KR101677328B1

KR101677328B1 - O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법

Info

Publication number: KR101677328B1
Application number: KR1020140104670A
Authority: KR
Inventors: 김솔; 유인화; 장진숙; 김혜원
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2014-08-12
Publication date: 2016-11-18
Anticipated expiration: 2034-08-12
Also published as: US20170260556A1; EP3181685A4; KR20160020050A; AR102049A1; WO2016024771A1; TW201612319A; CN106795485A; EP3181685A1; JP6807976B2; JP6570617B2; US10323262B2; CN106795485B; UA119985C2; RU2663726C1; JP2017528126A; JP2019150038A; ES2753413T3; EP3181685B1; TWI654305B

Abstract

본 발명은 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)의 배출능을 가지는 폴리펩타이드의 활성이 강화된 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린 또는 L-시스테인 생산 방법{A microorganism producing O-phosphoserine and a method for producing O-phosphoserine or L-cysteine using the same}

본 발명은 O-포스포세린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로, 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임A 생합성의 전구물질로 사용된다.

미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로 1) 미생물을 이용하여 D,L-ATC를 생물학적으로 전환하는 방법, 2) 대장균을 이용한 L-시스테인을 생산하는 직접 발효 방법이 알려져 있다(유럽등록특허 EP0885962B; Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). 3) 또한, 미생물을 이용하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")을 발효 생산한 후, O-포스포세린 설피드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, 이하 "OPSS")의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 L-시스테인으로 전환시킨 방법이 공지되어 있다(한국등록특허 제1381048호).

이때, 상기 3) 방법으로 고수율의 시스테인을 생산하기 위해서 전구체인 OPS를 과량 생산하여야 한다. 이에 본 발명자들은 OPS 생산 균주에서 생산된 OPS를 세포 밖으로 원활하게 배출시킬 수 있는 적절한 배출 인자를 규명하고자 예의 노력하였다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 OPS 배출능을 가지는 YhhS 및 MdtD 두 폴리펩타이드를 새롭게 규명하였고, OPS 생산 미생물에서 상기 폴리펩타이드의 활성을 강화시키는 경우, OPS를 효과적으로 배출시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, OPS 생산 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 상기 미생물 또는 이의 배지로부터 OPS를 분리하는 단계를 포함하는, OPS의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드의 OPS 생산 또는 배출 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) OPS 배출 활성을 나타내는 상기 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하여 OPS를 생산하는 단계; 및 b) OPS 설프하이드릴라아제 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는, OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, OPS 생산 미생물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")"은 세린 및 인산(phosphoric acid)의 에스터 화합물로서, 여러 단백질의 구성요소이다. 특히, 상기 OPS는 L-시스테인의 전구체로서, OPS 설피드릴라제(OPS sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 시스테인으로 전환될 수 있다(한국등록특허 제1381048호).

본 발명에서 용어, " OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드"는 세포 내의 OPS를 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가지는 막 단백질을 의미하며, 구체적으로는 대장균 유래의 막 단백질일 수 있다. 과량의 OPS가 존재하는 조건하에서 생육 저하가 해제되는 대장균으로부터 막 단백질 2종이 동정되었다. 이렇게 규명된 OPS 배출능을 가지는, 막 단백질은 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 YhhS MFS(major facilitator superfamily) 트랜스포터, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 YegB MFS 트랜스포터이다. 상기 YegB MFS 트랜스포터는 본 발명에서 MdtD와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 단백질의 OPS 배출 활성은 알려진 바 없으며, 본 발명에서 최초로 규명되었다.

또한, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2로 기재한 아미노산 서열일 수 있으며, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 폴리펩타이드와 동일하거나 상응하는 OPS 배출능을 나타내는 막 단백질이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 OPS 배출능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리펩타이드 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 상기 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)의 배출 활성능을 가지나타내는 폴리펩타이드의 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 1 또는 2로 기재한 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 3 또는 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 , 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다 (예. Sambrook et al., 1989, infra 참고).

본 발명의 일 구체예에서는, OPS 생산능을 갖는 미생물에서 상기 YhhS 단백질(서열번호 1) 또는 MdtD 단백질(서열번호 2)의 활성을 강화시키는 경우, 양성 대조군인 RhtB 단백질(한국공개특허 제10-2012-0041115호), 또는 비교군인 MFS 트랜스포터인 EmrD 또는 YcaD를 강화시킨 균주에 비하여 우수한 OPS 배출활성을 가짐을 확인하였다. 상기 'RhtB'는 호모세린/호모세린 락톤을 배출하는 막 단백질로 유전자 rhtB로 코딩된다. OPS 생산 균주에서 상기 RhtB의 활성을 강화시켰을 경우, OPS 배출능이 증가함을 확인된 바 있으므로(한국등록특허 제138104호), 이를 양성 대조군으로 사용하였다. OPS 생산 균주에서 상기 RhtB 단백질과 본 발명에 따른 YhhS 단백질 및 MdtD 단백질의 활성을 각각 강화시켰을 때, 본 발명에 따른 YhhS 단백질 MdtD 단백질은 상기 RhtB 단백질과 비교하여서도 우수한 OPS 배출능을 나타내었다. 또한 용어 'EmrD' 및 용어 'YcaD'는 대장균의 MFS 트랜스포터 단백질로서, 각각 emrD, ycaD 유전자로 코딩된다. 상기 EmrD 및 YcaD는 YhhS 및 MdtD 단백질과 같이 MFS 트랜스포터에 속하는 단백질로서, MFS 트랜스포터에 속하는 다른 단백질도 OPS 배출능을 나타낼 수 있는지 확인하고자 비교군으로 사용하였다. 그 결과, EmrD 및 YcaD 단백질은 YhhS 및 MdtD 단백질과 달리 OPS 배출능을 나타내지 않음을 확인하였다.

한편, 본 발명의 폴리펩타이드는 OPS 배출 활성을 지니므로, OPS 생산능을 갖는 미생물에서 상기 폴리펩타이드의 활성을 내재적 활성에 비하여 강화시키는 경우, OPS를 효과적으로 생산할 수 있다.

본 발명에서 용어, "OPS 생산"은 OPS를 균주 내에서 만들어내는 것뿐만 아니라, 세포 내의 OPS를 세포 밖, 예컨대 배지로 배출하는 것 역시 포함하는 개념이며, 구체적으로는 OPS를 세포 내에서 밖으로 배출하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 본래 미생물이 천연의 상태, 즉 비변이 상태에서 나타내는 폴리펩타이드의 활성 상태를 의미한다. "내재적 활성에 비하여 강화"는 본래 미생물이 천연의 상태에서 나타내는 폴리펩타이드의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 증가된 것을 의미하며, 특정 폴리펩타이드의 활성을 가지지 않는 미생물에 그 폴리펩타이드의 활성을 부여하는 것 역시 포함하는 개념이다.

상기 "활성의 강화"는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 폴리펩타이드 자체의 활성이 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 외부로부터의 유전자 도입, 프로모터 교체 또는 변형 및 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 변형하는 방법, 상기 폴리펩타이드 활성이 증가되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 폴리펩타이드의 활성이 강화되도록 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으며, 상기 기재된 방법에 제한되는 것은 아니다. 이러한 활성을 강화시키는 방법은 본 명세서 내의 다른 폴리펩타이드의 활성 강화시에도 동일하게 참고될 수 있다.

상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다

상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물일 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 프로모터(한국등록특허 제 0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있다.

아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

이와 같은 단백질 활성의 도입 및 증진은, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "OPS 생산 미생물"은 OPS를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, 구체적으로는 유전적 조작에 의하여 OPS를 축적할 수 있는 미생물을 의미한다.

