KR101726954B1 - Novel portable device for cell lysis comprising piezo-assembly - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 파쇄챔버, (b) 비드 및 (c) 투과성 금속제 격막과 고리형 압전소자 디스크로 구성된 피에조 결합체를 포함하는 휴대용 세포파쇄장치, 상기 휴대용 세포파쇄장치를 사용하여 세균을 파쇄하는 방법 및 세균으로부터 DNA를 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치를 사용하면, 인화성 기체가 존재하는 현장에서도 사용될 수 있고, 크기가 작으며 사용이 간단할 뿐만 아니라, 에너지 효율이 우수하여 적은 전력을 사용하므로, 현장에서 두터운 세포벽을 포함하는 그람 양성 세균과 같은 세균으로부터 DNA를 추출하고 이를 검사함으로써, 보다 효과적으로 세균을 검출 및 분석하는데 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a portable cell disruptor comprising (a) a disruption chamber, (b) a bead, and (c) a piezo-coupling comprising a permeable metal diaphragm and an annular piezoelectric element disc, Methods and methods for obtaining DNA from bacteria. The portable cell crushing device provided in the present invention can be used in a field where a flammable gas is present, is small in size, simple in use, and has excellent energy efficiency and uses less electric power. Therefore, Such as Gram-positive bacteria, which are capable of detecting and analyzing bacteria more effectively.
Description
본 발명은 피에조 결합체를 포함하는 휴대용 세포파쇄장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 (a) 파쇄챔버, (b) 비드 및 (c) 투과성 금속제 격막과 고리형 압전소자 디스크로 구성된 피에조 결합체를 포함하는 휴대용 세포파쇄장치, 상기 휴대용 세포파쇄장치를 사용하여 세균을 파쇄하는 방법 및 세균으로부터 DNA를 수득하는 방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a portable cell disruption device comprising a piezocomposite comprising (a) a disintegration chamber, (b) beads and (c) a permeable metal diaphragm and a piezocomposite comprising an annular piezoelectric element disc A method for disrupting bacteria using the portable cell disruption apparatus, and a method for obtaining DNA from bacteria.
생물학적으로, 세포에 의하여 생성되는 대부분의 물질은 세포막 내부에 존재하며, 세포 내 물질의 이용 또는 분석을 위해서는 세포 파쇄 과정이 반드시 요구된다. 상기 세포 파쇄를 위한 다양한 방법들이 알려져 있는데, 이들은 대체로 물리적 방법, 화학적 방법 및 생물학적 방법으로 크게 나누어진다.Biologically, most of the cell-generated materials are present inside the cell membrane, and cell crushing processes are indispensable for the use or analysis of intracellular material. Various methods for such cell disruption are known, and they are roughly classified into physical methods, chemical methods, and biological methods.
먼저, 물리적 방법은, 후렌치 프레스(french press), 볼 밀(ball mill) 등과 같이, 압력 변화를 주거나 작은 구슬 등과 충돌시킴으로써 세포를 파쇄하는 방식 및 미생물 세포를 포함하는 용액 내에 초음파 발진기를 삽입하고 높은 주파수의 음파를 가함으로써 세포를 파쇄하는 방식 등을 의미하는데, 세포 파쇄를 위한 용액의 회수 및 이송을 위한 별도의 장비 및 공정을 필요로 하는 관계로, 초기 설비 비용이 많이 소요되고, 오염의 가능성이 높다는 단점이 있는 반면, 초기 설비장치를 사용하여 대량으로 세포를 파쇄할 수 있다는 장점이 있다. First, physical methods include a method of crushing cells by applying a pressure change or a small ball or the like, such as a french press, a ball mill, etc., and a method of inserting an ultrasonic oscillator into a solution containing microbial cells A method of disrupting cells by applying a high frequency sound wave and the like requires separate equipment and process for recovering and transporting the solution for cell crushing, While there is a disadvantage that it is highly probable, it has the advantage of being able to disrupt cells in large quantities using an initial facility.
다음으로, 생물학적 방법은, 라이소자임(lysozyme)과 같은 효소를 이용하여 세포막을 용해시키는 방식을 의미하는데, 고가인 세포막 용해성 효소를 사용해야 하는 관계로, 처리 비용이 많이 소요되고, 효소 반응에 적합한 온도, pH 등의 조건을 제대로 유지해 주어야 하는 단점이 있는 반면, 생물학적 환경과 유사한 환경을 조성할 수 있어, 천연상태와 유사한 상태의 추출물을 수득할 수 있다는 장점이 있다.Next, the biological method refers to a method of dissolving a cell membrane using an enzyme such as lysozyme. Since it requires the use of an expensive cell membrane soluble enzyme, it requires a high processing cost, a temperature suitable for the enzyme reaction, pH, and the like. However, it has an advantage that an environment similar to a biological environment can be created, and an extract having a state similar to a natural state can be obtained.
끝으로, 화학적 방법은, 미생물의 세포막에 계면활성제를 가함으로써 화학 반응에 의한 세포막 분해를 유도하는 방식을 의미하는데, 세포 배양액에 계면활성제를 단순 첨가하는 방식이라 상기 물리적 방법에서와 같은 별도 공정이 불필요함은 물론, 상기 생물학적 방법에서와 같은 고가의 효소를 사용하지 않는 관계로, 다른 두 가지 방법에 비하여 전체적 처리 비용이 적게 소요되는 장점이 있으나, 별도의 물리화학적인 공정이 추가되어야 하고, 나중에 계면활성제를 제겅하는 추가공정이 필요하며, 계면활성제로 인하여 추출된 성분이 변성될 수 있어, 천연상태와 유사한 상태의 추출물을 수득하기는 어렵다는 단점이 있다.Finally, the chemical method refers to a method of inducing cell membrane degradation by chemical reaction by adding a surfactant to the cell membrane of a microorganism. Since a method of simply adding a surfactant to a cell culture solution is adopted, In addition, since it does not use expensive enzymes as in the above biological methods, it is advantageous in that the overall processing cost is less than that of the other two methods, but a separate physicochemical process must be added, and later There is a disadvantage that it is difficult to obtain an extract in a state similar to a natural state because an additional step of blending the surfactant is required and the extracted component can be denatured by the surfactant.
최근에 들어, 생물공학이 발전함에 따라, 다양한 미생물로부터 DNA, 단백질 등의 생체고분자를 추출하는 방법이 현저하게 발달되었는데, 이같은 생체고분자를 추출하기 위하여 기본적으로 수행되어야 하는 세포를 파쇄하는 방법은 크게 변화되지 않고, 주로 세포막 분해 활성이 우수한 효소 또는 계면활성제를 사용하는 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제1997-0070197호에는 스트랩토코커스 뮤탄스의 세포벽을 용해하는 용해효소가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2006-0059130호에는 알파 올레핀 설포네이트와 라이소자임 성분을 포함하는 세포 파쇄용 용액 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 방법은 세포를 파쇄할 수 있는 효소와 상기 효소의 반응이 수행될 수 있는 장비가 갖추어진 실험실 수준에서 수행될 수 있을 뿐, 미생물을 채취하는 현장에서는 사용할 수 없다는 단점이 있다. 예를 들어, 전염병과 같이 생물학적 오염이 유발된 지역에서, 오염의 원인균을 규명하기 위해서는, 상기 생물학적 오염이 유발된 지역에서 시료를 채취한 다음, 상기 시료를 실험실로 운반한 후에야 비로소 오염의 원인균을 분석할 수 있다. Recently, with the development of biotechnology, a method of extracting biopolymers such as DNA and proteins from various microorganisms has been remarkably developed. In order to extract such biomolecules, a method of disrupting cells to be basically performed is as follows. There has been developed a method using an enzyme or a surfactant which is not changed and has an excellent cell membrane-degrading activity. For example, Korean Patent Laid-Open Publication No. 1997-0070197 discloses a dissolution enzyme that dissolves the cell wall of Streptococcus mutans. In Korean Patent Publication No. 2006-0059130, a cell containing an alpha olefin sulfonate and a lysozyme component Disclosed is a solution composition for crushing. However, this method is disadvantageous in that it can be performed at a laboratory level equipped with an enzyme capable of disrupting cells and a device capable of performing the reaction of the enzyme, and can not be used at a site where microorganisms are collected. For example, in an area where biological contamination such as an infectious disease is caused, in order to identify the causative organisms of contamination, it is necessary to collect the sample from the area where the biological contamination has occurred, and then, after transporting the sample to the laboratory, Can be analyzed.
만일, 오염현장에서 신속하게 오염원인균을 파쇄하여 DNA를 추출할 수 있다면, 상기 오염원인균을 보다 신속하게 규명하여 이에 대비할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 그러나, 오염현장에서 오염원인균으로부터 DNA를 추출하기 위하여 상기 오염원인균을 파쇄하는 방법은 지금까지 개발되지 않고 있는 실정이다.If the DNA can be extracted by rapidly shaking the pollutant causing bacteria in the contaminated site, it is expected that the pollutants causing the pollution will be identified more quickly and prepared. However, a method of crushing the above-mentioned pollutant causing bacteria to extract DNA from a pollutant causing bacteria at a contaminated site has not been developed so far.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 현장에서도 오염원인균으로부터 DNA를 용이하게 추출할 수 있도록, 현장에서 채취된 시료에 포함된 세균의 DNA를 신속하게 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 투과성 금속제 격막과 고리형 압전소자 디스크를 포함하는 피에조 결합체를 포함하고, 초음파처리 및 미립자화를 수행하면서 동시에 비드비팅에 의한 기계적 파쇄를 수행하여 시료에 포함된 세균을 파쇄할 수 있는 세포파쇄장치를 사용할 경우, 휴대가 간편할 뿐만 아니라 소모되는 전력을 절감할 수 있어, 현장에서 채취된 시료에 포함된 세균으로부터 효과적이면서도 경제적으로 DNA를 분리 및 분석할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the present inventors have made extensive efforts to develop a method for rapidly analyzing the DNA of a bacterium contained in a sample collected in the field so that DNA can be easily extracted from a pollutant causing bacteria in the field. As a result, When a cell crushing device is used which includes a piezocomposite including a diaphragm and an annular piezoelectric element disk and is capable of performing mechanical fracturing by bead beating while simultaneously performing ultrasonic wave processing and microparticulation to break bacteria contained in a sample It is possible to separate and analyze DNA efficiently and economically from the bacteria contained in the sample collected in the field since it is easy to carry and can save power consumed and completed the present invention.
본 발명의 하나의 목적은 투과성 금속제 격막과 고리형 압전소자 디스크를 포함하는 피에조 결합체를 포함하는 휴대용 세포파쇄장치를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a portable cell disruption device comprising a piezocomposite comprising a permeable metal diaphragm and an annular piezoelectric element disc.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포파쇄장치를 사용하여 세균을 파쇄하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for disrupting bacteria using the cell-shredding apparatus.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포파쇄장치를 사용하여 세균으로부터 DNA를 수득하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for obtaining DNA from bacteria using the cell-shredding apparatus.
