나 반응성 등 특이한 성질을 갖도록 만들어 준다. 상기 HFA는 연결되어 있는 하이드록시기의 수에 따라 모노-, 디-, 트리-하이드록시 지방산으로 분류되며, 하이드록시기 외에 별도의 구조 를 포함하는 에폭시 하이드록시 지방산(epoxy-hydroxy fatty acid) 또는 옥소하이드록시 지방산(oxo-hydroxy fatty acid) 등도 포함할 수 있다.Hydroxy fatty acid (HFA) has one or more hydroxyl groups in the central chain of common fatty acids. The hydroxy fatty acid causes the fatty acid to have a specific property such as high viscosity or reactivity by the hydroxyl group added to the fatty acid chain. The HFA is classified into a mono-, di-, and tri-hydroxy fatty acid depending on the number of hydroxyl groups to which it is attached, and an epoxy-hydroxy fatty acid or an epoxy- Oxo-hydroxy fatty acid, and the like.
HFA가 갖는 특이한 성질로 인해 이들은 다양한 생리활성기능을 가질 수 있으며, 그 결과 신농약, 신의약, 고기능성 레진 및 섬유소재, 생분해성 플라스틱 소재, 윤활제, 화장품, 페인트 등 산업 전반에 걸쳐 광범위하게 응용될 수 있다.Due to the unique properties of HFA, they can have a variety of physiologically active functions. As a result, they can be widely applied to various industrial fields such as new pesticides, new drugs, highly functional resins and fiber materials, biodegradable plastic materials, lubricants, .
한편, HFA 중 7,10-디하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid, DOD)은 올레산이나 식물성 기름으로부터 미생물에 의해 쉽게 생산된다(Hou, C. T. et al., J. Ind. Microbiol. 1991, 7, 123-130; Min-Jung Suh et al., Applied Micrbiology and Biotechnology 2011, 89:1721-1727). 또한 최근의 보고에 의하면, DOD가 다양한 병원성 세균에 대해 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Hye-Ran Sohn, et al., Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2013, 2: 85-87).On the other hand, 7,10-dihydroxy-8 (E) -octadecenoic acid (DOD) in HFA is easily produced by microorganisms from oleic acid and vegetable oil Hou, CT et al., J. Ind. Microbiol., 1991, 7, 123-130; Min-Jung Suh et al., Applied Micrbiology and Biotechnology 2011, 89: 1721-1727). Recently, DOD has been reported to exhibit antibacterial activity against various pathogenic bacteria (Hye-Ran Sohn, et al., Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2013, 2: 85-87).
이러한 기술의 일 예가 하기 문헌 1 및 2 등에 개시되어 있다.Examples of such techniques are described in
예를 들어, 하기 특허문헌 1에는 식물성 오일이 첨가된 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 농축하고 동결건조한 다음, 상기 동결건조된 미생물 배양액으로부터 하이드록시 지방산을 추출하는 단계를 포함하는 동결건조된 미생물 배양액을 이용한 식물성 오일로부터 하이드록시 지방산을 제조하는 방법으로서, 1) 슈도모나스 에어루지노사를 1차 배양하고, 상기 슈도모나스 에어루지노사의 배양액에 식물성 오일을 첨가하여 추가적으로 배양하여 슈도모나스 에어루지노사 배양액을 얻는 단계, 2) 상기 1) 단계에서 얻은 미생물 배양액을 농축하는 단계, 3) 상기 2) 단계에서 얻은 미생물 배양액의 농축액을 동결건조하는 단계 및 4) 상기 2) 단계에서 얻은 동결건조된 미생물 배양액에서 하이드록시 지방산을 추출하는 단계를 포함하는 하이드록시 지방산의 제조방법에 대해 개시되어 있다.For example,
또 하기 특허문헌 2에는 올레인산을 포함하는 천연식물성 오일을 기질로 이용하는 것을 특징으로 하는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 미생물을 이용한 하이드록시 지방산의 제조방법으로서, 상기 천연식물성 오일은 올리브기름, 홍화씨기름, 콩기름, 옥수수기름, 참깨씨앗 기름, 들깨씨앗 기름, 포도씨 기름, 고추씨 기름, 카놀라유, 해바라기씨 기름, 참외씨 기름, 채종유 및 미강유로 구성된 군에서 선택되고, 상기 하이드록시 지방산은 탄소수 18개의 지방산 사슬 위에 7번 탄소와 10번 탄소에 각각 1개씩 총 2개의 하이드록실기를 가지며 8번 탄소와 9번 탄소 사이에 1개의 이중결합을 포함하고 있는 7,10-다이하이드록시-8(E)-옥타데세노산(7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid)인 기술에 대해 개시되어 있다.Also,
그러나 상술한 바와 같은 종래의 기술에서는 친환경 작물 보호제로서 DOD를 대량 생산하고 낮은 원가로 생산하기가 곤란하다는 문제가 있었다.However, in the conventional technology as described above, there has been a problem that it is difficult to mass produce DOD as an environment-friendly crop protection agent and produce it at low cost.
또 상업적으로 사용되는 식물 병해충 방제 농약의 경우 대부분이 식물병원성 곰팡이를 대상으로 하고 있으나, 식물병해 중에는 세균에 의해 기인되는 경우가 많으며 이에 대한 효과적인 방제법이 개발되어 있지 못하고 있다. 특히 시설하우스 재배작물과 과수의 경우 식물병원세균에 의한 피해가 많이 발생하지만 효과적인 대응책이 마련되어 있지 못하고 있다.Most commercial pesticide-controlling pesticides are plant pathogenic fungi, but most of them are caused by bacteria, and no effective control method has been developed for them. In particular, plant-grown crops and fruit trees are often damaged by botanical germs, but no effective countermeasures are available.
작물 수확 후 저장 중 발생하는 식물병해도 곰팡이와 세균에 의해 발생하므로 재배작물, 밭작물과 과수의 저장안전성을 획기적으로 증대시킬 수 있는 친환경 작물보호제 개발이 시급하다. 현재 소수의 식물세균병해 방제를 위한 미생물 농약이 개발되어 있으나, 지속적이지 못하며 단일처리로 효과를 거두기 어렵고, 특히 자연환경에서 변화하는 병원균의 병원성 변이로 인해 신속한 대처가 어렵다는 문제도 있었다.It is urgent to develop eco-friendly crop protection agents that can significantly increase the storage stability of cultivated crops, crops and fruit trees due to the occurrence of plant diseases caused by fungi and bacteria during crop storage and storage. Although microbial pesticides have been developed for controlling a small number of plant bacterium diseases, they are not continuous and have difficulties in achieving the effect by a single treatment. Especially, it is difficult to cope with a rapid response due to pathogenic mutations of pathogenic bacteria which change in a natural environment.
또한, 상기와 같은 종래의 기술에서는 식물 병원성균에 대한 DOD의 체계적 항균활성 검증되지 않았고, DOD에 대해 잔류 독성 평가의 문제점에 대해서도 전혀 개시되어 있지 않았다.In addition, in the above conventional techniques, the systematic antibacterial activity of DOD against phytopathogenic fungi has not been verified, and the problem of residual toxicity evaluation for DOD has not been disclosed at all.
또한, 상기와 같은 종래의 기술에서는 DOD의 제형화에 대해 개시되어 있지 않다.In addition, in the above-described conventional techniques, the formulation of DOD is not disclosed.
본 발명의 목적은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 과일씨앗으로부터 생산된 DOD를 최적화하여 제형하는 하이드록시 지방산의 제형 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made in order to solve the above problems, and it is an object of the present invention to provide a formulation of hydroxy fatty acid that optimizes DOD produced from fruit seeds and a method for producing the same.
본 발명의 다른 목적은 식물 병원성균에 대한 DOD의 체계적 항균활성 검증 및 잔류 독성 평가를 실행하여 친환경 작물보호제를 마련하는 하이드록시 지방산의 제형 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for preparing a hydroxy fatty acid and a method for producing the same, in which a systematic antimicrobial activity of DOD against plant pathogenic bacteria and evaluation of residual toxicity are evaluated to prepare an environmentally friendly crop protection agent.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 하이드록시 지방산(dihydroxy octadecenoic acid)의 제형의 제조방법은 하이드록시 지방산을 제형화하는 방법으로서, (a) 복숭아 씨, 천도복숭아 씨, 자두 씨, 매실 씨 중의 어느 하나의 씨앗을 마련하고, 분리한 다음 분쇄하여 추출하는 단계, (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 씨앗과 노멀 헥산(n-hexane)을 1:3의 비율로 혼합하고, 침지시킨 후 상층액을 분리하고 농축하여 농축액을 마련하는 단계, (c) 상기 단계 (b)에서 마련된 농축액을 이용하여 하이드록시 지방산을 생성하는 단계, (d) 하이드록시 지방산에 보조제를 투입하여 제형화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for preparing a hydroxy fatty acid (DHA) formulation, comprising the steps of: (a) preparing a formulation of a hydroxy fatty acid from a mixture of (a) peach seed, (B) mixing the seeds extracted in the step (a) with n-hexane in a ratio of 1: 3, and dipping the seeds Separating and concentrating the supernatant to prepare a concentrate; (c) producing a hydroxy fatty acid using the concentrate prepared in the step (b); (d) adding an adjuvant to the hydroxy fatty acid to formulate And a control unit.
또 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제형화 방법에서, 상기 보조제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate)를 포함하는 것을 특징으로 한다.In the method for forming a hydroxy fatty acid according to the present invention, the adjuvant is characterized by containing polyoxyethylene sorbitan monooleate.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제형의 제조방법은 올레산(oleic acid)을 함유하는 팜 오일(palm oil)을 기질로 사용하고, 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 미생물을 이용하여 하이드록시 지방산을 형성하는 단계와 하이드록시 지방산에 보조제를 투입하여 제형화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for preparing a hydroxy fatty acid formulation, which comprises using palm oil containing oleic acid as a substrate and using Pseudomonas aeruginosa microorganism Thereby forming a hydroxy fatty acid; and injecting an auxiliary agent into the hydroxy fatty acid to formulate it.
또한, 상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제형은 주성분으로서 상술한 하이드록시 지방산0.75g, Thymol 4g 및 Ethanol 17mL을 구비하고, 보조제로서 Dimethyl sulfoxide 8mL과 Polyoxyethylene sorbitan monooleate 75mL을 포함하는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the hydroxy fatty acid formulation according to the present invention comprises 0.75 g of hydroxy fatty acid as the main ingredient, 4 g of Thymol and 17 mL of Ethanol, 8 mL of Dimethyl sulfoxide as an auxiliary agent and 75 mL of Polyoxyethylene sorbitan monooleate .
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제형 및 그 제조방법에 의하면, 과일가공 부산물인 과실류 씨앗으로부터 DOD를 저비용/고효율로 최적 화 하여 제형화할 수 있다는 효과가 얻어진다.INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, according to the formulation of the hydroxy fatty acid and the method for producing the same according to the present invention, the effect of optimizing the DOD from the fruit seed, which is a byproduct of fruit processing, at a low cost / high efficiency can be obtained.
또, 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제형 및 그 제조방법에 의하면, DOD 제제화에 따라 작목 맞춤형 작물 보호를 실행할 수 있다는 효과도 얻어진다.Further, according to the formulation of the hydroxy fatty acid according to the present invention and the method for producing the same, it is also possible to achieve the effect of protecting crops customized for crops according to DOD formulation.