본 발명의 일 구체예로 상기 미생물은 서열번호 1 또는 2의 폴리펩타이드의 활성이 강화되는 경우, OPS를 배출할 수 있는 미생물이면 특별히 그 종류가 제한되지 않으며, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로는 에스케리키아 속 미생물, 그 예로 대장균을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 상기 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속 미생물의 경우, L-세린의 생합성 경로의 효소인 SerA, SerC 및 SerB 을 통해, OPS 및 L-세린을 생산할 수 있다(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 october; Wendisch VF et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;71(11):7139-44.).

또한, 상기 OPS 생산 미생물은 추가적으로 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것일 수 있다.

상기 SerB는 OPS를 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 지니므로, 상기 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물은 OPS를 축적하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 SerB는 서열번호 17 또는 18로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, SerB의 활성을 나타내는 한, 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 더 구체적으로는 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 SerB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 17 또는 18에 기재된 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 19 또는 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 용어, "내재적 활성에 비해 약화"는 본래 미생물이 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 감소된 것을 의미하며, 활성이 제거된 경우도 포함한다.

상기 약화는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 변이 등으로 단백질 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 유전자의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및 발현이 되더라도 활성이 없는 경우 역시 포함하는 개념이다.

이러한 단백질 활성의 약화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 변형하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이의 일례로 상동재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기에서 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 더욱 바람직하게는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 발현 조절서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.

또한, 상기 OPS를 생산하는 미생물은 추가적으로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것일 수 있다.

상기 SerA는 3-포스포글리세라이트(3-phosphoglycerate)를 3-포스포하이드록시피루베이트(3-phospho-hydroxypyruvate)로 전환하는 활성을 가지는 단백질이며, 상기 SerA는 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체가 사용될 수 있다. 또한, 상기 SerC는 3-포스포하이드록시피루베이트를 OPS로 전환하는 활성을 가지는 단백질이다. 따라서, 상기 SerA 또는/및 SerC의 활성이 강화된 미생물은 OPS 생산 균주로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 SerA는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 21 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 21은 야생형 SerA의 서열이며, 22 내지 26은 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체의 서열이다. 또한, SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체의 활성을 나타내는 한, 상기 아미노산 서열과 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 더 구체적으로는 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 피드백이 해제된 변이체는 상기 SerA를 암호화하는 유전자에 삽입, 치환 등의 방법으로 변이를 도입하여 세린 혹은 글리신에 의한 피드백 저해로부터 그 활성을 유지하거나, 강화된 경우를 의미하며, 상기 피드백이 해제된 변이체는 이미 잘 알려져 있다(Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276: 17844-17850, 2001; Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 437-441, 2002; 유럽등록특허 EP0943687B).

또한, 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 21 내지 26에 기재된 어느 하나의 아미노산 서열을 암화화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 27 내지 32에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.

상기 SerC는 예를 들어 서열번호 33으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, SerC의 활성을 나타내는 한, 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 더 구체적으로는 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 SerC를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 33에 기재된 아미노산을 암화화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 34의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.

또한, 상기 미생물은 추가로 OPS의 세포 안으로의 유입 또는 분해 능력을 감소시킨 미생물일 수 있다.

상기와 같은 OPS 생산 미생물에 대한 내용은 상기에서 기술된 내용 외에도 한국등록특허 제1381048호 또는 미국공개공보 제2012-0190081호 등에 개시된 내용이 본 발명의 참고자료로서 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는, OPS 배출 활성을 나타내고, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드의 활성이 강화된, OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 O-포스포세린 생산 미생물 또는 이의 배지로부터 O-포스포세린을 분리하는 단계를 포함하는, OPS의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 SerB 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 재조합 미생물의 배양은, 상기 미생물의 세린 요구성이 유도되어 배지에 글리신 또는 세린이 추가로 포함될 수 있다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 포함하는 이스트 추출물, 트립톤의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10 g/L, 구체적으로는 0.5 내지 3 g/L 일 수 있다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5 g/L, 구체적으로는 0.1 내지 1 g/L 일 수 있다.

상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 그러나 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 그러나 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 구체적으로는 30℃ 내지 35℃ 일 수 있다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속 될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있다.

본 발명은 상기 배양 단계에서 생산된 OPS를 추가로 분리 및 정제할 수 있으며, 그 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 OPS를 회수할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 일 양태로서, 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드의 OPS 생산 또는 배출 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태로서, a) 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는, OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하여 OPS를 생산하는 단계; 및 b) OPS 설프하이드릴라아제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "OPS 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS에 티올그룹(thiol, group, SH기)을 제공하여 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매하는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 효소는 애로피룸 페닉스(Aeropyrum pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 스메그마틱스(Mycobacterium smegmatics), 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis) (Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551: 133-138, 2003; Burns KE et al., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005)에서 처음으로 밝혀졌다. 또한, 상기 OPSS는 야생형 OPSS 단백질뿐만 아니라, 상기 OPSS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부 서열이 결실, 치환 또는 부가된 서열로서, 야생형 OPSS 단백질의 생물학적 활성과 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내는 변이체 단백질도 포함하며, 예를 들어, 한국등록특허 제1381048호 및 한국등록특허 제1208267호에 개시된 OPSS 단백질 및 이의 변이체 단백질도 모두 포함한다.

상기 황화물은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드(sulfide, S^2-),티올설페이트(thiosulfate, S₂O₃ ^2-)등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH기)으로 전환될 수 있는 모든 황화물이면 이용 가능하다. 구체적으로는 티올 그룹을 OPS에 제공하는 Na₂S, NaSH, H₂S, (NH₄)₂S, 및 Na₂S₂O₃를 이용할 수 있다. 상기 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 혹은 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배일 수 있으며, 구체적으로는 1 내지 2배일 수 있다.

또한, 본 발명에서는 추가로 상기 단계 b)의 반응 단계를 통하여 생산된 시스테인을 분리 및 정제하는 단계를 포함한다. 이때, 당해 분야에 공지된 적합한 반응을 이용하여 반응액으로부터 목적하는 시스테인을 분리 및 정제하여 회수할 수 있다.

또한, 본 발명의 특징은 서열번호 1 또는 2의 폴리펩타이드의 활성을 OPS 생산 미생물에서 강화시켜 OPS를 고수율로 생산하고, 이렇게 생산된 OPS를 OPSS와 반응시켜 시스테인을 효과적으로 생산할 수 있는 것에 있는 것으로, 이렇게 제조된 시스테인은 또한 당업계에 공지된 화학적 합성 반응을 통하여 시스테인의 수소 원자 또는 특정 원자단을 변형시킴으로써 다양한 시스테인 유도체로 생산될 수 있다.

본 발명에서 용어, "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물로서, 대개 화합물 중 수소 원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다.

본 발명에서 용어, "시스테인 유도체"는 시스테인의 수소 원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다. 그 예로, 시스테인의 아민기(-NH₂)의 질소 원자 또는 티올기(-SH)의 황 원자에 다른 원자 또는 원자단이 부착된 형태일 수 있으며, 그 예로 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH, (R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteine 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 시스테인은 아세틸레이션 에이젼트(acetylation agent)와 반응하여 NAC(N-acetylcysteine)로 쉽게 합성될 수 있으며, 염기성 조건에서는 할로아세틱 에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)로 합성될 수 있다. 상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로써 진해제, 기침 완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용된다.

본 발명의 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 신규 폴리펩타이드는 우수한 OPS 배출능을 지니므로, 이를 OPS 생산 미생물에 적용하는 경우 OPS를 고효율로 생산할 수 있어, L-시스테인 합성 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은, YhhS 및 MdtD 단백질의 기능을 강화시킨 본 발명의 재조합 미생물의 배양액에서 배출된 OPS를 모두 제거한 후, 세포 내부의 OPS를 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: YhhS MFS 트랜스포터 및 YegB MFS 트랜스포터의 동정

OPS의 배출에 관여하는 대장균의 막 단백질을 동정하기 위해 Escherichia coli K12_W3110(ATCC27325)의 게노믹 DNA 라이브러리를 이용하여 스크리닝을 수행하였다.