본 발명자들은 현장에서 채취된 시료에 포함된 세균의 DNA를 신속하게 분석할 수 있는 방법을 개발하고자, 오존을 이용할 경우 세균을 신속하게 파쇄할 수 있다는 점에 착안하여, 오존을 발생시킬 수 있는 마이크로 코로나 방전장치과 이에 공기를 공급할 수 있는 소형 공기펌프를 포함하는 휴대용 세포파쇄장치를 개발한 바 있다. 그러나, 상기 휴대용 세포파쇄장치는 마이크로 코로나 방전장치를 사용하기 때문에 인화성 기체가 존재하는 현장에서는 사용할 수 없다는 문제점이 제기되었다. 뿐만 아니라, 오존을 지속적으로 공급하기 위하여는 마이크로 코로나 방전장치를 지속적으로 구동시켜야 하는데, 이때 전력의 소모량이 많아서 배터리를 사용할 경우, 소량의 시료만을 분석할 수 있다는 문제점이 있었다. The inventors of the present invention focused on the fact that bacteria can be rapidly disrupted when ozone is used in order to develop a method for rapidly analyzing the DNA of bacteria contained in a sample collected in the field, A portable cell crushing device including a corona discharge device and a small air pump capable of supplying air thereto has been developed. However, since the portable cell disruption apparatus uses a micro corona discharge apparatus, it has been disadvantageous that it can not be used in a field where a flammable gas exists. In addition, in order to continuously supply ozone, the micro corona discharge device must be driven continuously. In this case, when the battery is used due to high power consumption, only a small amount of sample can be analyzed.
이에, 본 발명자들은 인화성 기체가 존재하는 현장에서도 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 전력의 소모량을 절감시킬 수 있는 세포파쇄장치를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 압전소자 디스크(piezoelectric disc)에 주목하게 되었다. 상기 압전소자 디스크에 전력을 공급하면, 압전소자 디스크로부터 물리적인 진동이 유발되고, 상기 진동으로 인하여 초음파가 발생할 뿐만 아니라, 상기 압전소자 디스크가 액체와 접촉되어 있는 경우에는, 상기 액체의 미립자화(atomization)를 유도한다고 알려져 있는데, 이러한 압전소자 디스크는 가정용 가습기로부터 하수처리장치에 이르기까지 다양한 분야에서 사용되고 있다. 본 발명자들은 상기 압전소자 디스크와 상기 디스크로부터 유래된 진동을 증폭시킬 수 있는 투과성 금속제 격막으로 구성된 피에조 결합체(piezo-assembly)를 사용할 경우, 상기 피에조 결합체로부터 유발되는 진동으로부터 유래된 초음파 및 미립자화에 의하여 시료에 포함된 세균을 파쇄할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 진동을 이용하여 비드비팅을 함께 수행할 경우, 상기 세균의 파쇄효율을 증진시킬 수 있음을 확인하였다. Accordingly, the present inventors paid attention to a piezoelectric disk while performing various studies in order to develop a cell disruption device which can not only be used in a field where a flammable gas exists, but also can reduce power consumption . When electric power is supplied to the piezoelectric element disk, physical vibration is generated from the piezoelectric element disk, ultrasonic waves are generated due to the vibration, and when the piezoelectric element disk is in contact with the liquid, atomization, which is used in a variety of fields from domestic humidifiers to sewage treatment plants. The inventors of the present invention have found that when a piezo-assembly composed of the piezoelectric element disk and the permeable metal diaphragm capable of amplifying the vibration derived from the disk is used, the ultrasonic wave and the microparticulation derived from the vibration generated from the piezo- It is confirmed that not only the bacteria included in the sample can be disrupted but also the bead beating is carried out by using the vibration to improve the breaking efficiency of the bacteria.
이에, 본 발명자들은 원통형의 수직형 파쇄챔버, 상기 파쇄챔버 내에 구비된 비드 및 상기 투과성 금속제 격막과 고리형의 압전소자 디스크로 구성된 피에조 결합체를 포함하는 휴대용 세포파쇄장치를 제작하였다. 상기 투과성 금속제 격막은 기본적으로 압전소자 디스크로부터 발생된 진동을 증폭시키는 역할을 수행하는데, 상기 격막의 중앙에는 상기 격막을 관통하는 구멍이 구비되어 있어, 상기 구멍을 통해 상기 시료를 방출함과 동시에, 상기 시료가 방출되는 동안 이에 포함된 세균을 파쇄하는 역할을 수행한다. 이때, 파쇄챔버에 구비된 비드는 상기 구멍보다 큰 직경을 갖고 있어, 상기 구멍을 통해 방출되지 않고, 파쇄챔버 내에 잔류하게 된다. 상기 제작된 세포파쇄장치의 상부을 통해 파쇄챔버내로 세균을 포함하는 시료를 가하면, 비드비팅을 통해 시료에 포함된 세균이 기계적으로 파쇄되고, 비드비팅을 통과한 시료는 투과성 금속제 격막의 구멍을 통해 아래로 방출되면서 초음파처리 및 미립자화에 의해 이에 포함된 세균이 추가로 파쇄된다. Thus, the present inventors produced a portable cell disruption apparatus comprising a cylindrical vertical crushing chamber, a bead provided in the crushing chamber, and a piezocomposite composed of the permeable metal diaphragm and the annular piezoelectric element disk. The permeable metal diaphragm basically serves to amplify the vibration generated from the piezoelectric element disk. The diaphragm has a hole at the center of the diaphragm so as to pass through the diaphragm, And breaks the bacteria contained therein during the release of the sample. At this time, the beads provided in the crushing chamber have a larger diameter than the holes, and are not discharged through the holes, but remain in the crushing chamber. When a sample containing bacteria is applied to the crushing chamber through the upper part of the prepared cell crushing apparatus, the bacteria contained in the sample are mechanically broken through the bead beating, and the bead beating sample passes through the hole of the permeable metal diaphragm And the bacteria contained therein are further broken by ultrasonic treatment and microparticulation.
상기 제작된 장치를 사용하여 시료에 포함된 세균을 파쇄할 때의 파쇄효율을 분석한 결과, 종래의 많은 전력을 소모하는 초음파 처리장치를 사용한 경우의 파쇄효율과 비교하여 별다른 차이를 나타내지 않음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 동일한 수준의 파쇄효율로 시료에 포함된 세균을 파쇄할 때, 소모되는 전력을 측정하여 파쇄에너지 효율을 분석한 결과, 4.5배 이상의 에너지 효율을 나타냄을 확인하였다. 뿐만 아니라 장치를 구성함에 있어, 종래의 구성요소보다 경제적인 구성요소를 사용할 수 있으므로, 제작비의 측면에서 약 50% 이하로 소요되는 비용을 절약할 수 있음을 확인하였다.As a result of analyzing the shredding efficiency when the bacteria contained in the sample were broken using the manufactured apparatus, it was confirmed that the shredding efficiency was not significantly different from the conventional shredding efficiency in the case of using an ultrasonic treatment apparatus consuming a large amount of electric power Respectively. In addition, when breaking the bacteria contained in the sample with the same level of crushing efficiency, the power consumption was measured and the fracture energy efficiency was analyzed. As a result, it was confirmed that the energy efficiency was 4.5 times or more. In addition, since it is possible to use components that are more economical than conventional components in constructing a device, it has been confirmed that a cost of about 50% or less can be saved in terms of production cost.
따라서, 본 발명에서 제공하는 휴대용 세균파쇄장치를 사용하면, 종래의 장치를 사용한 경우와 동등한 수준의 세포파쇄효율을 나타내면서도, 전력소모량을 현저하게 절감시킬 수 있음을 확인하였으므로, 인화성 기체가 존재하는 현장에서도 소량의 전력을 소모하여 시료에 포함된 세균으로부터 보다 효과적으로 DNA를 추출하고 이를 검사하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, it has been confirmed that the use of the portable bactericidal disruption device provided by the present invention can remarkably reduce the power consumption while exhibiting cell breaking efficiency equivalent to that in the case of using the conventional device, It can be seen that DNA can be extracted more effectively from the bacteria contained in the sample and can be used to inspect it.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 (a) 수직형 파쇄챔버; (b) 상기 파쇄챔버 내에 구비된 비드; 및 (c) 상기 파쇄챔버의 하단에 구비되고, 투과성 금속제 격막(perforated steel diaphragm)과 고리형 압전소자 디스크(annular piezoelectric disc)로 구성된 피에조 결합체(piezo-assembly)를 포함하는 휴대용 세포파쇄장치를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides, in one aspect, (a) a vertical crushing chamber; (b) a bead provided within the shredding chamber; And (c) a piezo-assembly disposed at the lower end of the crushing chamber and comprising a perforated steel diaphragm and an annular piezoelectric disc. do.
상기 휴대용 세포파쇄장치에 구비된 각 구성요소에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다:Each component included in the portable cell crushing apparatus will be described in detail as follows:
먼저, 수직형 파쇄챔버는 상부에 개구부를 형성하고, 하부에 투과성 금속제 격막이 구비된 형태의 원통형의 챔버로서, 세균을 포함하는 시료가 최초 투입되는 구성요소를 의미하는데, 여기서 시료에 포함된 세균을 대상으로 비드비팅을 수행할 뿐만 아니라, 피에조 결합체로 전달되기 전까지 시료에 포함된 세균을 잔류시키는 공간으로서의 역할을 수행할 수 있다. 상기 파쇄챔버는 내부에서 수행되는 비드비팅에 의한 충격을 견딜수 있는 한, 이를 구성하는 재질이 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 내부에 담겨진 시료수준 및 비드비팅의 상태를 외부에서 관찰할 수 있도록 투명성을 제공할 수 있는 재질을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 상기 투명성을 제공하면서도, 파쇄된 세포로부터 유래된 유전자와 세포내 물질이 지나치게 흡착되지 않는 플라스틱 재질, 아크릴 재질, 유리재질 등을 사용할 수 있다.First, the vertical crushing chamber is a cylindrical chamber having a top opening and a permeable metal diaphragm at the bottom, and means a component in which a sample containing bacteria is first introduced. Here, bacteria contained in the sample Not only the bead beating is carried out with respect to the sample, but also can serve as a space for retaining the bacteria contained in the sample until it is transferred to the piezocomposite. The material constituting the crushing chamber is not particularly limited as long as it is capable of withstanding the impact due to the bead beating performed therein. For example, the crushing chamber may have a transparency As another example, a plastic material, an acrylic material, a glass material, or the like, which does not excessively adsorb a gene derived from a crushed cell and an intracellular substance, may be used while providing the above transparency .
상기 파쇄챔버에는 현장에서 수득한 세균이 포함된 것으로 예상되는 액상시료가 가하여 질 수 있는데, 상기 액상시료에 포함된 세균은 본 발명의 휴대용 세포파쇄장치에 의하여 파쇄되어 DNA를 방출할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 세균성 포자, 진균류, 그람양성 세균류 등이 될 수 있고, 다른 예로서 펩티도글리칸층이 포함된 세포벽을 갖고 있어 세포벽의 파쇄가 용이하지 않은 그람양성 세균이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 두터운 펩티도글리칸층이 포함된 세포벽을 갖는 호기성 그람양성 세균이 될 수 있고, 이보다 상대적으로 얇은 세포벽을 갖는 호기성 그람음성 세균도 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 두터운 펩티도글리칸층이 포함된 세포벽을 갖는 호기성 그람양성 세균인 바실러스 서브틸리스 균주를 예시적으로 사용하였다.The liquid sample, which is expected to contain bacteria obtained in the field, may be added to the crushing chamber. As long as the bacteria contained in the liquid sample can be broken by the portable cell crushing apparatus of the present invention to release DNA, For example, bacterial spores, fungi, gram-positive bacterium and the like, and as another example, it may be a gram-positive bacterium having a cell wall containing a peptidoglycan layer and not easily breaking the cell wall And as another example, it may be an aerobic gram positive bacterium having a cell wall containing a thick peptidoglycan layer, and may also include aerobic gram negative bacteria having a relatively thin cell wall. For example, in the present invention, a Bacillus subtilis strain, which is a aerobic gram-positive bacterium having a cell wall containing a thick peptidoglycan layer, is exemplarily used.