즉, 본 발명에 따르면 DOD의 대량 생산 기술의 확립을 위해, DOD를 생물농약으로 사용하기 위한 대량 배양 기술을 개발하고, 생물반응기(bioreactor)에서 지속적이면서 안정적인 수율을 획득하여 제형화 공정을 확립함으로써 생물농약으로서의 가치를 증진할 수 있고, 친환경적인 과제 수행으로서, 과수 부산물을 이용한 자연 생태계의 순환원리를 이용한 생물농약 개발은 농약 사용량의 증가로 늘어나는 병해충의 내성을 방지하며, 농업생산성을 획기적으로 향상하고 기존 화학 농약 의존성 농업 경영 방식에서 탈피하여 농업 생산 기술과 농가 수익 향상에 직접적인 영향을 미치는 계기를 제공한다.That is, according to the present invention, in order to establish a mass production technology of DOD, mass culture technology for using DOD as a biocidal pesticide was developed, and a continuous and stable yield was obtained in a bioreactor to establish a formulation process Development of biological pesticides using the principle of circulation of natural ecosystem using fruit water byproducts can enhance the value as biological pesticides and can be used as an environmentally friendly task to prevent pest resistance and to improve agricultural productivity dramatically And it provides an opportunity to have a direct influence on the improvement of agricultural production technology and farm profit by avoiding the existing chemical pesticide dependent agricultural management method.
또 작물 수확 후 저장 중 발생하는 식물병해(곰팡이와 세균에 의해 발생)에 대한 재배작물, 밭작물과 과수의 저장안전성을 획기적으로 증대 도모하고, 소수의 식물세균병해 방제를 위한 미생물 농약이 개발되어 있으나, 지속적이지 못하며 단일처리로 효과를 거두기 어렵고, 특히 자연환경에서 변화하는 병원균의 병원성 변이 등 기존 보호제에서 대처가 어려웠던 문제점을 해결할 수 있다. In addition, microbial pesticides have been developed to dramatically increase the storage stability of cultivated crops, crops and fruit trees for plant diseases (caused by fungi and bacteria) that occur during storage after crop harvest, and to control a small number of plant bacterial diseases , It is not persistent and it is difficult to achieve the effect by single treatment. Especially, it is possible to solve the problem that it is difficult to cope with the existing protective agent such as pathogenic mutation of pathogenic bacteria changing in the natural environment.
또한, 세균성 식물병해 원인세균에 대해 광범위한 항균활성을 갖는 친환경 항균소재의 항생제 농약의 개발로, 높은 생산원가로 인해 일반 항생제를 농약으로 이용하기에 어려웠던 문제를 해결하고, 수요가 제한적인 시장에 낮은 가격과 질 높은 제품을 공급하므로 관련 산업의 발전에 따른 경제적인 파급 효과에 기여할 수 있다.In addition, the development of antibiotic pesticides for environmentally friendly antimicrobial materials that have broad antibacterial activity against bacteria causing bacterial plant diseases can solve the problem of difficulty in using general antibiotics as pesticides due to high production cost, It can contribute to the economic ripple effect of the development of the related industry by supplying high quality and high quality products.
도 1은 올리브오일로부터 미생물 PR3를 이용한 DOD 생산을 나타내는 그래프,
도 2는 세균성 식물병해의 대표적 원인세균에 대한 DOD의 항균활성 확인을 나타내는 도면,
도 3은 세균성 궤양병의 원인균 Xanthomonas campestris에 대한 DOD의 항균활성 확인을 나타내는 도면,
도 4는 식물성 오일로부터 미생물을 이용한 DOD 생산 가능성을 확인하는 도면,
도 5는 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제형을 위한 공정도,
도 6은 본 발명의 실험에 사용된 과일 씨 종류 및 추출된 지질량을 나타낸 표,
도 7은 추출한 과일 씨 오일을 이용한 DOD 생산 확인을 위한 TLC 분석 사진,
도 8은 과일 씨 추출물 5종을 기질로 이용하여 DOD 생산 비교를 나타내는 그래프,
도 9는 자두 씨 오일 농도별 첨가에 따른 DOD 생산량 비교를 나타내는 도면,
도 10은 복숭아 씨 오일 농도별 첨가에 따른 DOD 생산량 비교를 나타내는 도면,
도 11은 매실 씨 오일 농도별 첨가에 따른 DOD 생산량 비교를 나타내는 도면,
도 12는 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 탄소원 영향 TLC 분석을 나타내는 도면,
도 13은 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 탄소원 영향을 나타내는 그래프,
도 14는 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 프룩토오스 농도별 영향 TLC 분석을 나타내는 도면,
도 15는 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 프룩토오스 농도별 영향을 나타내는 그래프,
도 16은 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 질소원 영향 TLC 분석을 나타내는 도면,
도 17은 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 질소원 영향을 나타내는 그래프,
도 18은 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 요소 농도별 영향 TLC 분석을 나타내는 도면,
도 19는 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 요소 농도별 영향을 나타내는 그래프,
도 20은 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 기질 농도별 영향 TLC 분석을 나타내는 도면,
도 21은 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 기질 농도별 영향을 나타내는 그래프,
도 22는 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 배양 온도별 영향 TLC 분석을 나타내는 도면,
도 23은 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 배양 온도별 영향을 나타내는 그래프,
도 24는 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 pH별 영향 TLC 분석을 나타내는 도면,
도 25는 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 pH 별 영향을 나타내는 그래프,
도 26은 본 발명에 따라 팜 오일을 이용한 DOD 대량생산을 위한 장치를 나타내는 도면,
도 27은 DOD 대량생산을 위한 팜 오일 농도에 따른 DOD 생산성 비교를 나타내는 그래프,
도 28은 세균성 병원균에 대한 DOD의 항균활성을 나타내는 도면,
도 29는 곰팡이에 대한 DOD의 항균활성을 나타내는 도면,
도 30은 세균성 병원균에 대한 DOD 제제 조성별 항균활성을 나타내는 도면,
도 31은 본 발명에 따른 시제품의 제조 공정을 나타낸 도면.1 is a graph showing DOD production from olive oil using microorganism PR3,
2 is a view showing confirmation of antimicrobial activity of DOD against representative causative bacteria of bacterial plant diseases,
FIG. 3 is a view showing confirmation of antimicrobial activity of DOD against Xanthomonas campestris, a causative organism of bacterial enteric diseases,
4 is a view for confirming the possibility of DOD production using microorganisms from vegetable oils,
5 is a process diagram for the formulation of a hydroxy fatty acid according to the present invention,
FIG. 6 is a table showing the kinds of fruit seeds and the extracted amount of ground used in the experiment of the present invention,
7 is a TLC analysis photograph for confirming DOD production using extracted fruit seed oil,
8 is a graph showing the comparison of DOD production using five kinds of fruit seed extract as a substrate,
9 is a view showing a comparison of DOD production amounts according to addition of plum seed oil concentration,
10 is a view showing comparison of DOD production amount according to addition of peach seed oil concentration,
11 is a view showing a comparison of DOD production amount according to addition of plum seed oil concentration,
12 is a graph showing the TLC analysis of the carbon source effect on DOD production in palm oil use,
13 is a graph showing the effect of carbon sources on the production of DOD when palm oil is used,
FIG. 14 is a diagram showing the TLC analysis of the influence of fructose on the production of DOD when palm oil is used,
15 is a graph showing the influence of fructose concentration on the production of DOD when palm oil is used,
16 shows TLC analysis of the effect of nitrogen source on DOD production using palm oil,
17 is a graph showing the effect of nitrogen source on the production of DOD when palm oil is used,
18 is a diagram showing the TLC analysis of the influence of urea concentration on DOD production using palm oil,
FIG. 19 is a graph showing the effect of urea concentration on DOD production using palm oil,
20 is a diagram showing the TLC analysis of effect of substrate concentration on DOD production using palm oil,
21 is a graph showing the effect of substrate concentration on DOD production in palm oil use,
Figure 22 is a drawing showing the TLC analysis of the effect of culture temperature on the production of DOD when palm oil is used,
23 is a graph showing the influence of culture temperature on DOD production when palm oil is used,
24 is a diagram showing the TLC analysis of the effect of pH on the production of DOD when using palm oil,
25 is a graph showing the influence of pH on the production of DOD when palm oil is used,
26 shows an apparatus for mass production of DOD using palm oil according to the present invention,
27 is a graph showing the comparison of DOD productivity with palm oil concentration for DOD mass production,
28 is a diagram showing antimicrobial activity of DOD against bacterial pathogens,
29 is a view showing antimicrobial activity of DOD against fungi,
30 is a diagram showing antimicrobial activity of each DOD formulation composition against bacterial pathogens,
31 is a view showing a manufacturing process of a prototype product according to the present invention.
본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.These and other objects and novel features of the present invention will become more apparent from the description of the present specification and the accompanying drawings.
본 발명에 적용되는 하이드록시지방산(Hydroxy fatty acid, HFA)은 일반 지방산에 하이드록실기를 갖고 있는 형태로 자연계에서 식물체에서 극미량으로 발견되고 있지만, 하이드록실기에 의해 지방산으로 하여금 높은 점성이나 새로운 반응성 등 특이한 성질을 갖도록 제조된다.Hydroxy fatty acid (HFA) applied to the present invention is a form having a hydroxyl group in a common fatty acid and is found in a trace amount in a plant in a natural state. However, a hydroxyl group causes a fatty acid to have a high viscosity, And the like.
최근 지방산으로부터 미생물을 이용한 HFA 생산에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 그 중 Pseudomonas aeruginosa PR3는 올레산(oleic acid)으로부터 7,10-dihydroxy octadecenoic acid(DOD, 화학식 1)를 높은 효율로 생산할 수 있는 것이 밝혀졌다. Recently, HFA production using microorganisms from fatty acids has been studied. Among them, Pseudomonas aeruginosa PR3 can produce 7,10-dihydroxy octadecenoic acid (DOD, Formula 1) from oleic acid with high efficiency lost.
본 발명자에 의해 올레산을 포함하는 식물성 오일을 직접 이용하여 DOD를 낮은 원가로 생산할 수 있는 기술이 개발되었으며(기존 항생제 판매가 대비 1/100이하), 올리브오일을 기질로 사용했을 경우, 도 1에 도시된 바와 같이, DOD 생산효율이 70% 정도를 기록하였다.The present inventors have developed a technology for producing DOD at a low cost by directly using vegetable oils containing oleic acid (less than 1/100 of the price of existing antibiotics), and when olive oil is used as a substrate, As a result, the DOD production efficiency was about 70%.
도 1은 올리브오일로부터 미생물 PR3를 이용한 DOD 생산을 나타내는 그래프로서, 왼쪽은 배양시간에 따른 DOD 생산량 확인을 TLC로 분석한 결과로서, 시간이 경과함에 따라 상층의 올리브오일이 대부분 DOD로 생전환되는 것을 나타내며, 오른쪽은 72시간 후 시료를 GC로 분석한 것으로서, IS(internal standard)를 제외하면 DOD가 전체 피크 중의 대부분을 차지하고 있음을 알 수 있다. 기질에 대한 실제 수율을 계산했을 때 70% 정도로 나타남을 알 수 있었다.FIG. 1 is a graph showing DOD production using microorganism PR3 from olive oil. On the left, the results of TOD analysis of the DOD production amount according to the incubation time show that most of the olive oil in the upper layer is converted into DOD . On the right side, the sample was analyzed by GC after 72 hours. It can be seen that DOD occupies most of the entire peaks except IS (internal standard). When the actual yield for the substrate was calculated, it was found to be about 70%.
또 본 발명자에 의해 DOD가 대표적 세균성 식물병의 원인균인 감자둘레썩음병, 토마토궤양병(Clavibacter (Corynbacterium)), 무름병(Erwinia), 풋마름병(Ralstonia), 잔토모나스(Xanthomonas) 등에 대해 높은 항균활성을 나타내고 있음이 밝혀졌다(도 2 및 도 3 참조).The inventors of the present invention have also found that DOD is effective against bacterial plant diseases such as potato girth rot, Clavibacter (Corynbacterium), Erwinia, Ralstonia, Xanthomonas, (See Fig. 2 and Fig. 3).