OPS에 의해 대장균의 생육이 저하되는 조건을 셋업 하기 위해 OPS를 생산하는 기반 균주를 제작하였다. 스크리닝 기반 균주는 대장균 야생형 균주인 W3110에서 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 약화되도록 변이시킨 재조합 미생물로, KCCM11212P('CA07-0012'로도 명명, 한국등록특허 제10-1381048호; 미국공개특허 제2012-0190081호)라고 명명한 균주이다.

OPS 생산 균주인 KCCM11212P를 OPS를 포함하는 배지에서 배양시켜 생육 저하(growth inhibition)를 보이는 최적 스크리닝 조건을 수립하였다. W3110 게노믹 라이브러리 플라스미드를 CA07-0012에 전기천공법으로 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999), 과량의 OPS가 첨가된 배지 조건에서 생육 저하가 해제되는 콜로니들을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 플라스미드를 획득하여 시퀀싱 기법을 통해 염기서열을 분석하였다. 이로부터 과량의 OPS 첨가 조건에서 생육 저하를 해제시키는데 관여하는 대장균 막 단백질 2종을 동정하였다.

상기의 2종의 대장균 막 단백질은 YhhS major facilitator superfamily (MFS) 트랜스포터(서열번호 1의 아미노산 서열, 및 서열번호 3의 염기서열) 및 YegB MFS 트랜스포터(서열번호 2의 아미노산 서열, 및 서열번호 4의 염기서열)을 각각 코딩하는 yhhS 및 mdtD로 확인되었다(Pao SS, Paulsen IT, Saier MH (1998). "Major facilitator superfamily." Microbiol Mol Biol Rev 1998;62(1);1-34. PMID: 9529885).

실시예 2: yhhS 및 mdtD 과발현 벡터 제작

OPS에 의한 생육 저하를 해제시키는 데 관여하는 YhhS MFS 트랜스포터 및 YegB MFS 트랜스포터를 OPS 생산 균주에서 각각 강화시켜 주었을 경우, OPS 배출능이 향상되는지 확인하기 위하여 각각 유전자의 과발현 벡터를 제작하고자 하였다. 또한, 호모세린 및 호모세린 락톤 트랜스포터인 RhtB를 OPS 생산 균주에서 강화시켜 주었을 경우, OPS 농도가 상승하는 것을 확인하였기 때문에(한국등록특허 제138104호), 이를 양성 대조군(positive control)으로 이용하였다. 그리고 YhhS 및 MdtD와 동일하게, MFS(major facilitator superfamily)에 속하는 대장균 막 단백질 multidrug efflux transporter EmrD와 YcaD MFS transporter 또한 함께 평가하였다. YhhS MFS 트랜스포터를 코딩하는 유전자 yhhS(서열번호 3, Accession Numbers: b3473)와 YegB MFS 트랜스포터를 코딩하는 유전자 mdtD(서열번호 4, Accession Numbers: b2077) 단편은 W3110 게노믹 DNA을 주형으로 PCR을 통하여 획득하였다.

각각의 막 단백질 유전자에 대한 과발현 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에서 표기한 바와 같다.

유전자	프라이머 (5'->3')	서열번호	벡터
rhtB	GATATCATGACCTTAG AATGGTGG	9	pCL-PrhtB-rhtB
	AAGCTTTCACGCATGCCTCGCCGA	10
yhhS	GATATCATGCCCGAACCCGTAGC	5	pCL-PrhtB-yhhS
	AAGCTTTTAAGATGATGAGGCGGCCT	6
mdtD	GATATCATGACAGATCTTCCCGACAGC	7	pCL-PrhtB-mdtD
	AAGCTTTCATTGCGCGCTCCTTT	8
emrD	GATATCATGAAAAGGCAAAGAAACGTCAA	11	pCL-PrhtB-emrD
	AAGCTTTTAAACGGGCTGCCCCT	12
ycaD	GATATCATGTCCACGTATACCCAGCCTG	13	pCL-PrhtB-ycaD
	AAGCTTTTACACGTGAGCAACGGGTTT	14
pCL-1920	AAGCTTCGGGCCTCTTCGCTATTACGC	15	pCL-PrhtB
	AAGCTTAGGCTTACCCGTCTTACTGTC	16

yhhS PCR은 서열번호 5 및 6인 프라이머를, mdtD PCR은 서열번호 7 및 8을 이용하였다. 이때 이용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GeneBank)에 등록되어 있는 K12 W3110 유전자(GenBank accession number AP 003471) 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다.

rhtB, emrD 및 ycaD 유전자에 대한 PCR 역시 상기 표 1에 개시된 각각의 프라이머 쌍을 이용하여 해당 유전자 단편을 증폭하였다.

증폭된 각 유전자의 단편은 EcoRV와 HindⅢ의 제한 효소로 처리하였으며, pCL1920 벡터(GenBank No AB236930)에 대장균의 rhtB 유전자의 프로모터(PrhtB)가 삽입되어 있는 pCL-PrhtB-벡터의 EcoRV와 HindⅢ 제한 효소 자리에 클로닝하여, pCL-PrhtB-rhtB, pCL-PrhtB-yhhS, pCL-PrhtB-mdtD, pCL-PrhtB-emrD, pCL-PrhtB-ycaD를 각각 제작하였다.

실시예 3: YhhS MFS 트랜스포터 및 YegB MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가

<실시예 3-1: CA07-0012를 이용한 YhhS MFS 트랜스포터 및 YegB MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가>

실시예 2에서 제작된 5종의 플라스미드를 각각 OPS 생산주인 CA07-0012에 도입한 균주를 제작하여 OPS의 생산능을 평가하였다.

각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 2의 25 mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 34.5℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 3에 나타내었다.

조성물	농도 (리터당)
포도당	50 g
KH₂PO₄	6 g
(NH₄)₂SO₄	17 g
MgSO_4·7H₂O	1 g
FeSO_4·7H₂O	5 mg
MnSO_4·4H₂O	10 mg
L-글리신	2.5 g
효모액기스	3 g
탄산칼슘	30 g
pH	6.8

균주명	OD562nm	소모당 (g/L)	O-포스포세린 (g/L)
CA07-0012	35	32	1.1
CA07-0012/pCL-PrhtB-rhtB	40	35	1.3
CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS	37	34	2.1
CA07-0012/pCL-PrhtB-mdtD	41	32	1.8
CA07-0012/pCL-PrhtB-emrD	38	34	1.2
CA07-0012/pCL-PrhtB-ycaD	37	33	0.9

상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장균 유래의 CA07-0012 균주에 대장균 막 단백질 유전자를 추가로 도입한 경우 중, RhtB, YhhS 및 MdtD 강화주의 경우 OPS의 생산량이 CA07-0012에 비하여 증가한 결과를 나타내었고, 특히 본 발명의 YhhS 강화주 및 MdtD 강화주의 경우 OPS 농도가 150% 이상 상승하는 것을 확인하였다. 반면, 비교군인 EmrD 강화주 및 YcaD 강화주의 경우에는 OPS의 생산량을 증가시키지 못하는 결과를 나타내었다.

상기 CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS로 명명된 균주를 대장균 CA07-0266(Escherichia coli CA07-0266)으로 명명하고, 이를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2013년 12월 9일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11495P를 부여받았다.

또한, 상기 CA07-0012/pCL-PrhtB-mdtD를 대장균 CA07-0267(Escherichia coli CA07-0267)로 명명하고, 이를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2013년 12월 9일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11496P를 부여받았다.

