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KR101720760B1 - Ｉｇｆｂｐ-4에 대한 ｐａｐｐ-ａ 활성의 선택적 엑소사이트 억제 - Google Patents

Ｉｇｆｂｐ-4에 대한 ｐａｐｐ-ａ 활성의 선택적 엑소사이트 억제 Download PDF

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KR101720760B1
KR101720760B1 KR1020107018890A KR20107018890A KR101720760B1 KR 101720760 B1 KR101720760 B1 KR 101720760B1 KR 1020107018890 A KR1020107018890 A KR 1020107018890A KR 20107018890 A KR20107018890 A KR 20107018890A KR 101720760 B1 KR101720760 B1 KR 101720760B1
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클라우스 옥스빅
제이콥 호지 믹켈슨
클라우스 가이럽 닐슨
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오르후스 우니베르시테트
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Abstract

본 발명은 한 실시양태에서 PAPP-P의 LNR3을 포함하는 영역에 결합하고, IGFBP-4의 단백질분해를 효과적으로 억제하고 IGFBP-5에 대해서는 그렇지 않은 항체와 같은 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자에 관한 것이다. LNR3을 포함하는 상기 영역은 선택적인 단백질분해 억제를 표적으로 할 수 있는 기질 결합 엑소사이트를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 한 실시양태에서 엑소사이트의 표적화에 의한 천연 프로테아제 기질의 차별적 억제에 관한 것이다.

Description

ＩＧＦＢＰ-4에 대한 ＰＡＰＰ-Ａ 활성의 선택적 엑소사이트 억제{SELECTIVE EXOSITE INHIBITION OF PAPP-A ACTIVITY AGAINST IGFBP-4}
본원은 각기 본원에 전문이 참조 인용되는, 2008년 1월 25일에 출원된 미국 가특허출원 일련 번호 제61/023,631호 및 2008년 2월 1일에 출원된 미국 가특허출원 일련 번호 제61/025,545 호의 정규 출원이다. 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/023,631호 및 제61/025,545호, 또는 본원에 인용되는 모든 특허 및 비특허 참조문헌들도 또한 본원에 전문이 참조 인용된다.
기술 분야
본 발명은 1개 이상의 기질 결합 엑소사이트(들)를 표적화함으로써 프로테아제의 2개 이상의 생리학적 기질의 전반적 억제 또는 차별적 억제를 유발하는 하나 이상의 프로테아제 억제제에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 구체적으로 PAPP-A에서의 엑소사이트(들) 표적화에 관한 것이다.
인슐린-유사 성장 인자(IGF-I 및 -II)는 세포 증식, 이주 및 분화에 대한 자가분비 및 측분비 영향을 미치는 대략 70개 잔기의 폴리펩티드이다. IGF는 IGF-1 수용체(IGFR)에는 결합하나, 일련의 6개의 결합 단백질인 IGFBP-1 내지 -6은 IGF-I 및 -II에 대한 친화도가 더 높다는 이유로 IGFR로부터 IGF를 격리시킬 수 있다. 그러나, 생물활성 IGF는 결합 단백질의 단백질분해 절단으로 인해 상기 복합체로부터 방출되어, IGF에 대한 친화도가 감소된 IGFBP 단편이 발생되도록 유발할 수 있다. 구체적인 제한적 단백질분해는 IGF 활성화의 주요 기전을 나타낸다.
몇가지 일련의 증거들은, 메탈로프로테이나제 임신-관련 혈장 단백질-A(PAPP-A, 파파리신(pappalysin)-1, EC 3.4.24.79)이 IGF계에서 기능한다는 것을 입증하였다. PAPP-A는 IGFBP-4와 IGFBP-5를 특이적으로 절단함으로써, 격리된 IGF를 해리하거나 결합 단백질 불활성화를 유발한다. PAPP-A 녹아웃(knockout) 마우스는 야생형 배(littermate)에 비해 체중이 60% 감량된, 비례적 구루병을 가진 것이다. 이 표현형은 IGF-II 녹아웃 마우스의 표현형과 유사한데, 이는 IGF-II 활성이 IGFBP-4 의 절단이 IGF의 수용체로의 최종 전달을 가능하게 하는 조기 태아 발달에 있어 PAPP-활성을 필요로 한다는 가설을 지지한다. 생후, PAPP-A 및 IGFBP-4는 세포 증식의 많은 상이한 과정들, 예컨대 상처 치유, 모낭 선택, 이식, 근아세포 증식 및 분화, 및 생체내 골형성에 연관된 것으로 보인다. PAPP-A는 혈관신생술 후 혈관 평활근 세포에 의해 생성되는데, 이는 그것이 신생내막 세포 증식을 촉진함을 제시하고, 또한 급성 관상동맥증후군의 혈청 마커인 것으로 나타났는데, 이는 무엇보다 그것이 불안정한 아테롬경화성 플라크에서 다량 합성되기 때문이다.
400 kDa PAPP-A는 1547개 잔기로 된 서브유닛을 2개 가지고 있고, 메탈로프로테이나제의 메트진신(metzincin) 초과(superfamily)에 속한다. 비공지 기능의 라미닌 G-유사 모듈은 단백질분해 도메인에 대한 N-말단에 존재하고, PAPP-A가 세포 표면에 결합할 수 있도록 하는 5개의 보체 조절 단백질(CCP) 모듈이 서브유닛의 C-말단부에 위치한다(도 1). 부가적으로, PAPP-A는 PAPP-A, 그것의 동족 PAPP-A2 및 노치 수용체의 과(family)에 고유한 3가지 Lin12-노치 반복(Lin12-Notch repeat; LNR) 모듈을 포함한다. PAPP-A 및 PAPP-A2에서, 2개의 LNR 모듈(LNR1 및 2)은 단백질분해 도메인 내로 삽입되는 반면, 세 번째 모듈(LNR3)은 CCP 모듈에 대한 C-말단에 위치한다(도 1). PAPP-A 이량체 내에서, LNR 모듈은 아마도 하나의 서브유닛으로부터의 LNR1 및 2와 다른 하나의 서브유닛으로부터의 LNR3으로 구성된 삼량체 단위를 형성한다. 절충된 LNR 기능성은 PAPP-A가 IGFBP-4를 절단할 수 없도록 하는 반면, IGFBP-5의 절단은 영향을 받지 않는다.
IGF는 정상적 생리학과 인간 질병, 예를 들어 암 및 심혈관계 질병 모두에 관련되어 있어, IGF 신호전달의 직접적 억제 방법이 개발 중에 있다. 그러나, 성장 촉진 단백질분해 활성의 특이적 억제는 중요한 대안을 나타낼 수 있는데, 이는 특히 그러한 IGF 수용체 자극 억제가 인슐린 신호전달 및 정상적 생리학의 기타 측면을 저해할 것 같지 않기 때문이다.
엑소사이트 억제의 원리는 인간 질병과 관련된 많은 단백질분해 효소들, 특히 다중도메인 효소, 예컨대 대규모 군의 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 및 관련 효소에 대해 매우 적절하다. 기질 결합 엑소사이트 표적화에 의한 억제는, 직접적 활성 부위 억제에 비해 2가지 이상의 이점, 즉 특이성 및 선택성의 이점을 가진다. 먼저, 엑소사이트에 대해 지정되는 억제제는 유사한 활성 부위 구성을 가지는 다른 관련 프로테이나제의 활성에 영향을 줄 가능성이 덜하다. 두 번째로, 주어진 프로테이나제의 상이한 기질의 절단은 동일한 엑소사이트를 이용하지 않을 수 있어, 차별적으로 억제될 수 있다.
문헌은 엑소사이트 표적화에 의한 단백질분해 억제의 다수 예들을 가지고 있다. 예를 들어, I형 젤라틴 및 IV형 콜라겐의 MMP-2 절단은 합성 펩티드를 이용한 콜라겐 결합 도메인 표적화에 의해 억제되었고, 베타-APP 절단 효소의 촉매작용 부위와 구분된 기질 결합 포켓은 합성 펩티드에 의해 표적화되었다. 또한, 응고 효소 인자 VIIa에 대해 많은 엑소사이트 억제제들이 개발되었고, 이 프로테이나제에 대해 특이적이기는 하나, 그것의 수가지 생물학적 기질들 모두가 상기 억제제에 의해 표적화된다. 그러므로, 본 발명자들이 알고 있는 바로는, PAPP-A에 의한 IGFBP-4 단백질분해의 억제는 엑소사이트 표적화에 의한 하나의 천연 프로테이나제 기질의 선택적 억제의 첫 번째 예를 나타낸다.
발명의 개요
한 실시양태에서, 본 발명은 PAPP-A의 LNR3을 포함하는 영역에 결합하고 IGFBP-4의 단백질분해는 효율적으로 억제하면서 IGFBP-5의 단백질 분해는 보다 덜 억제하는 모노클로날 scFv 항체와 같은 항체의 생성에 관한 것이다. LNR3을 포함하는 영역은 선택적 단백질분해 억제에 의해 표적화될 수 있는 기질 결합 엑소사이트를 나타낸다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 엑소사이트 표적화에 의한 천연 프로테아제 기질의 차별적 억제에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3 중 어느 하나, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3 중 어느 하나의 폴리펩티드 단편으로 구성되는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편은 분자에 결합함으로써 폴리펩티드 또는 이의 단편의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명은 또한 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는, 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 폴리펩티드 변이체, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 단편의 폴리펩티드 변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 PAPP-A-유래 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 분자에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3, 또는 이의 천연 발생 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 5 또는 서열 번호 6, 또는 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 결합 단편을 포함하거나 이로 구성되는 항체에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 이의 단편은 PAPP-A 엑소사이트(들)와 상호작용할 수 있다. 본 발명은 또한 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또한 서열 번호 7, 또는 서열 번호 7의 결합 단편을 포함하거나 이로 구성되는 항체에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 이의 단편은 PAPP-A 엑소사이트(들) 외측의 PAPP-A와 상호작용할 수 있다. 본 발명은 또한 서열 번호 7의 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고 상기 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주 생물에서 시험관내, 또는 생체내 발현함으로써 상기 폴리펩티드를 생성시키는 단계를 포함하는, 상기 기재된 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드 또는 이의 변이체 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 엄격한 조건 하에서 상기 기재된 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드의 일부가 엄격한 조건 하에서 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 뉴클레오티드 서열의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드화하는, 상기 기재된 바에 따른 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 엑소사이트(들) 서열 번호 2를 포함하는 PAPP-A의 단편에 관한 것이다.
다른 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 3과 같은 PAPP-A 엑소사이트(들)를 포함하는 폴리펩티드 서열, 및 상기 엑소사이트(들)에 대한 친화성을 가지는 결합 파트너를 포함하는 복합체에 관한 것으로서, 여기서 엑소사이트(들)에 대한 결합 파트너의 결합은 PAPP-A의 활성을 변경시킨다.
추가로, 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적당한 숙주 세포 내 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어할 수 있는 조절 서열에 임의적으로 연결된다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상 및/또는 상기 기재된 발현 벡터를 포함하는 단리된 재조합 또는 트랜스제닉 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나의 또는 상기 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 재조합 또는 트랜스제닉 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 및 임의적으로 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 트랜스제닉, 포유동물 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 상기 폴리펩티드를 생성하는 트랜스제닉, 포유동물 숙주 세포를 발생시키는 단계를 포함하는, 트랜스제닉, 포유동물 숙주 세포의 발생 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상 및/또는 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상 및/또는 상기 기재된 벡터를 포함하는 재조합 박테리아 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 박테리아 세포 내로 도입하는 단계, 및 임의적으로 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 박테리아 세포 내에서 발현시킴으로써 상기 폴리펩티드를 생성하는 재조합 박테리아 세포를 발생시키는 단계를 포함하는, 재조합 박테리아 세포의 발생 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상 및/또는 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상 및/또는 상기 기재된 벡터를 포함하는 재조합 효모 세포를 포함하는 재조합 효모 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 재조합 또는 트랜스제닉 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 및 임의적으로 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 재조합 또는 트랜스제닉 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 상기 폴리펩티드를 생성하는 재조합 또는 트랜스제닉 숙주 세포를 발생시키는 단계를 포함하는, 재조합 또는 트랜스제닉 숙주 세포의 발생 방법에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 숙주 세포를 포함하는 트랜스제닉, 포유동물 유기체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 효모 세포 내로 도입하는 단계, 및 임의적으로 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 효모 세포 내에서 발현시킴으로써 상기 폴리펩티드를 생성하는 재조합 효모 세포를 발생시키는 단계를 포함하는, 재조합 효모 세포의 발생 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상 및/또는 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상 및/또는 상기 기재된 벡터를 포함하는 재조합 진균류 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 진균 세포 내로 도입하는 단계, 및 임의적으로 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 진균 세포 내에서 발현시킴으로써 상기 폴리펩티드를 생성하는 재조합 박테리아 세포를 발생시키는 단계를 포함하는, 재조합 진균 세포의 발생 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 E. 콜라이를 선택된 파지로 감염시키는 단계, 및 배양을 유도하여 발현된 단백질을 생성시키고 정제하는 단계를 포함하는, PAPP-A 내 엑소사이트(들)에 특이적인 모노클로날 파지-유래 scFv 항체의 발생 방법에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 항체 반응을 도출하는 조건 하에서 포유동물 대상을 상기 폴리펩티드로 면역화하는 단계, 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 동정하는 단계, 및 임의적으로 상기 포유동물 대상으로부터 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상에 특이적인 폴리클로날 항체 또는 이의 결합 단편의 발생 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항체 반응을 도출하는 조건 하에서 포유동물 대상을 상기 폴리펩티드로 면역화하는 단계, 상기 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리드를 제조하는 단계, 및 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 동정하는 단계를 포함하는, 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상에 특이적인 모노클로날 항체의 발생 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 항체에 의해 인식될 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 생리학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 임의적으로 하나 이상의 부가적 생물활성제(들)와 조합하여 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 의료적 용도를 위한, 항혈소판제, 항응고제, 섬유소용해제, 심혈관계 질병 치료 약물, 골다공증 치료 약물, 항암 약물의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부가적 생물활성제(들)와 조합하여 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상 또는 상기 기재된 약학적 조성물, 및 암, 하나 이상의 유형의 심혈관계 질병 및 골다공증 중 하나 이상의 유형을 치료하는 약물의 1개 이상의 부가적 성분을 포함하는 성분 키트(kit-of-parts)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 폴리펩티드를 추출하는 단계 및 상기 결합 파트너를 단리하는 단계를 포함하는, 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상에 대한 결합 파트너를 동정하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 상기 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PAPP-A의 기질 중 하나 이상의 단백질분해를 억제하기 위해 PAC1 및/또는 PAC2와 같은 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자를 포함한 엑소사이트 상호작용자를 이용하여 본 처치를 필요로 하는 개체를 처치하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 기질 결합 엑소사이트를 표적화함으로써 엑소사이트를 포함하는 프로테이나제의 1개 이상의 생리학적 기질의 전반적 억제를 유발하는 엑소사이트 상호작용자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 기질 결합 엑소사이트를 표적화함으로써 엑소사이트를 포함하는 프로테이나제의 2개 이상의 생리학적 기질의 차별적 억제를 유발하는 엑소사이트 상호작용자에 관한 것이다.
정의/약어
PAPP-A: 임신-관련 혈장 단백질-A. 본 문헌 내의 PAPP-A의 모든 개시내용은 또한 본 문헌 내에 기재된 PAPP-A 변이체 중 임의의 것에 관한 것이다.
PAC1: PAPP-A 엑소사이트 항체. 본 문헌 내의 PAC1의 모든 개시내용은 또한 본 문헌 내에 기재된 PAC1 변이체 중 임의의 것에 관한 것이다.
PAC2: PAPP-A 엑소사이트 항체. 본 문헌 내의 PAC2의 모든 개시내용은 또한 본 문헌 내에 기재된 PAC2 변이체 중 임의의 것에 관한 것이다.
PAC5: PAPP-A 비-엑소사이트 항체. 본 문헌 내의 PAC5의 모든 개시내용은 또한 본 문헌 내에 기재된 PAC5 변이체 중 임의의 것에 관한 것이다.
본원에 사용되는 용어 "치료하는 것(treating)", "치료(treatment)" 및 "요법"은 치유적 요법, 예방적 또는 방지적 요법 및 경감 요법을 동등하게 칭한다. 상기 용어는 임상적으로 달성될 수 있는 유익하거나 요망되는 생리학적 활성을 수득하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 요망되는 임상적 결과에는 검출가능 또는 검출불가능의 여부를 불문한, 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 상태/증상의 진전 지연 또는 저속화, 상태 또는 증상의 경감 또는 완화, 및 (부분적 또는 총체적 여부를 불문한) 감퇴가 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 본원에 사용되는 용어 "완화(palliation)", 및 이의 변형 표현은, 본 발명의 조성물을 투여하지 않은 경우에 비해, 생리학적 상태 또는 증상의 정도 및/또는 바람직하지 못한 표시가 경감되고/되거나 진전 시간 과정이 완화되거나 연장되는 것을 의미한다.
용어 "2차적 예방"은 병리학적 상태, 예컨대 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 협심증 및 말초 동맥 질병의 1차적 발생 후의 예방적 치료를 가리킨다.
"치료 효과" 또는 "치료적 효과"는, 용어 "처치하는 것" 및 "처치"의 정의를 구성하는 기준에 의해 측정 시, 피처치 상태에 변화가 있는 경우에 나타나는 것이다. 5% 이상의 개선, 바람직하게는 10% 개선, 보다 바람직하게는 25% 이상, 보다 더 바람직하게는 50% 이상, 예컨대 75% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상의 개선이 있는 경우에, 피처치 상태의 "변화"가 있는 것이다. 변화는 개체 내 피처치 상태의 심각도의 개선, 또는 생물활성제, 또는 본 발명의 약학적 조성물과 조합되는 생물활성제를 이용한 처치의 동반 및 비동반 하에서의 개체 집단의 향상된 상태의 빈도의 차이에 기초할 수 있다.
"생물활성제"의 "약리학적 유효량", "약학적 유효량" 또는 "생리학적 유효량"은, 약학적 조성물을 투여할 때 예상되는 생리학적 반응을 얻기 위해 피처치 개체 내의 혈류 또는 작용 부위(예를 들어, 폐, 위계, 직장결장계, 전립선 등)에 요망되는 수준의 활성제를 제공하기 위해 필요한, 본원에 기재된 약학적 조성물 내에 존재하는 활성제의 양이다. 정확한 양은 다수의 인자들, 예를 들어, 활성제, 조성물의 활성, 이용하는 전달 장치, 조성물의 물리적 특성, 의도하는 환자 용도(즉, 일일 투여 용량수), 환자 고려사항 등의 의존하고, 본원에 제공되는 정보에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 생물활성제의 "유효량"은 1회 투여로, 또는 총 유효량을 구성하는 양의 다수회 투여를 통해, 바람직하게는 24시간 내에 투여될 수 있다. 그것은 적절한 양 및 투여 타이밍 결정을 위한 표준 임상 절차를 이용하여 결정될 수 있다. "유효량"은 치료 보건 전문가 및/또는 개인의 부분에 대한 실험적 결정 및/또는 개체화(사례별) 결정의 결과일 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용되는 용어 유익한 효과를 "증진하는 것" 및 "개선하는 것", 및 이의 변형된 표현은 플라시보 대비 생물활성제의 치료 효과, 또는 본 발명의 생물활성제없이 투여될 때 통상 수득되는 효과 대비 상기 최신 기술의 의료 처치의 치료 효과의 증가를 지칭한다. "치료 효과"의 증가는 생물활성제(들)의 투여 결과로서 수득되는 치료 효과의 강도 및/또는 정도의 가속화 및/또는 증가가 있을 때 나타내어진다. 그것은 또한 치료 이익의 지속기간 연장도 포함한다. 그것은 또한 생물활성제 부재 하에 보다 많은 양의 약학적 조성물로 투여될 때와 대비하여, 본 발명에 의해 제공되는 생물활성제(들)와 함께 통시 투여될 때 동일한 이익 및/또는 영향 수득하는 데 보다 적은 양의 약학적 조성물의 필요한 경우도 나타낼 수 있다. 증진 효과는 바람직하게, 단 반드시 그러한 것은 아니나, 약학적 조성물 단독으로는 효과적이지 않거나 덜 치료 효과적인 급성 증상이 치료되도록 한다. 증진은, 약학적 조성물 단독 투여와 대비하여, 본 발명의 생물활성제를 약학적 조성물과 동시 투여할 때 치료 효과의 5% 이상의 증가, 예컨대 치료 효과의 10% 이상의 증가가 있을 때, 달성된다. 바람직하게, 증가는 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상이다.
본원에 사용되는 생물활성제(들), 또는 생물활성제 및 최신 기술의 의약의 "동시 투여하는 것" 또는 "동시 투여"는 일정 기간 내에 본 발명의 하나 이상의 생물활성제의 투여 또는 본 발명의 하나 이상의 생물활성제와 최신 기술의 약학적 조성물의 투여를 가리킨다. 시간은 바람직하게 72시간 미만, 예컨대 48시간 미만, 예를 들어 24시간 미만, 예컨대 12시간 미만, 예를 들어 6시간 미만, 예컨대 3시간 미만이다. 그러나, 이 용도들은 또한 생물활성제 및 치료적 조성물이 함께 투여될 수 있음도 또한 의미한다.
용어 "개체(individual)"는 척추동물, 포유동물의 특정 구성원을 가리키고, 이에는 가축, 예컨대 소, 말, 돼지, 양, 밍크, 개, 고양이, 마우스, 기니아피크, 토끼, 래트; 스포츠 동물, 예컨대 말, 폴리포니, 개, 낙타, 및 인간을 포함한 영장류가 포함되나 이들에 국한되지 않는다.
"폴리펩티드"는 천연 또는 합성 생성과 무관하게, 바람직하게 펩티드 결합에 의해서만 결합된 아미노산 잔기의 중합체이다. 비-숙주 DNA 분자의 발현에 의해 생성되는 폴리펩티드는 "이종성" 펩티드 또는 폴리펩티드. 본원에 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드를 포괄하는데, 상기 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 번역후 개질되었거나 그렇지 않을 수도 있다. 번역후 개질은 예를 들어 인산화, 메틸화 및 글루코실화일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 골다공증은 정상적 골 밀도 및 탄성이 손실됨으로써 부서지기 쉬운 골이 되도록 하는 것을 특징으로 하는 상태를 지칭한다.
용어 "예를 들어 서열 번호 1에 대해 상동성인 것"은 예를 들어 서열 번호 1 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드라는 점에서, 예를 들어 서열 번호 1과 유사하나 동일하지는 않은 서열을 가지는 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "예를 들어 서열 번호 1의 변이체"는 예를 들어 서열 번호 1 또는 이의 단편의 폴리펩티드 변이체라는 점에서, 예를 들어 서열 번호 1과 유사하나 동일하지는 않은 서열을 가지는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체 폴리펩티드는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 변형인 아미노산 서열을 가진다. 변형은 예를 들어 서열 번호 1의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 변경시키는 것이 아니라 서열을 변경시키는 하나 이상의 보존적 치환(들) 또는 하나 이상의 균등한 치환(들)을 포함한다.
본 발명은 또한 폴리펩티드 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7, 또는 이의 단편의 변이체에 관한 것으로서, 여기서 치환은 단백질 기능에 영향을 주는지의 여부를 예측하기 위해 서열 상동성을 이용하는 연산 분석에 의해 설계되었다(예를 들어, 문헌 [Pauline C. Ng and Steven Henikoff, Genome Research, Vol. 11, Issue 5, 863-874, May 2001]).
"단리된 폴리펩티드"는 본질적으로 세포 성분, 예컨대 탄수화물, 지질, 또는 성분상 폴리펩티드와 연관된 기타 단백질성 불순물이 본질적으로 없는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 단리된 폴리펩티드의 제제는 매우 높은 순도, 약 80% 이상의 순도, 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 95% 초과의 순도, 또는 99% 초과의 순도의 폴리펩티드를 함유한다. 특정 단백질 제제가 단리된 폴리펩티드를 함유하는 것을 나타내 보이는 한 방법은, 단백질 제제의 나트륨 도데실 황산염(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 후에 단일 밴드가 나타나는 것에 의한 것이다. 그러나, 용어 "단리된"은 대안적 물리적 형태, 예컨대 이량체 또는 대안적으로 글리코실화 또는 유도체화된 형태의 동일 폴리펩티드의 존재를 배제하지 않는다.
용어 "오르토로그(ortholog)"는 다른 한 종으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 상대측이 되는 한 종으로부터 수득된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 오르토로그 간의 서열 차는 종 분화의 결과이다.
"파라로그(paralog)"는 생물에 의해 만들어진, 구분되어 있으나 구조적으로 관련된 단백질이다. 파라로그는 유전자 복제를 통해 발생하는 하는 것으로 판단된다. 예를 들어, 알파-글로빈, 베타-글로빈, 및 미오글로빈는 상호간의 파라로그이다.
본원에 사용되는 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오티드, 및 결찰, 절제, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 발생되는 단편을 지칭한다. 핵산 분자는 천연 발생 뉴클레오티드(예컨대, DNA 및 RNA), 또는 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, (천연 발생 뉴클레오티드의 알파-거울이성질체 형태), 또는 이들 모두의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 부분 및/또는 피리미딘 또는 푸린 염기 부분이 변경된 것일 수 있다. 당 변형에는 예를 들어, 하나 이상의 히드록실기의 할로겐, 알킬기, 아민 및 아지도기로의 치환이 포함되거나, 당은 에테르 또는 에스테르로서 작용화될 수 있다. 또한, 전체 당 부분은 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조로 치환될 수 있는데, 예컨대 아자-당 및 카르보시클릭 당 유사체가 있다. 염기 부분의 변형의 예에는 알킬화된 푸린 및 피리미딘, 아실화된 푸린 또는 피리미딘, 또는 다른 공지된 복소환 치환체가 포함된다. 핵산 단량체는 상기 연결기의 포스포디에스테르 결합 또는 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결기의 유사체에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등이 포함된다. 용어 "핵산 분자"에는 또한 폴리아미드 골격에 결합된 천연 발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함하는, 소위 "펩티드 핵산"이 포함된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
용어 "천연 뉴클레오티드"는 4가지 데옥시리보뉴클레오티드, dA, dG, dT, 및 dC(DNA의 구성요소) 중 임의의 것을 지칭하고, 4가지 리보뉴클레오티드, A, G, U, 및 C(RNA의 구성요소)는 천연 뉴클레오티드이다. 각 천연 뉴클레오티드는 당 부분(리보스 또는 데옥시리보스), 인산염 부분, 및 천연/표준 염기 부분을 포함하거나 이들로 본질적으로 구성된다. 천연 뉴클레오티드는 염기 쌍의 공지된 법칙(와트슨 및 크릭(Watson and Crick))에 따라 상보적 뉴클레오티드에 결합하고, 이 때 아데닌(A)은 티민(T) 또는 우라실(U)과 쌍을 형성하고; 구아닌(G)은 시토신(C)과 쌍을 형성하며, 여기서 상응하는 염기-쌍은 상보적, 항-병렬 뉴클레오티드 가닥의 부분이다. 염기 쌍형성은 소정의 뉴클레오티드와 상보적 뉴클레오티드 간의 특이적 하이브리드화를 초래한다. 염기 쌍형성은 주형 올리고뉴클레오티드와 상보적인 올리고뉴클레오티드의 합성을 촉매할 수 있도록 하는 기초가 된다. 이 합성에서, 빌딩 블록(통상 A, T, U, C, 또는 G의 리보 또는 데옥시리보 유도체의 삼인산염)은 주형 올리고뉴클레오티드에 의해 지정되어, 올바른 상보적 서열을 가지는 상보적 올리고뉴클레오티드를 형성하도록 한다. 자체의 상보적 서열에 의한 올리고뉴클레오티드 서열의 인식은 염기 쌍을 형성하는, 상응하고 상호작용하는 염기들에 의해 매개된다. 본래, 염기 쌍형성을 초래하는 특이적 상호작용은 염기의 크기, 및 염기의 수소 결합 공여체 및 염기의 어셉터의 패턴에 의해 지배된다. 큰 푸린 염기(A 또는 G)는 작은 피리미딘 염기(T, U 또는 C)와 쌍을 형성한다. 부가적으로, 염기들 간의 염기 쌍 인식은 염기들 사이에 형성되는 수소 결합에 의해 영향을 받는다. 와트슨-크릭의 기하학에서, 6-원 환(천연 올리고뉴클레오티드 내 피리미딘)은 융합된 6-원 환 및 5-원 환으로 구성된 환계에 병치되고(천연 올리고뉴클레오티드 내 푸린), 상기 환 계에는 두 환 원자를 연결하는 가운데 수소 결합 연결이 있고, 각각의 환에 달려 있는 작용기를 연결하는 임의의 측에 수소 결합이 있으며, 공여체 기는 어셉터 기와 쌍을 형성한다.
"본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드" 또는 "본 발명에 따른 핵산"은 본 특허 출원의 청구범위 또는 본 특허 출원의 청구범위에 기초하여 허여된 특허에서 인용되는 임의의 폴리펩티드를 포함하는 "본 발명에 따른 폴리펩티드"를 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "핵산 분자의 보체" 기준 뉴클레오티드 서열과 대비되는, 역방향이고 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3'은 5' CCCGTGCAT 3'과 상보적이다.
용어 "축퇴 뉴클레오티드 서열"은 폴리펩티드를 코딩하는 기준 핵산 서열과 대비되는, 1개 이상의 축퇴 코돈을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 축퇴 코돈은 뉴클레오티드의 상이한 삼량체를 함유하나, 동일한 아미노산 잔기를 코딩한다(즉, GAU 및 GAC 삼량체는 각기 Asp를 코딩한다).
용어 "구조 유전자"는 메신저 RNA(mRNA)로 전사된 후, 특이적 폴리펩티드의 특징이 되는 아미노산의 서열로 번역되는 핵산 분자를 지칭한다.
"단리된 핵산 분자"는 생물의 게놈 DNA 내로 통합되지 않은 핵산 분자이다. 예를 들어, 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 성장 인자를 코딩하는 DNA 분자는 단리된 DNA 분자이다. 단리된 핵산 분자의 또 다른 예는 생물이 게놈 내에 통합되지 않는 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 특정 종으로부터 단리된 핵산 분자는 그 종으로부터의 염색체의 완전 DNA 분자보다 작다.
"핵산 분자 구성물"은 천연에 존재하지 않는 배치로 조합되고 병치되는 핵산의 세그먼트를 함유하는 인간 개입을 통해 변형된, 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자이다.
"선형 DNA"는 유리 5' 및 3' 말단을 가지는 비원형 DNA 분자이다. 선형 DNA는 효소 분해 또는 물리적 파괴에 의해 닫힌 형의 원형 DNA 분자, 예컨대 플라스미드로부터 제조될 수 있다.
"상보적 DNA(cDNA)"는 효소 역전사효소에 의해 mRNA 주형으로부터 형성되는 단일-가닥 DNA 분자이다. 전형적으로, mRNA의 부분에 상보적인 프라이머를 이용하여 역전사를 개시한다. 당업자는 또한 상기와 같은 단일-가닥 DNA 분자 및 그것의 상보적 DNA 가닥으로 구성되는 이중-가닥 DNA 분자를 지칭하는 데에도 용어 "cDNA"를 사용한다. 용어 "cDNA"는 또한 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론을 지칭한다.
"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지정하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시 부위에 인접한, 유전자의 5' 비코딩 영역에 위치한다. 전사의 개시에 작용하는 프로모터 내의 서열 요소는 종종 일치 뉴클레오티드 서열을 그 특징으로 한다. 이 프로모터 요소에는 RNA 중합효소 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소(DSE; 문헌 [McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)]), 시클릭 AMP 반응 요소(CRE), 혈청 반응 요소(SRE; 문헌 [Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)]), 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE), 및 기타 전사 인자에 대한 결합 부위, 예컨대 CRE/ATF(문헌 [O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)]), AP2(문헌 [Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)]), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) 및 10량체 인자(일반적으로, 문헌 [Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)] 및 문헌 [Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)] 참조)가 포함된다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제로의 반응을 증가시킨다. 이와 대조적으로, 프로모터가 구조적 프로머터인 경우에는 전사 속도는 유도제에 의해 제어되지 않는다. 억제성 프로모터도 또한 알려져 있다.
"코어 프로모터"는 TATA 박스 및 전사 개시를 포함한, 프로모터 기능에 대한 필수 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 정의에 의하면, 코어 프로모터는 활성을 증진시키거나 조직 특이적 활성을 부여할 수 있는 특이적 서열의 부재 하에 검출가능한 활성을 가지거나 가지지 않을 수 있다.
"조절 요소"는 코어 프로모터의 활성을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 조절 요소는 특정 세포, 조직 또는 세포소기관에서 독점적으로 또는 우세하게 전사를 가능하게 하는 세포내 인자와 결합하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이 유형의 조절 요소는 정상적으로 "세포-특이적," "조직-특이적," 또는 "세포소기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자와 정상적으로 결합된다.
"증진자(enhancer)"는 전사의 개시 부위에 대한 증진자의 거리 또는 방향과 무관하게, 전사의 효율을 증가시킬 수 있는 조절 요소의 유형이다.
"이종성 DNA"는 주어진 숙주 세포 내에 천연적으로 존재하지 않는, DNA 분자, 또는 DNA 분자 집단을 지칭한다. 특정 숙주 세포에 대해 이종성인 DNA 분자는 숙주 세포 종으로부터 유래된 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있는데, 다만 그 숙주 DNA는 비숙주 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되어야 한다. 예를 들어, 전사 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 세그먼트에 연결된 폴리펩티드를 코딩하는 비숙주 DNA 세그먼트를 포함하는 DNA 분자는 이종성 DNA 분자인 것으로 간주된다. 이와 역으로, 이종성 DNA 분자는 외인성 프로모터로 연결된 내인성 유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 예시로서, 야생형 세포로부터 유래된 유전자를 포함하는 DNA 분자는 그 DNA 분자가 야생형 유전자가 결여된 돌연변이체 세포 내에 도입될 경우, 이종성 DNA인 것으로 간주된다.
"통합된 유전 요소"는 그 요소가 인간 조작을 통해 세포 내에 도입된 후에 숙주 세포의 염색체 내로 도입된 DNA의 세그먼트이다. 본 발명 내에서, 통합된 유전 요소는 가장 일반적으로는. 전기천공 또는 기타 기법에 의해 세포 내로 도입되는 선형화된 플라스미드로부터 유도된다. 통합된 유전 요소는 원래의 숙주 세포에서 그것의 자손으로 계대된다.
"클로닝 벡터"는 숙주 세포 내에서 자가 복제가능한 핵산 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지이다. 클로닝 벡터는 전형적으로 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 동정 및 선택에 사용하기에 적당한 마커 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 벡터의 본질적인 생물학적 기능의 손실없이 결정가능한 방식으로 핵산 분자의 삽입을 허용하는 1개 또는 적은 개수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포 내에 발현되는 유전자를 코딩하는 핵산 분자이다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 통상 프로머터의 조절 하에 놓이고, 그러한 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결된" 것이라 칭해진다. 이와 유사하게, 조절 요소 및 코어 프로모터는, 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우, 작동가능하게 연결된 것이다.
"재조합 숙주"는 이종성 핵산 분자, 예컨대 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 세포이다.
"통합 형질전환체"는 이종성 DNA가 세포의 게놈 DNA에 통합된 재조합 숙주 세포이다.
용어 "분비 신호 서열"은 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통해 보다 큰 폴리펩티드를 지정하는 펩티드("분비 펩티드")를 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다. 보다 큰 폴리펩티드는 통상 분비 경로를 통해 통과하는 동안 분비 펩티드를 제거하기 위해 절단된다.
용어 "스플라이스 변이체"는 유전자로부터 전사된 RNA의 대안적 형태를 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 스플라이스 변이는 전사된 RNA 분자 내에서 또는 덜 통상적으로는 분리하여 전사된 RNA 분자들 사이에서 대안적 스플라이상 부위를 사용함으로써 통상 발생하고, 동일한 유전자로부터 전사된 수가지 mRNA를 초래할 수 있다. 스플라이스 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 스플라이스 변이체는 또한 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 나타내기 위해 본원에 사용된다.
용어 "보체/항-보체 쌍"은 적절한 조건 하에 비공유 결합된 안정된 쌍을 형성하는 동일하지 않은 부분들을 의미한다. 예를 들어, 비오틴 및 아비딘(또는 스트렙타비딘)은 보체/항-보체 쌍의 원형 구성원이다. 다른 예시적 보체/항-보체 쌍에는 수용체/리간드 쌍, 항체/항원 (또는 합텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등이 포함된다. 보체/항-보체 쌍의 후속적 해체가 바람직한 경우, 보체/항-보체 쌍은 바람직하게 109 M-1 미만의 결합 친화도를 가진다
용어 "엄격한 조건 하의 하이브리드화"는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1.101-1.104]에 따라 정의된다. 바람직하게, 엄격한 조건 하의 하이브리드화는, 50℃, 바람직하게는 55℃, 보다 바람직하게는 62℃, 가장 바람직하게는 68℃에서 1시간 동안 1×SSC 및 0.1% SDS로 세정한 후, 특히 50℃, 바람직하게는 55℃, 보다 바람직하게는 62℃, 가장 바람직하게는 68℃에서 1시간 동안 0.2×SSC 및 0.1% SDS로 세정한 후, 양성 하이브리드화 신호가 관찰됨을 의미한다. 유전적 암호의 축퇴의 범주 내에서 예를 들어 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열과 상기 세정 조건 하에서 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열도 본 발명 내에 포함된다.
본원에서 지칭되는 용어 "항체"에는 전 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 단쇄를 포함한다. "항체"는 이황화물 결합에 의해 상호간 연결된, 2개 이상의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변부(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부(본원에서 CH로 약칭됨)로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변부(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변부(본원에서 CL로 약칭됨)로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역"(FR)이라고 하는 더욱 보존된 영역 내에 존재하는 "상보성 결정 영역"(CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 정렬된, 3개의 CDR 및 4개의 FR, 즉 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역계(예를 들어, 이펙터 세포)의 각종 세포들 및 통상적 보체계의 제1 성분(C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자로의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"에 의해 포괄되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉 힌지 영역에 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의적으로 결합될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉VL 및 VH가 분리된 유전자에 의해 코딩될지라도, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단백질 단쇄로서 만들어지도록 할 수 있는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있다(단쇄 Fv(scFv)로도 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al.(1988) Science 242:423-426]; 및 문헌 [Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]을 참조한다). 그러한 단쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되도록 의도된다. 또 다른 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변부, 및 (iii) CH2 불변부에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변부를 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변부 또는 경쇄 가변부일 수 있다. 이 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상적 기법을 이용하여 수득되고, 단편은 비변형 항체에서와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
"항체 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab 등과 같은 항체의 부분이다. 구조와 무관하게, 항체 단편은 비변형 항체에 의해 인식되는 동일한 항원에 결합한다. 예를 들어, 항-(본 발명에 따른 폴리펩티드) 모노클로날 항체 단편은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프에 결합한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특이적 항원에 결합하는 합성 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드, 예컨대 경쇄 가변부로 구성된 폴리펩티드, 중쇄 및 경쇄의 가변부로 구성된 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변부가 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 초가변부를 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되고, 통상 특이적 전하 특성뿐만 아니라 특이적 3차원 구조적 특성을 가진다. 형태적 및 비형태적 에피토프는, 형태적 에피토프는 변성(denaturing) 용매의 존재 하에 소실되나, 비형태적 에피토프는 그러하지 않다는 점에서 구분된다.
본원에 사용되는 용어 "불연속 에피토프"는 단백질의 일차 서열 내 2개 이상의 구분된 영역으로부터 형성되는 단백질 항원 상의 형태적 에피토프를 의미한다.
"검출가능한 표지"는 진단에 유용한 분자를 생성하기 위해 항체 부분에 접합될 수 있는 분자 또는 원자이다. 검출가능한 표지의 예에는 킬레이터, 광활성제, 방사성 동위원소, 형광제, 상자성 이온 또는 기타 마커 부분들이 포함된다.