도 2는 세균성 식물병해의 대표적 원인세균에 대한 DOD의 항균활성 확인을 나타내는 도면으로서, A는 Oleic acid(1mg), B는 crude extract(1mg), C는 Olive oil(1mg), D는 DOD(1mg), F는 DMSO를 나타낸다. 도 3은 세균성 궤양병의 원인균 Xanthomonas campestris에 대한 DOD의 항균활성 확인을 나타내는 도면으로서, DOD를 이용하여 세균성 식물병해 중 세균성 궤양병의 원인균 Xanthomonas campestris에 대해 agar dilution 방법을 이용하여 항균활성을 확인한 것으로 낮은 DOD 농도에서도 세균에 대한 항균활성이 높게 나타나고 있음을 나타낸다.B is crude extract (1 mg), C is olive oil (1 mg), D is DOD (1 mg), B is
상술한 결과는 저가의 식물성 오일로부터 높은 항균활성을 지닌 DOD를 미생물 대사공학기법을 이용하여 대량으로 값싸게 생산해 낼 수 있음을 의미하며, 광범위한 식물병원성 세균에 대한 DOD의 높은 항균활성은 DOD를 세균성 농작물병해 방제를 위한 효과적인 작물보호제로 개발할 수 있는 가능성이 매우 높음을 나타낸다.The above results indicate that DOD with high antimicrobial activity from low-cost vegetable oils can be produced in large quantities cheaply using microbial metabolic engineering techniques. The high antimicrobial activity of DOD against a wide range of phytopathogenic bacteria is due to the fact that DOD The possibility of developing an effective crop protection agent for crop disease control is very high.
또 다양한 식물성 오일을 이용하여 P. aeruginosa PR3 균주에 의해 DOD 생산을 확인하여 본 결과 사용한 식물성 오일 모두에서 도 4에서 화살표로 나타낸 바와 같이, DOD가 생산됨을 확인할 수 있었다. 특히 올레산의 함량이 높은 올리브유의 경우뿐 아니라 포도씨유, 홍화씨유, 참기름 등에서도 DOD가 생산됨으로써 과일씨앗을 이용한 DOD 생산 가능성이 매우 높음을 보여주고 있다.In addition DOD production was confirmed by P. aeruginosa PR3 strain using various vegetable oils. As a result, it was confirmed that DOD was produced in all of the used vegetable oils as shown by an arrow in FIG. Especially, DOD is produced not only in olive oil having a high content of oleic acid but also in grape seed oil, safflower seed oil, sesame oil, etc., indicating that DOD production using fruit seeds is highly possible.
도 4는 식물성 오일로부터 미생물을 이용한 DOD 생산 가능성을 확인하는 도면이다.FIG. 4 is a view for confirming the possibility of DOD production using microorganisms from vegetable oil.
본 발명은 정제된 식물성 오일을 사용하였으나, 오일추출과 정제를 위한 별도의 비용이 소요되므로 DOD 생산성을 높이기 위해 오일을 포함한 씨앗의 분쇄물을 직접 이용할 수 있는 기술을 개발하여 DOD 생산비용을 크게 줄일 수 있는 것이다.The present invention uses refined vegetable oil, but it requires a separate cost for oil extraction and purification. Therefore, to improve the productivity of DOD, a technology for directly using the seed pulp including oil is developed to greatly reduce the production cost of DOD You can.
이하, 본 발명의 일 실시 예인 과일 씨 오일을 이용한 DOD 생산을 위해 도 5에 따라 설명한다.Hereinafter, DOD production using fruit seed oil as an embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.
도 5는 본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제형을 위한 공정도이다. 5 is a process diagram for the formulation of a hydroxy fatty acid according to the present invention.
먼저, 과일 씨 오일 추출 및 지방산 분석에 대해 설명한다.First, fruit seed oil extraction and fatty acid analysis are explained.
과일 씨 오일은 포도 씨, 참외 씨, 복숭아 씨, 천도복숭아 씨, 자두 씨, 매실 씨, 아보카드 씨의 7종의 과일에서 씨앗을 마련하고(S10), 분리한 다음 각각을 분쇄하여 추출하였다(S20). Fruit seed oil was prepared by preparing seeds from seven kinds of fruits (Grape seed, Melon seed, Peach seed, Nectarine seed, Plum seed, Plum seed and Avocado seed) (S10) ).
각각의 과일 씨 오일은 씨앗과 노멀 헥산(n-hexane)을 1:3의 비율로 혼합하고(S30), 24시간 침지시킨 후 상층액을 분리하고 농축하여 준비하였다(S40). Each fruit seed oil was prepared by mixing seeds and n-hexane at a ratio of 1: 3 (S30), immersing them for 24 hours, separating the supernatant, and concentrating (S40).
본 발명에서는 상기 단계 S40에서 마련된 농축액을 이용하여 하이드록시 지방산(dihydroxy octadecenoic acid)을 생성하였다(S50).In the present invention, a dihydroxy octadecenoic acid is produced using the concentrate prepared in step S40 (S50).
상기 단계 S50에서 생산된 하이드록시 지방산을 제형화 한다(S60).The hydroxy fatty acid produced in step S50 is formulated (S60).
분리된 과일 씨 오일의 추출율(%)은 매실 씨 오일 22.9%, 참외 씨 오일 21.5%, 자두 씨 오일 12%, 포도 씨 오일 7.7%, 천도복숭아 씨 오일 1.8%, 복숭아 씨 오일 1.0%, 아보카도 씨 오일 0.3%로 확인되었다.The percentage of extracted fruit seed oil was 22.9%, 21.5% of melon seed oil, 12% of plum seed oil, 7.7% of grape seed oil, 1.8% of peach seed oil, 1.0% of peach seed oil, The oil was identified as 0.3%.
도 6은 본 발명의 실험에 사용된 과일 씨 종류 및 추출된 지질량을 나타낸 표이다.FIG. 6 is a table showing the kinds of fruit seeds and the extracted soil mass used in the experiment of the present invention. FIG.
과일 씨 오일 7종의 지방산(fatty acid) 구성을 GC, GC/MS를 이용하여 확인하였다. 확인된 지방산들의 함량은 상대적인 함량비를 퍼센트로 환산하여 하기 표 1에 정리하였다. 그 결과, 과일 씨 오일들의 주요 성분으로 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(stearic acid), 올레산(oleic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)이 확인되었다. 특히 DOD 생산의 전구체인 oleic acid 함량이 자두 씨 오일 88%, 천도복숭아 씨 오일 86%, 복숭아 씨 오일 67%, 매실 씨 오일 61% 순으로 높게 관찰되었다. 이는 DOD 생산에 있어서 적합한 기질로 사용 가능성이 높음을 의미한다.The fatty acid composition of seven kinds of fruit seed oil was confirmed by GC and GC / MS. The contents of the identified fatty acids are summarized in Table 1 below in terms of relative content ratios. As a result, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid were identified as main components of fruit seed oils. Especially, the content of oleic acid, which is a precursor of DOD production, was 88% in the order of plum seed oil, 86% in the peach seed oil, 67% in the peach seed oil and 61% in the order of the plum seed oil. This means that it is likely to be used as a suitable substrate for DOD production.
하기 표 1은 추출된 과일 씨 오일의 지방산종류 및 함량을 나타낸다.Table 1 below shows the kinds and contents of fatty acids of the extracted fruit seed oil.
다음에 과일 씨 오일을 이용한 DOD 생산에 대해 설명한다.Next, we describe the production of DOD using fruit seed oil.
먼저, 표 1에 나타난 결과를 바탕으로 올레산 함량이 낮은 아보카도 씨 오일을 제외한 5종의 과일 씨 오일로 실험을 진행하였다. 24시간 동안 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PR3 균주를 배양한 뒤 5종의 과일 씨 오일을 기질로 1% 첨가하여 48~72시간 배양하였다.First, based on the results shown in Table 1, the experiment was conducted with five kinds of fruit seed oil except for the low content of avocado seed oil. For 24 hours, Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) PR3 strain was cultured and 5 kinds of fruit seed oil were added as a substrate at 1% and cultured for 48 to 72 hours.
배양액으로부터 추출된 생성물을 TLC로 분석하여 본 결과 도 7과 같이 자두 씨, 복숭아 씨, 매실 씨 오일을 기질로 이용하였을 때 DOD와 동일한 위치에 스폿(spot)이 나타나고 있는 것을 확인하였다. 나타난 스폿의 크기는 처리 조건에 따라 다르게 나타났지만 동일한 위치에 나타나고 있는 것으로 볼 때 동일한 물질로 추정되었다. The product extracted from the culture was analyzed by TLC. As a result, it was confirmed that a spot appeared at the same position as DOD when plum seed, peach seed, and plum seed oil were used as a substrate as shown in FIG. 7. The size of the spot appeared different depending on the treatment conditions, but it was estimated to be the same material when it appears at the same position.
이 결과를 바탕으로 GC 분석을 통해 DOD 생산량을 확인하였다. 도 8과 같이 첨가한 기질의 종류에 따라 세포성장에는 큰 차이를 보이지 않았지만 DOD 생산량은 기질의 종류에 따라 큰 차이를 확인할 수 있었다.Based on these results, the amount of DOD production was confirmed by GC analysis. As shown in FIG. 8, there was no significant difference in cell growth depending on the type of substrate added, but the amount of DOD production was significantly different depending on the type of substrate.
자두 씨 오일을 기질로 이용하였을 때 가장 많은 DOD를 생산하였고, 복숭아 씨, 자두 씨 오일 순으로 생산량이 많았다. 이는 과일 씨 추출물의 올레산 함량과 비례하는 결과를 보여주고 있다. 특히 자두 씨 오일은 대조(control)로 이용한 올리브 오일보다 올레산 함량이 더 높았고, 또한 DOD 생산에서도 약 2배 더 높은 생산성을 확인할 수 있었다. When plum seed oil was used as a substrate, the highest amount of DOD was produced, followed by peach seed and plum seed oil. This result is in proportion to the content of oleic acid in fruit seed extract. In particular, the content of oleic acid was higher in olive oil than in control olive oil, and the productivity was about twice higher in DOD production.
이러한 결과로 자두 씨 오일이 DOD 생산에서 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.These results suggest that plum seed oil can be used effectively in DOD production.
도 7은 추출한 과일 씨 오일을 이용한 DOD 생산 확인을 위한 TLC 분석 사진으로서, 도 7의 (A)는 48시간 추출, 도 7의 (B)는 72시간 추출이며, lane 1-2 : 올리브오일(대조), 3-4 : 포도 씨 오일, 5-6 : 자두 씨 오일, 7-8 : 참외 씨 오일, 9-10 : 복숭아 씨 오일, 11-12 : 매실 씨 오일을 나타낸다.FIG. 7 is a TLC analysis image for confirming DOD production using extracted fruit seed oil. FIG. 7 (A) shows extraction for 48 hours, FIG. 7 (B) shows extraction for 72 hours, 3-4: grape seed oil, 5-6: plum seed oil, 7-8: melon seed oil, 9-10: peach seed oil, and 11-12: plum seed oil.
도 8은 과일 씨 추출물 5종을 기질로 이용하여 DOD 생산 비교를 나타내는 그래프로서, 도 8의 (A)는 세포성장, 도 8의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.Fig. 8 is a graph showing comparison of DOD production using five kinds of fruit seed extract as a substrate. Fig. 8 (A) shows cell growth and Fig. 8 (B) shows DOD yield.
다음에 자두 씨, 복숭아 씨, 매실 씨 추출물의 농도별 첨가에 따른 DOD 생산을 비교하였다.Next, we compared DOD production by addition of concentration of plum seed, peach seed, and plum seed extract.