<실시예 3-2: SerA 및 SerC 강화 균주를 이용한 YhhS MFS 트랜스포터 및 YegB MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가>

또한, OPS 생합성 경로인 SerA(3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)와 SerC(3-포스포세린 아미노트랜스퍼레이즈, 3-phosphoserine aminotransferase)의 활성을 강화시켜 OPS 생산능이 증가된 OPS 생산 균주인 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC(한국공개특허 제10-2012-0041115호)를 이용하여 상기의 대장균 막 단백질 유전자의 효과를 파악하고자 하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

균주명	OD562nm	소모당 (g/L)	O-포스포세린 (g/L)
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC	30	27	2.4
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-PrhtB-rhtB	32	28	2.8
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-PrhtB-yhhS	28	26	4.0
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-PrhtB-mdtD	27	27	3.5
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-PrhtB-emrD	33	29	2.3
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-PrhtB-ycaD	34	28	1.9

상기 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장균 유래의 CA07-0012 균주보다 OPS 생산능이 향상된 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC에 대장균 막 단백질 유전자를 추가로 도입한 균주 중, 본 발명의 YhhS 및 MdtD 강화주 및 양성 대조군인 RhtB 강화주의 경우 OPS의 생산량이 대조군 대비 증가하는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다. 특히 본 발명의 YhhS 및 MdtD 강화주의 경우 상기 표 3의 결과와 유사하게 OPS 농도가 145% 이상 상승하는 결과를 나타내었다. 반면, 비교군인 ErmD 강화군 및 YcaD 강화군의 경우에는 대조군 대비 OPS 생산량이 감소한 결과를 나타내었다.

<실시예 3-3: 프로모터 세기에 따른 YhhS MFS 트랜스포터 및 YegB MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가>

또한, OPS 농도가 대조군 대비 상승된 막 단백질 YhhS, MdtD의 경우, 프로모터 세기를 강화하였을 때, 배출능이 향상될 수 있는지 확인해 보고자 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC에 yhhS 및 mdtD 유전자를 추가로 도입하면서, 이때 rhtB 프로모터(PrhtB)보다 강한 trc 프로모터(Ptrc)를 사용하였다.

각각의 유전자 YhhS, mdtD 단편은 pCL-PrhtB-gene을 EcoRV, HindIII로 제한 효소 처리하여, pCL1920 벡터에 trc 프로모터가 삽입되어 있는 pCL-Ptrc-GFP 벡터의 EcoRV와 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하여, pCL-Ptrc-yhhS, pCL-Ptrc-mdtD를 제작하였다. 이후 각 플라스미드를 주형으로 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하고 HindIII로 제한효소 처리하여 pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC의 HindIII 제한 효소 자리에 클로닝하였다.

균주명	OD562nm	소모당 (g/L)	O-포스포세린 (g/L)
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC	31	30	2.7
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-Ptrc-yhhS	28	33	5.5
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-Ptrc-mdtD	29	31	4.3

그 결과, 상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 프로모터를 강화하여 대장균 막 단백질의 발현을 증가시켰을 경우, 대조군 대비 수율 150% 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, rhtB 프로모터를 사용했을 때보다, 120% 이상 수율 증가하는 것을 확인하였다.

<실시예 3-4: 염색체상 프로모터 세기에 따른 YhhS MFS 트랜스포터 및 YegB MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가>

또한, 염색체상에서 yhhS와 mdtD의 프로모터를 더 강한 프로모터로 바꿔주었을 경우, 배출능이 향상되는지 확인해보기 위해 자가 프로모터를 cj1 프로모터(한국등록특허 제0620092호)로 치환된 균주를 제작하여 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다. Cj1 프로모터를 대장균의 염색체에 도입하는 방법은 통상 이용되는 하기의 방법으로 제작하였다. 염색체에 yhhS와 mdtD 자가 프로모터를 치환하기 위해 제작한 재조합 벡터를 OPS 생산균주인 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC(한국등록특허 제138104호) 에 형질전환시켜 모균주가 가지고 있는 자가 프로모터 서열과 상기한 벡터상의 프로모터 서열을 상동재조합을 통해 치환시킴으로써, 염색체 내로 cj1 프로모터 서열을 삽입시켰다.

각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후 33℃ 배양기에서 밤새 배양한 균주를 상기 표 2의 25 mL 역가 배지에 접종한 다음, 이를 34.5℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 하기 표 6에 나타내었다.　

균주명	OD562nm	소모당 (g/L)	O-포스포세린 (g/L)
CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC	30	29	2.7
CA07-0022::Pcj1 yhhs/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC	28	30	3.5
CA07-0022::Pcj1 mdtD/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC	29	31	3.2

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 염색체상에서 각 막 단백질의 발현을 증가시켰을 경우, 대조군 대비 수율이 최대 130% 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4:　YhhS MFS 트랜스포터 및 YegB MFS 트랜스포터의 OPS 배출 기능 확인

실시예 3에서 OPS 생산을 확인한 상기의 플라스크 샘플 중 막 단백질을 강화시키지 않은 음성 대조군(negative control)인 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC와, YhhS 및 MdtD 단백질을 강화시킨 샘플 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-Ptrc-yhhS와 CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC-Ptrc-mdtD를 이용하여 배지 내에 배출된 OPS를 모두 제거한 후 세포만을 수집하여 세포를 파쇄하였다.　이로부터 세포 내부의 OPS 농도를 HPLC(high performance liquid chromatography) 기기를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 YhhS 및 MdtD 강화주의 경우 대조군 대비 세포 내의 OPS 농도가 30~40%까지 감소하는 것을 확인하여, Yhhs 및 MdtD 단백질은 OPS를 세포 외부로 배출하는 역할을 하고 있음을 알 수 있었다. 이로써, Yhhs 및 MdtD 단백질을 강화시키는 경우, 세포 내부의 OPS를 원활히 배출함으로써, OPS 생산능을 향상시키는 것으로 판단되었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11495P