아울러, 상기 시료에 포함된 세균의 파쇄효율을 향상시키기 위하여, 상기 시료에 계면활성제를 추가할 수 있다. 상기 계면활성제는 본 발명의 휴대용 세포파쇄장치를 사용하여 시료에 포함된 세균의 파쇄효율을 향상시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있고, 다른 예로서, SDS(sodium dodecylsulfate), CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide), DTAB(dodesyltrimethylammonium bromide), Triton X-100, CHAPS((3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propane- sulphonate)) 등을 사용할 수 있으며, 또 다른 예로서, 음이온성 계면활성제인 SDS, CTAB, DTAB 등을 사용할 수 있다.In addition, a surfactant may be added to the sample to improve the efficiency of shredding bacteria contained in the sample. The surfactant is not particularly limited as long as it can improve the efficiency of disruption of bacteria contained in a sample by using the portable cell disruption apparatus of the present invention. However, for example, the surfactant may be a cationic surfactant, an anionic surfactant, Other examples include sodium dodecylsulfate (SDS), cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB), Triton X-100, CHAPS ((3- (3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 -propane-sulphonate). As another example, SDS, CTAB, DTAB and the like, which are anionic surfactants, can be used.
또한, 상기 계면활성제의 처리양 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 0.1 내지 1.0%(w/v)가 되도록 시료에 첨가될 수 있고, 다른 예로서, 0.25 내지 내지 1.0%(w/v)가 되도록 시료에 첨가될 수 있으며, 또 다른 예로서 0.5%(w/v)가 되도록 시료에 첨가될 수 있다. 이때, 상기 계면활성제의 처리양이 1.0%(w/v) 이상인 경우, 계면활성제로 인하여 발생된 과다한 거품으로 인하여 세균의 파쇄효율이 오히려 감소할 수 있다.The treatment amount of the surfactant is also not particularly limited, but may be added to the sample to be 0.1 to 1.0% (w / v) as an example, and 0.25 to 1.0% (w / v) ), And as another example 0.5% (w / v) may be added to the sample. At this time, when the amount of the surfactant treated is 1.0% (w / v) or more, the blooming efficiency of the bacteria may be rather reduced due to excessive bubbles generated by the surfactant.
다음으로, 비드는 상기 파쇄챔버 내에 잔류하여 피에조 결합체의 진동에 의하여 불규칙적으로 이동함으로써 시료에 포함된 세균을 기계적으로 파쇄하는 비드비팅을 수행할 수 있는 직접적인 수단으로 사용되는데, 비드비팅의 효율을 향상시키기 위하여 다수의 비드가 사용될 수 있다. Next, the beads remain in the crushing chamber and move irregularly by the vibration of the piezocomposite, thereby being used as a direct means of performing bead beating for mechanically crushing the bacteria contained in the sample. A plurality of beads may be used.
상기 비드는 대체로 구형의 입자형태를 갖는 것이 될 수 있는데, 상기 비드의 직경은 피에조 결합체로부터 유발된 진동에 의하여 쉽게 이동할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 상기 비드의 직경은 0.1 내지 2mm가 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 비드의 직경은 1mm가 될 수 있다. The diameter of the bead is not particularly limited as long as the diameter of the bead can be easily moved by the vibration generated from the piezo bond, As another example, the diameter of the beads may be 1 mm.
상기 비드의 개별적인 중량은 피에조 결합체로부터 유발된 진동에 의하여 쉽게 이동할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 상기 비드의 개별적인 중량은 1 내지 10mg이 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 비드의 중량은 5 내지 6mg이 될 수 있다.The individual weight of the bead is not particularly limited as long as it can be easily moved by the vibration caused from the piezocomposite, but as an example, the individual weight of the bead may be 1 to 10 mg, and as another example, The weight may be from 5 to 6 mg.
상기 비드의 사용갯수 역시 피에조 결합체로부터 유발된 진동에 의하여 쉽게 이동할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 15 내지 100개의 비드를 사용할 수 있고, 다른 예로서, 20 내지 80개의 비드를 사용할 수 있으며, 또 다른 예로서, 50개의 비드를 사용할 수 있다.The number of beads used is not particularly limited as long as it can be easily moved by the vibration caused by the piezo coupling. However, for example, 15 to 100 beads may be used, and as another example, 20 to 80 beads may be used As another example, 50 beads can be used.
아울러, 사용되는 비드의 총 중량 역시 피에조 결합체로부터 유발된 진동에 의하여 쉽게 이동할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 0.1 내지 1g이 될 수 있고, 다른 예로서 0.1 내지 0.5g이 될 수 있으며, 또 다른 예로서 0.5g이 될 수 있다.In addition, the total weight of the beads to be used is not particularly limited as long as it can be easily moved by the vibration caused from the piezocomposite. For example, it may be 0.1 to 1 g, and as another example may be 0.1 to 0.5 g As another example, it can be 0.5 g.
또한, 상기 비드의 재질은 비드비팅에 의해 유발되는 충격에 의하여 손상되지 않는 수준의 경도를 나타낼 수 있으며, 시료에 포함된 세균 또는 파쇄된 세균으로부터 유래된 성분과 결합하지 않거나 또는 비특이적으로 결합하여 세척이 용이한 재질로 구성될 수 있다. 일 예로서, 상기 비드는 페놀수지, 요소수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리에스터수지 등의 다양한 열경화성 수지 또는 강화 글래스 등의 재질로 제작된 것을 사용할 수 있다.In addition, the material of the beads may exhibit hardness not to be damaged by the impact caused by bead beating, and may not bind to components derived from bacteria or crushed germs contained in the sample, or may be non- Can be made of an easy material. For example, the beads may be made of various thermosetting resins such as phenol resin, urea resin, melamine resin, epoxy resin, and polyester resin, or reinforced glass.
예를 들어, 본 발명에서는 1mm의 직경을 갖는 글래스 비드를 0.5g의 총중량으로 사용하였다.For example, in the present invention, a glass bead having a diameter of 1 mm was used in a total weight of 0.5 g.
다음으로, 상기 피에조 결합체는 투과성 금속제 격막과 고리형 압전소자 디스크로 구성되며, 상기 투과성 금속제 격막이 고리형 압전소자 디스크의 상단에 결합된 형태로 구성되어, 상기 수직형 파쇄챔버가 투과성 금속제 격막에 위치하여 결합되도록 구성될 수 있다. 상기 피에조 결합체는 고리형 압전소자 디스크로부터 발생된 진동을 증폭시켜서 상기 증폭된 진동에 의하여 유발된 초음파를 시료내에 포함된 세균에 처리할 뿐만 아니라, 상기 진동을 이용하여 세균을 포함하는 시료를 미립자화시켜서 세균을 파쇄시키는 역할을 수행한다. 아울러, 피에조 결합체를 통해 증폭된 진동은 비드비팅을 수행하는 원인이 되기도 한다. 특히, 통상적으로 알려진 초음파 가습기와 같이, 피에조 결합체를 사용하여 액상성분이 미립자화되는 현상은 공지되어 있는데, 상기 미립자화시에는 부피의 급격한 팽창이 수반되고, 이러한 팽창으로 인한 압력이 시료에 포함된 세균에 가하여져서, 상기 압력으로 인하여 세균이 파쇄될 수 있다. Next, the piezocomposite is composed of a permeable metal diaphragm and an annular piezoelectric element disk, and the permeable metal diaphragm is coupled to the upper end of the annular piezoelectric element disk, and the vertical type impregnation chamber is connected to the permeable metal diaphragm And can be configured to be coupled. The piezo-electric combination amplifies the vibration generated from the annular piezoelectric element disk so as to treat the ultrasonic waves induced by the amplified vibration to the bacteria contained in the sample, and also uses the vibration to micropartize the sample containing the bacteria Thereby destroying bacteria. In addition, the vibration amplified through the piezocomposite may cause bead beating. Particularly, the phenomenon that a liquid component is made into fine particles by using a piezocomposite, such as a conventionally known ultrasonic humidifier, is known. At the time of the microparticulation, the volume is accompanied by a rapid expansion, The bacteria may be destroyed by the pressure.
상기 피에조 결합체를 형성하는 주요 구성요소인 투과성 금속제 격막과 고리형 압전소자 디스크를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.The permeable metal diaphragm and the annular piezoelectric element disk, which are the main constituent elements of the piezoelectric coupling, will now be described in more detail.
상기 피에조 결합체를 구성하는 투과성 금속제 격막은 상기 파쇄챔버와 고리형 압전소자 디스크의 가운데 위치하고, 중앙 영역에 상기 격막을 관통하는 다수의 구멍이 구비되어 있으며, 상기 구멍이 구비된 영역에 오목한 부위가 포함되도록 구성될 수 있다. 상기 투과성 금속제 격막은 고리형 압전소자 디스크로부터 발생된 진동을 증폭시켜서 이에 의하여 유발되는 초음파처리 및 미립자화의 효율을 증가시키는 역할을 수행한다. 특히, 상기 구멍은 파쇄챔버에 잔류하는 시료를 아랫쪽으로 방출함과 동시에 상기 증폭된 진동을 시료에 포함된 세균에 직접적으로 전달하여, 초음파처리 및 미립자화를 통한 세균의 파쇄효율을 더욱 증가시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 구멍의 직경은 상기 시료가 상기 구멍을 통하여 흐르듯이 통과하지 않고, 표면장력에 의하여 물방울 형태로 맺혀서 통과할 수 있는 크기를 갖을 수 있다. 즉, 상기 구멍은 세균을 포함하는 시료의 방출속도를 최적화할 수 있는데, 상기 구멍의 직경이 너무 크면, 시료가 너무 빨리 방출되어 이에 포함된 세균의 파쇄효율이 저하되고, 상기 구멍의 직경이 너무 작으면 시료의 방출이 지체되어, 세균의 파쇄에 소요되는 시간이 과도하게 증가된다. 이에 따라, 적절한 방출속도를 유지할 수 있는 구멍의 직경은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 5 내지 50㎛가 될 수 있고, 다른 예로서 20㎛가 될 수 있다.The permeable metal diaphragm constituting the piezocomposite body is positioned at the center of the crushing chamber and the annular piezoelectric element disk, and has a plurality of holes penetrating the diaphragm in a central region thereof. Lt; / RTI > The permeable metal diaphragm plays a role of amplifying the vibration generated from the annular piezoelectric element disk and increasing the efficiency of the ultrasonic treatment and the microfabrication caused thereby. Particularly, the holes release the sample remaining in the crushing chamber downward and directly transmit the amplified vibration to the bacteria included in the sample, thereby further increasing the efficiency of shredding bacteria by ultrasonic treatment and microparticulation have. In addition, the diameter of the hole can be such that the sample does not pass through the hole but passes through the droplet form due to the surface tension. That is, the hole can optimize the release rate of the sample containing bacteria. If the diameter of the hole is too large, the sample is released too soon, the breaking efficiency of the bacteria contained therein is lowered, If it is small, the release of the sample is retarded, and the time required for breaking the bacteria is excessively increased. Accordingly, the diameter of the hole capable of maintaining a proper discharge rate is not particularly limited, but may be, for example, 5 to 50 占 퐉, and as another example, 20 占 퐉.