"네이키드(naked) 항체"는 치료제와 접합되지 않는, 항체 단편과 반대되는 전(entire) 항체이다. 네이키드 항체는 특정 재조합 항체, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체뿐만 아니라, 폴리클로날 및 모노클로날 항체 모두를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "항체 성분"은 전 항체 및 항체 단편 모두를 포함한다.
CDR(상보성 결정 영역): 상보성 결정 영역은 항원에 상보함으로써 특정 항원에 대한 특이성을 가지는 수용체를 제공하는 항원 수용체(예를 들어, 면역글로불린/항체 및 T 세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 나타나는 짧은 아미노산 서열이다. 면역글로불린 및 T 세포 수용체와 연관되는 대부분의 서열 변화가 CDR에서 나타나기 때문에, 이 영역들은 경우에 따라 초가변 도메인으로도 칭해진다.
본원에 사용되는 용어 "억제"는 전체 억제 또는 부분적 억제일 수 있다. 본원에 사용되는 "전체 억제"는 완전한 억제 또는 90% 초과 억제와 같은 거의 완전한 억제를 지칭한다. "부분적 억제"는 90% 미만과 같은 완전하지 않는 억제를 지칭한다.
"표적 폴리펩티드" 또는 "표적 펩티드"는 1개 이상의 에피토프를 포함하고, 표적 세포, 예컨대 종양 세포, 또는 감염 작용제 항원을 가지는 세포 상에서 발현되는 아미노산 서열이다. T 세포는 표적 폴리펩티드 또는 표적 펩티드에 대해 주요 조직적합성 복합체 분자에 의해 제시되는 펩티드 에피토프를 인식하고, 전형적으로 표적 세포를 용해시키거나 표적 세포의 부위에 대한 다른 면역 세포를 보충함으로써 표적 세포를 사멸한다.
"항원성 펩티드"는 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합하여 T 세포에 의해 인식되는 MHC-펩티드 복합체를 형성함으로써, T 세포에 제시 시에 세포독성 림프구 반응을 유도하게 되는 펩티드이다. 따라서, 항원성 펩티드는 적절한 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합하여, 세포독성 T 세포 반응, 예컨대 세포 용해, 또는 항원에 결합하거나 항원을 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 사이토킨 방출을 유도할 수 있다. 항원성 펩티드는 항원 제시 세포 또는 표적 세포 상의 I류 또는 II류 주요 조직적합성 복합체 분자의 범주 내에서 결합된다.
"항-유전자형 항체"는 면역글로불린의 가변부 도메인과 결합하는 항체이다. 본 범주 내에서, 항-유전자형 항체는 항-항체의 가변부에 결합하며, 이로써 항-유전자형 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프를 모방한다.
용어 "이중특이적 분자"는 2개의 상이한 결합 특이성을 가지는 임의의 작용제, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체에 결합하거나 그것과 상호작용할 수 있다. 용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"는 2개 초과의 상이한 결합 특이성을 가지는 임의의 작용제, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체, 및 (c) 1개 이상의 다른 성분에 결합하거나 그것과 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 PAPP-A 및 기타 세포 표면 항원 또는 표적, 예컨대 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 지정되는 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함하나, 이들에 국한되지 않는다.
본원에 사용되는 인간 항체는, 항체가 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자를 가지는 트랜스제닉 마우스를 면역화함으로써 또는 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써, 인간 면역글로불린 서열 시스템으로부터 수득되는 경우에 특정 배선 서열"로부터 유도된" 것이며, 여기서 선택된 인간 항체는 그 아미노산 서열이 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 96% , 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 전형적으로, 특정 인간 배선 서열으로부터 유래된 인간 항체는 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10 이하의 아미노산 차, 보다 바람직하게는 5 이하의 아미노산 차, 또는 보다 더 바람직하게는 4, 3, 2, 또는 1 이하의 아미노산 차를 나타낼 것이다.
본원에 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부 및 불변부를 가지는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 유도되는 돌연변이). 그러나, 본원에 사용되는 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
"인간화된 항체"는, 모노클로날 항체의 쥐과동물 상보성 결정 영역이 쥐과동물 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 가변 도메인 내로 전달된 재조합 단백질이다.
본원에 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"에는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 발생 또는 단리된 모든 인간 항체들, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리드(이하 단락 I에 추가 기재됨)에 대한 트랜스제닉 또는 염색체도입 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하기 위해 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 이입세포(transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 발생 또는 단리된 항체가 포함된다. 그러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부 및 불변부를 가진다. 그러나, 특정 실시양태에서, 그러한 재조합 인간 항체에 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대한 동물 트랜스제닉이 사용될 때에는, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 적용할 수 있고, 이에 따라 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되어 그 서열과 관련되나 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 본원에 사용되는 "이종성 항체"는 그러한 항체를 생성하는 트랜스제닉 비- 인간 생물과 관련되어 정의된다. 이 용어는 트랜스제닉 인간외 동물로 구성되지 않은 생물에서 발견되는, 일반적으로는 트랜스제닉 인간외 동물의 경우와 다른 종으로부터의 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 가지는 항체를 지칭한다.
본원에 사용되는 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가지는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다(예를 들어, PAPP-A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 PAPP-A 외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, 인간 PAPP-A의 에피토프, 아형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 관련 항원에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다(예를 들어, PAPP-A 종 상동성). 또한, 단리된 항체에는 다른 세포내 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상이한 특이성을 가지는 "단리된" 모노클로날 항체들의 조합이 잘 정의된 조성물 내에 조합된다.
본원에 사용되는 "특이적 결합"은 소정의 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 FACS에서 IC50 값에 기초한 겉보기 친화도로서 측정 시 약 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 약 10-11 M 이하, 또는 심지어 그 미만의 KD에 상응하는 친화도로 결합하고, 소정의 항원 또는 밀접 연관 항원 외의 비-특이적 항원(예를 들어, BSA, 카제인)에 결합하는 친화도보다 10배 이상 더 낮은, 예컨대 100배 이상 더 낮은 KD에 상응하는 친화도로 결합한다.
친화도(Affinity): 수용체와 그것의 리간드 사이, 예를 들어 항체와 그것의 항원 사이의 결합 강도.
화합력(Avidity): 에피토프와 파라토프 간의 반응의 친화도와 항체 및 항원의 결합가(valency) 모두와 관련된, 항체의 그것의 항원과의 기능적 조합 강도.
항체 계열(Antibody Classes): 면역글로불린은 그것의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 계열들로 분류될 수 있다. 5가지(5) 이상의 주요 계열의 면역글로불린이 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 이들 중 몇가지는 하위계열(이소타입), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 추가 분류될 수 있다. 상이한 계열의 면역글로불린들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 각기 불린다. 항체의 경쇄는 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는, 2가지 구분된 유형들 중 하나로 분류될 수 있다. 상이한 계열의 면역글로불린들의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치가 공지되어 있다.
항체 조합 부위: 항체 조합 부위는 항원에 특이적으로 결합하는 (면역반응하는) 중쇄 및 경쇄 가변 및 초가변부로 이루어지는 항체 분자의 구조적 부분이다. 각종 형태의 용어 면역반응한다라는 것은, 항원 결정자 함유의 분자와, 전체 항원 분자 또는 이의 일부와 같은 항체 조합 부위를 가지는 분자 간의 특이적 결합을 의미한다. 대안적으로, 항체 조합 부위는 항원 결합 부위로 알려져 있다.
키메라 항체: 가변부가 한 종의 동물로부터 비롯되고, 불변부는 또 다른 종의 동물로부터 비롯된 항체. 예를 들어, 키메라 항체는 인간인 마우스 모노클로날 항체 및 불변부로부터 유도되는 가변부를 가지는 항체일 수 있다.
상보성 결정 영역 또는 CDR: 항체 인식 및 결합 도메인을 함께 형성하는 항체의 V-도메인 내 영역.
불변부 또는 불변 도메인 또는 C-도메인: 불변부는 보존적 치환을 내포할 수 있는 소정의 이소타입 내에 아미노산 잔기 서열을 포함한 항체 분자의 구조적 부분이다. 예시적 중쇄 면역글로불린 불변부는 CH1, CH2, CH3, CH4 및 CH5로서 당업계에 알려진 면역글로불린 분자의 부분이다. 한 예시적 경쇄 면역글로불린 불변부는 CL로서 당업계에 알려진 면역글로불린 분자의 부분이다.
디아바디(Diabody): 이 용어는 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 가지는 소형 항체 단편을 지칭한다. 너무 짧아 동일한 사슬 상에 2개의 도메인 내의 쌍형성을 허용하지 못하는 링커를 이용함으로써, 도메인으로 하여금 또 다른 사살의 상보적 도메인과 쌍을 형성하도록 하여, 2개의 항원 결합 부위를 생성시키도록 한다.
Fv: VH 및 VL 모두를 포함하는 이중 사슬 항체 단편
인간 항체 프레임워크: 항원 결합 부위, 및 인간 면역글로불린으로부터 유래된 분자의 본질적으로 모든 잔존 면역글로불린-유래 부분.
인간화 항체 프레임워크: 인간외 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래된 항원 결합 부위를 가지는 분자, 반면 상기 분자의 일부 또는 모든 잔존 면역글로불린-유래 부분은 인간 면역글로불린으로부터 유래됨. 항원 결합 부위는 하나 이상의 인간 불변 도메인에 융합된 인간외 면역글로불린으로부터의 완전 가변 도메인; 또는 가변 도메인 내 적절한 인간 프레임워크 영역에 결합된 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 인간화된 항체에서, CDR은 마우스 모노클로날 항체의 것일 수 있고, 항체의 다른 영역은 인간의 것이다.
아피바디(Affibody): 항체가 아닌 단백질의 Fc 결합 표면의 조합 다양성에 의해 작제된 라이브러리로부터 선택된 재조합 면역학적 활성 분자, 바람직하게는 58 잔기 포도상구균 단백질 A(SPA).
면역글로불린: IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD를 포함한 혈청 항체.
면역글로불린 이소타입: 상이한 H 사슬을 가지는 Ig에 주어진 이름으로서, 이름들에는 IgG(IgG1 ,2,3,4), IgM, IgA(IgA1 ,2), sIgA, IgE, IgD가 있다.
문구 "면역학적으로 구분된(immunologically distinct)"은 폴리펩티드 중 하나에는 특이적으로 결합하나, 다른 하나의 폴리펩티드에는 특이적으로 결합하지 않는 항체의 능력에 기초하여, 2개의 폴리펩티드 사이를 구분할 수 있음을 가리킨다.
각종 문법적 형태의 문구 "모노클로날 항체"는 특정 항원과 면역반응할 수 있는 항체 조합 부위의 단지 한 종만을 함유하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 따라서, 모노클로날 항체는 전형적으로 면역반응하는 대상인 임의의 항원에 대한 단일 결합 친화도를 나타낸다. 모노클로날 항체는 상이한 항원에 대해 각기 면역특이적인, 복수개의 항체 조합 부위를 가지는 항체 분자를 가질 수 있고, 예를 들어 이중특이적 모노클로날 항체가 있다.
"폴리클로날 항체"는 특이적 소정의 항원을 인식하는 항체 분자의 혼합체이며, 이에 따라 폴리클로날 항체는 상기 항원 내 상이한 에피토프들을 인식할 수 있다.
단쇄 항체 또는 scFv는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 단일 폴리펩티드를 지칭한다. 또한, Fv 단편의 H 및 L 사슬이 분리된 유전자에 의해 코딩될지라도, 이들은 직접적으로 또는 펩티드를 통해 연결될 수 있고, 예를 들어 이들이 재조합 방법에 의해 단일 단백질 사슬(단쇄 항체, sAb로도 알려짐; 문헌 [Bird et al. 1988 Science 242:423- 426]; 및 문헌 [Huston et al. 1988 PNAS 85:5879-5883])로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커가 만들어질 수 있다. 그러한 단쇄 항체는 또한 용어 "항체" 내에 포괄되고, 다중특이적 결합 분자의 조작 및 설계에 있어서의 결합 결정자로서 이용될 수 있다.
결합가(Valency): 용어 결합가는 폴리펩티드 내의 잠재적 항원 결합 부위, 즉 결합 도메인의 수를 지칭한다. 폴리펩티드는 1가이고 하나의 항원 결합 부위를 함유할 수 있거나, 폴리펩티드는 2가이고 2개의 항원 결합 부위를 함유할 수 있다. 부가적으로, 폴리펩티드는 4가이고 4개의 항원 결합 부위를 함유할 수 있다. 각 항원 결합 부위는 하나의 항원에 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드가 1개 초과의 항원 결합 부위를 함유할 때, 각 항원 결합 부위는 동일하거나 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 복수개의 항원 결합 부위들을 함유할 수 있고, 이에 따라 다가일 수 있으며, 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
V-도메인: 가변 도메인은 항원 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔기 서열을 포함하는 항체 분자의 구조 부분이다. 예시적 경쇄 면역글로불린 가변부는 VL로서 당업계에 알려진 면역글로불린 분자의 부분이다.
VL: 경쇄의 가변 도메인.
VH: 중쇄의 가변 도메인.
용어 "변이 유전자"는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 변형인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 지칭한다. 그러한 변이체는 본 발명에 따른 유전자의 천연 발생 다형, 및 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열의 보존적 아미노산 치환을 가지는 합성 유전자를 포함한다. 부가적 변이체 형태의 유전자는, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 결실을 가지는 핵산 분자이다. 본 발명에 따른 변이 유전자는 유전자가 엄격한 조건 하에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 보체를 가지는 핵산 분자와 하이브리드화하는지의 여부를 결정함으로써 동정될 수 있다.
대안적으로, 변이 유전자는 서열 비교에 의해 동정될 수 있다. 2개의 아미노산 서열은, 그 2개의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 최대로 상응하도록 정렬 시에 동일한 경우, "100% 아미노산 서열 동일성"을 가진다. 마찬가지로, 2개의 뉴클레오티드 서열은, 그 2개의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 잔기가 최대로 상응하도록 정렬 시에 동일한 경우, "100% 뉴클레오티드 서열 동일성"을 가진다. 서열 비교는 DNA스타(DNASTAR)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 생산되는 레이저진(LASERGENE) 생물정보학 연산 스위트 내에 포함된 것들과 같은 표준 소프트웨어 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 최적 정렬을 결정함으로써 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하는 다른 방법이 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Peruski and Peruski, Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)], 문헌 [Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Protein," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)] 및 문헌 [Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)]을 참조한다). 서열 동일성의 결정하는 특정 방법이 이하에 기재되어 있다.
변이 유전자의 동정에 사용되는 특정 방법과 무관 하에, 변이 유전자는 항-(본 발명에 따른 폴리펩티드) 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 그 특징으로 할 수 있는 폴리펩티드를 코딩한다.
용어 "대립형질 변이체"는 동일한 염색좌를 차지하는 2개 이상의 대안적 형태의 유전자들 중 임의의 것을 나타내기 위해 본원에 사용된다. 대립형질 변화는 돌연변이를 통해 천연 발생하고, 집단 내 표현형 다형을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵 돌연변이(코딩된 폴리펩티드 내 변화가 없음)일 수 있거나, 변형된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 대립형질 변이체는 또한 유전자의 대립형질 변이체에 의해 코딩되는 단백질을 나타내기 위해 본원에 사용된다.
"아미노산 잔기"는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기 연결 펩티드 결합, 또는 펩티드 결합과 상이한 결합일 수 있다. 아미노산 잔기는 D-입체배치 또는 L-입체배치의 것일 수 있다. 아미노산 잔기는 아미노 말단부(NH2), 및 탄소 원자를 포함하는 중앙부 또는 탄소 원자의 사슬에 의해 분리된 카르복시 말단부(COOH)를 포함하고, 이들 중 1개 이상은 1개 이상의 측쇄 또는 작용기를 가진다. NH2는 아미노산 또는 펩티드의 아미노 말단에 존재하는 아미노기를 지칭하고, COOH는 아미노산 또는 펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 카르복시기를 지칭한다. 총체적 용어 아미노산은 천연 및 비천연 아미노산을 모두 포함한다. 문헌 [J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969)]에 열거되어 있고 문헌 [37 C.F.R., 단락 1.822(b)(2)]에서 채택된 표준 명명법의 천연 아미노산들은 하기 표 1에 열거된 아미노산 군에 속한다. 비천연 아미노산은 표 1에 열거되지 않은 것들이다. 비천연 아미노산의 예는 각기 본원에 참조 인용되는, 예를 들어 문헌 [37 C.F.R. 단락 1.822(b)(4)]에 열거된 것들이다. 또한, 비천연 아미노산 잔기에는 변형된 아미노산 잔기, L-아미노산 잔기, 및 D-아미노산 잔기의 입체이성질체가 포함되나 이들에 국한되지 않는다.
천연 아미노산 및 이의 각각의 암호
기호 아미노산
1-문자 3-문자
Y Tyr 티로신
G Gly 글리신
F Phe 페닐알라닌
M Met 메티오닌
A Ala 알라닌
S Ser 세린
I Ne 이소루이신
L Leu 루이신
T Thr 트레오닌
V Val 발린
P Pro 프롤린
K Lys 리신
H His 히스티딘
Q Gln 글루타민
E Glu 글루탐산
W Trp 트립토판
R Arg 아르기닌
D Asp 아스파르트산
N Asn 아스파라긴
C Cys 시스테인
"균등한 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 구조 및/또는 기능성을 실질적으로 변경시키지 않으면서 폴리펩티드의 또 다른 아미노산 잔기를 치환할 수 있는 아미노산 잔기를 지칭한다. 이에 따라, 균등한 아미노산은 측쇄의 벌크성, 측쇄 극성(극성 또는 비극성), 소수성(소수성 또는 친수성), pH(산성, 중성 또는 염기성), 및 탄소 분자(방향족/지방족)의 측쇄 조직화와 같은 유사한 성질을 가진다. 이에 따라, "균등한 아미노산 잔기"는 "보존적 아미노산 치환"으로 간주될 수 있다.
한 실시양태에서, 균등한 아미노산의 분류는 하기 부류들로 칭해진다: 1) HRK, 2) DENQ, 3) C, 4) STPAG, 5) MILV 및 6) FYW
본원에 적용되는 용어 "균등한 아미노산 치환"의 의미 내에서, 한 실시양태에서, 하나의 아미노산은 이하 나타낸 아미노산 군들 내에서 상호 치환될 수 있다:
i) 극성 측쇄를 가지는 아미노산(Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr 및 Cys,)
ii) 비-극성 측쇄를 가지는 아미노산(Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Trp, Pro, 및 Met)
iii) 지방족 측쇄를 가지는 아미노산(Gly, Ala Val, Leu, lie)
iv) 시클릭 측쇄를 가지는 아미노산(Phe, Tyr, Trp, His, Pro)
v) 방향족 측쇄를 가지는 아미노산(Phe, Tyr, Trp)
vi) 산성 측쇄를 가지는 아미노산(Asp, Glu)
vii) 염기성 측쇄를 가지는 아미노산(Lys, Arg, His)
viii) 아미드 측쇄를 가지는 아미노산(Asn, Gln)
ix) 히드록시 측쇄를 가지는 아미노산(Ser, Thr)
x) 황-함유 측쇄를 가지는 아미노산(Cys, Met),
xi) 중성, 약소수성 아미노산(Pro, Ala, Gly, Ser, Thr)
xii) 소수성, 산성 아미노산(Gln, Asn, Glu, Asp), 및
xiii) 소수성 아미노산(Leu, lie, Val)
벤다이어그램은 아미노산을 그 성질에 따라 그룹화하는 또 다른 방법이다(문헌 [Livingstone & Barton, CABIOS, 9, 745-756, 1993]). 또 다른 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산은 동일한 벤다이어그램 그룹 내에서 상호 치환될 수 있다.
용어 "아미노-말단" 및 "카르복실-말단"은 폴리펩티드 내의 위치를 나타내기 위해 본원에 사용된다. 문맥에서 가능한 한도 내에서, 이들 용어들은 인접 또는 상대적 위치를 나타내기 위해 폴리펩티드의 특정 서열 또는 부분을 참조하여 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드 내 기준 서열에 대해 카르복실-말단에 위치한 특정 서열은 기준 서열의 카르복실 말단에 인접하게 위치하나, 완전 폴리펩티드의 카르복실 말단에 반드시 있는 것은 아니다.
"융합 단백질"은 2개 이상의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현되는 하이브리드 단백질이다. 예를 들어, 융합 단백질은 친화도 매트릭스에 결합하는 폴리펩티드와 융합된 본 발명에 따른 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 그러한 융합 단백질은 친화도 크로마토그래피를 이용하여 다량의 본 발명에 따른 폴리펩티드를 단리하는 수단을 제공한다.
용어 "발현"은 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 수반한다.
용어 "친화성 태그"는 제2 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하거나, 제2 폴리펩티드의 기질로의 부착을 제공하기 위해, 제2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 세그먼트를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 원칙적으로, 항체 또는 기타 특이적 결합제가 이용가능한 임의의 펩티드 또는 단백질이 친화성 태그로 사용될 수 있다. 친화성 태그는 폴리-히스티딘 트랙, 단백질 A(문헌 [Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)]), 글루타티온 S 트랜스퍼라제(문헌 [Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)]), Glu-Glu 친화도 태그(문헌 [Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)]), 물질 P, FLAG 펩티드(문헌 [Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)]), 스트렙타비딘 결합 펩티드, 또는 기타 항원성 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991)]를 참조한다. 친화성 태그를 코딩하는 DNA는 상업적 공급업체로부터 입수가능하다(예를 들어, 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)]를 참조한다.
"인슐린-유사 성장 인자" 또는 IGF는 인슐린에 대해 높은 서열 유사도를 가지는 폴리펩티드이다. IGF는 세포가 자체의 생리학적 환경과 소통하기 위해 사용하는 복합 시스템의 부분이다. 이 복합 시스템(종종 IGF "축(axis)"으로도 칭해짐)은 2개의 세포-표면 수용체(IGF1 R 및 IGF2R), 2개의 리간드(IGF-1 및 IGF-2), 6개의 고친화도 IGF 결합 단백질 계열(IGFBP 1-6), 및 집합적으로 프로테아제로 칭해지는 결합 IGFBP 분해 효소로 구성된다. 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1)는 주로 성장 호르몬(GH)에 의한 자극의 결과로서 간에 의해 분비된다. IGF-1은 정상적 생리학적 조절, 및 암을 포함한 다수의 병리학적 상태를 조절하는 데 중요하다. IGF 축은 세포 증식의 촉진 및 세포 사멸(아포프토시스)에 역할을 담당하는 것으로 나타났다). 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF-2)는 조기 발달에 필요한 일차 성장 인자인 것으로 사료되는 반면, IGF-1 발현은 최대 성장을 달성하는 데 필요하다. IGF-2는 일차적으로 작용에 있어 태기 수준(fetal)이나, 그 또한 뇌, 간 및 신장과 같은 기관의 발달 및 기능에 필수적이다.
"IGF 결합 단백질" 또는 IGFBP는 복잡한 방식으로 IGF 작용을 조절하는 것을 돕는다. 이는 IGF-1 수용체에 대한 결합을 방지함으로써 IGF 작용을 억제함은 물론, 가능히 수용체로의 전달을 도움으로써 IGF 작용을 촉진하고 IGF 반감기를 증가시키는 것을 수반한다. 현재, 6개의 구분된 IGF 결합 단백질(IGFBP1-6)이 있다. IGFBP가 IGF를 조절하는 능력에 부가하여 다른 기능을 가진다는 것을 제시하는 유의적 데이터가 현재 있다.
LNR: Lin12-노치 반복. PAPP-A는 PAPP-A, 이의 동족 PAPP-A2, 및 노치 수용체의 계열에 독특한 3개의 LNR 모듈을 포함한다. PAPP-A 및 PAPP-A2에서, 2개의 LNR 모듈(LNR1 및 2)은 단백질분해 도메인 내에 삽입되는 반면, 세 번째 LNR 모듈(LNR3)은 CCP 모듈에 대해 C-말단에 위치한다. PAPP-A 이량체 내에서, LNR 모듈은 아마도 1개의 서브유닛으로부터의 LNR1 및 2, 및 다른 하나의 서브유닛으로부터의 LNR3으로 구성된 삼량체 단위를 형성한다. 절충된 LNR 기능성은 PAPP-A가 IGFBP-4를 절단할 수 없도록 하고, 한편 IGFBP-5의 절단은 영향을 받지 않는다.
"보체계"은 생물로부터 병원체를 소거하는 것을 돕는 생화학적 캐스케이드이다. 그것은 적응화가능하지 않고 개체의 수명 과정에 걸쳐 변화하지 않는 보다 큰 면역계의 부분이고; 이에 따라 그것은 본연의 면역계이다. 그러나, 그것은 보충되어 적응성 면역계에 의해 작용되게 된다. 보체계는 통상 불활성 자이모겐으로서 순환하는, 혈액 내 발견되는 다수의 소형 단백질들로 구성된다. 수가지 촉발 인자들 중 하나에 의해 자극될 때, 시스템 내 프로테아제는 특정 단백질을 절단하여 사이토킨을 방출하고 추가 절단의 증폭 캐스캐이드를 개시한다. 이 활성화 캐스케이드의 최종 결과는 세포 사멸 막 공격 복합체의 활성화 및 반응의 대량 증폭이다. 20개 초과의 단백질 및 단백질 단편이 혈청 단백질, 장막 단백질, 및 세포막 수용체를 포함한 보체계를 구성한다.
"보체 조절 단백질" 또는 CCP는 세포 표면 상에 존재하고, 보체계의 조절에 관여한다. 그러한 조절자는 활성화 캐스케이드에서 조기에 형성된 생물분자 복합체인 컨버타제의 형성을 방해하는 작용을 한다. 이의 자체 표면 상의 존재 및 외래 입자의 표면으로부터의 부재는, 이들 조절자가 필요에 따라 보체 표적화의 중요 역할을 수행하는 반면(박테리아, 바이러스, 세포 파편 및 항체-항원 복합체), 숙주 조직에서의 활성화를 방지한다. "보체 활성화의 조절자(RAC)"는 용어 CCP의 동의어이다.
"효소 결합 면역흡수 검정법" 또는 ELISA은 샘플 내 항체 또는 항원의 존재를 검출하기 위해 면역학에서 주로 사용되는 생화학 기법이다. ELISA의 수행은 특정 항원에 대한 특이성을 가지는 1개 이상의 항체를 포함한다. 미지의 양의 항원을 가지는 샘플을, 비특이적으로(표면에의 흡착을 통해) 또는 특이적으로("샌드위치(sandwich)" ELISA에서 동일 항원에 특이적인 또 다른 항체에 의한 포착에 의해), 고체 지지체(통상 폴리스티렌 마이크로티터 플레이트) 상에 고정한다. 항원을 고정화한 후, 검출 항체를 부가하여, 항원과의 복합체를 형성한다. 검출 항체는 효소에 공유 결합될 수 있거나, 생물접합을 통해 효소에 연결된 2차적 항체에 의해 자체 검출될 수 있다. 각 단계 사이에, 플레이트를 전형적으로 온화한 세척액으로 세정하여 특이적으로 결합되지 않은 임의의 단백질 또는 항체를 제거한다. 최종 세정 단계 후에, 플레이트를 효소 기질 첨가에 의해 전개하도록 하여, 샘플 내 항원의 양을 가리키는 신호를 생성하도록 한다. 구형ELISA는 발색 기질을 이용하였으나, 신형 검정법은 감도가 훨씬 더 높은 형광성 기질을 이용한다. "효소 면역검정법" 또는 EIA은 ELISA의 동의어이다.
MMP=매트릭스 메탈로프로테이나제는 아연-의존성 엔도펩티다제이고; 다른 부류 구성원은 아다말리신, 세랄리신 및 아스타신이다. MMP는 메트진신 초과(superfamily)로 알려진 보다 큰 계열의 프로테아제에 속한다. 총체적으로, 그것은 모든 종류의 세포외 매트릭스 단백질들을 분해할 수 있으나, 다수의 생물활성 분자를 가공할 수도 있다. 이들은 세포 표면 수용체의 절단, 아포프토시스 리간드(예컨대, FAS 리간드)의 방출, 및 케모카인/활성화에 관여하는 것으로 알려져 있다. MMP는 또한 세포 증식, 이주(접착/분산액), 분화, 혈관신생, 아포프토시스 및 숙주 방어와 가은 세포 거동에 있어 주요 역할을 하는 것으로 사료된다.
엑소사이트(exosite)는 '촉매 코어와 구분된 프로테아제 상의 부가적 기질 결합 부위'로 정의된다. 기질 결합 및 후속되는 MMP에 의한 절단을 용이하게 하는 방법은 활성 부위 외측에 위치한 보다 작은 기능성 모듈, 또는 구별된 기질 결합 도메인 상의 분화된 2차적 기질 결합 부위를 통한 방법이다. 단백질-결합 도메인 및 모듈을 부가하게 되면, 특정 기질에 대한 프로테이나제의 친화도가 증가하고, 잘릴 수 있는 결합을 절단하는 MMP 촉매작용 도메인의 주요 기능의 특이성이 변형될 수 있다. 이 2차적 특이성은 "엑토도메인" 또는 "엑소사이트"로 칭해진다". 한 도메인 또는 모듈은 동일하거나 상이한 기질의 다중 결합 부위를 나타낼 수 있다. 엑소사이트와의 기질 상호작용은 다수 방식으로 프로테이나제의 거동에 영향을 줄 수 있다. 엑소사이트는 일차적 특이성 서브사이트에 의해 영향을 받지 않는 부각 접촉 부위를 제공함으로써 MMP의 기질 특이성 프로파일을 조절하고 확장한다. 이들 모듈 또는 도메인의 기질 결합 성질의 변화로써 MMP의 기질 선호도를 변경시킬 수 있고, MMP 분해계의 일부로서 특정 기질을 분해하도록 하는 경쟁적 이점을 프로테이나제에 부가할 수 있다. 이러한 방식으로, 프로테이나제의 기능이 개량되고, 일반적으로 더욱 특이적이거나 효율적으로 될 수 있다. 기질 결합은 종종 분화된 모듈의 주요 기능이다. 따라서, 모듈 설계를 통한 단순성은 프로테이나제 촉매 도메인에 대한 모듈 및 도메인의 부가는 기질 선호도의 새로운 다양성을 창출하는 선호되는 개념이다. 기질을 효소에 결부시켜 절단할 수 있도록 하는 것에 부가하여, 엑소사이트는 절단 전에 필수 "기질 제조"에 관여할 수 있다. 예를 들어, 천연 콜라겐 기질의 국소화 "풀림"은 삼중 헬리카나제 활성으로 칭해져 왔다. 엑소사이트는 또한 조직 내 기질이나 세포 결합 기질에 효소를 표적화할 수 있다. 따라서, 기질 엑소사이트의 확인 및 상기 부위의 결합 및 차단을 위해 설계된 특이적 약물의 개발은, MMP에 의한 특이적 기질의 분해에 대해 선택적인 고선택도 항-MMP 치료제에 새로운 경로를 잠재적으로 제공한다. 이는 부작용이 감소된 신규 치료법을 약속한다. 엑소사이트는 다수의 중요 방식으로 MMP의 거동에 영향을 줄 수 있다. 첫 번째로, 기질에 대한 MMP의 친화도를 증가시킴으로써, 엑소사이트는 MMP의 기질로의 공간적 표적화에 부가하여 조직 내 또는 세포 상의 섬유와 같은 기질의 거대분자 조립체에 대한 프로테이나제의 표적화를 가능하게 하는 매우 효율적인 적응화이며, 엑소사이트 결합은 또한 다른 방식으로 프로테이나제의 동력학적 성질에 영향을 미친다.
표준 분석 방법들의 불명확성으로 인해, 중합체의 분자량 및 길이는 대략적 값인 것으로 이해한다. 그러한 값을 "약" X 또는 "대략" X으로 표기할 때, X의 명시된 값은 정확히 ±20%, 예컨대 ±10%, 예를 들어 ±5% 이내인 것으로 이해한다.
도 1. PAPP-A 서브유닛의 모식도.
도 2. 폴리클로날 항체에 의한 PAPP-A 단백질분해 활성의 차별적 억제.
도 3. PAPP-A의 C-말단에 특이적인 scFv 항체에 의한 IGFBP-4 절단의 억제.
도 4. IGFBP-5의 단백질분해는 IGFBP-4 단백질분해의 억제제에 의해 부분적으로 억제된다.
도 5. PAC1은 합성 펩티드 기질에 대한 억제 활성을 보이지 않는다.
도 6. IGFBP-4 및 -5의 단백질분해는 PA-1A에 의해 불완전하게 억제된다.
도 7. PAC1은 PAPP-A2의 단백질분해 활성을 억제하지 않는다.
도 8. PAPP-A의 칼슘 이온 의존성 에피토프에 대한 PAC1 및 PAC2의 매핑.
도면의 상세한 설명
도 1. PAPP -A 서브유닛의 모식도.
1547-잔기 PAPP-A 서브유닛의 동정된 단백질 모듈은 N-말단 라미닌 G-유사 모듈(LamG), 단백질분해 도메인(PD), 3개의 Lin12-노치 반복 모듈(LNR1-3), 및 5개의 보체 조절 단백질 모듈(CCP1-5)을 포함한다. 면역화(쥐 PAPP-A의 잔기 1129-1545) 및 파지의 선택(인간 PAPP-A의 잔기 1133-1547)를 위해 사용되는 C-말단 재조합 단편이 강조되어 있다.
도 2. 폴리클로날 항체에 의한 PAPP -A 단백질분해 활성의 차별적 억제.
A) 방사성 표지된 IGFBP-4 또는 -5(10 nM)를 폴리클로날 항-PAPP-A(20 ㎍/mL)의 부재 하(레인 1 및 3) 또는 존재 하(래인 2 및 4)에, 인간 PAPP-A(0.1 nM)와 함께 항온배양하였다(37℃에서 1시간). 단백질분해 절단을 SDS-PAGE로 가시화한 후, 포스포르이미저를 이용하여 방사능 사진촬영을 행하였다. 비변형 기질(i) 및 동시 이주 절단 산물(c)의 위치가 나타내어져 있다. B) 잔기 1129-1545를 나타내는, 쥐 PAPP-A의 정제된 C-말단 단편의 쿠마시로 염색된 SDS-PAGE. 단백질을 293T 세포에서 발현하여, 니켈 친화도 크로마토그래피 및 헤파린 친화도 크로마토그래피의 연속 단계에 의해 정제하였다. C) 방사성 표지된 IGFBP-4 또는-5(10 nM)를, B에 도시된 PAPP-A의 C-말단 단편에 대해 성장시킨 폴리클로날 닭 항체(80 ㎍/mL IgY)의 부재 하(레인 1 및 3) 및 존재 하(레인 2 및 4)에서 쥐 PAPP-A(0.1 nM)와 함께 분해시켰다(37℃에서 1시간).
도 3. PAPP -A의 C-말단에 특이적인 scFv 항체에 의한 IGFBP -4 절단의 억제.
A) PAC1(1.5 μM)의 존재 하에서의 인간 PAPP-A(0.1 nM)에 의한 IGFBP-4(10 nM)의 절단. 절단 반응을 항온배양하였고(37℃), 샘플을 각 레인 위에 표시된 바와 같이 0분 내지 60분 간격으로 취하였다. 절단을 SDS-PAGE에 의해 가시화한 후, 방사능 사진촬영을 행하였다. 60분째에, 흐릇한 밴드가 절단 산물(c)의 위치에 가시화된다. B) 각 레인 위에 표시된 바와 같은, 0-750 nM PAC1의 존재 하, 37℃에서 1시간 동안의 쥐 PAPP-A(0.1 nM)에 의한 IGFBP-4(10 nM)의 절단. C) PAPP-A(0.1 nM)에 의한 IGFBP-4(10 nM)의 절단을 상이한 농도들의 PAC1로 분석하였다. 독립적으로 결정되는 상대적 초기 속도는 PAC1 농도의 함수로 플로팅된다. 아미노산 분석(IGFBP-4 및 PAC1) 또는 ELISA(PAPP-A)에 의해 모든 농도들을 결정하였다. 경쟁적 억제인 것으로 추정하여, 억제 상수를 계산하였다(K1 = 1.2 nM±0.1). D) PAC1의 고정화된 인간 PAPP-A에 대한 결합을 보여주는 센서그램. Purified PAC1(0.35, 0.7, 1.4, 2.8, 5.5 및 11 nM)을 120초 동안 37℃에서 칩에 주입한 후, 300초 동안 해체시켰다. 1:1 결합 모델을 이용하여, 전세계적 피팅에 기초한 동력학 매개변수를 계산하였다: ka = 4.36 x 10-6 M-1S-1; kd = 1.09 x 10-3 s-1; K0 = 0.25 nM(Χ2 = 0.23).
도 4. IGFBP -5의 단백질분해는 IGFBP -4 단백질분해의 억제제에 의해 부분적으로 억제된다.
A) IGFBP-4 및 -5의 PAPP-A 절단에 대한 PAC1의 영향의 비교.
방사성 표지된 IGFBP-4 또는 -5(10 nM)를 PAC1 20 nM의 부재 하(레인1 및 3) 또는 존재 하(레인 2 및 4) 에 인간 PAPP-A(0.1 nM)와 함께 항온배양하였다(37℃에서 1시간). 단백질분해 절단을 SDS-PAGE에 의해 가시화한 후, 방사능 사진촬영을 행하였다. B) PAPP-A(0.1 nM)에 의한 IGFBP-5(10 nM)의 절단을 상이한 농도들의 PAC1에서 분석하였다. 상대적 초기 속도를 PAC1 농도의 함수로서 플로팅한다. 포화 농도의 PAC1에서의 IGFBP-5에 대한 PAPP-A의 활성은 대략 45%이다. S자형 용량-반응 곡선을 데이터에 피팅하였다. 아미노산 분석(IGFBP-5 및 PAC1) 또는 ELISA(PAPP-A)에 의해 모든 농도들을 구하였다.
도 5. PAC1 은 합성 펩티드 기질에 대한 억제 활성을 보이지 않는다.
A) IGFBP-4로부터 유래된 합성 펩티드(5 μM)의 인간 PAPP-A(5 nM)에 의한 절단. 펩티드를 형광 공여체/켄처(quencher) 쌍으로부터 유도하였고, 이는 펩티드의 단백질분해 절단 후에 420 nm에서의 방출된 빛의 증가에 의해 PAPP-A 활성 검출을 허용한다. B) PAC1(1 μM)의 존재 하에 수행된 유사한 실험. C) PAPP-A(5 nM)의 진행 곡선은 표시된 바와 같이 mAb PA-1A(0.39-50 nM)의 존재 하에 펩티드 기질(10 μM)의 절단을 매개하였다. D) 진행 곡선으로부터 구해진 상대적 초기 속도(WV0%)를 mAb PA-1A 농도에 대한 함수로 플로팅한다. 플롯은, mAb PA-1A의 PAPP-A에 대한 단단한 결합에 의해 펩티드 절단의 효과적 억제를 나타내나, 포화 농도의 mAb PA-1A에서는 완전한 억제는 관찰되지 않는다.
도 6. IGFBP -4 및 -5의 단백질분해는 PA -1A에 의해 불완전하게 억제된다.
A) 인간 PAPP-A(0.1 nM)에 의한 IGFBP-4(10 nM)의 억제를 상이한 농도들의 mAb PA-1A에서 분석하였고, 상대 초기 속도를 PA-1A 농도에 대한 함수로 플로팅한다. S자형 용량-반응 곡선을 데이터에 대해 피팅하였다. B) IGFBP-5를 이용한 유사 분석.
도 7. PAC1 은 PAPP -A2의 단백질분해 활성을 억제하지 않는다.
A, 각 레인 위에 표시된 바와 같이 0-750 nM PAC1의 존재 하, 37℃에서 1시간 동안의 쥐 PAPP-A(0.1 nM)에 의한 IGFBP-4(10 nM)의 절단. B, 각 레인 위에 표시된 바와 같이 0-1500 nM PAC1의 존재 하, 37℃에서 1시간 동안의 인간 PAPP-A2(대략 0.1 nM)에 의한 IGFBP-5(10 nM)의 절단. 단백질분해 절단을 SDS-PAGE에 의해 가시화한 후, 방사능 사진촬영을 행하였다.