본 발명에 따른 실험에서, 과일 씨 오일 5종 중, 자두 씨 오일, 복숭아 씨 오일, 매실 씨 오일이 DOD 생산에 가장 효과적임을 확인하였다. 그러므로 이 3종의 과일 씨 오일을 기질로 사용하였을 때 첨가한 기질의 농도에 따른 DOD 생산량을 비교하는 실험을 진행하였다. In the experiment according to the present invention, among the five fruit seed oils, plum seed oil, peach seed oil and plum seed oil were found to be most effective for DOD production. Therefore, when these three kinds of fruit seed oil were used as the substrate, the experiment was performed to compare the DOD production according to the added substrate concentration.
24시간 P. aeruginosa PR3 균주를 배양한 뒤 기질의 농도를 1.0, 2,0, 3.0%(v/v)의 비율로 배지에 첨가하여 48~72시간 배양하였다. 자두 씨 오일, 복숭아 씨 오일, 매실 씨 오일 모두 기질의 농도가 증가할수록 셀 성장(cell growth)도 증가하였고, DOD 생산량 또한 증가한다는 것을 확인하였다.After culturing for 24 hours, P. aeruginosa PR3 was added to the medium at a concentration of 1.0, 2.0, 3.0% (v / v) and cultured for 48 to 72 hours. It was confirmed that cell growth and DOD production were also increased with increasing substrate concentration of plum seed oil, peach seed oil and plum seed oil.
특히, 기질을 1%(v/v) 첨가하였을 때보다 2%(v/v) 첨가하였을 때 DOD 생산량이 3종의 과일 씨 오일에서 약 3배 더 높게 생산됨을 확인할 수 있었다. 최대 수율은 자두씨 오일 45%, 복숭아씨오일 64%, 매실씨오일 45%로 과일씨앗 오일을 기질로 이용하여 DOD를 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 하지만, 자두, 복숭아, 매실이 계절 과일로 대량으로 씨앗을 확보하는 데 어려움이 있어 DOD 생산이 가능한 올리브유와 팜유 중 가격이 더 저렴한 팜유를 대체 기질로 이용하여 생산성을 높이는 최적화 실험을 진행하였다.Especially, 2% (v / v) addition of 1% (v / v) substrate resulted in about 3 times higher production of DOD than 3 kinds of fruit seed oil. The maximum yield was found to be 45% for plum seed oil, 64% for peach seed oil and 45% for plum seed oil. However, it was difficult to obtain large amounts of seeds from plums, peaches, and plums. Therefore, we optimized the productivity of olive oil and palm oil by using palm oil as an alternative substrate.
도 9는 자두 씨 오일 농도별 첨가에 따른 DOD 생산량 비교를 나타내는 도면으로서, 도 5의 (A)는 TLC 분석, 도 5의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.Fig. 9 is a diagram showing a comparison of DOD production amount according to the addition of plum seed oil concentration. Fig. 5 (A) shows the TLC analysis and Fig. 5 (B) shows the DOD yield.
도 10은 복숭아씨 오일 농도별 첨가에 따른 DOD 생산량 비교를 나타내는 도면으로서, 도 10의 (A)는 TLC 분석, 도 10의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.10 is a diagram showing a comparison of DOD production amount according to addition of peach seed oil concentration, wherein FIG. 10 (A) shows the TLC analysis and FIG. 10 (B) shows the DOD yield.
도 11은 매실 씨 오일 농도별 첨가에 따른 DOD 생산량 비교를 나타내는 도면으로서, 도 11의 (A)는 TLC 분석, 도 11의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.11 is a diagram showing a comparison of the DOD production amount according to addition of the concentration of plum seed oil. FIG. 11 (A) shows the TLC analysis and FIG. 11 (B) shows the DOD production amount.
다음에 본 발명의 다른 실시 예인 팜 오일(palm oil)을 이용한 DOD 생산 최적 조건에 대해 설명한다.Next, the optimal conditions of DOD production using palm oil, which is another embodiment of the present invention, will be described.
먼저, 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 탄소원 영향을 실험하였다.First, the effect of carbon source on the production of DOD when palm oil was used was examined.
기대했던 포도 씨 오일에서 DOD 생산성이 낮아 올레산 함량이 약 39%인 팜 오일을 대체하여 DOD 생산 최적조건을 잡는 실험을 진행하였다. In the grape seed oil, which was expected to be low in DOD productivity, the experiment was carried out to replace the palm oil having an oleic acid content of about 39% to obtain the optimal conditions for DOD production.
배지의 조성은 DOD 생산에 중요한 역할을 한다. 따라서, DOD 생산을 위한 최적 조건을 결정하기 위해 탄소원 및 농도, 질소원 및 농도, 기질의 영향에 대한 실험을 진행하였다. The composition of the medium plays an important role in DOD production. Therefore, the effects of carbon source and concentration, nitrogen source and concentration, and substrate were investigated to determine optimum conditions for DOD production.
DOD 생산을 위한 탄소원의 영향을 조사하기 위해 9가지의 탄소원은 동일하게 0.4%(v/v)의 농도로 표준 조건에서 실험되었다. To investigate the effect of carbon sources on DOD production, nine carbon sources were tested at standard concentrations of 0.4% (v / v).
도 12는 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 탄소원 영향 TLC 분석을 나타내는 도면으로서, 도 12의 (A)는 48시간 추출, 도 12의 (B)는 72시간 추출을 나타내며, lane 1-2 : Glucose, 3-4 : Galactose, 5-6 : Fructose, 7-8 : Lactose, 9-10 : Maltose, 11-12 : Sucrose, 13-14 : Xylose, 15-16 : Glycerol, 17-18 : Whey powder을 나타낸다.12 (A) shows extraction of 48 hours, FIG. 12 (B) shows extraction of 72 hours, and lane 1-2: Glucose , 3-4: Galactose, 5-6: Fructose, 7-8: Lactose, 9-10: Maltose, 11-12: Sucrose, 13-14: Xylose, 15-16: Glycerol, 17-18: Whey powder .
도 13은 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 탄소원 영향을 나타내는 그래프로서, 도 13의 (A)는 세포성장, 도 13의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.FIG. 13 is a graph showing the effect of carbon sources on the production of DOD when palm oil is used, in which FIG. 13 (A) shows cell growth and FIG. 13 (B) shows DOD yield.
도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 미생물은 탄소원의 종류와 상관없이 잘 자랐지만, DOD 생산에는 큰 차이를 보였다. 프룩토오스(Fructose)를 사용한 배지에서 가장 많은 DOD가 생산이 되었으며, 자일로오스(xylose)와 갈락토스(galactose) 배지에서는 DOD가 거의 생산되지 않았음을 확인할 수 있었다.As can be seen from Fig. 13, the microorganisms grew well regardless of the type of carbon source, but showed a large difference in DOD production. Most of the DOD was produced in the medium containing fructose, and the DOD was hardly produced in the xylose and galactose medium.
다음에, 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 프룩토오스 농도별 영향을 실험하였다.Next, the effect of fructose concentration on the production of DOD when palm oil was used was examined.
상기 실험에서 프룩토오스가 DOD 생산에서 가장 효과적인 탄소원임을 알았다. 그러므로 DOD 생산에서 프룩토오스의 농도에 따른 영향을 알아보는 실험을 진행하였다. In the above experiment, it was found that fructose was the most effective carbon source in DOD production. Therefore, an experiment was conducted to investigate the effect of fructose concentration on DOD production.
도 14에서 보는 것처럼 프룩토오스 농도에 따른 미생물 성장은 큰 차이를 보이지 않았다. 하지만, DOD 생산량은 프룩토오스의 농도가 높을수록 증가하여 0.5%(v/v) 일 때 생산량은 최대가 되었다. 그리고 0.5%(v/v)보다 더 높은 농도에서는 DOD 생산량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 프룩토오스의 농도를 0.5%(v/v)로 고정하여 다음 실험을 진행하였다.As shown in FIG. 14, microbial growth by fructose concentration did not show any significant difference. However, the amount of DOD increased with increasing fructose concentration and reached the maximum at 0.5% (v / v). And the DOD production was decreased at higher concentration than 0.5% (v / v). Based on these results, the concentration of fructose was fixed to 0.5% (v / v) and the following experiment was conducted.
도 14는 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 프룩토오스 농도별 영향 TLC 분석을 나타내는 도면으로서, 도 14의 (A)는 48시간 추출, 도 14의 (B)는 72시간 추출을 나타내며, lane 1-2 : Control, 3-4 : 0.1%(v/v), 5-6 : 0.3%, 7-8 : 0.5%, 9-10 : 0.7%, 11-12 : 1.0%를 나타낸다.14 (A) shows extraction of 48 hours and FIG. 14 (B) shows extraction of 72 hours. Fig. 14 (A) 2: Control, 3-4: 0.1% (v / v), 5-6: 0.3%, 7-8: 0.5%, 9-10: 0.7%, and 11-12: 1.0%.
도 15는 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 프룩토오스 농도별 영향을 나타내는 그래프로서, 도 15의 (A)는 세포성장, 도 15의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.FIG. 15 is a graph showing the influence of fructose on the production of DOD when palm oil is used. FIG. 15 (A) shows cell growth and FIG. 15 (B) shows DOD production.
또, 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 질소원 영향을 실험하였다.In addition, the effect of nitrogen source on the production of DOD when palm oil was used was examined.
몇몇 유기, 무기 질소원을 이용하여 DOD 생산에 미치는 영향에 대해 실험하였다. 대조인 SM6 배지에는 0.1%(v/v) diammonium hydrogen phosphate와 0.1%(v/v) yeast extract가 포함되어있다. 유기질소원으로는 효모 추출물(yeast extract), 맥아 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 글루타민(glutamine), 요소(urea)를, 무기질소원으로는 질산암모늄(ammonium nitrate), 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate)을 이용하였다. 각각의 질소원은 표준 배지와 같은 농도인 1.13g/L (약 0.1%,w/v)로 정량하여 실험을 하였다. Several organic and inorganic nitrogen sources were used to study the effects on DOD production. The control SM6 medium contains 0.1% (v / v) diammonium hydrogen phosphate and 0.1% (v / v) yeast extract. Yeast extract, malt extract, peptone, tryptone, glutamine and urea, and inorganic nitrates such as ammonium nitrate, , Ammonium sulfate, and ammonium phosphate were used. Each of the nitrogen sources was quantitatively assayed at a concentration of 1.13 g / L (about 0.1%, w / v) equivalent to that of the standard medium.
도 16은 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 질소원 영향 TLC 분석을 나타내며, lane 1-2 : Control, 3-4 : Yeast extract, 5-6 : Glutamine, 7-8 : Malt extract, 9-10 : Tryptone, 11-12 : Urea, 13-14 : NH4NO3, 15-16 : (NH4)2SO4, 17-18 : (NH4)2HPO4, 19-20 : Peptone을 나타낸다.FIG. 16 shows TLC analysis of the effect of nitrogen source on the production of DOD in palm oil using lane 1-2: Control, 3-4: Yeast extract, 5-6: Glutamine, 7-8: Malt extract, 9-10: Tryptone, 11-12: Urea, 13-14: NH 4 NO 3, 15-16: (NH 4) 2
도 17은 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 질소원 영향을 나타내는 그래프로서, 도 17의 (A)는 세포성장, 도 17의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.17 is a graph showing the effect of nitrogen source on the production of DOD when palm oil is used, in which FIG. 17 (A) shows cell growth and FIG. 17 (B) shows DOD yield.
