KR101690821B1 - 과분극화된 １３ｃ-프럭토즈를 사용하는 １３ｃ-자기 공명 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 영상화 매질을 사용하는 ¹³C-MR 검출 방법, 및 상기 방법에 사용하기 위한, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 함유하는 영상화 매질에 관한 것이다.

Description

과분극화된 １３Ｃ-프럭토즈를 사용하는 １３Ｃ-자기 공명 검출 방법{13C-MR DETECTION USING HYPERPOLARISED 13C-FRUCTOSE}

본 발명은, 과분극화된(hyperpolarised) ¹³C-프럭토즈를 포함하는 영상화 매질(imaging medium)을 사용하는 ¹³C-자기 공명(MR) 검출 방법, 및 상기 방법에 사용하기 위한, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 함유하는 영상화 매질에 관한 것이다.

자기 공명(MR) 영상화(MRI)는 비-침습적인 방식으로 또한 환자와 의료 요원을 X-선 같은 유해할 수 있는 방사선에 노출시키지 않으면서 환자의 신체 또는 그 일부의 영상을 수득할 수 있기 때문에 의사에게 특히 흥미를 끌고 있는 기법이다. 높은 품질의 영상 및 우수한 공간상 및 시간상 해상도 때문에, MRI는 연질 조직 및 기관을 영상화하기에 유리한 영상화 기법이다.

MRI는 MR 콘트라스트제를 사용하거나 사용하지 않고서 수행될 수 있다. 그러나, 콘트라스트-향상된 MRI는 통상 훨씬 더 작은 조직 변화의 검출을 가능케 하며, 이로 인해 예컨대 작은 종양 또는 전이 같은 초기 단계의 조직 변화를 검출하기 위한 강력한 도구가 된다.

몇 가지 유형의 콘트라스트제가 MRI에 사용되어 왔다. 수용성 상자성(paramagnetic) 금속 킬레이트, 예를 들어 옴니스캔(Omniscan)™[지이 헬쓰케어(GE Healthcare)] 같은 가돌리늄 킬레이트가 널리 사용되는 MR 콘트라스트제이다. 이들의 낮은 분자량 때문에, 이들은 맥관 구조 내로 투여될 때 세포외 공간(즉, 혈액 및 간질) 내로 신속하게 분포된다. 이들은 또한 신체로부터 비교적 신속하게 제거된다.

반면 혈액 풀(pool) MR 콘트라스트제, 예를 들어 초상자성 산화철 입자는 장기간동안 맥관 구조 내에 보유된다. 이들은 간에서 콘트라스트를 향상시킬 뿐만 아니라 모세관 투과성 이상, 예를 들어 종양 혈관 신생의 결과인 종양에서의 "새기 쉬운" 모세관 벽을 검출하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다.

WO-A-99/35508 호는 MRI 콘트라스트제로서 고 T₁ 약제의 과분극화된 용액을 사용하는 환자의 MR 조사 방법을 개시한다. 용어 "과분극화"는 고 T₁ 약제에 존재하는 NMR 활성 핵, 즉 0이 아닌 핵 스핀을 갖는 핵, 바람직하게는 ¹³C- 또는 ¹⁵N-핵의 핵 분극을 향상시킴을 의미한다. NMR 활성 핵의 핵 분극화를 향상시킬 때, 이들 핵의 여기 핵 스핀 상태 및 기저 핵 스핀 상태 사이의 개체수 차이가 상당히 증가하고, 이에 의해 MR 신호 강도가 100 이상의 계수만큼 증폭된다. 과분극화된 ¹³C- 및/또는 ¹⁵N-농축된 고 T₁ 약제를 사용하는 경우에는, ¹³C 및/또는 ¹⁵N의 자연 존재비가 무시될 정도이며, 따라서 영상 콘트라스트가 유리하게 높기 때문에, 배경 신호로부터의 간섭이 본질적으로 없다. 종래의 MRI 콘트라스트제와 이들 과분극화된 고 T₁ 약제의 주된 차이는, 전자의 경우에는 신체에서 물 양성자의 이완 시간에 영향을 끼침으로써 콘트라스트의 변화를 야기하는 반면, 후자의 약제 부류는 얻어지는 신호가 오로지 약제로부터만 발생되기 때문에 비-방사성 트레이서로서 간주될 수 있다는 것이다.

비-내인성 화합물 및 내인성 화합물을 비롯한, MR 영상화제로서 사용할 수 있는 다양한 고 T₁ 약제가 WO-A-99/35508 호에 개시되어 있다. 후자의 예로서, 영상화 대사 활성 면에서 바람직한 것으로 기재되는 정상적인 대사 사이클에서의 중간체가 언급되어 있다. 대사 활성의 생체내 영상화에 의해, 조직의 대사 상태의 정보를 수득할 수 있으며, 예컨대 건강한 조직 및 병에 걸린 조직을 구별하는데 상기 정보를 사용할 수 있다.

예를 들어, 피루베이트는 시트르산 사이클에서 역할을 담당하는 화합물이고, 인간 신체에서의 대사 과정의 생체내 MR 연구에 과분극화된 ¹³C-피루베이트의 그의 대사산물인 과분극화된 ¹³C-락테이트, 과분극화된 ¹³C-바이카본에이트 및 과분극화된 ¹³C-알라닌으로의 전환을 사용할 수 있다. 예를 들어 WO-A-2006/011810 호에 상세하게 기재되어 있는 바와 같은 생체내 종양 영상화 및 WO-A-2006/054903 호에 상세하게 기재되어 있는 바와 같은 MR 영상화에 의한 심근 조직의 생육력 평가를 위한 MR 영상화제로서 과분극화된 ¹³C-피루베이트를 사용할 수 있다.

과분극화된 ¹³C-피루베이트의 그의 대사산물인 과분극화된 ¹³C-락테이트, 과분극화된 ¹³C-바이카본에이트 및 과분극화된 ¹³C-알라닌으로의 대사 전환을, 인간 신체에서의 대사 과정의 생체내 MR 연구를 위해 이용할 수 있는데, 이는 상기 전환이 모화합물, 즉 과분극화된 ¹³C-피루베이트, 및 그의 대사산물로부터의 신호 검출을 가능케 할 정도로 충분히 빠른 것으로 밝혀졌기 때문이다. 알라닌, 바이카본에이트 및 락테이트의 양은 연구되는 조직의 대사 상태에 따라 달라진다. 과분극화된 ¹³C-락테이트, 과분극화된 ¹³C-바이카본에이트 및 과분극화된 ¹³C-알라닌의 MR 신호 강도는 이들 화합물의 양 및 검출시 남겨지는 분극화도에 관련되는 바, 과분극화된 ¹³C-피루베이트의 과분극화된 ¹³C-락테이트, 과분극화된 ¹³C-바이카본에이트 및 과분극화된 ¹³C-알라닌으로의 전환을 모니터링함으로써, 비-침습성 MR 영상화 또는 MR 분광법을 이용함에 의해 인간 또는 인간이 아닌 동물 신체에서 대사 과정을 생체내 연구할 수 있다. 신호 감쇠가 T₁ 이완에 의존하는 과분극화된 핵의 한정된 수명 때문에, 카복실화된 탄소가 대사 과정 연구용 영상화제의 개발을 위한 주요 표적이 되어 왔다. 부착된 양성자가 없고 양극성 교차 이완의 결과로서 이완을 한정하는 카본일 탄소는 자기장 강도에 따라 40 내지 60초 정도의 T₁으로 레이블 및 분극화하는 표준 물질이 되어 왔다. 그러나, 동위원소 농축되고 카본일 탄소에서 과분극화된 영상화제의 사용은 상류 당분해 과정의 조사를 어렵게 하는데, 상기 상류 당분해 과정은 암 대사뿐만 아니라 지방간 질병 및 당뇨병 같은 다른 대사 이상에도 관련되어 있다. 다수의 해당 분자가 카본일 탄소를 통해 분극화되어 관찰되었지만, 많은 수의 중요한 대사 중간체는 카본일을 함유하지 않는다. 따라서, 보충적인 대사 정보를 제공하는 영상화제가 탐구되어 왔다.

최근 놀랍게도 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 영상화제로서 사용할 수 있는 것으로 확인되었다.