도 8. PAPP -A의 칼슘 이온 의존성 에피토프에 대한 PAC 1 및 PAC2 의 매핑
A, ELISA에 의해 분석되는 인간 PAPP-A/PAPP-A2 키메라 또는 절단된 인간 PAPP-A 변이체에 대한 PAC1의 결합. PAPP-A 유래의 서열은 열린 막대로 나타내고, 결합(-) 또는 결합(+)의 부재가 표시되어 있다. B, 표면 플라즈몬 공명에 의해 나타내어지는 PAC1(175 nM)의 고정화 PAPP-A에 대한 칼슘 이온 의존성 결합. EDTA(10 mM) 포함 또는 불포함 샘플을 주입한 후(120초), 해체하였다(180초)(솔리드 선). 파선은 흐르는 완충액을 포함한, 칼슘 이온을 갖는 유세포의 재평형화 후의 결합을 도시하고, 이는 PAPP-A LNR3이 칼슘에 역으로 결합함을 나타낸다. C, ELISA 분석에 의한, 칼슘 이온과 배위결합하는 것으로 예측되는 잔기 Asp-1484, Asp-1499, 및 Asp-1502가 각기 알라닌으로 치환된 PAPP-A LNR3의 돌연변이체에 대한 PAC1, PAC2 및 PAC5의 결합. 결합(-) 또는 결합(+)의 부재가 표시되어 있다. 양성 대조군으로 사용된 PAC5는 CCP1에 대해 N-말단에 위치하는 PAPP-A에 결합한다.
발명의 상세한 설명
엑소사이트 상호작용자
한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 엑소사이트 상호작용자에 관한 것이다. 엑소사이트 상호작용은 임의의 단백질 내 엑소사이트와 상호작용할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 이 상호작용은 칼슘 이온 의존성일 수 있다. 한 실시양태에서 상기 단백질은 효소이다.
하나 이상의 엑소사이트 상호작용자는 하나 이상의 엑소사이트 길항자 및/또는 하나 이상의 엑소사이트 작용자일 수 있다. 따라서, 하나 이상의 엑소사이트 상호작용자는 하나 이상의 엑소사이트 억제제 및/또는 하나 이상의 엑소사이트 자극자일 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 엑소사이트 억제제는 기지 또는 미지의 기질의 기질 단백질 분해의 전반적 억제를 초래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 엑소사이트 억제제는 IGFBP-4 단백질분해의 억제를 초래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 엑소사이트 억제제는 IGF 방출의 자극을 초래한다.
본 발명은 기질 결합 엑소사이트 표적화에 의해 프로테아제의 1개 이상의 생리학적 기질의 전반적 억제를 유발하는 하나 이상의 프로테아제 억제제(들)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기질 결합 엑소사이트 표적화에 의해 프로테아제의 2개 이상의 생리학적 기질의 차별적 억제를 유발하는 하나 이상의 프로테아제 억제제(들)에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 엑소사이트 상호작용자는 하나 이상의 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 엑소사이트 상호작용자는 하나 이상의 소분자 약물(들)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 엑소사이트 상호작용자는 하나 이상의 단백질(들)을 포함한다. 하나 이상의 단백질은 합성 및/또는 천연 단백질(들)일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 엑소사이트 상호작용자는 하나 이상의 폴리펩티드(들)를 포함한다. 하나 이상의 펩티드는 합성 및/또는 천연 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한, 상기 기재된 엑소사이트 상호작용자 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 엑소사이트 상호작용자 중 임의의 것의 생성 방법에 관한 것이다. 엑소사이트 상호작용자의 생성 방법은 하기 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 1) PCR, 2) 클로닝, 3) 예를 들어 태그를 포함한 플라스미드 구성물의 생성, 4) 예를 들어 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포 내 단백질의 발현, 5) 단백질의 발현 및 정제.
본 발명은 또한 엑소사이트 및/또는 엑소사이트 상호작용자의 동정 방법에 관한 것이다. 엑소사이트 상호작용자는 엑소사이트 작용자 또는 길항자일 수 있다. 한 실시양태에서, 엑소사이트 상호작용자의 동정은 반합성 파지 라이브러리의 스크리닝을 포함할 수 있다. 선택 라이브러리는 파지 항체/펩티드 라이브러리, 및 압타머 기재의 라이브러리 또는 유기화학 화학적 화합물 기재의 라이브러리일 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 엑소사이트 상호작용자를 이용한 IGF 방출의 조절(자극 또는 억제)에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 IGFBP-4 단백질분해의 하나 이상의 엑소사이트 상호작용자를 이용한 IGFBP-4 단백질분해의 조절(자극 또는 억제)에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 엑소사이트 상호작용자는 100 Da 내지 1,000,000 Da, 예컨대 100 Da 내지 500 Da, 예를 들어 500 Da 내지 1,000 Da, 예컨대 1,000 Da 내지 1,500 Da, 예를 들어 1,500 Da 내지 2,000 Da, 예컨대 2,000 Da 내지 2,500 Da, 예를 들어 2,500 Da 내지 3,000 Da, 예컨대 3,000 Da 내지 3,500 Da, 예를 들어 3,500 Da 내지 4,000 Da, 예컨대 4,000 Da 내지 4,500 Da, 예를 들어 4,500 Da 내지 5,000 Da, 예컨대 5,000 Da 내지 5,500 Da, 예를 들어 5,500 Da 내지 6,000 Da, 예컨대 6,000 Da 내지 6,500 Da, 예를 들어 6,500 Da 내지 7,000 Da, 예컨대 7,000 Da 내지 7,500 Da, 예를 들어 7,500 Da 내지 8,000 Da, 예컨대 8,000 Da 내지 8,500 Da, 예를 들어 8,500 Da 내지 9,000 Da, 예컨대 9,000 Da 내지 9,500 Da, 예를 들어 9,500 Da 내지 10,000 Da, 예컨대 10,000 Da 내지 20,000 Da, 예를 들어 20,000 Da 내지 30,000 Da, 예컨대 30,000 Da 내지 40,000 Da, 예를 들어 40,000 Da 내지 50,000 Da, 예컨대 50,000 Da 내지 60,000 Da, 예를 들어 60,000 Da 내지 70,000 Da, 예컨대 70,000 Da 내지 80,000 Da, 예를 들어 80,000 Da 내지 90,000 Da, 예컨대 90,000 Da 내지 100,000 Da, 예를 들어 100,000 Da 내지 150,000 Da, 예컨대 150,000 Da 내지 200,000 Da, 예를 들어 200,000 Da 내지 250,000 Da, 예컨대 250,000 Da 내지 300,000 Da, 예를 들어 300,000 Da 내지 350,000 Da, 예컨대 350,000 Da 내지 400,000 Da, 예를 들어 400,000 Da 내지 450,000 Da, 예컨대 450,000 Da 내지 500,000 Da, 예를 들어 500,000 Da 내지 550,000 Da, 예컨대 550,000 Da 내지 600,000 Da, 예를 들어 600,000 Da 내지 650,000 Da, 예컨대 650,000 Da 내지 700,000 Da, 예를 들어 700,000 Da 내지 750,000 Da, 예컨대 750,000 Da 내지 800,000 Da, 예를 들어 800,000 Da 내지 850,000 Da, 예컨대 850,000 Da 내지 900,000 Da, 예를 들어 900,000 Da 내지 950,000 Da, 예컨대 950,000 Da 내지 1,000,000 Da 범위의 분자량을 가진다.
PAPP -A
본 발명은 또한 PAPP-A의 천연 엑소사이트(들) 또는 본 문헌의 임의의 다른 부분에 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들)의 임의의 변이체를 포함하는 PAPP-A 단백질 또는 DNA 서열에 관한 것이다.
PAPP-A의 인간 서열은 서열 번호 1로 표시된다.
PAPP-A의 인간 서열(서열 번호 1)은 이하와 같다:
Figure 112010054931816-pct00001
Figure 112010054931816-pct00002
서열 번호 1의 변이체들이 본 문헌 내 다른 임의의 부분에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 절충된 LNR 기능성을 가지는 PAPP-A에 관한 것이다. 절충된 LNR 기능성은 절충된 LNR3 기능성을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 항체를 생성시키기 위한, 상기 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 변이체 중 임의의 것을 가지거나 가지지 않는 PAPP-A 서열의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용 분자를 생성시키기 위한, 상기 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 변이체 중 임의의 것을 가지거나 가지지 않는 PAPP-A 서열의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PAPP-A 엑소사이트(들)와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 합성 펩티드의 생성을 위한, PAPP-A 서열 및 상기 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 변이체 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.
PAPP -A의 엑소사이트 (들)
본 발명은 PAPP-A 엑소사이트(들)를 코딩하는 DNA 서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PAPP-A 엑소사이트(들)의 단백질 서열에 관한 것이다.
인간 PAPP-A 엑소사이트(들)는 서열 번호 2로 표시된다. 서열 번호 2는 서열 번호 1의 일부이다. PAPP-A 엑소사이트(들)(서열 번호 2)의 인간 서열은 이하와 같다:
Figure 112010054931816-pct00003
넘버링은 문헌 [Kristensen et al. (1994), Biochemistry 33:1592-8. (PMID: 7508748)]에 기초한다.
서열 번호 2의 변이체가 본 문헌 내 다른 임의의 부분에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 항체의 생성을 위한, PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 및 상기 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 변이체 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용 분자의 생성을 위한, PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 및 상기 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 변이체 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PAPP-A 엑소사이트(들)와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 합성 펩티드의 생성을 위한, PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 및 상기 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들) 서열 변이체 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 2를 포함하는 서열 번호 1의 단편에 관한 것이다. 이 단편은 서열 번호 1의 1547개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 서열 번호 1의 1530개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1510개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1490개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1470개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1450개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1430개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1410개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1390개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1370개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1350개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1330개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1310개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1290개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1270개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1250개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1230개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1210개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1190개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1170개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1150개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1130개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1110개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1090개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1070개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1050개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1030개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1010개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 990개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 970, 예를 들어 950개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 930개 미만의 연속 아미노산 잔기 예를 들어 910개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 890개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 870개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 850개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 830개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 810개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 790개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 770개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 750개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 730개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 710개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 690개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 670개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 650개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 630개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 610개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 590개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 570개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 550개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 530개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 510개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 490개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 470개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 450개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 430개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 410개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 390개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 370개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 350개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 330, 예를 들어 310개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 290개 미만의 연속 아미노산 잔기 예를 들어 270개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 250개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 230개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 210개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 190개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 170개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 150개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 130개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 110개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 90개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 70개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 50개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 미만의 연속 아미노산 잔기를 포함한다.
PAPP -A 엑소사이트 (들) 상호작용자
한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자에 관한 것이다. PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 PAPP-A 엑소사이트(들)와 상호작용할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 이 상호작용은 칼슘 이온 의존성일 수 있다.
하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 길항자 및/또는 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 작용자일 수 있다. 따라서, 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 억제제 및/또는 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 자극자일 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, PAPP-A 엑소사이트(들) 억제제는 기지 또는 미지의 기질의 기질 단백질분해의 전반적 억제를 초래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, PAPP-A 엑소사이트(들) 억제제는 IGFBP-4 단백질분해의 억제를 초래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 엑소사이트 억제제는 IGF 방출의 자극을 초래한다.
본 발명은 또한 기질 결합 PAPP-A 엑소사이트(들) 표적화에 의한 PAPP-A의 1개 이상의 생리학적 기질(들)의 전반적 억제를 유발하는 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 억제제(들)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기질 결합 PAPP-A 엑소사이트(들) 표적화에 의한 PAPP-A의 2개 이상의 생리학적 기질(들)의 차별적 억제를 유발하는 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 억제제(들)에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 하나 이상의 항체를 포함한다. 하나 이상의 항체는 PAPP-A에 대해 억제 또는 자극 효과를 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 하나 이상의 소분자 약물(들)을 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 하나 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 하나 이상의 단백질(들)을 포함한다. 하나 이상의 단백질은 합성 및/또는 천연 단백질(들)일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 하나 이상의 펩티드(들)를 포함한다. 하나 이상의 펩티드는 합성 및/또는 천연 펩티드일 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 기지 또는 미지의 기질에 대한 PAPP-A의 활성의 부분 또는 완전 억제를 초래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 기질 IGFBP-4에 대한 PAPP-A의 활성의 억제를 초래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 IGFBP-4에 대한 PAPP-A의 활성의 억제(완전 억제)를 초래하고, IGFBP-5에 대해서는 PAPP-A 활성의 보다 적은 정도의 억제(부분 억제)를 초래한다.
본 발명은 또한 의약으로서 이용하기 위한, 상기 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자의 생성 방법에 관한 것이다. PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자의 생성 방법은 하기 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 1) PCR, 2) 클로닝, 3) 예를 들어 태그를 포함한 플라스미드 구성물의 생성, 4) 예를 들어 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포 내 단백질의 발현, 5) 단백질의 발현 및 정제.
본 발명은 또한 PAPP-A 엑소사이트(들) 및/또는 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자의 동정 방법에 관한 것이다. PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 엑소사이트 작용자 또는 길항자일 수 있다. 한 실시양태에서, 엑소사이트 상호작용자의 동정은 반합성 파지 라이브러리의 스크리닝을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PAPP-A의 억제 또는 자극과 같은 PAPP-A 활성의 조절 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 miRNA(마이크로RNA) 또는 siRNA(소형 간섭 RNA)의 사용에 의한, PAPP-A 생성의 조절에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자는 100 Da 내지 1,000,000 Da, 예컨대 100 Da 내지 500 Da, 예를 들어 500 Da 내지 1,000 Da, 예컨대 1,000 Da 내지 1,500 Da, 예를 들어 1,500 Da 내지 2,000 Da, 예컨대 2,000 Da 내지 2,500 Da, 예를 들어 2,500 Da 내지 3,000 Da, 예컨대 3,000 Da 내지 3,500 Da, 예를 들어 3,500 Da 내지 4,000 Da, 예컨대 4,000 Da 내지 4,500 Da, 예를 들어 4,500 Da 내지 5,000 Da, 예컨대 5,000 Da 내지 5,500 Da, 예를 들어 5,500 Da 내지 6,000 Da, 예컨대 6,000 Da 내지 6,500 Da, 예를 들어 6,500 Da 내지 7,000 Da, 예컨대 7,000 Da 내지 7,500 Da, 예를 들어 7,500 Da 내지 8,000 Da, 예컨대 8,000 Da 내지 8,500 Da, 예를 들어 8,500 Da 내지 9,000 Da, 예컨대 9,000 Da 내지 9,500 Da, 예를 들어 9,500 Da 내지 10,000 Da, 예컨대 10,000 Da 내지 20,000 Da, 예를 들어 20,000 Da 내지 30,000 Da, 예컨대 30,000 Da 내지 40,000 Da, 예를 들어 40,000 Da 내지 50,000 Da, 예컨대 50,000 Da 내지 60,000 Da, 예를 들어 60,000 Da 내지 70,000 Da, 예컨대 70,000 Da 내지 80,000 Da, 예를 들어 80,000 Da 내지 90,000 Da, 예컨대 90,000 Da 내지 100,000 Da, 예를 들어 100,000 Da 내지 150,000 Da, 예컨대 150,000 Da 내지 200,000 Da, 예를 들어 200,000 Da 내지 250,000 Da, 예컨대 250,000 Da 내지 300,000 Da, 예를 들어 300,000 Da 내지 350,000 Da, 예컨대 350,000 Da 내지 400,000 Da, 예를 들어 400,000 Da 내지 450,000 Da, 예컨대 450,000 Da 내지 500,000 Da, 예를 들어 500,000 Da 내지 550,000 Da, 예컨대 550,000 Da 내지 600,000 Da, 예를 들어 600,000 Da 내지 650,000 Da, 예컨대 650,000 Da 내지 700,000 Da, 예를 들어 700,000 Da 내지 750,000 Da, 예컨대 750,000 Da 내지 800,000 Da, 예를 들어 800,000 Da 내지 850,000 Da, 예컨대 850,000 Da 내지 900,000 Da, 예를 들어 900,000 Da 내지 950,000 Da, 예컨대 950,000 Da 내지 1,000,000 Da 범위의 분자량을 가진다.
다른 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 3과 같은 PAPP-A 엑소사이트(들)를 포함하는 폴리펩티드 서열, 및 상기 엑소사이트(들)에 대한 친화성을 가지는 결합 파트너를 포함하는 복합체에 관한 것으로, 여기서 엑소사이트(들)에 대한 결합 파트너의 결합은 PAPP-A의 활성을 변경시킨다. 한 바람직한 실시양태에서, 이 결합 파트너는 100 Da 내지 1,000,000 Da, 예컨대 100 Da 내지 500 Da, 예를 들어 500 Da 내지 1,000 Da, 예컨대 1,000 Da 내지 1,500 Da, 예를 들어 1,500 Da 내지 2,000 Da, 예컨대 2,000 Da 내지 2,500 Da, 예를 들어 2,500 Da 내지 3,000 Da, 예컨대 3,000 Da 내지 3,500 Da, 예를 들어 3,500 Da 내지 4,000 Da, 예컨대 4,000 Da 내지 4,500 Da, 예를 들어 4,500 Da 내지 5,000 Da, 예컨대 5,000 Da 내지 5,500 Da, 예를 들어 5,500 Da 내지 6,000 Da, 예컨대 6,000 Da 내지 6,500 Da, 예를 들어 6,500 Da 내지 7,000 Da, 예컨대 7,000 Da 내지 7,500 Da, 예를 들어 7,500 Da 내지 8,000 Da, 예컨대 8,000 Da 내지 8,500 Da, 예를 들어 8,500 Da 내지 9,000 Da, 예컨대 9,000 Da 내지 9,500 Da, 예를 들어 9,500 Da 내지 10,000 Da, 예컨대 10,000 Da 내지 20,000 Da, 예를 들어 20,000 Da 내지 30,000 Da, 예컨대 30,000 Da 내지 40,000 Da, 예를 들어 40,000 Da 내지 50,000 Da, 예컨대 50,000 Da 내지 60,000 Da, 예를 들어 60,000 Da 내지 70,000 Da, 예컨대 70,000 Da 내지 80,000 Da, 예를 들어 80,000 Da 내지 90,000 Da, 예컨대 90,000 Da 내지 100,000 Da, 예를 들어 100,000 Da 내지 150,000 Da, 예컨대 150,000 Da 내지 200,000 Da, 예를 들어 200,000 Da 내지 250,000 Da, 예컨대 250,000 Da 내지 300,000 Da, 예를 들어 300,000 Da 내지 350,000 Da, 예컨대 350,000 Da 내지 400,000 Da, 예를 들어 400,000 Da 내지 450,000 Da, 예컨대 450,000 Da 내지 500,000 Da, 예를 들어 500,000 Da 내지 550,000 Da, 예컨대 550,000 Da 내지 600,000 Da, 예를 들어 600,000 Da 내지 650,000 Da, 예컨대 650,000 Da 내지 700,000 Da, 예를 들어 700,000 Da 내지 750,000 Da, 예컨대 750,000 Da 내지 800,000 Da, 예를 들어 800,000 Da 내지 850,000 Da, 예컨대 850,000 Da 내지 900,000 Da, 예를 들어 900,000 Da 내지 950,000 Da, 예컨대 950,000 Da 내지 1,000,000 Da 범위의 분자량을 가진다.
소분자 약물은 PAPP -A 엑소사이트(들)와 상호작용한다.
본 발명은 PAPP-A 엑소사이트(들)와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 소분자 약물(들)에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 소분자 약물은 LNR3을 포함하는 PAPP-A의 C-말단 부분에 대해 지정된다. C-말단 부분이 도1에 나와 있고, CCP1-5 및 LNR3을 포함한다. 이는 서열 번호 2에 포함된다.
한 실시양태에서, 소분자 약물은 PAPP-A의 LNR3에 대해 지정된다. 또 다른 실시양태에서, 소분자 약물은 PAPP-A(서열 번호 2) 또는 본 문헌 내 임의의 부분에 기재된 상기 서열의 임의의 변이체의 엑소사이트(들) 와 상호작용할 수 있다. 이 상호작용은 칼슘 이온 의존성일 수 있다.
본 발명은 또한 PAPP-A(서열 번호 2) 또는 본 문헌 내 임의의 부분에 기재된 상기 서열의 임의의 변이체와 상호작용하거나, PAPP-A의 LNR3 또는 또 다른 PAPP-A의 단편과 상호작용하는 하나 이상의 소분자 약물(들)의 개발 방법에 관한 것이다. 이 방법은 칼슘 이온의 존재를 필요로 하는 상호작용 파트너의 선택을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 의약으로서의, PAPP-A(서열 번호 2) 또는 본 문헌 내 임의의 부분에 기재된 상기 서열의 임의의 변이체와 상호작용하거나, PAPP-A의 LNR3 또는 또 다른 PAPP-A의 단편과 상호작용하는 하나 이상의 소분자 약물(들)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PAPP-A, PAPP-A 엑소사이트(들) 및/또는 PAPP-A 내의 PAC1 및 PAC2 에피토프에 대한 결합제의 선택에 관한 것이다. 억제제와 같은 PAPP-A 상호작용자를 수득하기 위한 선택 방법이 한 실시양태에서 칼슘 결합의 붕괴에 의한 특이적 용출에 기초한다. 한 바람직한 실시양태에서, PAPP-A의 C-말단 단편은 직접적으로 또는 PAPP-A 특이적 항체에 의해 고정화될 수 있다. 화합물의 조합 라이브러리를 이어서 고정화된 PAPP-A에 통과시킨 후, 충분히 세정한다. EDTA 또는 기타 칼슘 결합 화합물의 첨가로 결합 화합물을 용출시켜, 예를 들어 LNR3 모듈의 구조를 붕괴시키거나 이 모듈의 칼슘 이온 결합을 붕괴시킨다. 특이적 용출은 PAPP-A의 특이적 영역에 대한 결합제를 선택하도록 할 것이다. 선택 라이브러리는 파지 항체/펩티드 라이브러리, 및 압타머 기재의 라이브러리 또는 유기화학 화합물 기재의 라이브러리일 수 있다. 이 선택법은 소분자 약물 또는 임의의 기타 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자의 동정을 위해 사용될 수 있다.
"소분자": 본원에 사용되는 용어 "소분자"는, 천연 발생 또는 인공적 생성(예를 들어, 화학적 합성을 통한 생성) 여부에 상관없이, 비교적 작은 분자량을 가지는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 소분자는 단량체이고, 바람직하게 약 1500 g/mol 미만의 분자량을 가진다. 바람직한 소분자는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 국소 또는 전신 효과를 생성한다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 소분자는 약물이다. 바람직하게, 다만 반드시는 아니나, 약물은 이미 적절한 정부기관 또는 신체에 의해 사용하기에 안전하고 효과적인 것으로 간주된 것이다. 예를 들어, 각기 본원에 참조 인용되는, 21 C.F.R. 단락 330.5, 331 내지 361, 및 440 내지 460을 통해 FDA에 의해 열거되는 인간 용도의 약물; 21 C.F.R. 단락 500 내지 589를 통해 FDA에 의해 열거된 수의 용도의 약물 모두는 본 발명에 따라 사용하기에 허용가능한 것으로 간주된다.
한 바람직한 실시양태에서, PAPP-A(서열 번호 2) 또는 본 문헌 내 임의의 부분에 기재된 상기 서열의 임의의 변이체의 엑소사이트(들), 또는 본 발명에 따른 PAPP-A의 LNR3 또는 또 다른 PAPP-A의 단편과 상호작용하는 소분자 약물(들) 은 10 Da 내지 10,000 Da, 예컨대 10 Da 내지 50 Da, 예를 들어 50 Da 내지 100 Da, 예컨대 100 Da 내지 150 Da, 예를 들어 150 Da 내지 200 Da, 예컨대 200 Da 내지 250 Da, 예를 들어 2500 Da 내지 300 Da, 예컨대 300 Da 내지 350 Da, 예를 들어 350 Da 내지 400 Da, 예컨대 400 Da 내지 450 Da, 예를 들어 450 Da 내지 500 Da, 예컨대 500 Da 내지 550 Da, 예를 들어 550 Da 내지 600 Da, 예컨대 600 Da 내지 650 Da, 예를 들어 650 Da 내지 700 Da, 예컨대 700 Da 내지 750 Da, 예를 들어 750 Da 내지 800 Da, 예컨대 800 Da 내지 850 Da, 예를 들어 850 Da 내지 900 Da, 예컨대 900 Da 내지 950 Da, 예를 들어 950 Da 내지 1,000 Da, 예컨대 1,000 Da 내지 2,000 Da, 예를 들어 2,000 Da 내지 3,000 Da, 예컨대 3,000 Da 내지 4,000 Da, 예를 들어 4,000 Da 내지 5,000 Da, 예컨대 5,000 Da 내지 6,000 Da, 예를 들어 6,000 Da 내지 7,000 Da, 예컨대 7,000 Da 내지 8,000 Da, 예를 들어 8,000 Da 내지 9,000 Da, 예컨대 9,000 Da 내지 10,000 Da 범위의 분자량을 가진다.
특이적 PAPP -A 엑소사이트 (들) 항체
한 실시양태에서, 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 억제제(들)는 PAPP-A 특이적 항체를 포함한다. 바람직하게, 이들 항체는 관련된 프로테이나제 PAPP-A2에 결합하지 않고 그것을 억제한다.
바람직한 실시양태에서, the PAPP-A 특이적 항체는 PAC1이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, PAPP-A 특이적 항체는 PAC2이다. 이 상호작용은 칼슘 이온성일 수 있다.
인간 PAPP-A 내 PAC1 및 PAC2에 의해 인식되는 에피토프는 서열 번호 3으로 표시된다.
서열 번호 3의 서열은 이하와 같다:
Figure 112010054931816-pct00004
마우스 PAPP-A 내 PAC1 및 PAC2에 의해 인식되는 에피토프는 서열 번호 4로 표시된다.
서열 번호 4의 서열은 이하와 같다:
Figure 112010054931816-pct00005
서열 번호 3 및 서열 번호 4의 변이체는 본 문헌 내 다른 임의의 부분에 기재되어 있다.
PAC1 및 PAC2는 서열 번호 5 및 서열 번호 6로 각기 표시된다. 억제제 PAC1 및 PAC2의 아미노산 서열이 이하와 나와 있다. 서열은 scFv PAC1 및 PAC2의 전장 서열이고, cDNA로부터 유래된다. 서열은 His- 및 c-myc 태그(양자 모두 밑줄 그어짐)를 포함한다. 이 His- 및/또는 c-myc 태그는 정제에 적당한 임의의 기타 태그로 치환될 수 있다. 대안적으로, His- 및/또는 c-myc 태그는 서열로부터 생략될 수 있다. 서열은 또한 CDR(상보성 결정 영역)(굵은 체로 표시됨)도 포함한다.
PAC1 서열(서열 번호 5):
Figure 112010054931816-pct00006
PAC2 서열(서열 번호 6):
Figure 112010054931816-pct00007
Figure 112010054931816-pct00008
서열 번호 5 및 서열 번호 6의 변이체는 본 문헌 내 다른 임의의 부분에 기재되어 있다.
항체의 CDR 영역은 매우 가변적이다. 본 발명에서, CDR 영역의 다양화된 잔기가 굵은 체로 나와 있다. 총 18개 잔기가 다양화되어 있다: H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96(H= 중쇄, L= 경쇄). 숫자는 PAC 항체를 선택한 톰린슨(Tomlinson) I 및 J 라이브러리의 제조업체에 따른 아미노산 위치를 가리킨다.
한 실시양태에서, PAC1, PAC2 및 PAC5(이후 기재되는 바와 같음)) 또는 임의의 기타 PAPP-A 항체 또는 임의의 기타 엑소사이트 항체와 같은 항체의 CDR 영역은, CDR의 18개 이상의 아미노산 잔기, 또는 17개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 상기 항체의 초가변 CDR 영역의 16개 이상의 아미노산 잔기, 또는 15개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 이상의 아미노산 잔기, 또는 13개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 이상의 아미노산 잔기, 또는 11개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 10개의 아미노산 잔기에서 보존된다.
한 실시양태에서, CDR 영역의 18개 이상의 아미노산 잔기가 보존되면, 항체의 PAC1, PAC2 및 PAC5(이후 기재되는 바와 같음)) 또는 임의의 기타 PAPP-A 항체 또는 임의의 기타 엑소사이트 항체와 같은 항체의 나머지 아미노산 서열은 상기 항체에 대한 99.9% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 99% 이상, 예를 들어 상기 항체 또는 이의 오르토로그와 98% 이상, 또는 97% 이상, 예를 들어 96% 이상, 또는 95% 이상, 예를 들어 94% 이상, 또는 93% 이상, 예를 들어 92% 이상, 또는 91% 이상, 예를 들어 90% 이상, 또는 89% 이상, 예를 들어 88% 이상, 또는 87% 이상, 예를 들어 86% 이상, 또는 85% 이상, 예를 들어 84% 이상, 또는 83% 이상, 예를 들어 82% 이상, 또는 81% 이상, 예를 들어 80% 이상, 또는 79% 이상, 예를 들어 78% 이상, 또는 77% 이상, 예를 들어 76% 이상, 또는 75% 이상, 예를 들어 74% 이상, 또는 73% 이상, 예를 들어 72% 이상, 또는 71% 이상, 예를 들어 70% 이상, 또는 69% 이상, 예를 들어 68% 이상, 또는 67% 이상, 예를 들어 66% 이상, 또는 65% 이상, 예를 들어 64% 이상, 또는 63% 이상, 예를 들어 62% 이상, 또는 61% 이상, 예를 들어 60% 이상, 또는 58% 이상, 예를 들어 56% 이상, 또는 54% 이상, 예를 들어 52% 이상, 또는 50% 이상, 예를 들어 48% 이상, 또는 46% 이상, 예를 들어 44% 이상, 또는 42% 이상, 예를 들어 40% 이상, 또는 38% 이상, 예를 들어 36% 이상, 또는 34% 이상, 예를 들어 32% 이상, 또는 30% 이상, 예를 들어 28% 이상, 또는 26% 이상, 예를 들어 24% 이상, 또는 22% 이상, 예를 들어 20% 이상, 또는 18% 이상, 예를 들어 16% 이상, 또는 14% 이상, 예를 들어 12% 이상, 또는 10% 이상, 예를 들어 8% 이상, 또는 6% 이상, 예를 들어 4% 이상, 또는 2% 이상, 또는 0.5% 이상의 서열 동일성을 가진다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 예컨대 PAC1 또는 PAC2, 또는 이의 오르토로그와 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가지는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6 또는 이의 오르토로그와 70% 이상, 예컨대 72% 이상, 예를 들어 74% 이상, 예컨대 76% 이상, 예를 들어 78% 이상, 예컨대 80% 이상, 예를 들어 82% 이상, 예컨대 84% 이상, 예를 들어 86% 이상, 예컨대 88% 이상, 예를 들어 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예를 들어 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예를 들어 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예를 들어 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 나타내기 위해 본원에 사용된다.
본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 PAPP-A 특이적 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 PAC1의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 PAC2의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PAC1 및/또는 PAC2의 생성 방법에 관한 것이다. PAC1 및/또는 PAC2의 생성 방법은 하기 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 1) PCR, 2) 클로닝, 3) 예를 들어 태그를 포함한 플라스미드 구성물의 생성, 4) 예를 들어 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포 내 단백질의 발현, 5) 단백질의 발현 및 정제.
또 다른 바람직한 실시양태에서, PAPP-A에 결합하는 PAC1 및 PAC2는 절대적으로 C-말단 PAPP-A 엑소사이트 서열 LNR3, 또는 LNR3 모듈의 C-말단 측, 및 칼슘 이온의 존재에 의존한다. 따라서, PAC1 및 PAC2에 의해 인식되는 에피토프는 적어도 부분적으로, 26-잔기 LNR3 모듈 내 아미노산들로 이루어진다.
본 발명은 또한 기지 또는 미지의 기질의 기질 단백질분해의 전반적 억제를 초래하는, PAPP-A 엑소사이트(들)에 결합하는 PAC1 및 PAC2에 관한 것이다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 억제는 완전 또는 부분 억제이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, PAC1 또는 PAC2는 IGFBP-4 단백질분해의 억제를 초래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 엑소사이트 억제제는 IGF 방출의 자극을 초래한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한 기질 결합 PAPP-A 엑소사이트(들) 표적화에 의한 PAPP-A의 1개 이상의 생리학적 기질(들)의 전반적 억제를 유발하는, PAPP-A 엑소사이트(들)에 결합하는 PAC1 또는 PAC2에 관한 것이다.
본 발명은 또한 기질 결합 PAPP-A 엑소사이트(들) 표적화에 의한 PAPP-A의 2개 이상의 생리학적 기질의 차별적 억제를 유발하는, PAPP-A 엑소사이트(들)에 결합하는 PAC1 또는 PAC2에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, PAPP-A에 결합하는 PAC1 및 PAC2는 IGFBP-4의 PAPP-A-매개 절단의 완전 억제 및 IGFBP-5의 부분 억제를 유발함으로써, PAPP-A 기질에 대한 부분 차별적 억제 효과를 유발한다. 한 실시양태에서, PAC1 및 PAC2 항체는 다른 기지 또는 미지의 PAPP-A 기질의 억제를 유발하지 않을 것이며, 그것의 절단은 동일한 엑소사이트(들)에 대한 결합에 의존하지 않아도 된다.
특이적 PAPP -A 비- 엑소사이트 (들) 항체
한 실시양태에서, 하나 이상의 PAPP-A 비-엑소사이트(들) 억제제(들)는 PAPP-A 특이적 항체를 포함한다. 바람직하게, 이들 항체는 관련된 프로테이나제 PAPP-A2에 결합하지 않고 그것을 억제한다.
한 바람직한 실시양태에서, PAPP-A 특이적 항체는 PAC5이다.
인간 PAPP-A 내 PAC5에 의해 인식되는 에피토프의 매핑은, PAC5의 결합 부위가 잔기 600-937을 포함하는 PAPP-A의 연장부에 국소화됨을 보여준다. 경계가 정확히 나타내어줄 수는 없으나, 결합 부위는 1) 단백질분해 도메인, 및 2) (서열 번호 2와 동일한) 잔기 1133- 1547를 포함하는 엑소사이트(들) 함유의 단편 내에 있지 않다. "PA 1-950"은 아미노산 잔기 1-950을 포함하는 PAPP-A의 단편이다. "PA 937-1547"은 아미노산 잔기 937-1547을 포함하는 PAPP-A의 단편이다. "PA 1-599"는 아미노산 잔기 1-599를 포함하는 PAPP-A의 단편이다.
PAPP-A에 결합하는 PAC5의 매핑
PA 1-950 결합
PA 937-1547 비결합
PA 1-599 비결합
PAC5는 서열 번호 7로 표시된다. 억제제 PAC5의 아미노산 서열이 이하에 나와 있다. 서열은 scFv PAC5의 전장 서열이고, cDNA로부터 유래된다. 서열은 His- 및 c-myc 태그(양자 모두 밑줄 그어짐)를 포함한다. 이 His- 및/또는 c-myc 태그는 정제에 적당한 임의의 기타 태그로 치환될 수 있다. 대안적으로, His- 및/또는 c- myc 태그는 서열로부터 생략될 수 있다. 서열은 또한 CDR(상보성 결정 영역)(굵은 체로 표시됨)을 포함한다.
PAC5 서열(서열 번호 7):
Figure 112010054931816-pct00009
서열 번호 7의 변이체가 본 문헌 내 다른 임의의 부분에 기재되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 예컨대 PAC5 또는 이의 오르토로그와 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가지는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 서열 번호 7 또는 이의 오르토로그와 70% 이상, 예컨대 72% 이상, 예를 들어 74% 이상, 예컨대 76% 이상, 예를 들어 78% 이상, 예컨대 80% 이상, 예를 들어 82% 이상, 예컨대 84% 이상, 예를 들어 86% 이상, 예컨대 88% 이상, 예를 들어 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예를 들어 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예를 들어 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예를 들어 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 나타내기 위해 본원에 사용된다.
본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 PAPP-A 특이적 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 PAC5의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PAC5의 생성 방법에 관한 것이다. PAC5의 생성 방법은 하기 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 1) PCR, 2) 클로닝, 3) 예를 들어 태그를 포함한 플라스미드 구성물의 생성, 4) 예를 들어 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포 내 단백질의 발현, 5) 단백질의 발현 및 정제.
PAC5의 결합 부위는 PAC1 및 PAC2의 결합 부위와 달리, 기질 결합 PAPP-A 엑소사이트로 구분될 수 없다. 그러나, PAC5 데이터는, PAPP-A의 억제가 단백질분해 도메인과 CCP1 사이의 서열 연장부 내에 위치한 에피토프(들)를 표적화함으로써 수득될 수 있음을 입증한다. 억제의 기전이 아마도 입체 장애이다.
본 발명은 또한 기지 또는 미지의 기질의 기질 단백질분해의 전반적 억제를 초래하는 PAPP-A에 결합하는 PAC5에 관한 것이다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 억제는 완전 또는 부분 억제이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은은 또한 PAPP-A의 1개 이상의 생리학적 기질(들)의 전반적 억제를 유발하는 PAPP-A에 결합하는 PAC5에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, PAC5는 IGFBP-4 및 IGFBP-5 단백질분해의 억제를 초래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 엑소사이트 억제제는 IGF 방출의 자극을 초래한다.
성분 키트
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 엑소사이트 상호작용자를 포함하는 성분 키트에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 엑소사이트 억제제를 포함하는 성분 키트에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 엑소사이트 자극자를 포함하는 성분 키트에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자를 포함하는 성분 키트에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 억제제를 포함하는 성분 키트에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 자극자를 포함하는 성분 키트에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2를 포함하는 성분 키트에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2의 하나 이상의 변이체를 포함하는 성분 키트에 관한 것이다.
본 발명에 사용되는 용어 "성분 키트"는 본 발명에 따른 하나 이상의 엑소사이트 상호작용자 및 조합 투여를 위한 제2 생물활성제를 제공한다. 조합되는 활성 물질은 동시, 순차 또는 분리 투여를 위해 사용될 수 있다. 모든 경우들에서, 상기 언급된 의약 및 생물활성제 중 임의의 것이 약학적 유효량으로 투여하는 것이 바람직하며, 즉 상기 투여는 유의적 환자 이익을 나타내도록 하기에 충분한, 의약 또는 약학적 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총양을 수분한다. 제제는 당업자에게 알려진 방법에 의해 편리하게 단위 투약형으로 제시될 수 있다. 키트는 예를 들어 투여용 투약 형태 내에 활성 화합물을 함유하는 것이 바람직하다. 투약 형태는 대상에게 투여될 때 바람직한 효과가 수득될 수 있도록 하는 충분한 양의 활성 화합물(들) 중 하나 이상을 함유한다 따라서, 의료 팩키지는 관련 투약 섭생법에 상응하는 양의 투약 유닛을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 한 실시양태에서, 의료 팩키지는 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 의료 팩키지는 예를 들어 (소화관을 통한) 장 투여 또는 비경구 투여(소화관 외의 경로)를 위한 임의의 적당한 형태일 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 팩키지는 카트리지, 예컨대 인슐린 치료로부터 알려진 주사 펜 등의 주사 펜용 카트리지의 형태이다. 바람직하게, 성분 키트는 바람직한 효과를 달성하기 위한 투약 형태의 사용을 설명하는 사용설명서, 및 특정된 시간에 걸쳐 취해지는 투약 형태의 양을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 의료 팩키지는 약학적 조성물을 투여하는 것에 관한 사용설명서를 포함한다. 지혈, 또는 지혈 또는 이의 위험의 기저 요인의 치료에 작용하는 1개 이상(예컨대, 2 또는 3개)의 부가적 의약(들), 및 본 발명에 따른 1개 이상(예컨대, 2 또는 3개)의 폴리펩티드가 상기 치료를 필요로 하는 개체에 투여하기 위한 본원에 기재된 "성분 키트" 중 임의의 것을 제조하는 데 사용될 수 있음이 구상된다.
항체
본 발명의 한 측면은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4, 또는 이의 기능성 동족체 내 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합하는 항체 또는 이의 기능적 균등체를 제공하는 것이다. 에피토프는 이후 언급되는 에피토프들 중 임의의 것일 수 있다.