20131209

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11496P

20131209

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism producing O-phosphoserine and a method for producing O-phosphoserine or L-cysteine using the same <130> PA131324KR <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 405 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(405) <223> YhhS MFS transporter, YhhS <400> 1 Met Pro Glu Pro Val Ala Glu Pro Ala Leu Asn Gly Leu Arg Leu Asn 1 5 10 15 Leu Arg Ile Val Ser Ile Val Met Phe Asn Phe Ala Ser Tyr Leu Thr 20 25 30 Ile Gly Leu Pro Leu Ala Val Leu Pro Gly Tyr Val His Asp Val Met 35 40 45 Gly Phe Ser Ala Phe Trp Ala Gly Leu Val Ile Ser Leu Gln Tyr Phe 50 55 60 Ala Thr Leu Leu Ser Arg Pro His Ala Gly Arg Tyr Ala Asp Ser Leu 65 70 75 80 Gly Pro Lys Lys Ile Val Val Phe Gly Leu Cys Gly Cys Phe Leu Ser 85 90 95 Gly Leu Gly Tyr Leu Thr Ala Gly Leu Thr Ala Ser Leu Pro Val Ile 100 105 110 Ser Leu Leu Leu Leu Cys Leu Gly Arg Val Ile Leu Gly Ile Gly Gln 115 120 125 Ser Phe Ala Gly Thr Gly Ser Thr Leu Trp Gly Val Gly Val Val Gly 130 135 140 Ser Leu His Ile Gly Arg Val Ile Ser Trp Asn Gly Ile Val Thr Tyr 145 150 155 160 Gly Ala Met Ala Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Val Phe Tyr His Trp 165 170 175 Gly Gly Leu Gln Ala Leu Ala Leu Ile Ile Met Gly Val Ala Leu Val 180 185 190 Ala Ile Leu Leu Ala Ile Pro Arg Pro Thr Val Lys Ala Ser Lys Gly 195 200 205 Lys Pro Leu Pro Phe Arg Ala Val Leu Gly Arg Val Trp Leu Tyr Gly 210 215 220 Met Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe 225 230 235 240 Ile Thr Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Gly Trp Asp Gly Ala Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Thr Leu Phe Ser Cys Ala Phe Val Gly Thr Arg Leu Leu Phe Pro 260 265 270 Asn Gly Ile Asn Arg Ile Gly Gly Leu Asn Val Ala Met Ile Cys Phe 275 280 285 Ser Val Glu Ile Ile Gly Leu Leu Leu Val Gly Val Ala Thr Met Pro 290 295 300 Trp Met Ala Lys Ile Gly Val Leu Leu Ala Gly Ala Gly Phe Ser Leu 305 310 315 320 Val Phe Pro Ala Leu Gly Val Val Ala Val Lys Ala Val Pro Gln Gln 325 330 335 Asn Gln Gly Ala Ala Leu Ala Thr Tyr Thr Val Phe Met Asp Leu Ser 340 345 350 Leu Gly Val Thr Gly Pro Leu Ala Gly Leu Val Met Ser Trp Ala Gly 355 360 365 Val Pro Val Ile Tyr Leu Ala Ala Ala Gly Leu Val Ala Ile Ala Leu 370 375 380 Leu Leu Thr Trp Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Glu His Val Pro Glu 385 390 395 400 Ala Ala Ser Ser Ser 405 <210> 2 <211> 471 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(471) <223> YegB MFS transporter, MdtD <400> 2 Met Thr Asp Leu Pro Asp Ser Thr Arg Trp Gln Leu Trp Ile Val Ala 1 5 10 15 Phe Gly Phe Phe Met Gln Ser Leu Asp Thr Thr Ile Val Asn Thr Ala 20 25 30 Leu Pro Ser Met Ala Gln Ser Leu Gly Glu Ser Pro Leu His Met His 35 40 45 Met Val Ile Val Ser Tyr Val Leu Thr Val Ala Val Met Leu Pro Ala 50 55 60 Ser Gly Trp Leu Ala Asp Lys Val Gly Val Arg Asn Ile Phe Phe Thr 65 70 75 80 Ala Ile Val Leu Phe Thr Leu Gly Ser Leu Phe Cys Ala Leu Ser Gly 85 90 95 Thr Leu Asn Glu Leu Leu Leu Ala Arg Ala Leu Gln Gly Val Gly Gly 100 105 110 Ala Met Met Val Pro Val Gly Arg Leu Thr Val Met Lys Ile Val Pro 115 120 125 Arg Glu Gln Tyr Met Ala Ala Met Thr Phe Val Thr Leu Pro Gly Gln 130 135 140 Val Gly Pro Leu Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Leu Leu Val Glu Tyr 145 150 155 160 Ala Ser Trp His Trp Ile Phe Leu Ile Asn Ile Pro Val Gly Ile Ile 165 170 175 Gly Ala Ile Ala Thr Leu Leu Leu Met Pro Asn Tyr Thr Met Gln Thr 180 185 190 Arg Arg Phe Asp Leu Ser Gly Phe Leu Leu Leu Ala Val Gly Met Ala 195 200 205 Val Leu Thr Leu Ala Leu Asp Gly Ser Lys Gly Thr Gly Leu Ser Pro 210 215 220 Leu Thr Ile Ala Gly Leu Val Ala Val Gly Val Val Ala Leu Val Leu 225 230 235 240 Tyr Leu Leu His Ala Arg Asn Asn Asn Arg Ala Leu Phe Ser Leu Lys 245 250 255 Leu Phe Arg Thr Arg Thr Phe Ser Leu Gly Leu Ala Gly Ser Phe Ala 260 265 270 Gly Arg Ile Gly Ser Gly Met Leu Pro Phe Met Thr Pro Val Phe Leu 275 280 285 Gln Ile Gly Leu Gly Phe Ser Pro Phe His Ala Gly Leu Met Met Ile 290 295 300 Pro Met Val Leu Gly Ser Met Gly Met Lys Arg Ile Val Val Gln Val 305 310 315 320 Val Asn Arg Phe Gly Tyr Arg Arg Val Leu Val Ala Thr Thr Leu Gly 325 330 335 Leu Ser Leu Val Thr Leu Leu Phe Met Thr Thr Ala Leu Leu Gly Trp 340 345 350 Tyr Tyr Val Leu Pro Phe Val Leu Phe Leu Gln Gly Met Val Asn Ser 355 360 365 Thr Arg Phe Ser Ser Met Asn Thr Leu Thr Leu Lys Asp Leu Pro Asp 370 375 380 Asn Leu Ala Ser Ser Gly Asn Ser Leu Leu Ser Met Ile Met Gln Leu 385 390 395 400 Ser Met Ser Ile Gly Val Thr Ile Ala Gly Leu Leu Leu Gly Leu Phe 405 410 415 Gly Ser Gln His Val Ser Val Asp Ser Gly Thr Thr Gln Thr Val Phe 420 425 430 Met Tyr Thr Trp Leu Ser Met Ala Leu Ile Ile Ala Leu Pro Ala Phe 435 440 445 Ile Phe Ala Arg Val Pro Asn Asp Thr His Gln Asn Val Ala Ile Ser 450 455 460 Arg Arg Lys Arg Ser Ala Gln 465 470 <210> 3 <211> 1218 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1218) <223> yhhS <400> 3 atgcccgaac ccgtagccga acccgcgcta aacggattgc gcctgaattt gcgcattgtc 60 tctatagtca tgtttaactt cgccagctac ctcaccatcg ggttgccgct cgctgtatta 120 ccgggctatg tccatgatgt gatgggcttt agcgccttct gggcaggatt ggttatcagc 180 ctgcaatatt tcgccacctt gctgagccgc cctcatgccg gacgttacgc cgattcgctg 240 ggacccaaaa agattgtcgt cttcggttta tgcggctgct ttttgagcgg tctggggtat 300 ctgacggcag gattaaccgc cagtctgcct gtcatcagcc tgttattact ttgcctgggg 360 cgcgtcatcc ttgggattgg gcaaagtttt gccggaacgg gatcgaccct atggggcgtt 420 ggcgtggttg gctcgctgca tatcgggcgg gtgatttcgt ggaacggcat tgtcacttac 480 ggggcgatgg cgatgggtgc gccgttaggc gtcgtgtttt atcactgggg cggcttgcag 540 gcgttagcgt taatcattat gggcgtggcg ctggtggcca ttttgttggc gatcccgcgt 600 ccgacggtaa aagccagtaa aggcaaaccg ctgccgtttc gcgcggtgct tgggcgcgtc 660 tggctgtacg gtatggcgct ggcactggct tccgccggat ttggcgtcat cgccaccttt 720 atcacgctgt tttatgacgc taaaggttgg gacggtgcgg ctttcgcgct gacgctgttt 780 agctgtgcgt ttgtcggtac gcgtttgtta ttccctaacg gcattaaccg tatcggtggc 840 ttaaacgtag cgatgatttg ctttagcgtt gagataatcg gcctgctact ggttggcgtg 900 gcgactatgc cgtggatggc gaaaatcggc gtcttactgg cgggggccgg gttttcgctg 960 gtgttcccgg cattgggtgt agtggcggta aaagcggttc cgcagcaaaa tcagggggcg 1020 gcgctggcaa cttacaccgt atttatggat ttatcgcttg gcgtgactgg accactggct 1080 gggctggtga tgagctgggc gggcgtaccg gtgatttatc tggcggcggc gggactggtc 1140 gcaatcgcgt tattactgac gtggcgatta aaaaaacggc ctccggaaca cgtccctgag 1200 gccgcctcat catcttaa 1218 <210> 4 <211> 1416 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1416) <223> mdtD <400> 4 atgacagatc ttcccgacag cacccgttgg caattgtgga ttgtggcttt cggcttcttt 60 atgcagtcgc tggacaccac catcgtaaac accgcccttc cctcaatggc gcaaagcctc 120 ggggaaagtc cgttgcatat gcacatggtc attgtctctt atgtgctgac cgtggcggtg 180 atgctgcccg ccagcggctg gctggcggac aaagtcggcg tgcgcaatat tttctttacc 240 gccatcgtgc tgtttactct cggttcactg ttttgcgcgc tttccggcac gctgaacgaa 300 ctgttgctgg cacgcgcgtt acagggcgtt ggcggcgcga tgatggtgcc ggtcggcaga 360 ttgacggtga