도 17에서 보듯이, 미생물은 맥아 추출물, 트립톤, 펩톤을 제외한 나머지 질소원에서 높은 세포성장을 보여주고 있다. 그리고 요소, 인산암모늄, 질산암모늄ㅇ을 첨가한 배지에서 배지 50ml당 각각 39.6, 13.8, 25.2mg으로 DOD 생산량이 높게 확인되었지만, 혼합 질소원을 사용한 대조 배지에서의 DOD 생산량 61.5mg/50ml보다는 훨씬 낮은 수준으로 생산되었다.As shown in Fig. 17, the microorganisms show high cell growth in the nitrogen source except malt extract, tryptone, and peptone. The amount of DOD production was found to be 39.6, 13.8, and 25.2 mg, respectively, per 50 ml of medium containing urea, ammonium phosphate and ammonium nitrate. However, the DOD yield was much lower than the DOD yield of 61.5 mg / 50 ml in the control medium using mixed nitrogen source Respectively.
이러한 결과는 동일한 농도의 단일 질소원 배지보다 혼합 질소원 배지 이용하였을 때 DOD 생산에 더 효과적이라는 것을 보여준다. 그러나 요소는 유용성과 저비용 때문에 DOD 생산을 위한 최고 질소원인 것으로 간주되어 요소의 농도에 따른 DOD 생산에 미치는 영향에 대하여 실험을 진행하였다.These results show that the use of mixed nitrogen source medium is more effective for DOD production than single nitrogen source medium at the same concentration. However, due to its usefulness and low cost, urea was regarded as the top nitrogen source for DOD production, and the effect of the concentration of urea on DOD production was tested.
이어서, 팜 오일 이용 시 세포성장에 미치는 요소(urea) 농도별 영향을 실험하였다.Next, we examined the effects of urea concentration on cell growth when palm oil was used.
C/N 비는 발효공정 과정에서 민감한 변수로서 대사산물의 축적에 영향을 미친다. 높은 C/N 비는 세균생장을 제한하고, 대사 산물의 축적을 증가시킨다. 이전 실험의 바탕으로 요소의 농도에 따른 DOD 생산에 미치는 영향에 대하여 실험을 진행하였다. The C / N ratio affects the accumulation of metabolites as a sensitive parameter in the fermentation process. High C / N ratios limit bacterial growth and increase accumulation of metabolites. Based on the previous experiment, the effect of the concentration of urea on DOD production was investigated.
도 18은 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 요소 농도별 영향 TLC 분석을 나타내고, 도 18의 (A)는 48시간 추출, 도 18의 (B)는 72시간 추출을 나타내며, lane 1-2 : 대조, 3-4 : 10mM, 5-6 : 50mM, 7-8 : 100mM, 9-10 : 150mM, 11-12 : 200mM을 나타낸다.18 shows the TLC analysis on the effect of urea concentration on the production of DOD when palm oil is used, FIG. 18 (A) shows extraction for 48 hours, FIG. 18 (B) shows extraction for 72 hours, lane 1-2: 3-4: 10 mM, 5-6: 50 mM, 7-8: 100 mM, 9-10: 150 mM, and 11-12: 200 mM.
도 19는 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 요소 농도별 영향을 나타내는 그래프로서, 도 19의 (A)는 세포성장, 도 19의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.19 is a graph showing the effect of urea concentration on the production of DOD when palm oil is used, in which FIG. 19 (A) shows cell growth and FIG. 19 (B) shows DOD production.
도 19에서 보듯이 미생물은 요소 농도가 높을수록 증가하다가 100mM 이상에서는 급격하게 감소하는 것을 확인하였다. 하지만, DOD 생산량은 가장 낮은 농도인 10mM에서 가장 높았고, 요소 농도가 증가할수록 DOD 생산량은 감소하였다. 단일 질소원인 요소를 사용하였을 때보다 혼합질소원을 사용한 배지에서 DOD 생산성이 더 높게 나타났기 때문에 인산수소이암모늄(diammonium hydrogen phosphate)과 효모 추출물의 혼합 배지를 이용하여 다음 실험을 계속하였다.As shown in FIG. 19, the microorganism increased with increasing urea concentration and decreased rapidly at 100 mM or more. However, the DOD yield was the highest at 10 mM, the lowest concentration, and the DOD yield decreased with increasing urea concentration. Since the DOD productivity was higher in the medium with mixed nitrogen source than in the case of using the single nitrogen source element, the following experiment was continued using a mixed medium of diammonium hydrogen phosphate and yeast extract.
또한, 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 기질 농도별 영향을 실험하였다. In addition, the effect of substrate concentration on the DOD production was examined by using palm oil.
P. aeruginosa PR3 의해 올레산과 트리올레인(triolein)으로부터 생산된 DOD는 시간이 지남에 따라 미생물에 의해서 다시 소모되는 것으로 보여진다. 이러한 결과로 DOD 생산량은 충분한 기질을 공급해줌에 따라 증가될 수 있음을 의미한다. 그러므로 P. aeruginosa PR3 이용한 팜유로부터 효과적인 DOD 생산을 위한 최적 기질 농도를 찾는 실험을 실행하였다. DOD produced from oleic acid and triolein by P. aeruginosa PR3 appears to be consumed again by microorganisms over time. These results indicate that the DOD yield can be increased as a sufficient substrate is supplied. Therefore, P. aeruginosa Experiments were conducted to find the optimal substrate concentration for effective DOD production from palm oil using PR3.
도 20은 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 기질 농도별 영향 TLC 분석을 나타내며, 도 20의 (A)는 48시간 추출, 도 20의 (B)는 72시간 추출을 나타내며, lane 1-2 : 0.6%, 3-4 : 1.0%, 5-6 : 1.4%, 7-8 : 2.0%, 9-10 : 3.0%을 나타낸다.20 (A) shows extraction of 48 hours, FIG. 20 (B) shows extraction of 72 hours, and lane 1-2: 0.6%. FIG. 20 shows the TLC analysis on the effect of substrate concentration on the production of DOD, , 3-4: 1.0%, 5-6: 1.4%, 7-8: 2.0%, and 9-10: 3.0%.
도 21은 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 기질 농도별 영향을 나타내는 그래프로서, 도 21의 (A)는 세포성장, 도 21의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.FIG. 21 is a graph showing the influence of the substrate concentration on the production of DOD when palm oil is used, in which FIG. 21 (A) shows cell growth and FIG. 21 (B) shows DOD yield.
도 21에서 보는 바와 같이, 기질의 농도가 증가할수록 세포성장도 함께 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 기질의 농도가 0.6에서 1.4%(v/v)로 증가할수록 DOD 생산량은 증가하다가 더 높은 농도에서는 비슷한 생산량으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 최적기질의 농도는 1.4%(v/v)로 이전의 실험에서 1.0%(v/v)로 첨가하였을 때보다 약 1.5배 더 많은 DOD를 생산하였다. 이러한 결과는 특정 기질의 농도는 P. aeruginosa PR3에 의해 팜유로부터 효과적인 DOD 생산을 위해 요구된다는 것을 의미한다.As shown in FIG. 21, it was confirmed that cell growth also increased with increasing substrate concentration. It was found that as the substrate concentration increased from 0.6 to 1.4% (v / v), the DOD yield increased, while at the higher concentration, the same yield was maintained. The optimum substrate concentration was 1.4% (v / v), which was about 1.5 times higher than that in the previous experiment when added at 1.0% (v / v). These results indicate that the concentration of specific substrate is higher than that of P. aeruginosa It is required for effective DOD production from palm oil by PR3.
한편, 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 배양 온도별 영향을 실험하였다.On the other hand, the effect of culture temperature on DOD production was examined by using palm oil.
같은 농도의 P. aeruginosa cell를 배양한 후 20~27℃ 범위에서 DOD 생산을 위한 최적 배양온도를 조사하였다. 배양온도를 제외한 모든 배양 조건은 표준 조건으로 동일 시 하였다. The same concentration of P. aeruginosa cells were cultured and the optimum culture temperature for DOD production was examined at 20 ~ 27 ℃. All culture conditions except incubation temperature were the same under standard conditions.
도 22는 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 배양 온도별 영향 TLC 분석을 나타내며, 도 22의 (A)는 48시간 추출, 도 22의 (B)는 72시간 추출을 나타내며, lane 1-2 : 20℃, 3-4 : 25℃, 5-6 : 27℃, 7-8 : 30℃, 9-10 : 35℃, 11-12 : 40℃를 나타낸다.22 shows the TLC analysis on the influence of the culture temperature on the production of DOD on the palm oil use, in which FIG. 22 (A) shows extraction for 48 hours, FIG. 22 (B) shows extraction for 72 hours, 3-4: 25 ° C, 5-6: 27 ° C, 7-8: 30 ° C, 9-10: 35 ° C, and 11-12: 40 ° C.
도 23은 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 배양 온도별 영향을 나타내는 그래프로서, 도 23의 (A)는 세포성장, 도 23의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.23 is a graph showing the effect of culture temperature on the production of DOD when palm oil is used, in which FIG. 23 (A) shows cell growth and FIG. 23 (B) shows DOD yield.
도 23에서 보듯이 세포 성장은 온도가 높을수록 증가하는 경향을 보였다. 하지만, DOD 생산량은 27℃까지 점점 증가하다가 30℃에서부터는 감소하는 것을 확인 할 수 있었으며, 40℃ 이상에서는 DOD가 생산되지 않았다. 이전의 올리브유(olive oil)를 기질로 이용하였을 때 20~30℃에서 DOD가 생산되는 것과 유사한 결과를 보여주었다. 27℃에서 배양하였을 때 DOD 생산량은 약 2.8g/L로 71%의 수율을 나타냈다.As shown in FIG. 23, cell growth tended to increase with increasing temperature. However, DOD production increased gradually to 27 ℃, but decreased from 30 ℃. DOD was not produced at above 40 ℃. When olive oil was used as a substrate, DOD was produced at 20 ~ 30 ℃. When cultured at 27 ℃, the yield of DOD was about 2.8 g / L, yielding 71%.
이 결과를 바탕으로 팜유를 이용한 최적 DOD 생산 온도는 27℃임을 확인하였고, 이 조건으로 다음 실험을 진행하였다.Based on these results, it was confirmed that the optimum DOD production temperature using palm oil was 27 ℃.
또한, 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 pH 별 영향을 실험하였다. In addition, the effect of pH on the production of DOD when palm oil was used was examined.
pH 3~10 범위에서 배지의 초기 pH가 DOD 생산에 미치는 영향에 대해 실험을 진행하였다. 전반적으로 알칼리성일 때 DOD 생산성이 좋았으며 특히 pH 8~9 사이에서 DOD 생산량이 최대가 되었다. 또한, 산성인 pH 6 이하에서는 DOD가 거의 생산되지 않았음을 확인할 수 있었다. 이는 DOD 생산성은 산성보다는 알칼리성 환경에서 더 높음을 보여준다. 하지만, 세포성장은 pH 7에서 가장 높았으며, 그 이상에서는 감소하였다. pH 6에서 pH 7에서의 최대값의 약 50%의 세포성장을 보여주었지만 DOD는 거의 생산되지 않았다. 이것은 올리브유를 기질로 DOD를 생산하였을 때 pH의 영향과 일치하는 결과를 나타낸다. The effect of initial pH of the medium on the DOD production was examined in the range of
DOD의 생산량은 pH 8에서 약 1.7g/L로 최대가 되었으며, pH 8을 초기 배지의 pH로 고정하여 실험을 계속하였다.The yield of DOD was maximized to about 1.7 g / L at
도 24는 팜 오일 이용시 DOD 생산에 미치는 pH별 영향 TLC 분석을 나타내며, 도 24의 (A)는 48시간 추출, 도 24의 (B)는 72시간 추출을 나타내고, lane 1-2 : pH5, 3-4 : pH6, 5-6 : pH7, 7-8 : pH8, 9-10 : pH10, 11-12 : pH11를 나타낸다.24 (A) shows extraction for 48 hours, FIG. 24 (B) shows extraction for 72 hours, and lane 1-2:
도 25는 팜 오일 이용 시 DOD 생산에 미치는 pH 별 영향을 나타내는 그래프로서, 도 25의 (A)는 세포성장, 도 25의 (B)는 DOD 생산량을 나타낸다.25 is a graph showing influences of pH on production of DOD when palm oil is used, in which FIG. 25 (A) shows cell growth and FIG. 25 (B) shows DOD yield.