항체 또는 이의 기능적 균등체는 당업계에 알려진 임의의 항체, 예를 들어 포유동물로부터 유래된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 또는 합성 항체, 예컨대 항체 단편을 포함하는 단쇄 항체 또는 하이브리드일 수 있다. 또한, 항체는 모노클로날 항체 또는 인공 폴리클로날 항체의 혼합물일 수 있다. 또한, 항체의 기능적 균등은 항체 단편, 특히 에피토프 결합 단편일 수 있다. 또한, 항체 또는 이의 기능적 균등체는 항체를 모방하는 소분자 모방체일 수 있다.
천연 발생 항체는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 면역글로불린 분자이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
모노클로날 항체(Mab)는 모든 항체 분자들이 유사하여 동일한 에피토프를 인식하는 항체이다. 모노클로날 항체는 일반적으로 하이브리도마 세포주에 의해 생성된다. 모노클로날 항체 및 항체를 합성하는 하이브리도마 세포의 제조 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 항체를 생성하는 하이브리도마는 예를 들어 항체 생성 B 림프구를 불멸화 B-림프구 세포주와 융합함으로써 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, By Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]에 기재된 바대로 제조될 수 있다. 상기 모노클로날 항체는 임의의 적당한 포유동물 종으로부터 유래될 수 있으나, 빈번하게는 모노클로날 항체는 설치류 항체 예를 들어 쥐 또는 래트 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 모노클로날 항체이거나 모노클로날 항체로부터 유래된 것이 바람직하다.
폴리클로날 항체는 특정 소정의 항원을 인식하는 항체 분자들의 혼합물이며, 이로써 폴리클로날 항체는 상기 항원 내의 상이한 에피토프들을 인식할 수 있다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 항원으로 사전 면역화된 포유동물의 혈청으로부터 정제된다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, By Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리클로날 항체는 임의의 적당한 포유동물 종, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 당나귀, 염소, 양, 소 또는 낙타로부터 유래될 수 있다. 항체는 비-포유동물 종로부터 유래되지 않는 것이 바람직하며, 즉 항체는 예를 들어 닭 항체가 아닌 것이 바람직하다. 항체는 또한 예를 들어 각기 본원에 전문이 참조 인용되는 미국 특허 제5,789,208호 또는 미국 특허 제6,335,163호에 기재된 인공 폴리클로날 항체일 수도 있다.
본 발명에 따른 항체는 또한 재조합 항체일 수 있다. 재조합 항체는 재조합 기술을 이용하여 생성된 항체 또는 이의 단편 또는 이의 기능적 균등체이다. 예를 들어, 재조합 항체는 합성 라이브러리 또는 파지 디스플레이에 의해 생성될 수 있다. 재조합 항체는 임의의 통상적 방법, 예를 들어 문헌 ["Recombinant Antibodies", Frank Breitling, Stefan Dubel, Jossey-Bass, September 1999]에 나와 있는 방법에 따라 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 또한 이중특이적 항체, 즉 2개의 상이한 에피토프를 인식하는 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 일반적으로, 예를 들어 특이성들을 조합하기 위해 2개의 하이브리도마를 조합하거나, 화학적 가교결합에 의하거나, 또는 재조합 기술에 의해, 모노클로날 항체 또는 재조합 항체로부터 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 또한 삼중특이적 항체일 수 있다.
항체의 기능적 균등체는 한 바람직한 실시양태에서 항체의 단편, 바람직하게는 항원 결합 단편 또는 가변부일 수 있다. 본 발명에 유용한 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편이 포함된다. 항체의 파파인 분해로써, 각기 단일 항원 결합 부위를 가지는 Fab 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 용이하게 결정화하는 능력으로 인해 명명된 잔류 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신 처리로써, 항원을 가교할 수 있는 2개의 항원 결합 단편을 가지는 F(ab')2 단편, 및 기타 잔류 단편(pFc'로 표시됨)이 생성된다. 부가적 단편에는 디아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체가 포함될 수 있다. 항체와 관련된, 본원에 사용되는 "기능성 단편"은 Fv, F(ab) 및 F(ab')2ι 단편을 가리킨다.
바람직한 항체 단편은, 항체가 그것의 항원 또는 수용체와 선택적으로 결합하는 능력을 일부 또는 본질적으로 모두 보유한다. 일부 바람직한 단편이 이하에 정의되어 있다:
(1) Fab는 항체 분자의 1가 항원-결합 단편을 포함하는 단편이다. Fab 단편은 효소 파파인으로 전 항체를 분해하여 비분해 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부를 얻음으로써 생성될 수 있다.
(2) Fab'는 항체 분자의 단편으로서, 펩신으로 전 항체를 처리한 후, 환원하여 비분해 경쇄 및 중쇄의 일부를 얻음으로써 수득될 수 있다. 2개의 Fab' 단편은 항체 분자 당 수득된다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역의 1개 이상의 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 몇 개의 잔기가 부가된 점에서 Fab 단편과 상이하다.
(3) (Fab')2는 효소 펩신으로 전 항체를 처리하되, 후속하여 환원하지 않음으로써 수득될 수 있는 항체 분자의 단편이다. F(ab')2는 2개의 이황화물 결합에 의해 함께 고정된 2개의 Fab' 단편의 이량체이다.
(4) Fv는 완전 항원 인식 및 결합 부위를 가지는 최소의 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비-공유 결합의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체(VH-VL 이량체)로 구성된다. 그것은 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 VH-VL 이량체의 표면 상에 있는 항원 결합 부위를 정의하기 위해 상호작용하는 입체배치를 가진다. 집합적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가지나, 전 결합 부위에 비해서는 친화도가 낮다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 유전적으로 융합된 단쇄 분자로서 적당한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 경쇄의 가변부와 중쇄의 가변부를 포함하는 유전적으로 조작된 분자로서 정의되는 단쇄 항체("SCA")이다. 그러한 단쇄 항체는 또한 "단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편으로 칭해진다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
항체는 또한 유용한 성질을 위해 선택될 수도 있고, 예를 들어 항체의 혈청 반감기를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 완전 항체 분자는 매우 긴 혈청 지속성을 가지는 반면, 단편(<60-80 kDa)은 신장을 통해 매우 급속히 여과된다. 완전 항체에서의 글리코실화는 일반적으로 혈청 지속성을 연장한다. PAPP-A 항체의 장기 작용이 바람직한 경우, PAPP-A 항체는 바람직하게 완전 항체이다.
본 발명 또 다른 실시양태에서, 항체의 기능적 균등체는 항체를 모방하는 소분자 모방체이다.
인간 항체
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 통상적 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)]의 표준 체세포 하이브리드화 기법을 포함한 각종 기법들에 의해 생성될 수 있다. 체세포 하이브리드화 절차가 바람직하긴 하나, 원칙적으로 다른 모노클로날 항체의 생성 방법들, 예를 들어 B-림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환, 또는 인간 항체 유전자의 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 기법을 이용할 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 마우스 면역계 외의 인간 면역계의 부분을 가지는 트랜스제닉 또는 염색체도입 마우스를 이용하여, PAPP-A에 대해 지정된 인간 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 이 트랜스제닉 및 염색체도입 마우스에는 본원에 각기 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 마우스들이 포함되고, 집합적으로는 본원에 "트랜스제닉 마우스"로 칭해진다.
HuMAb 마우스는 내인성 μ 및 κ 사슬 좌를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배치되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니-좌를 포함한다(문헌 [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859]). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 발현 감소, 및 면역화에 따른 인간 중쇄 및 경쇄 도입유전자의 도입을 나타내고, 고친화도 인간 IgG, κ 모노클로날 항체를 생성하기 위한 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪는다(문헌 [Lonberg, N. et al. (1994) 이하 상기와 같음]; 문헌 [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; 문헌 [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93] 및 문헌 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536- 546]에서 검토됨). HuMAb 마우스의 제조가 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; 문헌 [Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920]; 문헌 [Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474):856-859]; 문헌 [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; 문헌 [Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591]; 문헌 [Lonberg, N. 및 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93]; 문헌 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546]; 문헌 [Fishwild, D. etal. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 상세히 기재되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호(이들 모두 Lonberg 및 Kay의 건임), 및 미국 특허 제5,545,807호(Surani 등); WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187를 참조한다.
KM 마우스는 인간 중쇄 도입염색체 및 인간 카파 경쇄 도입유전자를 보유한다. KM 마우스에서는 또한 내인성 마우스 중쇄 및 경쇄 유전자가 붕괴되어, 마우스의 면역화가 마우스 면역글로불린 외의 인간 면역글로불린의 생성을 초래한다. KM 마우스의 작제, 및 이의 인간 면역글로불린 제공을 위한 용도가 WO 02/43478에 상세히 기재되어 있다.
면역화
PAPP-A에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 예를 들어 문헌 [Lonberg et al. (1994), 이하 상기와 같음; Fishwild et al. (1996), 이하 상기와 같음, 및 WO 98/24884에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자를 보유한 트랜스제닉 또는 염색체도입 마우스(예를 들어, HCo12, HCo7 또는 KM 마우스)를 PAPP-A 항원 및/또는 PAPP-A 발현 세포의 풍부화 제제로 면역화할 수 있다. 대안적으로, 마우스를 인간 PAPP-A를 코딩하는 DNA로 면역화할 수 있다. 바람직하게, 마우스는 첫 번째 주입 시에 6 내지 16주령일 것이다. 예를 들어, PAPP-A 항원의 풍부화된 제제(5 내지 50 ㎍)를 사용하여, HuMAb 마우스 복강내 제제를 면역화할 수 있다. PAPP-A 항원의 정제되거나 풍부화된 제제를 사용한 면역화로 항체를 수득하지 못할 경우, 마우스를 PAPP-A 발현 세포, 예를 들어 세포주로 면역화하여, 면역 반응을 촉진할 수도 있다.
각종 항원을 이용한 누적 실험은, 프로인트 보강제에서 PAPP-A 발현 세포로 복강내(i.p.) 또는 피하(s.c.) 초기 면역화한 후, PBS 내 PAPP-A 발현 세포로 2주마다 i.p. 면역화(총 10 이하)할 때, HuMAb 트랜스제닉 마우스가 가장 잘 반응한다는 것을 보여준다. 반응은 후안화 혈액에 의해 수득되는 혈장 샘플을 이용한 면역화 프로토콜 과정을 통해 모니터링할 수 있다. 혈장을 FACS 분석에 의해 스크리닝할 수 있고, 항-PAPP-A 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 가지는 마우스를 융합을 위해 사용할 수 있다. 마우스를 PAPP-A 발현 세포를 이용하여, 예를 들어 희생 및 비장 제거하기 4일 및 3일 전에, 부스팅할 수 있다.
PAPP -A에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 하이브리도마 생성
PAPP-A에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 하이브리도마를 생성시키기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장세포 및 림프절 세포를 단리하여, 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합할 수 있다. 이어서, 수득된 하이브리도마를 항원-특이적 항체 생성을 위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 혈장 림프구의 비장 단일 세포 현탁액을 50% PEG(w/v)를 갖는, SP2/0를 분비하지 않는 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 융합할 수 있다. 세포를 편평한 바닥의 마이크로티터 플레이트에 대략 1×105/세포로 플레이팅한 후, 통상의 시약 외에 10% 태아 클론 혈청, 5-10% 오리젠 하이브리도마 클로닝 인자(IGEN) 및 1×HAT(시그마(Sigma))를 포함하는 선택 배지 내에 2주 동안 항온배양할 수 있다. 대략 2주 후, 세포를 HAT를 HT로 대체한 배지에서 배양할 수 있다. 이어서, 각각의 웰을 인간 카파-경쇄 함유 항체에 대해서는 ELISA에 의해, 또한 PAPP-A 특이성에 대해서는 PAPP-A 발현 세포를 이용한 FACS 분석으로 스크리닝할 수 있다. 일단 대폭적 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지를 통상 10 내지 14일 후에 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하고, 다시 스크리닝할 수 있으며, 여전히 인간 IgG에 대해 양성인 경우, 항-PAPP-A 모노클로날 항체를 희석 제한에 의해 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관내 배양하여, 특징분석을 위해 조직 배양 배지에 생성시킬 수 있다.
PAPP -A에 대한 인간 모노클로날 항체를 생성하는 이입세포의 생성
본 발명의 인간 항체를 또한 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어 재조합 DNA 기법 및 유전자 형질전환법의 조합을 이용하여, 숙주세포의 이입세포에서 생성시킬 수 있고, 예를 들어 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]를 참조한다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항체 단편을 발현하기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄 코딩 DNA를 표준 분자생물학 기법(예를 들어, PCR 증폭, 부위 지정 돌연변이유발)로 수득할 수 있고, 그것을 발현 벡터 내에 삽입하여, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결되도록 할 수 있다. 이 맥락에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 자체의 의도된 기능을 수행하도록 벡터 내에 결찰됨을 의미하기 위한 것이다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용하는 발현 숙주 세포와 상용적이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 분리된 벡터에 삽입할 수 있거나, 보다 통상적으로는 양 유전자 모두 동일한 발현 벡터에 삽입한다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 블런트 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내에 삽입된다. 본원에 기재된 경쇄 및 중쇄 가변부를 사용하여, 원하는 이소타입의 중쇄 불변 및 경쇄 불변부를 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함에 의해 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 생성시킬 수 있고, 이에 따라VH 세그먼트가 벡터 내의 CH 세그먼트(들)에 작동적으로 연결되고, VL 세그먼트는 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동적으로 연결된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자를 벡터 내에 삽입하여, 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 대해 인-프레임(in-frame)으로 연결되도록 할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드[즉, 비- 면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 부가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내의 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 사열을 가진다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 증진자, 및 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 기타 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함한, 발현 벡터의 설계가 형질전환할 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존함이 당업자에 의해 인지될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열에는 포유동물 세포 내 높은 수준의 단백질 발현을 지정하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안(Simian) 바이러스 40(SV40), 아데노 바이러스(예를 들어, 아데노 바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터의 프로모터 및/또는 증진자가 포함된다. 대안적으로, 비바이러스성 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터가 사용될 수도 있다.
본 발명의 항체 사슬 유전자 및 조절 서열, 재조합 발현 벡터는 부가적 서열, 예컨대 숙주 세포 내 벡터의 복제를 제어하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주의 선택을 촉진한다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 미국 특허 제4,634,665호 및 미국 특허 제5,179,017호, 이들 모두는 Axel 등의 건임). 예를 들어, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr-숙주 세포에 사용하기 위한) 디히드로폴레이트 리럭타제(DHFR) 유전자 및 (G418 선택을 위한) 네오 유전자를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기법에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 각종 형태들의 용어 "형질감염(transfection)"은 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포의 도입에 통상 사용되는 매우 다양한 기법들, 예를 들어 전기천공, 칼슘-인산염 석출, DEAE- 덱스트란 형질감염, 리포펙틴 형질감염 등을 포괄하도록 의도된다.
한 실시양태에서, 항체는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 숙주 세포에서 발현된다. 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 CHO 세포(예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 DHFR 선택 마커와 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포), NS/0 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포 및 SP2.0 세포가 포함된다. 특히 NS/0 골수종 세포와 함께 사용하기 위한, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS(글루타민 신타제) 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 경우, 항체는. 숙주 세포 내에서의 항체 발현, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체의 분비를 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
PAPP -A에 대한 인간 모노클로날 항체 생성을 위한 다른 재조합 수단
대안적으로, 클로닝된 항체 유전자는 미생물과 같은 원핵 세포, 예를 들어 scFv 항체 생산을 위한 E. 콜라이, 조류, 및 곤충 세포를 비롯한 다른 발현 시스템 내에서 발현될 수 있다. 또한, 항체는 트랜스제닉 인간외 동물, 예컨대 양 및 토끼의 젖 또는 암탉의 달걀, 또는 트랜스제닉 식물에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Verma, R., et al. (1998) "Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems", J. Immunol. Meth. 216:165-181]; 문헌 [Pollock, et al. (1999) "Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies", J. Immunol. Meth. 231:147-157]; 및 문헌 [Fischer, R., et al. (1999) "Molecular farming of recombinant antibodies in plants", Biol.Chem. 380:825-839]를 참조한다.
비변형 항체를 발현하기 위한 부분 항체 서열의 용도
항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 우세하게 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내 아미노산 서열은 CDR 외의 서열보다 개별 항체들 간에 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용의 원인이기 때문에, 상이한 성질들을 가지는 상이한 항체들로부터의 프레임워크 서열에 접합된 특이적 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제함으로써 특이적 천연 발생 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327]; 문헌 [Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525]; 및 문헌 [Queen, C. et al. (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:10029-10033] 참조). 그러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 이 배선 서열은, B 세포 성숙 과정 중에 V(D)J 결합에 의해 형성되는 완전 조립 가변 유전자를 포함하지 않기 때문에, 성숙 항체 유전자 서열과는 상이하다. 배선 유전자 서열은 또한, 가변 유전자 전반에 걸쳐 돌연변이를 가지나, 통상 CDR에서 클러스터를 이루는 고친화도 2차 레파토리 항체의 서열과도 상이하다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노 말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에 비교적 빈번하지 않다. 이러한 이유로, 원래의 항체의 결합 성질과 유사한 결합 성질을 가지는 비변형 재조합 항체를 재생성시키기 위해, 특정 항체의 전 DNA 서열을 수득할 필요는 없다(WO 99/45962 참조). CDR 영역에 걸쳐 있는 부분 중쇄 및 경쇄 서열은 이러한 목적에서 전형적으로 충분하다. 부분 서열은 재조합된 항체 가변 유전자에 기여한 배선 가변 및 결합 유전자 세그먼트가 어떤 것인지를 결정하기 위해 사용된다. 이어서, 배선 서열은 가변부의 결실 부분을 채우기 위해 사용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 중에 절단되고, 최종 항체의 성질에 기여하지 않는다. 결실 서열을 부가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열은 결찰 또는 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 조합될 수 있다. 대안적으로, 전 가변부는 짧은 중첩 올리고뉴클레오티드의 세트로서 합성되고, PCR 증폭에 의해 조합됨으로써, 전합성 합성 가변부 클론을 생성시킬 수 있다. 이 과정은 제거 또는 함입, 또는 부분 제한 부위 또는 특정 코돈의 최적화와 같은 특정 이점을 가진다.
하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 동일한 아미노산 코딩 성능을 가지는 합성 V 서열을 생성시키기 위한 합성 올리고뉴클레오티드의 중첩 세트를 설계한다. 합성 중쇄 및 카파 사슬 서열은 하기 3가지 면에서 천연 서열과 상이할 수 있다: 반복 뉴클레오티드 염기의 열이 간섭되어, 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 촉진함; 최적 번역 개시 부위가 코작 법칙(Kozak's rules)(문헌 [Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867- 19870])에 따라 도입됨; 및 HindIII 부위가 번역 개시 부위의 업스트림에서 조작됨.
중쇄 및 경쇄 가변부 모두에 대해, 최적화된 코딩 및 상응하는 비코딩 가닥 서열이 상응하는 비코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중간점에서 30 내지 50개 뉴클레오티드로 파쇄된다. 따라서, 각 사슬에 대해, 올리고뉴클레오티드는 150 내지 400개 뉴클레오티드의 세그먼트에 걸친 중첩 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 이어서, 풀을 주형으로 사용하여, 150 내지 400개 뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물을 생성시킨다. 전형적으로, 단일 가변부 올리고뉴클레오티드 세트를 2개의 풀로 파쇄하고, 이를 분리하여 증폭시켜 2개의 중첩 PCR 산물을 생성시킨다. 이어서, 이 중첩 산물을 PCR 증폭에 의해 조합하여, 완전 가변부를 형성한다. 발현 벡터 구성물 내로 용이하게 클로닝될 수 있는 단편을 생성시키기 위해, PCR 증폭에서 중쇄 또는 경쇄 불변부(카파 경쇄의 BbsI 부위 또는 감마 중쇄의 AgeI 부위 포함)의 중첩 단편을 포함하는 것이 바람직할 수도 있다.
이어서, 재작제된 중쇄 및 경쇄 가변부를 클로닝된 프로모터, 리더, 번역 개시, 불변부, 3' 미번역, 폴리-아데닐화, 및 전사 종결, 서열과 조합하여, 발현 벡터 구성물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구성물을 단일 벡터 내로 조합하고, 숙주 세포 내로 동시 형질감염, 일련 형질감염 또는 분리 형질감염시킬 수 있으며, 이어서 그것을 융합시켜 양 사슬 모두를 발현하는 숙주 세포를 형성한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 인간 항-PAPP-A 항체의 구조적 특성을 이용하여, 본 발명의 항체의 한 가지 이상의 기능적 성질, 예컨대 PAPP-A에의 결합을 보유하는, 구조적으로 관련된 인간 항-PAPP-A 항체를 생성시킨다. 보다 구체적으로, 2C6의 하나 이상의 CDR 영역을 알려진 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합 방식으로 조합하여, 본 발명의 부가적, 재조합으로 작제된 인간 항-PAPP-A 항체를 생성시킬 수 있다.
단가 항체
일특이적 결합 구성원은 1가, 즉 단지 하나의 결합 도메인만을 가지는 것일 수 있다.
1가 항체의 경우, 면역글로불린 불변 도메인 아미노산 잔기 서열은 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 당업계에 알려져 있는 항체 분자의 구조적 부분을 포함한다. 바람직한 것은 CL로 당업계에 알려져 있는 결합 구성원이다. 바람직한 CL 폴리펩티드는 C카파 및 C람다로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또한, 지금까지 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인 (각기 CH 또는 CL)일 수 있기 때문에, 각종 1가 결합 구성원 조성물이 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들어, 경쇄 불변 도메인은 또 다른 경쇄 불변 도메인 또는 중쇄 불변 도메인에 이황화물 가교로 이어질 수 있다. 이와 대조적으로, 중쇄 불변 도메인은 2개의 독립적 이황화물 가교를 형성할 수 있어, 양자 모두를 또 다른 중쇄 및 경쇄에 가교할 수 있거나, 중쇄의 중합체를 형성할 수도 있다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 1가 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 이 때 불변 사슬 도메인 C가 1개 이상의 이황화물 가교를 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 가지고, 조성물이 상기 이황화물 가교에 의해 공유 결합된 2개 이상의 1가 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물을 고려한다.
바람직한 실시양태에서, 불변 사슬 도메인 C는 CL 또는 CH일 수 있다. C가 CL인 경우, CL 폴리펩티드는 바람직하게 C카파 및 C람다로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 1가 폴리펩티드를 포함하는 결합 구성원 조성물로서, 다만 C가 이황화물 가교를 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 가지는 CL이어서 조성물이 상기 이황화물 가교에 의해 공유 결합된 2개의 1가 폴리펩티드를 함유하는 경우를 제외하는 조성물을 고려한다.
항체: 이중특이성을 포함한 다중특이성
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 상이한 실체를 결합시키기 위한 친화도를 가지고 그러한 결합을 가능하게 하는, 다중 특이적 결합 구성원에 관한 것이다. 다중특이적 결합 구성원은 이중특이적 결합 구성원을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 다중특이적 분자는 2개 이상의 상이한 결합 도메인을 보유하고 이 중 1개 이상은 항체 기원의 것인 이중특이적 항체(BsAb)이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 또한 단쇄 이중특이적 분자, 예컨대 단쇄 이중특이적 항체, 1개의 단쇄 항체 및 결합 도메인을 포함하는 단쇄 이중특이적 분자, 또는 2개의 결합 도메인을 포함하는 단쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 다중특이적 분자는 또한 단쇄 분자일 수도 있거나, 2개 이상의 단쇄 분자를 포함해도 된다.
이중특이적 항체를 포함한 다중특이적 항체는 당업자에게 알려진 임의의 적당한 방식에 의해 생성될 수 있다.
이중특이적 전 항체를 발생하기 위한 종래 방법은, 각기 요망되는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 2개의 하이브리도마 세포주를 융합하는 것이었다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 결합으로 인해, 이들 하이브리드 하이브리도마는 10개 이하의 상이한 중쇄 및 경쇄 조합(이중 단지 하나만이 이중특이적 항체임)의 혼합물을 생성한다. 그러므로, 이들 이중특이적 항체는 요망되는 생성물의 수율을 상당히 감소시키는 번거로운 절차들로 정제되어야 한다.
대안적 방법은 상기 기재된 바와 같이 힌지에 또는 유전적으로 도입된 C-말단 Cys를 통해 시스테인 잔기의 화학적 가교에 의해 2개의 항원 특이성의 시험관내 연결을 포함한다. 그러한 시험관내 어셈블리의 개선은 Fab를 이종이량체의 형성을 촉진하는 펩티드와 재조합 융합함에 의해 달성되었다. 그러나, 이들 방법에서의 이중특이적 산물의 수율은 100%에 훨씬 미치지 못한다.
시험관내 화학적 어셈블리 단계를 수반하지 않는 2가 또는 이중특이적 항체 단편의 생성을 위한 더 효율적인 방법이 Holliger 등(1993)에 의해 기재되었다. 이 방법은 scFv가 단량체 및 이량체 모두로서 종종 존재한다는 관찰을 이용한다. 이 관찰은 상이한 사슬의 VH 및 VL이 쌍을 형성함으로써, 이량체 및 보다 큰 복합체를 형성할 수 있음을 제시하였다. Hollinger 등에 의해 "디아바디"라고도 칭해지는 이량체성 항체 단편은 실제로 생체내 조립된 소형 2가 항체 단편이다. 2개의 상이한 항체 1 및 2의 VH 및 VL을 연결하여 "크로스오버(cross-over)" 사슬 VH 1VL 2 및 VH 2-VL 1을 형성함으로써, 이량체화 과정은 양 항원 결합 부위 모두를 재조립하는 것으로 나타났다. 2개 모두의 결합 부위의 친화도는, VH 및 VL을 공유 결합시키는 폴리펩티드 링커를 제거함으로써 각기 직접적으로 VH로 구성되고 VL에 공유 결합되어 VH과 쌍 형성을 하지 않는 2개의 단백질을 생성할 때, 개시 scFv와 동일하거나, 심지어는 10배 증가된 것으로 나타났다. 이러한 이중특이적 항체 단편의 생성 방법도 또한 수가지 특허 출원들에 기재되었다. 특허 출원 WO 94/09131(SCOTGEN LTD; 우선일 1992년 10월 15일)은, 결합 도메인은 2개의 사슬에 존재하거나 scFv에 연결된 VH 및 VL 영역 모두로부터 유래되는 반면, 다른 융합된 항체 도메인, 예를 들어 C-말단 불변 도메인은 이량체성 구성물을 안정화하기 위해 사용되는 이중특이적 결합 단백질에 관한 것이다. 특허 출원 WO 94/13804(CAMBRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY/MEDICAL RESEARCH COUNCIL; 첫 번째 우선일 1992년 12월 4일)은 상호 결합할 수 없는 VH 및 VL을 함유하여, V-도메인이 링커의 존재 또는 부재 하에 연결될 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다.
Mallender 및 Voss(1994)(이 또한 특허 출원WO 94/13806(DOW CHEMICAL CO; 우선일 1992년 12월 11일)에 기재됨)는, E. 콜라이 내 단쇄 이중특이적 항체 단편의 생체내 생성에 대해 보고하였다. 2가 단백질의 이중특이성은 가요성 폴리펩티드 링커에 의해 유전 수준으로 함께 연결된 구분된 특이성을 가지는, 사전 생성된 2개의 1가 scFv 분자에 기초하였다. 종래, 단쇄 항체 단편에 관한 한, 폴리펩티드 링커의 존재 또는 부재 하에 1개의 중쇄가 1개의 (상응하는) 경쇄에 연결된 것으로 구성된 단일 분자가 관련되었다. "디아바디" 방법(Holliger 등(1993) 및 특허 출원 WO 94/09131)에 의해 혹은 "이중 scFv" 방법(Mallender 및 Voss(1994) 및 특허 출원 WO 94/13806)에 의해 2가 또는 이중특이적 항체 단편을 제조할 경우, 이 역시 VH가 (상응하는) VL에 연결된다.
상기 기재된 다중특이적 분자는 다수의 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 모든 특이성은 동일한 벡터에서 코딩되어, 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조립될 수 있다. 이 방법은 특히 다중특이적 분자가 mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F(ab')2 또는 리간드 X Fab 융합 단백질일 때 유용하다. 2가 또는 다가 항체의 생성을 위한 각종 기타 방법이 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 제5,455,030호; 제4,881,175호; 제5,132,405호; 제5,091,513호; 제5,476,786호; 제5,013,653호; 제5,258,498호; 및 제5,482,858호에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 또는 다중특이적 결합 구성원을 이용함으로써, 본 발명은 일특이적/1가 결합 구성원에 비해 수가지 이점을 제공한다.
이중특이적/다중특이적 결합 구성원은 스트렙토코커스(Streptococcus) 단백질, 특히 뉴모라이신(Pneumolysin)을 특이적으로 인식하여 그것에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인을 가지는 반면, 다른 결합 도메인(들)은 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서 1개 이상의 다른 결합 도메인은 제1 결합 도메인과 대비하여, 스트렙토코커스 단백질에 대한 결합, 예컨대 동일한 스트렙토코커스 단백질 상의 또 다른 에피토프에 대한 결합을 위해 사용된다. 이로써, 스트렙토코커스 종에 대한 특이성이 증가할 뿐만 아니라, 결합 구성원의 화합력도 증가한다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 다른 결합 도메인은 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포에 특이적으로 결합하기 위해 사용될 수 있다. 치료 방법에서 결합 구성원의 효과를 증가시키기 위해, 적어도 결합 도메인이 면역활성 세포, 예컨대 백혈구, 마크로파지, 림프구, 호염기성 세포 및/또는 호산성 세포에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 이는 1개 이상의 다른 결합 도메인이 포유동물 단백질, 예컨대 인간 단백질, 예컨대 클러스터 분화 단백질(CD) 중 임의의 것, 특히 CD64 및/또는 CD89로부터 선택된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 확립함으로써 달성될 수 있다. CD64 특이성을 가지는 이중특이적 항체의 생성 방법이 미국 특허 제6,071,517호(Medarex, Inc.)에 기재되어 있다
따라서, 본 발명은 PAPP-A에 대한 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함한 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89), 또는 T 세포 수용체, 예를 들어 CD3이다. 그러므로, 본 발명은 이펙터 세포(예를 들어, 단핵구, 마크로파지 또는 다형핵 세포(PMN))를 발현하는 FcγR, FcαR 또는 FcεR에 결합할 수 있으면서, PAPP-A를 발현하는 표적 세포에 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이 이중특이적 및 다중특이적 분자는 PAPP-A 발현 세포를 이펙터 세포 등에 표적화하고, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 Fc 수용체-매개 이펙터 세포 할성, 예컨대 PAPP-A 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 사이토킨 방출, 또는 과산화물 음이온의 발생을 촉발한다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-PAPP-A 결합 특이성에 부가하여, 제3의 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제3의 결합 특이성은 항증진 인자(EF) 부분, 예를 들어 세포독성 활성과 관련된 표면 단백질에 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항증진 인자 부분"은 주어진 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체에 결합함으로써, Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결정자를 결합시키는 효과를 증진시키게 되는 항체, 기능성 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항증진 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항증진 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성이 결합하는 실체와 상이한 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항증진 인자 부분은 세포독성 T 세포(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대한 증가된 면역 반응을 초래하는 기타 면역 세포)에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이성으로서, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단쇄 Fv를 비롯한 1개 이상의 추가의 항체를 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소의 단편, 예컨대 Ladner 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 Fv 또는 단쇄 구성물일 수 있다. 항체는 또한 미국 특허출원 제2003/0118592호 및 미국 특허출원 제2003/0133939호에 개시된 바와 같은 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질일 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성이 인간 모노클로날 항체에 의해 제공될 수 있고, 이의 결합은 인간 면역글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에 사용되는 용어 "IgG 수용체"는 염색체 1에 위치한 8개의 γ쇄 유전자 중 임의의 것을 지칭한다. 이 유전자는 3가지 Fcγ 수용체 부류, 즉: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)로 군 분류되는 총 12개의 막횡단 또는 가용성 수용체 아형을 코딩한다. 한 바람직한 실시양태에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화성 FcγRI이다.
이들 바람직한 모노클로날 항체의 생산 및 확인이 Fanger 등의 WO 88/00052 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있다. 이 항체는 수용체의 Fcγ 결합 부위와 구분되는 부위를 갖는, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하고, 이로써 그 결합은 생리학적 수준의 IgG에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이적 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. 다른 실시양태에서, 항-Fey 수용체 항체는 인간화된 형태의 mAb 22(H22)이다. H22 항체의 생산 및 확인이 문헌 [Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10):4996-5002] 및 WO 94/10332에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 HA022CL1의 명칭 하에 1992년 11월 4일에 미국 미생물보존국[American Type Culture Collection]에 기탁되었고, 등록 번호 No. CRL 11177를 가진다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성이 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fcα 수용체(Fcαl (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되고, 이들의 결합은 바람직하게 인간 면역글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 "IgA 수용체"는 염색체 19에 위치한 1개의 α-유전자(FcαRI)의 유전자 산물을 포함하도록 의도된다. 이 유전자는 55 내지 110 kDa의 수가지 대안적으로 스플라이싱된 막횡단 아형을 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI(CD89)는 단핵구/마크로파지, 호산구 및 호중구에 구성적으로 발현되나, 비-이펙터 세포 집단에서는 발현되지 않는다. FcαRI는 IgA1 및 IgA2 모두에 대한 중간 친화도를 가지고, 이 친화도는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토킨에 노출될 때 증가한다(문헌 [Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]). IgA 리간드 결합 도메인 외부의 FcαRI에 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 동정된 4개의 FcαRI-특이적 모노클로날 항체가 기재되었다(문헌 [Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764]).
인간 모노클로날 항체가 바람직하나, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 이용될 수 있는 다른 항체는 쥐, 키메라 및 인간화된 모노클로날 항체이다. 그러한 쥐, 키메라 및 인간화된 모노클로날 항체는 당업계에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 화학적 기법(예를 들어, 문헌 [D. M. Kranz et al. (1981) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 78:5807] 참조), "폴리오마" 기법(미국 특허 제4,474,893호 참조), 또는 재조합 DNA 기법을 이용하여 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 알려진 방법을 이용하여, 구성 결합 특이성, 예를 들어 항-FcR 및 항-PAPP-A 결합 특이성을 접합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각 결합 특이성은 분리하여 생성된 후, 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성는 단백질 또는 펩티드이고, 각종 커플링 또는 가교제가 공유 접합을 위해 사용될 수 있다. 가교제의 예에는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세트산염 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)가 포함되고, 예를 들어 문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp . Med . 160:1686]; 문헌 [Liu, M. A., et al. (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:8648]를 참조한다. 다른 방법에는 문헌 [Paulus(Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132)]; 문헌 [Brennan etal. (1985) Science 229:81-83] 및 문헌 [Glennie et al. (1987) J. Immunol . 139:2367-2375]에 기재된 것들이 포함된다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이고, 이 양자 모두 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.; 미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수가능하다.
결합 특이성이 항체인 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 한 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에, 홀수개, 바람직하게는 1개의 술피히드릴기를 가지도록 변형된다.
대안적으로, 양 결합 특이성 모두 동일한 벡터에서 코딩되어, 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조립될 수 있다. 이 방법은 특히 다중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb×Fab, Fab×F(ab')2 또는 리간드×Fab 융합 단백질일 때 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단쇄 분자, 예컨대 단쇄 이중특이적 항체, 1개의 단쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자, 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 단쇄 분자일 수도 있거나, 2개 이상의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자의 제조 방법이 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기재되어 있다.
이중특이적 및 다중특이적 분자의 이의 특이적 표적으로의 결합은 효소 결합 면역흡수 검정법(ELISA), 방사능 면역 검정법(RIA), FACS 분석법, 바이오검정법(예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정법에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정법은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 시약(예를 들어, 시약)을 이용함으로써 특히 관심 대상인 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어 항체-FcR 복합체를 인식하고 그것에 특이적으로 결합하는 효소 결합 항체 또는 항체 단편을 이용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 복합체는 다른 면역검정법들 중 임의의 것을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사능 표지되어, 방사능 면역 검정법에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 방사능 동위원소는 γ 카운터 또는 신틸레이션 카운터의 사용 또는 방사능 사진촬영과 같은 수단에 의해 검출될 수 있다.
인간화 항체 프레임워크
인간외 "외래" 에피토프가 피처리 개체에서 면역 반응을 도출할 수 있기 때문에, 인간 요법에 대해 인간외 항체를 사용하는 것이 항상 바람직한 것은 아니다. 인간외 항체와 관련된 문제를 소거 또는 최소화하기 위해, 키메라 항체 유도체, 즉 인간외 Fab 가변부 결합 결정자를 인간 불변부(Fc)과 조합하는 "인간화된" 항체 분자와 조작하는 것이 바람직하다. 그러한 항체는 상기 기재된 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 균등한 항원 특이성 및 친화도를 그 특징으로 하고, 인간에 투여될 때, 면역원성이 덜하며, 이에 따라 피처리 개체에 의해 더 잘 견디어진다.
따라서, 한 실시양태에서, 결합 구성원은 인간화 항체라고도 불리는 인간화 항체 프레임워크 상에 보유된 결합 도메인을 가진다.
인간화 항체는 일반적으로, 인간 항체로부터 유래된 영역 및 인간외 항체로부터 유래된 영역, 예컨대 설치류 항체를 포함하는 키메라 항체이다. 인간화(재형상화(reshaping) 또는 CDR-접합이라고도 불림)는 이종발생성 공급원(통상 설치류)로부터의 모노클로날 항체(mAbs)의 면역원성을 감소시키고, 인간 면역글로불린에 대한 상동성을 증가시키며, 인간 면역계의 활성화를 향상시키기 위한 잘 확립된 기법이다. 따라서, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체 내 유사 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화된 항체는 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 성질을 보유하는 것도 또한 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해, 한 바람직한 방법에 따라, 인간화된 항체는 모서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용한 각종 개녀적 인간화된 산물 및 모서열의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 통상 이용가능하고, 당업자에게 자명하다. 가능한 선택된 후보 면역글로불린 서열의 3차원 형태 구조를 예시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 표시의 조사는, 후보 면역글로불린 서열의 기능화에 있어 특정 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린의 자체 항원에 대한 결합능에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 수령 서열 및 입수 서열로부터 선택 및 조합될 수 있고, 이로써 요망되는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 최대화되나, 항원 결합에 직접적으로 또한 가장 실질적으로 영향을 미치는 것은 CDR 잔기이다.
MAb의 인간화를 위한 한 방법은 한 항체의 완전 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 부위가 제2 항체, 바람직하게는 인간 항체로부터 유래된 불변 도메인에 융합된 키메라 항체의 생산과 관련되었다. 그러한 키메라화 절차를 수행하는 방법이 예를 들어 EP-A-0 120 694(셀테크 리미티드(Celltech Limited)), EP-A-0 125 023(제네테크 인코포레이티드(Genentech Inc.)), EP-A-0 171 496(Res. Dev. Corp. Japan), EP-A-0 173 494(스탠포드 대학(Stanford University)) 및 EP-A-0 194 276(Celltech Limited)에 기재되어 있다. 항체의 더욱 복잡한 형태의 인간화는, 인간외 항체 결합 부위를 구성하는 아미노산이 인간 항체 가변부의 프레임워크에 통합되도록 하는 가변부 도메인의 재설계를 수반한다(문헌 [Jones et al., 1986]).
본 발명의 인간화된 항체는 인간 항체의 CDR의 적어도 일부를 인간외 항체로부터 유래된 CDR로 치환할 수 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. Winter는 본 발명의 인간화된 항체의 제조에 사용될 수 있는 방법을 기재하고(UK 특허 출원 GB 2188638A, 1987년 3월 26일 출원), 이 문헌의 내용은 명시적으로 참조 인용된다. 인간 CDR은 이하 실시예에서 기재되는 바와 같이 올리고뉴클레오티드 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 인간외 CDR로 치환될 수 있다.