5원 및 6원 고리의 이성질체 혼합물로서 발생되는 프럭토즈는 그의 가장 안정한 이성질체로서 C2 위치에 헤미케탈을 갖는 β-프럭토피라노즈를 갖는다. 프럭토즈는 헥소키나제 또는 프럭토키나제를 통해 당분해에 들어갈 수 있다. 헥소키나제를 통한 포스포릴화된 프럭토즈-6-포스페이트로의 1단계 대사는 당분해의 제 1 단계와 유사한데, 여기에서는 글루코즈가 포스포릴화되어 글루코즈-6-포스페이트로 된다. 세포에서 프럭토즈-6-포스페이트로의 대사 흐름(flux)은 하류의 당분해 대사 경과뿐만 아니라 펜토즈 포스페이트 경로(PPP)의 활성에 관련된다. PPP는 우세한 양의 뉴클레오타이드 합성(이는 높은 전환 속도에서 증가됨)을 담당하며, 암 세포에서 NADPH의 재생의 공급원이어서 이들을 산화 스트레스에 대해 더욱 내성이 되도록 하고 이들이 글루타티온을 재보충할 수 있도록 하는 것으로 가정하였다. 뿐만 아니라, 프럭토즈의 대사는 비-알콜성 지방간(NASH) 및 특이 유형의 암의 발병기전에 연루되어 있다. 프럭토즈는 또한 프럭토키나제를 통해(간에서 주로 이루어지는 반응) 프럭토즈-1-포스페이트로 대사될 수도 있다. 간 흡수는 프럭토즈에 대해 상대적인 특이성을 나타내는 GLUT5 수송자(transporter)를 통한다. 이 수송자의 발현은 간 외 조직에서의 질병에 대한 중요한 생체 지표일 수 있다. 예를 들어, 인간의 프럭토즈 수송자인 GLUT5는 유방암 세포주에서 고도로 발현되지만 정상적인 유방 조직에서는 그렇지 않다. 프럭토즈와 전립선에서의 양성 암 조직 사이의 관계도 밝혀졌다. 따라서, 영상화제로서 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 사용함으로써 대사 활성을 평가할 수 있으며, ¹³C 피루베이트 같은 공지의 과분극화된 ¹³C-MR 영상화제에 비해 프럭토즈에 대해 상이한 흡수 메카니즘이 있기 때문에, 추가적인 대사 정보를 수득할 수 있고 새로운 용도가 가능해진다.

도 1은, GLUT5에 의한 수송의 메카니즘 및 헥소키나제에 의한 프럭토즈로부터 프럭토푸라노즈-6-포스페이트로의 대사의 제 1 단계를 도시한 것이다.
도 2의 (a)는 프럭토즈의 자연 존재비 스펙트럼이고 (b)는 [2-¹³C]-프럭토즈의 DNP 스펙트럼이다. DNP 스펙트럼에서는 선형이 나타나지만, 매우 낮은 수준에서는 열 스펙트럼과 유사하다. (상부에서) 각 이성질체의 구조가 이들의 유사한 공명과 함께 도시된다.
도 3의 (a)는, 헥소키나제 400U와 반응한 프럭토즈의 스펙트럼으로서, 확대된(zoomed) 영역에서는 프럭토즈 및 프럭토즈-6-포스페이트에 상응하는 공명을 도시한 것이다. 도 3의 (b)는, 헥소키나제와의 반응 5초 후의 동적 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 3의 (c)는, DNP한지 평균 85분 후 헥소키나제를 갖는 동일한 용액의 열 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4의 (a)는, 중간-후기 단계의 유전자 이식 모델(TRAMP) 마우스 전립선 종양의 T₂ 강조 영상이다. 도 4의 (b)는, 프럭토즈 주입으로부터의 대사의 결과로서, 프럭토즈 및 β-프럭토피라노즈 및 복합체 β-프럭토푸라노즈-6-포스페이트 및 β-프럭토푸라노즈에 상응하는 공명을 도시한 것이다. 도 4의 (c)는, 동일한 마우스에서 과분극화된 피루베이트를 수득한 후 동일한 위치로부터의 피루베이트 및 락테이트 공명을 도시한 것이다.
도 5는, 주위의 양성 조직과 비교하여 종양 내에서의 프럭토즈의 차별적인 흡수 및 대사를 보여주는, TRAMP 마우스의 ¹³C 분광 영상을 도시한 것이다. β-프럭토피라노즈 및 복합체 β-프럭토푸라노즈-6-포스페이트 및 β-프럭토푸라노즈에 상응하는 공명이 도시된다. 밝은 회색 구역은 양성의 어두운 회색 구역(마우스 전립선의 다른 엽)과 비교하여 확산성 종양 영역을 나타낸다.

따라서, 제 1 요지에서 본 발명은, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 영상화 매질을 사용하는 ¹³C-MR 검출 방법을 제공한다.

용어 "영상화 매질"은, MR 활성제, 즉 영상화제로서 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 액체 조성물을 나타낸다. 본 발명에 따른 영상화 매질을 ¹³C-MR 검출 방법에서 영상화 매질로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 ¹³C-MR 검출 방법에 사용하기 위한, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 영상화 매질이다.

본 발명의 방법에 사용되는 영상화 매질을 생체내(즉, 살아있는 인간 또는 인간이 아닌 동물 내에서의) ¹³C-MR 검출용 영상화 매질로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 사용되는 영상화 매질은 시험관내(예를 들어, 세포 배양액, 예컨대 뇨, 침 또는 혈액 같은 신체 샘플, 생체외 조직, 예컨대 생검으로부터 수득되는 생체외 조직 또는 단리된 기관에서의) ¹³C-MR 검출용 영상화 매질로서 사용될 수 있다.

용어 "¹³C-MR 검출"은, ¹³C-MR 영상화 또는 ¹³C-MR 분광법 또는 조합된 ¹³C-MR 영상화와 ¹³C-MR 분광법, 즉 ¹³C-MR 분광 영상화를 나타낸다. 이 용어는 또한 다양한 시점에서의 ¹³C-MR 분광 영상화를 가리킨다.

분자식 C₆H₁₂O₆를 갖는 프럭토즈는 또한 D-아라비노-헥술로즈, 과당, 베타-레불로즈 및 레불로즈로도 불린다. 프럭토즈는 다수의 과일, 채소 및 꿀에서 발생되는 매우 달콤한 당이며, 식료품용 보존제로서 또한 정맥내 영양제로서 사용된다. 프럭토즈는 케톤 작용기를 갖는 단당류이다. 프럭토즈는 글루코즈의 이성질체이다. 용액에 용해되는 경우, 이는 글루코즈와 유사한 고리 구조를 형성하는데, 이는 환상 헤미케탈로 분류된다. 프럭토즈는 2개의 헤미케탈 이성질체, 즉 프럭토푸라노즈로 불리는 5원 고리 및 프럭토피라노즈로 불리는 6원 고리를 가지며, 이 때 피라노즈 형태가 가장 안정한 이성질체이다. 두 형태가 모두 아래에 도시된다. 프럭토즈는 시판되고 있는 화합물이다. 프럭토즈는 내약성이 매우 우수하며, 영상화제로서 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 사용하는 것은 안전성의 관점에서 유리하다.

용어 "프럭토즈"는, 달리 명시되지 않는 한 α 또는 β 형태의 프럭토푸라노즈 또는 프럭토피라노즈의 D-이성질체 또는 이들의 혼합물을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 영상화 매질은 과분극화된 ¹³C-α-D- 또는 ¹³C-β-D-프럭토피라노즈 또는 ¹³C-α-D- 또는 ¹³C-β-D-프럭토푸라노즈 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 과분극화된 ¹³C-프럭토즈의 동위원소 농축은 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상이며, 90%가 넘는 동위원소 농축이 가장 바람직하다. 이상적으로, 농축은 100%이다. 본 발명의 영상화 매질 및 방법에 사용되는 ¹³C-프럭토즈는 C2-위치에서 동위원소 농축된다(즉, [2-¹³C]-프럭토즈). 이는 *가 ¹³C-라벨을 나타내는 상기 구조에 도시되어 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 영상화 매질은 과분극화된 [2-¹³C]-프럭토즈를 포함한다.

용어 "과분극화된"과 "분극화된"은, 이후 상호교환적으로 사용되며, 0.1%를 넘는, 더욱 바람직하게는 1%를 넘는, 가장 바람직하게는 10%를 넘는 핵 분극화도를 가리킨다.

화학적 이동의 이방성 때문에, 카본일 탄소는 T₁에서 감소되는 경향이 있어서 자기장이 높을수록 보다 빠른 분극화 감쇠를 야기한다. 이 행태는 프럭토즈의 헤미케탈에 대해서는 유지되지 못하여, 자기장 강도에 따른 T₁의 연장을 나타낸다. 11.7T에서 15 내지 16초, 또한 3T에서 13 내지 14초의 이완 시간을 달성하였다. 그 이유는, 프럭토즈의 이완이 이웃하는 양성자로부터의 양극성 이완에 의해 지배되기 때문이다. 이에도 불구하고, 프럭토즈의 C₂는 과분극화된 분광법의 시간 규모에서 대사 정보를 제공하기에 충분히 긴 이완 시간을 갖는다.