tgaaaatcgt accgcgcgag caatatatgg cggcgatgac ctttgtcacg 420 ttacccggtc aggtcggtcc gctgctcggt ccggcgctcg gcggtctgct ggtggagtac 480 gcatcgtggc actggatctt tttgatcaac attccggtgg ggattatcgg tgcgatcgcc 540 acattgctgt taatgccgaa ctacaccatg cagacgcggc gctttgatct ctccggattt 600 ttattgctgg cggttggcat ggcggtatta accctggcgc tggacggcag taaaggtaca 660 ggtttatcgc cgctgacgat tgcaggcctg gtcgcagttg gcgtggtggc actggtgctt 720 tatctgctgc acgccagaaa taacaaccgt gccctgttca gtctgaaact gttccgtact 780 cgtacctttt cgctgggcct ggcggggagc tttgccggac gtattggcag tggcatgttg 840 ccctttatga caccggtttt cctgcaaatt ggcctcggtt tctcgccgtt tcatgccgga 900 ctgatgatga tcccgatggt gcttggcagc atgggaatga agcgaattgt ggtacaggtg 960 gtgaatcgct ttggttatcg tcgggtactg gtagcgacca cgctgggtct gtcgctggtc 1020 accctgttgt ttatgactac cgccctgctg ggctggtact acgttttgcc gttcgtcctg 1080 tttttacaag ggatggtcaa ctcgacgcgt ttctcctcca tgaacaccct gacgctgaaa 1140 gatctcccgg acaatctggc gagcagcggc aacagcctgc tgtcgatgat tatgcaattg 1200 tcgatgagta tcggcgtcac tatcgccggg ctgttgctgg gactttttgg ttcacagcat 1260 gtcagcgtcg acagcggcac cacacaaacc gtctttatgt acacctggct tagcatggcg 1320 ttgatcatcg cccttccggc gttcatcttt gccagagtgc cgaacgatac gcatcaaaat 1380 gtagctattt cgcggcgaaa aaggagcgcg caatga 1416 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of yhhS to construct pCL-PrhtB-yhhS <400> 5 gatatcatgc ccgaacccgt agc 23 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of yhhS to construct pCL-PrhtB-yhhS <400> 6 aagcttttaa gatgatgagg cggcct 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of mdtD to construct pCL-PrhtB-mdtD <400> 7 gatatcatga cagatcttcc cgacagc 27 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of mdtD to construct pCL-PrhtB-mdtD <400> 8 aagctttcat tgcgcgctcc ttt 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of rhtB to construct pCL-PrhtB-rhtB <400> 9 gatatcatga ccttagaatg gtgg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of rhtB to construct pCL-PrhtB-rhtB <400> 10 aagctttcac gcatgcctcg ccga 24 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of emrD to construct pCL-PrhtB-emrD <400> 11 gatatcatga aaaggcaaag aaacgtcaa 29 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of emrD to construct pCL-PrhtB-emrD <400> 12 aagcttttaa acgggctgcc cct 23 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ycaD to construct pCL-PrhtB-ycaD <400> 13 gatatcatgt ccacgtatac ccagcctg 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ycaD to construct pCL-PrhtB-ycaD <400> 14 aagcttttac acgtgagcaa cgggttt 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of pCL-PrhtB-genes to constrct pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-genes <400> 15 aagcttcggg cctcttcgct attacgc 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of pCL-PrhtB-genes to constrct pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-genes <400> 16 aagcttaggc ttacccgtct tactgtc 27 <210> 17 <211> 446 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(446) <223> phosphoserine phosphatase, SerB <400> 17 Met Ser Cys Ser Ala Leu Arg His Glu Thr Ile Val Ala Val Thr Glu 1 5 10 15 Leu Ile Gln Asn Glu Ser Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Ala Gly Gln 20 25 30 Gln Val Ala Leu Arg Glu Gly Tyr Leu Pro Ala Val Ile Thr Val Ser 35 40 45 Gly Lys Asp Arg Pro Gly Val Thr Ala Ala Phe Phe Arg Val Leu Ser 50 55 60 Ala Asn Gln Val Gln Val Leu Asp Val Glu Gln Ser Met Phe Arg Gly 65 70 75 80 Phe Leu Asn Leu Ala Ala Phe Val Gly Ile Ala Pro Glu Arg Val Glu 85 90 95 Thr Val Thr Thr Gly Leu Thr Asp Thr Leu Lys Val His Gly Gln Ser 100 105 110 Val Val Val Glu Leu Gln Glu Thr Val Gln Ser Ser Arg Pro Arg Ser 115 120 125 Ser His Val Val Val Val Leu Gly Asp Pro Val Asp Ala Leu Asp Ile 130 135 140 Ser Arg Ile Gly Gln Thr Leu Ala Asp Tyr Asp Ala Asn Ile Asp Thr 145 150 155 160 Ile Arg Gly Ile Ser Asp Tyr Pro Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Val 165 170 175 Thr Val Pro Asp Val Ser Pro Gly Gly Gly Glu Ala Met Arg Lys Ala 180 185 190 Leu Ala Ala Leu Thr Ser Glu Leu Asn Val Asp Ile Ala Ile Glu Arg 195 200 205 Ser Gly Leu Leu Arg Arg Ser Lys Arg Leu Val Cys Phe Asp Cys Asp 210 215 220 Ser Thr Leu Ile Thr Gly Glu Val Ile Glu Met Leu Ala Ala His Ala 225 230 235 240 Gly Lys Glu Ala Glu Val Ala Ala Val Thr Glu Arg Ala Met Arg Gly 245 250 255 Glu Leu Asp Phe Glu Glu Ser Leu Arg Glu Arg Val Lys Ala Leu Ala 260 265 270 Gly Leu Asp Ala Ser Val Ile Asp Glu Val Ala Ala Ala Ile Glu Leu 275 280 285 Thr Pro Gly Ala Arg Thr Thr Ile Arg Thr Leu Asn Arg Met Gly Tyr 290 295 300 Gln Thr Ala Val Val Ser Gly Gly Phe Ile Gln Val Leu Glu Gly Leu 305 310 315 320 Ala Glu Glu Leu Glu Leu Asp Tyr Val Arg Ala Asn Thr Leu Glu Ile 325 330 335 Val Asp Gly Lys Leu Thr Gly Asn Val Thr Gly Lys Ile Val Asp Arg 340 345 350 Ala Ala Lys Ala Glu Phe Leu Arg Glu Phe Ala Ala Asp Ser Gly Leu 355 360 365 Lys Met Tyr Gln Thr Val Ala Val Gly Asp Gly Ala Asn Asp Ile Asp 370 375 380 Met Leu Ser Ala Ala Gly Leu Gly Val Ala Phe Asn Ala Lys Pro Ala 385 390 395 400 Leu Lys Glu Ile Ala Asp Thr Ser Val Asn His Pro Phe Leu Asp Glu 405 410 415 Val Leu His Ile Met Gly Ile Ser Arg Asp Glu Ile Asp Leu Ala Asp 420 425 430 Gln Glu Asp Gly Thr Phe His Arg Val Pro Leu Thr Asn Ala 435 440 445 <210> 18 <211> 322 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(322) <223> phosphoserine phosphatase, SerB <400> 18 Met Pro Asn Ile Thr Trp Cys Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Leu Trp 1 5 10 15 Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Pro Leu Asp 20 25 30 Tyr His Ala Gly Arg Ser Gly Trp Leu Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Asp 35 40 45 Lys Gln Arg Leu Thr Gln Tyr Gln Ser Lys Leu Gly Ala Ala Met Val 50 55 60 Ile Val Ala Ala Trp Cys Val Glu Asp Tyr Gln Val Ile Arg Leu Ala 65 70 75 80 Gly Ser Leu Thr Ala Arg Ala Thr Arg Leu Ala His Glu Ala Gln Leu 85 90 95 Asp Val Ala Pro Leu Gly Lys Ile Pro His Leu Arg Thr Pro Gly Leu 100 105 110 Leu Val Met Asp Met Asp Ser Thr Ala Ile Gln Ile Glu 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Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(1341) <223> phosphoserine phosphatase, SerB <400> 19 atgtcgtgtt ccgcgctcag acatgagaca attgttgccg tgactgaact catccagaat 60 gaatcccaag aaatcgctga gctggaagcc ggccagcagg ttgcattgcg tgaaggttat 120 cttcctgcgg tgatcacagt gagcggtaaa gaccgcccag gtgtgactgc cgcgttcttt 180 agggtcttgt ccgctaatca ggttcaggtc ttggacgttg agcagtcaat gttccgtggc 240 tttttgaact tggcggcgtt tgtgggtatc gcacctgagc gtgtcgagac cgtcaccaca 300 ggcctgactg acaccctcaa ggtgcatgga cagtccgtgg tggtggagct gcaggaaact 360 gtgcagtcgt cccgtcctcg ttcttcccat gttgttgtgg tgttgggtga tccggttgat 420 gcgttggata tttcccgcat tggtcagacc ctggcggatt acgatgccaa cattgacacc 480 attcgtggta tttcggatta ccctgtgacc ggcctggagc tgaaggtgac tgtgccggat 540 gtcagccctg gtggtggtga agcgatgcgt aaggcgcttg ctgctcttac ctctgagctg 600 aatgtggata ttgcgattga gcgttctggt ttgctgcgtc gttctaagcg tctggtgtgc 660 ttcgattgtg attccacgtt