다음에 본 발명에 따라 팜 오일을 이용한 DOD 대량생산에 대해 설명한다.Next, mass production of DOD using palm oil will be described according to the present invention.
상술한 바와 같은 실험 결과를 바탕으로 팜 오일을 이용한 DOD 대량생산을 실행하였다. Based on the experimental results described above, DOD mass production using palm oil was carried out.
5L의 배양기를 이용하여 팜 오일을 각각 1%(v/v), 1.5%(v/v)를 첨가하였을 때 배양시간에 따른 DOD 생산량을 비교하였다. (V / v) and 1.5% (v / v) of palm oil, respectively, using a 5 L incubator.
도 26은 본 발명에 따라 팜 오일을 이용한 DOD 대량생산을 위한 장치를 나타내며, 5L 배양기를 이용한 DOD 대량생산 과정을 나타낸 사진이다.26 shows a device for mass production of DOD using palm oil according to the present invention and shows a process of mass production of DOD using a 5 L incubator.
도 27은 DOD 대량생산을 위한 팜 오일 농도에 따른 DOD 생산성 비교를 나타내는 그래프로서, 도 27의 (A)는 팜 오일 1.0%(v/v) 첨가, 도 27의 (B)는 팜 오일 1.5%(v/v) 첨가를 나타낸다.27 is a graph showing a comparison of DOD productivity according to the palm oil concentration for mass production of DOD. Fig. 27 (A) shows the addition of 1.0% (v / v) palm oil, (v / v) addition.
도 27에서 보듯이 DOD 생산량은 시간이 지날수록 점점 증가하다가 72시간에 생산량이 최대가 되었으며, 그 이후에는 서서히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 최적 배양시간인 72시간에 DOD 생산량은 기질을 1%(v/v) 첨가하였을 때보다 1.5%(v/v) 첨가하였을 때 각각 1.95g/L와 3.35g/L로 약 1.7배 더 높은 생산성을 보였으며, 57%의 수율을 나타냈다. 이전의 실험에서 올리브유를 기질로 이용하여 펙페드배치(d-batch)를 하는 경우 DOD 생산량은 12g/L로 배치(batch) 결과보다 약 3.5배 정도 높은 생산성을 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 팜 오일을 기질로 이용하여 페드배치로 DOD를 생산할 경우 약 80% 이상의 생산수율을 기대할 수 있다.As shown in FIG. 27, the DOD production gradually increased with time, and the yield was maximized at 72 hours and gradually decreased thereafter. The optimum DOD production time was 72 hrs. The productivity of DOD was 1.95g / L and 3.35g / L, respectively, about 1.7 times higher than that of 1% (v / v) And showed a yield of 57%. In the previous experiment, when the olive oil was used as a substrate and the d-batch was performed, the DOD yield was 12 g / L, which was about 3.5 times higher than the batch result. Based on these results, it can be expected that the production yield of the DOD is about 80% or more when the palm oil is used as the substrate and the DOD is produced by the batch arrangement.
이하, 상술한 바와 같이 제조된 DOD를 정제하여 제형화하는 과정(S60)에 대해 설명한다.Hereinafter, the process (S60) of purifying DOD prepared as described above and formulating it will be described.
먼저, 작물별 원인균에 대한 DOD 항균활성 검증실험을 하였다.First, the DOD antimicrobial activity test was performed on the causative bacteria of each crop.
상기 단계 S50에서 생산된 DOD를 정제하여(S60) 작물별 원인균에 대한 항균활성 실험을 진행하였다. 실험에 사용한 식물성 병원균은 표 2와 같이 세균성 병원균 8종, 곰팡이병원균 6종으로 항균활성 테스트를 하였다.The DOD produced in the above step S50 was purified (S60), and the antimicrobial activity test for the causative microorganism of each crop was carried out. As shown in Table 2, 8 kinds of bacterial pathogens and 6 kinds of fungal pathogens were tested for antimicrobial activity.
표 2는 DOD 항균활성 실험을 위한 식물병원균 종류를 나타낸다.Table 2 shows the kinds of plant pathogens for the DOD antibacterial activity test.
또 세균성 병원균에 대한 DOD의 항균활성을 실험하였다.The antimicrobial activity of DOD against bacterial pathogens was also examined.
원인세균 대해 한천 배지 위에서 plate diffusion assay를 이용하여 투명대(clear zone)의 크기를 확인하여 항균활성을 측정하였다. DOD 농도는 0.5~2.0mg의 범위로 DMSO 20㎕에 녹여 이용하였고, 양성 대조군(positive control)은 페니실린(penicillin)과 겐타마이신(gentamicin)을 사용하였다.Bacteria were assayed for antimicrobial activity by determining the size of the clear zone using plate diffusion assay on agar medium. DOD concentration was dissolved in 20 μl of DMSO in the range of 0.5 to 2.0 mg. Penicillin and gentamicin were used as positive controls.
도 28에서 보는 바와 같이 마름병 원인균인 Pseudomonas syringae pv. Syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris KACC 10490와 궤양병 원인균인 Xanthomonasaxonopodispv. citriKACC 10443, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis에서 DOD에 대한 항균활성을 보여주었다. 하지만, 점무늬병, 시들음병, 무름병의 원인균에 대해서는 DOD에 대한 항균활성이 나타나지 않았다.As shown in Fig. 28, Pseudomonas syringae pv. Syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris KACC 10490 and Xanthomonasaxonopodispv. citriKACC 10443, Clavibacter michiganensis subsp. showed antimicrobial activity against DOD in michiganensis. However, no antimicrobial activity against DOD was observed in the causative bacteria of spotted, wilted, or cloudless disease.
도 28은 세균성 병원균에 대한 DOD의 항균활성을 나타내는 사진으로서, (A) Pseudomonas syringae pv. Syringae, (B) Ralstonia solanacearum, (c) Xanthomonas campestris KACC 10490, (D) Pseudomonas syringae pv. Sesami, (E) Erwinia sp, (F) Xanthomonas axonopodis pv. citri KACC 10443, (G) Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis corrig, (H) Pseudomonas syringae pv. actinidiae이고, Disk No. 1: DOD-MG 0.5mg, 2: DOD 0.5mg, 3: DOD 1.0mg, 4: DOD 1.5mg, 5: DOD 2.0mg, 6: Penicillin 10㎍, 7: Gentamicin 10㎍, 8: DMSO 20㎕이다.FIG. 28 is a photograph showing the antibacterial activity of DOD against bacterial pathogens. (A) Pseudomonas syringae pv. Syringae, (B) Ralstonia solanacearum, (c) Xanthomonas campestris KACC 10490, (D) Pseudomonas syringae pv. Sesami, (E) Erwinia sp, (F) Xanthomonas axonopodis pv. citri KACC 10443, (G) Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis corrig, (H) Pseudomonas syringae pv. actinidiae, < / RTI > 1: DOD-MG 0.5 mg, 2: DOD 0.5 mg, 3: DOD 1.0 mg, 4: DOD 1.5 mg, 5: DOD 2.0 mg, 6:
이 결과를 바탕으로 식물성 세균병 원인균에 대한 DOD의 최소처리 농도를 측정하는 실험을 진행하였다. 액체 배지를 이용하여 1.95~500㎍/㎖ 범위의 농도로 DOD를 처리하여 MIC(최소억제농도) 값을 측정하였다.Based on these results, an experiment was conducted to measure the minimum treatment concentration of DOD for the causative organisms of botanical germs. The MIC (minimum inhibitory concentration) value was measured by treating DOD at a concentration ranging from 1.95 to 500 μg / ml using a liquid medium.
표 3에서 보듯이 MIC50 값은 궤양병 원인균인 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis에서 125㎍/㎖로 가장 낮았고, 그 다음으로 마름병 원인균인 Pseudomonas syringae pv. Syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris KACC 10490와 궤양병 원인균인 Xanthomonas axonopodis pv. citri KACC 10443이 250㎍/㎖로 낮은 값을 나타냈다.As shown in Table 3, MIC 50 The value of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis was the lowest at 125 ㎍ / ㎖, followed by Pseudomonas syringae pv. Syringae, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris KACC 10490 and Xanthomonas axonopodis pv. citri KACC 10443 showed a low value of 250 / / ml.
이 결과를 바탕으로 MIC50 값의 범위인 125~500㎍/mL보다 더 높은 농도로 DOD를 처리하였을 경우 약 70~90%의 세균성 병원균에 대한 억제력이 있다는 것을 확인할 수 있었으며 또한, DOD가 마름병 원인균과 궤양병 원인균에 대하여 강한 항균활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.Based on these results, it was confirmed that DOD treatment at a concentration higher than 125-500 ㎍ / mL, which is the range of MIC 50 value, inhibits about 70 ~ 90% of bacterial pathogens. Also, And it showed strong antimicrobial activity against pathogenic bacteria.
표 3은 세균성 병원균에 대한 DOD의 최소저해농도를 나타내는 표이다.Table 3 is a table showing the minimum inhibitory concentrations of DOD against bacterial pathogens.
이러한 결과를 보아 DOD가 마름병 원인균과 궤양병 원인균에 대하여 강한 항균활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.These results suggest that DOD has a strong antimicrobial activity against pathogenic bacteria and pathogenic bacteria.
다음에 곰팡이에 대한 DOD의 항균활성을 실험하였다.Next, the antimicrobial activity of DOD against fungi was examined.
곰팡이에 대해 한천 배지 위에서 plate diffusion assay를 이용하여 투명대의 크기를 확인하여 항균활성을 측정하였다. DOD는 농도는 1mg~5mg의 범위로 DMSO 10㎕에 녹여 이용하였고 양성 대조군은 케토코나졸(Ketoconazole)을 사용하였다.The antimicrobial activity of the fungi was determined by measuring the size of the zona pellucida using plate diffusion assay on agar medium. DOD was dissolved in 10 μl of DMSO at a concentration ranging from 1 mg to 5 mg, and ketoconazole (Ketoconazole) was used as a positive control.
도 29에서 보듯이, Rhizoctonia solani AG-1(IA) KACC 40101, Corynespora cassiicola KACC 40964, Colletotrichumgloeosporioides KACC 40690, Botrytis cinerea KACC 40574에 대해서는 DOD 대한 항균활성이 나타나지 않았다. 하지만, 겹무늬병인 Botryosphaeria dothidea KACC 45481에 대해서는 투명대를 측정할 수 있었고 DOD에 대한 항균활성이 있음을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 29, there was no antimicrobial activity against DOD for Rhizoctonia solani AG-1 (IA) KACC 40101, Corynespora cassiicola KACC 40964, Colletotrichum gloeosporioides KACC 40690 and Botrytis cinerea KACC 40574. However, for the Botryosphaeria dothidea KACC 45481, a zona pellucida, the zona pellucida could be measured and the antimicrobial activity against DOD was confirmed.