양성자에 직접 결합한 C-1 및 C-3을 선택적으로 중수소화시킴으로써 T₁을 연장시켜 신호-대-노이즈 비 또는 영상화 윈도우를 추가로 증가시킬 수 있다.

고체 과분극화된 ¹³C-프럭토즈, 예를 들어 ¹³C-프럭토즈의 동적 핵 분극화(DNP)에 의해 수득되는 고체 과분극화된 ¹³C-프럭토즈에서의 고체 상태 ¹³C-NMR 측정에 의해 분극화도를 결정할 수 있다. 고체 상태 ¹³C-NMR 측정은 바람직하게는 낮은 숙임각(flip angle)을 이용하는 단일 펄스-획득 NMR 시퀀스(simple pulse-acquire NMR sequence)로 구성된다. NMR 스펙트럼에서의 과분극화된 ¹³C-프럭토즈의 신호 강도를 분극화 과정 전에 획득된 NMR 스펙트럼에서의 ¹³C-프럭토즈의 신호 강도와 비교한다. 이어, 분극화 전후의 신호 강도의 비로부터 분극화도를 계산한다.

유사한 방식으로, 용해된 과분극화된 ¹³C-프럭토즈의 분극화도를 액체 상태 NMR 측정에 의해 결정할 수 있다. 다시, 용해된 과분극화된 ¹³C-프럭토즈의 신호 강도를 분극화 전(또는 분극화가 열평형 수준으로 회복된 후)의 용해된 ¹³C-프럭토즈의 신호 강도와 비교한다. 이어, 분극화 전후의 ¹³C-프럭토즈의 신호 강도의 비로부터 획득되는 분극화도를 계산한다.

예를 들어 WO-A-98/30918 호, WO-A-99/24080 호 및 WO-A-99/35508 호에 기재되어 있고 모두 본원에 참고로 인용되어 있는 상이한 방법에 의해 NMR 활성 ¹³C-핵의 과분극화를 달성할 수 있다. 당 업계에 공지되어 있는 과분극화 방법은 불활성 기체로부터의 분극화 전달, "전수 조사(brute force)", 스핀 냉동(spin refrigeration), 파라 수소 방법 및 동적 핵 분극화(DNP)이다.

과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 수득하는 한 가지 방법은 WO-A-98/30918 호에 기재되어 있는 과분극화된 불활성 기체로부터의 분극화 전달이다. 원형 편광을 사용함으로써, 0이 아닌 핵 스핀을 갖는 불활성 기체를 과분극화시킬 수 있다. 과분극화된 불활성 기체, 바람직하게는 He 또는 Xe, 또는 이들 기체의 혼합물을 사용하여, ¹³C-핵의 과분극화를 수행할 수 있다. 과분극화된 기체는 기상일 수 있거나, 이는 액체/용매에 용해될 수 있거나, 또는 과분극화된 기체 자체가 용매로서의 역할을 할 수 있다. 다르게는, 기체를 냉각된 고체 표면 상으로 응축시켜 이 형태로 사용할 수 있거나, 또는 승화시킬 수 있다. 과분극화된 기체와 ¹³C-프럭토즈의 긴밀한 혼합이 바람직하다.

과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 수득하는 다른 방법은 극저온 및 높은 자기장에서 열역학적 평형에 의해 ¹³C-핵에 분극화를 부과하는 것이다. 매우 높은 자기장 및 극저온을 이용함으로써(전수 조사) NMR 분광계의 작동 자기장 및 온도에 대한 과분극화를 수행한다. 이용되는 자기장 강도는 가능한 한 높아야 하는데, 적합하게는 1T보다 높고, 바람직하게는 5T보다 높으며, 더욱 바람직하게는 15T 이상, 특히 바람직하게는 20T 이상이어야 한다. 온도는 매우 낮아야 하는데, 예컨대 4.2K 이하, 바람직하게는 1.5K 이하, 더욱 바람직하게는 1.0K 이하, 특히 바람직하게는 100mK 이하여야 한다.

과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 수득하는 또 다른 방법은 스핀 냉동 방법이다. 이 방법은 스핀 냉동 분극화에 의한 고체 화합물 또는 시스템의 스핀 분극화를 포괄한다. 시스템을 Ni²⁺, 3차수 이상의 대칭 축을 갖는 란타나이드 또는 악티나이드 이온 같은 적합한 결정질의 상자성 물질로 도핑하거나 상기 물질과 긴밀하게 혼합한다. 공명 여기장이 인가되지 않기 때문에 균일한 자기장이 필요하지 않아 DNP에 대해 요구되는 것보다 기구가 더 간단하다. 자기장 방향과 수직인 축 둘레로 샘플을 물리적으로 회전시킴으로써 공정을 수행한다. 이 방법의 선행 조건은 상자성 물질이 고도로 이방성인 g-계수를 갖는 것이다. 샘플 회전의 결과, 전자 상자기 공명이 핵 스핀과 접촉하게 되어 핵 스핀 온도를 감소시키게 된다. 핵 스핀 분극화가 새로운 평형상태에 도달할 때까지 샘플 회전을 수행한다.

바람직한 실시양태에서는, DNP(동적 핵 분극화)를 이용하여 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 수득한다. DNP에서는, 분극화제 또는 소위 DNP제, 즉 쌍을 이루지 않은 전자를 포함하는 화합물에 의해, 분극화되어야 하는 화합물의 MR 활성 핵의 분극화를 수행한다. DNP 공정 동안, 통상 극초단파 형태의 에너지가 제공되며, 이 에너지는 처음에는 DNP제를 여기시키게 된다. 기저 상태로의 감쇠시, DNP제의 쌍을 이루지 않은 전자로부터, 분극화되어야 하는 화합물의 NMR 활성 핵으로, 예컨대 ¹³C-프럭토즈의 ¹³C 핵으로 분극화가 전달된다. DNP 방법에 의해 화학적 물질, 즉 화합물을 분극화시키기 위해서는, 분극화되어야 하는 화합물과 DNP제를 포함하는 조성물을 제조하고, 이어 이를 냉동시킨 후 분극화를 위해 DNP 분극화기 내로 삽입한다. 분극화 후, 냉동된 고체 과분극화된 조성물을 용융시킴으로써 또는 적합한 용해 매질에 용해시킴으로써 이를 액체 상태로 신속하게 변화시킨다. 용해가 바람직하고, 따라서 냉동된 과분극화된 조성물의 용해 공정 및 적합한 장치가 WO-A-02/37132 호에 상세하게 기재되어 있다. 용융 공정 및 용융에 적합한 장치는 예를 들어 WO-A-02/36005 호에 기재되어 있다.

분극화되어야 하는 화합물에서 높은 분극화도를 수득하기 위하여, 상기 화합물과 DNP제를 DNP 공정동안 긴밀하게 접촉시킬 필요가 있다. 조성물이 냉동 또는 냉각될 때 결정화되는 경우에는 그렇지 않다. 결정화를 피하기 위하여, 유리 형성제를 조성물에 포함시킬 수 있다. 유리 형성제가 필요한 가능성에 영향을 주는 인자는 용액중 프럭토즈의 농도, 또는 다른 약제가 프럭토즈와 함께 동시 분극화되어야 하는지의 여부이다. DNP에 의한 ¹³C-프럭토즈의 과분극화를 위해, ¹³C-프럭토즈 및 DNP제를 포함하는 조성물을 제조한다.

DNP제는 그의 선택이 ¹³C-프럭토즈에서 달성될 수 있는 분극화도에 큰 영향을 갖기 때문에 DNP 공정에서 결정적인 역할을 한다. "OMRI 콘트라스트제"로 표시된 WO-A-99/35508 호의 다양한 DNP제가 공지되어 있다. WO-A-99/35508 호, WO-A-88/10419 호, WO-A-90/00904 호, WO-A-91/12024 호, WO-A-93/02711 호 또는 WO-A-96/39367 호에 기재되어 있는 산소-계, 황-계 또는 탄소-계의 안정한 트리틸 라디칼을 사용하면 다양한 상이한 샘플에서 높은 분극화도를 생성시켰다.

바람직한 실시양태에서는, DNP에 의해 본 발명의 방법에 사용되는 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 수득하며, 사용되는 DNP제는 트리틸 라디칼이다. 상기에서 간략하게 언급한 바와 같이, 전자 라모(Larmor) 진동수에 가까운 극초단파 조사를 통해, DNP제, 즉 트리틸 라디칼의 큰 전자 스핀 분극화가 ¹³C-프럭토즈의 ¹³C 핵의 핵 스핀 분극화로 전환된다. 극초단파는 e-e 및 e-n 전이를 통해 전자 스핀 시스템과 핵 스핀 시스템 사이의 연통을 자극한다. 효과적인 DNP를 위해, 즉 ¹³C-프럭토즈에서 높은 분극화도를 달성하기 위하여, 트리틸 라디칼은 이들 화합물에서 안정하고 가용성이어서 ¹³C-프럭토즈와 트리틸 라디칼 사이의 긴밀한 접촉(이는 상기 전자 스핀 시스템과 핵 스핀 시스템 사이의 연통에 필요함)을 달성해야 한다.