한 예로서, 본 발명의 인간화된 항체는 이하 간략한 설명에 기재되는 바와 같이 제조될 수 있다. 본 발명의 인간화된 항체는 하기 과정에 의해 생산될 수 있다:
(a) 통상적 기법에 의해, CDR 및 항체 결합 특이성을 보유할 것이 요구되는 가변 도메인 프레임워크 영역의 최소 부분이 인간외 면역글로불린으로부터 유래되고, 항체 사슬의 나머지 부분이 인간 면역글로불린으로부터 유래되는 항체 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 오페론을 갖는 발현 벡터를 작제함으로써, 본 발명의 벡터를 생산하는 과정;
(b) 통상적 기법에 의해, CDR 및 공여체체 결합 특이성을 보유할 것이 요구되는 가변 도메인 프레임워크 영역의 최소 부분이 인간외 면역글로불린으로부터 유래되고, 항체 사슬의 나머지 부분이 인간 면역글로불린으로부터 유래되는 상보적 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 오페론을 갖는 발현 벡터를 작제함으로써, 본 발명의 벡터를 생산하는 과정;
(c) 통상적 기법에 의해 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 본 발명의 형질감염된 숙주 세포를 생산하는 과정; 및
(d) 통상적 기법에 의해 형질감염된 세포를 배양하여, 본 발명의 인간화 항체를 생산하는 과정.
숙주 세포는 또한 본 발명의 2개의 벡터로 동시 형질감염될 수 있는데, 이 중 제1 벡터는 경쇄 유래 폴레핍티드를 코딩하는 오페론을 포함하고, 제2 벡터는 중쇄 유래 폴레핍티드를 코딩하는 오페론을 포함한다. 2개의 벡터는 상이한 선택 마커들을 포함하나, 다른 경우라면 항체 중쇄 및 경쇄 코딩 서열과 별도로, 동일한 것이 바람직하며, 이에 따라 가능한 한, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현이 보장된다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드 모두를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터인 달일 벡터가 사용될 수도 있다. 경쇄 및 중쇄를 위한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 양자 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 변경된 항체를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포는 에쉐리키아 콜라이( Escherichia coli)와 같은 박테리아 세포, 또는 진핵 세포일 우 있다. 특히, 이러한 목적을 위한 잘 정의된 유형의 포유동물 세포, 예컨대 골수종 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포가 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터가 작제될 수 있도록 하는 일반적 방법, 및 본 발명의 숙주 세포를 생산하는 데 필요한 형질감염 방법, 및 그러한 숙주 세포로부터 본 발명의 항체를 생산하는 데 필요한 방법은 모두 통상적 기법이다. 마찬가지로, 본 발명의 인간화된 항체는 일단 생산되면, 이하 기재된 바와 같은 표준 절차에 따라 정제될 수 있다.
인간 항체 프레임워크
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 항체 프레임워크에 의해 보유되는 결합 구성원, 즉 항체가 인간화 항체보다 인간 펩티드 서열 정도가 더 큰 결합 구성원에 관한 것이다.
인간 단백질에 대해 지정된 인간 mAb 항체는 마우스 면역계보다 완전 인간 면역계를 가지는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 관심 항원으로 면역화된 상기 트랜스제닉 마우스로부터의 비장세포를 사용하여, 인간 단백질에 대한 특이적 친화성을 가지는 인간 mAb를 분비하는 하이브리도마를 생성한다(예를 들어, Wood et al. 국제 특허 출원 WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT 출원 WO 91/10741; Lonberg et al. 국제 특허 출원 WO 92/03918; Kay et al. 국제 특허 출원 92/03917; 문헌 [Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859]; 문헌 [Green, L. L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21]; 문헌 [Morrison, S. L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855]; 문헌 [Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40]; 문헌 [Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724]; 문헌 [Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326] 참조).
그러한 트랜스제닉 마우스는 압제닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc.), 프레몬트(Fremont, 미국 캘리포니아 소재), 및 메다렉스 인코포레이티드(Medarex, Inc., 미국 뉴저지주 아난데일 소재)로부터 입수가능하다. 키메라 및 배선 돌연변이 마우스 내 항체 중쇄 결합 영역(IH)의 동종 결실은 내인성 항체 생산의 완전 억제를 초래하는 것으로 기재되었다. 상기 배선 돌연변이 마우스에서의 인간 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지 시의 인간 항체 생산을 초래한다, 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993)]; 문헌 [Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993)]; 문헌 [Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 및 문헌 [Duchosal et al. Nature 355:258 (1992)]을 참조한다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다(문헌 [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991)]; 및 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581- 597 (1991)]; 및 문헌 [Vaughan, et al., Nature Biotech 14:309 (1996)]).
대안적 "결합 구성원"
천연 단일 도메인 항체. 중쇄 항체(HCAb)는 낙타류(낙타, 단봉낙타, 라마)에 의해 자연적으로 생산된다. HCAb는 경쇄가 결핍되어 있고, 단지 중쇄 및 제1 불변 도메인으로 이루어진 된 동종이량체이다(문헌 [Hamers- Casterman et al., 1993]). 이들 동물의 면역화 가능성은 단일 도메인만으로 구성된 항원 결합 단위의 클로닝, 선택 및 생산을 허용한다. 또한, 이들 최소 크기의 항원 결합 단편은 박테리아에서 잘 발현되고, 고친화도로 항원과 상호작용하며, 매우 안정적이다.
신규 또는 너스 샤크 항원 수용체(Nurse Shark Antigen Receptor; NAR) 단백질은 경쇄가 결합되지 않은, 2개의 중쇄로 된 이량체로서 존재한다. 각 사슬은 1개의 가변(V) 도메인 및 5개의 불변 도메인으로 구성된다. NAR 단백질은 항체 분자보다 훨씬 더 가벼운 단일 면역글로불린 가변-유사 도메인을 구성한다(문헌 [Greenberg, A. S., Avila, D., Hughes, M., Hughes, A., McKinney, E. C. & Flajnik, M. F. (1995) Nature (London) 374, 168-173]).
비-면역글로불린 결합 구성원. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 천연 발생 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래된 결합 구성원에 관한 것이고; 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 예를 들어 새로(de novo) 설계될 수 있거나 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 결합 구성원은 단일 부분, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질 도메인일 수 있거나, 그것은 2개 이상의 부분, 예를 들어 폴리펩티드의 쌍을 포함할 수 있다. 결합 구성원은 예를 들어, 단 독점적으로 리포칼린(lipocalin), 단쇄 MHC 분자, 안티칼린(Anticalin)™(피에리스(Pieris)), 아피바디™, 또는 쓰넥틴(Thnectin)™(파일로스(Phylos)), 나노바디즈(Nanobodies)(Ablynx))일 수 있다. 결합 구성원은 당업자에게 알려진 재조합 방법에 의해 선택되거나 설계될 수 있다.
아피바디는 재조합 DNA 기술의 당업자에게 공지된 방법에 의해 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 파지 디스플레이 기법은 특정 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 아피바디를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 아피바디는 예를 들어, 단 이에만 제한되지는 않으나 E. 콜라이 또는 S. 세레비지아에(S. cerevisiae)(이하 참조)와 같은 임의의 적당한 숙주에서 생산될 수 있다(문헌 [Hansson M et al., "An in vitro selected binding protein (affibody) shows conformation-dependent recognition of the respiratory syncytial virus (RSV) G protein", Immunotechnology. 1999 Mar; 4(3-4): 237-52] 참조).
아피바디-항체 키메라. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 결합 구성원은 아피바디-항체 키메라이다(문헌 [Ronnmark J et al, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli. J Immunol Methods. 2002 Mar 1; 261(1-2):199-211]). 본 발명에 따라, 아피바디-항체 키메라는 수가지 방법에 의해, 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 융합 또는 폴리펩티드 서열의 융합에 의해 작제될 수 있다. 아피바디의 핵산 서열은 적당한 숙주 내 결합 구성원의 생산을 위한 DNA 재조합 기술에 의해 항체의 핵산 서열에 융합될 수 있다. 아피바디 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 항체 경쇄 뉴클레오티드 서열 또는 항체 중쇄 핵산 서열에 융합될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 아피바디 서열은 항체 서열의 단편과 융합될 수 있다. 아피바디 서열은 예를 들어, 단 이에만 제한되지는 않으나 항체의 Fc 단편과 융합될 수 있고, 이에 따라 잠재적으로 이량체가 동종이량체화를 형성할 수 있다. 아피바디 항체 키메라는 다수의 아피바디 서열, 예컨대 6개 이상의 아피바디 서열 중 적어도 2개, 3개, 4개를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 3개의 아피바디의 융합체는 Fc 단편과 융합되어, 이량체화 시에 4가 결합 구성원을 초래할 수 있다.
대안적으로, 키메라는 당업자에게 알려진 방법에 의해 2개의 단백질/폴리펩티드 분자를 함께 연결함으로써 수득될 수 있다.
폴리펩티드
본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산을 위한 일반적 방법
서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7를 갖는 폴리펩티드, 또는 본 문헌 내 다른 임의의 부분에 기재된 상기 폴리펩티드의 임의의 변이체는 이하 기재된 방법들 중 하나 이상에 의해 생성될 수 있다.
전장 폴리펩티드, 기능성 단편, 및 융합 단백질을 비롯한, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적 기법에 따라 재조합 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 본 발명에 따른 유전자를 발현하기 위해, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터내 전사 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 후, 숙주 세포에 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 증진자에 부가하여, 발현 벡터는 번역 조절 서열, 및 발현 벡터를 가지는 세포의 선택에 적당한 마커 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함할 수 있는 숙주 세포에는 동물 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 진균 세포, 효모 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포가 예시될 수 있다.
진핵 세포 내 외래 단백질의 생산에 적당한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 박테리아 숙주 내 발현 벡터의 성장 및 선택을 위해 제공하는 항생제 내성 마커 및 박테리아 복제 기점에 대해 코딩하는 원핵 DNA 요소; (2) 전사의 개시를 조절하는 진핵 DNA 요소, 예컨대 프로모터; 및 (3) 전사체의 가공을 조절하는 DNA 요소, 예컨대 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 발현 벡터는 또한 이종성 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 지정하는 분비 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 본 발명에 따른 유전자, 및 상기 유전자 또는 또 다른 분비 유전자로부터 유래된 분비 서열을 포함할 수 있다.
박테리아와 함께 통상 사용되는 벡터의 예에는 pET 계열(노바젠(Novagen), pGEX 계열(Ge 헬쓰케어(Ge Healthcare)), pBAD-계열(인비트로젠(Invitrogen))이 포함된다. 효모 내 벡터의 예는 피치아(Pichia)(인비트로젠)의 pPic 계열, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)로부터의 pKlac 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England biolabs)), S. 세레비지아에 벡터(문헌 [Patel, O., Fearnley, R., and Macreadie, I. 3002. Saccharomyces cerevisiae expression vectors with thrombin-cleavable N- and C-terminal 6x(His) tags. Biotechnol Lett. 2003 25(4):331 - 334]) 및 S. 세레비지아에에 대한 pYes 시스템(인비트로젠)이다. 진균류에 사용하기 위한 벡터의 예는 pBAR 계열(문헌 [Pall, M. L. and J. Brunelli. 1993. A series of six compact fungal transformation vectors containing polylinkers with unique restrictions sites. Fungal Genetics Newsletter 40:59-61]에 기재됨)이다. plEx 플라스미드 기재의 시스템(머크) 또는 바큘로바이러스 기재의 시스템(머크)는 곤충 세포에 유용한 시스템의 2개의 예이다. 유사 산물이 다른 회사들로부터 입수가능하다.
곤충 세포에 사용하기 위한 벡터의 예에는 테트라사이클린 조절 시스템 pTet 및 pTre, 아데노바이러스 기재의 시스템 아데노-X, 레트로바이러스 기재의 시스템 레트로-X(모두 클론테크(Clontech) 사제) 및 pcDNA 벡터(인비트로젠)가 포함된다. 역시, 더욱 많은 예들이 존재하고 시판 중이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적당한 포유동물 숙주 세포의 예에는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vera; ATCC CRL 1587), 인간 배아 신장 세포(293-HEK; ATCC CRL 1573), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개 신장 세포(MDCK; ATCC CCL 34), 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44(문헌 [Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555 1986]), 래트 뇌하수체 세포(GH 1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 래트 간세포(H-4-II-E; ATCC CRL 1548) SV40-형질전환 원숭이 신장 세포(COS-1; ATCC CRL 1650) 및 쥐 배아 세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)가 포함된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는 데 사용되는 포유동물 숙주 세포는 결코 인간의 배선 유전 동일성을 변형시키는 과정으로서 의도되지 않는데, 이는 단지 불멸화 또는 형질전환된 2배체 인간 세포만이 이 과정에 기재되어 있기 때문이다.
포유동물 숙주의 경우, 전사 및 번역 조절 신호는 바이러스 공급원, 예컨대 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 시미안 바이러스 등으로부터 유래될 수 있으며, 여기서 조절 신호는 높은 발현 수준을 가지는 특정 유전자와 연관된다. 적당한 전사 및 번역 조절 서열은 또한 포유동물 유전자, 예컨대 액틴, 콜라겐, 미오신, 및 메탈로티오네인 유전자로부터 수득될 수 있다.
전사 조절 서열은 RNA 합성의 개시를 지정하는 데 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 적당한 진핵 프로모터에는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터(문헌 [Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273(1982)]), 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(문헌 [McKnight, Cell 31:355(1982)]), SV40 조기 프로모터(문헌 [Benoist et al., Nature 290:304(1981)]), 로우스 육종 바이러스 프로모터(문헌 [Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777(1982)]), 사이토메갈로바이러스 프로모터(문헌 [Foecking et al., Gene 45:101(1980)]), 및 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터(일반적으로, 문헌 [Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)] 참조).
대안적으로, 원핵 프로모터, 예컨대 박테리오파지 T3 RNA 중합효소 프로모터는, 원핵 프로모터가 진핵 프로모터에 의해 제어될 경우, 포유동물 세포에서의 유전자 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다(문헌 [Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990)] 및 문헌 [Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).
발현 벡터는 인산칼슘 형질감염, 리포좀-매개 형질감염, 미세사출(microprojectile)-매개 전달, 전기천공 등을 포함한 각종 표준 기법들을 이용하여 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 형질감염된 세포는 숙주 세포 게놈 내 안정되게 통합된 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하도록 선택 및 증식될 수 있다. 벡터를 진핵 세포에 도입하는 기법 및 우세 선택 마커를 이용한 안정된 형질전환체를 선택하는 기법이 예를 들어 Ausubel(1995) 및 Murray(ed.)에 의해, 문헌 [Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991)]에 기재되어 있다.
예를 들어, 하나의 적당한 선택 마커는 항생 네오마이신에 대한 내성을 제공하는 유전자이다. 이 경우에, 선택은 네오마이신형 약물, 예컨대 G-418 등의 존재 하에 수행된다. 선택계는 또한 관심 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있고, 이는 "증폭"으로 칭해지는 과정이다. 낮은 수준의 선택제의 존재 하에 형질감염체를 배양한 후, 도입된 유전자의 높은 수준의 산물을 생성하는 세포에 대해 선택하기 위한 선택제의 양을 증가시킴으로써 증폭을 수행한다. 한 적당한 증폭가능한 선택 마커는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 디히드로폴레이트 리덕타제이다. 다른 약물 내성 유전자(예를 들어, 하이그로마이신 내성, 다중-약물 내성, 푸로마이신 아세틸트랜스퍼라제)도 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 녹색 형광 단백질, 또는 세포 표면 단백질과 같은 변경된 표현형을 도입하는 마커, 예컨대 CD4, CD8, I류 MHC, 태반 알칼리성 포스파타제를 사용하여, FACS 분류법 또는 자기 비드 분리 기술과 같은 수단에 의해 형질감염되지 않은 세포로부터 형질감염된 세포를 분류할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 바이러스 전달계를 이용하여 배양된 포유동물 세포에 의해서도 생성될 수 있다. 이 목적을 위한 예시적 바이러스에는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시나 바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)가 포함된다. 아데노바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스는 현재 이종성 핵산의 전달을 위한 가장 잘 연구된 유전자 전달 벡터이다(검토를 위해, 문헌 [Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994)] 및 문헌 [Douglas 및 Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)]을 참조한다). 아데노바이러스 시스템의 이점에는 비교적 큰 DNA 삽입체의 수용, 높은 역가로 성장시키는 능력, 넓은 범위의 포유동물 세포 유형의 감염 능력, 및 상이한 프로모터를 포함하는 다수의 이용가능한 벡터과 함께 사용하도록 허용하는 융통성이 포함된다.
아데노바이러스 게놈의 부분을 결실시킴으로써, 이종성 DNA의 보다 큰 삽입물(7 kb 이하)을 수용할 수 있다. 이 삽입물은 직접적 결찰에 의해, 또는 동시 형질감염된 플라스미드와의 상동성 재조합에 의해 바이러스 DNA에 도입될 수 있다. 한 선택 방안은 바이러스 벡터로부터 필수 E1 유전자를 결실시켜, E1 유전자가 숙주 세포에 의해 제공되지 않는 한 복제불능이 되게 되는 것이다. 예를 들어 아데노바이러스 벡터로 감염된 인간 293 세포(ATCC 번호 CRL-1573, 45504, 45505)는 유의량의 단백질을 생성하기 위해 부착 세포로서 또는 비교적 높은 세포 밀도로 현탁 배양액 중에서 성장될 수 있다(문헌 [Gamier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)] 참조).
바큘로바이러스 시스템은 본 발명에 따른 클로닝된 유전자를 곤충 세포에 도입하는 효율적 수단을 제공한다. 적당한 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcMNPV)에 기초하고, 및 드로소필라 열 쇼크(Drosophila heat shock) 단백질(hsp) 70 프로모터, 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스 즉시-조기 유전자 프로모터(ie-1) 및 지연 조기 39K 프로모터, 바큘로바이러스 p10 프로모터, 및 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터와 같은 공지된 프로모터를 포함한다. 재조합 바큘로바이러스를 제조하는 두 번째 방법은 Luckow에 의해 기재된 트랜스포손 기재의 시스템을 이용한다(문헌 [Luckow, et al., J. Virol. 67:4566 (1993)]). 전달 벡터를 이용하는 이 시스템은 BAC-투(to)-BAC 키트(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 미국 매릴랜드 로크빌 소재)에서 시판된다. 이 시스템은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 "백미드(bacmid)"로 불리는 대형 플라스미드로서 E. 콜라이 내에 유지되는 바큘로바이러스 게놈 내로 이동시키기 위해, Tn7 트랜스포손을 함유하는 PFASTBAC(라이프 테크놀로지즈)인 전달 벡터를 이용한다. 문헌 [Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990)], 문헌 [Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)], 및 문헌 [Chazenbalk, 및 Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)]을 참조한다. 추가로, 전달 벡터는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단에 있는 에피토프 태그, 예를 들어 Glu-Glu 에피토프 태그를 코딩하는 DNA와의 인-프레임 융합체를 포함할 수 있다(문헌 [Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985)]). 당업계에 알려진 기법을 이용하여, 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 전달 벡터를 E. 콜라이 내로 형질전환하고, 재조합 바큘로바이러스를 가리키는 간섭된 lacZ 유전자를 포함하는 백미드에 대해 스크리닝한다. 이어서, 재조합 바큘로바이러스 게놈을 함유하는 백시드 DNA를 통상의 기법을 이용하여 단리한다.
예시적 PFASTBAC 벡터를 상당한 정도로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 다면체 프로모터를 제거하여, 바큘로바이러스 감염에서 보다 조기에 발현되고, 분비 단백질을 발현하는 데 유익한 것으로 나타난 바큘로바이러스 염기성 단백질 프로모터(Pcor, p6.9 또는 MP 프로모터로도 알려짐)로 치환될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)], 및 문헌 [Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)] 참조). 그러한 전달 벡터 구성물에서, 짧거나 긴 버전의 염기성 단백질 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 천연 분비 신호 서열을 곤충 단백질로부터 유래된 분비 신호 서열로 치환하는 전달 벡터를 작제할 수 있다. 예를 들어, 엑다이스테로이드(Ecdysteroid) 글루코실트랜스퍼라제(EGT), 꿀벌 멜리틴(Melittin)(인비트로젠 코포레이션; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 또는 바큘로바이러스 gp67(파밍젠(PharMingen): 미국 캘리포니아주 San Diego, Calif.)로부터의 분비 신호 서열을 구성물에 사용하여, 네이티브 분비 신호 서열을 치환할 수 있다.
재조합 바이러스 또는 백미드를 사용하여, 숙주 세포를 형질감염시킨다. 적당한 곤충 숙주 세포에는 IPLB-Sf-21 유래의 세포주, 스포도프테라 프루기페라(Spodoptera frugiperda) 용화 난소 세포주, 예컨대 Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21 AE, 및 Sf21 (인비트로젠 코포레이션; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 및 드로소필라 쉬나이더(Drosophila Schneider)-2 세포, 및 트리코플루시아 나이(Trichoplusia ni) 유래의 HIGH FIVEO 세포주(인비트로젠)(미국 특허 제5,300,435호)가 포함된다. 상업적으로 입수가능한 무혈청 배지를 사용하여 세포를 성장시키고 유지시킬 수 있다. 적당한 배지는 Sf9 세포에 대해서는 Sf900 II™(라이프 테크놀로지즈) 또는 ESF 921™(발현계)이고; T. 나이 세포에 대해서는 Ex-cellO405™(JRH 바이오사이언시스(JRH Biosciences), 미국 캔자스주 레넥사 소재) 또는 엑스프레스 파이브오(Express FiveO)™(라이프 테크놀로지즈)이다. 재조합 바이러스를 사용할 때, 세포를 대략 2 내지 5×105 세포의 접종 밀도로부터 1 내지 2×106 세포 밀도로 성장시키고, 후자 시기에는 재조합 바이러스 스톡을 0.1 내지 10, 보다 통상적으로는 대략 3의 감염중복지수(multiplicity of infection; MOI)로 첨가한다.
바큘로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 생성시키기 위한 확립된 방법이 문헌 [Bailey et al., ["Manipulation of Baculovirus Vectors," in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pages 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991)], 문헌 [Patel et al., "The baculovirus expression system," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995)], 문헌 [Ausubel (1995) at pages 1637 to 1657], 문헌 [Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)] 및 문헌 [Lucknow, "Insect Cell Expression Technology," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)]의 의해 제공된다.
효모 세포를 포함한 진균류 세포를 또한 사용하여, 본원에 기재된 유전자를 발현시킬 수 있다. 이와 관련하여 특히 관심이 되는 효모 종에는 삭카로마이세스 세레비지아에, 피치아 파스토리스, 및 피치아 메타놀리카(Pichia methaolica)가 포함된다. 효모 내 발현에 적당한 프로모터에는 GAL1(갈락토스), PGK(포스포글리세레이트 키나제), ADH(알코올 데히드로게나제), AOX1(알코올 옥시다제), HIS4(히스티디놀 데히드로게나제) 등으로부터의 프로모터가 포함된다. 많은 효모 클로닝 벡터들이 설계되었고, 바로 이용가능하다. 이 벡터에는 Ylp 기재의 벡터, 예컨대 Ylp5, YRp 벡터, 예컨대 YRp17, YEp 벡터, 예컨대 YEp13 및 YCp 벡터, 예컨대 YCp19이 포함된다. 외인성 DNA로 S. 세레비지아에 세포를 형질전환시키고 이로부터 재조합 폴리펩티드를 생성시키는 방법이, 예를 들어 Kawasaki의 미국 특허 제4,599,311호, Kawasaki 등의 미국 특허 제4,931,373호, Brake의 미국 특허 제4,870,008호, Welch 등의 미국 특허 제5,037,743호, 및 Murray 등의 미국 특허 제4,845,075호에 개시되어 있다. 형질전환된 세포는 통상 약물 내성인 선택 마커에 의해 결정되는 표현형, 또는 특정 영양소(예를 들어, 루이신)의 부재 하에 성장하는 능력에 의해 선택된다. 삭카로마이세스 세레비지아에에서 사용하기에 적당한 벡터 시스템은 Kawasaki et al.(미국 특허 제4,931,373호)에 개시된 POT1 벡터 시스템으로서, 이는 형질전환된 세포가 포도당 함유의 배지 내 성장에 의해 선택되도록 한다. 효모에 사용하기에 적당한 부가적 프로모터 및 종결자에는 해당 효소 유전자(예를 들어, Kawasaki의 미국 특허 제4,599,311호, Kingsman 등의 미국 특허 제4,615,974호 및 Bitter의 미국 특허 제4,977,092호 참조) 및 알코올 데히드로게나제 유전자로부터의 것들이 포함된다. 또한, 미국 특허 제4,990,446호, 제5,063,154호, 제5,139,936호, 및 제4,661,454호를 참조한다. 효모에 사용하기에 적당한, 통상 사용되고/되거나 상업적으로 이용가능한 벡터의 다른 예는 pPic 계열(인비트로젠), 클로이베로마이세스 락티스로부터의 pKlac 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 및 S. 세레비지아에 벡터(문헌 [Patel et al., Biotechnology letters 2003 vol 25(4):331-334]) 및 S. 세레비지아에를 위한 pYes 시스템(인비트로젠)이다. 진균류에서, pBAR 계열이 유용하다(문헌 [Pall et al., 1993 vol. 40:59-61, Functional Genetics Newsletter]).
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 시조삭카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카, 피치아 길레르몬디이(Pichia guillermondii) 및 칸디다 말토사(Candida maltosa)를 비롯한 다른 효모들을 위한 형질전환 시스템이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459(1986)] 및 Cregg, 미국 특허 제4,882,279호를 참조한다. McKnight 등의 미국 특허 제4,935,349호의 방법에 따라, 아스페르길루스(Aspergillus) 세포를 또한 사용할 수 있다. 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)의 형질전환 방법이 Sumino 등의 미국 특허 제5,162,228호에 의해 개시되어 있다. 뉴로스포라의 형질전환 방법이 Lambowitz의 미국 특허 제4,486,533호에 의해 개시되어 있다.
예를 들어, 피치아 메타놀리카를 재조합 단백질의 생성을 위한 숙주로 사용하는 것이 Raymond의 미국 특허 제5,716,808호, Raymond의 미국 특허 제5,736,383호, 문헌 [Raymond et al., Yeast 14:11 23(1998)], 및 국제 특허 공개 번호 WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, 및 WO 98/02565에 의해 개시되어 있다. P. 메타놀리카의 형질전환을 위한 DNA 분자는 형질전환 전에 선형화될 수 있는 이중-가닥의 원형 플라스미드로 통상 제조될 수 있다. P. 메타놀리카에서의 폴리펩티드 생성을 위해, 플라스미드 내의 프로모터 및 종결자는 P. 메타놀리카 유전자, 예컨대 P. 메타놀리카 알코올 이용 유전자(AUG1 또는 AUG2)의 프로모터 및 종결자일 수 있다. 기타 유용한 프로모터에는 디히드록시아세톤 신타제(DHAS), 포름산염 데히드로게나제(FMD) 및 칼라타제(CAT) 유전자의 것들이 포함된다. DNA를 숙주 염색체에 통합하는 것을 촉진하기 위해, 플라스미드의 전체 발현 세그먼트가 숙주 DNA 서열에 의해 양 말단에 플랭킹되어 있는 것이 바람직하다. 피치아 메타놀리카에 사용하기에 적당한 선택 마커는 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제(AIRC; EC 4.1.1.21)를 코딩하고 아데2 숙주 세포를 아데닌의 부재 하에 성장하도록 하는 P. 메타놀리카 ADE2 유전자이다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대규모 산업 과정을 위해, 양 메탄올 이용 유전자(AUG1 및 AUG2)를 결실된 숙주 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 분비된 단백질의 생성을 위해, 액포 프로테아제 유전자(PEP4 및 PRB1)가 결핍된 숙주 세포를 사용할 수 있다. 전기천공을 사용하여, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드를 P. 메타놀리카 세포 내로 도입하는 것을 촉진한다. P. 메타놀리카 세포는 2.5 내지 4.5 kV/cm, 바람직하게는 약 3.75 kV/cm의 장(field) 강도, 및 1 내지 40 밀리초, 가장 바람직하게는 약 20 밀리초의 시간 상수(t)를 가지는 지수적으로 감수하는, 펄스 전기장을 이용하여 전기천공에 의해 형질전환될 수 있다.
발현 벡터는 또한 식물 원형질, 비변형 식물 조직, 또는 단리된 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 발현 벡터를 식물 조직 내로 도입하는 방법은 직접적 감염, 또는 식물 조직의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)과의 공동 배양, 미세사출-매개 전달, DNA 주입, 전기천공 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Horsch et al., Science 227:1229(1985)], 문헌 [Klein et al., Biotechnology 10:268(1992)] 및 문헌 [Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al.(eds.), pages 67-88(CRC Press, 1993)]을 참조한다.
대안적으로, 본 발명에 따른 유전자는 원핵 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 원핵 숙주 내에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있는 적당한 프로모터가 당업자에게 공지되어 있고, 이에는 T4, T3, Sp6 및 T7 중합효소를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 및 PL 프로모터, E. 콜라이의 trp, recA, heat shock, lacUV5, tac, lpp- lacSpr, phoA, 및 lacZ 프로모터, B. 섭틸리스의 프로모터, 바실러스의 박테리오파지의 프로모터, 스트렙토마이세스 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터이 포함된다. 진핵 프로모터는 문헌 [Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277(1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed.(Benjamin Cummins 1987)] 및 문헌 [Ausubel et al.(1995)]에 의해 검토되었다.
적당한 원핵 숙주에는 E. 콜라이 및 바실러스 섭틸리스가 포함된다. E. 콜라이의 적당한 균주에는 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 및 ER1647이 포함된다(예를 들어, 문헌 [Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)] 참조). 바실러스의 적당한 균주에는 BR151, YB886, MM 19, MI120, 및 B170이 포함된다(예를 들어, 문헌 [Hardy, "Bacillus Cloning Methods," in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)] 참조).
E. 콜라이와 같은 박테리아에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 때, 폴리펩티드는 세포질에 전형적으로 불용성 과립으로 보유되거나, 박테리아 분비 서열에 의해, 또는 원형질 외극에 지정될 수 있다. 전자의 경우, 세포를 용해하고, 과립을 회수하며, 예를 들어 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 우레아를 이용하여 변성시킨다. 이어서, 변성된 폴리펩티드를 리폴딩하고, 변성제의 희석, 예컨대 우레아, 및 환원 및 산화 글루타티온의 조합의 용액에 대한 투석, 및 이에 이은 완충 염수 용액에 대한 투석에 의해 이량체화한다. 후자의 경우, 폴리펩티드는, 세포를 (예를 들어, 음파처리 또는 삼투압 쇼크에 의해) 파괴하여 원형질 외극의 내용물을 방출하고, 단백질을 회수함으로써, 가용성 및 기능성 형태로 원형질 외극으로부터 회수되고, 이에 따라 변성 및 리폴딩에 대한 필요가 없어진다.
원핵 숙주 내 단백질 발현 방법이 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)], 문헌 [Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)] 및 문헌 [Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)] 참조).
발현 벡터를 박테리아세포, 효모세포, 곤충 세포 및 식물 세포에 도입하는 표준 방법이 예를 들어 Ausubel (1995)에 의해 제공되어 있다.
포유동물 세포계에 의해 생성된 외래 단백질을 발현하고 회수하는 일반적 방법이 예를 들어 문헌 [Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)]에 제공되어 있다. 박테리아계에 의해 생성된 단백질을 회수하기 위한 표준 기법이 예를 들어 문헌 [Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 59-92 (Oxford University Press 1995)]에 기재되어 있다. 바큘로바이러스 시스템로부터 재조합 단백질을 단리하기 위한 확립된 방법이 문헌 [Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)]에 의해 기재되어 있다.
한 대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드는 독점적 고체 상 합성, 부분 고체 상 방법, 단편 축합 또는 통상의 용액 합성에 의해 합성될 수 있다. 이 합성 방법은 당업자에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)], 문헌 [Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984)], 문헌 [Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986)], 문헌 [Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989)], 문헌 [Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997)] 및 문헌 [Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)] 참조). 총 화학적 합성법, 예컨대 "네이티브 화학 결찰" 및 "발현된 단백질 결찰"의 변형도 또한 표준이다(예를 들어, 문헌 [Dawson et al., Science 266:776(1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845(1997)], 문헌 [Dawson, Methods Enzymol. 287: 34(1997)], 문헌 [Muir et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705(1998)] 및 문헌 [Severinov 및 Muir, J. Biol. Chem. 273:16205(1998)] 참조).
본 발명은 본원에 기재된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 고려한다. 그러한 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 담체는 통상적 유기 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예에는 물, 완충액, 알코올, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 참깨유, 옥수수유 등이 포함된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 단리
본 발명의 폴리펩티드(서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7, 또는 본 문헌 내 다른 임의의 부분에 기재된 이의 임의의 변이체)는 오염 거대 분자, 특히 다른 단백질 및 핵산에 대해 약 80% 이상의 순도, 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 또는 95% 초과의 순도로 정제될 수 있고, 감염제 및 발열제가 없다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 99.9% 초과의 순도인 약학적으로 순수한 상태로 정제될 수 있다. 일부 제제에서, 정제된 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 없다.
분획화 및/또는 통상적 정제 방법을 이용하여, 천연 공급원으로부터 제조된 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드 및 재조합 숙주 세포로부터 정제된 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드의 제제를 수득할 수 있다. 일반적으로, 황산암모늄 석출, 및 산 또는 케이오트로프 추출(chaotrope extraction)을 이용하여, 샘플을 분획화할 수 있다. 예시적 정제 단계는 히드록시아파타이트, 크기 배제, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 적당한 크로마토그래피 매질은 유도체화 덱스트란, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 특수 실리카 등을 포함한다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 바람직하다. 예시적 크로마토그래피 매질은 페닐기, 부틸기 또는 옥틸기로 유도체화된 매질, 예컨대 페닐-세파로스(Phenyl-Sepharose) FF(파마시아(Pharmacia)), 토요펄 부틸 650(Toyopearl Butyl 650)(도소 하스(Toso Haas), 미국 펜실베니아주 몽고메리빌 소재), 옥틸-세파로스(파마시아) 등; 또는 폴리아크릴 수지, 예컨대 암베르크롬(Amberchrom) CG 71(도소 하스) 등을 포함한다. 적당한 고체 지지체에는 사용 상태 하에서는 불용성인, 유리 비드, 실리카 기재의 수지, 셀룰로스 수지, 아가로스 비드, 가교된 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 가교된 폴리아크릴아미드 수지 등이 포함된다. 이 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분에 의한 단백질의 부착을 허용하는 반응성 기로 변형되어도 된다.
커플링 화학작용의 예에는 브롬화시아노겐 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학작용을 위한 카르복실 및 아미노 유도체가 포함된다. 이들 고체 및 상기 고체 매질이 공지되어 있고, 당업계에 널리 사용되며, 상업적 공급업체로부터 입수가능하다. 폴리펩티드 단리 및 정제를 위한 특정 방법의 선택은 일상적 설계 문제이고, 부분적으로는 선택된 지지체의 성질에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌 Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), and Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)]를 참조한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 단리 및 정제의 부가적 변화는 당업자에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 이하 기재되는 바와 같이 수득되는 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 이의 단편을 인식하는 특이적 항체를 사용하여, 면역친화도 정제에 의해 다량의 단백질을 단리할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 특정 성질을 이용함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 고정화된 금속 이온 흡착(IMAC) 크로마토그래피를 이용하여, 폴리히스티딘 태그를 포함한 단백질을 비롯한 히스티딘-풍부 단백질을 정제할 수 있다. 간략히, 겔을 먼저 이가 금속 이온으로 하전하여 킬레이트를 형성한다(문헌 [Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1(1985)]). 히스티딘-풍부 단백질이 친화도가 사용 금속 이온에 따라 친화도가 다른 상기 매트릭스에 흡착되어, 경쟁적 용출, pH 저감 또는 강 킬레이트제 사용에 의해 용출될 것이다. 다른 정제 방법에는 렉틴 친화도 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화 단백질의 정제가 포함된다(문헌 [M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)]). 본 발명의 부가적 실시양태 내에서, 관심 폴리펩티드 및 친화성 태그(예를 들어, 말토스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)의 융합을 작제하여, 정제를 촉진할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 및 이의 단편은 또한 상기 기재된 바와 같이, 화학적 합성에 의해 제조될 수도 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체; 글리코실화 또는 비글리코실화; peg화 또는 비-peg화될 수 있으며; 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않아도 된다.
서열 상동성
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예컨대 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7, 또는 이의 오르토로그와 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가지는 천연 발생 또는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7 또는 이의 오르토로그와 70% 이상, 예컨대 72% 이상, 예를 들어 74% 이상, 예컨대 76% 이상, 예를 들어 78% 이상, 예컨대 80% 이상, 예를 들어 82% 이상, 예컨대 84% 이상, 예를 들어 86% 이상, 예컨대 88% 이상, 예를 들어 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예를 들어 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예를 들어 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예를 들어 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7 또는 이의 오르토로그와 80% 이상의 서열 동일성, 예컨대 81% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 82% 이상의 서열 동일성, 예컨대 83% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 84% 이상의 서열 동일성, 예컨대 85% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 86% 이상의 서열 동일성, 예컨대 87% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 88% 이상의 서열 동일성, 예컨대 89% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 90% 이상의 서열 동일성, 예컨대 91% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 92% 이상의 서열 동일성, 예컨대 93% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 94% 이상의 서열 동일성, 예컨대 95% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 96% 이상의 서열 동일성, 예컨대 97% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 98% 이상의 서열 동일성, 예컨대 99% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 99.5% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 나타내기 위해 본원에 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7 또는 이의 오르토로그의 아미노산 잔기의 99.5% 미만, 예컨대 98% 미만, 예를 들어 97% 미만, 예컨대 96% 미만, 예를 들어 95% 미만, 예컨대 94% 미만, 예를 들어 93% 미만, 예컨대 92% 미만, 예를 들어 91% 미만, 예컨대 90% 미만, 예를 들어 88% 미만, 예컨대 86% 미만, 예를 들어 84% 미만, 예를 들어 82% 미만, 예컨대 80% 미만, 예를 들어 75% 미만, 예컨대 70% 미만, 예를 들어 65% 미만, 예컨대 60% 미만, 예를 들어 55% 미만, 예컨대 50% 미만, 예를 들어 45% 미만, 예컨대 40% 미만, 예를 들어 35% 미만, 예컨대 30% 미만, 예를 들어 25% 미만, 예컨대 20% 미만, 예컨대 15% 미만, 예를 들어 10% 미만을 가지는 폴리펩티드를 나타내기 위해 본원에 사용된다.
한 실시양태에서, 서열 번호 1에 따른 폴리펩티드는 서열 번호 1의 1547개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1530개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1510개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1490개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1470개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1450개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1430개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1410개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1390개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1370개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1350개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1330개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1310개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1290개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1270개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1250개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1230개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1210개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1190개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1170개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1150개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1130개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1110개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1090개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1070개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1050개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 1030개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 1010개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 990개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 970, 예를 들어 950개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 930개 미만의 연속 아미노산 잔기 예를 들어 910개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 890개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 870개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 850개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 830개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 810개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 790개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 770개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 750개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 730개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 710개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 690개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 670개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 650개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 630개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 610개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 590개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 570개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 550개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 530개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 510개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 490개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 470개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 450개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 430개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 410개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 390개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 370개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 350개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 330, 예를 들어 310개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 290개 미만의 연속 아미노산 잔기 예를 들어 270개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 250개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 230개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 210개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 190개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 170개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 150개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 130개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 110개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 90개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 70개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 50개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 미만의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단편이다.
또 다른 실시양태에서, 서열 번호 1에 따른 폴리펩티드는 서열 번호 1의 6개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 7개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 9개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 12개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 16개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 24개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 28개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단편이다.