도 29는 곰팡이에 대한 DOD의 항균활성을 나타내고, (A) Rhizoctonia solani AG-1(IA) KACC 40101, (B) Corynespora cassiicola KACC 40964, (C) Colletotrichum gloeosporioides KACC 40690, (D) Colletotrichum acutatum KACC 40805, (E) Botryosphaeria dothidea KACC 45481 (F) Botrytis cinerea KACC 40574이고, Disk No. 1: Ketoconazole 25㎍, 2: DOD 1mg, 3: DOD 3mg, 4: DOD 5mg, 5: DMSO 10㎕이다.(A) Rhizoctonia solani AG-1 (IA) KACC 40101, (B) Corynespora cassiicola KACC 40964, (C) Colletotrichum gloeosporioides KACC 40690, (D) Colletotrichum acutatum KACC 40805 , (E) Botryosphaeria dothidea KACC 45481 (F) Botrytis cinerea KACC 40574; 1: 25 μg of ketoconazole, 2: 1 mg of DOD, 3 mg of DOD, 4 mg of DOD, and 5 μl of DMSO.
다음에 DOD 제제화를 위한 보조제 선발에 대해 설명한다.Next, selection of supplements for DOD formulation will be described.
생산된 DOD의 안정성 및 효능 향상을 위하여 보조제 선정을 위한 실험을 진행하였다. In order to improve the stability and efficacy of the produced DOD, an experiment was conducted to select an adjuvant.
보조제는 일반적인 농업용으로 사용되고 있는 비이온화 계면활성제 중 분산성이 높고 안정성이 입증된 5종의 계면활성제에 대하여 물리적 특성을 검토하였다(표 4). 5종의 계면활성제는 농림축산식품부령 친환경농어업 육성 및 유기식품 등의 관리 지원에 관한 법률 시행규칙에 명시된 미국 환경보호국(EPA)에서 정하는 농약제품에 허가된 불활성 성분목록(Inert Ingredients List) 3 또는 4에 해당하는 보조제로서 유기농업자재 제조 시 보조제로 사용가능한 물질만을 선택하였다.Among the non-ionic surfactants used in general agriculture, the adjuvants were examined for their physical properties for five surfactants with high dispersibility and proven stability (Table 4). Five types of surfactants are listed in the Inert Ingredients List 3 (approved by the US Environmental Protection Agency (EPA) as specified in the Enforcement Regulations of the Act on the Promotion of Environmentally Friendly Farming and Fisheries and the Support for Organic Foods) 4, only the substances that can be used as auxiliary agents in the production of organic agricultural materials were selected.
표 4는 본 발명에 따른 시험에 사용된 보조제를 나타낸다.Table 4 shows the adjuvants used in the tests according to the invention.
보조제에 대한 확산 실험, 부착력 실험, 건조시간 실험, 소포력 실험을 진행하였으며, 확산 실험은 평평한 탁자 위에 각각의 보조제를 희석배수 2,000배로 하여, 20㎕씩 3번씩 떨어뜨린 후 4분 뒤 확산면적을 조사하였고, 부착력 실험은 각각의 보조제를 희석배수 2,000배로 하여, 비커에 고추잎을 5초간 침지시킨 후 시험탁자에 올려놓고 비교하였고, 건조시간 실험은 각각의 보조제를 희석배수 2,000배로 하여, 비커에 고추잎을 5초간 침지시킨 후 시험탁자에 올려놓고 시험약제가 90%이상 건조된 시간을 측정하였다. 또, 소포력 시험 각각의 보조제를 희석배수 2,000배로 하여, 정량플라스크 넣고 20회 흔들어 비커에 따른 후 10분 후 소포되는 모양을 비교하였다. 또한, 각각의 보조제의 식물체 안정성을 검증하기 위하여 희석배수 2,000배, 1,000배, 500배, 250배로 하여, 토마토 모종에 스프레이하여 약해 정도를 확인하였다.Diffusion experiments, adhesion experiments, drying time experiments and vesiculation experiments were carried out. The diffusion experiments were performed by diluting each adjuvant with a dilution factor of 2,000 on a flat table, dropping 3 times by 20, and spreading area after 4 minutes The test was carried out by immersing the pepper leaves in a beaker for 5 seconds and placing them on the test table. The drying time experiment was performed by diluting the supplements to 2,000 times, The pepper leaves were immersed for 5 seconds, placed on a test table, and the time when the test agent was dried by 90% or more was measured. The suppositories of each of the suppository tests were diluted 2,000 times, and then the suppositories were shaken 20 times in a constant volume flask, and 10 minutes after the beakers were dispensed. In order to verify the plant stability of each adjuvant, the degree of weakness was confirmed by spraying tomato seedlings at a dilution of 2,000 times, 1,000 times, 500 times, and 250 times.
각각의 보조제로 시험탁자 위에서 확산시험을 한 결과, 확산이 가장 좋은 보조제는 폴리옥시에틸렌 도데실 모노에테르(polyoxyethylene dodecyl monoether)이었으며, 그 다음으로는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate), 폴리옥시에틸렌 알킬 아민 에테르(polyoxyethyelene alkyl amine ether), polyoxyethylene (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether, sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate 순이었다.Diffusion tests were performed on the test table with each adjuvant. As a result, the best adjuvant was polyoxyethylene dodecyl monoether, followed by polyoxyethylene sorbitan monooleate, , Polyoxyethylene alkylamine ether, polyoxyethylene (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether and sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate.
표 5는 보조제별 확산 정도를 나타낸다.Table 5 shows the degree of diffusion for each adjuvant.
각각의 보조제를 고춧잎에 침지시킨 후 결과, 가장 부착력이 좋았던 약제는 폴리옥시에틸렌 도데실 모노에테르이었으며, 그 다음으로 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, polyoxyethylene (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether, 폴리옥시에틸렌 알킬 아민 에테르는 비슷한 결과를 나타내었으며, Sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate 보조제 중 가장 부착력이 좋지 않았다.As a result, the most adherent agent was polyoxyethylene dodecyl monoether, followed by polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether, and polyoxyethylene alkylamine ether showed similar results, and the adhesion of sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate was the poorest.
표 6은 본 발명에 적용되는 보조제별 부착 정도를 나타낸다.Table 6 shows the degree of adhesion of the adjuvant applied to the present invention.
건조시간 시험에 대한 실험 결과, 고춧잎이 가장 빠르게 건조되는 보조제는 polyoxyethylene sorbitan monooleate이었으며, 그 다음으로는 polyoxyethylene dodecyl monoether, polyoxyethylene (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether, Polyoxyethyelene alkyl amine ether, Sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate 순이었다.As a result of the drying time test, it was found that polyoxyethylene sorbitan monooleate was the most rapid drying agent for the pepper leaf, followed by polyoxyethylene dodecyl monoether, polyoxyethylene (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether, bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate.
표 7은 본 발명에 적용되는 보조제별 건조시간을 나타낸다.Table 7 shows the drying time of the auxiliary agent applied to the present invention.
소포력 시험 결과, 가장 소포력이 좋았던 보조제는 polyoxyethylene dodecyl monoether이었으며, 그 다음으로는 polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether이었으며, Sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate, Polyoxyethyelene alkyl amine ether는 소포력이 가장 안 좋은 것으로 나타났다.As a result of the puffing test, polyoxyethylene dodecyl monoether, polyoxyethylene sorbitan monooleate, and polyoxyethylene (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl ether were the best suppositories. Sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate, Polyoxyethyelene alkyl amine ether showed the worst vesicle force.
표 8은 본 발명에 적용되는 보조제별 소포력을 나타낸다.Table 8 shows the squeezing force of the adjuvant applied to the present invention.
보조제의 약해 정도를 실험 결과, 농가에서 일반적으로 많이 사용하는 희석배수인 1,000배의 경우 Polyoxyethyelene alkyl amine ether에서만 약한 약해증상이 나타났으며, 500배의 경우 Polyoxyethylene dodecyl monoether와 Sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate에서 약한 약해 증상이 나타났다. As a result of the experiment, the degree of weakness of the adjuvant was found to be weak in Polyoxyethyelene alkyl amine ether only at a dilution ratio of 1,000 times, which is commonly used in a farmhouse. Polyoxyethylene dodecyl monoether and sodium bis (2-ethylhexyl) Sulfosuccinate showed weak mild symptoms.
따라서 보조제에 대한 종합적인 실험 결과 효과는 Polyoxyethylene dodecyl monoether보다 약간 낮지만, 안정성에서 뛰어난 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Polyoxyethylene sorbitan monooleate)를 보조제로 선택하는 것이 효율적으로 판단할 수 있었다.Therefore, it was concluded that polyoxyethylene sorbitan monooleate (polyoxyethylene sorbitan monooleate), which is superior in stability to polyoxyethylene dodecyl monoether, was selected as an adjuvant.
표 9는 본 발명에 적용되는 보조제별 약해 정도를 나타낸다.Table 9 shows the degree of weakness according to the adjuvant applied to the present invention.
다음에 본 발명에 따라 DOD 제제화를 위한 최적 배합 결정을 실험하였다.Next, the optimal formulation for DOD formulation was experimented according to the present invention.
상술한 바와 같은 실험에서 나온 결론을 토대로 최적 배합조건인 표 10의 조성으로 DOD 제제 샘플을 제조하여, 식물 병원균에 대한 항균활성을 측정하였다. Based on the conclusions from the experiments described above, DOD preparation samples were prepared with the composition of Table 10, which is the optimum mixing condition, and the antimicrobial activity against plant pathogenic bacteria was measured.
표 10은 본 발명에 따른 DOD 제제의 최적 배합 조성을 나타낸다.Table 10 shows the optimal formulation of the DOD formulation according to the present invention.
또한, 시제품으로 제작 시 안정성을 확인하기 위해 54±2℃에서 14일 동안, 0±2℃에서 7일 동안 경시변화실험을 통해 물리성 변화, 식물 병원균에 대한 항균활성을 측정하였다. In order to confirm the stability of the prototype product, physical changes and antimicrobial activity against plant pathogens were measured by aging test at 54 ± 2 ° C for 14 days and 0 ± 2 ° C for 7 days.
경시변화는 농촌진흥청 고시 '생물농약의 등록시험방법 및 등록신청서류 검토기준'의 '경시변화 시험기준과 방법(미생물농약 및 생화학농약 공통)'에 준하여 실시하였다.The aging change was carried out according to the 'criteria and method of aging change test (common to microbial pesticides and biochemical pesticides)' of the 'Examination methods for registration of biological pesticides and registration application documents' notified by Rural Development Administration.
물리성 변화는 희석 시 육안검사를 통하여 판단하였으며, 식물 병원균에 대한 항균활성은 DOD에 대해 감수성이 뛰어난 Pseudomonas syringae pv. Syringae, Ralstonia solanacearum에 대해 한천 배지 위에서 plate diffusion assay를 이용하여 투명대의 크기를 확인하여 측정하였다. 양성 대조군은 겐타마이신을 사용하였다.Changes in physical properties were determined by visual inspection at dilution. Antimicrobial activity against plant pathogenic bacteria was evaluated by Pseudomonas syringae pv. Syringae, and Ralstonia solanacearum were determined by using plate diffusion assay on agar medium. Gentamicin was used as a positive control.
표10에서 보는 바와 같이 각 조성별 Pseudomonas syringae pv. Syringae, Ralstonia solanacearum에 대한 항균활성은 Pseudomonas syringae pv. Syringae에 대해 G-2, G-3, G-4와 T-3, T-4 조성에서 활성이 높게 나왔으며, Ralstonia solanacearum에 대해 G-3, G-4, G-5와 T-2, T-3, T-4 조성에서 높은 항균활성을 보여주었다. As shown in Table 10, Pseudomonas syringae pv. The antimicrobial activity against Syringae and Ralstonia solanacearum was Pseudomonas syringae pv. G-3, G-4, G-5, T-2, and G-4 for Ralstonia solanacearum. T-3, and T-4.