바람직한 실시양태에서, 트리틸 라디칼은 하기 화학식 1의 라디칼이다:

상기 식에서,

M은 수소 또는 1가의 양이온이고;

R1은, 동일하거나 상이하며, 하나 이상의 하이드록실기에 의해 임의적으로 치환되는 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₆-알킬기, 또는 기 -(CH₂)_n-X-R2이며;

n은 1, 2 또는 3이고;

X는 O 또는 S이고;

R2는, 하나 이상의 하이드록실기에 의해 임의적으로 치환되는 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₄-알킬기이다.

바람직한 실시양태에서, M은 수소 또는 1가의 생리학적으로 허용가능한 양이온이다. 용어 "생리학적으로 허용가능한 양이온"은, 인간 또는 인간이 아닌 동물 신체에 의해 허용되는 양이온을 가리킨다. 바람직하게는, M은 수소 또는 알칼리 양이온, 암모늄 이온 또는 유기 아민 이온, 예컨대 메글루민이다. 가장 바람직하게는, M은 수소 또는 나트륨이다.

R1은 바람직하게는 동일하고, 더욱 바람직하게는 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₄-알킬기, 가장 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 아이소프로필이거나; 또는 R1은 바람직하게는 동일하고, 더욱 바람직하게는 1개의 하이드록실기에 의해 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₄-알킬기, 가장 바람직하게는 -CH₂-CH₂-OH이거나; 또는 R1은 바람직하게는 동일하고, -CH₂-OCH₃, -CH₂-OC₂H₄OH, -CH₂-OC₂H₅, -CH₂-CH₂-OCH₃, -CH₂-SCH₃, -CH₂-SC₂H₅ 또는 -CH₂-CH₂-SCH₃, 가장 바람직하게는 -CH₂-CH₂-OCH₃이다.

특히 바람직한 실시양태에서, X는 O이고, M은 알칼리 양이온, 가장 바람직하게는 나트륨이고, R1은 -CH₂-CH₂-OCH₃이다.

상기 화학식 1의 트리틸 라디칼은 WO-A-88/10419 호, WO-A-90/00904 호, WO-A-91/12024 호, WO-A-93/02711 호, WO-A-96/39367 호, WO-A-97/09633 호, WO-A-98/39277 호 및 WO-A-2006/011811 호에 상세하게 기재되어 있는 바와 같이 합성될 수 있다.

DNP 공정을 위해, 출발 물질 ¹³C-프럭토즈(하기에서는 "샘플"이라고 함)와 DNP제, 바람직하게는 트리틸 라디칼, 더욱 바람직하게는 화학식 1의 트리틸 라디칼의 용액을 제조한다. 용매 또는 용매 혼합물을 사용하여 DNP제의 샘플 중으로의 용해를 촉진할 수 있다. 그러나, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 생체내 ¹³C-MR 검출용 영상화제로서 사용하고자 하는 경우에는, 용매의 양을 최소량으로 유지하거나 또는 가능한 경우 용매의 사용을 피하는 것이 바람직하다. 생체내 영상화제로서 사용하기 위해서는, 분극화된 ¹³C-프럭토즈를 통상 비교적 고농도로 투여한다. 즉, 고도로 농축된 샘플을 DNP 공정에 바람직하게 사용하며, 따라서 용매의 양은 바람직하게는 최소량으로 유지한다. 이와 관련하여, 샘플을 함유하는 조성물, 즉 DNP제, 샘플 및 필요한 경우 용매의 질량을 가능한 한 작게 유지함을 언급하는 것이 또한 중요하다. 예를 들어 ¹³C-MR 검출용 영상화제로서 사용하기 위하여 DNP 공정 후 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 함유하는 고체 조성물을 액체 상태로 전환시키는데 용해가 이용되는 경우에는, 높은 질량이 용해 공정의 효율에 부정적인 영향을 갖게 된다. 이는, 용해 공정에서의 소정 부피의 용해 매질에 있어서, 조성물의 질량이 증가하면 조성물의 질량 대 용해 매질의 비가 감소된다는 사실 때문이다. 또한, 특정 용매를 사용하면, 이들 용매가 생리학적으로 허용가능하지 않을 수 있기 때문에, MR 영상화제로서 사용되는 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여하기 전에 이들 용매를 제거할 필요가 있을 수 있다.

DNP를 통해 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 수득하기 위하여 출발 물질로서 ¹³C-프럭토즈를 사용하면, DNP제와 ¹³C-프럭토즈의 용액을 제조하기 위하여 통상 용매를 첨가한다. 바람직하게는 수성 담체, 가장 바람직하게는 물을 용매로서 사용한다. 하나의 실시양태에서는, DNP제를 용해시키고, ¹³C-프럭토즈를 용해된 DNP제에 후속 용해시킨다. 다른 실시양태에서는, ¹³C-프럭토즈를 용매에 용해시킨 다음, DNP제를 용해된 ¹³C-프럭토즈에 용해시킨다. 교반, 볼텍싱(vortexing) 또는 초음파 처리 같은 당 업계에 공지되어 있는 몇 가지 수단에 의해 화합물의 긴밀한 혼합을 촉진할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 DNP에 의해 수득하는 경우, ¹³C-프럭토즈 및 DNP제를 포함하는 분극화되어야 하는 조성물은 상자성 금속 이온을 추가로 포함할 수 있다. 상자성 금속 이온의 존재는 본원에 참고로 인용되는 WO-A2-2007/064226 호에 상세하게 기재되는 바와 같이 DNP에 의해 분극화되어야 하는 화합물에서 분극화도를 높일 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 "상자성 금속 이온"은, 염 및 상자성 킬레이트, 즉 킬레이트화제와 상자성 금속 이온을 포함하는 화학적 물질(여기에서는, 상기 상자성 금속 이온과 상기 킬레이트화제가 착체를 형성함) 형태의 상자성 금속 이온을 가리킨다.

바람직한 실시양태에서, 상자성 금속 이온은 상자성 금속 이온으로서 Gd^{3 +}를 포함하는 화합물, 바람직하게는 킬레이트화제 및 상자성 금속 이온으로서 Gd^{3 +}를 포함하는 상자성 킬레이트이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 상자성 금속 이온은 분극화되어야 하는 조성물에서 가용성이고 안정하다.

앞서 기재된 DNP제와 마찬가지로, 분극화되어야 하는 ¹³C-프럭토즈는 상자성 금속 이온과도 긴밀하게 접촉해야 한다. ¹³C-프럭토즈, DNP제 및 상자성 금속 이온을 포함하는 DNP에 사용되는 조성물은 몇 가지 방식으로 수득될 수 있다. 제 1 실시양태에서는, ¹³C-프럭토즈를 적합한 용매에 용해시켜 용액을 수득한다. 이 ¹³C-프럭토즈의 용액에 DNP제를 첨가하고 용해시킨다. DNP제, 바람직하게는 트리틸 라디칼은 고체로서 또는 용액으로, 바람직하게는 고체로서 첨가될 수 있다. 후속 단계에서는, 상자성 금속 이온을 첨가한다. 상자성 금속 이온은 고체로서 또는 용액으로, 바람직하게는 고체로서 첨가될 수 있다. 다른 실시양태에서는, DNP제와 상자성 금속 이온을 적합한 용매에 용해시키고, 이 용액을 ¹³C-프럭토즈에 첨가한다. 또 다른 실시양태에서는, DNP제(또는 상자성 금속 이온)를 적합한 용매에 용해시키고 ¹³C-프럭토즈에 첨가한다. 후속 단계에서는, 상자성 금속 이온(또는 DNP제)을 이 용액에 고체로서 또는 용액으로, 바람직하게는 고체로서 첨가한다. 바람직하게는, 상자성 금속 이온(또는 DNP제)을 용해시키기 위한 용매의 양을 최소량으로 유지한다. 다시, 교반, 볼텍싱 또는 초음파 처리 같은 당 업계에 공지되어 있는 몇 가지 수단에 의해 화합물의 긴밀한 혼합을 촉진할 수 있다.