또한, 상기 오목한 부위는 고리형 압전소자 디스크로부터 발생된 단방향성 진동을 복합진동으로 전환시키는 역할을 수행한다. 즉, 고리형 압전소자 디스크로부터 발생된 진동은 단방향성 진동이므로, 단순한 막 형태의 투과성 금속제 격막을 통해 상기 진동이 증폭된다 하여도 단방향성 진동이라는 속성이 변화되지는 않는다. 그러나, 상기 투과성 금속제 격막은 단순한 막 형태가 아니라 중앙부에 오목한 부위가 포함되어 있어, 상기 오목한 부위의 표면을 따라 진동이 증폭되는 경우에는 단방향성 진동이 다양한 방향성을 나타내는 복합진동으로 전환되며, 이러한 복합진동은 초음파 처리와 미립자화의 효율을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 상기 비드를 이용한 비드비팅의 효율을 증진시킬 수 있다. 특히, 다양한 방향성을 나타내는 진동에 의하여 비드의 운동방향이 다양하게 변화될 수 있으므로, 이에 의하여 비드비팅의 효율을 증진시킬 수 있다.In addition, the concave portion serves to convert the unidirectional vibration generated from the annular piezoelectric element disk into a composite vibration. That is, since the vibration generated from the annular piezoelectric element disk is a unidirectional vibration, the property of unidirectional vibration is not changed even if the vibration is amplified through a simple film-like permeable metal diaphragm. However, when the vibration is amplified along the surface of the concave portion, the unidirectional vibration is converted into a composite vibration that exhibits various directions. The vibration can improve the efficiency of ultrasonic treatment and microparticulation, as well as improve the efficiency of bead beating using the beads. Particularly, since the direction of motion of the bead can be variously changed by the vibration indicating various directions, it is possible to improve the efficiency of bead beating.
아울러, 상기 투과성 금속제 격막은 상기 특성을 갖는 구멍이 구비될 수 있으면서도 비드비팅으로 인한 충격을 견딜 수 있는 금속재질로 구성될 수 있다.In addition, the permeable metal diaphragm may be formed of a metal material which can be provided with the hole having the characteristic, and can withstand the impact due to the bead beating.
끝으로, 상기 피에조 결합체를 구성하는 고리형 압전소자 디스크는 전력의 공급에 의하여 진동을 발생시키고, 상기 발생된 진동은 투과성 금속제 격막을 통해 증폭되어 초음파처리 및 미립자화를 유발시켜서 시료에 포함된 세균을 파쇄하는 직접적인 수단으로 사용된다. 상술한 바와 같이, 진동으로 인하여 유발되는 초음파는 시료에 포함된 세균에 가하여져서, 세균을 파쇄할 수 있고, 진동에 의해 시료를 미립자화하여 부피의 팽창에 의한 압력으로 세균을 파쇄할 수 있다. Finally, the annular piezoelectric element disk constituting the piezocomposite generates vibration by the supply of electric power, and the generated vibration is amplified through the permeable metal diaphragm to induce ultrasonic treatment and fine particleization, Is used as a direct means of crushing. As described above, the ultrasonic waves induced by the vibration can be applied to the bacteria included in the sample to break the bacteria, and the bacteria can be broken down by the pressure caused by the expansion of the volume by making the sample into fine particles by the vibration.
상기 고리형 압전소자 디스크는 피에조 결합체를 구성하여 상술한 피에조 결합체의 기능을 수행하게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 공지된 납, 지르콘 및 티타늄으로 구성된 합금인 PZT(lead zirconia titanate)를 이용하여 제작된 것을 사용할 수 있는데, 상기 투과성 금속제 격막의 구멍이 형성된 부위에 상응하는 부위에 빈 공간이 형성된 고리형태로 제작된 것을 사용할 수 있다.The annular piezoelectric element disk is not particularly limited as long as it can constitute a piezo-coupled body to perform the function of the piezo-coupled body. However, for example, lead zirconia titanate (PZT), which is an alloy composed of lead, zircon and titanium, ) May be used, and those formed in the form of a ring in which a hollow space is formed at a portion corresponding to a hole-formed portion of the permeable metal septum may be used.
따라서, 상기 투과성 금속제 격막과 고리형 압전소자 디스크로 구성된 피에조 결합체는 시료에 포함된 세균을 파쇄하는 주된 수단을 제공하므로, 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치의 핵심적인 역할을 수행하는 구성요소가 될 수 있다.Therefore, the piezocomposite composed of the permeable metal diaphragm and the annular piezoelectric element disk provides a main means of breaking the bacteria contained in the sample, so that a component that plays a key role in the portable cell crushing apparatus provided by the present invention .
한편, 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치는 상기 구성요소 이외에, 세균파쇄를 보다 효율적으로 수행하는데 사용될 수 있는 추가적인 구성요소를 포함할 수 있는데, 상기 추가적인 구성요소는 상기 고리형 압전소자 디스크의 하부에 구비되어 파쇄된 시료를 회수할 수 있는 수집용 챔버, 상기 고리형 압전소자 디스크에 전력을 공급하는데 사용되는 전원공급장치 등이 될 수 있다. 특히, 전원공급장치는 특별히 이에 제한되지 않으나, 전원, 전원공급장치를 작동하는데 사용되는 제어판넬, 상기 제어판넬의 작동수준을 표시할 수 있는 LCD 디스플레이 등으로 구성될 수 있다.In addition, the portable cell disruption apparatus provided in the present invention may include, in addition to the above components, additional components that can be used to more efficiently perform bacterial disruption, A collecting chamber that can collect the broken sample, a power supply unit used to supply power to the annular piezoelectric element disk, and the like. In particular, the power supply may be configured by a power supply, a control panel used to operate the power supply, an LCD display capable of indicating the operation level of the control panel, and the like.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 수직형 파쇄챔버의 하부에, 투과성 금속제 격막과 이의 하부에 고리형 압전소자 디스크가 결합된 형태의 피에조 결합체를 결합시켜서, 세포파쇄장치를 제작하였다(도 1a 내지 1e). According to an embodiment of the present invention, a cell disruption device is manufactured by combining a permeable metal diaphragm and a piezo-electric coupling element in which a ring-shaped piezoelectric element disk is coupled to a lower part of the permeable metal diaphragm, 1e).
상술한 세포파쇄장치는 이에 포함된 고리형 압전소자 디스크의 자체적인 진동에 의해 구동되기 때문에, 종래의 세포파쇄장치에 비하여 상대적으로 단순한 구조를 갖는다. 따라서, 상기 세포파쇄장치에 포함된 파쇄챔버와 피에조 결합체의 크기를 자유롭게 확대시키거나 축소시켜서, 다양한 크기를 갖도록 제작될 수 있다. 특히, 상기 세포파쇄장치를 축소시킬 경우, 사람의 손바닥 위에 올라갈 수 있는 크기(가로 10cm, 세로 10cm, 높이 1.2cm)를 갖는 세포파쇄장치를 제작할 수 있을 뿐만 아니라, 이의 구동시에 소요되는 전력도 1회 당 약 2W에 불과하여, 휴대폰 배터리 크기의 소규모의 전원을 사용하여도 충분히 전력을 공급할 수 있으므로, 이의 휴대성을 현저히 향상시킬 수 있다. The above-described cell crushing apparatus is driven by its own vibration of the annular piezoelectric element disk included therein, and thus has a relatively simple structure as compared with the conventional cell crushing apparatus. Therefore, the size of the crushing chamber and the piezocomposite contained in the cell crushing apparatus can be freely enlarged or reduced, and can be manufactured to have various sizes. Particularly, when the cell disruption device is reduced, a cell disruption device having a size (10 cm in width, 10 cm in length, and 1.2 cm in height) capable of climbing on the palm of a person can be manufactured. The power consumption can be remarkably improved because the power supply can be sufficiently supplied even by using a small power source of a cell phone battery size.
따라서, 본 발명의 세포파쇄장치는 현장에서 수집된 세균을 포함하는 시료를 그 자리에서 직접파쇄하는데 사용할 수 있는 휴대용 세포파쇄장치로서 사용될 수 있다는 장점을 나타낸다.Thus, the cell-shredding device of the present invention demonstrates the advantage that it can be used as a portable cell disruption device that can be used to directly disinfect a sample containing bacteria collected in the field in situ.
본 발명은 다른 양태로서, 상기 휴대용 세포파쇄장치를 사용하여 세균을 파쇄하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 세균의 파쇄방법은 (a) 상기 휴대용 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 세균을 포함하는 시료를 공급하는 단계; 및 (b) 상기 휴대용 세포파쇄장치를 구동하여 상기 시료에 포함된 세균을 파쇄하고, 파쇄된 세균을 회수하는 단계를 포함한다.In another aspect, the present invention provides a method for disrupting bacteria using the portable cell disruption apparatus. Specifically, the method for disrupting bacteria provided by the present invention comprises the steps of: (a) supplying a sample containing bacteria to a vertical disintegration chamber of the portable cell disruption apparatus; And (b) driving the portable cell crushing device to break the bacteria contained in the sample, and recovering the broken bacteria.
상기 방법에 있어서, (a) 단계에서 사용되는 시료는 현장에서 수집된 시료를 그대로 사용하거나 또는 상기 수집된 시료에 SDS와 같은 계면활성제를 처리한 것을 사용할 수도 있다. 상기 계면활성제를 처리한 시료를 사용하면, 시료에 포함된 세균의 파쇄효율을 향상시킬 수 있다.In the above method, the sample collected in the step (a) can be used as it is, or the collected sample can be treated with a surfactant such as SDS. Use of the sample treated with the surfactant can improve the efficiency of shredding bacteria contained in the sample.
또한, (b) 단계에서 휴대용 세포파쇄장치의 구동은 상기 피에조 결합체의 구동에 의해 수행되는데, 상기 피에조 결합체에서 발생된 진동에 의하여 비드비팅, 초음파처리 및 미립자화가 동시에 수행되어, 시료에 포함된 세균을 파쇄하게 된다. 상기 휴대용 세포파쇄장치에 공급된 시료는 다양한 수단에 의해 이에 포함된 세균이 파쇄된 후, 중력에 의하여 상기 피에조 결합체의 하부로 방출되는데, 상기 피에조 결합체의 하부에 구비되는 수집용 챔버를 사용하면, 파쇄된 세균을 용이하게 회수할 수 있다. 이때, 소요되는 전력은 특별히 이에 제한되지 않으나 일 예로서 1 내지 3W가 될 수 있고, 다른 예로서 2W가 될 수 있다.In the step (b), driving of the portable cell disruption device is performed by driving the piezo-electric combination, wherein bead beating, ultrasonic treatment and microparticulation are simultaneously performed by the vibration generated in the piezo-electric combination, . The sample supplied to the portable cell disruptor is discharged to the lower portion of the piezocomposite body by gravity after the bacteria contained therein are broken up by various means. When the collecting chamber provided at the lower portion of the piezocomposite body is used, The broken bacterium can be easily recovered. At this time, the power consumed is not particularly limited, but may be 1 to 3 W as an example, and 2 W as another example.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포파쇄장치를 단독으로 사용하거나, 글래스 비드를 가하여 비드비팅과 함께 사용하거나 또는 SDS가 처리된 시료를 이용하여 세포파쇄장치를 사용함으로써, 두터운 펩티도글리칸 층을 포함하는 바실러스 서브틸리스 균주를 각각 파쇄한 결과, 세포파쇄장치를 단독으로 사용한 경우에 얻어진 세포파쇄율은 순수한 비드비팅 방법 및 초음파처리 방법을 통해 얻어진 세포파쇄율의 중간값을 나타내었고(도 2), 글래스 비드를 가하여 비드비팅과 함께 사용한 경우에 얻어진 세포파쇄율은 비드의 직경(도 3a) 또는 부가수준(도 3b)이 증가할 수록 증가하며, SDS가 처리된 시료를 이용하면 SDS의 농도에 비례하여 세포파쇄율이 증가하는 양상을 나타냄을 확인하였다(도 4). According to an embodiment of the present invention, by using the cell crushing apparatus alone, using bead beads together with glass beads, or using a cell crushing apparatus using samples subjected to SDS treatment, a thick peptidoglycan (Bacillus subtilis strains), respectively, showed that the cell lysis rate obtained when the cell lysing apparatus was used alone was a median value of the cell lysing rate obtained by the pure bead beating method and the ultrasonic treatment method (Fig. 2). When the glass bead is added and bead beads are used together with the bead beads, the cell disintegration rate increases as the diameter of the beads (Fig. 3a) or the additional level (Fig. 3b) (Fig. 4). As shown in Fig.