gatcactggt gaggtcattg agatgctggc ggctcacgcg 720 ggcaaggaag ctgaagttgc ggcagttact gagcgtgcga 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Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(410) <223> SerA <400> 21 Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr 20 25 30 Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys 35 40 45 Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His 50 55 60 Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly 65 70 75 80 Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys 85 90 95 Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val 100 105 110 Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro 115 120 125 Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala 130 135 140 Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly 145 150 155 160 His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr 165 170 175 Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr 180 185 190 Gln Val Gln His Leu Ser 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atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240 tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300 gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360 ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420 aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480 catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540 gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600 ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660 atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720 ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780 gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840 ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900 caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960 acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacggtgg gcgtcgtctg 1020 atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080 cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140 attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200 ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233 <210> 28 <211> 1593 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D-3-phosphoglycerate dehydrogenase(E235K), SerA(E235K) <400> 28 atgagccaga atggccgtcc ggtagtcctc atcgccgata agcttgcgca gtccactgtt 60 gacgcgcttg gagatgcagt agaagtccgt tgggttgacg gacctaaccg cccagaactg 120 cttgatgcag ttaaggaagc ggacgcactg ctcgtgcgtt ctgctaccac tgtcgatgct 180 gaagtcatcg ccgctgcccc taacttgaag atcgtcggtc gtgccggcgt gggcttggac 240 aacgttgaca tccctgctgc cactgaagct ggcgtcatgg ttgctaacgc accgacctct 300 aatattcact ccgcttgtga gcacgcaatt tctttgctgc tgtctactgc tcgccagatc 360 cctgctgctg atgcgacgct gcgtgagggc gagtggaagc ggtcttcttt caacggtgtg 420 gaaattttcg gaaaaactgt cggtatcgtc ggttttggcc acattggtca gttgtttgct 480 cagcgtcttg ctgcgtttga gaccaccatt gttgcttacg atccttacgc taaccctgct 540 cgtgcggctc agctgaacgt tgagttggtt gagttggatg agctgatgag ccgttctgac 600 tttgtcacca ttcaccttcc taagaccaag gaaactgctg gcatgtttga tgcgcagctc 660 cttgctaagt ccaagaaggg ccagatcatc atcaacgctg ctcgtggtgg ccttgttgat 720 gagcaggctt tggctgatgc gattgagtcc ggtcacattc gtggcgctgg tttcgatgtg 780 tactccaccg agccttgcac tgattctcct ttgttcaagt tgcctcaggt tgttgtgact 840 cctcacttgg gtgcttctac tgaagaggct caggatcgtg cgggtactga cgttgctgat 900 tctgtgctca aggcgctggc tggcgagttc gtggcggatg ctgtgaacgt ttccggtggt 960 cgcgtgggcg aaaaggttgc tgtgtggatg gatctggctc gcaagcttgg tcttcttgct 1020 ggcaagcttg tcgacgccgc cccagtctcc attgaggttg aggctcgagg cgagctttct 1080 tccgagcagg tcgatgcact tggtttgtcc gctgttcgtg gtttgttctc cggaattatc 1140 gaagagtccg ttactttcgt caacgctcct cgcattgctg aagagcgtgg cctggacatc 1200 tccgtgaaga ccaactctga gtctgttact caccgttccg tcctgcaggt caaggtcatt 1260 actggcagcg gcgcgagcgc aactgttgtt ggtgccctga ctggtcttga gcgcgttgag 1320 aagatcaccc gcatcaatgg ccgtggcctg gatctgcgcg cagagggtct gaacctcttc 1380 ctgcagtaca ctgacgctcc tggtgcactg ggtaccgttg gtaccaagct gggtgctgct 1440 ggcatcaaca tcgaggctgc tgcgttgact caggctgaga agggtgacgg cgctgtcctg 1500 atcctgcgtg ttgagtccgc tgtctctgaa gagctggaag ctgaaatcaa cgctgagttg 1560 ggtgctactt ccttccaggt tgatcttgac taa 1593 <210> 29 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D-3-phosphoglycerate dehydrogenase(197 delta), SerA(197 delta) <400> 29 atgagccaga atggccgtcc ggtagtcctc atcgccgata agcttgcgca gtccactgtt 60 gacgcgcttg gagatgcagt agaagtccgt tgggttgacg gacctaaccg cccagaactg 120 cttgatgcag ttaaggaagc ggacgcactg ctcgtgcgtt ctgctaccac tgtcgatgct 180 gaagtcatcg ccgctgcccc taacttgaag atcgtcggtc gtgccggcgt gggcttggac 240 aacgttgaca tccctgctgc cactgaagct ggcgtcatgg ttgctaacgc accgacctct 300 aatattcact ccgcttgtga gcacgcaatt tctttgctgc tgtctactgc tcgccagatc 360 cctgctgctg atgcgacgct gcgtgagggc gagtggaagc ggtcttcttt caacggtgtg 420 gaaattttcg gaaaaactgt cggtatcgtc ggttttggcc acattggtca gttgtttgct 480 cagcgtcttg ctgcgtttga gaccaccatt gttgcttacg atccttacgc taaccctgct 540 cgtgcggctc agctgaacgt tgagttggtt gagttggatg agctgatgag ccgttctgac 600 tttgtcacca ttcaccttcc taagaccaag gaaactgctg gcatgtttga tgcgcagctc 660 cttgctaagt ccaagaaggg ccagatcatc atcaacgctg ctcgtggtgg ccttgttgat 720 gagcaggctt tggctgatgc gattgagtcc ggtcacattc gtggcgctgg tttcgatgtg 780 tactccaccg agccttgcac tgattctcct ttgttcaagt tgcctcaggt tgttgtgact 840 cctcacttgg gtgcttctac tgaagaggct caggatcgtg cgggtactga cgttgctgat 900 tctgtgctca aggcgctggc tggcgagttc gtggcggatg ctgtgaacgt ttccggtggt 960 cgcgtgggcg aagaggttgc tgtgtggatg gatctggctt aa 1002 <210> 30 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D-3-phosphoglycerate dehydrogenase(G336V), SerA(G336V) <400> 30 atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60 caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120 gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180 tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240 tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300 gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360 ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420 aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480 catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540 gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600 ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660 atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720 ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780 gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840 ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900 caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960 acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacgttgg gcgtcgtctg 1020 atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080 cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140 attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200 ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233 <210> 31 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*(G336V,G337V) <400> 