트리틸 라디칼을 DNP제로서 사용하는 경우, 조성물중 이러한 트리틸 라디칼의 적합한 농도는 DNP에 사용되는 조성물중 1 내지 25mM, 바람직하게는 2 내지 20mM, 더욱 바람직하게는 10 내지 15mM이다. 상자성 금속 이온을 조성물에 첨가하는 경우, 이러한 상자성 금속 이온의 적합한 농도는 조성물중 0.1 내지 6mM(금속 이온)이고, 0.5 내지 4mM의 농도가 바람직하다.

¹³C-프럭토즈, DNP제 및 임의적으로 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물을 제조한 후, 당 업계에 공지되어 있는 방법에 의해, 예를 들어 이를 동결기, 액체 질소 중에서 동결시킴으로써, 또는 단순히 이를 DNP 분극화기(여기에서는, 액체 헬륨이 이를 동결시킴)에 위치시킴으로써 상기 조성물을 동결시킨다. 임의적으로는, 조성물을 분극화기 내로 삽입하기 전에 조성물을 "비드"로서 동결시킬 수 있다. 조성물을 액체 질소에 적가함으로써 이러한 비드를 수득할 수 있다. 이러한 비드는 더욱 효율적으로 용해되는 것으로 관찰되었는데, 이는 다량의 ¹³C-프럭토즈가 분극화되는 경우, 예를 들어 분극화된 ¹³C-프럭토즈를 생체내 ¹³C-MR 검출 방법에 사용하고자 하는 경우에 특히 적절하다.

상자성 금속 이온이 조성물에 존재하는 경우에는, 동결하기 전에 예컨대 헬륨 기체를 조성물을 통해 폭기시킴으로써(예컨대 2 내지 15분간) 상기 조성물을 탈기시킬 수 있으나, 다른 공지의 통상적인 방법에 의해 탈기시킬 수도 있다.

DNP 기법은 예컨대 본원에 참고로 인용되는 WO-A-98/58272 호 및 WO-A-01/96895 호에 기재되어 있다. 일반적으로, 예를 들어 DNP 공정을 액체 헬륨 및 약 1T 이상의 자기장에서 수행함으로써, 중간 또는 높은 자기장 및 극저온을 DNP 공정에 이용한다. 다르게는, 중간 자기장 및 충분한 분극화 향상이 달성되는 임의의 온도를 이용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 액체 헬륨 및 약 1T 이상의 자기장에서 DNP 공정을 수행한다. 적합한 분극화 장치는 예를 들어 WO-A-02/37132 호에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 분극화 장치는 저온 유지 장치 및 분극화 수단, 예컨대 도파관에 의해 초전도성 자석 같은 자기장 생성 수단에 의해 둘러싸인 중심 구멍에 있는 극초단파 공급원에 연결된 극초단파 챔버를 포함한다. 구멍은 적어도 자기장 강도가 샘플 핵의 분극화가 일어나기에 충분히 높은(예컨대, 1 내지 25T) 초전도성 자석 근처의 영역 P 수준까지 아래로 수직으로 연장된다. 프로브(즉, 분극화되어야 하는 동결된 조성물)용 구멍은 바람직하게는 밀봉가능하며, 저압, 예컨대 1밀리바 이하 정도의 압력까지 배기될 수 있다. 제거가능한 수송 관 같은 프로브 도입 수단이 구멍 내부에 함유될 수 있으며, 이 관은 구멍의 상부로부터 영역 P의 극초단파 챔버 내부의 지점까지 아래로 삽입될 수 있다. 영역 P를 액체 헬륨에 의해 분극화가 일어나기에 충분히 낮은 온도, 바람직하게는 0.1 내지 100K 정도, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10K, 가장 바람직하게는 1 내지 5K의 온도까지 냉각시킨다. 구멍 내에 부분적인 진공을 유지하기에 적합한 임의의 방식으로 프로브 도입 수단을 바람직하게는 그의 상부 말단에서 밀봉할 수 있다. 프로브-보유 컵 같은 프로브-보유 용기를 프로브 도입 수단의 하부 말단 내부에 제거가능하게 끼워넣을 수 있다. 프로브-보유 용기는 바람직하게는 예컨대 KelF(폴리클로로트라이플루오로에틸렌) 또는 PEEK(폴리에터에터케톤) 같은 낮은 비열용량 및 우수한 극저온 특성을 갖는 경량 물질로 제조되며, 이는 하나보다 많은 프로브를 보유할 수 있도록 하는 방식으로 디자인될 수 있다.

프로브를 프로브-보유 용기 내로 삽입하고, 액체 헬륨 중에 담그고, 극초단파로 조사한다. DNP제의 EPR 선으로부터 극초단파 진동수를 결정할 수 있으며, 이는 28.0GHz/T 같이 자석의 자기장에 따라 달라진다. 최대 NMR 신호에 대해 진동수를 조정함으로써 최적 극초단파 진동수를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 최적 극초단파 진동수는 3.35T로 하전된 자석의 경우 약 94GHz, 4T로 하전된 자석의 경우 110GHz, 5T로 하전된 자석의 경우 140GHz, 7T로 하전된 자석의 경우 200GHz이다. 동력은 프로브 크기에 따라 50 내지 200mW에서 선택될 수 있다. 예컨대 극초단파 조사 동안 프로브의 고체 상태 ¹³C-NMR 신호를 획득함으로써 앞서 기재된 바와 같이 분극화도를 모니터링할 수 있다. 일반적으로, NMR 신호 대 시간을 보여주는 그래프에서 포화 곡선을 수득한다. 따라서, 언제 최적 분극화도에 도달하는지를 결정할 수 있다. 고체 상태 ¹³C-NMR 측정은 적합하게는 낮은 숙임각을 사용하는 단일 펄스-획득 NMR 시퀀스로 이루어진다. 동적 핵 분극화된 핵, 즉 ¹³C-프럭토즈의 ¹³C 핵의 신호 강도를 DNP 전의 ¹³C-프럭토즈의 ¹³C 핵의 신호 강도와 비교한다. 이어, DNP 전후의 신호 강도의 비로부터 분극화를 계산한다.

DNP 공정 후, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 동결된 고체 조성물을 고체 상태에서 액체 상태로 변화시킨다(즉, 액화시킨다). 적절한 용매 또는 용매 혼합물(용해 매질)에 용해시킴으로써 또는 고체 조성물을 용융시킴으로써, 예를 들어 열 형태의 에너지를 가함으로써 이를 수행할 수 있다. 용해가 바람직하고, 따라서 용해 공정 및 적합한 장치가 WO-A-02/37132 호에 상세하게 기재되어 있다. 용융 공정 및 용융에 적합한 장치는 예를 들어 WO-A-02/36005 호에 기재되어 있다. 간략히, 분극화기로부터 물리적 분리되거나 또는 분극화기 및 용해 장치/용융 장치를 함유하는 장치의 일부인 용해 장치/용융 장치를 사용한다. 바람직한 실시양태에서는, 높은 자기장에서, 예를 들어 분극화기 내부에서 용해/용융을 수행하여, 이완을 개선하고 최대의 과분극화를 유지한다. 자기장 결절(field node)은 피해야 하고, 낮은 자기장은 상기 기준에도 불구하고 향상된 이완을 야기할 수 있다.

과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 조성물을 용해에 의해 액화시키는 경우, 특히 바람직하게는 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 생체내 ¹³C-MR 검출용 영상화 매질에 사용하고자 하는 경우에 바람직하게는 생리학적으로 허용가능하고 약학적으로 허용되는 물, 완충 용액 또는 염수 같은 수성 담체를 용매로서 적합하게 사용한다. 시험관내 용도의 경우에는, 비수성 용매 또는 용매 혼합물, 예를 들어 DMSO 또는 메탄올 또는 수성 담체와 비수성 용매를 포함하는 혼합물(예컨대, DMSO와 물의 혼합물 또는 메탄올과 물의 혼합물)도 사용할 수 있다.

용어 "완충 용액" 또는 "완충제"는, 이후 상호교환적으로 사용된다. 본원과 관련하여 "완충제"는 하나 이상의 완충제, 즉 완충제의 혼합물도 가리킨다.

바람직한 완충제는 생리학적으로 허용가능한 완충제, 더욱 바람직하게는 예컨대 포스페이트 완충제(KH₂PO₄/Na₂HPO₄), ACES, PIPES, 이미다졸/HCl, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS 또는 TRICIN 같은 약 pH 7 내지 8의 범위에서 완충시키는 완충제이다.

다른 바람직한 실시양태에서, 수성 담체, 또는 적용가능한 경우 혼합된 수성 담체/염기 용액은 유리 상자성 이온을 결합하거나 착화시킬 수 있는 하나 이상의 화합물, 예를 들어 DTPA 또는 EDTA 같은 킬레이트화제를 추가로 포함한다.