아울러, 상기 파쇄시에 소요된 에너지효율을 비교하면, 상기 세포파쇄장치를 단독으로 사용한 경우에는 초음파처리를 수행한 것에 비하여 에너지 효율이 약 1.7배 증가하였고, 상기 세포파쇄장치에 글래스 비드를 부가하여 비드비팅을 추가로 수행하거나 또는 SDS를 처리한 경우에는 대조군 대비 파쇄에너지 효율이 각각 약 4.8배 또는 약 5.0배 증가함을 알 수 있었다. 특히, 상기 세포파쇄장치에 글래스 비드를 부가하거나 SDS를 처리한 경우에는 세포파쇄율의 측면에서 대조군과 동등한 수준을 나타내면서도, 파쇄에너지 효율이 현저하게 증가됨을 알 수 있었다(표 1).In addition, when the cell crushing apparatus was used alone, the energy efficiency of the cell crushing apparatus was increased by about 1.7 times as compared with the case where ultrasonic wave treatment was performed, and glass beads were added to the cell crushing apparatus It was found that when the bead beating is further performed or the SDS treatment is performed, the crushing energy efficiency is increased by about 4.8 times or about 5.0 times compared to the control. Particularly, when glass beads were added to the cell disruption apparatus or treated with SDS, it was found that the cell disruption rate was equivalent to that of the control group, but the breakage energy efficiency was remarkably increased (Table 1).
상술한 바와 같이, 휴대용 세포파쇄장치를 사용하여 시료에 포함된 세균을 파쇄하면, 공지된 초음파처리 장치를 사용하여 세균을 파쇄할 경우보다고, 소모되는 전력대비 세포파쇄효율이 현저히 증가됨을 알 수 있다. As described above, it has been found that when the bacteria contained in the sample are crushed using the portable cell crushing apparatus, the cell crushing efficiency is significantly increased compared with the case of using the known ultrasonic treatment apparatus for breaking the bacteria have.
예를 들어, 통상적으로 사용되는 휴대폰의 배터리(3.8 V 11.78 Wh 3100 mAH)를 전원으로 사용할 경우를 상정하면, 이로부터 산출되는 전력에너지의 약 50%를 사용할 수 있다고 가정할 때, 실제로 사용가능한 전기에너지는 약 21204 J이다. 상기 약 21204 J의 전기에너지를 사용하여 1회 구동시에 10W의 전력이 소모되는 초음파 처리 장치를 구동시키면 92번 동안 반복구동할 수 있는 반면, 1회 구동시에 2W의 전력이 소모되는 본 발명의 휴대용 세포파쇄장치를 구동시키면 460번 동안 반복구동할 수 있다. 즉, 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치는 소모전력이 20%에 불과하므로, 사용회수가 5배 증가되기 때문에, 보다 많은 양의 시료에 포함된 세균을 파쇄하는데 사용될 수 있다. For example, assuming that a battery of a typical mobile phone (3.8 V 11.78 Wh 3100 mAH) is used as a power source, assuming that about 50% of the power energy calculated from the battery can be used, The energy is about 21204 J. When using the electric energy of about 21204 J, it is possible to repeatedly drive 92 times by driving an ultrasonic wave processing apparatus consuming 10 W of power at the time of driving once, while the portable electric power consumption of the present invention When the cell crushing device is driven, it can be repeatedly driven for 460 times. That is, the portable cell crushing device provided by the present invention can be used to crush the bacteria contained in a larger amount of sample because the consumption power is only 20% and the use frequency is increased five times.
이처럼, 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치를 사용하면 적은 양의 전력을 사용하여 보다 많은 양의 세균을 파쇄할 수 있으므로, 휴대용으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 절전형 세포파쇄장치로서도 사용될 수 있다는 장점을 나타낸다.As described above, the portable cell crushing apparatus provided in the present invention has an advantage that it can be used not only for portable use but also as a power saving type cell crushing apparatus since a larger amount of bacteria can be crushed using a small amount of electric power .
본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 휴대용 세포파쇄장치를 사용하여 세균으로부터 DNA를 수득하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 세균으로부터 DNA를 수득하는 방법은 (a) 상기 휴대용 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 세균을 포함하는 시료를 공급하는 단계; (b) 상기 휴대용 세포파쇄장치를 구동하여 상기 시료에 포함된 세균을 파쇄하고, 파쇄된 세균을 회수하는 단계; 및 (c) 상기 파쇄된 세균으로부터 DNA를 수득하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 (a) 및 (b) 단계는 상술한 바와 동일하다.In another aspect, the present invention provides a method for obtaining DNA from a bacterium using the portable cell-crushing apparatus. Specifically, a method for obtaining DNA from a bacterium provided by the present invention comprises the steps of: (a) supplying a sample containing bacteria to a vertical crushing chamber of the portable cell crushing apparatus; (b) driving the portable cell disruption apparatus to disrupt the bacteria contained in the sample, and recovering the disrupted bacteria; And (c) obtaining DNA from the crushed germ. At this time, steps (a) and (b) are the same as those described above.
상기 (c) 단계에 있어서, 시료로부터 DNA를 수득하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 파쇄된 세균을 포함하는 시료를 원심분리하여 DNA를 포함하는 상층액을 수득하는 방법을 사용할 수 있는데, 이때 원심분리 조건은 파쇄된 세균으로부터 DNA 분획을 분리할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 범주에서 당업자에게 공개된 모든 조건을 사용할 수 있다.In the step (c), a method for obtaining DNA from a sample is not particularly limited. For example, a method of obtaining a supernatant containing DNA by centrifuging a sample containing a crushed bacterium can be used , Wherein the centrifugation conditions are not particularly limited as long as DNA fragments can be separated from the crushed germs, and all conditions disclosed to those skilled in the art in the scope of the present invention can be used.
또한, 상기 수득한 DNA를 포함하는 분획으로부터 DNA를 순수분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 방법 역시 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 범주에서 당업자에게 공개된 모든 방법을 사용할 수 있다.In addition, the method may further include a step of purely separating the DNA from the fraction containing the DNA. The method used here is not particularly limited, and any method disclosed in the scope of the present invention may be used .
본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치를 사용하면, 인화성 기체가 존재하는 현장에서도 사용될 수 있고, 크기가 작으며 사용이 간단할 뿐만 아니라, 에너지 효율이 우수하여 적은 전력을 사용하므로, 현장에서 두터운 세포벽을 포함하는 그람 양성 세균과 같은 세균으로부터 DNA를 추출하고 이를 검사함으로써, 보다 효과적으로 세균을 검출 및 분석하는데 활용될 수 있을 것이다.The portable cell crushing device provided in the present invention can be used in a field where a flammable gas is present, is small in size, simple in use, and has excellent energy efficiency and uses less electric power. Therefore, Such as Gram-positive bacteria, which are capable of detecting and analyzing bacteria more effectively.
도 1a는 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치의 형태를 나타내는 사진이다.
도 1b는 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치에 포함된 피에조 결합체를 구성하는 투과성 금속제 격막을 나타내는 사진이다.
도 1c는 본 발명의 투과성 금속제 격막의 일부를 확대한 사진이다.
도 1d는 피에조 결합체를 구성하는 투과성 금속제 격막에 포함된 구멍의 역할을 나타내는 개략도이다.
도 1e는 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치를 이용하여 세균을 파쇄하는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 1f는 본 발명의 세포파쇄장치에 적용되어, 최종적으로 시료 수집용기(sample collection vial)에 회수된 미립자화된 시료(atomized bacterial sample)를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치, 공지된 비드비팅 방법 또는 공지된 초음파처리 방법을 사용하여 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 점선은 비드비팅 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타내고, 실선은 초음파처리 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타낸다.
도 3a는 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 대양한 다양한 직경(0.1, 0.5 및 1.0 mm)의 글래스 비드를 부가하여, 피에조 결합체로부터 유발된 초음파처리와 미립자화 및 비드비팅을 동시에 수행함으로써 얻어진 세포파쇄율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 도 2와 마찬가지로 점선은 비드비팅 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타내고, 실선은 초음파처리 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타낸다.
도 3b는 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 1.0 mm의 글래스 비드를 서로 다른 수준(0.1, 0.2 및 0.5 g)으로 부가하여, 피에조 결합체로부터 유발된 초음파처리와 미립자화 및 비드비팅을 동시에 수행함으로써 얻어진 세포파쇄율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 도 2와 마찬가지로 점선은 비드비팅 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타내고, 실선은 초음파처리 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타낸다.
도 4는 다양한 농도(0, 0.1, 0.25, 0.5 및 1.0%)의 SDS가 처리된 시료를 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치로 파쇄하여 얻어진 세포파쇄율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 도 2와 마찬가지로 점선은 비드비팅 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타내고, 실선은 초음파처리 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타낸다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1A is a photograph showing a form of a portable cell crushing apparatus provided in the present invention. FIG.
1B is a photograph showing a permeable metal diaphragm constituting a piezocomposite included in the portable cell crushing apparatus provided in the present invention.
1C is an enlarged photograph of a part of the permeable metal diaphragm of the present invention.
Fig. 1D is a schematic view showing the role of the holes included in the permeable metal diaphragm constituting the piezocomposite.
FIG. 1E is a schematic view showing a method of disrupting bacteria using the cell-shredding apparatus provided in the present invention. FIG.
FIG. 1F is a photograph showing an atomized bacterial sample applied to the cell disruption apparatus of the present invention and finally recovered in a sample collection vial. FIG.
FIG. 2 is a graph showing the results of comparing the cell disruption rates of disrupted bacteria using the cell disruption apparatus, the known bead beating method, or the known ultrasonic disinfection method provided by the present invention. And the solid line represents the cell disruption rate of the bacterium that has been disrupted by the ultrasonic treatment method.
FIG. 3A shows the results of ultrasonic treatment induced by a piezocomposite and microparticulation and bead beating by adding oceans of various diameter (0.1, 0.5 and 1.0 mm) glass beads to a vertical crushing chamber of the cell disruption apparatus provided in the present invention As shown in FIG. 2, the dotted line indicates the cell disruption rate of the disrupted bacteria by the bead beating method, and the solid line indicates the cell disintegration rate of the disrupted microorganisms by the ultrasonic treatment method .
Fig. 3b shows the results obtained by adding 1.0 mm glass beads at different levels (0.1, 0.2 and 0.5 g) to a vertical crushing chamber of the cell-shredding apparatus provided in the present invention to obtain ultrasound treatment, microparticulation and beads As shown in the graph of FIG. 2, the dotted line represents the cell disruption rate of the disrupted bacterium by the bead beating method, and the solid line represents the cell disruption rate of the disrupted bacterium by the ultrasonic treatment method Lt; / RTI >
FIG. 4 is a graph showing the results of comparing the cell crushing rates obtained by disrupting the SDS-treated samples of various concentrations (0, 0.1, 0.25, 0.5, and 1.0%) with the cell disruption apparatus provided in the present invention, , The dotted line indicates the cell disruption rate of the disrupted bacteria by the bead beating method and the solid line indicates the cell disintegration rate of the disrupted microorganisms by the ultrasonic disinfection method.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: 피에조 결합체를 포함하는 세포파쇄장치의 제작 1: Fabrication of cell disruption apparatus containing piezocomplex
먼저, 투과성 금속제 격막(perforated steel diaphragm)을 준비하고, 상기 투과성 금속제 격막의 하부에 실리콘 링 봉인을 통해 고리형 압전소자 디스크(annular piezoelectric disc)를 결합시킨 형태의 피에조 결합체(piezo-assembly)를 수득하였다.First, a perforated steel diaphragm was prepared, and a piezo-assembly in which an annular piezoelectric disc was coupled through a silicon ring seal to the lower part of the permeable metal diaphragm was obtained. Respectively.