도 30은 세균성 병원균에 대한 DOD 제제 조성별 항균활성을 나타내고, (A) Pseudomonas syringae pv. Syringae, (B) Ralstonia solanacearum이고, A-1, B-1 Disk No. 1: Gentamicin 10㎍/10㎕, 2: G-1 ×10 희석액 10㎕, 3: G-2 ×10 희석액 10㎕, 4: G-3 ×10 희석액 10㎕, 5: G-4 ×10 희석액 10㎕, 6: G-5 ×10 희석액 10㎕, 7: DMSO 10㎕이며, A-2, B-2 Disk No. 1: Gentamicin 10㎍/10㎕, 2: T-1 ×10 희석액 10㎕, 3: T-2 ×10 희석액 10㎕, 4: T-3 ×10 희석액 10㎕ , 5: T-4 ×10 희석액 10㎕, 6: T-5 ×10 희석액 10㎕, 7: DMSO 10㎕이다.30 shows antimicrobial activity of each DOD preparation composition against bacterial pathogens. (A) Pseudomonas syringae pv. Syringae, (B) Ralstonia solanacearum, and A-1, B-1 Disc No. 1. 1: 10 μg / 10 μl of Gentamicin, 2 μl of G-1 × 10 dilution, 10 μl of 3: G-2 × 10 dilution, 10 μl of 4: 10 μl of 6: G-5 × 10 dilution, and 10 μl of 7: DMSO. 1: 10 μg / 10 μl of gentamicin, 2 μl of T-1 × 10 dilution, 10 μl of 3: T-2 × 10 dilution, 10 μl of 4: 10 μl of 6: T-5 × 10 dilution, and 10 μl of 7: DMSO.
가열 안정성 시험(54±2℃에서 14일) 결과 모든 조성에서 물리성의 변화는 없었으나, 항균활성은 G-5, T-4, T-5 조성이 뛰어난 것으로 나타났다.As a result of the heating stability test (14 days at 54 ± 2 ° C), there was no change in physical properties in all the compositions, but the antimicrobial activity showed excellent compositions of G-5, T-4 and T-5.
표 11은 세균성 병원균에 대한 DOD 제제 조성별 플레이트 상의 투명대(mm)를 나타낸다. Table 11 shows the plate clearance (mm) on a plate by DOD formulation composition for bacterial pathogens.
가열안정성시험(54±2℃에서 14일) 결과 모든 조성에서 물리성의 변화는 없었으나, 항균활성은 G-4, T-4 조성이 뛰어난 것으로 나타났다.As a result of the heating stability test (14 days at 54 ± 2 ° C), there was no change in physical properties in all the compositions, but the antimicrobial activity showed excellent G-4 and T-4 composition.
표 12는 조성별 가열 안정성 시험을 나타낸다.Table 12 shows the heating stability test by composition.
저온 안정성 시험(0±2℃에서 7일) 결과 게라니올(geraniol)이 들어간 조성에서 층이 분리되는 증상이 있었으며, 항균활성은 G-2, G-3, G-4, G-5, T-3, T-4, T-5 조성이 뛰어난 것으로 나타났다.G-2, G-3, G-4, G-5, and G-5 were found to have a layer separation at the composition containing geraniol as a result of low temperature stability test (7 days at 0 ± 2 ° C) T-3, T-4 and T-5.
표 13은 조성별 저온 안정성 시험을 나타낸다.Table 13 shows the low temperature stability test by composition.
이상의 결과에서 DOD 제제화를 위한 최적 배합은 T-4 조성이 효과나 안정성, 경제성 면에서 적합한 것으로 나타났다. 또한 경시변화 기준상 54±2℃에서 14일 동안 안정적인 것은 1년 동안 효능이 보증됨을 나타내므로 시제품의 보증기간을 1년 이상으로 설정하여도 무방함을 알 수 있었다. From the above results, it was found that the optimal formulation for DOD formulation was suitable for the T-4 composition in terms of effectiveness, stability, and economy. In addition, it is shown that the stable period of 14 days at 54 ± 2 ℃ over the aging change standard indicates that the efficacy is guaranteed for 1 year, so it is also possible to set the guarantee period of the prototype to 1 year or more.
표 14는 DOD 제제의 최적 배합 조성을 나타낸다.Table 14 shows the optimum composition of the DOD preparation.
이상의 실험 결과에서 도출된 DOD 제제의 최적 배합 조성으로 도 31의 제조공정을 통해 시제품을 제조하여 고추의 풋마름병에 대한 포트(pot) 실험을 수행하였다. 도 31은 본 발명에 따른 시제품의 제조 공정을 나타낸다.As a result of the above experiment, a prototype product was manufactured through the manufacturing process of FIG. 31 as an optimal combination composition of the DOD preparation, and a pot experiment for pepper foot wilt was performed. 31 shows a manufacturing process of a prototype product according to the present invention.
지름 10cm의 포트에 상토를 채우고 모종을 식재하여 4엽기가 되었을 때 풋마름병의 원인균인 Ralstonia solanacearum 현탁액을 30mL(107cfu/mL)씩 관주하여 발병을 유도하였으며, 발병 억제효과를 4주간 관찰하였다. A 10 cm diameter port was filled with seedlings and seedlings were planted to induce the onset of Ralstonia solanacearum suspension, which is a causative agent of foot rot disease, at 30 days (10 7 cfu / mL) at 4th leaf stage, and the onset inhibition effect was observed for 4 weeks .
DOD 제제의 처리는 병원균 처리 7일 전 1회, 처리 후 7일 간격으로 4회 총 5회 10mL/3.3m2를 정량으로 하여 반량, 정량, 배량 관주 처리하였다.DOD preparation was treated once, 7 days before pathogen treatment, and 7
Ralstonia solanacearum 처리 후 평균 8일 후 발병증세를 보였으며, 각 처리마다 9주씩 3반복으로 실험하여 평균값을 구하였다. 현장에서 시제품의 약해 유무를 판단하기 위해 약제 처리 7일 후마다 약해유무를 관찰하였다. 약해 평가는 농촌진흥청 고시 '농약의 등록시험 기준과 방법'의 '약해시험의 기준과 방법'에 준하여 실시하였다. 또한, 처리된 약제의 안정성 확인을 위하여 잔류독성 검사를 실시하였다.Ralstonia solanacearum was observed on average 8 days after treatment, and each treatment was repeated three times for 9 weeks to obtain the mean value. In order to determine whether the prototype was weak or not at the site, the presence or absence of the weakness was observed every 7 days after the treatment. The evaluation of the weakness was carried out according to the 'criteria and method of the weak test' of the 'Pesticide registration test standards and methods' notified by Rural Development Administration. Residual toxicity tests were also conducted to confirm the stability of the treated medicines.
고추 풋마름병에 대해 무처리구는 최종 조사에서 92.6%의 발병율을 보였으나, 정량 처리구(10mL/3.3m2)의 경우 25.9%의 발병율과 73.3%의 방제가를 보였다. 배량 처리구(20mL/3.3m2)의 경우 18.5%의 발병율과 81.3%의 방제가를 보여 정량 처리시 70% 이상의 방제 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 또한 5회에 걸친 처리에 있어 모든 처리구에서 약해가 발생하지 않았으며, 잔류독성평가 결과 독성물질이 불검출되어 DOD 제제의 안정성을 확인할 수 있었다.In the final study, the incidence of incontinence of pepper foot blight was 92.6%, but the incidence rate of 25.9% and the control value of 73.3% in the quantitative treatment (10mL / 3.3m 2 ) were shown. In the case of the dose (20 mL / 3.3 m 2 ), the incidence rate was 18.5% and the control value was 81.3%. In addition, no toxicity was detected in all treatments for 5 treatments, and toxicity was not detected as a result of the residual toxicity test, which confirmed the stability of the DOD preparation.
표 15는 시제품의 처리 회수별 고추 풋마름병 방제가를 나타낸다.Table 15 shows the control of pepper foot wilt disease according to the number of treatments of the prototype.
표 16은 시제품의 처리 후 약해 발생 유무를 나타낸다.Table 16 shows the occurrence of the weakness after the treatment of the prototype.
이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.Although the present invention has been described in detail with reference to the above embodiments, it is needless to say that the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications may be made without departing from the spirit of the present invention.
본 발명에 따른 하이드록시 지방산의 제형 및 그 제조방법을 사용하는 것에 의해 과일가공 부산물인 과실류 씨앗으로부터 DOD를 저비용/고효율로 최적 화 하여 제형화할 수 있다.By using the hydroxy fatty acid formulation and the manufacturing method according to the present invention, it is possible to optimize DOD from Fruit Seed which is a byproduct of fruit processing at a low cost / high efficiency and formulate it.
Claims (4)
(a) 복숭아 씨, 천도복숭아 씨, 자두 씨, 매실 씨 중의 어느 하나의 씨앗을 마련하고, 분리한 다음 분쇄하여 추출하는 단계,
(b) 상기 단계 (a)에서 추출된 씨앗과 노멀 헥산(n-hexane)을 1:3의 부피 비율로 혼합하고, 침지시킨 후 상층액을 분리하고 농축하여 농축액을 마련하는 단계,
(c) 상기 단계 (b)에서 마련된 농축액을 이용하여 하이드록시 지방산을 생성하는 단계,
(d) 하이드록시 지방산에 보조제를 투입하여 제형화하는 단계를 포함하고,
상기 단계 (c)는 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PR3 균주를 배양한 뒤 상기 농축액인 기질의 농도를 2.0%(v/v)의 비율로 배지에 첨가하여 48~72시간 배양하여 실행되며,
상기 단계 (d)에서는 하이드록시 지방산 0.75g에 Thymol 4g 및 Ethanol 17mL와 상기 보조제로서 Dimethyl sulfoxide 8mL과 Polyoxyethylene sorbitan monooleate 75mL을 투입하여 제형화하는 것을 특징으로 하는 DOD(dihydroxy octadecenoic acid)의 제형화 방법.A method of formulating a dihydroxy octadecenoic acid,
(a) preparing seeds of any one of peach seed, peach seed, plum seed and plum seed, separating and then pulverizing and extracting seeds,
(b) mixing the seeds extracted in the step (a) with n-hexane in a volume ratio of 1: 3, and separating the supernatant and concentrating the concentrate to prepare a concentrate,
(c) producing a hydroxy fatty acid using the concentrate prepared in the step (b)
(d) adding an adjuvant to the hydroxy fatty acid to formulate it,
Wherein said step (c) comprises the step of contacting Pseudomonas aeruginosa The PR3 strain is cultured, and the concentration of the substrate, which is the concentrate, is added to the medium at a ratio of 2.0% (v / v) and cultured for 48 to 72 hours.
In step (d), 4 g of Thymol and 17 ml of ethanol are added to 0.75 g of hydroxy fatty acid, and 8 ml of dimethyl sulfoxide and 75 ml of polyoxyethylene sorbitan monooleate are added as the adjuvant, thereby forming a DOD (dihydroxy octadecenoic acid) formulation.
하이드록시 지방산에 보조제를 투입하여 제형화하는 단계를 포함하고,
상기 제형화하는 단계에서는 하이드록시 지방산 0.75g에 Thymol 4g 및 Ethanol 17mL와 상기 보조제로서 Dimethyl sulfoxide 8mL과 Polyoxyethylene sorbitan monooleate 75mL을 투입하여 제형화하는 것을 특징으로 하는 DOD(dihydroxy octadecenoic acid)의 제형화 방법.A step of using a palm oil containing oleic acid as a substrate and a Pseudomonas aeruginosa microorganism to form a hydroxy fatty acid;
A step of injecting an adjuvant into the hydroxy fatty acid to formulate it,
Wherein the formulation is carried out by adding 4 g of Thymol and 17 mL of ethanol to 0.75 g of hydroxy fatty acid, and adding 8 mL of dimethyl sulfoxide and 75 mL of polyoxyethylene sorbitan monooleate as the adjuvant to the DOD (dihydroxy octadecenoic acid) formulation.
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