DNP 방법에 의해 과분극화를 수행하는 경우, DNP제, 바람직하게는 트리틸 라디칼 및 임의적인 상자성 금속 이온을 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 함유하는 액체로부터 제거할 수 있다. 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 생체내 용도를 위한 영상화 매질에 사용하고자 하는 경우에는 이들 화합물을 제거하는 것이 바람직하다.

트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 제거하는데 유용한 방법은 당 업계에 공지되어 있고, 본원에 참고로 인용되는 WO-A2-2007/064226 호 및 WO-A1-2006/011809 호에 상세하게 기재되어 있다.

바람직한 실시양태에서는, ¹³C-프럭토즈, 화학식 1의 트리틸 라디칼 및 임의적으로 Gd^{3 +}를 포함하는 상자성 킬레이트를 포함하는 조성물의 동적 핵 분극화에 의해, 본 발명의 방법에 사용되는 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 수득한다. 이 바람직한 실시양태에서는, 트리틸 라디칼 및 사용되는 경우 Gd^{3 +}를 포함하는 상자성 킬레이트의 용액을 제조한다. 용해된 트리틸 라디칼 및 임의적인 용해된 상자성 킬레이트를 나트륨 ¹³C-프럭토즈에 첨가하고, 조성물을 바람직하게는 초음파 처리하거나 휘저어 혼합하여, 모든 성분의 긴밀한 혼합을 촉진한다.

본 발명의 방법에 따른 영상화 매질을 시험관내 ¹³C-MR 검출, 예를 들어 인간 또는 인간이 아닌 동물 신체로부터 유래되는 세포 배양액, 신체 샘플, 생체외 조직 또는 단리된 기관에서의 ¹³C-MR 검출용 영상화 매질로서 사용할 수 있다. 이를 위해, 영상화 매질은 예컨대 세포 배양액, 뇨, 혈액 또는 침 같은 샘플, 생검 조직 같은 생체외 조직 또는 단리된 기관에 첨가하기 적합한 조성물로서 제공된다. 이러한 영상화 매질은 바람직하게는 영상화제, 즉 MR 활성제인 과분극화된 ¹³C-프럭토즈에 덧붙여, 시험관내 세포 또는 조직 분석과 양립가능하고 그에 사용되는 용매, 예컨대 DMSO 또는 메탄올 또는 수성 담체와 비수성 용매를 포함하는 용매 혼합물(예를 들어, DMSO와 물 또는 완충 용액의 혼합물 또는 메탄올과 물 또는 완충 용액의 혼합물)을 바람직하게 포함한다. 당 업자에게 명백한 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 제형 보조제가 이러한 영상화 매질에 존재할 수 있으나, 그러한 목적으로 요구되지는 않는다.

또한, 본 발명의 방법에 따른 영상화 매질을 생체내 ¹³C-MR 검출, 즉 살아있는 인간 또는 인간이 아닌 동물에서 수행되는 ¹³C-MR 검출용 영상화 매질로서 사용할 수 있다. 이를 위해, 영상화 매질은 살아있는 인간 또는 인간이 아닌 동물 신체에 투여하기에 적합할 필요가 있다. 따라서, 이러한 영상화 매질은 바람직하게는 영상화제, 즉 MR 활성제인 과분극화된 ¹³C-프럭토즈에 덧붙여, 수성 담체, 바람직하게는 생리학적으로 허용가능하고 약학적으로 허용되는 물, 완충 용액 또는 염수 같은 수성 담체를 포함한다. 이러한 영상화 매질은 종래의 약학적 또는 수의학적 담체 또는 부형제, 예를 들어 인간용 의약 또는 수의학적 의약에서 진단 조성물에 통상적인 안정화제, 삼투압 조정제, 가용화제 등과 같은 제형 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 영상화 매질을 생체내 ¹³C-MR 검출, 즉 살아있는 인간 또는 인간이 아닌 동물 신체에서 사용하는 경우에는, 상기 영상화 매질을 비경구적으로, 바람직하게는 정맥내로 바람직하게 투여한다. 일반적으로는, 시험되는 신체를 MR 자석에 위치시킨다. 전용 ¹³C-MR RF-코일을 해당 구역을 덮도록 위치시킨다. 영상화 매질의 투여량 및 농도는 독성 및 투여 경로 같은 광범위한 인자에 따라 달라진다. 투여한지 400초 미만, 바람직하게는 120초 미만, 더욱 바람직하게는 투여한지 60초 미만, 특히 바람직하게는 20 내지 50초 후에, 조합된 진동수 및 공간 선택적인 방식으로 해당 부피를 암호화하는 MR 영상화 시퀀스를 적용한다. MR 시퀀스를 적용하는 정확한 시간은 해당 부피 및 종에 따라 매우 달라진다.

본 발명에 따른 ¹³C-MR 검출 방법에서는, 모든 이성질체를 포함하는 ¹³C-프럭토즈, ¹³C-프럭토즈-6-포스페이트 및 ¹³C-프럭토즈-1-포스페이트의 신호를 검출하는 것이 바람직하다. 헥소키나제를 통한 프럭토즈-6-포스페이트로의 1단계 대사는 당분해의 제 1 단계와 유사하다. 과분극화된 프럭토즈와 헥소키나제의 반응은 포스포릴화된 펜토즈, 즉 프럭토푸라노즈-6-포스페이트를 수초 내에 생성시킨다. 따라서, ¹³C-프럭토즈-6-포스페이트의 검출은 ¹³C-프럭토푸라노즈-6-포스페이트의 검출을 포함한다. 프럭토즈는 또한 프럭토키나제를 통해 프럭토즈-1-포스페이트로 대사될 수 있다(주로 간에서 일어나는 반응). 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 영상화제로서 사용하여, 과분극화된 프럭토푸라노즈-6-포스페이트의 검출에 기초하여 정상적인 조직과 구별할 수 있다. 과분극화된 프럭토즈의 효소에 의한 전환은 상향 조절된 헥소스 흡수, 헥소키나제 활성 및 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 흐름의 변화를 비롯한 피루베이트 상류의 당분해 대사에서의 중요한 변화를 조사할 수 있다.

따라서, 바람직한 실시양태에서는, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 영상화 매질을 사용하는 ¹³C-MR 검출 방법이 제공되는데, 여기에서는 ¹³C-프럭토즈, ¹³C-프럭토즈-6-포스페이트 및 ¹³C-프럭토즈-1-포스페이트의 신호, 바람직하게는 ¹³C-프럭토즈 및 ¹³C-프럭토푸라노즈-6-포스페이트의 신호를 검출한다.

본 발명과 관련하여 용어 "신호"는, ¹³C-프럭토즈 또는 그의 대사산물을 나타내는 ¹³C-MR 스펙트럼에서의 피크의 노이즈에 대한 MR 신호 진폭 또는 적분 또는 피크 면적을 가리킨다. 바람직한 실시양태에서, 신호는 피크 면적이다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서는, ¹³C-프럭토즈 및 그의 대사산물의 상기 신호를 사용하여 대사 프로파일을 생성시킨다.

하나의 실시양태에서는, ¹³C-프럭토즈 및 그의 대사산물의 상기 신호를 사용하여 살아있는 인간 또는 인간이 아닌 동물의 대사 프로파일을 생성시킨다. 상기 대사 프로파일은 전체 신체로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 전체 신체 생체내 ¹³C-MR 검출에 의해 수득될 수 있다. 다르게는, 상기 대사 프로파일은 해당 영역, 즉 상기 인간 또는 인간이 아닌 동물 신체의 특정 조직, 기관 또는 부분으로부터 생성된다. 특히, 프럭토즈의 대사가 예컨대 유방암 및 전립선암 같은 특정 유형의 암의 발병기전에 연루되어 있기 때문에, 상기 대사 프로파일은 암에 걸린 영역으로부터 유도될 수 있다.

다른 실시양태에서는, ¹³C-프럭토즈 및 그의 대사산물의 상기 신호를 사용하여 세포 배양액, 뇨, 혈액 또는 침 같은 샘플, 또는 생검 조직 같은 생체외 조직 또는 단리된 기관의 대사 프로파일을 생성시킨다. 시험관내 ¹³C-MR 검출에 의해 상기 대사 프로파일을 생성시킨다.

따라서, 바람직한 실시양태에서는, ¹³C-프럭토즈 및 그의 대사산물의 신호를 검출하고 상기 신호를 사용하여 대사 프로파일을 생성시키는, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 영상화 매질을 사용하는 ¹³C-MR 검출 방법이 제공된다.