한 실시양태에서, 서열 번호 2에 따른 폴리펩티드는 서열 번호 2의 415개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 410개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 405개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 400개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 395개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 390개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 385개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 380개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 375개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 370개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 365개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 360개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 355개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 350개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 345개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 340개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 335개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 330개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 325개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 320개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 315개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 310개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 305개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 300개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 295개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 290개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 285개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 280개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 275개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 270, 예를 들어 265개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 260개 미만의 연속 아미노산 잔기 예를 들어 255개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 250개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 245개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 240개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 235개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 230개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 225개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 220개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 215개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 210개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 205개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 200개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 195개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 190개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 185개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 180개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 175개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 170개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 165개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 160개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 155개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 150개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 145개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 140개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 135개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 130개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 125개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 120개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 115개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 110, 예를 들어 105개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 100개 미만의 연속 아미노산 잔기 예를 들어 95개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 90개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 85개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 80개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 75개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 70개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 65개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 60개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 55개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 50개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 45개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 40개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 35개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 30개 미만의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단편이다.
또 다른 실시양태에서, 서열 번호 2에 따른 폴리펩티드는 서열 번호 2의 6개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 7개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 9개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 12개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 16개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 24개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 28개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단편이다.
한 실시양태에서, 서열 번호 3에 따른 폴리펩티드는 서열 번호 3의 70 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 65 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 60 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 55 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 50 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 45 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 40 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 35 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 30 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 25 개 미만의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 미만의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단편이다.
또 다른 실시양태에서, 서열 번호 3에 따른 폴리펩티드는 서열 번호 3의 6개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 7개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 9개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 12개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 16개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 24개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예컨대 28개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단편이다.
본 발명은 또한 2가지 기준에 따라 동정될 수 있는 변이체 핵산 분자를 고려한다: a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 간의 동일성 또는 유사성의 결정, 및 b) 엄격한 조건 하에서 수행되는 하이브리드화 검정을 포함한다. 예를 들어, 특정 유전자 변이체는 엄격한 세정 조건 하에서 세정한 후(여기서, 세정 엄격성은 55℃ 내지 65℃에서의 0.1% SDS 포함의 0.5× 내지 2× SSC임), 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예컨대 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 보체와 하이브리드화한 상태로 유지되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대안적으로, 변이 유전자는 엄격한 세정 조건 하에서 세정한 후(여기서, 세정 엄격성은 55℃ 내지 65℃에서의 0.1% SDS 포함의 0.5 X 내지 2 X SSC임), 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예컨대 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 보체와 하이브리드화한 상태로 유지되는 핵산 분자로 확인될 수 있다.
서열 동일도 %는 통상적 방법에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌 [Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)] 및 문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)]를 참조한다. 간략히 말해, 10의 갭 개방 패널티, 1의 갭 연장 패널티, 및 [Henikoff and Henikoff (ibid.)]의 "BLOSUM62" 스코어링 매트릭스를 이용하여 정렬 스코어를 최적화하도록, 2개의 아미노산 서열을 정렬한다. 이어서, 동일도 %를 이하와 같이 계산한다: ([동일 매치의 총수]/[보다 긴 서열의 길이 + 2개 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열에 도입된 갭의 수])×(100).
당업자는 2개의 아미노산 서열을 정렬하는 데 이용가능한 많은 확립된 알고리즘들이 있음을 인지한다. Pearson 및 Lipman의 "FASTA" 유사도 조사 알고리즘은 본원에 개시된 아미노산 서열 및 추정의 아미노산 또는 변이체에 의해 공유되는 동일성 수준을 조사하기에 적당한 단백질 정렬 방법이다. FASTA 알고리즘이 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)] 및 문헌 [Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)]에 의해 기재되어 있다.
간략히 말해, FASTA는 먼저 보존적 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 고려하지 않으면서, 질의 서열(예를 들어, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7) 및 최고 항등 밀도(ktup 변수가 1인 경우) 또는 항등 쌍(ktup=2인 경우)을 가지는 시험 서열에 의해 공유되는 영역을 동정함으로써 서열 유사도를 확인한다. 이어서, 아미노산 치환 매트릭스를 이용하여 쌍을 형성한 모든 아미노산의 유사도를 비교함으로써, 최고의 항등 밀도를 가지는 10개 영역을 다시 스코어링하고, 영역의 말단을 "트리밍(trimmed)하여", 최고의 스코어에 기여하는 잔기들만을 포함하도록 한다. 수가지 영역이 있는 경우, "컷오프(cutoff)" 값(서열 길이 및 ktup 값에 기초한 소정의 식에 의해 계산됨), 트리밍된 초기 영역을 조사하여, 영역들이 결합하여 갭을 가지는 대략적 정렬을 형성하는지의 여부를 조사한다. 마지막으로, 아미노산 삽입 및 결실을 허용하는 니들맨-분쉬-셀러즈(Needleman-Wunsch-Sellers) 알고리즘(문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970)]; 문헌 [Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)]) 의 변형법을 이용하여, 2개의 아미노산 서열의 최고의 스코어링 영역을 정렬한다. FASTA 분석을 위한 바람직한 매개변수는 이하와 같다: ktup=1, 갭 개방 패널티=10, 갭 연장 패널티=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62. 이 매개변수를 문헌 [Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)]의 부록 2에 설명된 바와 같이, 스코어링 매트릭스 file ("SMATRIX")을 변형시킴으로써 FASTA 프로그램에 대입할 수 있다.
FASTA를 또한 상기 개시된 바와 같은 비를 사용하여 핵산 분자의 서열 동일성을 결정하기 위해 사용할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 비교를 위해, ktup 값은 1 내지 6의 범위, 바람직하게는 3 내지 6의 범위, 가장 바람직하게는 3일 수 있다. 기타 매개변수들을 이하와 같이 설정할 수 있다: 갭 개방 패널티=10, 및 갭 연장 패널티=1.
본 발명에 따른 폴리펩티드 내 아미노산 잔기의 치환
본 발명은 또한 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열 대비, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(들)을 가지는 폴리펩티드, 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(들)을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 즉, 예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체가 수득될 수 있다. 변이체에는, 알킬 아미노산이 알킬 아미노산으로 치환된 서열, 방향족 아미노산이 방향족 아미노산으로 치환된 서열, 황 함유의 아미노산이 황 함유의 아미노산으로 치환된 서열, 히드록시 함유의 아미노산이 히드록시 함유의 아미노산으로 치환된 서열, 산성 아미노산이 산성 아미노산으로 치환된 서열, 염기성 아미노산이 염기성 아미노산으로 치환된 서열, 또는 이염기성 모노카르복실 아미노산이 이염기성 모노카르복실 아미노산으로 치환된 서열이 포함된다.
통상적 아미노산들 중, 예를 들어 "보존적 아미노산 치환"은 각각의 하기 군 내의 아미노산들 간의 치환에 의해 예시될 수 있다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 및 이소루이신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
BLOSUM62 표는 관련 단백질의 500개 초과의 기의 고보존 영역을 나타내는, 단백질 서열 세그먼트의 약 2,000개 국소 다중 정렬로부터 유래된 아미노산 치환 행렬이다(문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)]). 따라서, BLOSUM62 치환 빈도를 사용하여, 본 발명의 아미노산 내로 도입될 수 있는 보존적 아미노산 치환을 정의할 수 있다. (상기 논의된 바와 같이) 화학적 성질에만 기초한 아미노산 치환 설계가 가능하나, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 바람직하게 -1 초과의 BLOSUM62 값으로 나타내어지는 치환을 지칭한다. 예를 들어, 아미노산 치환은 그 치환이 0, 1, 2, 또는 3의 BLOSUM62 값으로 나타내어지는 경우 보존적이다. 이 시스템에 따르면, 바람직한 보존적 아미노산 치환은 1 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 하나, 더욱 바람직한 보존적 아미노산 치환은 2 이상(예를 들어, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다.
폴리펩티드의 특정 변이체는 예를 들어 아미노산 서열의 변화가 하나 이상의 보존적 아미노산 치환으로 인한 것일 때, 본원에 개시된 상응하는 아미노산 서열(즉, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7)과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 95% 초과의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 한다.
아미노산 서열의 변이체, 예컨대 "보존적 아미노산" 변이체는 예를 들어 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 링커-스캐닝 돌연변이유발, 중합효소 사슬 반응을 이용한 돌연변이유발 등에 의해 수득될 수 있다(문헌 [Ausubel (1995) at pages 810 to 822]; 및 문헌 [McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)] 참조).
본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다. 비천연 발생 아미노산에는 예를 들어, 다만 비제한적 예로 trans-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, cis-4-히드록시프롤린, trans-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, allo-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, tert-루이신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌이 포함된다.
비천연 발생 아미노산 잔기를 단백질에 도입하기 위한 수가지 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 넌센스 돌연변이를 화학적으로 아미노아실화 서프레서 tRNA에 의해 억제하는 시험관내 시스템을 이용할 수 있다. 아미노산의 합성 및 tRNA의 아미노아실화 방법이 당업계에 알려져 있다. 넌센스 돌연변이를 포함하는 플라스미드의 전사 및 번역은 전형적으로 E. 콜라이 S30 추출물 및 상업적으로 이용가능한 효소 및 기타 시약을 포함하는 무세포 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예를 들어, 문헌 [Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991)], 문헌 [Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991)], 문헌 [Chung et al., Science 259:806 (1993)], 및 문헌 [Chung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993)]을 참조한다.
문헌 [Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53 (1988))] 또는 문헌 [Bowie and Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989))]에 의해 개시된 바와 같은, 돌연변이유발 및 스크리닝의 공지 방법을 이용하여 다중 아미노산 치환을 행하고 시험할 수 있다. 간략히 말해, 이들 저자들은 폴리펩티드 내 2개 이상의 위치를 동시에 무작위하고, 기능성 폴리펩티드에 대해 선택한 후, 돌연변이화된 폴리펩티드를 시퀀싱하여 각 위치에 허용가능한 치환의 스펙트럼을 결정하는 방법을 개시한다. 사용될 수 있는 다른 방법에는 파지 디스플레이(예를 들어, 문헌 [Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991)], Ladner 등의 미국 특허 제5,223,409호, Huse, 국제 특허출원 공개 번호 WO 92/06204, 및 영역-지정 돌연변이유발 (문헌 [Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986)], 및 문헌 [Ner et al., DNA 7:127, (1988))]이 포함된다.
문헌 [Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)], 및 국제 특허 출원 No. WO 97/20078에 의해 개시된 바와 같은 DNA 셔플링을 통해 본 발명에 따른 개시된 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 변이체도 또한 생성시킬 수 있다. 간략히 말해, 모 DNA의 무작위 단편화에 의한 시험관내 상동성 재조합, 및 이에 이은 PCR을 이용한 재조합을 행함으로써, 무작위로 도입되는 점 돌연변이를 초래함으로써, 변이체 DNA 분자를 생성시킬 수 있다. 이 기법은 한 계열의 모 DNA 분자, 예컨대 상이한 종들로부터의 대립형질 변이체 또는 DNA 분자를 이용하여 과정에 부가적 가변성을 도입함으로써 변형될 수 있다. 요망되는 활성에 대한 선택 또는 스크리닝, 및 이에 이은 돌연변이유발 및 검정의 부가적 반복은, 바람직한 돌연변이에 대해 선택함과 동시에 해로운 변화에 대해서도 반대 선택함으로써 서열의 급속 "진화(evolution)"를 제공한다.
본원에 개시된 돌연변이 방법을 고성능 자동화 스크리닝 방법과 조합하여, 숙주 세포 내 클로닝되고 돌연변이유발된 폴리펩티드의 활성을 검출할 수 있다. 생물학적 활성 폴리펩티드, 또는 특이적 항체에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이유발된 DNA 분자를 숙주 세포로부터 회수하여, 현대 장비를 이용하여 급속히 시퀀싱할 수 있다. 이 방법은 관심 폴리펩티드에서의 개별 아미노산 잔기의 중요성을 급속히 결정할 수 있게 하고, 또한 미지의 구조의 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드의 "기능성 단편" 및 그러한 기능성 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자의 통상의 결실 분석을 수행하여, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 기능성 단편을 수득할 수 있다. 한 예로서, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7을 코딩하는 DNA 분자를 Bal31 뉴클레아제로 분해하여, 일련의 내포 결실을 수득할 수 있다. 이어서, 단편을 적절한 리딩 프레임 내 발현 벡터에 삽입하고, 발현된 폴리펩티드를 단리하여, 항-항체에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 시험한다. 엑소뉴클레아제 분해에 대한 한 대안은, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발을 사용하여, 요망되는 단편의 생산을 구체화하기 위한 결실 또는 종결 코돈을 도입하는 것이다. 대안적으로, 중합효소 사슬 반응을 이용하여 본 발명에 따른 유전자의 특정 단편을 합성할 수 있다.
기능성 도메인의 동정 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 인터페론의 한 말단 또는 양 말단의 절단(truncation)에 대한 연구가 문헌 [Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995)]에 요약되었다. 또한, 단백질의 기능적 분석에 대한 표준 기법이 예를 들어 문헌 [Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993)], 문헌 [Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2 5A synthetase induced by human interferon," in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed), pages 65-72 (Nijhoff 1987)], 문헌 [Herschman, "The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985)], 문헌 [Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995)]; 문헌 [Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995)], 및 문헌 [Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)]에 의해 기재되어 있다.
본 발명은 또한 예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열 대비, 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기능성 단편을 고려한다. 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 특정 아미노산 서열의 동일성 수준을 결정함으로써 구조의 기초에 기초하여 동정될 수 있다. 구조에 기초하여 변이체 폴리펩티드를 동정하는 방법은 상기 논의된 바와 같이 잠재적 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7을 코딩하는 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있는지의 여부를 결정하는 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프 보유 부분을 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 펩티드를 제공한다. 그러한 단편 또는 펩티드는 전체 단백질을 면역원으로 사용할 때 항체 반응을 도출하는 단백질의 일부인 "면역원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 면역원성 에피토프 보유의 펩티드는 표준 방법을 이용하여 동정될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)] 참조).
이와 대조적으로, 폴리펩티드 단편 또는 펩티드는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역인 "항원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 특정 에피토프는 선형 또는 연속 신장 형태의 아미노산으로 구성되고, 그러한 에피토프의 항원성은 변성제에 의해 파괴되지 않는다. 단백질의 에피토프를 모방할 수 있는 비교적 짧은 합성 펩티드를 사용하여 단백질에 대한 항체 생산을 자극할 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)] 참조). 따라서, 본 발명의 항원성 에피토프 보유의 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 기재된 폴리펩티드와 결합하는 항체를 제기하는 데 유용하다.
항원성 에피토프 보유의 펩티드 및 폴리펩티드는 예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 적어도 4 내지 10개의 아미노산, 예를 들어 적어도 5 내지 10개의 아미노산, 예컨대 적어도 6 내지 10개의 아미노산, 예를 들어 적어도 7 내지 10개의 아미노산, 예컨대 적어도 10 내지 15개의 아미노산, 예를 들어 약 15 내지 약 30개의 아미노산을 포함한다.
그러한 에피토프 보유의 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편화 또는 화학적 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다. 또한, 에피토프는 무작위 펩티드 라이브러리의 파지 디스플레이에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, [Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993)] 및 문헌 [Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)] 참조). 에피토프를 동정하고, 에피토프를 포함하는 소형 펩티드로부터 항체를 생성하기 위한 표준 방법이 예를 들어 문헌 [Mole, "Epitope Mapping," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 105 1 16 (The Humana Press, Inc. 1992), 문헌 [Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 60 84 (Cambridge University Press 1995)] 및 문헌 [Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1 9.3.5 and pages 9.4.1 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997)]에 의해 기재되어 있다.
본 발명에 따른 변이 유전자의 특정 뉴클레오티드 서열에 상관없이, 유전자는 예를 들어 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 또는 서열 번호 7에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 할 수 있는 폴리펩티드를 코딩한다.
융합 폴리펩티드
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 사용하여, 재조합 숙주 내 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있고, 발현된 폴리펩티드를 단리할 수 있다. 한 유형의 융합 단백질은 재조합 숙주 세포로부터 본 발명에 따른 폴리펩티드를 지정하는 펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포의 분비 경로로 지정하기 위해, 분비 신호 서열(신호 펩티드, 리더 서열, 프리프로(prepro)-서열 또는 프리(pre) 서열)이 적당한 발현 벡터에 제공된다. 분비 신호 서열은 본 발명에 따른 폴리펩티드로부터 유래될 수 있고, 한편 적당한 신호 서열도 또한 또 다른 분비된 단백질로부터 유래되거나, 신규 합성될 수 있다. 분비 신호 서열은 본 발명에 따른 유전자 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어, 2개의 서열이 올바른 리딩 프레임 내 결합되고 위치 지정되어, 새로 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로 내로 지정한다. 특정 분비 신호 서열은 관심 뉴클레오티드 서열 내 다른 임의의 위치에 위치할 수 있으나, 분비 신호 서열은 통상 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 에 위치한다(예를 들어, Welch 등의 미국 특허 제5,037,743호; Holland 등의 미국 특허 제5,143,830호 참조).
본 발명에 따른 유전자의 분비 신호 서열, 또는 포유동물 세포에 의해 생성된 또 다른 단백질(예를 들어, 미국 특허 제5,641,655호에 기재된 바와 같은, 예컨대 조직-유형 플라스미노겐 활성화 신호 서열)은 재조합 포유동물 숙주 내 본 발명에 따른 유전자의 발현에 유용하나, 효모 신호 서열은 효모 세포 내 발현에 적당하다. 적당한 효모 신호 서열의 예는 효모 부합 페로몬 알파-인자(MF-알파1 유전자에 의해 코딩됨), 인버타제(SUC2 유전자에 의해 코딩됨), 또는 산 포스파타제(PHO5 유전자에 의해 코딩됨)로부터 유래된 것들이다. 예를 들어, 문헌 [Romanos et al., "Expression of Cloned Genes in Yeast," in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2.sup.nd Edition, Glover and Hames (eds.), pages 123-167 (Oxford University Press 1995)]을 참조한다.
박테리아 세포에서, 이종성 단백질을 융합 단백질로서 발현하여, 독성을 감소시키고, 안정성을 증가시키며, 발현된 단백질의 회수를 증진시키는 것이 종종 바람직하다. 예를 들어, 본 발명에 따른 유전자는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제 융합 단백질은 전형적으로 가용성이고, 고정화된 글루타티온 칼럼 상에서 E. 콜라이 용해물로부터 용이하게 정제가능하다. 유사한 방법으로서, 말토스 결합 단백질 폴리펩티드를 포함한 본 발명에 따른 융합 단백질을 아밀로스 수지 칼럼으로 단리할 수 있고, 한편 절단된 단백질 A 유전자의 C-말단부를 포함하는 융합 단백질은 IgG-세파로스를 이용하여 정제할 수 있다. 박테리아 세포에서 이종성 폴리펩티드를 융합 단백질로서 발현하는 확립된 기법이 예를 들어 문헌 [Williams et al., "Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies," in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2.sup.nd Edition, Glover and Hames (Eds.), pages 15-58 (Oxford University Press 1995)]에 의해 기재되어 있다. 추가로, 상업적으로 이용가능한 발현 시스템을 이용가능하다. 예를 들어, 피노포인트(PINPOINT) Xa 단백질 정제 시스템(프로메가 코포레이션(Promega Corporation); 미국 위스콘신주 매디슨 소재)은 아비딘을 포함하는 수지로 발현하는 동안 비오티닐화되는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 단리하는 방법을 제공한다.
원핵 또는 진핵 세포에 의해 발현되는 이종성 폴리펩티드를 단리하는 데 유용한 펩티드 태그에는 (니켈-킬레이트화 수지에 대한 친화도를 가지는) 폴리히스티딘 태그, c-myc 태그, 카모둘린 결합 단백질(카모둘린 친화도 크로마토그래피로 단리됨), 물질 P, (항-RYIRS 항체와 결합하는) RYIRS 태그, Glu-Glu 태그, 및 (항-FLAG 항체와 결합하는) FLAG 태그가 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996)], 문헌 [Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996)] 및 문헌 [Zheng et al., Gene 186:55 (1997)]가 포함된다. 그러한 펩티드 태그를 포함하는 핵산 분자는 예를 들어 시그마-알드리히 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수가능하다.
또 다른 형태의 융합 단백질은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 불변부, 전형적으로는2개의 불변부 도메인 및 힌지 영역을 포함하나 가변부는 결여된 Fc 단편을 포함한다. 한 예로서, Chang 등의 미국 특허 제5,723,125호는, 인간 인터페론 및 인간 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질을 기재한다. 인터페론의 C-말단은 펩티드 링커 부분에 의해 Fc 단편의 N-말단에 연결된다. 펩티드 링커의 한 예는 면역학적으로 불활성인 T 세포 삽입 서열을 주로 포함한 펩티드이다. 예시적 펩티드 링커는 아미노산 서열: GGSGG SGGGG SGGGG S을 가진다. 이 융합 단백질에서, 바람직한 Fc 부분은 용액 중에서 안정하고 보체 활성화 활성을 가지지 않는 인간 감마4 사슬이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 인간 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질을 고려하고, 여기서 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 이의 단편의 C-말단은 펩티드 링커를 통해 Fc 단편의 N-말단에 결합된다.
또 다른 변형 양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 IgG 서열을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 부분은 IgG 서열의 아미노 말단부에 공유 결합되고, 신호 펩티드는 본 발명에 따른 폴리펩티드 부분의 아미노 말단에 공유 결합되며, 여기서 IgG 서열은 하기 요소들을 하기 순서로 포함하거나 그것들로 구성된다: 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인. 따라서, IgG 서열은 CH1 도메인이 결여되어 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 부분은 프로테아제 억제 활성을 나타낸다. 항체 및 비-항체 부분을 모두 포함하는 융합 단백질의 생성을 위한 상기의 일반적 방법은 LaRochelle et al., EP 742830 (WO 95/21258)에 의해 기재되었다.
융합 단백질은 융합 단백질의 각 성분들을 제조하고 이들을 화학적으로 접합함으로써 당업자에게 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 적절한 리딩 프레임에서 융합 단백질의 양 성분 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 알려진 기법을 이용하여 생성되어, 본원에 기재된 방법에 의해 발현될 수 있다. 융합 단백질의 효소적 절단 및 화학적 절단을 위한 일반적 방법이 예를 들어 문헌 [Ausubel (1995) at pages 1619 to 1625]에 의해 기재되어 있다.
약학적 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체, 및 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자와 같은 엑소사이트 상호작용자를 포함하는 약학적 조성물, 및 이들 작용제를 동정하는 방법에 관한 것이다. 약학적 조성물은 치료 효과, 경감 효과 또는 예방 효과를 수득하기에 약리학적으로 유효한 양으로 본 처치를 필요로 하는 개체에 투여된다.
IGFBP-4 프로테아제로서의 PAPP-A의 동정은 PAPP-A를 치료 표적으로 이용함으로써 생체내 성장 및 분화에 영향을 미치는 방법을 제공한다. PAPP-A의 억제제는 생체이용가능한 IGF-I 및 IGF-II의 양을 감소시킬 것이다. 예를 들어, PAPP-A 활성의 억제는 재협착, 죽상경화증 및 섬유화증과 같은 장애에 유용할 수 있다. 활성제, 또는 PAPP-A의 활성을 증가시키는 작용제는 생체이용가능한 IGF-I 및 IGF-II의 양을 증가시킬 것이다.
PAPP-A 활성을 변경하거나 세포 표면에 대한 PAPP-A의 부착을 변경시키는 작용제가 약학적 조성물에 도입될 수 있다. 예를 들어, PAC1 및/또는 PAC2와 같은 PAPP-A 항체를 약학적으로 허용가능한 비독성 부형제 또는 담체와 혼합에 의해 약학적 조성물 내에 도입될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 통상의 부형제(즉, 약학적으로 허용가능한 담체)로서 무균수 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수첨 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 특히, 생체적합성, 생체분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜라이드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체가 생체내 본 발명의 방출을 제어하기 위한 부형제의 예이다. 다른 적당한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-아세트산비닐 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식 주입 시스템 및 리포좀을 포함한다. 흡입 투여용 제제는 필요한 경우, 락토와 같은 부형제를 함유할 수 있다. 흡입 제제는 예를 들어 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액일 수 있거나, 코 점적제 형태로 투여하기 위한 유성 용액일 수 있다. 필요한 경우, 화합물을 비내 적용하기 위한 겔로 제형할 수 있다. 비경구 투여용 제제는 또한 설하 투여를 위해 글리코콜레이트를 포함하여도 된다.
질병의 치료
표적화 IGF 신호 전달은 인간 질병, 특히 암 및 심혈관계 질병에 매우 관련성있는 것으로 사료된다. 성장 촉진 단백질분해 활성의 특이적 억제는, IGF 신호 전달의 직접적 억제에 대한 중요한 대안일 수 있는데, 이는 특히 그러한 IGF 수용체 자극 억제가 예를 들어 인슐린 신호 전달을 간섭할 가능성이 낮기 때문이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 질병의 치료를 위한, PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 처치를 필요로 하는 개체 내 하나 이상의 엑소사이트(들) 상호작용자에 의한 PAPP-A 활성 및/또는 생성 및/또는 IGF 방출 및/또는 IGFBP-4 절단의 조절에 관한 것이다. 이 개체는 예를 들어 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명은 또한 PAC1 또는 PAC2와 같은 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자 등의 본 발명에 기재된 엑소사이트(들) 상호작용자 중 하나 이상을 사용함에 의한, 재협착, 죽상경화증, 배란, 난포 발달, 상처 치유, 섬유화증, 또는 암과 같은 하나 이상의 성장-촉진 상태(들)의 조절에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PAC1 또는 PAC2와 같은 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자 등의 본 발명에 기재된 엑소사이트(들) 상호작용자 중 하나 이상을 사용함에 의한, 예를 들어 골다공증, 골 리모델링 또는 암과 같은 하나 이상의 성장-억제 상태(들)의 조절에 관한 것이다.
예를 들어, 증진된 PAPP-A 활성은 상처 치유, 골절, 골다공증, 또는 배란에 유용할 수 있다. 골다공증 또는 골 손실의 기타 상태는 골 형성 증가 및 골 흡수 감소로부터 이익을 볼 수 있다.
전형적으로 신체 루멘의 개방을 복원 또는 유지하기 위해 신체 내에 사용되는, 골 또는 스텐트를 안정화하기 위해 사용되는, 예를 들어 골 플레이트 또는 골 스크류와 같은 의료 장치는 하나 이상의 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자로 코팅될 수 있다.
하나 이상의 유형의 암(들)의 치료
한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 유형의 암의 치료를 위한, PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신 피질 암종, 에이즈 관련 암, 에이즈 관련 림프종, 항문암, 성상세포종(예를 들어, 소아 소뇌성 또는 소아 대뇌성), 기저 세포 암종, 간외 담관암, 방광암, 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌종양, 유방암, 남성 유방암, 기관지 선종/유암종, 버킷 림프종, 유암종 종양, 원발 부위 불명 암종, 원발성 중추신경계 림프종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 상의세포종(소아 상의세포종 등), 식도암, 유윙 종양 패밀리, 두개외 생식세포 종양(소아 두개외 생식세포 종양 등), 생식선외 생식세포 종양, 안암(안내 흑색종 또는 망막아세포종), 담낭암, 위(위장)암, 위장관 유암종, 임신성 융모 종양, 신경교종, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간) 암, 호지킨 림프종, 하인두암, 시상하부 및 시신경로 신경교종(예컨대, 소아 시상하부 및 시신경로 신경교종), 안내 흑색종, 섬세포종(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장(신세포)암, 후두암, 구순암 및 구강암, 폐암(비소세포암 또는 소세포암), 림프종(예컨대, 에이즈-관련 림프종, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 비호지킨 림프종), 매크로글로불린혈증(발덴스트룀의 매크로글로불린혈증 등), 골내 악성 섬유성 조직구종/골육종, 수아세포종(예컨대, 소아 수아세포종), 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종(예컨대, 성인 악성 중피종 또는 소아 중피종), 잠재성 원발 부위를 갖는 전이성 경부 편평 상피세포암, 다발성 내분비선종증 증후군(예컨대, 소아 발생), 다발성 골수종/형질세포 신생물, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수종(예컨대, 다발성 골수종), 만성 골수증식 질환, 비강암 및 비부비동암, 비인두암, 비인두암(예컨대, 소아 비인두암), 신경아세포종, 구인두암, 골육종/골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암(예컨대, 소아 난소암), 난소 상피암, 난소 생식세포 종양, 악성 잠재성이 낮은 난소 종양, 췌장암, 췌장암, 부비강암 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 갈색세포종(크롬친화성 세포종), 송과체아세포종 및 천막상부 원시신경외배엽 종양, 뇌하수체 종양, 흉막폐아세포종, 전립선암, 신우 및 수뇨관 이행세포 암, 망막아세포종, 횡문근육종(예컨대, 소아 횡문근육종), 타액선암, 성인 발병성 연조직 육종, 연조직 육종(예컨대, 소아 연조직 육종), 자궁 육종, 세자리 증후군, 피부암(예컨대, 비흑색종 피부암), 메르켈 세포 피부 암종, 소장암, 천막상부 원시신경외배엽 종양(예컨대, 소아 발생 천막상부 원시신경외배엽 종양), 피부 T-세포 림프종, 고환암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 수뇨관의 이행세포암, 융모 암종(예컨대, 임신성 융모 종양), 요도암, 자궁내막암, 자궁 육종, 질암, 시신경로 및 시상하부 신경교종(예컨대, 소아 시신경로 및 시상하부 신경교종), 반덴스트롬 매크로글로불린혈증 또는 윌름 종양으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유형의 암의 치료를 위한, PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
하나 이상의 심혈관계 질병(들)의 치료
한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 유형의 심혈관계 질병(들)의 치료를 위한, PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
예를 들어, 의료 장치를 PAPP-A 억제제로 코팅 또는 함침하는 것은 벌룬 혈관신생술 후의 재협착 발생을 막는 것을 돕거나, 혹은 아테롬경화성 플라크의 크기 더 증가하는 것을 막을 수 있다. 스텐트 설치를 이용한 관상동맥 혈관신생술은 현재 관상동맥 죽상경화증의 선두 치료법이다. 관상동맥 질병의 혈관신생물의 중요 목표는 급성 및 만성 합병증을 모두 예방하는 것이다. 근대의 절차는 즉각적 문제를 해소하는 데에는 매우 성공적이다. 안타깝게도, 스텐트 설치 환자들 중20 내지 30%에서 재협착이 여전히 일어난다. 재협착을 방지하기 위해 이용가능한 알려진 약리학적 개입법이 없다. 특정 기전에 한정되고자 함은 아니나, 관상동맥 평활근 세포에 의한 IGFBP-4 프로테아제 발현의 증가는 인간에서의 혈관신생물에 대응한 신생내막 형성에 앞서는 것으로 사료된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 동맥류, 앙기나, 부정맥, 죽상동맥경화증, 심근증, 뇌혈관 사고(뇌졸중), 뇌혈관 질병, 선천성 심장병, 울혈성 심부전, 심부전, 심근염, 판막 질환, 관상 동맥 질병, 확장성 심근증, 이완 기능장애, 심내막염, 높은 혈압(고혈압), 비후성 심근증, 승모 판막 탈출증, 심근경색(심장 마비) 및 정맥 혈전색전증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유형의 심혈관계 질병(들)의 치료를 위한, PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 급성 관상동맥 증후군, 예를 들어 심근허혈 및 심근경색, 뇌혈관 사고/뇌졸중, 심방 세동, 심부정맥, 협심증, 안정형 앙기나, 심정맥 혈전증 및 폐색전증, 혈전증(혈병), 말초 동맥 폐색, 원발성 또는 재발성 동맥 혈전증 또는 색전증, 혈전성향증(혈전증 발병 경향), 심장 수술을 위한 심폐 우회술 및 신부전에서의 혈액투석, 통상적 항혈전 요법, 응고 인자 장애, 혈우병, 혈우병 A(인자 VIII 결핍), 혈우병 B (인자 IX 결핍 또는 "크리스마스병") 및 혈우병 C(인자 Xl 결핍, 경증 출혈 경향), 폰 빌레브란트 병, 출혈, 혈우병, 혈소판 장애(선천성 또는 후천성), 글라츠만혈소판무력증, 베르나르-술리에 증후군(비정상 당단백질 Ib-IX-V 복합체), 회색 혈소판 증후군(알파 과립 결핍), 델타 저장 풀 결핍(치밀 과립 결핍), 출혈, 혈소판 수 감소, 골수이형성 증후군, 골수 장애, 면역계에 의한 파괴, 면역성 혈소판감소성 자반증/ITP, 혈전성 혈소판감소성 자반증/TTP, 용혈성 요독 증후군/HUS, 발작성 야간 혈색뇨증/PNH, 파종성 혈관내 응고/DIC, 헤파린-유발 혈소판감소증/HIT), 혈전증, 인공/보철 심장 판막, 심장 판막 질환, 박테리아성 심내막염, 류마티스성 승모 판막 질환, 승모 판막 협착증, 승모 판막 탈출증, 승모 판막 환상 석회화, 고립성 대동맥 판막 질환, 혈전성향증(혈전증 발병 경향), 혈전성향증, 인자 V 라이덴, 과다응고 장애, 인자 V를 코딩하는 유전자의 돌연변이, 심정맥 혈전증(DVT), 폐색전증, 뇌졸중, 심장 마비, 일과성 허혈 발작, 프로트롬빈 돌연변이, 인자 II 돌연변이, MTHFR 돌연변이 또는 비타민(비타민 B6, B12 및 엽산) 결핍으로 인한 높은 호모시스테인 수준, 항인지질 증후군 (또는 항인지질 항체 증후군) (APS), 동맥 및 정맥의 양쪽의 혈전증, 플라스미노겐 및 피브린 용해 장애, 발작성 야간 혈색뇨증, 단백질 C 결핍, 단백질 S 결핍 및 항트롬빈 III 결핍으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유형의 심혈관계 심혈관계 질병(들)/상태의 치료를 위한, PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
하나 이상의 유형의 골다공증의 치료
골다공증은 골절 위험의 증가를 초래하는 뼈 질병이다. 골다공증에서, 골 무기질 밀도(bone mineral density; BMD)가 감소하고, 골 미세구성이 파괴되며, 골 중 비콜라겐성 단백질의 양 및 종류가 변한다. 용어 "확립된 골다공증"에는 연약성 골절의 존재를 포함한다. 골다공증은 폐경후 골다공증이라 불리는 경우, 폐경후에 여성에게 가장 일반적이나, 스테로이드- 또는 글루코코르티코이드 유도의 골다공증(SIOP 또는 GIOP)으로 불리는 경우, 특정 호르몬 장애 및 기타 만성 질환의 존재 하에 또는 흡연 및 약물, 특히 글로코코르티코이드의 결과로서 남성 및 폐경전 여성에게도 발병할 수 있다. 골다공증 골절에 대한 위험 인자는 비변형성 및 (잠재적) 변형성으로 분류될 수 있다. 추가로, 골다공증이 인식 합병증인 특이적 질병 및 장애가 있다. 의약 용도는 이론적으로 변형가능하나, 많은 경우들에서 골다공증 위험을 증가시키는 의약의 사용이 불가피하다.
비변형성 위험-인자: 골다공증에 대한 가장 중요한 위험 인자는 (남성 및 여성 모두에 있어) 고령 및 성별 여성이고; 폐경후 에스트로겐 결핍은 BMD의 급속 감소와 상관되는 한편, 남성의 경우에는 테스토스테론 수준의 감소가 이에 필적하는 (단 덜 현저한) 영향을 미친다. 골다공증은 모든 인종 집단의 사람들에서 발생하나, 유럽 또는 아시아 혈통이 골다공증에 취약하다. 골절 또는 골다공증의 가계 병력이 있는 자는 증가된 위험에 처해 있고; 골절 및 저 골 무기질 밀도의 유전성이 비교적 높으며, 대략 25 내지 80% 범위에 상당한다. 골다공증 발병과 관련된 30개 이상의 유전자가 있다. 이미 골절을 당한 자는 동일한 연령 및 성별의 혹자에 비해 다시 골절을 걸릴 가능성이 2배 이상이다.
잠재적 변형성: 흡연 - 흡연은 골아세포의 활성을 억제하고, 골다공증에 대한 독립적 위험 인자이다. 낮은 체질량 지수 - 과체중은 하중 증가에 의해 또는 호르몬 렙틴을 통해 골다공증으로부터 보호한다. 영양실조. 알콜중독. 불충분 신체 활동 - 뼈는 신체적 스트레스에 대해 리모델링을 행한다. 생활 전반에 걸쳐 신체적으로 활성을 유지하는 사람은 골다공증에 대한 위험이 보다 낮은. 뼈에 가장 영향이 큰 신체 활동의 종류는 웨이트를 가지고 하는 운동이다. 달리는 사람에 있어서의 뼈 돌출부위 및 부착은 웨이트를 드는 사람과 체형 및 크기가 다르다. 신체 활동은 피크 골 질량(bone mass)에 가장 큰 영향을 미치는 청소년기 동안에 가장 큰 영향을 준다. 성인의 경우, 신체 활동은 골 질량의 유지를 돕고, 골 질량을 1 또는2% 증가시킬 수 있다. 만년에 신체 건강(physical fitness)은 골 무기질 밀도 증가보다는 하락 위험 감소와 더욱 관련성이 있다. 이와 반대로, 가만히 누워있는 사람은 유의적으로 증가된 위험에 처해 있다. 과다 신체 활동 - 과도한 운동은 상기 기재된 바와 같이 구조의 소모를 유발할 수 있는 뼈에 대한 지속적 손상을 초래할 수 있다. 만년에 심각한 골다공증을 발병한 마라톤 주자들의 사례가 많이 있다. 여성의 경우, 심한 운동은 에스트로겐 수준의 감소와 관련된 무월경(월경 사이클의 억류)를 초래한다. 중금속 - 카드뮴, 납 및 골 질병 간의 강한 연관성이 현재 확립되었다. 카드뮴에 대한 낮은 수준의 노출은 남성 및 여성 모두에 있어 빈번하게 골 무기질 밀도의 손실 증가와 관련되고, 이는 특히 노인 및 여성에 있어서 통증 및 골절 위험 증가를 초래한다. 카드뮴 노출이 증가하면 골연화증(골의 연화)이 초래된다. 청량 음료 - 일부 연구는 청량 음료(이들 상당수는 인산을 함유함)가 골다공증의 위험을 증가시킬 수 있음을 나타내고; 다른 연구는 청량 음료가 골다공증을 직접적으로 유발하기 보다는 다이어트로부터 칼슘 함유의 음료를 대체할 수 있다고 제시한다. 의약 - 골다공증을 잠재적으로 유발하는 의약의 경우, 그것의 긍정적 영향을 부정적 영향과 비교할 필요가 있다. 스테로이드로 유도된 골다공증(SIOP)은 글루코코르티코이드의 사용으로 인해 일어나는데, 이는 쿠싱 증후군과 유사하고 주로 중축 골격과 관련된다. 합성 글루코코르티코이드 처방 약물인 프레드니솔론은 섭취 연장 다음으로 주요 후보 요인이다. 일부 전문적 지침은 30 mg 초과의 히드로코르티손(7.5 mg의 프레드니솔론)의 당량을 섭취하는 환자, 특히 이 것이 3개월을 넘는 경우, 그 환자에게 있어 예방을 권장한다. 바비투레이트 및 일부 다른 효소 유도 항간질약 - 이는 아마도 비타민 D의 대사를 가속화한다. 양성자 펌프 억제제- 이 약물은 위산의 생성을 억제하고; 이는 칼슘 흡수를 간섭하는 것으로 사료된다. 항응고제 - 헤파린의 장기 사용은 골 밀도 감소와 연관되고, 와파린 (및 관련 쿠마린)은 장기 사용 시 골다공증 골절의 위험 증가와 연관되었다. (당뇨병에 사용되는) 티아졸리딘디온 - PPARγ의 억제제인 로시글리타존 및 가능하게는 피오글리타존은 골다공증 및 골절의 위험 증가와 연관되었다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폐경, 노화, 호르몬 장애, 에스트로겐 결핍, 테스토스테론 감소, 만성 질환, 흡연, 유전적 소인, 저 체질량 지수, 영양실조. 알콜중독, 신체 활동 부족, 중금속 노출(예를 들어, 카드뮴 및 납), 청량 음료 과다 소비, 및 스테로이드/글루코코티코이드 또는 바비투레이트 또는 기타 효소 유도성 항간질제, 또는 프로톤 펌프 억제제 또는 항응고제, 또는 (당뇨병에 사용되는) 티아졸리딘디온과 같은 의약의 사용으로 구성된 군으로부터 선택되는 임의의 위험 인자에 의해 유발되는 골다공증 질병의 치료를 위한, PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다:
투여 및 투약량 섭생법
포유동물, 특히 인간에게 유효 용량의 본 발명의 화합물을 제공하기 위해, 임의의 적당한 투여 경로가 이용될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장, 질, 국소, 비경구, 눈, 폐, 코 등이 이용될 수 있다. 다른 투여 예에는 설하, 정맥내, 근육내, 척추강내, 피하, 피부 및 경피 투여가 포함된다. 한 바람직한 실시양태에서, 투여는 흡입, 주사 또는 이식을 포함한다. 본 발명에 따른 화합물의 투여는 국소(국부) 효과 또는 신체 전반(전신) 효과를 초래할 수 있다.