다음으로, 상기 피에조 결합체를 구성하는 투과성 금속제 격막의 위쪽에 실리콘 링 봉인을 통해 수직형 파쇄챔버(lysing chamber)의 하부를 결합시킨 후, 상기 파쇄챔버에 글래스 비드(glass bead)를 부가하여, 휴대용 세포파쇄장치를 제작하였다(도 1a 내지 1f). 도 1a는 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치의 형태를 나타내는 사진이다.Next, a lower portion of a vertical type lysing chamber is coupled to the upper part of the permeable metal diaphragm constituting the piezo-coupled body through a silicon ring seal, and then a glass bead is added to the crushing chamber, To prepare a cell disruption apparatus (Figs. 1A to 1F). BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1A is a photograph showing a form of a portable cell crushing apparatus provided in the present invention. FIG.
또한, 도 1b는 본 발명에서 제공하는 휴대용 세포파쇄장치에 포함된 피에조 결합체를 구성하는 투과성 금속제 격막을 나타내는 사진이다. 도 1b에서 보듯이, 상기 투과성 금속제 격막(두께 약 0.1mm, 직경 약 16mm)은 중앙에 다수의 관통하는 구멍(through-hole)이 구비되어 있는데, 상기 구멍의 직경은 약 20㎛이고 구멍 사이의 간격은 약 100㎛가 되도록 설정하였다. 상기 구멍이 구비된 영역은 중앙부의 약 5mm의 직경을 갖는 원형부위로 설정하였는데, 상기 원형부위의 중심에는 약간 오목한 부위가 구비된 약 3mm의 직경을 갖는 원형부위가 포함되도록 하였다. 상기 오목한 부위는 피에조 결합체에 의하여 발생된 진동을 비평면성 진동으로 전환시켜서, 보다 효과적인 미립자화를 수행할 수 있게 한다.1B is a photograph showing a permeable metal diaphragm constituting a piezocomposite included in the portable cell crushing apparatus provided by the present invention. As shown in FIG. 1B, the permeable metal diaphragm (thickness of about 0.1 mm, diameter of about 16 mm) is provided with a plurality of through-holes at its center, the diameter of which is about 20 μm, The interval was set to be about 100 mu m. The area provided with the hole was set to a circular area having a diameter of about 5 mm at the center, and a circular area having a diameter of about 3 mm with a slightly concave area at the center of the circular area was included. The concave portion converts the vibration generated by the piezoelectric coupling to a non-planar vibration, thereby enabling more effective atomization.
도 1c는 본 발명의 투과성 금속제 격막의 일부를 확대한 사진이고, 도 1d는 피에조 결합체를 구성하는 투과성 금속제 격막에 포함된 구멍의 역할을 나타내는 개략도이다. 도 1c 및 1d에서 보듯이, 상기 피에조 결합체를 구성하는 투과성 금속제 격막에 포함된 구멍은 글래스 비드보다 작은 직경을 갖기 때문에, 상기 구멍을 통해 파쇄된 세균을 포함하는 시료를 아래쪽으로 방출될 수 있으나, 글래스 비드는 방출될 수 없도록 구성하였다.FIG. 1C is a magnified photograph of a part of the permeable metal diaphragm of the present invention, and FIG. 1D is a schematic view showing the role of a hole included in the permeable metal diaphragm constituting the piezo-bonded body. As shown in Figs. 1C and 1D, since the holes included in the permeable metal diaphragm constituting the piezocomposite have a smaller diameter than the glass beads, the sample containing the bacteria broken through the holes can be discharged downward, The glass beads were constructed so that they could not be emitted.
또한, 고리형 압전소자 디스크는 PZT(lead zirconia titanate)로 제작된 두께 약 0.65mm, 내측직경 약 8mm 및 외측직경 약 16mm로 구성되고, 가운데 부분이 없는 고리형태의 것을 사용하였다. 상기 고리형 압전소자 디스크에 전력을 공급하면 진동이 유발되는데, 상기 진동은 투과성 금속제 격막으로 전달되어 증폭됨과 동시에 비평면성 진동으로 전환되어, 세균에 대한 초음파처리 및 미립자화를 유발시킨다.In addition, the annular piezoelectric element disk was formed of lead zirconia titanate (PZT), having a thickness of about 0.65 mm, an inner diameter of about 8 mm, and an outer diameter of about 16 mm, and a ring-shaped one having no middle portion was used. When power is supplied to the annular piezoelectric element disk, vibration is generated. The vibration is transmitted to the permeable metal diaphragm and amplified and converted to a non-planar vibration to induce ultrasonic treatment and microparticulation of bacteria.
도 1e는 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치를 이용하여 시료에 포함된 세균을 파쇄하는 방법을 나타내는 개략도이다. 도 1e에서 보듯이, 피펫(pipette)으로 수직형 파쇄챔버(lysing chamber)에 세균을 포함하는 시료(bacterial sample)를 가하고, 제어판(driving circuit)을 통해 세포파쇄장치를 구동시키면, 피에조 결합체를 구성하는 고리형 압전소자 디스크가 진동한 다음, 상기 진동이 투과성 금속제 격막을 통해 증폭되고 복합진동으로 전환되어, 상기 세균을 포함하는 시료에 초음파처리를 수행함과 동시에 시료의 미립자화를 유도하여 상기 시료에 포함된 세균을 파쇄하고, 상기 시료는 상기 피에조 결합체를 구성하는 투과성 금속제 격막에 구비된 관통하는 구멍(through-hole array)을 통해 하부로 이동하여 미립자화된 시료(atomized bacterial sample)를 형성하며, 상기 미립자화된 시료는 시료 수집용기(sample collection vial)에 회수된다(도 1f). 도 1f는 본 발명의 세포파쇄장치에 적용되어, 최종적으로 시료 수집용기(sample collection vial)에 회수된 미립자화된 시료(atomized bacterial sample)를 나타내는 사진이다.FIG. 1E is a schematic view showing a method of disrupting bacteria contained in a sample using the cell-shredding apparatus provided by the present invention. FIG. As shown in FIG. 1E, when a bacterial sample containing a bacterium is applied to a vertical lysing chamber with a pipette and a cell crushing device is driven through a driving circuit, The vibration is amplified through the permeable metal diaphragm and converted into a composite vibration so that the ultrasonic wave treatment is performed on the sample containing the bacteria and the microparticulation of the sample is induced, And the sample is moved down through a through-hole array provided in a permeable metal diaphragm constituting the piezocomposite to form an atomized bacterial sample, The particulate sample is collected in a sample collection vial (Fig. 1F). FIG. 1F is a photograph showing an atomized bacterial sample applied to the cell disruption apparatus of the present invention and finally recovered in a sample collection vial. FIG.
한편, 상기 파쇄챔버 내에 글래스 비드(glass bead)를 가하면, 고리형 압전소자 디스크에 의해 발생된 진동으로 인하여 비드비팅(bead beating)이 추가로 수행될 수 있다. 이처럼 초음파 처리, 미립자화 및 비드비팅이 동시에 수행될 경우, 상기 시료가 투과성 금속제 격막을 통해 방출되는 속도는 40 ㎖/h 이하가 되도록 설계하였다.On the other hand, when a glass bead is applied to the crushing chamber, bead beating can be further performed due to vibration generated by the annular piezoelectric element disk. When the ultrasonic treatment, the atomization, and the bead beating are simultaneously performed, the rate at which the sample is discharged through the permeable metal septum is designed to be 40 ml / h or less.
결과적으로, 세포파쇄장치는 약 10 cm × 10 cm × 12 cm의 크기를 나타내고, Instrustar ISDS205B 오실로스코프가 구비된 전원공급장치를 사용하여 구동될 수 있도록 제작되었다. 상기 오실로스코프를 통하여, 상기 제작된 세포파쇄장치는 약 12 Vpp 및 약 100 KHz에서 약 50%의 사용율을 나타내는 구형파의 형태로 진동을 유발시킴을 확인하였는데, 이때 소모되는 전체적인 전력소비량은 약 2W임을 확인하였다.As a result, the cell disruption device is approximately 10 cm × 10 cm × 12 cm in size and is designed to be driven using a power supply equipped with an Instrustar ISDS205B oscilloscope. Through the oscilloscope, it was confirmed that the manufactured cell disruption device induced vibration in the form of a square wave having a usage rate of about 50% at about 12 Vpp and about 100 KHz. The total power consumption consumed at this time was about 2 W Respectively.
실시예Example 2: 세포파쇄장치를 이용한 세포파쇄의 효율분석 2: The efficiency of cell disruption using cell disruption device
실시예Example 2-1: 세균을 포함하는 시료의 준비 2-1: Preparation of sample containing bacteria
두터운 펩티도글리칸 층을 포함하여 기계적인 파쇄가 어렵다고 알려진 바실러스 서브틸리스 균주(ATCC 6051)를 대상으로 상기 세포파쇄장치의 파쇄효율을 평가하였다.The Bacillus subtilis strain (ATCC 6051), which is known to be difficult to mechanically break down, including a thick peptidoglycan layer, was evaluated for the efficiency of the cell disruption apparatus.
상기 균주를 LB 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에서 접종하고, 160 rpm으로 교반하면서 배양하고, 상기 배양물을 원심분리하여 세균을 수득하였으며, 상기 수득한 세균을 0.1 moles/L PBS로 2회 세척한 다음, 동일한 용액에 현탁시켜서 현탁액을 수득하였다. 상기 현탁액의 흡광도(OD600)값을 측정한 결과, 흡광도가 1.4인 경우 세균의 함량이 0.5 g/L임을 확인하고, 이하에서는 상기 현탁액을 세균을 포함하는 시료로서 사용하였다.The strain was inoculated in LB medium (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) and cultured with stirring at 160 rpm. The culture was centrifuged to obtain bacteria, and the bacteria obtained were suspended in 0.1 moles / L PBS Washed twice, and then suspended in the same solution to obtain a suspension. As a result of measuring the absorbance (OD 600 ) value of the suspension, it was confirmed that the content of bacteria was 0.5 g / L when the absorbance was 1.4, and the suspension was used as a sample containing bacteria.
실시예Example 2-2: 고리형 압전소자 디스크로부터 유발된 초음파처리와 2-2: Ultrasonic processing induced from annular piezoelectric element disk and 미립자화를To atomize 이용한 세포파쇄의 효율분석 Analysis of cell crushing efficiency
상기 세균을 포함하는 시료 250 ㎕를 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 가하고, 글래스 비드는 가하지 않은 상태로 약 2W의 전력을 가하여 상기 세포파쇄장치를 구동시키고, 파쇄된 세균은 수집용 바이알을 이용하여 회수하였다. 이때, 미립자화 속도를 약 40 ml/h 또는 10.9 ㎕/s가 되도록 설정하여, 250 ㎕ 시료의 총 잔류시간은 약 23초가 되도록 하였다. 또한, 비교군으로서 동일한 세균을 포함하는 시료를 대상으로 0.1 mm의 글래스 비드 0.5 g을 사용하여 3000 rpm으로 비드비팅을 23초간 수행하여 파쇄된 세균 및 동일한 시료를 초음파 분쇄기(P-1 microprobe가 장착된 ultrasonic dismembrator)에 적용하여 10 W로 23초간 처리하여 파쇄된 세균을 사용하였다.250 μl of the sample containing the bacteria was applied to a vertical crushing chamber of a cell crushing apparatus, and power of about 2 W was applied in a state of no glass bead to drive the cell crushing apparatus. The crushed germs were collected using a collection vial Respectively. At this time, the microparticle-forming rate was set to about 40 ml / h or 10.9 μl / s so that the total residence time of the 250 μl sample was about 23 seconds. In addition, samples containing the same bacteria as the comparative group were subjected to bead beating at 3000 rpm for 23 seconds using 0.5 g of glass beads of 0.1 mm, and the broken bacterium and the same sample were placed in an ultrasonic pulverizer (P-1 microprobe And then treated with 10 W for 23 seconds to use shredded bacteria.