하나의 실시양태에서는, ¹³C-프럭토즈 및 그의 대사산물(¹³C-라벨링된 화합물)의 스펙트럼 신호 강도를 사용하여 대사 프로파일을 생성시킨다. 다른 실시양태에서는, ¹³C-라벨링된 화합물의 스펙트럼 신호 강도를 사용하여 대사 프로파일을 생성시킨다. 다른 실시양태에서는, ¹³C-라벨링된 화합물의 별도의 영상으로부터의 신호 강도를 이용하여 대사 프로파일을 생성시킨다. 또 다른 실시양태에서는, ¹³C-라벨링된 화합물의 신호 강도를 둘 이상의 시점에서 수득하여, ¹³C-라벨링된 화합물의 변화 속도를 계산한다.

다른 실시양태에서, 대사 프로파일은 ¹³C-라벨링된 화합물의 처리된 신호 데이터, 예를 들어 신호의 비, 보정된 신호, 또는 다수회의 MR 검출, 즉 스펙트럼 또는 영상의 신호 패턴으로부터 유추되는 동적 또는 대사 속도 상수 정보를 포함하거나, 또는 상기를 이용하여 생성된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서는, 보정된 ¹³C-프럭토즈 신호, 즉 ¹³C-프럭토즈 대 ¹³C-프럭토즈-6-포스페이트 신호 및/또는 ¹³C-프럭토즈 대 ¹³C-프럭토즈-1-포스페이트 신호가 대사 프로파일에 포함되거나 또는 상기를 사용하여 대사 프로파일을 생성시킨다. 다른 바람직한 실시양태에서는, 보정된 ¹³C-프럭토즈 대 총 ¹³C-탄소 신호가 대사 프로파일에 포함되거나 또는 상기를 사용하여 대사 프로파일을 생성시키는데, 이 때 총 ¹³C-탄소 신호는 ¹³C-라벨링된 화합물의 신호의 합이다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서 생성되는 대사 프로파일은 시험되는 신체, 신체의 일부, 세포, 조직, 신체 샘플 등의 대사 상태 및 활성에 대한 정보를 제공하며, 예를 들어 질병을 확인하고/하거나 질병의 경과를 모니터링하고/하거나 질병 상태를 결정하거나 요법을 모니터링하기 위한 후속 단계에 상기 정보를 사용할 수 있다.

이러한 질병은 종양일 수 있는데, 종양 조직은 통상 건강한 조직보다 더 높은 대사 활성을 그 특징으로 하기 때문이다. 이러한 더 높은 대사 활성은 종양 또는 종양의 생체외 샘플의 대사 프로파일을 건강한 조직(예를 들어, 주변 조직 또는 건강한 생체외 조직)의 대사 프로파일과 비교함으로써 결정될 수 있으며, ¹³C-라벨링된 화합물의 높은 신호 또는 높은 보정된 ¹³C-프럭토즈 신호 또는 높은 대사 속도, 또는 높은 프럭토즈-6-포스페이트 신호, 또는 높은 프럭토즈-6-포스페이트 대 프럭토즈 비에 의해 상기 대사 프로파일에서 입증될 수 있다.

다른 질병은, 허혈성 심근 조직이 통상 건강한 심근 조직보다 더 낮은 대사 활성을 그 특징으로 하므로, 심장에서의 허혈일 수 있다. 다시, 이러한 더 낮은 대사 활성은 허혈성 심근 조직의 대사 프로파일을 건강한 심근 조직의 대사 프로파일과 비교함으로써 결정될 수 있다. 또한, ¹³C-프럭토즈가 다른 공지의 약제보다 더 높은 속도로 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있으므로, 이는 또한 신경 용도에도 유용할 수 있다.

또 다른 질병은 비-알콜성 지방간 질병 같은 간 관련 질병일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 나트륨 ¹³C-프럭토즈, 트리틸 라디칼 및 임의적으로 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물이다.

제 1 실시양태에서, 상기 조성물은 ¹³C-프럭토즈, 트리틸 라디칼 및 임의적으로 상자성 금속 이온을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 ¹³C-프럭토즈는 [2-¹³C]-프럭토즈이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 트리틸 라디칼은 M이 수소 또는 나트륨이고, R1이 바람직하게는 동일하고, 더욱 바람직하게는 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₄-알킬기, 가장 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 아이소프로필이거나, 또는 R1이 바람직하게는 동일하고, 더욱 바람직하게는 1개의 하이드록실기에 의해 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₄-알킬기, 가장 바람직하게는 -CH₂-CH₂-OH이거나, 또는 R1이 바람직하게는 동일하고 -CH₂-CH₂-O-CH₃인 화학식 1의 트리틸 라디칼이다.

다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 상자성 금속 이온을 포함하고, 상기 상자성 금속 이온은 바람직하게는 상자성 금속 이온으로서 Gd^{3 +}를 포함하는 화합물, 바람직하게는 킬레이트화제 및 상자성 금속 이온으로서 Gd^{3 +}를 포함하는 상자성 킬레이트이다. 적합하게는, 상기 조성물은 용매 또는 용매들을 추가로 포함하며; 바람직하게는 수성 담체, 가장 바람직하게는 물을 용매로서 사용한다. 높은 분극화도를 갖는 동적 핵 분극화(DNP)에 의해 과분극화된 나트륨 ¹³C-프럭토즈를 수득하는데 상기 조성물을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 과분극화된 나트륨 ¹³C-프럭토즈, 임의적으로 트리틸 라디칼 및 임의적으로 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물이며, 이 때 상기 조성물은 동적 핵 분극화에 의해 수득된다. 과분극화된 나트륨 ¹³C-프럭토즈를 포함하는 조성물을 제조하는 경우, DNP제로서 사용되는 트리틸 라디칼은 최종 단계로서 임의적으로 제거될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 과분극화된 ¹³C-프럭토즈, 바람직하게는 [2-¹³C]-프럭토즈이다.

본 발명의 또 다른 양태는 과분극화된 ¹³C-프럭토즈, 바람직하게는[2-¹³C]-프럭토즈를 포함하는 영상화 매질이다. 본 발명에 따른 영상화 매질을 ¹³C-MR 검출에서 영상화 매질로서 사용할 수 있다.

하기 비한정적인 실시예에 의해 본 발명을 예시한다.

실시예

실시예 1: 프럭토즈의 과분극화

아든재-라슨(Ardenkjaer-Larsen) 등의 문헌[(2003) Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10158-10163]에 기재되어 있는 바와 같이 하이퍼센스(Hypersense) 기구[옥스포드 인스트루먼츠(Oxford Instruments)] 상에서 15mM OX063 트리틸 라디칼(옥스포드 인스트루먼츠)을 함유하는 물중 2-[¹³C]-프럭토즈[아이소텍(Isotec), 미국 오하이오주 마이아미스버그]의 4.0M 용액을 과분극화시켰다. 냉동된 샘플을 1X 포스페이트 완충된 염수(PBS)에 용해시켰으며(생성된 pH 7.6), 10mm NMR 관으로 즉시 옮겼다.

11.7T NMR 연구: 10mm ¹⁵N/³¹P/¹³C 삼중-조정된 직접 검출 프로브를 사용하는 11.7T 배리안(Varian) INOVA 분광계[125MHz ¹³C, 배리안 인스트루먼츠(Varian Instruments)] 상에서 NMR 연구를 수행하였다. 먼저, 언스트(Ernst) 각 펄스(45°)를 이용하여 37℃에서 1X PBS 완충제 중의 자연 존재비 프럭토즈 샘플에 대해 열 스펙트럼을 획득하였다(nt=9000, sw=30000, np=30000, TR=3.5초, 획득 시간=0.5초). 도 2는 프럭토즈의 자연 존재비 ¹³C 스펙트럼을 도시한다. C₂ 탄소 공명은 프럭토즈 분자의 두 고리 형태(피라노즈 및 푸라노즈 형태)의 이성질체 분포에 상응한다.

과분극화된 ¹³C 스펙트럼을 획득하기 위하여, 5° 펄스 및 왈츠-16 분리 계획을 이용하여 분리된 양성자를 사용하여 80개 펄스 과분극화된 ¹³C NMR 스펙트럼(1 평균, 스펙트럼 윈도우=30000Hz, 지점 수=30000, TR=3.5초, 획득 시간=0.5초, 총 획득 시간=2분 55초)을 획득하였다. 과분극화 연구 후에는 90° 선단 각 및 대략 4 T₁의 반복 시간을 이용하여, 거의 동일한 매개변수를 사용하여 열 데이터를 획득하였다(TR=76초, nt=64). 과분극화된 화합물의 신호 감쇠 곡선으로의 단일 변수 지수 핏(mono-exponential fit)을 수행함으로써 T₁을 결정하였다. 과분극화 및 열 데이터 세트를 비교하고 수득되는 선단 각의 차이 및 과도현상(transient)을 평가함으로써 신호 향상 % 분극화를 계산하였다. T₁ 감쇠를 이용하여 분극화기로부터의 전달 시간에 대해 향상을 보정함으로써 고체 상태 분극화를 계산하였다.