투약 형태에는 정제, 트로키제, 분산액, 현탁액, 용액, 캡슐, 크림, 연고, 에어로졸 등이 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 화합물은 경구 또는 정맥내 투여된다.
이용되는 활성 성분의 유효 투약량은 이용하는 특정 화합물, 투여 방식, 피처리 상태 및 피처리 상태의 심각도에 따라 다양할 수 있다. 그러한 투약량은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 일일 약 0.1 밀리그램 내지 약 100 밀리그램/킬로그램 동물 체중의 투약량으로 투여되고, 바람직하게는 단일 일일 투약으로 또는 일일 2회 내지 6회 분할 투약으로, 또는 지연 방출 형태로 제공된다. 대부분의 큰 포유동물들의 경우, 총 일일 투약량은 약 1.0 밀리그램 내지 약 1000 밀리그램, 바람직하게는 약 1 밀리그램 내지 약 50 밀리그램이다. 70 kg 성인 인간의 경우, 총 일일 용량은 일반적으로 약 1 밀리그램 내지 약 350 밀리그램일 것이다. 특히 강한 화합물인 경우, 성인 인간에 대한 투약량은 0.1 mg 정도로 낮을 수 있다. 투약량 섭생법은 최적 치료적 반응을 제공하기 위해, 상기 범위 내에서 또는 심지어 상기 범위 외에서 조정될 수 있다.
경구 투여는 통상 정제를 이용하여 수행된다. 정제 내 용량의 예는 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg 및 250 mg이다. 기타 경구 형태는 또한 동일한 투약량(예를 들어, 캡슐)을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 본 처치를 필요로 하는 개체에 유효량으로 제공된다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물의 양은 약 0.01 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 20 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.02 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 18 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.04 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 16 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.06 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 14 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.08 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 12 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.1 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.3 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.5 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.7 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.9 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 1.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 1.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 2.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 2.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 3.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 3.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 4.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 4.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 5.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 5.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 5.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 5.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 5.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 6.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 6.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 6.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 6.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 6.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 7.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 7.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 7.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 7.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 7.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 8.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 10 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.3 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.5 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.7 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.9 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 1.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 1.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 2.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 2.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 3.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 3.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 4.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 4.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 5.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 5.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 5.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 5.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 5.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 6.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 8 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.3 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.5 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.7 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 0.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 0.9 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 1.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 1.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 1.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 2.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 2.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 2.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 3.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 3.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 3.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 4.2 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.4 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 4.6 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예를 들어 약 4.8 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약, 예컨대 약 5.0 밀리그램/kg 체중/투약 내지 약 6 밀리그램/kg 체중/투약의 범위이다.
본 발명은 또한 예를 들어 PAC1 및/또는 PAC2와 같은 PAPP-A 엑소사이트(들) 상호작용자 등의 엑소사이트(들) 상호작용자를 포함하는, 환자 내 설치하기 위한 의료 장치(예를 들어, 임플란트)를 그 특징으로 한다.
동시 투여
하나 이상의 항-암 약물과의 동시 투여
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와 하나 이상의 항암 약물(들)의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와, 하기의 것들로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암 약물(들)의 동시 투여에 관한 것이다:
알데스류킨(Aldesleukin)/프로류킨(Proleukin)(케이론 코포레이션(Chiron Corp))
알렘투주맵(Alemtuzumab)/캄패스(Campath)(밀레니엄 앤드 일렉스 파트너스 엘피(Millennium and ILEX Partners, LP))
알리트레티노인(alitretinoin)/판레틴(Panretin)(리간드 파마슈티칼스(Ligand Pharmaceuticals))
알로푸리놀(allopurinol)/자일로프림(Zyloprim)(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline))
알트레타민(altretamine)/헥살렌(Hexalen)(US 바이오사이언스(US Bioscience))
아미포스틴(amifostine)/에티올(Ethyol)(US 바이오사이언스)
아나스트로졸(anastrozole)/아리미덱스(Arimidex)(아스트라제네카(AstraZeneca))
삼산화비소/트리세녹스(Trisenox)(셀 테라퓨틱(Cell Therapeutic))
아스파라기나제/엘스파(Elspar)(머크 앤드 캄파니 인코포레이티드(Merck & Co, Inc))
BCG 라이브(BCG Live)/TICE BCG(오가논 테키나카 코포레이션(Organon Teknika Corp))
벡사로텐(bexarotene) 캡슐/타그레틴(Targretin)(리간드 파마슈티칼스(Ligand Pharmaceuticals))
블레오마이신(bleomycin)/블레녹산(Blenoxane)(브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb))
부설판(busulfan)/부설펙스(Busulfex)(글락소스미스클라인)
칼루스테론(calusterone)/메토사르브(Methosarb)(파마시아 앤드 업존 캄파니(Pharmacia & Upjohn Company))
카페시타빈(capecitabine)/젤로다(Xeloda)(로슈(Roche))
카르보플라틴(carboplatin)/파라플라틴(Paraplatin)(브리스톨-마이어스 스큅)
카르무스틴(carmustine)/BCNU, BiCNU(브리스톨-마이어스 스큅)
폴리페프로산(Polifeprosan) 20 임플란트를 포함한 카르무스틴/글리아델 웨이퍼(Gliadel Wafer)(구일포드 파마슈티칼스 인코포레이티드(Guilford Pharmaceuticals Inc.))
셀레콕시브(celecoxib)/셀레브렉스(Celebrex)(서얼(Searle))
클로람부실(chlorambucil)/류케란(Leukeran)(글락소스미스클라인)
시스플라틴(cisplatin)/플라티놀(Platinol)(브리스톨-마이어스 스큅)
클라드리빈(cladribine)/류스타틴(Leustatin), 2-CdA(R.W. 존슨 파마슈티칼 리서치 인스티튜트(R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute))
사이클로포스파미드 사이톡산(Cytoxan)/네오사르(Neosar)(브리스톨-마이어스 스큅)
시타라빈(cytarabine)/시토사르(Cytosar)-U(파마시아 앤드 업존 캄파니)
다카르바진(dacarbazine)/DTIC-돔(Dome)(바이엘(Bayer))
닥티노마이신(dactinomycin)/액티노마이신(actinomycin) D 코스메겐(Cosmegen)(머크)
다르베포에틴 알파(Darbepoetin alfa)/아라네스프(Aranesp)(암젠 인코포레이티드(Amgen, Inc))
다우노루비신(daunorubicin)/다우노마이신(daunomycin)/다우노루비신(베드포드 랩스(Bedford Labs))
다우노루비신/다우노마이신/세루비딘(와이어스 에이어스트(Wyeth Ayerst))
데니류킨(Denileukin)/디프티톡스(diftitox)/온탁(Ontak)(세라겐 인코포레이티드(Seragen, Inc))
덱스라족산(dexrazoxane)/진카드(Zinecard)(파마시아 앤드 업존 캄파니)
도세탁셀(docetaxel)/탁소텔(Taxotere)(아벤티스 파마슈티칼(Aventis Pharmaceutical))
독소루비신 아드리아마이신/루벡스(Rubex)(파마시아 앤드 업존 캄파니)
드로모스타놀론 프로피오네이트(DROMOSTANOLONE PROPIONATE)/마스테론 인젝션(MASTERONE INJECTION)(신텍스(SYNTEX))
엘리어트 용액(Elliott's B Solution)(오판 메디칼 인코포레이티드(Orphan Medical, Inc))
에피루비신(epirubicin)/엘렌스(Ellence)(파마시아 앤드 업존 캄파니)
에토포시드 포스페이트(브리스톨-마이어스 스큅)
에토포시드/VP-16/베페시드(Vepesid)(브리스톨-마이어스 스큅)
엑세메스탄(exemestane)/아로마신(Aromasin)(파마시아 앤드 업존 캄파니)
필그라스팀(Filgrastim)/뉴포젠(Neupogen)(암젠 인코포레이티드)
플록스리딘(floxuridine)/FUDR(로슈)
플루다라빈(fludarabine)/플루다라(Fludara)(베르렉스 래보러터리즈 인코포레이티드(Berlex Laboratories Inc.))
플루오로우라실/5-FU/아드루실(Adrucil)(ICN 푸에르토 리코(ICN Puerto Rico))
풀베스트란트(fulvestrant)/파슬로덱스(Faslodex)(IPR)
젬시타빈(gemcitabine)/젬자르(Gemzar)(엘라이 릴리(EIi Lilly))
젬투주맵(gemtuzumab)/오조가미신(ozogamicin)/마이로타르그(Mylotarg)(와이어스 에이어스트)
고세렐린 아세테이트/졸라덱스 임플란트(Zoladex Implant)(아스트라제네카 파마슈티칼스)
히드록시우레아/히드레아(Hydrea)(브리스톨-마이어스 스큅)
이브리투모맵 티욱세탄((lbritumomab Tiuxetan)/제발린(Zevalin)(IDEC 파마슈티칼스 코포레이션(IDEC Pharmaceuticals Corp))
이다루비신(idarubicin)/이다마이신(ldamycin)(아드리아 래보러터리즈(Adria Laboratories))
이포스타미드(ifosfamide)/IFEX(브리스톨-마이어스 스큅)
이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate)/글리벡(Gleevec)(노바티스(Novartis))
인터페론 알파-2a/로페론-A(호프만-라 로슈 인코포레이티드(Hoffmann-La Roche Inc))
인터페론 알파-2b/인트론 A(쉐링 코포레이션(Schering Corp))
이리노테칸(irinotecan)/캠프토사르(Camptosar)(파마시아 앤드 업존 캄파니)
레트로졸(letrozole)/페마라(Femara)(노바르티스(Novartis))
류코보린 웰코보린(leucovorin Wellcovorin)/류코보린(Leucovorin)(이뮤넥스 코포레이션(Immunex Corporation))
레바미솔(levamisole)/에르가미솔(Ergamisol)(얀센 리서치 파운데이션(Janssen Research Foundation))
로무스틴(lomustine)/CCNU/CeeBU(브리스톨-마이어스 스큅)
메클로레타민(meclorethamine)/질소 머스타드/무스타겐(Mustargen)(머크)
메게스트롤(megestrol) 아세테이트/메게이스(Megace)(브리스톨-마이어스 스큅)
멜팔란(melphalan)/L-PAM/알케란(Alkeran)(글락소스미스클라인)
머캅토푸린/6-MP 푸리네톨(Purinethol)(글락소스미스클라인)
메스나(mesna)/메스넥스(Mesnex)(아스타 메디카(Asta Medica))
메토트렉세이트(메토트렉세이트)(레덜리 래보러터리즈(Lederle Laboratories))
메톡살렌(methoxsalen)/우바덱스(Uvadex)(테라코스(Therakos))
미토마이신 C/무타마이신(Mutamycin)(브리스톨-마이어스 스큅)
미토마이신 C/미토지트렉스(Mitozytrex)(수퍼젠(Supergen))
미토탄(mitotane)/리소드렌(Lysodren)(브리스톨-마이어스 스큅)
미톡산트론(mitoxantrone)/노반트론(Novantrone)(레덜리 래보러터리즈)
난드롤론(nandrolone) 펜프로피오네이트/듀라볼린(Durabolin)-50(오가논(Organon)
노페투모맵(Nofetumomab)/베루마(Verluma)(뵈링거 인겔하임 파마 카게(Boehringer lngelheim Pharma KG)(구명 Dr. 카알 토마스 게엠바하(Dr. Karl Thomae GmbH))
오프렐베킨(Oprelvekin)/뉴메가(Neumega)(제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute))
옥살리플라틴(oxaliplatin)/엘록사틴(Eloxatin)(사노피 신텔라보(Sanofi Synthelabo))
파클리탁셀(paclitaxel)/탁솔(브리스톨-마이어스 스큅)
파미드로네이트(pamidronate)/아레디아(Aredia)(노바티스)
페가데마사(pegademase)/아다젠(Adagen)(페가데마사 보빈(Pegademase Bovine))(엔존(Enzon))
페그아스파르가제(Pegaspargase)/온카스파르(Oncaspar)(엔존 인코포레이티드(Enzon, Inc))
페그필그라스팀(Pegfilgrastim)/뉼라스타(Neulasta)(암젠 인코포레이티드)
펜토스타틴(pentostatin)/니펜트(Nipent)(파크 데이비스 파마슈티칼 캄파니(Parke-Davis Pharmaceutical Co.))
피포브로만(pipobroman)/베르사이트(Vercyte)(애보트 랩스(Abbott Labs))
플리카마이신(plicamycin)/미트라마이신(mithramycin)/미트라신(Mithracin)(화이자 랩스(Pfizer Labs))
포르피머(porfimer) 나트륨/포토프린(Photofrin)(QLT 포토테라퓨틱 인코포레이티드(QLT Phototherapeutics Inc.)
프로카바진(procarbazine)/마툴란(Matulane)(시그마 타우 팜스(Sigma Tau Pharms))
퀴나크린(quinacrine)/아타브린(Atabrine)(애보트 랩스(Abbott Labs))
라스부리카제(Rasburicase)/엘레테크(Elitek)(사노피-신텔라보 인코포레이티드(Sanofi-Synthelabo, Inc))
리툭시맵(Rituximab)/리툭산(Rituxan)(제네테크 인코포레이티드(Genentech, Inc))
사르그라모스팀(Sargramostim)/프로카킨Prokine)(이뮤넥스 코포레이션(Immunex Corp))
스트렙토조신(streptozocin)/자노사르(Zanosar)(파마시아 앤드 업존 캄파니)
탈크/스클러로졸(Sclerosol)(브라이언(Bryan))
타목시펜(tamoxifen)/노바덱스(Nolvadex)(아스트라제네카 파마슈티칼스)
테모졸로마이드(temozolomide)/테모다르(Temodar)(쉐링(Schering))
테니포시드(teniposide)/VM-26/부몬(Vumon)(브리스톨-마이어스 스큅)
테스토락톤(testolactone)/테슬락(Teslac)(브리스톨-마이어스 스큅)
티오구아닌/6-TG/티오구아닌(글락소스미스클라인)
티오테파/티오플렉스(레덜리 래보러터리즈)
토포테칸/히캄틴(Hycamtin)(글락소스미스클라인)
토포테칸/히캄틴(글락소스미스클라인)
토레미펜/파레스톤(Fareston)(오리온 코포레이션(Orion Corp))
토시투모맵(Tositumomab)/벡사르(Bexxar)(코릭사 코포레이션(Corixa Corporation))
트라스투주맵(Trastuzumab)/헤르셉틴(Herceptin)(제네테크 인코포레이티드)
트레티노인/ATRA/베사노이드(Vesanoid)(로슈)
우라실 머스타드(로버츠 랩스(Roberts Labs))
발루비신/발스타르(Valstar)(메데바(Medeva))
빈블라스틴/벨반(Velban)(엘라이 릴리)
빈크리스틴/온코빈(Oncovin)(엘라이 릴리)
비노렐빈/나벨빈(Navelbine)(글락소스미스클라인), 및
졸레드로네이트/조메타(Zometa)(노바르티스)
하나 이상의 심혈관계 질병(들)의 치료를 위한 하나 이상의 약물(들)을 이용한 동시 투여
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와 항혈소판 활성을 가지는 하나 이상의 약물의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와, 아스피린, 알록시프린, 디타졸, 카르바살레이트 칼슘, 클로리크로멘, 인도부펜, 피코타미드, 트리플루살, 클로피도그렐, 디피리다몰, 프라수그렐, 티클로피딘, 베라프로스트, 프로스타사이클린, 일로프로스트, 트레프로스티니, 압시시맵, 엡티피바티드 및 티로피반으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항혈소판 활성을 가지는 하나 이상의 약물의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와 항응고 활성을 가지는 하나 이상의 약물의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와, 헤파린, 베미파린, 달테파린, 에녹사파린, 나드로파린, 파나파린, 레비파린, 틴자파린, 설로덱시드, 다나파로이드, 와파린/쿠마린, 아세노쿠마롤, 클로린디온, 쿠마테트랄릴, 디쿠마롤, 디페나디온, 에틸 비스쿠마아세테이트, 펜프로쿠몬, 페닌디온, 티오클로마롤, 다비가트란, 이드라파리눅스, 레피루딘, 비발리루딘, 아르가트로반, 데시루딘, 히루딘, 멜라가트란, 시멜라가트란, 항트롬빈 III, 리바록사반, 폰다파리눅스, 단백질 C, 단백질 S, TFPI, 데피브로티드 및 머마탄 설페이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 항응고 활성을 가지는 하나 이상의 약물의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와 하나 이상의 섬유소용해 약물(들)의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와, 테넥테플라제, 아니스트레플라제, 앤크로드, 드로트레코진, 피브리노리신, 브리나제, tPA, uPA, 우로키나제 및 스트렙토키나제로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 섬유소용해 약물(들)의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와 심혈관계 질병 치료용 하나 이상의 약물의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와, ACE 억제제(예를 들어, 캅토프릴(Captopril), 조페노필(Zofenopil), 에날라프릴(Enalapril), 라미프릴(Ramipril)/알타세(Altace), 퀴나프릴(Quinapril), 페린도프릴(Perindopril), 리시노프릴(Lisinopril)/제스트릴(Zestril), 베나제프릴(Benazepril), 포시노프릴(Fosinopril)/모노프릴(Monopril), 레신나민(Rescinnamine), 카소키닌스(casokinins) 및 락토킨닌스(lactokinins); 안지오텐신(Angiotensin) Il 수용체 길항자(예를 들어, 칸데사르탄(Candesartan)/아타칸드(Atacand), 에프로사르탄(Eprosartan), 이르베사르탄(Irbesartan)/아바프로(Avapro), 로사르탄(Losartan)/코자아르(Cozaar), 올메사르탄(Olmesartan), 텔미사르탄(Telmisartan)/미카르디스(Micardis)/프로토르(Pritor) 및 발사르탄(Valsartan)/디오반(Diovan)); 직접적 레닌-억제제(예를 들어, 알리스키렌(Aliskiren)/테크투르나(Tekturna)/라실레즈(Rasilez)); 이뇨제(예를 들어, 푸로세마이드(Furosemide), 에타크리닌산(Ethacrynic acid), 토라세마이드(Torasemide), 부메타나이드(Bumetanide), 하이드로클로로티아지드, 클로르티아지드, 벤드로플루메티아지드, 아밀로라이드, 스피로노락톤(Spironolactone), 에플레네논(Eplerenone), 트리암테렌(Triamterene), 칼륨 칸레노에이트(Potassium canrenoate), 칸레논(Canrenone), 인다파미드(Indapamide), 클로르탈리돈(Chlortalidone), 퀸에타존(Quinethazone), 메르살릴(Mersalyl), 메톨라존(Metolazone), 테오브로민(Theobromine) 및 시클레타닌(Cicletanine)); 베타 차단제(예를 들어, 비소프롤롤(Bisoprolol), 카르베딜롤(Carvedilol), 메토프롤롤(Metoprolol), 아테놀롤(Atenolol), 라베탈롤(Labetalol), 메토프롤롤(Metoprolol)/로프레서(Lopressor)/토프롤(Toprol) XL 및 프로파놀롤(Propranolol)); 양성 수축촉진제(예를 들어, 디곡신 및 도부타민); 칼슘 통로 차단제(예를 들어, 니페디파인(Nifedipine)/아달라트(Adalat)/프로카르디카(Procardia), 암로디파인(Amlodipine)/노르바스크(Norvasc), 펠로디파인(Felodipine)/플렌딜(Plendil), 니카르디파인(Nicardipine)/카르덴(Cardene), 니모디파인(Nimodipine)/니모탑(Nimotop), 니솔디파인(Nisoldipine)/술라(Sular), 니트렌디파인(Nitrendipine)/카르디프(Cardiff)/니트레핀(Nitrepin), 라시디파인(Lacidipine)/모텐스(Motens), 레르카니디파인(Lercanidipine)/자니딥(Zanidip), 딜티아젬(Diltiazem)/카르디젬(Cardizem), 베라파밀(Verapamil)/칼란(Calan)/이소틴(lsoptin) 및 갈로파밀(Gallopamil)/D600); 대체 혈관확장제(예를 들어, 이소소르바이드 디니트레이트(lsosorbide dinitrate), 하이드랄라진(Hydralazine), 디아족시드(Diazoxide), 미녹시딜(Minoxidil), 니트로프루시드(Nitroprusside), 펜톨라민(Phentolamine) 및 테오브로민(Theobromine)); 교감신경억제제(예를 들어, 클로니딘(Clonidine), 구아파사인(Guanfacine), 메틸도파(Methyldopa), 목소니딘(Moxonidine), 레세르파인(Reserpine), 릴메니다인(Rilmenidine), 메카밀라민(Mecamylamine), 트리메타판(Trimethaphan), 프라조신(Prazosin), 구아네티딘(Guanethidine), 딘도라민(Indoramin), 독사조신(Doxazosin) 및 테라조신(Terazosin)); 및 기타 항고혈압제(예를 들어, 세로토닌 길항자, 예컨대 케탄세린(Ketanserin), 엔도텔린(endothelin) 수용체 길항자, 예컨대 보센탄(Bosentan), 암브리센탄(Ambrisentan) 및 시탁센탄(Sitaxsentan))로 구성되는 군으로부터 선택되는 심혈관계 질병 치료용 하나 이상의 약물의 동시 투여에 관한 것이다.
하나 이상의 보강제(들)와의 동시 투여
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와 하나 이상의 보강제(들)의 동시 투여에 관한 것이다.
면역원성 조성물의 효능을 최적화하기 위해 보강제가 종종 사용된다. 보강제는 일반적으로 요망되는 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물의 능력을 제공 및/또는 증진하는 데 사용되는 제제 내에 포함되는 작용제들로 구성된다.
헵텐 결정자를 비롯한 항원성 결정자를 포함하는 면역원성 결정자의 면역원성을 증진 및/또는 조절하는 강한 비독성 보강제는 한 군의 바람직한 보강제들을 나타낸다. 추가로, 그러한 보강제는 바람직하게 보다 조기에, 보다 강하거나 보다 연장된 면역 반응을 도출한다.
그러한 보강제는 또한 항원 공급이 제한되거나 생산 비용이 클 경우에 유용할 것이다.
본 발명에 속하는 보강제는 그것의 기원에 따라서, 무기, 박테리아, 식물성, 합성 또는 숙주 산물로 분류될 수 있다. 이러한 분류에 따른 제1 군은 무기 보강제, 예컨대 알루미늄 화합물이다. 알루미늄 염이 석출된 항원 또는 수행된 알루미늄 화합물과 혼합되거나 그것에 흡착된 항원을 폭넓게 사용하여, 동물 및 인간에서의 면역 반응을 보강하였다. 알루미늄 입자는 면역화 후 7일간 토끼의 국소 림프절에서 나타났고, 또 다른 중요 기능은 항원을 림프절 자체 내 T 세포를 가지는 영역에 지정하는 것일 수 있다. 보강제 효능은 배수 림프절의 표시와 상관있는 것으로 나타났다. 많은 연구들은 알루미늄 염이 투여된 항원이 증가된 체액성 면역을 초래하고, 세포 매개 면역은 지연형 과민감성에 의해 측정 시에 단지 약간 증가하는 것임을 입증하였다. 수산화알루미늄은 또한 보체 경로를 활성화하는 것으로 기재되었다. 이 기전은 국소 염증성 반응 및 면역글로불린 생성 및 B 세포 기억에서 역할을 담당할 수 있다. 주로 우수한 안전성 기록으로 인해, 현재 알루미늄 화합물이 인간에서 사용되는 유일한 보강제가다.
알루미늄 염은 보호를 도출하기 위해 항체 반응만을 필요로 하는 강한 면역원을 위해 충분한 보강제가었으나, 이들이 예를 들어 말라리아의 합성 펩티드와 같은 약한 면역원과 함께 사용될 때, 또는 세포-매개 면역 반응 또는 감염에 저항하는 데 필요한 유형의 gG 이소타입을 도입하는 데 항상 효과적이지 않을 수 있다.
또 다른 큰 부류의 보강제는 박테리아 기원의 보강제가다. 박테리아 기원의 보강제는 정제되어 합성될 수 있고(예를 들어, 무라밀 디펩티드, 지질 A), 숙주 매개자는 클로닝되었다(인터류킨 1 및 2). 최근 십여년간 박테리아 기원의 활성 성분의 3가지 이상의 보강제, 즉 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 리포다당류 및 프로인트 완전 보강제(FCA)의 화학적 정제에 있어 상당한 진전이 있었다. 본 발명에 따른 부가적으로 적당한 보강제는 예를 들어 티터맥스(Titermax), ISCOMS, Quil A, ALUN(미국 특허 제58767호 및 제5,554,372호 참조), 지질 A 유도체, 콜레라톡신 유도체, HSP 유도체, LPS 유도체, 합성 펩티드 매트릭스, GMDP 등, 및 이들과 면역자극제의 조합물(미국 특허 제5,876,735호)이다.
B. 퍼투시스는 T-림프구 집단에 대한 세포-매개 면역원을 조절하는 능력으로 인해 본 발명의 범주 내에서 보강제로서 주목된다. 리포다당류 및 프로인트 완전 보강제의 경우, 구조-기능 관계의 연구를 허용하는 보조 활성 부분이 동정되어 합성되었다. 이는 또한 본 발명에 따른 면역원성 조성물 내 포함되도록 고려된다. 지질 A를 비롯한 리포다당류 및 이의 각종 유도체는 리포좀 또는 기타 지질 유화액과 조합하여 강력한 보강제인 것으로 나타났다. 인간에서 범용되기에 충분히 낮은 독성을 가진 유도체가 생성될 수 있는지의 여부는 아직 명확하지 않다. 프로인트 완전 보강제는 가장 실험적인 연구에서 표준이다.
많은 다른 유형의 물질들이 본 발명에 따른 면역원성 조성물 내 보강제로서 사용될 수 있다. 이에는 사포닌과 같은 식물 산물, 키틴과 같은 동물 산물, 및 다수의 합성 화합물이 포함된다. 본 발명에 따른 보강제는 또한 이의 제안된 작용 기전에 의해 범주 분류될 수 있다. 이러한 유형의 분류는 대부분의 보강제들이 하나 초과의 기전에 의해 기능하는 것으로 보이기 때문에 필히 다소 임의적이다. 보강제는 항원 국소화 및 전달을 통해, 또는 면역계, 예컨대 거대세포 및 림프구를 구성하는 세포에 대한 직접적 영향에 의해 작용할 수 있다. 본 발명에 따른 보강제가 면역 반응을 증진하도록 하는 또 다른 기전은 항원 데포의 생성에 의한 것이다. 이는 알루미늄 화합물, 오일 에멀션, 리포좀, 및 합성 중합체의 보조 활성에 기여하는 것으로 보인다. 리포다당류 및 무라밀 디펩티드의 보조 활성은 마크로파지의 활성화를 통해 주로 매개되는 것으로 보이는 반면, B. 퍼투시스는 마크로파지 및 림프구 모두에 영향을 미친다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 도입될 때 유용할 수 있는 보강제의 다른 예가 미국 특허 제5,554,372호에 기재되어 있다.
혈액 응고 캐스케이드의 하나 이상의 억제제와의 동시 투여
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와 혈액 응고 캐스케이드의 하나 이상의 억제제의 동시 투여에 관한 것이다.
혈액 응고 시스템은 시스템의 다수 천연 발생 억제제에 의해 억제된다. 조직 인자 경로 억제제(TFPI)는 혈장 지단백질 및 혈관 내피와 결합된 34-kDa 단백질이다.
안티트롬빈은 세린 프로테아제; 트롬빈 및 fXa, 및 fXIIa, 및 fIXa를 불활성화하는 58 kDa 당단백질 세린 프로테아제 억제제(세르핀(serpin))이다. 그것은 일정하게 활성이나, 상기 인자들에 대한 부착은 헤파란 술페이트 프로테오글리칸(글리코스아미노글리칸)의 존재 또는 헤파린의 투여(상이한 헤파린들은 fXa, 트롬빈, 또는 양자 모두에 대한 친화도를 증가시킴)에 의해 증가된다. 안티트롬빈은 혈전에 결합된 트롬빈 또는 fXa은 불활화하지 않는다.
단백질 C는 주요 생리학적 항응고제이다. 그것은 트롬빈에 의해 활성화된 단백질 C(APC)로 활성화되는 비타민 K-의존성 세린 프로테아제 효소이다. 활성화된 형태(보조인자로서 단백질 S 및 인지질을 가짐)는 인자 Va 및 인자 VIIIa를 분해한다. 단백질 C 경로의 핵심 효소인 활성화된 단백질 C는 생리학적 항혈전 활성을 제공하고, 항염증 활성 및 항아포프토시스 활성 모두를 나타낸다. 이의 작용은 혈전증 및 허혈성 뇌졸중의 발병과 관련된다.
단백질 S는 간에서 합성되는 비타민 K-의존성 혈장 당단백질이다. 순환에서, 단백질 S는 2가지 형태, 즉 자유 형태, 및 보체 단백질에 결합된 복합체 형태로 존재한다. 단백질 S의 최량의 특징화 기능은 인자 Va 및 VIIIa의 불활성화에 있어 단백질 C에 대한 보조인자로서 기능하는 항응고 경로에서의 역할이다. 단지 자유 형태만이 보조인자 활성을 가진다. 또한, 단백질 S는 카르복실화 GLA 도메인을 통해 음하전 인지질에 결합할 수 있다. 이 성질은 단백질 S로 하여금, 세포 표면 상의 음하전 인지질을 나타내는, 아포프토시스를 겪고 있는 세포를 제거하는 데 작용하는 것이다. 단백질 S는 음하전 인지질에 결합함으로써 아포프토시스 세포와 식세포 사이의 가교 분자로서 작용한다.
정상 조건 하에서, 혈액 응고를 촉진하는 인자는 그것을 억제하는 인자와 균형을 이룬다. 응고촉진제 자극이 항응고제 및 섬유소용해 시스템을 압도할 때에는 정맥 또는 동맥 혈전증이 일어난다. 비르효 3조(Virchow's triad)는 혈전 형성, 혈액의 컨시스턴시(두께), 및 혈관의 질에 영향을 미치는 것으로 알려진 3가지 인자의 군이다. 현재, 혈전증을 치료하기 위한 의료적 개입법은 예를 들어 저분자량 헤파린(LMWH)을 비경구 투여한 후, 예를 들어 와파린을 경구 투여하는 것을 포함하는, 항응고제 투여에 의해 일어난다. 더욱 신규인 약물 부류인 직접적 트롬빈 억제제가 개발 중이고; 일부 구성원이 이미 임상 사용 중이다(예컨대, 레피루딘). 또한 특정 응고 인자(예를 들어, 리바록사반)의 효소 작용을 직접 간섭하는 다른 소분자 화합물들도 개발 중이다. 항혈소판제에는 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰 및 티클로피딘이 포함되고; 비경구 당단백질 IIb/IIIa 억제제가 혈관신생술 중에 사용된다.
헤파린은 호염기성 세포 및 비만 세포에 의해 생성되는 천연 발생의 고황산화 글리코스아미노글리칸이다. 헤파린은 항응고제로서 작용하여, 혈액 내 혈전 형성 및 존재하는 혈전의 확장을 방지한다. 헤파린은 이미 형성된 혈전은 붕괴하지 않으나(조직 플라스미노겐 활성제는 파괴할 것임), 신체의 천연 혈전 분해 기전을 정상적으로 작용시켜, 이미 형성된 혈전을 붕괴하도록 한다. 헤파린은 효소 억제제 안티트롬빈 III(AT-III)에 결합하여, 형태 변화를 유발하여, 활성 부위가 노출되도록 한다. 이어서, 활성화된 AT-III는 트롬빈 및 혈액 혈전형성에 관여하는 기타 프로테아제, 가장 특히 인자 Xa를 불활성화한다. AT-III에 의한 상기 프로테아제의 불활성화율은 헤파린의 결합으로 인해 1000배 증가한다. AT-III는 헤파린 중합체 내에 함유된 특정 오당류 황산화 서열에 결합한다. 헤파린 결합 시의 AT-III 내 형태 변화는 인자 Xa의 억제를 매개한다. 그러나, 트롬빈 억제의 경우, 트롬빈은 또한 오산화에 인접하는 부위에서 헤파린 중합체에 결합해야 한다. 헤파린의 높은 음하전 밀도는 그것의 트롬빈과의 매우 강한 정전 상호작용에 기여한다. AT-III, 트롬빈 및 헤파린 간의 3원 복합체의 형성으로 트롬빈이 불활성화된다. 이러한 이유로, 트롬빈에 대한 헤파린의 활성은 크기에 의존하고, 3원 복합체는 효율적 형성을 위해 18개 이상의 당 단위를 필요로 한다. 이와 대조적으로, 항-인자 Xa 활성은 단지 오당류 결합 부위만을 필요로 한다. 이 크기 차이는 저분자량 헤파린(LMWH)이 개발되도록 하였고, 더욱 최근에는 항트롬빈(Na) 활성이 아닌 항인자 Xa 활성을 표적화하는 약학적 항응고제로서 폰다파리눅스(fondaparinux)가 개발되도록 하였다. 장기 항응고가 필요한 경우, 헤파린은 종종 단지 경구 항응고제 와파린이 효과를 나타낼 때까지 항응고 요법을 개시하는 데에만 사용된다.
인자 II, VII, IX 및 X는 N-말단부에서 상호에 대해 상동성이다. 신호 펩티드의 제거 후, 세포질 망상 또는 골지체에 있는 카르복실라제는 상기 단백질의 프로펩티드 영역에 결합하여, 인접한 "GIa 도메인"에서 10-12 글루타메이트(Glu) 잔기를 g-카르복시글루타메이트(GIa)로 전환시킨다. 프로펩티드는 분비 전, 카르복실화 폴리펩티드에서 제거된다. GIa 잔기는 칼슘 이온을 결합시키고, 상기 응고 인자들의 활성에 필수적이다. Gia의 합성은 비타민 K를 필요로 한다. g-카르복실화 중에, 비타민 K는 사이클 지속을 위해 산화된 후, 이어서 환원되어야 한다. (쿠마린 군으로부터의) 항응고 약물 와파린은 비타민 K의 환원을 억제함으로써, 활성 인자 II, VII, IX, 및 X의 합성을 방지한다.
통상 단지 헤파린 주사 및/또는 경구 항응고제(통상 와파린)를 이용한 항응고 요법은, 고위험군 환자에 대한 예방책으로서 또는 급성 동맥 또는 정맥 혈전증의 치료책으로서 제공될 때 심각한 혈관 상태를 예방하는 데 매우 효과적이다. 이에 따라, 항응고 요법은 존재하는 혈전의 형성 및 연장을 방지한다. 그러나, 완전 투약 항응고는 또한 치명적일 수 있는, 두개내, 위장 또는 복막후 출혈을 비롯한 주요 내부 출혈의 공통된 요인이다. 그러므로, 항응고 요법으로부터 이익을 가장 받기 쉬운 환자(즉, 주요 혈전색전증 상황의 위험이 주요 출혈의 위험을 초과하는 자)를 선택하는 것이 중요하고; 항응고 요법 과정 중에 혈전색전증 및 출혈 병태 및 치사 모두를 최소화하는 것이 중요하다.
골다공증의 치료용 약물과의 동시 투여
본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트(들)를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와 골다공증의 치료에 사용되는 하나 이상의 약물의 동시 투여에 관한 것이다. 골다공증의 치료에 사용되는 하나 이상의 약물은 한 실시양태에서 이하 예들로부터 선택될 수 있다.
비스포스파네이트
비스포스파네이트, 예를 들어 포사맥스(Fosamax)(알렌드로네이트 나트륨), 보니바(Boniva)(이반드로네이트 나트륨) 또는 액토넬(Actonel)(리세드로네이트 나트륨)은 칼슘을 제어하고 골 붕괴 예방을 돕는 한 유형의 의약이다. 골 대체 또는 오래된 뼈의 새로운 뼈로의 대체는 우리들의 신체 내에서의 정상적 과정이다. 골다공증 환자에서, 새 뼈로의 대체는 오래된 뼈의 붕괴와 속도를 맞추지 못한다. 비스포스파네이트는 골 붕괴의 원인이 되는 세포인 파골 세포를 억제함으로써 골 질량을 유지하는 것을 돕는 골 붕괴 속도를 감소시킨다.
스트론륨 라넬레이트( Strontium ranelate )
스트론륨 라넬레이트(프로텔로스(Protelos))는 새로운 골 형성을 자극하는 약물이고, 비스포스포네이트를 잘 견디지 못하는 자라면 이 약물을 사용한다. 스트론튬은 골 건강에 필수인 다수의 미량 무기물 중 하나이다. 스트론튬은 건강한 골아세포 분화를 지지하고, 파골 세포 활성의 균형 유지를 돕는다. 부가적으로, 스트론튬 보충물은 골아세포에 의한 골아세포에 의한 건강한 콜라겐 형성을 지지하여, 골 인장 가도를 증진시킨다.
칼시토닌 ( 미아칼신 )( Miacalcin ))
칼시토닌은 주사제로서 제공되거나 비강 스프레이로 취해질 수 있는, 갑상선에 의해 생성되는 천연 발생 호르몬이다. 미아칼신(Miacalcin)이라는 상표명으로 시판되는 칼시토닌은 또한 뼈를 붕괴시키는 파골 세포의 기능을 억제한다. 칼시토닌은 오랫동안 골다공증 환자에게 유익한 것으로 알려져 왔으나, 주사제 투여가 곤란하고 좋지 않은 부작용이 있었다. 비강 스프레이는 칼시토닌 사용을 매우 향상시켰고, 오늘날 훨씬 더 통상적으로 사용된다. 칼시토닌은 골 손실 속도를 늦추고 또한 골다공증 골절과 관련된 통증을 감소시키는 것으로 나타났다.
랄록시펜( Raloxifene )
랄록시펜은 잠재적 부작용 없이, 에스트로겐(HRT)의 동일한 이점들 중 일부를 제공하도록 개발된 더욱 신규한 의약이다. 랄록시펜은 선택적 에스트로겐 수용체 조절자, 또는 SERM으로 불리는 한 유형의 의약이다. 골 질량의 증가 및 콜레스테롤 저감을 비롯한 랄록시펜의 영향은 에스트로겐과 유사한 것으로 나타났다. 그러나, SERM은 자궁막에 동일한 영향을 미치지 않고, 이에 따라 프로게스테론과 조합될 필요가 없다. 또한, 랄록시펜이 유방암의 위험을 감소시킬 수 있다는 증거가 있다.
에스트로겐
호르몬 대체 요법 또는 HRT은 골 질량의 유지를 도울 뿐만 아니라, 폐경 후 골 질량을 증가시킬 수 있다. 다수 연구들은 골다공증 및 골절된 뼈의 위험 감소를 비롯한 에스트로겐 요법의 이점을 나타냈다. 추가로, 폐경후 환자에서의 에스트로겐 대체의 다른 이점들에는 보다 적은 콜레스테롤, 감소된 대장암 위험, 폐경후 증상 감소가 포함된다. HRT는 자궁암의 위험을 증가시키는 것으로 나타났으나, 이 위험은 에스트로겐을 프로게스테론과 조합할 때 해소된다. 일부 연구 집단에서 유방암의 위험 증가를 나타내는 연구들이 있었다. HRT에 대한 환자는 또한 약간 증가된 혈전 및 뇌졸중 발병 위험을 나타냈다.