상기 파쇄된 각 세균을 14000 rpm 으로 1분동안 원심분리하여 잔류물이 제거된 상층액을 수득하고, 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer ASP-2680)를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 DNA 농도를 측정하였으며, 측정된 DNA 농도를 하기 식에 적용하여, 세포파쇄율을 산출하였다(도 2).Each of the above-mentioned crushed bacteria was centrifuged at 14,000 rpm for 1 minute to obtain a supernatant from which the residue was removed. The absorbance at 260 nm was measured using a spectrophotometer (UV / VIS spectrophotometer ASP-2680) And the measured DNA concentration was applied to the following equation to calculate the cell disruption rate (FIG. 2).
세포파쇄율(%) = (파쇄된 세균에서 얻어진 DNA 농도 - 음성대조군에서 얻어진 DNA 농도)/(양성대조군에서 얻어진 DNA 농도) × 100(%) = (DNA concentration obtained from crushed bacteria - DNA concentration obtained from negative control group) / (DNA concentration obtained from positive control group) x 100
상기 식에서, 음성대조군은 동일한 시료를 14,000 rpm으로 1분동안 원심분리하여 수득한 상층액이고, 양성대조군은 동일한 시료를 초음파 분쇄기에 적용하여 10 W로 1분간 처리한 다음, 이를 원심분리하여 수득한 상층액이다.In the above equation, the negative control group was the supernatant obtained by centrifuging the same sample at 14,000 rpm for 1 minute, and the positive control group was applied to the ultrasonic pulverizer to treat the same sample at 10 W for 1 minute and then centrifuged It is a supernatant.
도 2는 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치, 공지된 비드비팅 방법 또는 공지된 초음파처리 방법을 사용하여 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 점선은 비드비팅 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타내고, 실선은 초음파처리 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치를 사용하여 파쇄된 세균의 세포파쇄율은 약 23.14±1.90%이며, 이는 비드비팅 방법을 통해 얻어진 세포파쇄율(9.82±0.38%)과 초음파처리 방법을 통해 얻어진 세포파쇄율(65.58±1.84%)의 중간값임을 확인하였다.FIG. 2 is a graph showing the results of comparing the cell disruption rates of disrupted bacteria using the cell disruption apparatus, the known bead beating method, or the known ultrasonic disinfection method provided by the present invention. And the solid line represents the cell disruption rate of the bacterium that has been disrupted by the ultrasonic treatment method. As shown in FIG. 2, the cell disruption rate of the disrupted bacterium using the cell disruption apparatus provided by the present invention was about 23.14 ± 1.90%, and the cell disruption rate obtained by the bead beating method (9.82 ± 0.38%) and the ultrasound (65.58 ± 1.84%) obtained by the treatment method.
실시예Example 2-3: 고리형 압전소자 디스크로부터 유발된 초음파처리와 2-3: Ultrasonic processing induced from annular piezoelectric element disk and 미립자화Atomization 및 And 비드비팅을Bead Beating 동시에 수행한 세포파쇄의 효율분석 Analysis of efficiency of simultaneous cell disruption
상기 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 다양한 직경(0.1, 0.5 및 1.0 mm)의 글래스 비드 2g을 부가하거나 또는 1.0 mm의 글래스 비드를 서로 다른 수준(0.1, 0.2 및 0.5 g)으로 부가하여 비드비팅을 동시에 수행하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법을 수행하고, 이로부터 얻어진 파쇄된 세균을 사용하여 세포파쇄율을 분석하였다(도 3a 및 3b).2 g glass beads of various diameters (0.1, 0.5 and 1.0 mm) were added to the vertical crushing chamber of the cell crusher or 1.0 mm glass beads were added at different levels (0.1, 0.2 and 0.5 g) The same method as in Example 2-2 was carried out, and the cell disruption rate was analyzed using the obtained bacterium (Figs. 3A and 3B).
도 3a는 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 대양한 다양한 직경(0.1, 0.5 및 1.0 mm)의 글래스 비드를 부가하여, 피에조 결합체로부터 유발된 초음파처리와 미립자화 및 비드비팅을 동시에 수행함으로써 얻어진 세포파쇄율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 도 2와 마찬가지로 점선은 비드비팅 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타내고, 실선은 초음파처리 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타낸다. 도 3a에서 보듯이, 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 글래스 비드를 부가하여 비드비팅을 동시에 수행하면, 비드의 크기에 상관없이 비드를 부가하지 않은 경우(23.14±1.90%)보다도 세포파쇄율이 증가함(46.06±5.25%, 56.55±1.20% 및 58.74±3.55%)을 확인하였다. FIG. 3A shows the results of ultrasonic treatment induced by a piezocomposite and microparticulation and bead beating by adding oceans of various diameter (0.1, 0.5 and 1.0 mm) glass beads to a vertical crushing chamber of the cell disruption apparatus provided in the present invention As shown in FIG. 2, the dotted line indicates the cell disruption rate of the disrupted bacteria by the bead beating method, and the solid line indicates the cell disintegration rate of the disrupted microorganisms by the ultrasonic treatment method . As shown in FIG. 3A, when the bead beating was performed simultaneously with the glass bead in the vertical crushing chamber of the cell crushing apparatus, the cell crushing rate was higher than that in the case where the bead was not added (23.14 ± 1.90% (46.06 ± 5.25%, 56.55 ± 1.20% and 58.74 ± 3.55%), respectively.
또한, 비드의 직경크기와 세포파쇄율의 상관관계를 분석한 결과, 비드의 직경이 증가할 수록 세포파쇄율이 증가함을 확인하였다. 다만, 비드의 직경을 0.5mm에서 1.0mm로 증가시켰을 때 향상되는 세포파쇄율(약 2.19%)보다도, 0.1mm에서 0.5mm로 증가시켰을 때 향상되는 세포파쇄율(약 10.49%)이 현저하게 높은 값을 나타내었으므로, 비드의 직경이 일정수준에 도달하면, 비드의 직경을 증가시켜도 세포파쇄율이 더 이상 증가되지 않을 것으로 분석되었다.As a result of analysis of the correlation between the diameter of the beads and the cell crushing rate, it was confirmed that the cell crushing rate increases as the diameter of the bead increases. However, when the diameter of the bead is increased from 0.5 mm to 1.0 mm, the rate of cell destruction (about 10.49%), which is improved when it is increased from 0.1 mm to 0.5 mm, is significantly higher than that of the improved cell destruction rate Therefore, when the diameter of the bead reaches a certain level, it is analyzed that even if the diameter of the bead is increased, the cell disruption rate will not be further increased.
도 3b는 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 1.0 mm의 글래스 비드를 서로 다른 수준(0.1, 0.2 및 0.5 g)으로 부가하여, 피에조 결합체로부터 유발된 초음파처리와 미립자화 및 비드비팅을 동시에 수행함으로써 얻어진 세포파쇄율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 도 2와 마찬가지로 점선은 비드비팅 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타내고, 실선은 초음파처리 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타낸다. 도 3b에서 보듯이, 세포파쇄장치의 수직형 파쇄챔버에 동일한 직경의 글래스 비드를 부가하여 비드비팅을 동시에 수행하면, 비드를 부가하지 않은 경우(23.14±1.90%)보다도 비드의 부가수준이 증가할 수록 세포파쇄율이 증가함(54.08±0.73%, 58.74±3.55% 및 63.34±1.39%)을 확인하였다. Fig. 3b shows the results obtained by adding 1.0 mm glass beads at different levels (0.1, 0.2 and 0.5 g) to a vertical crushing chamber of the cell-shredding apparatus provided in the present invention to obtain ultrasound treatment, microparticulation and beads As shown in the graph of FIG. 2, the dotted line represents the cell disruption rate of the disrupted bacterium by the bead beating method, and the solid line represents the cell disruption rate of the disrupted bacterium by the ultrasonic treatment method Lt; / RTI > As shown in FIG. 3B, when the bead beating is performed simultaneously by adding glass beads of the same diameter to the vertical crushing chamber of the cell crushing apparatus, the bead addition level is increased more than when the bead is not added (23.14 ± 1.90%) (54.08 ± 0.73%, 58.74 ± 3.55% and 63.34 ± 1.39%), respectively.
또한, 비드의 부가수준과 세포파쇄율의 상관관계를 분석한 결과, 비드의 부가수준을 0.1g에서 0.2g으로 증가시켰을 때 향상되는 세포파쇄율(약 4.66%)과, 0.2g에서 0.5g으로 증가시켰을 때 향상되는 세포파쇄율(약 4.6%)이 유사한 수준을 나타내었으므로, 비드의 부가수준이 일정수준에 도달하면, 비드의 부가수준을 증가시켜도 세포파쇄율이 더 이상 증가되지 않을 것으로 분석되었다.As a result of analyzing the correlation between the level of addition of beads and the cell crushing rate, it was found that when the addition level of beads was increased from 0.1 g to 0.2 g, the improved cell crushing rate (about 4.66%) and 0.2 g to 0.5 g (About 4.6%) of the cells showed a similar level, and therefore, when the level of addition of the beads reached a certain level, the cell disruption rate would not be further increased even if the addition level of the beads was increased .
실시예Example 2-4: 고리형 압전소자 디스크로부터 유발된 초음파처리와 2-4: ultrasonic treatment induced from annular piezoelectric element disc and 미립자화Atomization 및 계면활성제 처리를 동시에 수행한 세포파쇄의 효율분석 And the efficiency of cell disruption performed simultaneously with surfactant treatment
상기 시료 250 ㎕를 원심분리하여 침전된 세균을 수득하고, 상기 수득한 세균을 다양한 농도(0, 0.1, 0.25, 0.5 및 1.0%(w/v))의 SDS 용액(0.1M PBS) 250 ㎕에 현탁시킨 것을 시료로서 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법을 수행하고, 이로부터 얻어진 파쇄된 세균을 사용하여 세포파쇄율을 분석하였다(도 4).250 μl of the sample was centrifuged to obtain precipitated bacterium. The obtained bacterium was added to 250 μl of SDS solution (0.1 M PBS) at various concentrations (0, 0.1, 0.25, 0.5 and 1.0% (w / v) The same method as in Example 2-2 was carried out except that the suspension was used as a sample, and the cell disruption rate was analyzed by using the shredded bacterium obtained therefrom (FIG. 4).