실시예 2: [2- ¹³ C]- 프럭토즈를 사용한 대사의 NMR 연구

프럭토즈의 프럭토즈-6-포스페이트로의 효소에 의한 전환의 NMR 연구를 위하여, 15mM ATP, 50mM TRIS 및 13mM MgCl₂의 존재하에 과분극화된 [2-¹³C]-프럭토즈를 헥소키나제[시그마 알드리치(Sigma Aldrich)] 400U와 반응시켰다. 라벨링 및 수송 및 대사의 메카니즘은 아래에 도시되나(도 1), 이 효소 연구에서는 수송 요소를 제거하였고 효소 활성을 독립적으로 측정하였다. 유사한 실험 매개변수 세트를 이용하여 자연 존재비 탄소 스펙트럼을 사용하여 프럭토즈-6-포스페이트에 상응하는 피크를 확인하였다.

3T 연구: MNS(다핵 분광법) 하드웨어 패키지가 장치된 3T GE 시그나(Signa)™ 스캐너(지이 헬쓰케어, 미국 위스콘신주 워케샤)를 사용하여 T₁ 연구를 수행하였다. 5° 비편재화된 펄스, TR=3초 및 단일 변수 지수로의 핏을 이용하여 용액 스펙트럼을 획득하였다. 이들 실험에 사용된 RF 코일은 초기 디자인에 기초하고 ¹³C-피루베이트 마우스 영상화 연구에도 사용된 90도(quadrature) ¹³C 채널 및 선형 ¹H 채널 구성을 갖는 이중-조정된 ¹H-¹³C 코일이었다. 동물 연구를 위해, MRSI 연구 전에 T₂-강조 빠른 스핀 에코 영상을 획득하여 해부학적 구조를 나타내고 복셀을 해당 영역에 위치시켰다. 후(Hu S) 등의 문헌[(2008) Compressed sensing for resolution enhancement of hyperpolarized 13C flyback 3D-MRSI. J Magn Reson 192, 258-264]에 이미 공개된 바와 같은 압축 센싱 이중 스핀 3D MRSI 획득 계획을 이용하여 생체내 MRSI 연구를 수행하였다(TE=140ms, TR=215ms, FOV=8cm×8cm, 및 16×8 해상도). 전립선암의 유전자 이식 모델(TRAMP)의 [1-¹³C] 피루베이트에 대해, 앨버스(Albers MJ) 등의 문헌[(2008) Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate and alanine: noninvasice biomarkers for prostate cancer detection and grading. Cancer Res. 68, 8607-8615]에 기재되어 있는 것과 유사하게 80mM [2-¹³C]-프럭토즈 500㎕를 주입하였다. 해당 종양 영역에서의 동일한 복셀에 있어서 표준 [1-¹³C]-피루베이트 주입에 대해 이들 주입을 비교하였다.

결과:

11.7T 및 3T에서 C₂ 프럭토즈 탄소에 대한 계산된 T₁을 표 1에 기재한다. 자기장 강도의 감소에 따라 해당 탄소의 T₁ 이완에서 약간의 감소가 있다. 프럭토즈의 이성질체 사이에서는 T₁의 상당한 차이가 없었다. % 분극화는 프럭토즈의 이성질체에 있어서 유사한 값을 나타낸다(12% 정도의 평균). 프럭토즈의 경우 5.9 내지 7.8의 pH 범위에서는 pH에 대한 T₁ 의존이 관찰되지 않았다.

각 프럭토즈 이성질체의 경우 11.7T 및 3T에서의 T₁ 이완 시간 및 % 분극화

이성질체	T1 초(11.7T)	T1 초(3T)	% 분극화(보정됨)
β-프럭토피라노즈	16.3±0.5	14.5±0.3	12.0±2.2
β-프럭토푸라노즈	15.8±0.5	13.4±2.5	11.6±2.5
A-프럭토푸라노즈	15.5±0.5	13.4±0.4	11.8±2.0

과분극화된 C₂-프럭토즈와 헥소키나제의 반응은 수초내에 포스포릴화된 펜토즈를 생성시킨다. 도 3은 완충제중 헥소키나제에 프럭토즈를 첨가한 후 5초 이내의 전환을 보여준다. 스펙트럼의 다운필드(downfield) 영역을 확대해 보면(도 3a), 105.5ppm 공명에서 쪼개짐이 보여지는데, 이는 β-프럭토-푸라노즈와 β-프럭토-피라노즈-6-포스페이트의 조합이다. 도 3은 또한 과분극화 획득의 첫번째 스캔(도 3b)을 DNP 후 85분간에 걸쳐 획득된 열 스펙트럼(도 3c)과 비교한다. 효소가 이제는 프럭토즈를 프럭토즈-6-포스페이트로 완전히 전환시켰으며, β-프럭토-피라노즈에 상응하는 공명이 더 이상 존재하지 않음이 명백하다.

도 4는 동일한 TRAMP 마우스에 80mM 과분극화된 프럭토즈(도 4b) 및 피루베이트(도 4c)를 별도로 주입한 후의 대사를 보여준다. 원발성 TRAMP 종양은 높은 수준의 과분극화된 락테이트, 및 프럭토즈 및 그의 대사산물인 β-프럭토-푸라노즈-6-포스페이트의 과분극화된 스펙트럼의 우수한 신호 대 노이즈 스펙트럼을 나타낸다. 용액중 프럭토즈 피라노즈 대 푸라노즈의 이성질체 비가 약 77/23이기 때문에, 105.5ppm에서의 생체내 피크(및 보이는 경우 하류의 108.25ppm 공명)는 주로 프럭토-푸라노즈-6-포스페이트에 기인한다. 이 초기-내지-중간 단계 TRAMP 종양에서는, 동일한 0.035cc 복셀에서 주입한지 15초 후에 높은 수준의 LDH 활성 및 가능한 헥소키나제 활성이 둘다 보여졌다. 이를 더 지속시켜 더욱 확산성인 전립선 종양에 적용하였다(도 5). MRSI 데이터는 복합체 β-프럭토-푸라노즈 및 β-프럭토-푸라노즈-6-포스페이트에 상응하는 공명이 주위의 양성 조직에 비해 확산성 종양의 영역에서 더 높음을 보여주었다. 다시, 이 공명의 β-프럭토피라노즈 공명에 대한 비는 주위 조직에 비해 증가된다.

Claims (14)

¹³C-MR 영상화, ¹³C-MR 분광법, 또는 조합된 ¹³C-MR 영상화와 ¹³C-MR 분광법을 통해, ¹³C-프럭토즈(fructose)의 스펙트럼 신호와, ¹³C-프럭토즈-6-포스페이트 및 ¹³C-프럭토즈-1-포스페이트 중 하나 이상의 스펙트럼 신호를 검출하는 데 사용하기 위한, 과분극화된(hyperpolarised) ¹³C-프럭토즈를 포함하는 영상화 매질.

삭제

제 1 항에 있어서,
상기 스펙트럼 신호가, ¹³C-프럭토즈, ¹³C-프럭토즈-6-포스페이트, 또는 ¹³C-프럭토즈-1-포스페이트를 나타내는 ¹³C-MR 스펙트럼에서의 피크의 노이즈에 대한 MR 신호 진폭, 또는 적분 또는 피크 면적을 나타내며, 대사 프로파일을 생성시키는 데 사용되는, 영상화 매질.

삭제

삭제

¹³C-프럭토즈, 트리틸(trityl) 라디칼 및 상자성(paramagnetic) 금속 이온을 포함하는, ¹³C-MR 검출을 위한 영상화 매질로서 사용하기 위한 조성물.

제 6 항에 있어서,
상기 ¹³C-프럭토즈가 [2-¹³C]-프럭토즈인, 조성물.

제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 상자성 금속 이온이 Gd³⁺를 포함하는 상자성 킬레이트인, 조성물.

제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 트리틸 라디칼이 하기 화학식 1의 트리틸 라디칼인, 조성물:
화학식 1

상기 식에서,
M은 수소 또는 1가의 양이온이고;
R1은, 동일하거나 상이하며, 하나 이상의 하이드록실기에 의해 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C₁-C₆-알킬기, 또는 -(CH₂)_n-X-R2 기이며;
n은 1, 2 또는 3이고;
X는 O 또는 S이고;
R2는 하나 이상의 하이드록실기에 의해 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 C₁-C₄-알킬기이다.

제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 조성물이 동적 핵 분극화에 사용되는, 조성물.

제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 조성물이, 상기 조성물의 동적 핵 분극화에 의해 수득되는, 과분극화된 ¹³C-프럭토즈, 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 포함하는, 조성물.

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