부갑상성 호르몬( PTH )
PTH는 골 재흡수 및 신규 골 형성을 자극한다. 간헐적 투여는 재흡수보다는 형성을 더 자극한다. 지금까지의 임상 시험은, PTH 요법이 골다공증의 예방 및 치료 모두에 효과적임을 제시하고, 매일의 주사제로 제공되는 포르테오(Forteo)라고 불리는 제제는 심각한 골다공증의 치료용으로 현재 FDA 승인을 받았다. 포르테오는 다른 어떠한 치료보다 척수 골 밀도를 구성하는 데 더욱 효과적이다. 그러나, 그것은 매일의 주사를 필요로 하고 또한 그 비용으로 인해, 통상 매우 심각한 척수 골다공증 환자에게만 제공된다.
디드로넬( Didronel )
디드로넬(에티드로네이트 이나트륨)은 주로 뼈에 작용한다. 그것은 인산칼슘 표면에의 화학흡착에 의해 히드록시아파타이트 결정 및 그것의 비결정 전구체의 형성, 성장 및 용해를 억제할 수 있다. 결정 재흡수의 억제가 결정 성장을 억제하는 데 필요한 용량보다 낮은 용량에서 일어난다.
노화방지 약물과의 동시 투여
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와, 이하 기재되는 것들과 같은 하나 이상의 항노화 약물(들)의 동시 투여에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PAC1 및/또는 PAC2, 또는 본 문헌에 기재된 PAC1 및/또는 PAC2의 임의의 변이체와 같은 PAPP-A 내 엑소사이트를 표적화하는 하나 이상의 프로테아제 억제제와, 산화방지제, 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 에톡시퀸(Ethoxyquin)(디히드로에톡시트리메틸퀴놀론), DDC(암모늄 디에틸디티오카르바메이트), 비타민 E(알파-토코페롤), MEA(메르캅토에틸라마인), 디아미노디에틸 DS(디아미노디에틸 이황화물), 판토테네이트, 비타민, 비타민 혼합물, 무기질, 무기 혼합물, 파이로딕소네즈(Pyrodixonej)(비타민 B6), 비타민 C, 비타민 A, 비타민 B12, 프로카인(Procaine), 데아놀(Deanol), 레보도파(Levodopa), 펜포르민(Phenformin), 페니토인(Phenytoin), BHT, 광조사로부터 보호하는 약물, 방사능 보호 약물, 예컨대 MEA, 유리 라디칼 반응을 억제하는 것으로 알려진 약물, 에톡시퀸 NDHGA(노르디히드로구아레트산), 프로안토시아닌, 바이오프라보노이드, 라이코펜, 식물 유래의 산화방지제, 디에틸히드록실아민(DEHA), EMHP, 2-에틸-6-메틸-3-히드록시피리딘 HCl, Co-효소 Q10, 리포산, 엽산, 셀레늄, 플라보노이드 카로틴, DHEA, 비타민 B, 카르니틴, SAM, 빈포세틴(카빈톤), 데프레닐(엘데프릴), 파이토-약물, 허브, HGH, 베타 카로틴, 엽산, 알파 리포산, 아세틸-l-카르니틴, 크레아틴, 멜라토닌, 어유, 예컨대 50% EPA/DHA, 유청 단백질 농축물, 미토콘드리아 항산화제, 예컨대 R-리포산, NtBHA, 이데베논 및 클로로필린, SOD 조절자, 예컨대 데프레닐, 하이데르긴 및 바코파, 항당화제, 예컨대 파이독사민, 벤포티아민, 카르노신, ALT-711, 키네틴, 데프레닐, 프로카인, 크로뮴, 몰리브덴, 칼륨, 콜린 비타르트레이트, 이노시톨, PABA, 아마씨 분말, 5-HTP, 루테인, 라이코펜, 글루코사민 술페이트, SAMe, 붕소, 니켈, 규소, 주석, 미량의 무기 배합물, 바나듐, 바이오플라보노이드 농축물, 은행나무 추출물, 녹차 추출물, 환원된 L-글루타티온, L-카르니틴, L-글루타민, DL-페닐알라닌, L-티로신, 아미노산 혼합체, GABA, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 K, 티아민, 리보플라빈, 니아신, 엽산염, 비오틴, 판토텐산, 칼슘, 요오드, 마그네슘, 아연, 구리, 망간, B3, 프롤레바, 인간 성장 호르몬 및 성장 호르몬으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항노화 약물(들)의 동시 투여에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 항노화 약물은 노화의 특정 질병, 예컨대 알츠하이머씨병, 치매, 관절염, 암, 우울증, 당뇨병, 과지질혈증, 고혈압, 면역거부증, 박테리아 감염, 진균류 감염, 기억 상실증, 폐경, 근육약화, 골다공증, 파킨슨씨병, 전립선 비대증, 성 장애, 뇌졸중 위험, 뇌졸중, 체중 증가 및 비을 치료 및/또는 예방하기 위한 하나 이상의 약물을 포함한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 설명되며, 이는 특허청구범위에 기재된 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예 1
플라스미드 구성물 - 중첩 연장 PCR에 의해 모듈 CCP1로 시작되는 쥐 PAPP-A의 C-말단 부분의 His-태그 부착 형태를 코딩하는 발현 구성물(도 1)을 제작하였다. 간략히 말해, 인간 IGFBP-5(유전자은행 등록 번호 NP 000590)을 코딩하는 구성물로부터 PCR에 의해 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 단편(MVLLTAVLLLLAAYAGPAQS)을 유도하였다. 프라이머는 5'-GACGAAGCTTATGGTGTTGCTCACCGCGGT-3'(도입된 HindIII 부위가 굵은 체로 표시됨) 및 5'-TTCTGGGCAGTCGGCGCTCTGGGCCGGCCCCGCAT-S'(쥐 PAPP-A의 잔기 1129-1133를 코딩하는 뉴클레오티드가 밑줄 그어짐)이다. 1545-잔기 쥐 PAPP-A의 넘버링은 문헌 [Soe, R., Overgaard, M. T., Thomsen, A. R., Laursen, L. S., Olsen, I. M., Sottrup-Jensen, L, Haaning, J., Giudice, L C, Conover, C. A., and Oxvig, C.(2002) Eur. J. Biochem. 269(8), 2247- 2256)]에 따르고, 1547-잔기 인간 PAPP-A의 넘버링은 문헌 [Kristensen, P., 및 Winter, G.(1998) Fold Des 3(5), 321-328)]에 따른다. 주형으로서 쥐 PAPP-A를 코딩하는 pcDNA3.1-mPA를 이용하여, His-태그가 이어지는 쥐 PAPP-A의 잔기 1129-1545를 코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 단편을 제작하였다. 프라이머는 5'-GGGCCGGCCCAGAGCGCCGACTGCCCAGAACTGGC-3'(쥐 PAPP-A 코딩 뉴클레오티드가 밑줄 그어짐) 및 5'-CATTTCTAGA TCAATGATGATGATGATGATGTCCTGA GCCATGGCTATATCCCCGAAGATCTTTCC-3'(Xbal 부위가 굵은 체로 표시되고, 잔기 Gly-Ser 및 이에 이은 6개의 히스티딘 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드가 이탤릭체로 표시되며, 쥐 PAPP-A 코딩 뉴클레오티드는 밑줄 그어짐)이었다. 2개의 단편의 조합으로 얻어지는 PCR 산물을 pcDNA3.1(+)(인비트로젠)의 HindIII/Xbal 부위 내에 클로닝하여, 쥐 PAPP-A 잔기 1129-1545 및 이에 이은 아미노산 서열 GSHHHHHH을 코딩하는 pmPA(CCPI-C-His)를 수득하였다. 인간 PAPP-A의 잔기 1133-1547을 코딩하는 유사한 구성물을 제작하였다. 이 구성물은 His-태그를 포함하지 않는다. 또한 형질감염을 위해, 인간 PAPP-A, 쥐 PAPP-A, 인간 PAPP-A2, 인간 PAPP-A/PAPP-A2 키메라 단백질(PAPP-A(P2-CCP5-C), PAPP-A(P2- CCP4-C), PAPP-A(P2-CCP3-C), PAPP-A(P2-CCP2-C), PAPP-A(P2-CCP1-C), PAPP-A(P2-CCP3-4), 및 PAPP-A(P2-LNR3), PAPP-A의 절단 변이체(PAPP-A(dl_NR3-C)), 및 단일 아미노산이 알라닌으로 치환된 PAPP-A의 변이체, PAPP-A(DI 484A), PAPP-A(D1499A), 및 PAPP-A(DI 502A))를 코딩하는 발현 구성물을 사용하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 활성 부위의 Glu-483이 글루타민으로 치환된 PAPP-A인, PAPP-A(E483Q)을 코딩하는 구성물을 사용하였다.
세포 배양 및 포유동물 세포 내에서의 단백질 발현 - 인간 배아 신장 293T 세포(293tsA1609neo)를 10% 우태 혈청, 2 mM 글루타민, 비필수 아미노산, 및 젠타미신(인비트로젠)으로 보충된 고함량 포도당 둘베코 병형 이글 배지(high-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 유지시켰다. 세포를 6-cm 조직 배양 디쉬에 플레이팅하고, 18시간 후에, 키아프렙 스핍 키트(QIAprep Spin Kit)(키아겐(Qiagen))에 의해 제조된 10 ㎍의 플라스미드 DNA를 이용하여 인산칼슘 동시 석출에 의해 일시적으로 형질감염시켰다. 48시간 후, 배지를 수거하고 원심분리에 의해 투명화하였다. 쥐 PAPP-A(1129-1545), 인간 PAPP-A(1133- 1547), 및 인간 PAPP-A(E483Q)를 코딩하는 cDNA로 형질감염된 세포를 무혈청 배지에서 추가로 배양하여, 정제를 촉진하였다.
닭 폴리클로날 항체 생성 - 킬레이트화 세파로스 고속 유동 비드(Chelating Sepharose Fast Flow beads)(1 mL)(아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences))를 이용하여 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 무혈청 배지로부터 쥐 PAPP-A(1129-1545)를 정제하였다. 칼럼을 1 M NaCl, 50 mM 인산나트륨, pH 5.5으로 세정하였고, 결합된 단백질을 20 mM EDTA 함유의 PBS로 용출하였다. PBS 중에 평형화된 1 mL HiTrap 헤파린 HP 칼럼(아머샴 바이오사이언시스)를 이용하여 헤파린 친화도 크로마토그래피에 의해 풀링된 분획을 추가 정제하였다. 칼럼을 250 mM NaCl 함유의 PBS로 세정하였고, 결합된 단백질을 1 M NaCl 함유의 PBS로 용출하였다.
3마리의 닭(이사 브라운(Isa Brown))을 각 라운드에 대해 15 ㎍의 정제된 단백질을 이용하여 유방 근육에의 근육내 주사로써 면역화하였다. 완전 프로인트 보강제(시그마)를 주사의 제1 라운드에 사용하였고, 불완전 프로인트 보강제(시그마)를 연속 라운드에 사용하였다. 달걀을 매일 수집하고, 4℃에서 유지시켰다. 노른자로부터 IgY의 정제, 및 이에 이은 직접적 ELISA에 의해 정규 간격으로 역가를 평가하였고, 여기서 쥐 PAPP-A(1129-1545)를 플라스틱에 코팅하였다. HRP-접합 항-닭-lgY(시그마)를 이용하여 검출을 행하였고, 최고의 역가를 가지는 IgY 제제를 추가 시험을 위해 사용하였다.
단백질분해 활성의 측정 - IGFBP-4 및 -5에 대한 PAPP-A의 단백질분해 활성을 상기 상세히 기재되었다(45). 간략히 말해, 아미노산 분석에 의해 정량화된 정제된 기질을 125I로 표지하였다(아머샴 바이오사이언시스). 10배 몰과량의 IGF-II(다이아그노스틱 시스템즈 래보러터리즈(Diagnostic Systems Laboratories))의 부재(IGFBP-5) 또는 존재(IGFBP-4) 하에, 50 mM 트리스(Tris)-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.5 중에 절단 반응을 수행하였다. 37℃에서 항온배양한 후, EDTA(10 mM) 첨가에 의해 반응을 켄칭하고, -20℃에서 보관하였다. 절단 산물을 10-20% SDS-PAGE에 의해 분리하였고, 방사능 사진촬영에 의해 가시화하였다. 타이푼(Typhoon) 촬영 시스템(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))을 이용하여 밴드 강도의 정량화함으로써 절단 정도를 결정하였고, 배경 수준(모의 신호)를 차감하였다. IGF의 부재 하의 IGFBP-5에 대한 PAPP-A2의 단백질분해 활성을 이전에 상세히 설명된 바와 같이 유사하게 분석하였다(26). IGFBP-4로부터 유래된 26-잔기 합성 펩티드에 대한 펩티드분해 활성의 분석을 전술된 바와 같이 수행하였다(46). 절단 부위의 N-말단 및 C-말단 측에 있는 잔기를 각기 o-아미노벤조산으로 변형시키고, 3-니트로티로신으로 치환하였다. 반응 완충액은 50 mM 트리스, pH 8.0, 0.01% 트윈(Tween)-20이었다. 310 nm의 빛을 사용하여 여기하였고, 420 nm에서 방출이 검출되었다. 경쟁적 억제에 대한 방정식을 이용하여 프리즘(Prism) 5.0(그래프패드 소프트웨어)을 이용하여 정량 분석을 수행하였다. 부분 억제의 경우, S자형 용량-반응 곡선을 데이터에 피팅시켰다.
반합성 파지 라이브러리의 스크리닝 - 100 mM 이탄산나트륨, pH 9.8 중에 함유되고 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.5 (TBS) 중 3% 탈지유 분말로 차단된 폴리클로날 PAPP-A 항체 (5 ㎍/mL)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅한,.5 mL 면역튜브(눈크 맥시소프(Nunc Maxisorp)에, 인간 PAPP-A(1133-1547)를 고정하였다(37℃에서 1시간). 본 발명자들은 2개의 반합성 파지 라이브러리(톰린슨(Tomlinson) I + J)의 조합을 사용하였고(48), 파지의 포획(각 라이브러리 당 1012개)을 완만히 회전하면서 실온에서 2시간 동안 수행하였다. 포획 후, 관을 1 M NaCl 및 0.1% 트윈-20 (TBST) 함유의 TBS 중에 10회 헹군 후, 연동 펌프를 이용하여 5시간 동안 2 L TBST로 4℃에서 세정하였고, 마지막으로 TBS로 5회 세정하였다. 파지의 용출을, TBS 중에 희석된 0.5 mL DPPC로 처리된 트립신(1 mg/mL)(시그마)을 이용하여 실온에서 10분 동안 수행하였다. 대안적으로, 파지의 용출은 EDTA의 사용을 포함할 수 있다. 또한, 파지 라이브러리 외의 당업계에 알려진 다른 라이브러리도 사용될 수 있다.
용출된 파지로 감염된(37℃에서 30분) E. 콜라이(TG1)를 1% 포도당 및 암피실린(100 ㎍/mL)으로 보충된 TYE 플레이트 상에 플레이팅하였다. 콜로니를 1% 포도당 및 암피실린(100 ㎍/mL)을 함유하는 2×TY 배지를 가지는 96-웰 배양 플레이트로 옮기고, 항온배양하였다(37℃에서 하룻밤). 각 플레이트의 복제물을 3시간 동안 항온배양하고, KM13 헬퍼 파지를 첨가하였다(각 웰에 109개). 1시간 동안 항온배양한 후, 배지를 암피실린(100 ㎍/mL) 및 카나마이신(50 ㎍/mL)을 함유하는 2×TY로 바꾸고, 플레이트를 30℃에서 20시간 동안 항온배양하였으며, 이어서 파지 함유의 상등액을, 폴리클로날 PAPP-A 항체를 가지는 96-웰 플레이트 내에 고정화된 인간 PAPP-A(E483Q)에의 결합에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 플레이트를 2% 소 혈청 알부민(시그마)으로 차단하였고, 0.1% 트윈-20 함유의 TBS로 세정하였으며, HRP 접합 항-M13(GE 헬쓰케어)를 이용하여 검출을 수행하였다. 클론으로부터 선택된 파지미드 DNA(plT2)를 제조하여 시퀀싱하였다.
PAPP-A N-말단의 영역을 CCP1에 결합시키는 파지 항체를 또한 수득하기 위해, 전장 인간 PAPP-A를 이용하여 유사한 스크리닝을 수행하였다. 클론 PAC5를 수득하였고, scFv 포맷으로 대조 항체로 사용하였다. PAPP-A와 무관한 특이성을 가지는 클론 PAC33을 또한 대조 항체로 사용하였다.
scFv 항체의 발현 및 정제, 및 억제능의 분석 - E. 콜라이 HB2151(앰버 종결 코돈의 비-서프레서)을 모노클로날 scFv 항체의 생산을 위한 선택 파지로 감염시켰다. 1 L의 배양액을 1 mM IPTG와 함께 4-16시간 동안 유도하였고, 발현된 단백질을 음파 처리 후, 킬레이트화 세파로스 고속 유동 비드(5 mL)(GE 헬쓰케어) 상의 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20 mM 이미다졸, 100 mM NaCl, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0을 이용하여 세정을 수행하였다. 용출을 위해, 이미다졸의 농도를 300 mM로 증가시켰다. 용출된 단백질을 20 mM 트리스, 100 mM NaCl, pH 8 내로 투석하였다. 추가 정제를 위해 모노Q((MonoQ) 칼럼(GE 헬쓰케어) 또는 단백질 L 칼럼(피어스)를 사용하였다. 정제된 단백질을 기능적 분석 전에 관련 완충액 내로 투석하였다. 검출을 위해 HRP 접합 항-His-태그 항체(시그마)를 이용하여 96-웰 플레이트에서, 상기 기재된 바와 같이 고정화된 PAPP-A에의 결합에 대한 분석을 수행하였다.
정제된 항체의 제제를 아미노산 분석에 의해 정량화하였고, PAPP-A 활성에 대한 항체의 효과를 제어되는 양의 절단 반응이 부가로써 분석하였다. PAC33를 음성 대조군으로 사용하였다.
표면 플라즈몬 공명 분석 - 시리즈 S CM5 센서 칩 및 제조업체에 의해 공급된 커플링 시약을 이용하여, 바이아코어(BIAcore) T100 기기(바이아코어 AB, 스웨덴 웁살라 소재) 상에서 표면 플라즈몬 공명 실험을 수행하였다. 10 mM 아세트산나트륨, pH 5.0 중 10 ㎍/mL의 친화도 정제 PAPP-A(E483Q)를 25℃에서 활성화된 칩에(500 공명 단위(RU))의 수준으로) 고정화하였다. 잔존 활성화된 기를 1 M 에탄올아민으로 차단하였다. 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.05% 트윈-20, pH 7.4(HBS) 중에 희석된 정제된 항체(0.35-11 nM)를 37℃에서 30 μL/분의 유속으로 2분 동안 센서 칩에 주입하였다. 기록된 신호를 관련 항체의 주입에 의해 결정되는 배경 신호에서 차감하였다. 칼슘 이온 의존성의 분석을 위해, 10 mM EDTA의 부재 또는 존재 하에 175 nM PAC1을 이용하여 일부 실험을 수행하였다. 제조업체의 소프트웨어(바이아코어 T100 평가 소프트웨어 버전 1.1)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
항체 특이성의 결정 및 항체 결합의 매핑 - PAPP-A/PAPP-A2 키메라 단백질 및 PAPP-A의 돌연변이화된 변이체를 이용하여 ELISA에 의해 항체 결합의 매핑을 수행하였다. 단백질을 폴리클로날 PAPP-A 항체로 고정화하였고, 파지 항체의 결합을 상기 상세히 설명한 바대로 분석하였다.
결과
PAPP -A의 C-말단 단편에 대해 제기된 폴리클로날 항체에 의한 단백질분해의 억제 - PAPP-A 단백질분해 활성의 유일하게 알려진 생리학적 억제제는 PAPP-A/proMBP로 표시되는 공유 이황화물 기재 2:2 복합체의 형성에 의해 PAPP-A를 불활성화하는 대용형(proform)의 호산구성 주염기 단백질(proMBP)이다. ProMBP에 의한 억제가 비가역적이나, 복합체 형성의 과정이 비교적 느리고, 산화환원 포텐셜에 대해 민감하다. 합성 저분자량 화합물들, 예컨대 관련 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 많은 억제제들 중, PAPP-A에 대한 것으로 발견된 것이 없다.
그러나, IGFBP-4 및 -5 모두에 대한 PAPP-A 활성은 폴리클로날 항체에 의해 효과적으로 억제되었다(도 2A). 본 발명자들은 PAPP-A의 LNR3 영역이 기질 결합에서 엑소사이트로서 관련된다는 것을 사전에 가설로 세웠기 때문에, 본 발명자들은 PAPP-A의 C-말단 영역에 대해 제기된 항체의 억제 성질을 시험하고자 하였다. 본 발명자들은 5개의 CCP 모듈 및 LNR3을 포함한, 쥐 PAPP-A의 잔기 1129-1545를 코딩하는 플라스미드 구성물을 제작하였고(도 1), 293T 세포 내에 발현된 재조합 단백질을 면역화를 위해 정제하였다(도 2B). PAPP-A LNR3이 매우 보존되고(인간 PAPP-A LNR3과 쥐 PAPP-A LNR3 간의 100% 동일성), 이에 따라 포유동물에서의 면역 반응을 도출할 가능성이 덜 하기 때문에, 면역화를 위해 닭을 선택하였다. 생성된 폴리클로날 IgY 항체는 IGFBP-4의 PAPP-A 단백질분해를 효과적으로 억제하는 것으로 나타난 반면, IGFBP-5의 절단은 훨씬 덜 영향을 받았다(도 2C). 전면역(preimmune) IgY에 있어 2개 기질의 단백질분해에 대한 영향은 관찰되지 않았다(도시되지 않음).
LNR3 영역 외의 많은 에피토프들이 면역화를 위해 사용되는 대략 60 kDa C-말단 단편 상에 존재하였으나, 이 실험은 LNR3이 기질 결합 엑소사이트로서 기능한다는 가설을 지지한다. 또한, 그러한 폴리클로날 항체가 IGFBP-5의 절단을 효율적으로 억제할 수 없다는 발견 사실은 차별적 방식의 기질 결합을 제시하고, 또한 IGFBP-4의 PAPP-A 절단을 선택적으로 표적화하는 억제제가 수득될 수 있음을 제시한다.
IGFBP -4 단백질분해를 억제하는 PAPP -A 모노클로날 scFv 항체의 파지 디스플레이에 의한 선택 - IGFBP-4의 PAPP-A 절단에 대한 선택적 억제 활성을 가지는 모노클로날 항체를 수득하기 위해, 실험 절차에서 상세히 설명된 바와 같이, 인간 PAPP-A의 60 kDa C-말단 단편(잔기 1133-1547)로의 결합에 대해 파지 항체 라이브러리를 스크리닝하였다. 보존된 LNR3 영역에 결합하는 파지 항체를 수득할 가능성을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 통상 사용되는 단일 VH 및 VL 인간 유전자 세그먼트의 프레임워크 상에 구성된 2개의 반합성 파지 라이브러리의 조합물을 사용하였다. 결합된 파지를 클로닝하였고, 그것의 전장 PAPP-A에의 결합을 ELISA에 의해 평가하였으며, 이어서 선택된 파지로부터의 scFv 항체를 E. 콜라이에서 생산하여 억제 활성에 대해 평가하였다. 2개의 억제 scFv 항체인, PAC1 및 PAC2가 수득되었다. 가변부의 서열 분석은 PAC1 및 PAC2가 특유의 클론임을 보여주었다(도시되지 않음).
추가 확인을 위해, PAC1 및 PAC2를 보다 큰 규모로 발현하고, 정제하며, 아미노산 분석에 의해 정량화하였다. 양 scFv 항체 모두는 PAC1로 도시한 바와 같이, IGFBP-4의 PAPP-A 절단을 효과적으로 억제하였다(도 3A). 쥐 PAPP-A의 효율적 억제도 또한 쥐 및 인간 PAPP-A 간의 매우 큰 서열 보존도와 일치하는 PAC1(도 3B) 및 PAC2에서 나타났다. 인간 PAPP-A 및 쥐 PAPP-A 모두에서, PAC1가 PAC2보다 약간 더 양호한 억제제였다(도시되지 않음).
상대적 초기 속도를 항체 농도의 함수로서 플로팅함으로써, 인간 PAPP-A의 억제를 더욱 분석하였다(도 3B). 이 분석에 기초하여, 인간 PAPP-A에 대한 PAC1의 억제 상수를 구하였다(K1 = 1.2 nM). 고정화된 PAPP-A에 대한 항체 결합을 표면 플라즈몬 공명으로부터 추가 분석하였고, 이로부터 본 발명자들은 용액상 실험과 일치하는 PAC1에 대한 평형 해리 상수(KD = 0.25 nM, 도 3C)를 수득하였다.
IGFBP -5에 대한 PAPP -A 활성은 단지 부분적으로만 항체 PAC1 에 의해 억제된다 - 항체 PAC1은 종점(end-point) 검정법에 의해 도시된 바와 같이, IGFBP-4에 비해 IGFBP-5의 PAPP-A 절단에 대한 훨씬 더 적은 억제 활성을 나타냈고(도 4A), 정량적으로 추가 분석하였다(도 4B). 포화 농도의 PAC1에서, PAPP-A는 여전히 IGFBP-5에 대한 약 45% 활성을 나타냈는데, 이는 IGFBP-5에 대한 PAPP-A 활성이 효소-기질 결합과의 직접적 간섭이 아닌 입체 장애에 의해서만 감소되기 때문일 수 있다.
흥미롭게도, IGFBP-4로부터 유래된 합성 펩티드의 PAPP-A 절단(46)은 PAC1에 의해 억제되지 않았다(도 5A 및 B). 그러므로, PAPP-A에 대한 PAC1의 결합은 활성 부위 환경의 변경된 구조를 유발하지 않는다. 이는 상기 펩티드의 절단을 효율적으로 억제한 PAPP-A 모노클로날 항체(rmAb), PA-1A (45)의 억제 성질과 대조적이다(도 5C 및 D). 그러나, mAb PA-1A는 비변형 IGFBP-4(도 6A) 및 IGFBP-5(도 6B) 모두에 대한 열한 억제제이다. 양 경우 모두에서, PAPP-A 활성의 약 40%가 포화 농도의 mAb PA-1A에서 유지되었고, 이는 PAC1로 수득된 IGFBP-4 절단에 대한 효율적 억제와는 현저히 상반된다(도 3B). 가장 가능하게는, mAb PA-1A는 활성 부위에 또는 그 부근에 위치하는 PAPP-A의 에피토프를 인식한다. 이와 일치하게도, mAb PA-1A는 인간 PAPP-A의 C-말단 단편(잔기 1133-1547)에 결합하지 않았다(도시되지 않음).
항체 PAC1 은 LNR3 에 결합하고 칼슘 이온에 의존한다 - IGFBP-4의 쥐 PAPP-A 절단의 효율적 억제가 쥐 PAPP-A와 인간 PAPP-A 간의 높은 서열 보존도와 일치하는, PAC1(도 7A) 및 PAC2(도시되지 않음)에서 나타났다. 그러나, 본 발명자는 PAC1 및 PAC2 모두는 동족 PAPP-A2의 그것의 2개의 알려진 기질, IGFBP-3(도시되지 않음) 및 IGFBP-5(도 7)에 대한 활성에 어떠한 영향도 미치지 않음을 밝혀냈다. 그러므로, PAPP-A에 대한 PAC1의 결합을 설명하기 위해, C-말단의 가변 부분이 PAPP-A2의 서열과 교환된 한 세트의 키메라를 분석하였다. LNR3의 서열이 PAPP-A로부터 유래된 구성물만이 PAC1(도 8A) 및 PAC2(도시되지 않음)의 결합을 나타냈다. 또한, PAC1은 LNR3의 N-말단 측 상에서 절단된 PAPP-A의 돌연변이체로의 어떠한 결합도 나타내지 않았다(도 8A).
PAPP-A의 LNR 모듈이 칼슘 이온과 배위결합하는 것으로 제시되었기 때문에, PAC1 결합에 대한 칼슘 이온의 가능한 의존성을 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 칼슘 이온의 존재 하에 고정화된 PAPP-A에 대한 결합을 평가하였으나(도 8B 및 3C), 샘플 및 유동 세포 모두가 킬레이터 EDTA와 평형화를 이룰 때 결합이 나타나지 않았다(도시되지 않음). 그러나, 결합은 단지 PAC1가 칼슘 이온 함유의 완충액과 평형화된 칩 상으로 EDTA와 함께 주입될 때에만 저해되었다(도 8B). EDTA 처리 후, 칼슘 이온 함유의 완충액을 이용한 유동 세포의 평형화는 PAC1 결합능을 복원하였다(도 8B). 이에 따라, PAPP-A로의 PAC1 결합에는 칼슘 이온이 필요하였고, EDTA에 의한 LNR3으로부터의 칼슘 제거는 가역적 과정이다. PAC2에서도 유사한 결과가 수득되었다(도시되지 않음).
이들 결과에 기초하여, 본 발명자들은, 칼슘 이온과 배위결합하는 것으로 예측되는 3개의 단일 산 잔기가 알라닌과 각기 치환되어 있는 LNR3의 돌연변이체로의 항체 결합을 분석하였다. PAPP-A/PAPP-A2 키메라를 이용한 매핑 데이터 및 표면 플라즈몬 공명 실험 데이터와 일치하게, PAC1 및 PAC2는 이 돌연변이에 대해 비결합을 나타냈다(도 8C).
실시예 2
PAC1 및 PAC2의, C-말단 70 잔기 내의 단일 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환된 인간 PAPP-A의 돌연변이체에 대한 결합:
PAC1 PAC2
D1484A 비결합 비결합
D1499A 비결합 비결합
D1502A 비결합 비결합
K1509A 결합 결합
D1521A 약결합 약결합
D1525A 결합 결합
R1529A 비결합 비결합
D1530A 비결합 비결합
E1535A 결합 결합
실시예 3
인간 PAPP-A의 단편(서열 번호 1)에 대한 PAC5의 결합.
"PA 1-950"은 아미노산 잔기 1-950을 포함하는 PAPP-A의 단편이다. "PA 937-1547"은 아미노산 잔기 937-1547을 포함하는 PAPP-A의 단편이다. "PA 1-599"는 아미노산 잔기 1-599를 포함하는 PAPP-A의 단편이다.
PAPP-A에 결합하는 PAC5의 매핑
PA 1-950 결합
PA 937-1547 비결합
PA 1-599 비결합
SEQUENCE LISTING <110> Aarhus Universitet <120> Targeting of exosite in Pregnancy-Associated Plasma Protein-A <130> P1834 <160> 7 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1547 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Gly Ala Thr Glu Glu Pro Ser Pro Pro Ser Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Phe Ser Gly Arg Gly Glu Gln Leu Arg Val Leu Arg Ala Asp Leu 20 25 30 Glu Leu Pro Arg Asp Ala Phe Thr Leu Gln Val Trp Leu Arg Ala Glu 35 40 45 Gly Gly Gln Arg Ser Pro Ala Val Ile Thr Gly Leu Tyr Asp Lys Cys 50 55 60 Ser Tyr Ile Ser Arg Asp Arg Gly Trp Val Val Gly Ile His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Asp Gln Asp Asn Lys Asp Pro Arg Tyr Phe Phe Ser Leu Lys Thr 85 90 95 Asp Arg Ala Arg Gln Val Thr Thr Ile Asn Ala His Arg Ser Tyr Leu 100 105 110 Pro Gly Gln Trp Val Tyr Leu Ala Ala Thr Tyr Asp Gly Gln Phe Met 115 120 125 Lys Leu Tyr Val Asn Gly Ala Gln Val Ala Thr Ser Gly Glu Gln Val 130 135 140 Gly Gly Ile Phe Ser Pro Leu Thr Gln Lys Cys Lys Val Leu Met Leu 145 150 155 160 Gly Gly Ser Ala Leu Asn His Asn Tyr Arg Gly Tyr Ile Glu His Phe 165 170 175 Ser Leu Trp Lys Val Ala Arg Thr Gln Arg Glu Ile Leu Ser Asp Met 180 185 190 Glu Thr His Gly Ala His Thr Ala Leu Pro Gln Leu Leu Leu Gln Glu 195 200 205 Asn Trp Asp Asn Val Lys His Ala Trp Ser Pro Met Lys Asp Gly Ser 210 215 220 Ser Pro Lys Val Glu Phe Ser Asn Ala His Gly Phe Leu Leu Asp Thr 225 230 235 240 Ser Leu Glu Pro Pro Leu Cys Gly Gln Thr Leu Cys Asp Asn Thr Glu 245 250 255 Val Ile Ala Ser Tyr Asn Gln Leu Ser Ser Phe Arg Gln Pro Lys Val 260 265 270 Val Arg Tyr Arg Val Val Asn Leu Tyr Glu Asp Asp His Lys Asn Pro 275 280 285 Thr Val Thr Arg Glu Gln Val Asp Phe Gln His His Gln Leu Ala Glu 290 295 300 Ala Phe Lys Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Asp Val Leu Glu Val 305 310 315 320 Ser Asn Ser Ser Leu Arg Arg Arg Leu Ile Leu Ala Asn Cys Asp Ile 325 330 335 Ser Lys Ile Gly Asp Glu Asn Cys Asp Pro Glu Cys Asn His Thr Leu 340 345 350 Thr Gly His Asp Gly Gly Asp Cys Arg His Leu Arg His Pro Ala Phe 355 360 365 Val Lys Lys Gln His Asn Gly Val Cys Asp Met Asp Cys Asn Tyr Glu 370 375 380 Arg Phe Asn Phe Asp Gly Gly Glu Cys Cys Asp Pro Glu Ile Thr Asn 385 390 395 400 Val Thr Gln Thr Cys Phe Asp Pro Asp Ser Pro His Arg Ala Tyr Leu 405 410 415 Asp Val Asn Glu Leu Lys Asn Ile Leu Lys Leu Asp Gly Ser Thr His 420 425 430 Leu Asn Ile Phe Phe Ala Lys Ser Ser Glu Glu Glu Leu Ala Gly Val 435 440 445 Ala Thr Trp Pro Trp Asp Lys Glu Ala Leu Met His Leu Gly Gly Ile 450 455 460 Val Leu Asn Pro Ser Phe Tyr Gly Met Pro Gly His Thr His Thr Met 465 470 475 480 Ile His Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu Tyr His Val Phe Arg Gly 485 490 495 Ile Ser Glu Ile Gln Ser Cys Ser Asp Pro Cys Met Glu Thr Glu Pro 500 505 510 Ser Phe Glu Thr Gly Asp Leu Cys Asn Asp Thr Asn Pro Ala Pro Lys 515 520 525 His Lys Ser Cys Gly Asp Pro Gly Pro Gly Asn Asp Thr Cys Gly Phe 530 535 540 His Ser Phe Phe Asn Thr Pro Tyr Asn Asn Phe Met Ser Tyr Ala Asp 545 550 555 560 Asp Asp Cys Thr Asp Ser Phe Thr Pro Asn Gln Val Ala Arg Met His 565 570 575 Cys Tyr Leu Asp Leu Val Tyr Gln Gly Trp 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Pro Leu Cys Leu Gln 785 790 795 800 Cys Lys Pro Leu Lys Tyr Lys Val Val Arg Asp Pro Pro Leu Gln Met 805 810 815 Asp Val Ala Ser Ile Leu His Leu Asn Arg Lys Phe Val Asp Met Asp 820 825 830 Leu Asn Leu Gly Ser Val Tyr Gln Tyr Trp Val Ile Thr Ile Ser Gly 835 840 845 Thr Glu Glu Ser Glu Pro Ser Pro Ala Val Thr Tyr Ile His Gly Arg 850 855 860 Gly Tyr Cys Gly Asp Gly Ile Ile Gln Lys Asp Gln Gly Glu Gln Cys 865 870 875 880 Asp Asp Met Asn Lys Ile Asn Gly Asp Gly Cys Ser Leu Phe Cys Arg 885 890 895 Gln Glu Val Ser Phe Asn Cys Ile Asp Glu Pro Ser Arg Cys Tyr Phe 900 905 910 His Asp Gly Asp Gly Val Cys Glu Glu Phe Glu Gln Lys Thr Ser Ile 915 920 925 Lys Asp Cys Gly Val Tyr Thr Pro Gln Gly Phe Leu Asp Gln Trp Ala 930 935 940 Ser Asn Ala Ser Val Ser His Gln Asp Gln Gln Cys Pro Gly Trp Val 945 950 955 960 Ile Ile Gly Gln Pro Ala Ala Ser Gln Val Cys Arg Thr Lys Val Ile 965 970 975 Asp Leu Ser Glu Gly Ile Ser Gln His Ala Trp Tyr Pro Cys Thr Ile 980 985 990 Ser Tyr Pro Tyr Ser Gln Leu Ala Gln Thr Thr Phe Trp Leu Arg Ala 995 1000 1005 Tyr Phe Ser Gln Pro Met Val Ala Ala Ala Val Ile Val His Leu 1010 1015 1020 Val Thr Asp Gly Thr Tyr Tyr Gly Asp Gln Lys Gln Glu Thr Ile 1025 1030 1035 Ser Val Gln Leu Leu Asp Thr Lys Asp Gln Ser His Asp Leu Gly 1040 1045 1050 Leu His Val Leu Ser Cys Arg Asn Asn Pro Leu Ile Ile Pro Val 1055 1060 1065 Val His Asp Leu Ser Gln Pro Phe Tyr His Ser Gln Ala Val Arg 1070 1075 1080 Val Ser Phe Ser Ser Pro Leu Val Ala Ile Ser Gly Val Ala Leu 1085 1090 1095 Arg Ser Phe Asp Asn Phe Asp Pro Val Thr Leu Ser Ser Cys Gln 1100 1105 1110 Arg Gly Glu Thr Tyr Ser Pro Ala Glu Gln Ser Cys Val His Phe 1115 1120 1125 Ala Cys Glu Lys Thr Asp Cys Pro Glu Leu Ala Val Glu Asn Ala 1130 1135 1140 Ser Leu Asn Cys Ser Ser Ser Asp Arg Tyr His Gly Ala Gln Cys 1145 1150 1155 Thr Val Ser Cys Arg Thr Gly Tyr Val Leu Gln Ile Arg Arg Asp 1160 1165 1170 Asp Glu Leu Ile Lys Ser Gln Thr Gly Pro Ser Val Thr Val Thr 1175 1180 1185 Cys Thr Glu Gly Lys Trp Asn Lys Gln Val Ala Cys Glu Pro Val 1190 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165 170 175 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 195 200 205 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Ile 210 215 220 Ala Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 225 230 235 240 Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu 245 250 255 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 265

Claims (224)

  1. 서열 번호 2 또는 서열 번호 3으로 이루어진 단리된 폴리펩티드, 또는 서열 번호 3의 28개 이상의 연속 아미노산 잔기를 함유하는 서열 번호 3의 단편으로 이루어진 폴리펩티드, 또는 이들의 산부가염으로서, 상기 폴리펩티드는 PAPP-A에 결합하여 이의 활성을 억제하는 항체 또는 항체의 단편에 결합할 수 있는 것인 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 블록킹기를 더 포함하는 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항의 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계 및 비인간 숙주 유기체의 생체 내에서 또는 시험관 내에서 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 제1항의 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  4. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 경우에 따라서 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것인 발현 벡터.
  6. 제1항의 폴리펩티드, 제4항의 폴리뉴클레오티드 및 제5항의 발현 벡터 중 하나 이상을 포함하는 단리된 재조합 또는 트랜스제닉 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포, 진균 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 식물 세포, 또는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, 인간 배아 신장 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, 개 신장 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 래트 뇌하수체 세포, HeLa S3 세포, 래트 간세포, SV40-형질전환 원숭이 신장 세포 및 쥐 배아 세포로 이루어진 군에서 선택된 포유동물 세포인 것인 숙주 세포.
  7. 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 결합 단편은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편의 결합은 C-말단 PAPP-A LNR 모듈에 가역적으로 결합한 칼슘 이온에 의존성인 것인 항체 또는 이의 결합 단편.
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