도 4는 다양한 농도(0, 0.1, 0.25, 0.5 및 1.0%)의 SDS가 처리된 시료를 본 발명에서 제공하는 세포파쇄장치로 파쇄하여 얻어진 세포파쇄율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 도 2와 마찬가지로 점선은 비드비팅 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타내고, 실선은 초음파처리 방법으로 파쇄된 세균의 세포파쇄율을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, SDS 농도를 0에서 0.5%로 증가시키면, 세포파쇄율이 23.14±1.90% 에서 66.13±10.93%로 증가되었으므로, SDS의 농도에 비례하여 세포파쇄율이 증가하는 양상을 나타내었으나, 1%의 SDS를 처리한 경우에는 세포파쇄율이 오히려 감소함을 확인하였다. 이는 과다한 SDS의 처리로 인하여 과도한 거품이 형성되고, 상기 형성된 거품에 의하여 세포파쇄가 억제되었기 때문인 것으로 분석되었다.FIG. 4 is a graph showing the results of comparing the cell crushing rates obtained by disrupting the SDS-treated samples of various concentrations (0, 0.1, 0.25, 0.5, and 1.0%) with the cell disruption apparatus provided in the present invention, , The dotted line indicates the cell disruption rate of the disrupted bacteria by the bead beating method and the solid line indicates the cell disintegration rate of the disrupted microorganisms by the ultrasonic disinfection method. As shown in FIG. 4, when the SDS concentration was increased from 0 to 0.5%, the cell disruption rate was increased from 23.14 ± 1.90% to 66.13 ± 10.93%, and thus the cell disruption rate was increased in proportion to the SDS concentration , And 1% SDS, respectively. It was analyzed that excessive bubbles were formed due to excessive SDS treatment, and cell rupture was suppressed by the bubbles formed.
실시예Example 3: 세균의 파쇄시에 소요된 에너지효율 분석 3: Analysis of Energy Efficiency in Destruction of Bacteria
상기 실시예 2-2 내지 2-4에서 수행한 세균 파쇄시 사용된 에너지 효율을 하기 식으로 산출하고 비교하였다(표 1). 이때, 대조군으로는 초음파 처리에 의하여 파쇄된 세균을 사용하였다.The energy efficiencies used in the disruption of bacteria performed in Examples 2-2 to 2-4 were calculated and compared (Table 1). At this time, as the control group, the bacterium which was disrupted by the ultrasonic treatment was used.
파쇄에너지 효율(%/J) = (세포파쇄율(%))/(잔류시간(s)×전력소비량(W))Fracture energy efficiency (% / J) = (cell crushing ratio (%)) / (residence time (s) × power consumption (W)
세포파쇄장치
세포파쇄장치 + 글래스 비드(1mm, 0.5g)
세포파쇄장치 + 0.5 % SDSUltrasonic treatment (control group)
Cell crushing device
Cell crusher + glass beads (1 mm, 0.5 g)
Cell shredding device + 0.5% SDS
23.14
63.34
66.1365.58
23.14
63.34
66.13
0.50
1.38
1.440.29
0.50
1.38
1.44
상기 표 1에서 보듯이, 대조군에 비하여 본 발명의 세포파쇄장치를 사용할 경우에는 파쇄에너지 효율이 약 1.7배 증가하였고, 상기 세포파쇄장치에 글래스 비드를 부가하여 비드비팅을 추가로 수행하거나 또는 SDS를 처리한 경우에는 대조군 대비 파쇄에너지 효율이 각각 약 4.8배 또는 약 5.0배 증가함을 알 수 있었다. 특히, 상기 세포파쇄장치에 글래스 비드를 부가하거나 SDS를 처리한 경우에는 세포파쇄율의 측면에서 대조군과 동등한 수준을 나타내면서도, 파쇄에너지 효율이 현저하게 증가됨을 알 수 있었다.As shown in Table 1, when using the cell disruption apparatus of the present invention, the breaking energy efficiency was increased about 1.7 times as compared with the control group. Glass beads were added to the cell disruption apparatus to perform bead beating or SDS The fracture energy efficiency increased about 4.8 times or about 5.0 times compared with the control. Particularly, when glass beads were added to the cell disruption apparatus or treated with SDS, it was found that the efficiency of disruption energy was remarkably increased even though the cell disruption rate showed the same level as that of the control group.
따라서, 본 발명의 세포파쇄장치는 단독으로 사용하여도, 종래의 초음파 처리장치보다 우수한 파쇄에너지 효율을 나타낼 뿐만 아니라, 글래스 비드 또는 SDS 처리를 동시에 수행할 경우에는, 동등한 수준의 세포파쇄율을 나타내면서도 종래의 초음파 처리장치보다 파쇄에너지 효율이 현저하게 증가됨을 알 수 있었다.Therefore, the cell-shredding apparatus of the present invention not only exhibits better crush energy efficiency than the conventional ultrasonic treatment apparatus even when used alone, but also exhibits an equivalent level of cell crushing rate when glass beads or SDS treatment are simultaneously carried out It was also found that the fracture energy efficiency was significantly increased as compared with the conventional ultrasonic treatment apparatus.
Claims (16)
상기 파쇄챔버의 하단에 장착되는 피에조 결합체; 및
상기 피에조 결합체의 하측에 배치되는 수집용 챔버;를 포함하고,
상기 피에조 결합체는,
다수의 관통 구멍을 가지며, 상기 다수의 관통 구멍이 형성된 영역에 오목한 부위가 포함된 금속제 격막;
상기 금속제 격막 하단에 장착되어, 상기 금속제 격막의 진동을 유발하는 고리형 압전소자 디스크;를 포함하는,
휴대용 세포파쇄장치.
A crushing chamber into which a sample and a plurality of beads are charged;
A piezo-electric coupling mounted on the lower end of the crushing chamber; And
And a collecting chamber disposed under the piezoelectric coupling,
The piezo-
A metal diaphragm having a plurality of through holes, the metal diaphragm including a concave portion in a region where the plurality of through holes are formed;
And an annular piezoelectric element disk mounted on the lower end of the metal septum to cause vibration of the metal septum.
Portable cell crushing device.
상기 비드의 재질은 열경화성 수지 및 강화 글래스 중 선택된 어느 하나인 것인,
휴대용 세포파쇄장치.
The method according to claim 1,
Wherein the material of the bead is one selected from a thermosetting resin and a tempered glass.
Portable cell crushing device.
상기 복수의 비드 중 어느 하나의 비드의 직경은 0.1 내지 2mm이고, 상기 복수의 비드의 총 중량은 0.1 내지 1g인,
휴대용 세포파쇄장치.
The method according to claim 1,
Wherein a diameter of one of the plurality of beads is 0.1 to 2 mm and a total weight of the plurality of beads is 0.1 to 1 g,
Portable cell crushing device.
상기 피에조 결합체에 전력을 공급하는 전원공급장치를 더 포함하는,
휴대용 세포파쇄장치.
The method according to claim 1,
Further comprising a power supply for supplying power to the piezo-
Portable cell crushing device.
상기 전원공급장치는 전원, 상기 전원공급장치를 작동하는데 사용되는 제어판넬 및 상기 제어판넬의 작동수준을 표시할 수 있는 LCD 디스플레이를 포함하는 것인,
휴대용 세포파쇄장치.
6. The method of claim 5,
Wherein the power supply comprises a power supply, a control panel used to operate the power supply, and an LCD display capable of indicating an operating level of the control panel.
Portable cell crushing device.
상기 휴대용 세포파쇄장치는 시료에 포함된 세균의 DNA를 추출하기 위하여, 상기 세균을 파쇄하는 수단으로 사용되는 것인,
휴대용 세포파쇄장치.
The method according to claim 1,
Wherein the portable cell-crushing device is used as a means for breaking down the bacteria to extract the DNA of the bacteria contained in the sample,
Portable cell crushing device.
상기 시료는 세균의 파쇄효율을 향상시킬 수 있는 계면활성제를 추가로 포함하는 것인,
휴대용 세포파쇄장치
8. The method of claim 7,
Wherein the sample further comprises a surfactant capable of improving the efficiency of shredding bacteria.
Portable cell crusher
상기 계면활성제의 농도는 0.1 내지 1.0%(w/v)인 것인,
휴대용 세포파쇄장치.
9. The method of claim 8,
Wherein the concentration of the surfactant is 0.1 to 1.0% (w / v).
Portable cell crushing device.
상기 계면활성제는 SDS(sodium dodecylsulfate)인 것인,
휴대용 세포파쇄장치.
9. The method of claim 8,
Wherein the surfactant is sodium dodecylsulfate (SDS).
Portable cell crushing device.
상기 세균은 그람음성 세균인 것인,
휴대용 세포파쇄장치.
8. The method of claim 7,
Wherein the bacterium is a gram-negative bacterium.
Portable cell crushing device.
상기 그람음성 세균은 펩티도글리칸층이 포함된 세포벽을 갖는 것인,
휴대용 세포파쇄장치.
12. The method of claim 11,
Wherein the gram-negative bacterium has a cell wall containing a peptidoglycan layer.
Portable cell crushing device.
상기 휴대용 세포파쇄장치는,
시료와 복수의 비드가 투입되는 파쇄챔버;
상기 파쇄챔버의 하단에 장착되는 피에조 결합체; 및
상기 피에조 결합체의 하측에 배치되는 수집용 챔버;를 포함하고,
상기 피에조 결합체는,
다수의 관통 구멍을 가지며, 상기 다수의 관통 구멍이 형성된 영역에 오목한 부위가 포함된 금속제 격막; 및
상기 금속제 격막 하단에 장착되어, 상기 금속제 격막의 진동을 유발하는 고리형 압전소자 디스크;를 포함하며,
상기 방법은,
(a) 상기 파쇄챔버에 시료와 복수의 비드를 투입하는 단계;
(b) 상기 고리형 압전소자 디스크가 진동하여 상기 시료에 포함된 세포를 파쇄하는 단계; 및
(c) 상기 수집용 챔버가 상기 다수의 관통 구멍을 통해 방출된 파쇄된 세포를 회수하는 단계;를 포함하는,
세포 파쇄 방법.
A method for disrupting cells using a portable cell disruptor,
The portable cell crushing apparatus may further comprise:
A crushing chamber into which a sample and a plurality of beads are charged;
A piezo-electric coupling mounted on the lower end of the crushing chamber; And
And a collecting chamber disposed under the piezoelectric coupling,
The piezo-
A metal diaphragm having a plurality of through holes, the metal diaphragm including a concave portion in a region where the plurality of through holes are formed; And
And an annular piezoelectric element mounted on the lower end of the metal diaphragm to cause vibration of the metal diaphragm,
The method comprises:
(a) injecting a sample and a plurality of beads into the crushing chamber;
(b) breaking the cells contained in the sample by vibrating the annular piezoelectric element disk; And
(c) recovering the disrupted cells released through the plurality of through-holes by the collecting chamber.
Cell disruption method.
상기 (b) 단계는,
상기 고리형 압전소자 디스크에 전력을 공급함으로써, 상기 고리형 압전소자 디스크가 진동하여 상기 시료에 포함된 세포를 파쇄하는 단계이고,
상기 고리형 압전소자 디스크에 공급되는 전력은 1W 내지 3W인,
세포 파쇄 방법.
14. The method of claim 13,
The step (b)
And supplying power to the annular piezoelectric element disk, the annular piezoelectric element disk vibrates to break the cells contained in the sample,
The power supplied to the annular piezoelectric element disk is 1 W to 3 W,
Cell disruption method.
(d) 상기 파쇄된 세포로부터 DNA를 수득하는 단계를 더 포함하는,
세포 파쇄 방법.
14. The method of claim 13,
(d) obtaining DNA from said shredded cells. < RTI ID = 0.0 >
Cell disruption method.
상기 (d) 단계는,
상기 파쇄된 세포를 원심분리하여 상층액을 수득하여 DNA를 수득하는 단계인,
세포 파쇄 방법.16. The method of claim 15,
The step (d)
Centrifuging the shredded cells to obtain a supernatant to obtain DNA,
Cell disruption method.
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