31 atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60 caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120 gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180 tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240 tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300 gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360 ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420 aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480 catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540 gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600 ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660 atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720 ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780 gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840 ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900 caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960 acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacgttgt gcgtcgtctg 1020 atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080 cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140 attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200 ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233 <210> 32 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serA*(G336V,R338G) <400> 32 atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60 caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120 gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180 tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240 tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300 gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360 ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420 aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480 catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540 gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600 ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660 atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720 ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780 gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840 ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900 caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960 acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacgttgg gggtcgtctg 1020 atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080 cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140 attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200 ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233 <210> 33 <211> 362 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(362) <223> 3-phosphoserine/phosphohydroxythreonine aminotransferase, SerC <400> 33 Met Ala Gln Ile Phe Asn Phe Ser Ser Gly Pro Ala Met Leu Pro Ala 1 5 10 15 Glu Val Leu Lys Gln Ala Gln Gln Glu Leu Arg Asp Trp Asn Gly Leu 20 25 30 Gly Thr Ser Val Met Glu Val Ser His Arg Gly Lys Glu Phe Ile Gln 35 40 45 Val Ala Glu Glu Ala Glu Lys Asp Phe Arg Asp Leu Leu Asn Val Pro 50 55 60 Ser Asn Tyr Lys Val Leu Phe Cys His Gly Gly Gly Arg Gly Gln Phe 65 70 75 80 Ala Ala Val Pro Leu Asn Ile Leu Gly Asp Lys Thr Thr Ala Asp Tyr 85 90 95 Val Asp Ala Gly Tyr Trp Ala Ala Ser Ala Ile Lys Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Tyr Cys Thr Pro Asn Val Phe Asp Ala Lys Val Thr Val Asp Gly Leu 115 120 125 Arg Ala Val Lys Pro Met Arg Glu Trp Gln Leu Ser Asp Asn Ala Ala 130 135 140 Tyr Met His Tyr Cys Pro Asn Glu Thr Ile Asp Gly Ile Ala Ile Asp 145 150 155 160 Glu Thr Pro Asp Phe Gly Ala Asp Val Val Val Ala Ala Asp Phe Ser 165 170 175 Ser Thr Ile Leu Ser Arg Pro Ile Asp Val Ser Arg Tyr Gly Val Ile 180 185 190 Tyr Ala Gly Ala Gln Lys Asn Ile Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ile Val 195 200 205 Ile Val Arg Glu Asp Leu Leu Gly Lys Ala Asn Ile Ala Cys Pro Ser 210 215 220 Ile Leu Asp Tyr Ser Ile Leu Asn Asp Asn Gly Ser Met Phe Asn Thr 225 230 235 240 Pro Pro Thr Phe Ala Trp Tyr Leu Ser Gly Leu Val Phe Lys Trp Leu 245 250 255 Lys Ala Asn Gly Gly Val Ala Glu Met Asp Lys Ile Asn Gln Gln Lys 260 265 270 Ala Glu Leu Leu Tyr Gly Val Ile Asp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg Asn 275 280 285 Asp Val Ala Lys Ala Asn Arg Ser Arg Met Asn Val Pro Phe Gln Leu 290 295 300 Ala Asp Ser Ala Leu Asp Lys Leu Phe Leu Glu Glu Ser Phe Ala Ala 305 310 315 320 Gly Leu His Ala Leu Lys Gly His Arg Val Val Gly Gly Met Arg Ala 325 330 335 Ser Ile Tyr Asn Ala Met Pro Leu Glu Gly Val Lys Ala Leu Thr Asp 340 345 350 Phe Met Val Glu Phe Glu Arg Arg His Gly 355 360 <210> 34 <211> 1089 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1089) <223> 3-phosphoserine/phosphohydroxythreonine aminotransferase, SerC <400> 34 atggctcaaa tcttcaattt tagttctggt ccggcaatgc taccggcaga ggtgcttaaa 60 caggctcaac aggaactgcg cgactggaac ggtcttggta cgtcggtgat ggaagtgagt 120 caccgtggca aagagttcat tcaggttgca gaggaagccg agaaggattt tcgcgatctt 180 cttaatgtcc cctccaacta caaggtatta ttctgccatg gcggtggtcg cggtcagttt 240 gctgcggtac cgctgaatat tctcggtgat aaaaccaccg cagattatgt tgatgccggt 300 tactgggcgg caagtgccat taaagaagcg aaaaaatact gcacgcctaa tgtctttgac 360 gccaaagtga ctgttgatgg tctgcgcgcg gttaagccaa tgcgtgaatg gcaactctct 420 gataatgctg cttatatgca ttattgcccg aatgaaacca tcgatggtat cgccatcgac 480 gaaacgccag acttcggcgc agatgtggtg gtcgccgctg acttctcttc aaccattctt 540 tcccgtccga ttgacgtcag ccgttatggt gtaatttacg ctggcgcgca gaaaaatatc 600 ggcccggctg gcctgacaat cgtcatcgtt cgtgaagatt tgctgggcaa agcgaatatc 660 gcgtgtccgt cgattctgga ttattccatc ctcaacgata acggctccat gtttaacacg 720 ccgccgacat ttgcctggta tctatctggt ctggtcttta aatggctgaa agcgaacggc 780 ggtgtagctg aaatggataa aatcaatcag caaaaagcag aactgctata tggggtgatt 840 gataacagcg atttctaccg caatgacgtg gcgaaagcta accgttcgcg gatgaacgtg 900 ccgttccagt tggcggacag tgcgcttgac aaattgttcc ttgaagagtc ttttgctgct 960 ggccttcatg cactgaaagg tcaccgtgtg gtcggcggaa tgcgcgcttc tatttataac 1020 gccatgccgc tggaaggcgt taaagcgctg acagacttca tggttgagtt cgaacgccgt 1080 cacggttaa 1089

Claims

서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, O-포스포세린을 생산하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 O-포스포세린 생산 미생물은 대장균인 것인 미생물.
O-포스포세린(OPS) 배출 활성을 나타내고, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드의 활성이 강화된, O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및
상기 O-포스포세린 생산 미생물 또는 이의 배지로부터 O-포스포세린을 분리하는 단계
를 포함하는, O-포스포세린의 생산방법.
제5항에 있어서, 상기 O-포스포세린 생산 미생물은 추가로 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것인, 생산방법.
제5항에 있어서, 상기 O-포스포세린 생산 미생물은 추가로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것인, 생산방법.
제5항에 있어서, 상기 O-포스포세린 생산 미생물은 대장균인 것인, 생산방법.
a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린(OPS)을 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-Phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
제9항에 있어서, 상기 황화물은 Na₂S, NaSH, (NH₄)₂S, H₂S 및 Na₂S₂O₃로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.